A postmenopausalis és glükokortikoid indukálta csontvesztés genomikai hátterének vizsgálata Doktori tézisek
Kósa János Pál Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Dr. Speer Gábor egyetemi adjunktus, Ph.D.
Hivatalos bírálók:
Dr. Bálint B. László, egyetemi tanársegéd Ph.D. Dr. Várbíró Szabolcs, egyetemi tanársegéd Ph.D.
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Sasvári Mária egyetemi tanár, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Korányi László főorvos, D.Sc. Dr. Kiss Csaba főorvos, Ph.D.
Budapest 2009.
BEVEZETÉS A primer és szekunder csontvesztés hátterében álló komplex genetikai hatások még teljes egészében nem tisztázottak. Tudjuk, hogy a menopausat követő ösztrogén hiányos állapotban gyorsul a remodeling, fokozódik a gyulladást mediáló citokinek expressziója. Jelenlegi ismereteink alapján a glükokortikoidok többféle módon is befolyásolják a csontképződést, elsősorban az osteoblastok funkciójának gátlásán keresztül.
Azonban
a
fent
említett
mechanizmusok
pontos
genomikai
és
transzkriptomikai okait nem ismerjük. A felnőttkori csontélettanra a remodelling folyamata jellemző, amely a felnőtt, érett csont folyamatos átépülését jelenti. A remodelling során a csontformáció és reszorpció térben és időben szorosan kapcsoltan zajlik és egészséges szervezetben a két folyamat intenzitása megegyezik. A felnőtt szervezet tehát – ideális esetben – tartani tudja csúcs-csonttömegét, miközben a folyamatos remodelling következtében a teljes vázrendszer megújul. A szerves és szervetlen állomány képzése több szinten szabályzott folyamat. A csontállomány termelése és bontása végeredményben a csontsejtek, az osteoblastok, az osteoclastok és az osteocyták jól összehangolt együttműködésének köszönhető. A csontszöveti remodelling összehangoltan működik (coupling), ha a csontbontás és építés mértéke megegyezik. Az összhang felbomlásakor (uncoupling), a túlzott reszorpció következtében nem marad elegendő csontgerenda, melyre új csont rakódhat, vagy az osteoblastok nem képesek teljesen kitölteni a reszorpciós gödröket. A folyamat a csont ásványianyag-tarlamának egyre nagyobb mértékű megfogyatkozásához és végül csontritkulás kialakulásához vezethet. A csontanyagcserét szabályozó molekulák és jelátviteli rendszerek közöl elsősorban
a
csont
élettani
folyamatainak
szabályozásában
kulcsfontosságú
RANK/RANKL/OPG rendszert emelnénk ki. Az NF-κB receptor aktivátor molekula ligandumát (RANKL) az osteoblast-vonal sejtjei és aktivált T-sejtek is termelik. A RANKL elősegíti az osteoclast képzést, fúziót, differenciációt, aktivációt és túlélést, ezzel is a csontreszorpció, és a csontvesztés irányába hatva. A RANKL specifikus receptorát, a RANK-ot (NF-κB receptor aktivátor molekula) stimulálja, amely korlátozott számú sejttípusban (progenitor és érett osteoclastok, myeloid-eredetű
2
dendritikus sejtek) expresszálódik. A RANK aktiváció a c-Jun, NF-κB, Akt/PKB útvonalakat is magába foglaló intracelluláris kaszkád beindulásához vezet. Az osteoprotegerin (OPG) RANKL szolubilis, a jelátvitelben szerepet nem játszó receptora. A remodelling során kiemelt jelentősége van a szöveti RANKL/OPG hányadosnak. Amennyiben az OPG expresszió csökken, vagy a RANKL expresszió megnő, a csontbontás fokozódik, a remodelling egyensúlya a reszorpció irányába billen. A csont morfogenetikus proteinek (BMP) a transzformáló növekedési faktor β (TGFβ) polipeptid szupercsalád tagjai. A csont morfogenetikus fehérjék számos extraszkeletális
szövetben
expresszálódnak,
de
a
csontszövet
szempontjából
legfontosabbak a BMP-2, -4, -6, és -7 molekulák. Alapvető funkcióik közé tartozik a mesenchymalis sejtek differenciálása az osteoblastikus vonal irányába, elősegítve az osteoblastikus érést és működést. Egyéb lokálisan ható, a postmenopausás csontvesztésben jelentős szerepet játszó, az osteoblastok által termelt interleukin-1 kettős hatású molekula. Egyfelől serkenti az osteoblastok kollagéntermelését, másfelől részben közvetlenül, részben a reszorpciót fokozó interleukin-6
expressziójának és hatásának erősítésével az osteoclastokat
aktiválja. Az IL-6 nagyon erős reszorpciós hatású molekula, és ezt jól példázza, hogy IL-6 illetve IL-1 hiányos egerekben még ovariectomia hatására sem alakul ki csontritkulás. Az interleukin-11 szintén az osteoclastok működését serkenti. A tumor nekrózis faktor mindkét sejtre serkentő hatású, tehát a teljes remodelling folyamatát fokozza. Kutatásaink másik fő iránya a glükokortikoid indukálta csontvesztés molekuláris biológiai hátterének megértése volt. A csontvesztés másodlagos okok miatt (egyéb endokrinológiai, gasztroenterológiai hematológiai betegségek, vagy gyógyszerek) is kialakulhat, ekkor szekunder osteoporosisról beszélünk. A szekunder csontritkulás egyik leggyakoribb oka a gyógyszer indukálta - és ezen belül is a glükokortikoid indukálta, - csontvesztés. Mivel a glükokortikoidok alkalmazása széleskörű, rendkívül sok indikációjuk van. Napjainkban a nyugati felnőtt lakosság közel 1%-a orális glükokortikoid kezelés alatt áll, ezért számos betegséghez kapcsolódhat másodlagosan csontvesztés. A glükokortikoid indukálta csontvesztés pathogenesise komplex és multifaktoriális. A glükokortikoid indukálta csontvesztés celluláris mechanizmusa egyelőre részlegesen ismert. Hosszú glükokortikoid kezelésben részesülők vizsgálata
3
csökkent csont-turnovert és csökkent csontképzést igazolt. A glükokortikoid kezelés a csontmátrixban és a csontösszetételben is változást eredményezhet, ami meghatározza a csont törékenységét és a törések kockázatát. A postmenopausas csontvesztésben a trabekuláris csonttérfogat csökkenése a csontreszorpció fokozódásának eredménye lehet, ezzel ellentétben ez a jelenség a glükokortikoid indukálta csontvesztés esetében a csökkent csontképzés miatt van. Több más tényezőknek is szerepe van a glükokortikoid indukálta csontvesztés létrejöttében, ilyenek pl. a kalcium háztartás szabályozásának változása és szex-hormonok. A glükokortikoid használat következtében csökken a bélben a kalcium felszívódás és csökken a vesében a kalcium tubularis reabszorpciója is. Elmondható, hogy a glükokortikoid indukálta csontritkulás a csont és kalciumháztartásra kifejtett közvetlen és közvetett hatások összegeként jön létre. Mára már közismert, hogy az immunrendszer és a csontrendszer funkcionális kapcsolatban áll egymással. Sejtalkotóik a csontvelői mikrokörnyezetben interakcióba lépnek és különböző citokinek termelésén illetve jelátviteli mechanizmusokon keresztül részt vesznek egymás szabályozásában. A menopausat követő nemi hormon hiány mind a csontszövet, mind az immunrendszer élettani folyamatait közvetve és közvetlenül egyaránt befolyásolja, megváltoztatva ezzel komplex kölcsönhatásukat. Többek között postmenopausas korban szignifikánsan fokozódik a gyulladásos citokinek (interleukin1, interleukin-6, tumor necrosis faktor) expressziója, amely az aktivált T limfocitákon serkenti a RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) kifejeződését és ezáltal a csontbontó osteoclastok érését, aktivitását. Vizsgálatainkban célunk volt postmenopausas nemi hormonok hiányában szignifikánsan változó csontszöveti expressziót mutató gének meghatározása, illetve néhány új kandidáns génben található egypontos nukleotid polimorfizmus azonosítása postmenopausalis nőkben. Egy aktív glükokortikoid analógnak, a dexametazonnak (DEX) az osteoblastok életképességére és a csontfejlődésben szerepet játszó gén kifejeződésére
gyakorolt
hatásának
vizsgálata.
Továbbá
az
immunrendszer
szabályozásában központi szerepet betöltő gének expressziós mintázatának analízise postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus csontszövetekben.
4
CÉLKITŰZÉSEK I. A postmenopausas csontvesztés transzkripciós és genomikai szintű molekuláris genetikai vizsgálata I/a. Postmenopausas nőkből izolált csontszövet minták komplex génexpressziós profil meghatározása Célunk a csontanyagcserében és a csont homeosztázisában nélkülözhetetlen szerepet játszó, előre leválogatott közel 150 kandidáns gén menopausat követő csontszöveti mRNS expressziós mintázatának vizsgálata ABI 7500 kvantitatív valósidejű RT-PCR rendszerben TaqMan Assay felhasználásával. I/b. Postmenopausas nőkből izolált csontszövet minták immunológailag releváns génexpressziós profiljának meghatározása Különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gének eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausas nőkben, osteoimmunológiai megközelítésben. I/c. Postmenopausas nők egypontos nukleotid polimorfizmusainak vizsgálata Célunk
új
kandidáns
gének
egypontos
nukleotid
polimorfizmusainak
feltérképezése 353 magyar postmenopausalis nő genetikai mintájában. Annak vizsgálata, hogy a szarvas modellben azonosított és a humán mintákon validált, a csontritkulás pathomechanizmusában potenciális szereppel bíró gének allélikus variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra.
II. A glükokortikoid indukálta csontvesztés in vitro génexpressziós hatásai osteoblast sejteken Egy ismert glükokortikoid analóg, a dexametazon a csont fejlődésében, életképességében szerepet játszó gének expressziójára kifejtett hatásának vizsgálta immortalizált egér csontsejtvonal (MC3T3-E1) és egér calvariából izolált osteoblastok felhasználásával. A feltételezhetően szerepet játszó gének további vizsgálata fehérjeszinten és géncsendesítési (gén knock-down, siRNA) kísérletekben.
5
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 1. Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők vizsgálati csoportja A postmenopausas nem osteoporotikus csoportban (POST csoport) 10 csontmintát elemeztünk, míg a kontrollként használt premenopausas nem osteoporotikus csoport (PRE csoport) 7 nő csontmintáját tartalmazta. A postmenopausalis nők életkorának medián értéke 55.00 év (tartomány: 47-57). A kontroll premenopausalis nők életkorának medián értéke 52.00 év (tartomány: 50-57). Nem találtunk szignifikáns különbségeket a vizsgált POST és PRE csoportok átlag életkorában, csont-ásványianyag tartalmában, dohányzását illetően, bevitt kalcium mennyiségében, alkohol és kávé fogyasztásában, fizikai aktivitásában, illetve nem részesültek semmilyen biológiai terápiában. Azonban erőteljes szignifikáns eltéréseket észleltünk a szérum ösztradiol szintekben (p = 0,0006) és a csontanyagcsere markereinek koncentrációiban, azaz; osteocalcin (p = 0,002) és beta-crosslaps (p = 0,01) értékek esetében a két vizsgálati csoport alkotó nők tekintetében. 2. Az egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) analízisek vizsgálati csoportja A polimorfizmus vizsgálatokhoz 353 magyar, független mintaválasztásból származó postmenopausalis stádiumú nő vérmintáját gyűjtöttük össze (5. táblázat). A kiválasztott nőkön a Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászati Klinikáján csontsűrűség mérés történt kettős energiájú röntgensugár - abszorpciometria (DEXA) segítségével. A BMD értékeket a lumbalis gerinc (L2-L4) és a teljes femur vonatkozásában Lunar Prodigy DXA készülékkel (GE Medical Systems, Diegem, Belgium), a radiust tekintve Norland pDEXA denzitométerrel (CooperSurgical Inc, Trumbull, CT, USA) határoztuk meg. A vizsgálatból kizártuk azokat a résztvevőket, akiknél endokrinológiai vagy egyéb krónikus betegségek gyanúja merült fel, illetve akik hormonpótló terápiában vagy egyéb olyan gyógyszeres kezelésben részesültek, amely befolyásolhatja a csontanyagcserét. Továbbá, nem kerültek bevonásra azok a személyek, akik szérum ALPL, TSH, PTH, 25-OH D-vitamin szintjében a normálértékektől eltérés volt tapasztalható. 3. Humán csontszövet minták izolálása A vizsgálatainkban felhasznált humán csontminták a diagnosztizált III. stádiumú primer osteoarthritist gyógyító műtétet szolgáló csípőizületi totál endoprotézis beépítésekor leforgácsolódott csontszövet darabok összegyűjtéséből származtak. A primer osteoarthritis minősítése az Amerikai Ortopédsebészeti Társaság (AAOS) ajánlásával a Kellgren-Lawrenceféle rendszer alapján történt. A gyűjtést követően a friss mintákat azonnal alaposan megtisztítottuk a csontvelőtől, illetve egyéb vérszennyeződésektől PBS felhasználásával, majd folyékony nitrogénben tároltuk. A vizsgálat a Semmelweis Egyetem Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága által jóváhagyva készült (SOTE-TUKEB 6392-1/2004-1018EKU, 6
SOTE-TUKEB 33/2008). Minden betegtől – részletes felvilágosítás után – írásos beleegyező nyilatkozatot is kértünk. 4. Direkt messenger RNS (mRNS) szeparálás csontszövetből A humán csontmintákat folyékony nitrogén alatt elporítottuk freezer-mill 6750 készülék segítségével. Az RNS izolálást Dynabeads Oligo (dt)25 kit felhasználásával végeztük. Ezután az mRNS-t 2 µl DN-áz I. enzimmel kezeltük. Az mRNS tisztítását a NucleoSpin RNA Cleanup kit segítségével a gyártó előírása szerint végeztük. A humán mRNS-t cDNS-re fordítunk át reverz transzkripció során, random primer és ribonukleáz inhibitort felhasználása mellett. 5. DNS szeparálás perifériás vérből A polimorfizmus meghatározásokhoz összegyűjtött 353 résztvevő EDTA-s vérmintájából genomiális
DNS-t
izoláltunk
Roche High
Pure PCR Template Purification
kit
felhasználásával. A tisztított DNS minőségét és mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel határoztuk meg, majd minden mintát 10 ng/µl DNS végkoncentrációra higítottunk. 6. A vizsgált gének kiválasztása a génexpressziós analízisekhez, kvantitatív valós idejű RT-PCR és a vizsgálati csoportok statisztikai összehasonlítása Kvantitatív valós idejű RT-PCR módszer alkalmazásával olyan kandidáns géneket vizsgáltunk melyek eltérő génexpressziós aktivitása szerepet játszhat a menopausat követően megváltozott csontszöveti anyagcsere-folyamatok kialakulásában. A kvantitatív real-time PCR-hez előre megtervezett és validált gén-specifikus TaqMan próba alapú génexpressziós Assayt használtunk az Applied Biosystemstől. A kiválasztott 147 gén amplifikálásához ABI Prism 7500 valós idejű PCR rendszert használtunk. 7. Gének és SNP-k kiválasztása a genomikai analízisekhez, genotipizálás Az SNP analízisekhez öt olyan, humán csontszövetben expresszálódó gént (ALPL, MMP2, TIMP2, FGFR1, FABP3) választottunk, amelyek vizsgálataink szerint is meghatározó szerepet tölthetnek be a csontanyagcserében. A kiválasztott 21 SNP-kről elmondhatjuk, hogy az „in silico” kapcsoltsági adatok alapján a genotipizált SNP-k 29%, 80%, 64%, 41% illetve 55%-os mértékben reprezentálják az ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2 és TIMP2 gének (és upstream illetve downstream nem kódoló régióik) összes allelikus variánsát r2>0.8 valószínűséggel. 8. Többváltozós transzkriptomikai adatelemzések A nagyszámú vizsgált gén illetve SNP egyes mintacsoportokkal összefüggéesit hagyományos statisztikai adatelemzések mellett többváltozós (multiparametrikus) elemzésekkel is vizsgáltuk. A diszkriminancia elemzés (Discriminant Function Analysis, DFA) segítségével egyes eleve megadott géncsoportok közötti elválások maximalizálhatók, míg a A főkomponens analízis (Principal Components Analysis, PCA) egy standard technika, amely 7
széles körben alkalmazható az orvosbiológiai kutatásokban, különösen microarray és egyéb génexpressziós adattömegek statisztikai kiértékelésében. A módszer összegzi a multivariációs adatrendszereket néhány fontos, egymástól független és az eredeti adatstruktúrát jól tükröző dimenzióba, mely dimenziókat komponenseknek nevezünk. 9. A glükokortikoid indukálta csontvesztés vizsgálatához használt csontsejt kultúrák, sejt életképességi tesztek, kezelések Az in-vitro kísérletekhez egér calvariából izolált osteoblastokat és egér pre-osteoblast sejtvonalat, MC3T3-E1 sejteket használtuk fel. Jelen tanulmányban felhasznált konfluens MC3T3-E1 sejteket differenciált osteoblastoknak tekintettük mivel az osteocalcin (késői osteoblast differenciációs marker) jól mérhetően kifejeződött bennük. A dexametazon kezeléseket, sejtéletképességi vizsgálatokat és fluoreszcencia aktiválta áramlási citometria (FACS) méréseket a gyártók előírásai szerint alkalmaztuk. 10. Totál RNS preparálás egér sejtekből, mennyiségi valós idejű polimerizációs láncreakció és az adatok statisztikai értékelése A sejtekből totál RNS-t izoláltunk spin-column módszerű eljárással, Roche High Pure Total RNA Isolation System segítségével. A cDNS-sé átfordított mintákat triplikátunként vizsgáltunk ABI Prism 7500 real-time PCR rendszeren. A glükokortikoid indukálta csontvesztés expressziós vizsgálatához kiválogatott 110 gén expresszió adatainak a kiértékeléséhez hagyományos statisztikai módszereklet használtunk. 11. A BMP-8 fehérje Western blot analízise és siRNS kezelés alapú géncsendesítés Az MC3T3-E1 sejtekből western blot technika segítségével határoztuk meg a dexametazon kezelés hatására szignifikánssan megváltozó BMP-8 fehérje mennyiséget, míg a vizsgált fehérje funkcionális szerepét Ambion siRNS alapú géncsendesítéses vizsgálatokkal igazoltuk.
EREDMÉNYEK 1.
Postmenopausas
és
premenopausas
nem
osteoporotikus
nők
csontszöveti
génexpressziós mintázatának vizsgálata egyváltozós Mann-Whitney U teszt segítségével Hét kollagén molekula (COL2A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL12A1, COL15A1), három nem-kollagén típusú extracelluláris mátrix (ECM) molekula (MGP, BGLAP, FN1) és két szerves mátrix bontó enzim (MMP13, BMP1) génkifejeződési mintázata szignifikánsan nagyobb volt a postmenopausalis stádiumú nem osteoporotikus csontban. Postmenopausas nőkben a közös TGFB/BMP jelátviteli hálózatba tarozó öt gén (BMPR1A, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, SMAD4) nagyobb transzkripciós aktivitását észleltük. Ugyanebben a csoportban két nélkülözhetetlen osteoblast specifikus transzkripciós faktor (RUNX2, SP7) és újabb kettő, amely a Wingless útvonalban (TCF7L2) illetve a porcsejtek 8
érésében (SOX9) játszik szerepet, megnövekedett génexpressziós szintet mutatott. Két MAPK (mitogénaktivált protein kináz) kaszkád által szabályozott növekedési faktor génje (PDGFA, FGFR1), valamint két osteoclast stimuláló faktor (TNFSF11/RANKL, IL6) és egy, a differenciálódott osteoblastokat jelző molekula (ALPL) génátíródása is felerősödött a postmenopausas csoportban. 2.
Postmenopausas
és
premenopausas
nem
osteoporotikus
nők
csontszöveti
génexpressziós mintázatának vizsgálata többváltozós statisztikai analízisek segítségével Diszkriminancia adatelemzést (dfa) alkalmaztunk, hogy a postmenopausas és premenopausas csoportot multidimenzionális térben elkülönítsük a csontszöveti génexpressziós adataik alapján,
illetve
meghatározzuk
azokat
a
géncsoportokat,
amelyek
a
legnagyobb
diszkriminációs képességgel rendelkeznek. Az ER-béta által szabályozott gének csoportja rendelkezett a legnagyobb megkülönböztető erővel, amely egyértelműen szétválasztotta a post- és premenopausas csoportokat. Az ECM fehérjéket kódoló gének csoportja és a TGFB/activin/nodal szabályozási útvonalhoz kapcsolódó gének szintén erős korrelációt mutattak a kanonikus változóval és a vizsgált nem osteoporotikus nők két csoportjának határozott szétválasztását tették lehetővé. A növekedési faktorok és a BMP kaszkád génjei gyengébb elkülönítő erővel bírtak (1. ábra) POST PRE
BMP útvonal
WNT útvonal
TGFB/activin/nodal útvonal
Növekedési faktorok/MAPK útvonal
Lipid anyagcsere
ER-béta jelátvitel
ER-alfa jelátvitel
TGFB/BMP útvonal (p ≤ 0.05)
ECM (p ≤ 0.05) -12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1. ábra: Tíz postmenopausas nem osteoporotikus (POST, fekete rombusz) és hét premenopausalis nem osteoporotikus (PRE, üres rombusz) nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.
Főkomponens analízis alapján elmondhatjuk, hogy a premenopausas nők mérsékelt génexpressziós aktivitással jellemezhetők, ezért egy relatív kompakt csoportot képeznek az 1es és 2-es komponensek mentén negatív irányban (2.ábra).
9
Component 2
15 14 POST07 13 12 11 10 9 8 7 POST01 6 5 POST04 PRE01 4 3 POST02 POST08 POST03 2 1 POST10 0 POST11 PRE05 -1 POST06 -2 PRE06 PRE02 -3 PRE07 PRE04 -4 -5 -6 -7 PRE03 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Component 1
POST05
10
12
14
16
2. ábra: A PCA diagramon a 17 vizsgált nő pozíciója látható a két főkomponens mentén.
A csontszöveti komplex génexpressziós mintázat alapján a postmenopausalis és premenopausalis fenotípusok elkülönülnek egymástól. A nagyon hasonló transzkripciós aktivitással rendelkező premenopausas nők (fehér PRE) egy diszkrét csoportot képezve elválnak a postmenopausas (fekete POST) nőket magában foglaló halmaztól. 3. Az immunrendszer működését szabályozó gének expressziós változásainak valós idejű RT-PCR vizsgálata postmenopausas csontszövetben A 3. ábrán mutatjuk be a szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató 9 gén expressziós változására vonatkozó adatait (RQ POST / RQ PRE) 17 nem osteoporotikus nő csontszövetében.
10
1000,00
POST PRE
GAPDH-hoz viszonyított relatív génexpresszió
100,00 10,00 1,00 0,10 0,01
FS F1 1
FB 3
TN
TG
AM
IT G
IL -6
0 IL -1
LA -A
86
H
CD
14 CD
C 3
0,00
3. ábra: Szignifikánsan megváltozott expressziós mintázatot mutató 9 gén mRNS-ének relatív mennyisége 10 postmenopausalis (fekete oszlop) vs. 7 premenopausalis stádiumú nem osteoporotikus (szürke oszlop) nő csontszövetében log skálán feltüntetve.
Hat, különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gén ötszörös illetve annál nagyobb mértékben megnövekedett expressziós mintázattal rendelkezik a postmenopausas csontban. A transzkripció fokozódásának mértéke a postmenopausas csontban a premenopausas nem osteoporotikus csontszövethez viszonyítva a C3 esetén 5,15szoros, a CD86 esetén 5,91-szoros, az IL-10 esetén 6,97-szoros, az IL-6 esetén 6,43-szoros a TGFB3 esetén 3,34-szoros, a TNFSF11 esetén pedig 18,49-szoros volt (10. ábra). Három gén kifejeződése csökkent postmenopausalis állapotban. A represszió mértéke a CD14 esetén 18,32-szoros, a HLA-A esetén 8,69-szoros, végül az ITGAM esetén pedig 5,63-szoros volt. Az immunológiailag releváns gének közül DFA kiértékelés alapján a legerőteljesebb diszkriminációs hatás a T-limfociták működésében, és annak szabályozásában szerepet játszó gének esetén volt azonosítható, mely génhalmaz élesen elválasztotta a POST és PRE csoportokat (4. ábra).
11
- POST - PRE
9 7 5 3 1 -1 -3 -5 -7 -9 -11 -13
T sejt aktiváció Gén CD86 TNFSF11 IL-10 CD40 IFNG IL-6
Korr. KV. 0.579 0.564 0.519 0.442 0.334 0.288
B sejt aktiváció Gén
IL-1B
0.226
CD86 IL-10 CD40 IFNG IL-6 TGFB1 HLADRB1
TGFB1 TNF HLADRB1 CD80 IL-7 IL-12A HLA-A
0.139 0.138
CD80 IL-7
Korr. KV. 0.638 0.572 0.487 0.368 0.317 0.154 -0.069
Gyulladási reakció Gén ICAM1 IL-12A IL-8 TNF IL-1B IL-6 IFNG
Korr. KV. 0.570 0.453 -0.104 -0.192 -0.315 -0.401 -0.465
-0.140 -0.337
-0.062 -0.127 -0.306 -0.326 -0.664
Komplementrendszer Gén C3 IFNG IL-6 IL-1B TNF C5R1
Korr. KV. 0.529 0.364 0.330 0.254 0.154 -0.003
Fagocitózis Gén TLR4 SCARA3 FCGR2A ITGAX VCAM1 ICAM1
Korr. KV. 0.469 0.344 -0.010 -0.118 -0.129 -0.474
ITGAX
-0.114
ITGAM
-0.515
C1QA ITGAM
-0.453 -0.500
ITGB2 CD14
-0.544 -0.614
ITGB2
-0.528
Antigén prezentáció Gén CD86 TNFSF11 CD40 IFNG TNFRSF11 IL-6
Korr. KV. 0.585 0.569 0.446 0.337 0.330 0.291
IL-1B HLADRB1 VCAM1
-0.063 -0.113
0.229
CD80 IL-12A ICAM1 HLA-A
-0.128 -0.329 -0.414 -0.670
4. ábra: Tíz postmenopausalis (POST, fekete vonal) és hét premenopausalis nem osteoporotikus (PRE, fehér vonal) és nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.
4. Új génpolimorfizmusok összefüggése a postmenopausalis csontvesztéssel
A SNPstream genotipizálási módszer technikai pontossága 100%-os volt vizsgálatunkban, azaz a párhuzamosan genotipizált minták eredményeiben nem volt eltérés. A végső adatbázisunk tehát 21 SNP genotípsuát és 353 személy adatait tartalmazta (összesen 7413 validált genotípus eredmény). Az FGFR1-ben található rs6996321 SNP szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbalis BMD-vel (a mean BMD±S.E.M. 0,858±0,013; 0,912±0,015 és 0,916±0,029 a G/G, A/G és A/A genotípusok esetén).
A korrigált BMD értékek
szignifikáns különbséget mutattak a domináns genetikai modellben (a korrigált BMD különbségek
-0,031±0,011 és 0,031±0,011 g/cm2 voltak a G/G és a A/G+A/A csoportok
esetén, p=0,002) (12. ábra). A FABP3-ban található rs10914367 polimorfizmus homozigóta recesszív genotípusa szignifikánsan magasabb BMD-t eredményezett a teljes femur tekintetében (a mean BMD±S.E.M. 0,783±0,009; 0,776±0,028 és 0,945±0,029 volt a G/G,
12
A/G és A/A genotípusokban, míg a korrigált BMD különbségek a recesszív modellben 0,004±0,008 és 0,143±0,037 voltak a G/G+A/G és az A/A csoportokban, p=0,028) (5. ábra). rs10914367 (p=0,028)
rs6996321 (p=0,002)
0.20
Korigált femur BMD
Korrigált lumbális BMD
0.050
0.025
0.000
-0.025
-0.050
G/G n=166
0.15 0.10 0.05 0.00 -0.05
A/G + A/A n=187
G/G + A/G n=342
A/A n=11
5. ábra: Egyedi SNP-k összefüggése a csontdenzitással.
5. A glükokortikoid indukálta csontvesztés in vitro vizsgálata, sejtéletképesség
Az egér osteoblast sejtekeket különböző koncentrációjú dexametazon (DEX) mellett tenyésztettük 1-48 órán keresztül. A sejtéletképességet meghatározva 1,1 ± 0,8 nM EC50 értéket kaptunk MC3T3-E1 és 3,7 ± 2,3 nM calvaria osteoblast sejtek esetében. A FACS és a konfokális lézer scanning mikrószkópos eredmények alapján apoptotikus sejthalált igazoltunk. 6. A DEX hatása a génexpressziós profilra MC3T3-E1 és calvaria osteoblastokon
A DEX transzkripció moduláló hatását egymással párhuzamosan növesztett, DEX kezelésben részesült és kezeletlen sejtkultúrák eredményeinek összehasonlításával vizsgáltuk. . A 110 vizsgált gén közül az MC3T3-E1 sejteken 5, míg calvaria sejteken 6 mutatott szignifikánsan megváltozott kifejeződést. Ezek közül 5 gén azonos volt a két osteoblast típus esetében, de találtunk egy génterméket a calvaria sejteken, amit nem sikerült detektálni az immortalizált sejtvonalon (1. táblázat). 1. táblázat: Hat, calvaria sejteken szignifikáns génexpresszió változást mutató gén
0,1 µM/16 óra DEX kezelés hatására. Gén szimbólum BMP-4 BMP-8 COL2A1 COL9A1 MMP2 Smad3
Calvaria osteoblast Átlag SD P érték 1,39 0,11 0,03 14,72 2,42 0,00 0,55 0,12 0,04 1,71 0,19 0,01 1,42 0,15 0,04 0,43 0,05 0,03
13
MC3T3-E1 sejtvonal Átlag SD P érték 1,95 0,14 0,02 51,46 3,84 0,00 0,66 0,11 0,02 n/a n/a n/a 2,16 0,19 0,01 0,36 0,01 0,00
A mennyiségi valósidejű RT-PCR eredményeket a kezelten kontroll sejtek eredményeire normalizáltuk és arányként jelenítettük meg.
Kísérleteinkben két nagyságrendbeli emelkedést tapasztaltunk a BMP-8 mRNS esetében 16 órás DEX kezelés eredményeképpen. A DEX mindkét osteoblast típusú sejt esetében idő és koncentrációfüggő BMP-8 kifejeződés változást indukált (6.ábra) a BMP-8 géntermék fehérje szintű emelkedését western blottal igazoltuk. a,
b,
60
90 80
50
40 Calvaria
30
MC3T3-E1
20
mRNS kifejeződés (a.u.)
mRNS kifejeződés (a.u.)
70 60 50
Calvaria
40
MC3T3-E1
30 20
10 10
0
0
UTC
30m
1h
3h
5h
24h
UTC
1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M
6. ábra: BMP-8 mRNS relatív expressziója osteoblast sejteken. Az a panelen az időfüggő BMP-8 expresszió változásokat láthatunk (0,1 µM DEX). A b panelen a koncentráció BMP-8 expresszió változásokat láthatunk (16 óra). A BMP-8 relatív expressziókat GAPDH kifejeződésre normalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk (a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak. A szignifikancia értékeket az adott minta és az UTC között számoltuk (*: P < 0,05, **: P < 0,01).
7.
A
BMP-8
gén
kifejeződésének
gátlása
/
géncsendesítés
siRNS
rendszer
felhasználásával, funkcionalitás bizonyítása
Kimutattuk a BMP-8 specifikus mRNS 9,7-szeres csökkenését 24 órás 1 nM DEX kezelést követően siRNS módszerrel (7. ábra). Ez a 89%-os BMP-8 specifikus géncsendesítés szignifikánsan növelte az MC3T3-E1 sejtek pusztulását a kontrollhoz képest. A 24 órás DEX kezelés hatására bekövetkező sejthalál 6,9%, 10,8% és 21,9%-ról 11,0%, 32,6% és 38.7%-ra növekedett 1, 10, 100 nM DEX jelenlétében a géncsendesítés eredményeként.
14
*
50
* Cell death (%)
40 negative control siRNA
30
Bmp-8 siRNA 20 10 0 1
10
100
DEX concentration (nM)
7. ábra: BMP-8 gén specifikus géncsendesítése fokozza a DEX indukálta sejthalált MC3T3-E1 sejteken. A különdöző DEX koncentrációk mellett előkezelt sejteket BMP-8 specifikus (■) és negatív kontroll (□) siRNSekkel transzfektáltuk 20 nM koncentrációban / 48 órát. (*: P < 0,05)
KÖVETKEZTETÉSEK Az postmenopausas csontvesztést befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai tényezők egymással való kapcsolata teljes egészében nem ismert. Az egyes gének, génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban. A menopausat követő multifaktoriális változások hátterében poligénes hatás és az egyes gének egymással való interakciója valószínűsíthető.
• Vizsgálatunkba a postmenopausalis és premenopausas nők csontszövetében szignifikánsan
eltérő
génexpressziós
mintázatot
mutattunk
ki.
A genetikai
adatelemzésben új megközelítési módok, ill. statisztikai rendszerek alkalmazása (DFA, PCA) lehetővé tették számos olyan új gén, illetve géncsoport azonosítását, amelyeket a menopausa csontra kifejtett hatásaival eddig még nem hoztak összefüggésbe. A transzkripciós hálózatban megfigyelt változások tovább segíthetik az ösztrogén hiányában módosuló csontanyagcsere folyamatok megértését. •
Kimutattuk a postmenopausalis csont immunológiai szempontból meghatározó transzkriptomikai
eltéréseit
megkülönböztettük
a
és
a
genetikai
postmenopausalis
és
adatok
alapján
premenopausalis
egyértelműen fenotipusokat.
Azonosítottunk olyan, az immunrendszer működéséhez szorosan kapcsolt géneket, amelyek
markánsan
megváltozott
kifejeződése
postmenopausalis csontvesztés vonatkozásában. 15
eddig
nem
volt
ismert
a
•
Kutatómunkánk során néhány gén – ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2 – polimorfizmusainak összefüggését vizsgáltuk a postmenopausalis csontvesztéssel. Az öt gén új kandidánsként szerepelhet a további humán vizsgálatokban, mivel az ortológ-modell, a szarvas-agancsképzés kapcsán kerültek először látóterünkbe, génexpressziós változásaikat humán csontszövetben is leírtuk. Régóta tudjuk, hogy a tartós, szisztémás glükokortikoid kezelés egyik jelentős
mellékhatása a csontvesztés. Az elöregedő, jelentős gyógyszer felhasználó civilizált társadalmak számára minden tekintetben fokozódó problémát jelentenek a csontrendszer megbetegedései. Az ezekben szenvedő emberek száma emelkedik, azonban a pontos okokozati
összefüggésekről,
lezajlásuk
lépéseiről
nagyon
kevés
információ
áll
rendelkezésünkre. Munkánk során a nyugati felnőtt lakosság jelentős részét érintő szteroid okozta
csontvesztés
a
megnövekedett
glükokortikoid
mennyiség
hatására,
a
csontanyagcserében szerepet játszó gének kifejeződésében bekövetkező változásokat kerestünk. •
Eredményeink azt mutatják, hogy a GC terápia egyértelmű génexpressziós profil változást eredményez olyan gének esetében is, amelyek jelentős szerepet játszanak a csontfejlődésben és a remodellingben aktívan résztvevő csontsejtek működésében. Ezek a változások csökkent csontképződés és növekedő csontbomlás irányába mutatnak, amelyek a csonttömeg csökkenéséhez vezetnek.
•
A csontmetabolizmusban új szereplőnek számító BMP-8 kifejeződésében bekövetkező markáns változások vélhetően további kutatásokat indukálhatnak, amelyek jelentősen hozzájárulhatnak a glükokortikoid indukálta csontvesztés pathomechanizmusának jobb megértéséhez. A géncsendesítéses vizsgálatok bizonyították a BMP-8 fontos szerepét a GC jelek továbbításában osteoblastokon, a knock-down eredmények a BMP-8, a DEX hatással szembeni, védő szerepét támasztják alá.
16
SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Originális cikkek kumulatív impakt faktora (IF): 51,281 Az értekezés témájával összefüggő saját közlemények jegyzéke János P. Kósa*, Bernadett Balla*, János Kiss, Adrienn Borsy, János Podani, István Takács, Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Gábor Speer, László Orosz and Péter Lakatos: Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of non-osteoporotic women Menopause 2009 March;16(2):367-377 IF: 3,452 * These authors equally contributed to this work
János P. Kósa*, Bernadett Balla*, János Kiss, János Podani, István Takács, Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Attila Karsai, Gábor Speer, Péter Lakatos: Postmenopausal Expression Changes of Immune System-Related Genes in Human Bone Tissue J Clin Immunol. 2009 Aug 7. [Epub ahead of print]DOI 10.1007/s10875-009-9321-9 * These authors equally contributed to this work IF: 3,248
Bernadett Balla; János P. Kósa; János Kiss; János Podani; István Takács; Gábor Speer; Krisztián Bácsi; Áron Lazáry; Zsolt Nagy; Péter Lakatos: Transcriptional profiling of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue Clin Immunol. 2009 May;131(2):354-9. IF: 3,606 Borsy, Adrienn; Podani, János; Stéger, Viktor; Balla, Bernadett; Kósa, János P.; Gyurján Jr., István; Molnár, Andrea; Szabolcsi, Zoltán; Szabó, László; Jáko, Eéna; Zomborszky, Zoltán; Nagy, János; Vellai, Tibor; Lakatos, Péter; Orosz, László: Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis Molecular Genetics and Genomics 2009 Mar;281(3):301-13. IF: 2,838 Balla Bernadett, Kósa János, Takács István, Kiss János, Podani János, Borsy Adrienn, Lazáry Áron, Bácsi Krisztián, Nagy Zsolt, Speer Gábor, Orosz László, és Lakatos Péter: Menopauza hatása a csontszöveti génkifejeződésre posztmenopauzás és premenopauzás korú IF: nem oszteoprotikus nőkben Magy Belorv Arch 2008; 61(3):208-219. Áron Lazáry*, János P. Kósa*, Bálint Tóbiás, Judit Lazáry, Bernadett Balla, Krisztián Bácsi, István Takács, Zsolt Nagy, Tibor Mező, Gábor Speer, Péter Lakatos: Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk Eur J Endocrinol. 2008 Aug;159(2):187-96. IF: 3,791 * These authors equally contributed to this work
Bernadett Balla*, János P. Kósa*, János Kiss, Adrienn Borsy, János Podani, István Takács, Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Gábor Speer, László Orosz and Péter Lakatos: Different Gene Expression Patterns in the Bone Tissue of Aging Postmenopausal Osteoporotic and Non-osteoporotic Women Calcif Tissue Int. 2008 Jan;82(1):12-26. * These authors equally contributed to this work IF: 2,737
17
Kósa P. János, Kis Adrián, Bácsi Krisztián, Nagy Zsolt, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Takács István, Speer Gábor és Lakatos Péter: Új, a glükokortikoidok csontsejtekre gyakorolt hatásának közvetítésében szerepet játszó gének azonosítása izolált és immortalizált egér osteoblast sejteken Magy Belorv Arch. 2007; 60. 435-441 IF: -
Áron Lazáry, Bernadett Balla, János P. Kósa, Krisztián Bácsi, Zsolt Nagy, István Takács, Péter Varga, Gábor Speer and Péter Lakatos: Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells.Biomaterials. 2007 28(3):393-9 IF: 6,262
További saját közlemények jegyzéke Bácsi Krisztián, Kósa János, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Takács István, Nagy Zsolt, Speer Gábor és Lakatos Péter: A kalciummetabolizmus jelentősége a csontritkulás és a colorectalis daganat patogenezisében Orvosképzés 2009; LXXXIV, S2:101-110 IF: Szendrői Attila, Speer Gábor, Tabák Ádám, Kósa P. János, Horváth Henrik, Romics Imre, Lakatos Péter: A D vitamin, ösztrogén és calcium sensing receptor genotípusainak valamint a szérum kalciumnak a prosztatarák kialakulásában betöltött szerepe Uroonkológia (2009 March – elfogadott) IF: K. Bácsi, E. Hitre, J. P. Kósa, H. Horváth, Á. Lazáry, P. L. Lakatos, B. Balla, B. Budai, P. Lakatos, G. Speer: Effects of the lactase gene 13910 C/T and calcium-sensing receptor gene A986S G/T polymorphisms on the incidence and recurrence of colorectal cancer in Hungarian patients. BMC Cancer. 2008 Nov 3;8(1):317. IF: 3,087 K. Bácsi, J. P. Kósa, Á. Lazáry, B. Balla, H. Horváth, A. Kis, Zs. Nagy, I. Takács, P. Lakatos, G. Speer: LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporos Int. 2009 Apr;20(4):639-45. IF: 4,290 Lazáry A, Speer G, Varga PP, Balla B, Bácsi K, Kósa JP, Nagy Z, Takács I, Lakatos P.: Effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells. J Orthop Res. 2008 May;26(5):601-607. IF: 2,963 Lazáry A, Balla B, Kósa J, Bácsi K, Nagy Z, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P.: A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának összefoglalása. A gipsz szerepe a csontpótlásban: molekuláris biológiai megközelítéssel, saját eredményeink alapján Orv Hetil. IF: 2007 Dec 23;148(51):2427-33. Bácsi Krisztián, Kósa János, Lazáry Áron, Horváth Henrik, Balla Bernadett, Speer Gábor, Lakatos Péter: A CYP3A7-1C-polimorfizmus hatása a csont ásványianyag-tartalmára posztmenopauzás nőkben Orv Hetil. 2007 Jul 8;148(27):1273-80. IF: Gábor Földvári, Márton Márialigeti, Norbert Solymosi, Zoltán Lukács, Gábor Majoros, János P. Kósa, Róbert Farkas: Hard Ticks Infesting Dogs in Hungary and their Infection with Babesia and Borrelia Species. Parasitol Res. (2007) 101:S25-S34 IF:1,512 Bácsi Krisztián, Kósa János, Lazáry Áron, Horváth Henrik, Balla Bernadett, Lakatos Péter és Speer Gábor: A dehidroepiandroszteron és dehidroepiandroszteron-szulfát jelentősége különböző kórállapotokban Orv Hetil. 2007 Apr 8;148(14):651-7 IF: 18
Tóbiás Bálint, Both Mária és Kósa P. János: Egy genetikai kutatás eredményei a biológiaórán A biológia tanítása. 2007. Jan; XV(1):12-18 IF: Folhoffer A, Ferenci P, Csak T, Horvath A, Hegedus D, Firneisz G, Osztovits J, Kosa JP, Willheim-Polli C, Szonyi L, Abonyi M, Laszlo Lakatos P, Szalay F. : Novel mutations of the ATP7B gene among 109 Hungarian patients with Wilson's disease Eur J Gastroenterol Hepatol. 2007 Feb;19(2):105-111. IF: 1,830 Bacsi K, Kosa JP, Borgulya G, Balla B, Lazary A, Nagy Zs, Horvath C, Speer G, Lakatos P.: CYP3A7*1C polymorphism, serum dehydroepiandrosterone sulphate level and bone mineral density in postmenopausal women Calcif Tissue Int. 2007 Mar;80(3):154-9. IF: 2,435 Gábor Speer, Péter Szenthe, János P. Kósa, Ádám G. Tabák, Anikó Folhoffer, Péter Fuszek, Károly Cseh and Péter Lakatos: Myocardial infarction is associated with the S allelic variant of the Sp1 binding site polymorphism of collagen type 1A1 gene Acta Cardiol. 2006 Jun;61(3):321-325. IF: 0,519 Bajnok É, Takács I, Tabák Á, Speer G, Nagy Z, Horváth C, Mészáros S, Kósa J, Nyíri P, Lakatos P: Génpolimorfizmusok lehetséges szerepe a toxikus adenoma és az azt kísérő osteopathia kialakulásában. Magyar Belorvosi Archívum, 2006. 60:97-102. IF: Speer Gábor, Szenthe Péter, Kósa P. János, Tabák G. Ádám, Nagy Zsolt, Folhofert Anikó, Cseh Károly, Lakatos Péter: Az 1-es típusú kollagén A1-génjének -1245 G/T polimorfizmusa összefügg a miokardiális infarktussal: az új patogenetikai faktor? Cardiologia Hungarica 2005;35:64-69 IF: M. Sárvári, I. Vágó, C. S. Wéber, J. Nagy, P. Gál, M. Mák, J. P. Kósa, P. Závodszky and T. Pázmány: Inhibition of C1q-beta-amyloid binding protects hippocampal cells against complement mediated toxicity, Journal of Neuroimmunology, Volume 137, Issues 1-2, April 2003, 12-18 IF: 3,054 Tamas Pazmany, János P. Kósa, Thomas B. Tomasi, Laszlo Mechtler, Andrea Turoczi and Attila Lehotzky: Effect of transforming growth factor-1 on microglial MHC-class II expression, Journal of Neuroimmunology, Volume 103, Issue 2, 3 January 2000, Pages 122130 IF:3,355 Tamas Pazmany, Laszlo Mechtler, Thomas B. Tomasi, János P. Kósa, Andrea Turoczi and Zoltan Urbanyi: Differential regulation of major histocompatibility complex class II expression and nitric oxide release by –amyloid in rat astrocyte and microglia, Brain Research, Vol 835, Issue 2, 24 July 1999, 213-223 IF:2,302
19
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Lakatos Péter professzor segítőkészsége közismert. Mégis megkülönböztetett tiszteletemet, elismerésemet és külön baráti köszönetemet fejezem ki azért - a mellett, hogy a Klinikán laboratóriumában biztosította a kutatómunkámhoz szükséges feltételeket - elindított ezen az úton,
valamint, hogy munkám során végig mellettem volt és határozottan támogatott. Szakmai útmutatásán túl atyai jó tanácsai, kritikai megjegyzései is segítettek a dolgozat elkészítésében. Korábbi közleményeim és jelen dolgozatom elkészítésében útmutatásai irányítottak. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, dr. Speer Gábor adjunktus úrnak baráti segítségét, bíztatását a Ph.D. dolgozat megírására és természetesen, hogy elvállalta témavezetésemet és a dolgozatom kijavításával is segítette munkámat. Különös hálával tartozom dr. Takács Istvánnak, dr. Nagy Zsoltnak és dr. Tóth Tamásnak az együtt végzett munkáért és a sok szakmai segítségért. Köszönöm kutatócsoportunk tagjainak, elsősorban Balla Bernadettnek, dr. Lazáry Áronnak, dr. Bácsi Krisztiánnak, dr. Kis Adriánnak, Tóbiás Bálintnak és mindazoknak, akik az elmúlt évek
során tanácsaikkal és kritikájukkal támogatták munkámat. Köszönetemet fejezem ki Podani János professzor úrnak, aki megismertetett a többváltozós statisztikával, nélküle a dolgozat statisztikai kiértékelése sokkal közérthetőbb és semmitmondóbb lenne. Köszönöm az ELTE Genetika tanszékén dolgozó kollégák segítségét, elsősorban Borsy Adriennek, Stéger Viktornak, Vellai Tibor és Orosz László professzor uraknak.
Köszönöm laboratóriumunk minden kedves munkatársának, elsősorban Szabóné Sinkovits Tünde, Keresztényi Györgyi és Máté Edit türelmét és gyakorlati segítségét. Végül feleségem és lányaim segítségét köszönöm, akik az otthon melegét biztosították, melyből bármikor erőt meríthettem.
20
