Transzgénikus modell állatok: genomikai megközelítések Vellai Tibor (
[email protected])
Eötvös Loránd Tudományegyetem Genetikai Tanszék
2013.11.07
GENETIKA
A jelen biológiai kutatások integráló diszciplínája (a legutóbbi 10 orvosbiológiai Nobel díj közül 6-ot genetikai kutatásokért ítélték oda). Alapvető célja: az öröklődés törvényszerűségeinek feltárása gének és géntermékek biológiai funkciójának meghatározása Eszköztára: funkció elrontása - mutagenezis szerkezet (információ) meghatározása - szekvenálás
Orvosi Nobel díj, 2002 Sydney Brenner
„I almost forgot to say that genetics will disappear as a separate science because, in the 21st century, everything in biology will become gene-based, and every biologist will be a geneticist.” Sydney Brenner
Funkcionális megközelítés: gének funkciójának megváltoztatása – genetikai boncolás
I.
mutáns analízis (forward genetika és reverse genetika) -gene knock out (génkiütés – deléciók) -transzpozonok -fenotípusos elemzés (mutant screens)
II. RNS interferencia - géncsendesítés (reverse genetika) (gene knock down)
Klasszikus (forward) genetika: mutáns fenotípus Fordított (reverse) genetika: gén
gén
biológiai funkció (fenotípus)
feltétele: genomi szekvenciák ismerete
A reverse genetikai világ alapja – genomika (teljes genom szekvenciák ismerete)
humán genom (23 pár kromoszóma)
DNA: the molecule of life
DNA sequence
Genome analysis
Reverse genetika
PCR primerek A, Duplaszálú RNS (géncsendesítés) B, Random mutagenezis, deléciós allél izolálása PCR-alapú (a kisebb fragment preferáltan amplifikálódik)
Mutánsok elemzése a mutagenezis korszaka előtt – Morgan iskola Spontán mutánsok izolálása fáradságos munkával Morgan csoportjában.
Thomas Hunt Morgan Orvosi Nobel díj, 1933
Vad típus. Piros szemű (w+) Fehér szemű mutáns (w-)
Drosophila morfológiai mutánsok
Vad típus
Mutációk indukálása: Hermann Muller, a mutagenezis atyja
mutagenezis a gén genetikai természete Muller’s morphs: Amorph (null) Hypomorph (redukált) Hypermorph (túlaktivált) Antimorph (domináns-neg.) Neomorph (új funkció)
Hermann J. Muller Orvosi Nobel díj, 1946
Mutációk típusai működés szerint Amorf: a funkció teljes elvesztése – „genetic null” – deficienciával szemben nem javít (klasszikus loss-of-function)
a k i t
Hipomorf: részleges funkcióvesztés (reduction-of-function)
e n e G
Hipermorf: funkciónyeréses mutációk (gain-of-function), sokszor a szabályozó régióban hiperfunkció vagy ektopikus expresszió (olyan sejtekben is, ahol normálisan nem expresszálódnak sokszor domináns) Antimorf: a mutáció ellentétesen hat a vad típusú alléllel – dominánsnegatív mutációk Neomorf: a vad típusú alléltól teljesen eltérő új funkció alakul ki
Muller morfok: amorf mutációk Teljes funkcióvesztés (loss-of-function) – genetikai null mutáció Vad típus
homozigóta vad
Vad típus
heterozigóta
mutáns
homozigóta mutáns
Általában recesszív, néha domináns (ilyenkor haploinsufficient)
Muller morfok: hypomorf mutációk Részleges funkcióvesztés (reduction-of-function) Vad típus
homozigóta vad
Vad típus
heterozigóta
mutáns
homozigóta mutáns
Weak vagy leaky allél. A legtöbb báziscsere (szubsztitúció) ezt okozza.
Muller morfok: hypomorf és amorf (null) mutációk a white lókuszban Homozigóta!
Homozigóta!
White+/+
White-/-
White-/-
White+ (vad)
White hypomorf
White amorf
Muller morfok: hypermorf mutációk Funkciónyeréses (gain-of-function) mutációk Vad típus
homozigóta vad
mutáns
heterozigóta
mutáns
homozigóta mutáns
Muller morfok: hypermorf mutáció a white lókuszban
White+/+
White+
White+/-
White hypermorf
Mutációk általában a gén szabályozó régiójában (ektopikus expresszió) vagy a fehérje funkcionális doménjében (onkogenikus mutációk - pl. nem tud foszforilálódni)
Muller morfok: fenotípusok palettája
Funkciónyeréses
White gf/gf hypermorf
Funkcióvesztéses
White+/+ Vad típus
White+/-
White-/-
hypomorf
amorf
Muller morfok: antimorf mutációk Az antimorf allél terméke interferál a vad típusú fehérjével (pl. dimerizálódnak, és így a vad termék kititrálódik) Vad típus
homozigóta vad
mutáns
heterozigóta
mutáns
homozigóta mutáns
Már heterozigóta állapotban is megnyilvánul a mutáns fenotípus: domináns negatív mutáció
Muller morfok: antimorf mutáció a white lókuszban
Vad típus
mutáns
mutáns
White+/+
White+/-
White-/-
Homozigóta vad
Heterozigóta!
Homozigóta mutáns!
Domináns negatív
Antimorf mutációk felismerése
hypomorf
White+/+
White+/-
White-/-
White+/+
White+/-
White-/-
amorf
antimorf
Már heterozigótában is!! White+/+
White+/-
White-/-
Muller morfok: neomorf mutációk A neomorf allélek új funkciót adnak a fehérjének.
Vad típus
homozigóta vad
Vad / mutáns)
heterozigóta
mutáns
homozigóta mutáns
Muller morfok: neomorf fenotípus Pl. az Antp (Hox) gén ektopikus expressziója az antennát lábbá transzformálja (homeotikus mutáció). Vad morfológia
Antennapedia mutáns
láb
antenna
Antp+/+
Antp+/D
A mutagenezis célja: génjeink funkciójának megismerése Egyedfejlődésünk feltérképezése.
A mutagenezis célja: génjeink funkciójának megismerése Honnan jövünk ...
… és merre tartunk?
Az ember, mint genetikai modell rendszer?
Nem: hosszú generációs idő kicsi egyedszám (egy keresztezésből) nem mutagenizálható nem keresztezhető szabadon …
Valójában igen: szekvenálási hatékonyság természetes mutagenezis (betegségek) mutáns bankok (kórházakban) családfák (CEPH családok, LOD analízis)
Megoldás: genetikai modell szervezetek
Bakétriumok Élesztő (egysejtű) Caenorhabditis elegans (fonalféreg) Drosophila melanogaster (rovar) Danio rerio (hal) Mus musculus (emlős) Arabidopsis thaliana (növény)
Génfunkciók és az egyedfejlődés alapvető kérdéseinek tanulmányozása genetikai modell szervezeteken
Caenorhabditis elegans
e n e G
a k i t
Drosophila melanogaster
Mus musculus
… és természetesen
Arabidopsis thaliana
A fonalféreg Caenorhabditis elegans
A C. elegans kutatások kezdete…
e n e G
a k i t
Frontvonalak: idegrendszer működése egyedfejlődés szabályozása
Brenner levele a Nobel-díjas Max Perutz-hoz, az MRC igazgatójához
e n e G
a k i t
C. elegans, mint genetikai modell rendszer
Előnyök: 1. Laboratóriumban könnyen fenntartható (agar tartalmú Petri lemezeken) 2. Egyszerű anatómia (959 testi sejt, 302 neuron. Transzparens test!!!) 3. Kis testméret (1.2 mm) 4. Nagy egyedszám (250 utód generációnként) 5. Gyors életciklus (kb. 3 nap 25 °C-on) 6. Speciális szexuális dimorfizmus: önmegtermékenyítő hímnősek (hermafroditák) és hímek. A hímnősek a tiszta genetikai vonalak fenntartását (nincs hímekkel történő keresztezés), a hímek a genetikai vonalak kombinálást (pl. kettős mutánsok előállítása) teszik lehetővé.
Fenntartás
A C. elegans törzsek lefagyaszthatók Spontán háttérmutációk kiküszöbölése.
A C. elegans 3 napos életciklusa Aging modell
Morfológiai mutáns fenotípusok
vad
small
dumpy
long
Az embrió burka (egg shell) átlátszó: fénymikroszkóp segítségével az egyedfejlődés nyomon követhető Genetikai vizsgálatok egyedi sejtszinten (at the single-cell level)
Blasztoméra képződése
e n e G
a k i t
C. elegans egyedfejlődése – konzervált sejtleszármazás
Orvosi Nobel díj 2002
Invariáns sejtvonal
5.30, 6.10
Apoptózis (programozott sejthalál) genetikai útvonala
Robert Horvitz Nobel price, 2002
Egyszerű idegrendszer (302 neuron)
Az idegrendszer elektronmikroszkópos (sorozat)metszete
The mind of the worm
Idegrendszer-specifikus fehérjék expressziója in vivo
Az elsőként megszekvenált soksejtű genom – mérföldkő az emberi genom megismerése felé
Cosmid klón
„Kicsi” genom: 100 Mbp
Genom annotálás: ORF-ek (open reading frame) meghatározása
Splice variánsok
Genetikai transzformáció: instrumentumok mikroinjektor
génpuska
Géntranszfer C. elegans csíravonal prekurzor sejtekbe
Expressziós analízis Mikor (az egyedfejlődés mely stádiumában) és hol (mely sejtekben) fejeződik ki egy gén.
GFP: green fluorescent protein
Expressziós vektor
Expressziós konstrukciók
RE (restrikciós enzim)
RE
ATG plazmid
RE
RE
STOP
promóter
plazmid GÉN (kódoló régió – STOP jel)
GFP
frame unc-54 3’ UTR
Minden génre megtervezhető – genom-szintű erőfeszítések. GFP analízis vs. antitest festés – melyik jobb? Transzkripciós fúziós rendszer Transzlációs fúziós rendszer – mutáns menekítés
GFP konstrukciók
GFP
Martin Chalfie Nobel price in chemistry, 2008
Aequorea victoria, medúza
GFP, CFP, YFP, RFP
GFP, CFP, YFP, RFP G: green C: cyan Y: yellow R: red
Neuronális GFP expresszió
Neuronális GFP-RFP expresszió
Ko-expresszió: sárga
daf-7
HSF-1 binding site Consensus: C. elegans: C. briggsae: C. remanei: C. brenneri:
GAANNTTCNNGAA AGAAGCTTCCAGAAAA CGGAGCTTCTAGAAAA GGAATTTTCTGGAAGT GGAAACTTCTAGAAGC
-278bp -284bp -317bp -247bp
-strand -strand -strand +strand
Kötőhely elemzés (irányított mutagenezis)
3,8 kb HSF-1 binding site
ATG
daf-7 pdaf-7::gfp pmutdaf-7::gfp
…TTCTGGAAGCTTCT… …TTCTGGAAGCTTCT…
pdaf-7::gfp
pmutdaf-7::gfp
wild-type
wild-type ASIs
hsf-1(-)
GFP
hsf-1(-)
A HSF-1 köt a daf-7 promóterhez (gátol). Mutáns promóterhez nem tud kötni: nem represszálja az expressziót.
Genomszintű géncsendesítés
Duplaszálú RNS specifikusan inaktiválja a szekvencia homológ endogén mRNS-t. Transzlációs gátlás vagy mRNS destabilizálás.
Öröklődő géncsendesítés
Zsíranyagcserét szabályozó gének genomi analízise C. elegansban
Vad típus
daf-2(-)
daf-2(-);daf-16(-)
daf-2
daf-16
Kevés lipid
Sok lipid
Kevés lipid Ruvkun és mtsi. Nature, 2003
Gének, melyek elhízást okozhatnak C. elegans gének
Humán ortológ biológiai funkciója
Drosophila melanogaster (gyümölcslégy – muslica)
A Drosophila életciklusa
A Drosophila embrió korai fejlődése
Szegmentáció és a sejtek szegment identitása az anteroposzterior tengely mentén korán kialakul
3 órás embrió
10 órás embrió
lárva
Imaginális diszkuszok
Korai egyedfejlődés - anyai hatású gének korai letalitás, embrió polaritása mRNS
bicoid
nanos
fehérje
Korai egyedfejlődést befolyásoló mutációk izolálása Recesszív anyai hatású mutációk „Screen” F3-ban!
„Screen” F2-ben!
A gap gének expressziós mintázata mutánsok
hunchback
Krüppel
knirps
Korai lárva letális mutációk: a Drosophila lárva szegmentális mintázatának defektusai
Homeotikus szelektor gének – Hox gének
Ko-linearitás
Emlős Hox clusterek
akár külön kromoszómákon Hox paralógok
A HOX fehérjék ko-faktorokkal válnak specifikussá (önmagukban nem tudnak specifikus szekvenciához kötődni) Ubx-Exd komplex
HOX ko-faktork: Extradenticle, PBX és Homothorax fehérjék
Az A/P szegmentációs mintázatot kialakító hiearchikus génkaszkád
Korai embrionális fejlődés
Ed Lewis
Christiane Eric Wieschaus Nüsslein-Volhard
1995 Nobel díj: A korai embrionális fejlődés genetikája
Transzformáció
érzőneuronok lárvában
UAS-Gal4 rendszer
dpp-Gal4, UAS-eyeless Gal4 élesztő transzkripciós faktor, ami a megfelelő DNS-szekvenciához köt a célgén promóterében (UAS – upstream activating sequence), és elindítja a génexpressziót.
In vivo UAS-RNSi könyvtárak
Eyeless RNSi
Flip rekombináz kötőhely
Szomatikus klónok
Atg8::mCherry, GFP Flip rekombináz CD2 kivágása: promóter meghajtja a gal4-et
a GAL4 meghajtja az UAS promóter mögé kapcsolt gént
Amelyik sejt zöld, abban van kikapcsolva egy adott gén. Kontroll az identikus környezet.
Atg2 RNSi
Zebrahal (Danio rerio)
Korai egyedfejlődés
“A trópusi, édesvízi zebrahalat, a Brachydanio rerio-t, számos előnyös tulajdonsága miatt választottuk: a generációs ideje mindössze 3-4 hónap; a felnőtt nőstények heti rendszerességgel több száz ikrát raknak, amelyek gyorsan és szinkronban fejlődnek az anyán kívül; a hal kicsi (3 cm), szívós és könnyen tartható. A 7 napos, szabadon úszó halak mindössze néhány milliméter hosszúak, de már a kifejlett egyedek számos morfológiai és viselkedési bélyegét mutatják. Mindez lehetővé teszi a mutációk nagy léptékű szűrését. Mivel a normális fejlődés 25 és 31°C fok között zajlik, lehetőség nyílik hőmérsékletérzékeny mutációk izolálására is.“ Nature (1981) 291: 293-296.
Keresztezési stratégia
Átlátszó
In situ hibridizáció
Fluoreszcens immunfestés
Idegsejt-aktivitás detektálása in vivo Ca2+ szenzitív festékekkel
Géncsendesítés - morfolino
Regenerációs modell
Atg8:GFP
Regenerációs modell
Expressziós analízis
CRISPR RNS-vezetett Cas9 nuclease genom engeneering
Ismétlés: forward genetikai analízis Genomi szekvencia ismerete - targetálás Gene knockout-ot (deléciós mutációk) létrehozása bármely génre A célgén
Marker gén
X: rekombináció
határoló szekvenciák Cre rekombináz A deléció
Eredménye Generation of the Ripply3 knockout mouse.
deléció
mRNS szint
Dystrophin gén KO (kiütött) egér
Dystrophin gén mutáns ember: Duchenne muscular dystrophy
Izom degeneráció dys gén: X-kapcsolt 1:3600 halálos
GFP analízis - génexpresszió
