ONKOGENO-NKFP1a A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel Országos Onkológiai Intézet, AstraZeneca Kft, Auroscience kft, GlaxoSmithKline kft, JanssenCilag Kft, Roche Magyarország kft, Szilak Labor kft, Zenon Bio Kft Alvállalkozók: Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet, MTA Enzimológiai Intézete

project vezető: dr. Tímár József www.oncol.hu/Jedlik

1.sz részjelentés 2005. szeptember 15.-2006. szeptember 30.

1


Tartalomjegyzék

oldal 1.sz beszámoló részfeladatai………………………………………………….3 1.sz beszámolási időszak eredményei………………………………………...5* 1. 2. 3. 4.

programcsomag………………………………………………………..5 programcsomag………………………………………………………11 programcsomag………………………………………………………27 programcsomag………………………………………………………42

Publikációk………………………………………………………………….55 Tervezett és tényleges költségek összehasonlítása…………………………57 Monitoring adatszolgáltatás…………………………………………………59 K+F-ben résztvevő személyek/munkaidő elszámolása……………………..61

*A szakmai jelentés hosszát a dokumentációs anyag bősége (TÁBLÁZATOK, GRAFIKONOK ÉS MIKROSZKÓPOS ÁBRÁK) és a klinikai protokollok synopsisai indokolják

2


1.sz Beszámolási időszak feladatai 1. beszámoló A beszámoló időpontja: 2006. szeptember 15. Konzorciumi tag neve: Részfeladatok megnevezése 1.1.1. Örökletes daganatok 1.2.1. Fúziós gének kimutatására alkalmas módszerek kidolgozása (lágyrész tumorokban és nonHodgkin lymphomákban) 2.1.1. Vaszkularizáció sajátosságai különböző típusú tüdőrákokban 2.1.3. Keringő Angioblaszt kimutatás különböző típusú tüdőrákokban 2.1.2. Előállítjuk a rekombináns PEX fehérjét és származékait, valamint az αvβ3 integrin extracelluláris régióját és vizsgáljuk kölcsönhatásukat. 3.1.1. Új melanóma markerek expressziójának vizsgálata naevusban és melanómában-RT-PCR segítségével 3.2.1. A motilitási szignálútvonal kulcs-elemeinek expressziós mintáza-tának meghatározása 4.1.1. Molekuláris terápiás célpontok meghatározása emlő és fej-nyak daganatokban. 4.3.1. Antraciklin molkuláris imaging 4.4.1. A CRC-k adjuváns kezelésének költséghatékony optimalizálása a farmakogenomikai vizsgálatok alapján

Országos Onkológiai Intézet A részfeladatok szakmai tartalma az adott beszámolási időszakban A daganatos megbetegedésekre hajlamosító öröklött genetikai változások (mutációk, polimorfizmusok) meghatározása familiaris daganatos betegek vérmintáiból nyert 300DNS mintában Fúziós gén és staging vizsgálatok beállítása (bcl2, MBR/MCR régiókra tervezett próbák tesztelése, Anyaggyűjtés 20-20 tüdőrák altípusban (laphámrák, adenokarcinóma, kissejtes rák) vizsgáljuk az érellátás sajátosságait immunhisztokémiai módszerrel

A részfeladat státusza elkészült

elkészült

Későbbre halasztott (lsd. Szakmai jelentés)

50 NSCLC beteg vérének analízise Előre hozott, elkészült Előállítjuk a rekombináns PEX fehérjét és származékait, valamint az αvβ3 integrin extracelluláris régióját és vizsgáljuk kölcsönhatásukat.

elkészült

A programban a CyclinE, b3endonexin, decorin expressziót határozzuk meg 50 melanoma, 20 naevus, 10 dysplasticus Elkészült, módosítva naevus esetében (lsd. Szakmai jelentés) A vizsgálatokhoz általunk tervezett makrochipet fogunk használni, mely segítségével a korábban azonosított Elkészült, kibővített motilitási mintázatot elemezzük. A fenti anyagban lézermikrodisszekció, q-PCR segítségével elemezzük a chipen megváltozott gének expresszióját. EGFR és steroid receptorok jelátviteli mechanizmusának felderítése DNS chip módszerrel emlő és fej-nyak daganatokban. Antraciklin sejten belüli lokalizációjának kimutatása humán emlőráksejtekben fibroblasztban és endotélsejtben

elkészült

elkészült

MTHFR, XPD és UDP-glukuronát TF polimorfizmus vizsgálatok colorectalis rákos szövetekben elkészült

3


Részfeladatok megnevezése Konzorciumi tag 1.1.1. Örökletes daganatok

Konzorciumi tag 1.2.1. Fúziós gének kimutatására alkalmas módszerek kidolgozása (lágyrész tumorokban és nonHodgkin lymphomákban) Konzorciumi tag 2.3.1. EPO kezelés hatása fejnyaki, tüdőés rectumrák ereződésére Konzorciumi tag 2.4.1 ZD6474 kezelés 3.3.1. Melanóma progresszió gátlása LMWH segítségével Konzorciumi tag 3.3.2 LMWH heparin+DTIC kezelés St-III melanómás betegek esetében Konzorciumi tag 4.1.1. Molekuláris terápiás célpontok meghatározása emlő és fej-nyak daganatokban. Konzorciumi tag 4.2.1. ER+ fejnyaki laphámrákok kiegészítő hormonterápiája

A részfeladatok szakmai tartalma az adott beszámolási időszakban Zenon Bio A daganatos megbetegedésekre hajlamosító öröklött genetikai változások (mutációk, polimorfizmusok) meghatározása familiaris daganatos betegek vérmintáiból nyert 300DNS mintában Auroscience Fúziós gén és staging vizsgálatok beállítása (bcl2, MBR/MCR régiókra tervezett próbák tesztelése, Anyaggyűjtés

A részfeladat státusza

elkészült

elkészült

Janssen-Cilag Klinikai protokoll kidolgozása, engedélyeztetése elkészült AstraZeneca Klinikai protokoll kidolgozása, engedélyeztetése GSK Protokoll kidolgozása, engedélyeztetése

elkészült elkészült

Szilak Labor Syndecan4 knockout human melanoma sejetek biológiai viselkedésének tesztelése in vitro, szignalizációjuk meghatározása elkészült Roche Diagnosztika Csont-markerek kimutatásának infrastrukturális alapjainak megteremtése, a diagnosztikus kitek tesztelése, validálása

elkészült

AsztraZeneca Protokoll kidolgozása és engedélyeztetése elkészült

4

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 1. Programcsomag: Molekuláris Diagnosztikai szolgáltatások fejlesztése 1.1. Örökletes daganatok predikciója és detektálása Magyarországon (dr. Oláh Edit, dr. Forrai Gábor, Zenon Bio kft) 1.1.1. Rákra hajlamosító gének daganatos családokban Összefoglalás Új ismereteket szereztünk a genetikailag determinált daganatokról, hazai előfordulásukról és a rák iránti genetikai fogékonyság molekuláris alapjairól. Az emlő-, petefészek-, méh-, vastagbél- és hererák familiáris eseteiben jellemeztük az ismert rákra hajlamosító géneket, leírtuk azok betegségre hajlamosító mutációit és a hererákos családok vonatkozásában – nemzetközi együttműködés keretében – új hajlamosító gént sikerült megismerni. A rák iránti genetikai hajlam meghatározása révén olyan célpopuláció azonosítására nyílt lehetőség, amely legtöbbet profitál a rákkockázat és a halálozás csökkentését célzó beavatkozásokból. Ezért az eredmények hozzájárulnak az örökletes daganatok diagnózisához, megelőzéséhez, késleltetéséhez és a kezelési modalitások megválasztásához a hazai familiáris megbetegedésekben. Betegek és módszerek A mutáció hordozói státuszt határoztuk meg familiáris daganatos megbetegedésekben abból a célból, hogy – a populáció szintjén ritka előfordulású – örökletes rákszindrómák újabb eseteit azonosíthassuk. Minden esetben EDTAval konzervált vérből nyert DNS-ben vizsgáltuk a BRCA1/2, CHECK-2 örökölt mutációit emlő- és petefészekrákban; az APC, STK-11, MYH, MADH4 mutációkat polipózisban és az MLH1, MSH2 gének örökölt mutációinak jelenlétét nem polipózis talaján kifejlődő vastagbélrákos családokban. Összesen 340 daganatos családot vizsgáltunk: 218 emlő- és petefészekrákos családban, 52 polipózisos szindrómában, 57 nem polipózis talaján kialakuló vastagbélrákos családban és 13 hererákos családban fejeztük be a hajlamosító gének elemzését. A gének valamennyi kódoló szekvenciájára kiterjedő mutációvizsgálatot a hagyományos SSCP, HDA és közvetlen DNS szekvenálási módszerekkel végeztük. A konzorcium 6.sz. kisvállalkozó partnerével (Zenon Bio Kft.) szoros együttműködésben sikerült bevezetni két új mutáció elemző módszert, a DHPLC és a nagy genomi deléciók azonosítására szolgáló MPLA módszert, abból a célból, hogy javítsuk az öröklött génmutációk költséghatékony kimutatását a BRCA1/2, APC, MLH1 és MSH2 génekre. Ez úgy volt lehetséges, hogy a kisvállalkozó partner alkalmazásában álló Kovács András biológust franciaországi továbbképzésre küldte és a hazahozott módszereket alkalmaztuk a Wave3500 Mutáció Detektáló készülékre. A készülék folyamatos működését, szervizelését szintén az ipari partner biztosította. Eredmények Emlő- és petefészekrákos családok genetikai elemzése (BRCA1/2 és CHEK2 gének vizsgálata) Az örökletes emlő- és petefészekrákos családok kialakulásáért leggyakrabban a BRCA1 és a BRCA2 gének öröklött meghibásodása felelős. 198 női- és 20 férfi emlőrákos családban végeztünk genetikai vizsgálatot a BRCA1 és BRCA2 gének öröklött mutációinak kimutatására. Eddig 20 családban sikerült mutációt azonosítani, további 21 DNS szekvencia eltérés funkcionális szerepét még tanulmányozzuk. Az egyes mutációk előfordulási gyakoriságát az alábbiakban ismertetjük: BRCA1 gén: 5382insC (6 család), 185delAG (3 család), 300T>G (2 család), 2415delAG (1 család) BRCA2 gén: 9326insA (2 család), 6174delT (2 család), 3303GA>TT (1 család) – a világon először azonosított elváltozás., 6884C>G (1 család), 8141del5 (1 család), C39R (1 család) Az utóbbi évben végzett mutáció elemzések eredményei megerősítik korábbi megfigyeléseinket, amelyek szerint a BRCA1 gén meghibásodása gyakran a gén azonos szekvenciáját érinti, aminek következtében több családban is ugyanaz a mutáció fordul elő. Ezzel szemben ezt az úgynevezett alapító hatást a BRCA2 génben kizárólag a magyarokban előforduló 9326insA mutáció és a zsidó származásúakra jellemző 6174delT mutáció esetében észleltük. A CHEK2 gén allélvariánsainak feltérképezése magyar emlőrákos családokban A CHEK2 egy, a sejtciklus ellenőrző mechanizmusában részt vevő "checkpoint" fehérje, mely fontos szerepet játszik a DNS-ben kódolt genetikai tartalom megóvásában. A CHEK2 csíravonalas mutációit számos, különféle rákos megbetegedéssel hozták összefüggésbe. Az emlőrákra nézve legjelentősebb mutációja a 10. exonban elhelyezkedő 1100delC, mely a fő hajlamosító génekhez (BRCA1, BRCA2) képest kis penetranciájú ugyan, de a skandináv térségben populációs szinten is viszonylag gyakori (1,5-2%), familiáris emlőrákos esetekben pedig 4-5%. Célunk volt, hogy feltérképezzük a magyarországi emlőrákos populációban a CHEK2 csíravonalas mutációit különös tekintettel az 1100delC allélre. 147 olyan emlőrákos családot vizsgáltunk, ahol a betegség 60 éves kor előtt jelentkezett és ennek ellenére nem találtunk BRCA1/2 csíravonalas mutációt. Az eredményeink azt mutatják, hogy egyetlen esetben sem fordult elő az 1100delC allél. Hat betegnél azonosítottunk T470C mutációt. Egy esetben figyeltünk meg 444 + 1G>A splice site mutációt, további egy esetben észleltünk A252G neutrális hatású elváltozást és néhány, már leírt polimorfizmust. Azt a következtetést vonjuk le, hogy az 1100delC mutáció előfordulási gyakorisága Magyarországon

5

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ nem jelentős, szűrése nem indokolt. A T470C elváltozás azonban más országokban mért adathoz (1-2%) képest gyakoribb (4%). Vizsgálatát érdemes kiterjeszteni más típusú rákszindrómákra is. Örökletes vastagbélrák polipózis szindrómák genetikai háttere Magyarországon A vastag- végbélrák daganatok egyik legfontosabb kockázati faktorát a pozitív családtörténet jelenti, amely több tünetcsoportban is megnyilvánulhat. Ezek közé tartozik a familiáris adenomatosus polipózis, az MYH-asszociált polipózis, a Peutz-Jeghers, valamint a juvenilis polipózis szindróma. Vizsgálataink arra irányultak, hogy hazai családokban meghatározzuk a fenti szindrómák hajlamosító génjeinek (APC, MYH, STK11, SMAD4) magyarországi mutációs spektrumát, valamint értékeljük a genotípus és fenotípus esetleges összefüggéseit. A vizsgálatba beleegyező és genetikai tanácsadáson megjelent több, mint 50 család tagjainak vérmintáiból DNS-t izoláltunk, majd a fenti gének teljes kódoló régióját kombinált mutációvizsgálatnak vetettük alá. A variánsokat direkt szekvenálással azonosítottuk. A vizsgált családok mintegy kétharmada esetében mutattuk ki valamely gén inaktiváló, a daganatos fenotípushoz egyértelműen kapcsolható mutációját, emellett több bizonytalan hatású variánst, illetve polimorfizmust is azonosítottunk. Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a polipózis talaján kialakuló vastagbélrákos szindrómák kialakulásának hátterében hazánkban az esetek mintegy kétharmadában volt kimutatható az ezt okozó tumorszuppresszor gének mutációja. A kimutatott szekvenciavariánsok legnagyobb része visszatérő jellegű volt. A mutációs spektrum további értékelése nagyobb esetszámú vizsgálat elvégzését teszi szükségessé. Nem polipózis talaján kialakuló örökletes vastagbélrák (HNPCC) hajlamosító génjeinek elemzése 57 család kombinált mutációvizsgálata (HDA/SSCP/MLPA/szekvenálás) alapján ezek 31,6%-a (18/57) hordozott patogén mutációt. Az azonosított 18 mutáció fele az MLH1, másik fele az MSH2 génben volt. A vizsgált populációban minden mutáció csak egyszer fordult elő, azaz alapító hatással nem találkoztunk. A detektált mutációk fele új, azaz eddig még egyetlen populációból sem írták le. A mutációk jelentős része (4/18, 22%) genomi aberráció (nagy deléció vagy duplikáció), ezekből 1 az MLH1 génben, 3 pedig az MSH2-ben volt kimutatható. A betegség kialakulásával biztosan kapcsolatba hozható mutációkon kívül 7-féle besorolatlan variánst is találtunk (10 családnál, azaz a családok 17,5%-ban), ezek közül 2 (1 az MLH1-ben, egy az MSH2-ben) előzetes vizsgálataink szerint erősen valószínűsíthetően patogén. A többi besorolatlan variáns karakterizálása folyamatban van. A fentieken túl 6-féle, változó gyakoriságú (5-50% heterozigóta) polimorfizmust is azonosítottunk (3 az MLH1-ben, 3 az MSH2-ben). A mutációk és a patogénnek tartott besorolatlan variánsok túlnyomó többségét a szigorú nemzetközi Amsterdam I-II klinikai kritériumoknak megfelelő családokban detektáltuk (>80%). Hererákos családok A Hererák Konzorciummal végzett genom-elemzés után megállapítottuk, hogy az emlőrákok esetében megismert nagy penetranciájú genetikai változások nem játszanak szerepet a familiáris hererákos megbetegedések kialakulásában (Crockford és mtsai., 2006). Ugyanakkor a nemzetközi szakirodalomban az első olyan genetikai változást írtuk le, amely mérsékelten fokozza a hererák kialakulásának kockázatát (Nathanson és mtsai., 2005).

6

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 1.2.Molekuláris diagnosztikai szolgáltatások fejlesztése (dr. Szentirmay Z, Soós Miklós, Auroscience kft, dr. Józsa Adrienne, Roche Diagnoasztika kft) 1.2.1. Fúziós gének kimutatására alkalmas módszerek kidolgozása (lágyrész tumorokban és non-Hodgkin lymphomákban) 1. Bcl-2/IgH génátrendeződés és molekuláris staging meghatározás tüsző eredetű lymphomákban. A follikuláris lymphomák (FL) az összes non-Hodgkin lymphoma mintegy 30%-át teszik ki. Ez országosan évi 380 új megbetegedést jelent, ebből az Országos Onkológiai Intézetben kb. 80-100 új beteget kezelnek. FL-ban a daganatos klón t(14;18) kromoszómális translocatioval jellemezhető. Az ilyen esetek több mint 90%-ban a Bcl-2 gén áthelyeződik az immunglobulin nehéz lánc (IgH) gén promoter régiójába. Follikuláris (és más alacsony malignitású) B-sejtes nonHodgkin lymphomáknál különösen előrehaladott stádiumban a kezelés után gyakran relapsus következik be, amit jelenlegi ismereteink szerint a vérben és csontvelőben jelenlévő residualis daganatsejtek (minimális residualis betegség) okoznak. A klinikai vizsgálatok eredménye azt mutatja, hogy betegkövetés során a Bcl-2/IgH génátrendeződést hordozó daganatsejtek hiánya a csontvelőben vagy a perifériás vérben szignifikánsan hosszabb remisszióhoz vezet. A betegség molekuláris módszerekkel történő követésekor a PCR-rel kimutatott Bcl-2/IgH génátrendeződés szekvenciája a kiújulások során mindig azonos az eredeti FL klónban talált génátrendeződéssel. Ritkábban az is előfordul, hogy a kimutatott génátrendeződés nem azonos az eredeti MBR/JH fúziós szekvenciával. Ez a meglepő lelet abból adódik, hogy hasonló típusú génátrendeződés a perifériás vérben tumoros folyamat fennállása nélkül is kialakulhat. Ezért alapvető fontosságú annak meghatározása, hogy azok a sejtek, amelyekben a Bcl-2/IgH transzlokációt a perifériás vérben kimutattuk, azonosak vagy különböznek az eredeti daganatos klóntól. A PCR-rel amplifikált termék szekvencia analízise széles körben elfogadott, de egyúttal időigényes és drága módszere a probléma megoldásának. Ezért fluorescens olvadáspont analízisre alapozott valós idejű PCR módszert dolgoztunk ki a kérdéses DNS fragmentek analízisére. A módszer azon alapszik, hogy az olvadáspont értéke az adott szekvencia GC tartalmától, és a szekvencia hosszától függ. Az általunk kifejlesztett fluorescencia rezonancia energia transzfer (FRET) próba kombinálva a SYBER Green I. festéssel alkalmas az olvadáspont analízisére. 115 különböző klinikai stádiumú FL-ben szenvedő beteg alábbi klinikai adatait táblázatba foglaltuk: (a) a beteg azonosítója, neve, életkora; (b) a kórszövettani diagnózis; (c) a primer tumorból végzett molekuláris vizsgálat eredménye; (d) a perifériás vérből vagy csontvelőből végzett molekuláris vizsgálatok eredményei. A betegek vérmintáiból a lymphocytákat Biocoll szeparáló oldattal feldúsítottuk, a DNS izolálás Roche izoláló kittel történt. A major breakpoint (MBR)- és minor cluster régióra (MCR) specifikus PCR primereket az NCBI GenBank adatbázis alapján terveztük. A töréspont régió szekvenciájának megsokszorozását valós idejű PCR módszerrel LightCycler (Roche) segítségével végeztük. 20 µl reakcióelegybe 2 µl FastStart mastermixet (Roche), 5 µM MgCl2-t, 0,5 µM primert és próbát, 2 µl templátot mértünk. Az amplifikáció után minden egyes kapillárisba további 2 µl mastermix-et adtunk és elvégeztük az olvadáspont analízist. Tizenegy esetben a PCR termékek szekvencia analízise is megtörtént. 1. ábra. Bcl2-IgH fúziós gén kimutatása NHL-ben

7

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Az 1. ábrán két betegnél a primer tumorból származó daganatsejtek és a vérben keringő daganatsejtek töréspont régió szekvenciáit és olvadáspontjait hasonlítottuk össze. Az ábra felső részén a primer tumorban lévő és a vérben keringő daganatsejtek töréspont régiója azonos, a szekvenciák olvadáspontja is azonos, és ez daganatos relapsus jele. Az ábra alsó részén a primer tumor és a vérben keringő daganatsejtek töréspont régiója eltér, a két szekvencia olvadáspontja is eltér, ez pedig a Bcl-2 génátrendeződés ellenére sem utal daganatos kiújulásra.

2. ábra. FL betegek adatai.

A 2. ábrán tizenegy beteg kezelésének és kórlefolyásának adatai láthatók. A vizsgált vér- és csontvelő minták időrendi sorrendben vannak feltüntetve (0-56 hónap). Nyilak jelzik a kezelések időpontját, és a betegkövetések végén található a jelenlegi klinikai állapot. Három esetben (9, 10, 11) volt kimutatható az eredeti nyirokcsomóban található génátrendeződéstől eltérő t(14,18) transzlokáció. Az általunk kidolgozott módszernek az a jelentősége, hogy a relapsus előre jelzése a klinikai tüneteknél sokkal korábban megtörténhet, a vizsgálat olcsó, gyors, más esetben pedig szükségtelenné válhat drága kezelés, ami nem csak költséghatékony, hanem a beteg életminőségét is nagy mértékben javítja. 2. Fúziós gének és génamplifikációk kimutatása lágyrész tumorokban A lágyrész tumorok szövettani diagnosztikája az egyes elváltozásokban meglévő szöveti mintázaton, jellegzetes sejttípuson és a stroma eltérésein alapszik. A szöveti szerkezet segítségével kialakított daganat csoportok között nincs éles határvonal, a csoporton belül pedig egyedül a morfológiai kép nem ad elegendő támpontot az egyes daganatféleségek további elkülönítéséhez. Az immunhisztokémia a diagnosztikus patológia elfogadott módszere. Rendszerint olyan antigéneket mutatunk ki, amelyek normális körülmények között csak egy-két meghatározott ép szövetben fordulnak elő. Lágyrész tumorokban ezen antigének aberrans expressioja gyakori. Tovább nehezíti a diagnosztikát, hogy rutin szövettani metszetekben egy-egy tumorra egyébként jellemző fehérje marker immunhisztokémiával az ép szövetnél sokkal kisebb mennyiségben, és rendszerint csak 50%-80% gyakorisággal mutatható ki. Ezért mondhatjuk, hogy az immunhisztokémia sokszor szintén nem elég specifikus a hisztogenetikai diagnosztikához. A kromoszómális génátrendeződések gyakoriak lágyrész tumorokban. Ezekre jellemző, hogy két, egyébként nem daganatkeltő gén egy-egy jól körülhatárolt szakaszon eltörik és egymással összekapcsolódva egyetlen új daganatkeltő fúziós génné alakul át. A különböző fúziós gének más-más daganatokban találhatók, tehát kimutatásuk diagnosztikus jelentőségű. A vizsgálatokat a tumorszövetből történő RNS izolálás után RT-PCR technikával végezzük. A PCR primereket az 1. táblázatban feltüntetett tumor típusokban meglévő specifikus génelváltozások kimutatására terveztük. 1. táblázat. Fúziós gének lágyrész sarcomakban Tumor-specifikus Tumor típusok hybrid gének FUS – CHOP Jól differenciált és myxoid liposarcoma EWS – Fli1 Ewing sc./ PNET / Askin tu. / Esthesioneuroblastoma EWS – AFT1 Világossejtes sarcoma EWS – WT1 Desmoplasticus kis kereksejtes tumor EWS – CHN Extraseletalis myxoid chondrosarcoma SYT – SSXT Synoviális sarcoma FKHR – PAX3 Alveoláris rhabdomyosarcoma NTRK3 – ETV6 Congenitalis fibrosarcoma COL1A1 – PDGFB Dermatofibrosarcoma protuberans Tapasztalatok szerint a génvizsgálatok szükségessége gyakorlatilag mindig a rutin szövettani diagnosztika során merül fel, amikor legtöbbször már csak formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetek állnak rendelkezésre. Az ilyen mintákban az RNS gyakran degradálódik és ezért a fúziós gén kimutatása sokszor sikertelen. Ezért jelenleg új, rövidebb RNS szakaszokat igénylő primer készlet kidolgozását végezzük, ami jobban használható formalin-fixált

8

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ szövetmintán.Számos olyan génelváltozás található lágyrész sarcomákban, amelyek nem kötődnek szorosan valamely daganat-típushoz, ezért kimutatásuk inkább prognosztikai mint diagnosztikai jelentőségű. Ezek közül vizsgáltuk az MYCN onkogén amplifikáció mértékének meghatározását neuroblastomában. A neuroblastomák rizikó csoportokba sorolása a klinikai stádium, a szövettani kép, a MYCN státus és a sejtenkénti DNS tartalom (DNS ploidia) alapján történik. A neuroblastomák prognózisának fentiek szerinti meghatározása a korszerű kezelés elengedhetetlen feltétele, mert alacsony rizikójú tumoroknál elegendő a műtéti eltávolítás, átmeneti rizikójú daganatok esetén a műtét után mérsékelt dózisú kemoterápia, míg magas rizikójú tumoroknál nagy dózisú csontvelő ablatív terápia is szükséges. 2005.01.01 és 2006.09.14 között összesen 32 műtéttel eltávolított neuroblastomában valósidejű kvantitatív PCR (LightCycler) és kvantitatív dual-color-FISH módszerrel (Q-BIOgene) meghatároztuk a MYCN gén amplifikációjának mértékét. A műtéti preparátumok fixálatlanul érkeztek molekuláris patológiai diagnosztikára. A tumorszövetből félre tettünk DNS izolálás és mélyfagyasztásos tárolás céljára, továbbá lenyomati keneteket készítettünk DNS cytometria és FISH vizsgálatokra, végül a daganatot formalinban fixáltuk és paraffinba ágyaztuk szövettani analízisre. A sejtenkénti FISH szignál szám vizsgálata a Központi Fizikai Kutatóintézet Anyagtudományi Intézetében Eördögh Imre és munkatársai által kifejlesztett színes kvantitatív képfeldolgozó rendszer (IMAN) segítségével történt. Jelenleg a kétféle módszerrel (PCR, FISH) meghatározott MYCN kópiaszámot hasonlítottuk össze. Előzetes eredményeinket a 3. ábrán mutatjuk. A FISH képeken (3 éves kislány III. stádiumú magas rizikójú tumora) a 2. kromoszóma centromer (α-satellita) régiója zöld szignál, az MYCN gén vörös szignál formájában látható. A képfeldolgozó rendszer külön kijelöli, elkülöníti és megszámolja a vörös és zöld szignált. Egy szignál egy kromoszómának illetve gén-kópiának felel meg. Nagyon jó lineáris pozitív korrelációt találtunk a FISH és LightCycler segítségével meghatározott MYCN kópiaszám között (a képen a bal alsó ábra, a koordinátákon a MYCN kópiaszám van ábrázolva). Kvantitatív PCR nem ad felvilágosítást a 2. kromoszóma számbeli eltéréseiről, átlagos sejtenkénti MYCN kópiaszámot ad meg, de akár 200-szoros amplifikáció is meghatározható. Kvantitatív FISH jól tükrözi a sejtek heterogenitását, mutatja a 2. kromoszóma esetleges polysomiáját (3. ábra) de 25szörös amplifikáció fölött a MYCN kópiaszámot nem tudja megadni. 3. ábra N-myc gén státusz meghatározása NBL-ben IMAN program segítségével

3. A vastagbélrákok molekuláris diadnosztikája és prognosztikája Előzetes vizsgálataink arra utalnak, hogy a vastagbélrákok prognózisát a lokalizáció és a TNM-re alapozott klinikai stádium mellett leginkább a Braf gén V600E mutációja és microsatellita státusa határozza meg. A sejtek növekedését és proliferációját többféle mechanizmus is kontrollálja. Ezek egy része külső szignál, ami az un. mitogén-aktiválta protein kináz (MAPK) úton keresztül jut el a sejtmagba. Ha e szignálút kulcs-génjeiben mutációk alakulnak ki, azok többféle emberi daganat kialakulását is elősegítik. A 7q34 kromoszóma régióra lokalizálódó Braf is ilyen kulcs-gén, amit a növekedési faktorok a receptor tyrozin kinázokon és a G-proteinhez kapcsolt receptorokon, majd a ras fehérjén keresztül aktiválnak. A Braf specifikus mutációi önmagukban előidézik a génaktivációt, így növekedési faktor szignál nélkül is beindítják a sejtproliferációt és gátolják a differenciációt. Microsatellitáknak nevezzük a genomban előforduló nagyszámú ismétlődő szekvenciákat, amelyek hossza genetikailag meghatározott és állandó. Microsatellita instabilitásról akkor beszélünk ha ezen repetitív szekvenciák hossza változik a „mismatch repair” gének valamelyikének mutációja vagy az MLH1 gén promoter metilációja okozta inaktivitás következtében. Ezen az alapon a colorectalis rákok mikrosatellita instabil (MSI-H) illetve mikrosatellita stabil (MSS) csoportba sorolhatók. Az Országos Onkológiai Intézetből, a Debreceni Egyetem Sebészeti Klinikájáról és a zentai (Szerbia) Dr. Gerő István Egészségügyi Centrum kórházából származó összesen 206 beteg klinikai pathologiai és genetikai adatait dolgoztuk fel. A DNS mintákat fixálatlan vagy paraffinba ágyazott tumorszövetből izoláltuk. A microsatellita instabilitást valós idejű kvantitatív PCR (LightCycler) módszerrel, olvadáspont analízis segítségével vizsgáltuk és standard microsatellita

9

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ markereket használtunk. A BRAF mutációt a laboratóriumban kifejlesztett LightCycler teszt és olvadáspont analízis segítségével mutattuk ki. Az eredményt DNS szekvencia analízissel is igazoltuk. Eredmények és diszkusszió: (1) Azt találtuk, hogy a colorectalis carcinomák (CrC) prognózisa leginkább az alábbi 4 paramétertől függ: klinikai stádium, lokalizáció, microsatellita- és BRAF státusz. (2) Az MSI-H CrC-k szignifikánsan jobb prognózisúak, mint az MSS tumorok. (3) Mutáns BRAF gén nem fordult elő 14 HNPCC-s beteg daganatában. (4) A BRAFV600E mutáció 7-szer gyakoribb MSI-H tumorokban (9/23), mint MSS rákokban. (10/169). (5) A BRAFV600E mutációt hordozó vastagbélrákok sokkal kedvezőtlenebb biológiai viselkedést mutatnak, mint a BRAF negatív tumorok. Az ilyen betegeknél tanácsos agresszívebb daganatellenes gyógykezelést alkalmazni már II. stádiumú tumorok esetén is, mert korai tumor stádiumban a betegek jelenleg nem kapnak kemoterápiát, ráadásul a mutáns BRAF ellenes célzott kemoterápia is rövidesen rendelkezésre fog állni. A vizsgálatoktól azt várjuk, elősegíti a vastagbélrákok hisztogenetikai osztályozását és segít megítélni a várható kórlefolyását. Számítunk arra, hogy esetleg optimalizált terápiás javaslattal szolgálhatunk, vagy elősegítjük új terápiás eljárás kifejlesztését. 4. ÚJ alkalmazás: A humán papillomavírus (HPV) kimutatás jelentősége az anogenitális daganatok szűrésében és megelőzésében. A világon az összes emberi daganat 6.1%-a HPV eredetű. Egyértelmű bizonyítékok szólna a mellett, hogy az anogenitális régió rákmegelőző állapotait és carcinomáit valamint számos, a fej-nyaki régióból kiinduló laphámrák HPV fertőzéssel függ össze. Magyarországon a női lakosság mintegy 25%-a genitálisan HPV-vel fertőzött, és az ilyen anyák újszülöttjeinek száj-nyálkahártyájában sok esetben a vírus évek múlva is kimutatható. Több mint 100-féle HPV típust azonosítottak, de ennek csak a fele okozza a nyálkahártya sejtek malignus átalakulását. A HPV fertőzés kimutatásának népegészségügyi jelentőségét az alábbi kérdések világítják meg: 1.) Nagy anyagon nemzetközi együttműködéssel végzett összehasonlító vizsgálatokban kimutatták, hogy a rákszűrésre alkalmazott cervix cytologiai vizsgálatok önmagukban a rákmegelőző közepes-és súlyosfokú hámelváltozást (CIN 2/3) csak 53%-ban deríti fel, HPV kimutatással kombinálva ez az arány 90-98%. 2.) Magyarországon 2007. év elején kerül bevezetésre a leggyakoribb HPV fertőzések (HPV 6, 11, 16, 18) megelőzésére szolgáló oltóanyag. Kérdés, hogy cytologiai elváltozást nem, vagy csak enyhe elváltozást mutató fertőzések esetén a vakcina hatásos vagy nem? 3.) Hatásos-e a védőoltás a fenti négy típushoz genetikailag nagyon hasonló ezért azonos filogenetikai csoportokba tartozó további 15-féle papillomavírus fertőzés vagy többszörös vírusfertőzés esetén is? 4.) Csökkenti-e a HPV vakcináció a fej-nyaki régió juvenilis papillomatosisának és bizonyos laphámrák-típusainak előfordulási gyakoriságát? 5.) A HPV pozitív nők férfi partnereinek HPV fertőzöttségi gyakorisága indokolja-e a férfiak vakcinációba történő bevonását? A Roche cég nagyon érzékeny un. „Linear Array HPV Genotyping Test”-et fejlesztett ki, amellyel eddig összesen 59 vizsgálatot végeztünk és az eredményeket a saját korábban kifejlesztett PCR-alapú HPV tesztünkkel összevetettük. Az array-HPV teszt sajátunknál sokkal érzékenyebbnek és megbízhatóbbnak mutatkozik a HPV fertőzések, különösen a többes vírus fertőzések kimutatásában (5. ábra). Tervezzük az array-HPV tesztnél sokkal olcsóbb és gyorsabb, de ugyanannyira megbízható valósidejű PCR alapú eljárás kidolgozását. Saját HPV tesztünket rutinszerűen kívánjuk alkalmazni a cervix cytologiai minták vizsgálata során a méhnyakrák szűrés hatékonyságának növelésére és a HPV vakcináció hatásosságának monitorizálására. Az array-HPV tesztet pedig rendszeres minőségi kontrollként továbbra is alkalmazzuk. 5. ábra. HPV pattern citológiai mintákban

10

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2. Programcsomag: Daganatereződés diagnosztikus, prognosztikus jelentősége és terápiás kiaknázása 2.1. A daganat-ereződés sajátosságainak meghatározása az egyes tüdőrák-altípusokban. Témavezető: dr. Döme Balázs (Országos Korányi TBC és Pulmonológiai Intézet) 2.1.3. Keringő angioblaszt kimutatás különböző típusú tüdőrákokban Miután a program keretében az angiogenezis gátló ZD6474 klinikai vizsgálata is meg fog indulni tüdőrákos betegeken, úgy gondoltuk, hogy a 3. évre tervezett 2.1.3. programpontot előre hozzuk, mert szükség van egy olyan érzékeny diagnosztikus-monitorozásra alkalmas gyors módszerre, amely a betegek ilyen szerekkel történő kezelése során a terápiás választ a daganaton mérhető válasz előtt a célponton (angiogenezis) már jelzi. Napjainkig általánosan elfogadott volt, hogy a daganatok ereződése a már meglévő erek endotheliális sejtjei proliferációjának és a daganatba történő benövésének eredménye. Azonban egyre több adat áll rendelkezésünkre, amelyek ettől eltérő, a daganatok által indukált angiogenesis mechanizmusokat írnak le. Ezen mechanizmusok egyike a vasculogenezis, a csontvelői eredetű endoteliális prekurzor sejtek (EPC-k) beépülése a daganatos erek endotheliális borításába. Ezek az őssejtek jól jellemezhetőek a sejtfelszínen megjelenő antigénjeikkel: CD34, CD133, VEGFR2 és VE-cadherin. Azonban a daganatok angiogenezisében betöltött szerepük mértéke ma még nem egyértelműen tisztázott, a legtöbb daganatféleség esetében ismeretlen. Munkánkban nem-kissejtes tüdőrákos (NSCLC) betegek (53 páciens) perifériás vérében határoztuk meg a CD34+/VEGFR2+ EPC-k számát flow-citométerrel a kezelések előtt és azt követően. Ezen felül quantitativ PCR segítségével meghatároztuk a VEGFR2, CD34, CD133 és a VE-cadherin mRNS expressziót is a perifériás vérmintákban. Eredményeink azt mutatják, hogy a keringő EPC-k száma emelkedett a daganatos betegekben az egészséges kontrollokhoz képest (1.ábra), és a magas EPC szint szorosan korrelált a rosszabb átlagos túléléssel (2. ábra). A terápia előtt nem volt semmilyen összefüggés az EPC szint és a vizsgált standard prognosztikus paraméterek között (1. táblázat), azonban a terápia utáni EPC szint szignifikánsan alacsonyabb volt a terápiára reagálók mintáiban a rezisztens esetekhez képest (1. ábra). A molekuláris diagnosztikai módszerrel végzett vizsgálat eredménye azt mutatta, hogy csak a VEGFR2 receptor mRNS expressziója emelkedett szignifikánsan a daganatos betegekben és ennek szintje is párhuzamosan alakult a terápiás válasszal (3. ábra) 1. ábra. A keringő EPC-k száma NSCLC betegek perfériás keringésében. Circulating EPC num ber

**

7000

EPCs / mL of blood

6000 5000 4000 3000

*

2000 1000 0 Control

Tumor

Responder

Non-responder

2. ábra. Keringő EPC-k száma és a túlélés összefüggése. Kaplan-Meier analízis. Magas EPC: több mint 1000 sejt/ml vér.

EPC low

EPC high

11

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 3. ábra. EPC markergének QPCR analízise NSCLC betegek perifériás vérében. 160,000 140,000 120,000 100,000

Tumor Responder

80,000

Non-Responder

60,000 40,000 20,000 0,000 VEGFR2

CD34

AC133

VE-cad

1. Tablázat. Keringő EPC-k szintje és az NSCLC klinikopatológiai paraméterei közötti korreláció

All patients

No. of patients (%)

EPC low (%)

EPC high (%)

53

36

17

26 (49.1%)

18 (50%)

8 (47%)

27 (50.9%)

18 (50%)

9 (53%)

19 (35.8%)

13 (36.1%)

6 (35.3%)

34 (64.2%)

23 (63.9%)

11 (64.7%)

28 (52.8%)

18 (50%)

10 (58.8%)

25 (47.2%)

18 (50%)

7 (41.2%)

23 (43.4%)

15 (41.7%)

8 (47.1%)

26 (49.1%)

18 (50%)

8 (47.1%)

4 (7.5%)

3 (8.3%)

1 (11.8%)

17 (32.1%)

10 (27.8%)

7 (41.2%)

9 (17%)

8 (22.2%)

1 (5.9%)

22 (41.5 %)

15 (41.7%)

7 (41.2%)

5 (9.4%)

3 (8.3%)

2 (11.7%)

18 (34%)

12 (33.3%)

6 (35.3%)

10 (18.9%)

6 (16.7%)

4 (23.5%)

22 (41.5%)

15 (41.7%)

7 (41.2%)

3 (5.6%)

3 (8.3%)

0 (0%)

P value

Age (years)a <58 >58

n.s.

Smoking history Non-smoker Current or ex-smoker

n.s.

Gender Male Female

n.s.

Histologic type Squamous cell Adenocarcinoma Adenosquamous

n.s.

Pathologic stage Stage I Stage II Stage III Stage IV

n.s.

Therapy Chemotherapy Chemo-radiotherapy Surgery Palliative therapy

n.s.

Elsőként javasoltuk a keringő EPC meghatározást tüdőrákos betegek monitorozására. Két diagnosztikus EPCmódszert is kidolgoztunk: az áramlási citometriás immuncitokémiai módszert és az ennél érzékenyebb molekuláris diagnosztikai módszert. Vizsgálataink alapján megállapítható, hogy érzékeny módszereket dolgoztunk ki a tüdőrákok angiogén fenotípusának kimutatására (áramlási citometria+immuncitokémia illetve VEGFR2-qPCR), melyek alkalmasak a standard terápiás kezelés hatékonyságának monitorozására is. A kidolgozott módszereket nemzetközi közlemény validálja (Döme et al, Cancer Res,2006)

12

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2.2. Innovatív molekulatervezés felhasználása új anti-angiogenetikus szerek kifejlesztésére : dr. Patthy László, MTA Enzimológiai intézet 2.2.1.Előállítjuk a rekombináns PEX fehérjét és származékait, valamint az αvβ3 integrin extracelluláris régióját és vizsgáljuk kölcsönhatásukat. Bevezetés Célunk a tumor növekedést és metasztázisok kialakulását gátoló terápia kidolgozása céljából a tumor angiogenezist megakadályozó, az αvβ3 integrinen keresztül ható angiogenezis inhibitorok és receptoruk közötti kölcsönhatás vizsgálata. Néhány extracelluláris mátrix fehérje degradációjából származó fragmentről kimutatták, hogy gátolja az angiogenezist. Ilyen fehérjék a plazmin degradációjával keletkező angiosztatin a XVIII kollagén fragmentje az endosztatin, a IV kollagénből származó tumstatin, a thrombospondin egyik fragmentje, a fibronektin fragment anastellin és a zselatináz A PEX doménje. A fehérjék angiogenezist gátló hatásának molekuláris mechanizmusát vizsgálva kiderült, hogy a fehérjék egy része integrineken keresztül fejti ki hatását. A tumsztatin, angiosztatin, PEX domén az αvβ3, az endosztatin, anastellin pedig az α5β1 integrinhez kötődik. Az angiogenezisben mind proteolitikus mind sejtadhéziós folyamatok lényeges szerepet játszanak. A plazmin/angiosztatin és a zselatináz A/PEX domén esetében az antiangiogenetikus hatással rendelkező fehérje fragmentek az αVβ3 integrinhez kötődve gátolják a proteázok (plazmin, zselatinázA) kötődését, ezáltal mind a felszini proteolízist, mind a integrinen keresztül kiváltott sejtproliferációt gátolják. Az αvβ3 integrin számos extracelluláris mátrix fehérje, pl. fibronektin, vitronektin, fibrinogén receptora. A receptor extracelluláris részének háromdimenziós szerkezetét röntgenkrisztallográfiával határozták meg (www.pdb.org: 1JV2, 1L5G, 1M1X). A két alegység az α alegység β-propeller doménjén (PROP) és a β alegység I-like doménjén, (von Willebrandt faktor like domain (VWFA)) keresztül kapcsolódik egymáshoz, a két domén közösen alakítja ki az RGDkötő felszínt. A receptor Mg 2+ és Ca 2+ ionokat köt. A fémkötő helyek fémkötése mind a molekula térszerkezetét, mind ligandkötését befolyásolja. Az zselatináz A PEX doménje és receptora közötti kölcsönhatás szerkezeti hátterének és a jelátvitel mechanizmusának tisztázása révén várható, hogy kis molekulasúlyú angiogenezis inhibitorokat lehet kifejleszteni, melyek hosszan tartó tumor-terápiában alkalmazhatóak. A PEX domén és receptora közötti kölcsönhatás jellemzéséhez szükséges a PEX domén és a receptor fehérje extracelluláris régiójának előállítása. Jelentésünkben beszámolunk a PEX domén és a receptor fehérje extracelluláris régiójának klónozásáról. Anyagok és módszerek Az αVβ3 integrin extracelluláris PROP és a VWFA doménjeinek klónozása A PROP és a VWFA doméneket kódoló cDNS-t PCR reakcióban amplifikáltuk: Az αv alegység PROP doménjét kódoló cDNS-t human fetalis vese cDNA könyvtárból amplifikáltuk az 5’ GG GGA ATT CGC GCC TTC AAC CTA GAC G 3’forward és 5’ GG GGG ATC CGG TCT GGC CCT GTA TAA GAT 3’reverse primerek segítségével. A β3 alegység vWFA doménjét kódoló cDNS-t pedig human fetalis máj cDNA könyvtárból az 5’ GG GGA ATT CGG GAT TAC CCT GTG GAC ATC 3’ forward és 5’ GGG GGA TCC GAA CGG ATT TC CCA TAA GCA 3’reverse primerekkel amplifikáltuk. A PCR reakció körülményei a két reakciónál egyformák voltak: egyszeri 3 perces 95 Co -on történt denaturálást követően, 35 ciklusban - 95 Co 30 mp, 58 Co 1 perc és 72 Co2 perc - amplifikáltuk a DNS-t. A PCR termékeket M13mp19 bakteriofág EcoRI/BamHI helyére klónoztuk . A klónokat szekvenálással ellenőriztük. PROP és a VWFA domének expressziója P.pastoris-ban A fehérjéket Pichia pastoris metilotróf élesztőben terveztük előállítani. Ehhez az Invitrogen EasySelectTM Pichia Expression Kit-jét választottuk. Az M13mp19 vektorból EcoRI és XbaI enzimekkel kihasított inszerteket ugyanezzel a két enzimmel hasított pPICZαB vektorba klónoztuk. A vektor zeocin rezisztencia gént és ColE1 replikációs origót hordoz, így a rekombinánsok E. coli JM109 törzsben zeocinos szelekciót alkalmazva fenntarthatók.A vektorban az expresszálni kívánt fehérjét kódoló DNS 5’ végéhez az élesztő alpha-factor signál szekvenciája kapcsolódik, így az expresszált fehérje szekretálódhat a táptalajba. Az expressziót a Pichia pastoris AOX1 promotere szabályozza, ennek következtében metanollal indukálható. A klónokat restrikciós endonukleázos emésztéssel és részleges újraszekvenálással hitelesítettük. A vektorokat Pme I restrikciós endonukleázzal linearizáltuk, a linearizált DNS-sel P. pastoris GS115 sejteket transzformáltunk, a transzformánsokat zeocinnal szelektáltuk. A zeocin rezisztens klónokból genomiális DNS-t preparáltunk, és az amplifikáláshoz használt primerekkel PCR-rel ellenőriztük, hogy tartalmazák-e a megfelelő domének cDNS-ét. Az αVβ3 integrin extracelluláris PROP és vWA doménjeit együtt expresszáló Pichia pastoris sejtek izolálása A koexpresszióhoz az integrin extracelluláris doménjeit a pPIC9K vektorba építettük. Ehhez a pPICZαB-PROP és pPICZαB-vWA vektorokból EcoRI és AgeI restrikciós enzimekkel az inszerteket kihasítottuk és az ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pPIC9K vektorba építettük. A helyes leolvasási keret kialakításáért a pPIC9K-PROP’ és pPIC9K –vWA’ vektorokat EcoRI restrikciós enzimmel hasítottuk, Klenow polimerázzal a ragadós végeket feltöltöttük majd újra összeligáltuk. Az expresszió ebben az esetben is metanollal indukálható és az expresszált fehérje szekretálódhat a táptalajba. A pPIC9K vektor egy G418 antibiotikum rezisztenciagént hordoz így a kétféle antibiotikummal – zeocin és G418- szelektálva, lehetőség nyílik olyan élesztősejtek izolálására, amelyek mindkét expressziós konstrukciót

13

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ hordozzák.Ezért a pPICZαB-PROP és pPIC9K-vWA illetve a pPICZαB-vWA és a pPIC9K-PROP vektorokkal egyszerre transzformáltunk GS115 Pichia pastoris sejteket, zeocint és G418 antibiotikumot tartalmazó táptalajon izoláltunk olyan élesztó klónokat melyek alkalmasak lehetnek a két fehérje koexpressziójára. PROP és a VWFA domének expressziója E.coli-ban A doméneket kódoló DNS-ket pmed23 expressziós vektor PvuII/BamHI helyére szubklónoztuk. Az így kapott vektorokkal E. coli JM109 sejteket transzformáltunk. A fehérjék termelése isopropil β-D thiogalaktopiranoziddal (IPTG-vel) indukálható. Az indukció hatására a baktériumok mindkét esetben nagy mennyiségben termelik a béta galaktozidáz első 35 aminosavát is tartalmazó fúziós fehérjéket. A fehérjéket inklúziós testből tisztítottuk: 100 mM Tris-HCl, 8 M urea, 5 mM EDTA, 100 mM DTE pH 8.0 pufferben oldottuk és a denaturált, redukált mintát 100 mM Tris-HCl, 8 M urea, 10 mM EDTA, 0.1% 2-mercaptoethanol, pH 8.0 pufferrel ekvilibrált Sephacryl S300 oszlopon kromatografáltuk (2.ábra.). A rekombináns fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítettük és refoldáltattuk. A fehérjét intenzív keverés közben 10-szeres térfogatú 50mM TAPS pH 9.0 oldattal kihigítottuk és 24 órán keresztül refoldáltattuk. A kicsapódott fehérjefrakciót centrifugálással eltávolítottuk, a felülúszót 3x 3l 100mM ammonium bikarbonát oldattal szemben dializáltuk és liofilizáltuk. A refoldált fehérjét a polimerektől gélszűréssel választottuk el. A humán zselatináz A hemopexin doménjének klónozása A zselatináz A PEX doménjét kódoló DNS-t az 5’ GCG AAT TCG ATC TGC AAA CAG GAC ATT GTA TTT G 3’forward és 5’ GCA AGC TTG CAG CCT AGC CAG TCG G 3’reverse primerekkel PCR reakcióval amplifikáltuk. A reakcióban a teljes zselatináz A-t kódoló cDNS-t tartalmazó pGEL 186.2 plasmidot használtuk templátként. (A plazmid Dr. Greg Goldbergtől, St. Louis, MO származik. ) A PCR reakció körülményei: 3 percig 95 Co -on történt denaturálás után 35 ciklusban - 95 Co 30 mp, 62 Co 1 perc és 72 Co2 perc - amplifikáltuk a DNS-t. A PEX domént kódoló DNS-t EcoRI és HindIII restrikciós enzimekkel történt emésztést követően a pCDFDuet-1 bakteriális expressziós vektor EcoRI/HindIII helyére ligáltuk. A ligáló reakció eleggyel Escherichia coli JM 109 baktérium sejteket transzformáltunk és 25 µg/ml Streptomycint tarlamazó táptalajon szelektáltuk. A PEX domént tartalmazó telepeket PEX specifikus primerekkel végzett telep-PCR reakcióval azonosítottuk. A pozitív klónokból izolált plazmidot szekvenálással ellenőriztük. A pCDFDuet-1 vektor T7lac promotert és az iniciációs metionin és a poliklónozó hely közé épített, hat hisztidint kódoló DNS-t – un. His-tag-t - tartalmaz. Ezért a fehérje termeléshez az ellenőrzött és hibátlan szekvenciájú, PEX domént tartalmazó plazmidot Escherichia coli BL21 (DE3) baktérium sejtekbe kell juttatni. Ezek a sejtek ugyanis hordozzák a T7 RNS polimeráz génjét, így képesek arra, hogy IPTG-vel történt indukció hatására expresszálják a PEX domént. Az expresszált fehérje N-terminális végén levő His-tag lehetővé teszi a fehérje Ni-kelát affinitás kromatográfiával történő tisztítását. Eredmények Az αVβ3 integrin extracelluláris régiójának előállítása Emberi embrionális vese illetve máj cDNS könyvtárból sikerült amplifikálni majd kétféle expressziós rendszerbe is beépíteni az integrin két alegységének extracelluláris doménjeit kódoló DNS-t. A szekréciós élesztő expressziós rendszer előnye a bakteriális rendszerekkel szemben, hogy a szekretálódott fehérjék térszerkezete általában ép, a natív szerkezethez hasonló. Ezért tartottuk célszerűnek a αVβ3 integrin alegységeinek extracelluláris doménjeit ebben a rendszerben előállítani. Az élesztő táptalajban azonban nem tudtuk kimutatni a fehérjéket. Ennek, egyes irodalmi adatok szerint, oka lehet az, hogy a két domén csak egymás jelenlétében veszi fel natív szerkezetét. Ezért kísérletet tettünk a két fehérje élesztőben történő koexpressziójára. Mindkét fehérjét kódoló DNS-t beépítettük egy új élesztő expressziós vektorba. A korábbi expressziós konstrukcióhoz hasonlóan, az új expressziós vektorban is a fehérje termelése metanollal indukálható és a képződött termék a táptalajban szekretálódik. Az új vektor azonban más antibiotikum rezisztencia gént hordoz, így lehetőség nyílik olyan Pichia pastoris élesztő sejtek előállítására amelyek mindkét alegység extracelluláris doménjét tartalmazzák. A kettős antibiotikum rezisztenciát mutató élesztősejtekben molekuláris biológiai módszerekkel kimutattuk mindkét alegység extracelluláris doménjét kódoló DNS beépülését az élesztő genomba, azonban metanolos indukciót követően az élesztő táptalajban nem tudtuk kimutatni a fehérjéket. Bakteriális expressziós rendszer esetében nagy mennyiségű fehérje termelődött. A fehérjék natív körülmények között oldhatatlan un. inklúziós testet képeztek. Az inklúziós testből denaturáló/redukáló körülmények között feloldott fehérjéket ugyancsak denaturáló/redukáló körülmények között gélszűrve elválasztottuk a bakteriális szennyezés nagy részétől. Az ilyen módon részlegesen megtisztított fehérjét 10-szeres térfogatra higítottuk és refoldáltattuk. A refoldálás során nemcsak monomer hanem a fehérjék polimer formája is keletkezett. A humán zselatináz A hemopexin doménjének előállítása A megadott körülmények között végzett PCR reakcióval amplifikáltuk a Pex domént kódoló 596 bp méretű DNS-t és beépítettük a pCDFDuet-1 vektorba. A telep-PCR reakcióban pozitív klónokból plazmid DNS-t izoláltunk, szekvenciáját ellenőriztük és egy hibátlan szekvenciájú DNS-sel E.coli BL21(DE3) sejteket transzformáltunk. Az elvégzett próbaindukció szerint a sejtek nagy mennyiségben expresszálják a várt 24 kDa fehérjét.

14

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2.3. Erythropoetin-indukált érelváltozások funkcionális jelentőségének elemzése daganatokban. Témavezető dr Tímár József, dr. Romány Anna, Janssen.Cilag kft 2.3.1. EPO kezelés hatása vastagbélrák és fejnyaki rák ereződésére neoadjuváns kezelés során: fázis-III vizsgálat

Erythropoietin alfa (EPO) kezelés hatása vastagbélrák és fejnyaki rák ereződésére neoadjuváns kezelés során: prospectiv klinikopatológiai vizsgálat 2006: Vizsgálati protokoll elkészítése, Etikai engedély megkérése céljából. Miután az EPO-t az ipari partner biztosítja a vizsgálat során, a protokoll angol nyelven készült, mert azt a partner külföldi központja felé is továbbítjuk. Study protocol Sponsor: Researcher initiated study in the National Institute of Oncology Budapest, Hungary, with the financial support of NKFP1a-0024-05. Study title: A case control study on the effect of recombinant human erythropoietin alpha on the vascularization of locally advanced head and neck cancers Study director: József Tímár MD, PhD, DSc Professor of Pathology, Department of Tumor Progression, National Institute of Oncology, 7-9 Ráth Gy. Street, 1122 Budapest, Hungary, Phone: (36-1)-224-8600, Fax: (36-1)-224-8600, e-mail: [email protected] Principal investigator: Éva Remenár, MD, PhD, Department of Head and Neck Surgery Co-principal investigator: Csaba Polgár MD, PhD, Department of Radiotherapy Investigators: prof. Miklós Kásler, MD, PhD, Károly Pólus MD, PhD, András Boer MD, József Lövey MD, PhD, Agnes Janovics MD Responsible pharmacist: Éva Vonákné Petrovics Trial monitor: prof. György Németh MD, PhD, DSc Synopsis Title of the study: Investigation of the effect of recombinant human erythropoietin alpha on the vascularization of locally advanced head and neck cancers Study site: National Institute of Oncology, 7-9 Ráth Gy. Street, 1122 Budapest, Hungary Duration of the study: Enrollment of eligible patients for 24 months. All subjects to be followed for survival Clinical phase: A case control phase II. clinicopathological study Objectives Primary objective: To demonstrate vascular alterations in cancer tissue when patients are treated with EPOα for anaemia Secondary objectives: to demonstrate vascular changes in retinal vessels in cancer patients treated with EPOa for anaemia. Rationale: Anemia, a common complication in cancer patients, induces fatigue, weakness, impaired concentration, resulting in diminished physical capacity and poor quality of life. Numerous clinical data suggest that hypoxia in cancers enhances their aggressiveness and promotes malignant progression. Hypoxia is an independent prognostic factor in some malignant cancers such as cervical carcinoma and head and neck tumors. However, the correction of anemia, and the increased oxygen level inside the tumor not only result in an improvement in the quality of life but enhance the success of cancer therapy as well, leading to improved survival of patients. Recombinant human erythropoietin (rHuEPO) is widely used for correction of hemoglobin level by increasing the number of red blood cells. Recent studies show that, beside hematopoietic progenitor cells, numerous other cell types (endothelial and cancer cells) express erythropoietin receptor (EPOR), and rHuEPO may affect their

15

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ functions. Previous data indicated that the oxygen level in the tumor tissue influences the success of anticancer therapy. On the other hand, data also suggested that rHuEPO can increase the oxygen level in the tumor mass independently of hemoglobin level (11). These data together suggested that rHuEPO may influence tumor perfusion through the tumor vasculature. In our human epidermoid and colorectal cancer xenograft models rHuEPO prevented the decrease in RBC and hematocrit values, had no effect on the growth of tumors, but significantly increased the antitumor efficacy of 5-Fluorouracil. The major “side effect” of erythropoietin, beside influencing hematopoiesis, is its effect on endothelial cell proliferation. It is well documented that endothelial cells express EPO receptor, and several data indicated that EPO inhibited apoptosis, and induced proliferation and migration of these cells. EPO is a potent angiogenic factor comparable in its effect to VEGF. rHuEPO stimulated the endothelial tube formation in vitro and angiogenesis in chicken chorioallantois membrane assay in vivo. rHuEPO treatment did not affect the microvessel density of human cancer xenografts in our study but induced a significant vessel enlargement. To explore the background of the rHuEPO-induced increase in vessel size, we measured the proliferation index in the tumor mass using BrdU. Notwithstanding that A431 tumor cells express the EPO receptor, their proliferation index did not change upon rHuEPO treatment, corresponding to the results of our in vitro proliferation tests. On the other hand, rHuEPO significantly increased the endothelial cell proliferation inside the living tumor mass, without affecting pericytes, resulting in incompletely covered endothelial channels in the tumor tissue. Our result that both the host- and tumor-derived VEGF expression had decreased significantly in rHuEPO-treated xenogratfs compared to controls suggests, that the rHuEPO-corrected RBC and hematocrit levels (as well as hypoxia) may control tumoral VEGF expression. Taken together, these data demonstrate that rHuEPO had profound effect on tumoral blood vessels in human epidermoid and colorectal cancer xenograft models. rHuEPO did not influence the density of microvessels, but increased their size due to the selectively enhanced proliferation of endothelial cells. The increased vessel surface resulted in improved drug delivery to tumor cells and augmented its antitumor effectiveness. These effects of rHuEPO were restricted to tumoral vessels, since there were no alterations observed in microvessels of mouse muscle or hepatic tissues. Based on these preclinical results studies are urgently needed to test the general nature of these observations in rHuEPO-treated cancer patients. Accordingly, the aim of the present clinical trial is to study the vascular effects of EPO treatment in head and neck and rectal cancer patients. Using pre- and post-EPO biopsies a detailed pathological analysis on tumoral and stromal vessels will be carried out using immunohistochemistry and morphometry. Furthermore, these studies will be completed with ophthalmic analysis of retinal microvasculature to test EPO effect in cancer patients. It is expected that a selective modulation of tumoral blood vessels will be demonstrated in EPO-treated cancer patients. Ref.: Tóvári J, Gilly R, Rásó E, Paku S, Bereczky B, Varga N, Vágó Á, Tímár J. Recombinant human erythropoietin α targets intratumoral blood vessels, improving chemotherapy in human xenograft models. Cancer Res 65:7186-7193, 2005 Methodology: A single center case control clinical-pathological study in subjects with stage III head and neck cancers. The study to be conducted in concordance with the ICH-GCP requirements. Type of blinding: not applicable Sample size: 40 patients receiving rHuEPO and 40 patients selected as case controls. Diagnosis and criteria for inclusion: patients with histologically proven stage II-III squamous cell cancer of head and neck. Initial pretreatment Hgb level must be below 13. Age>18 years. KPS<70, ECOG 0-1. Test product, mode of administration: Epoetinum alfa 0.084 mg (10000NE) injection, subcutaneous administration. Reference therapy: Head and neck cancer: concomitant chemoradiation with standard simulation based 2D fields or 3D conformal radiotherapy. Dose of gross tumor volume 70 Gy, high risk local and nodal areas 60 Gy and elective volumes 50 Gy with conventional 2 Gy fractions, 5 fraction per week. Spinal cord maximal dose 46 Gy. Chemotherapy consist of three cycles of cisplatin, 100 mg/m2 on week 1, 4 and 7. Duration of treatment: Reference therapy: 7 weeks from initiation Erythropoetin: Registered usage is followed: Treatment can be started following two independent haematology test proving Hgb under 13 g/l and serum iron levels are normalized. Treatment can be started before chemoradiation starts or on the first day of reference therapy.

16

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Evaluation criteria Primary endpoint: vascular changes in the tumor and normal tissues measured as microvascular density of tumors after EPO treatment versus at diagnosis and vascular changes in the retina of the study subjects determined on 6th week of EPO treatment. Secondary endpoints: overall survival, progression free survival, quality of life, side effects of EPO treatment Statistical methods: Vasularization data is to be analyzed by Fisher’s exact test, chi-squared test, ANOVA, univariate and multivariate COX regression, survival data by Kaplan-Meier method. Phase and visit schedule Screening phase 14 days prior the initiation of treatment. Treatment phase: 7 weeks of reference therapy Follow-up phase: unbtil 60 week as shown in the flowchart. After 60 week every 3 moths until 2 years from the beginning of therapy. After tow years every 6 months and after 5 years every year.

Flowchart of the trial

Informed consent Eligibility criteria Medical history Physical examination Demographics Vital signs PS QoL assessment Chest X-ray CT or MR, Fiberoscopy Ophthalmology of the retina Biopsy Hematology+iron Serum chemistry Coagulation Concomitant Medication EPO Adverse events Study termination report

Screening 2 weeks prior treatment

Treatment phase visit 1 w1

+ + + +

+

+ + +

+ + +

visit 2 w2

visit 3 w3

visit 4 w4

visit 5 w5

visit 6 w6

+ +

+

+ + + +

+ +

+

+

visit 7 w7

visit 8 w15

visit 9 w23

visit 10 w35

visit 11 w47

visit 12 w60

+

+

+

+

+

+

+

+ + +

+ +

+ + + + + +

+ +

+ + +

+ +

+

+ +

+

+ + + + +

+

+

3xW +

+ +

+

+

+ + + +

+

+

+ +

3xW +

3xW +

3xW +

3xW +

3xW +

3xW +

+ + + +

+

+ + + +

+

+ + + +

+

+

+

+

+

Abbreviations: PS. Performance status, QoL: qualitiy of life, CT: computed tomography, MRI: magnetic resonance imaging, 3xW: rHuEPO, 10000 IE, 3 times per week

17

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2.3.1. EPO kezelés hatása tüdőrákok ereződésére kemoterápiás kezelés során: klinikopatológiai vizsgálat (dr. Kovács Gábor, dr. Romány Anna, Janssen-Cilag kft)

A humán rekombináns erythropoietin hatása a citosztatikus kemoterápia mellékhatásaként kialakult anaemiára lokálisan előrehaladott és előrehaladott stádiumú tüdőrákos betegek esetében: a klinikai kórlefolyás, a keringő endothel őssejtszám, a szolubilis angiogén citokin (VEGF, FGF, PDGF) expresszió és a tumorsejt EPOR expresszió vizsgálata. 2006: Vizsgálati protokoll elkészítése, Etikai engedély megkérése céljából Study protocol Sponsor: Researcher initiated study in the National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology, Hungary, with the financial support of NKFP1a-0024-05. Study title: An open labeled clinico-pathological study on the effect of rHuEPO on the chemotherapy induced anaemia in locally advanced and advanced lung cancer patients: analysis of the clinical outcome and the numbers of circulating endothelial progenitor cells, serum levels of angiogenic cytokines (VEGF, FGF and PDGF) and expression of EPOR in tumor cells. Study director: József Tímár MD, PhD, DSc Professor of Pathology, Department of Tumor Progression, National Institute of Oncology, 7-9 Ráth Gy. Street, 1122 Budapest, Hungary, Phone: (36-1)-224-8600, Fax: (36-1)-224-8600, e-mail: [email protected] Principal investigator: Gábor Kovács, MD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Co-principal investigator: Gyula Ostoros MD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Investigators: Balázs Döme MD., PhD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology; János Strausz MD, PhD, DSc., Director, National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Responsible pharmacist: Hegedűsné Lászlóné, National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Trial monitor: dr. Ágoston Péter Synopsis Title of the study: An open labeled clinico-pathological study on the effect of rHuEPO on the chemotherapy induced anaemia in locally advanced and advanced lung cancer patients: analysis of the clinical outcome and numbers of circulating endothelial progenitor cells, serum levels of angiogenic cytokines (VEGF, FGF and PDGF) and expression of EPOR in tumor cells.. Study site: National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology, Piheno Street, 1529 Budapest, Hungary Duration of the study: eligible patients who received two complete cycles of chemotherapy during the 18 months enrollment period. All subjects to be followed for quality of life, response rate, time to progression and overall survival. Clinical phase: A phase II/III clinical-pathological trial Objectives Primary objective: To demonstrate alterations of circulating endothelial progenitor cell (EPC) numbers, soluble angiogenic cytokine levels (VEGF, FGF, PDGF) in chemotherapy and EPO treated small cell and non-small cell lung cancer patients. Definition of the correlation between the tumoral EPOR expression (in surgically removed specimens and on circulating tumor cells) and the clinical outcome. Secondary objectives: Changes in haemoglobin levels during EPO treatment concerning the angiogenic cytokine expressions Response rate, quality of life, time to progression, overall survival concerning the above mentioned biological markers Rationale:

18


Recent studies show that, beside haematopoietic progenitor cells, numerous other cell types (endothelial and cancer cells) express erythropoietin receptor (EPOR), and rHuEPO may affect their functions. Moreover, we have demonstrated previously that in human cancer xenograft models rHuEPO prevents the decrease in RBC and haematocrit values, has no effect on the growth of tumors, but significantly increases the antitumor efficacy of 5-fluorouracil. Although we detected EPOR in human squamous cell carcinoma and colon adenocarcinoma cells, in contrast to the suggestion of others, in vitro rHuEPO treatment did not stimulate cell proliferation at human-equivalent dose. In contrast, we demonstrated that rHuEPO administration significantly increase the proliferation of the tumor-associated endothelial cells and the size of intratumoral blood vessels. The increased vessel surface resulted in improved drug delivery to tumor cells and augmented the antitumoral effects of 5fluorouracil (Tovari J et al. Cancer Res 2005; 65:7186-93.). Although rHuEPO is frequently used for the correction of chemotherapy induced anaemia in lung cancer patients, our previous and several other data indicate that human lung cancer cells express the EPO-receptor (Dagnon K et al. Clin Cancer Res 2005; 11:993-9). The receptor experience on the lung cancer cells generates the question, whether the rHuEPO treatment of these cells can influence their proliferation activity. Based on these experimental and preclinical results, and on the fact that controversial data have been published with the combination of EPO and chemotherapy in cancer patients (Bohlius J et al. Nat Clin Pract Oncol 2006, 3:152-64.), the aim of the present clinical trial is to study the effects of EPO treatment in nonsmall cell lung cancer patients on the alterations of circulating endothelial progenitor cell (EPC) numbers, the soluble angiogenic cytokine levels (VEGF, FGF, PDGF) and on the clinical outcome (RR, QOL, TTP, OS). Methodology: A single center phase II/III clinical-pathological study in EPO treated small and nonsmall cell lung cancer patients with chemotherapy induced anaemia. The study to be conducted in concordance with the ICH-GCP requirements. Type of blinding: open label Sample size: 30 patients receiving rHuEPO with chemotherapy induced anaemia in lung cancer Diagnosis and criteria for inclusion: patients with histologically and/or cytologically proven stage III/IV lung cancer. Age>18 years. ECOG 0-2. Test product, mode of administration: Recombinant human erythropoietin alpha; s.c., 25-100 IU/three times per week Evaluation criteria Primary endpoint: To demonstrate alterations of circulating endothelial progenitor cell (EPC) numbers, soluble angiogenic cytokine levels (VEGF, FGF, PDGF) in chemotherapy and EPO treated small cell and non-small cell lung cancer patients. Definition of the correlation between the tumoral EPOR expression (in surgically removed specimens and on circulating tumor cells) and the clinical outcome. Secondary endpoints: Changes in haemoglobin levels during EPO treatment concerning the angiogenic cytokine expressions Response rate, quality of life, time to progression, overall survival concerning the above mentioned biological markers Statistical methods: experimental and clinical data are to be analyzed by Fisher’s exact test, chisquared test, ANOVA, univariate and multivariate COX regression, survival data by Kaplan-Meier method. Phase and visit schedule Screening phase In case of haemoglobin level below than 11g/dl at the initiation of treatment. Treatment phase: until Hg level >13 g/dl and/or after 3 weeks following chemotherapy Follow-up phase:18 months

19


Flowchart of the study Screening Treatment 2 weeks phase prior visit 1 visit visit visit visit visit visit visit visit visit visit Visit treatment 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Informed consent Eligibility criteria Medical history Physical examination Demographics Vital signs PS Radiological imaging Hematology Serum chemistry Concomitant Medication

+

EPC **EPO medication

+

Adverse events

+

+ + +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Started here +

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

* +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

The frequencies of the visits depending on the type of cytotoxic regimes are three or four weeks intervals. * three weeks after the last dose of chemotherapy; ** until Hg level >13 g/dl and/or after 4 weeks following chemotherapy

20

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Az erythropoietin szerepe a nem-kissejtes tüdődaganatok kezelésében, preklinikai vizsgálat Régóta ismert tény, hogy a kevésbé oxigenizált tumorszövetek kisebb mértékben érzékenyek a sugárkezelésre és a kemoterápiára, ugyanakkor a rosszabb oxigénellátottság növeli az áttétképzés valószínűségét. Daganatos betegekben a tumorok és a kezelések miatt is gyakran lép fel anaemia, amely jelentősen csökkenti a betegek életminőségét. Az anaemia csökkentésére ma már rutinszerűen alkalmazzák az erythropoietint, amellyel a normális hemoglobinszintet próbálják elérni a betegekben. A kísérletes és klinikai eredmények azonban ellentmondásosak a rekombináns humán erythropoetin (rHuEPO) onkológiai alkalmazásának tekintetében. Több kísérleti eredmény azt mutatja, hogy az rHuEPO érzékenyíti a daganatokat a kemoterápiára, fokozza a tumorellenes immunválaszt, valamint egyedül is képes daganatregressziót okozni. Azonban néhány újabb megfigyelés ellentmondásban van a pozitív eredményekkel. Több tumor expresszálja az EPO-receptort (EPOR), amely befolyásolhatja a daganatsejtek szaporodását. Az irodalomban több szöveti eredetű daganat esetében vizsgálták az rHuEPO lehetséges hatását. Jelenleg számos vizsgálat folyik rHuEPO-val a nem-kissejtes tüdődaganatok (NSCLC) esetében is a tumoros betegek kezelése során fellépő anaemia korrekciójára. Azonban a korábban említett lehetséges negatív hatások miatt fontos kérdés annak tisztázása, hogy vajon ezen daganatféleség esetében van-e valamilyen szerepe vagy közvetlenül, vagy a különböző terápiákkal kombinálva az rHuEPO-nak.Preklinikai vizsgálatainkban humán nem-kissejtes tüdőrák sejtvonalakon, valamint xenograft modelleken tanulmányoztuk az rHuEPO hatását. Immuncitokémiai és áramlási citométeres vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a különböző NSCLC sejtvonalak az EPOR-t különböző mértékben expresszálják. Ennek ellenére funkcionális vizsgálatainkban az rHuEPO-kezelés nem befolyásolta sejtvonalaink proliferációját, sem a gemcitabin proliferációgátló hatását in vitro.A kemoterápia in vivo hatásában szerepet játszhat az a korábbi megfigyelésünk más daganatféleségeken, hogy az rHuEPO fokozza a tumor indukálta neoangiogenezisben érintett erek endothelsejtjeinek proliferációját, amely nagyobb érfelületet eredményez, és ezzel párhuzamosan emelkedik a tumorszövetek perfúziója. Az NSCLC xenograftokkal végzett vizsgálataink is azt mutatták, hogy a tumoros erek az rHuEPO-val kezelt daganatokban szignifikánsan nagyobb átmérőjűek, amelynek az endotheliális sejtek proliferációjának fokozódása az oka. Sejtvonalak.Kísérleteinkben a következő, nem-kissejtes tüdőrák vonalakat használtuk: H1975, H358, H1650, HCC15 (valamennyi adenocarcinoma), valamint LCLC-LO3H (nagysejtes) és LOU-NH31 sejtvonalakat. EPO-receptor kimutatása áramlási citometriával. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a különböző eredetű tüdőrák sejtvonalak eltérő mértékben ugyan (10-57%), de valamennyien expresszálják az EPOR-t (1 ábra). 1. ábra. EPOR-pozitivitás vizsgálata különböző NSCLC-sejtvonalakban (áramlási citometria)

70%

EpoR-expresszió

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

HCC-15

H358

H1650

H1975

LCLC-LO3H

LOU-NH31

rHuEPO hatása az NSCLC sejtek in vitro proliferációjára.Bár az irodalmi adatok ellentmondásosak, a vizsgálatainkban az in vitro rHuEPO kezelés nem befolyásolta az EPO receptort expresszáló NSCLC sejteken proliferációját. (2 ábra). Az in vivo humán dózisnak megfelelő koncentráció az 1 IU/ml, de még ennek a 10-szerese sem okozott változást a sejtek szaporodásában.

21

Extinkció

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2. ábra. rHuEPO hatása NSCLC sejtek in vitro proliferációjára.

1,600000

HCC-15

1,400000

H358

1,200000

H1650

1,000000

H1975

0,800000 0,600000 0,400000 0,200000 0,000000

Kontroll

0,1 U/ml

1 U/ml

10 U/ml

Epoetin alfa

Tumortérfogat (mm 3)

rHuEPO hatása NSCLC sejtek in vivo növekedésére és tüdőkolonizációjára. Kísérleteinkben 106 H1975 tumorsejtet oltottunk SCID egerekbe subcutan, és a tumoroltással egyidejűleg megkezdtük az rHuEPOα kezelést a humán protokollnak megfelelően: heti 3 alkalommal 150 IU/kg dózisban. A tumorokat, miután elérték az 50 mm3-es nagyságrendet (14 nappal az oltás után) elkezdtük Gemzarral kezelni (a humán dózisnak megfelelően, heti egy alkalommal). Az eredményekből megállapítható, hogy az rHuEPOα kezelés nem hogy nem fokozta, még csökkentette is az EPOR+ tumorok növekedését (3. ábra). A Gemzarral történt kombinációs kezelésben érdemben nem befolyásota annak hatását, mivel a Gemzar magában is igen jelentős tumornövekedést gátló hatást mutatott. A H358 sejtekkel végzett tüdőkolonizációs tesztben az rHuEPO kezelés nem befolyásolta szignifikánsan a kialakuló kolóniák számát, azonban fokozta a Gemzar antitumorális hatását (4. ábra). 3. ábra. rHuEPO- és Gemzar-kezelés hatása HT1975 sejtek sc. növekedésére SCID egérben.

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

Kontroll Epo Gem zar Epo+Gem zar

21

24

27

31

36

Oltástól eltelt idő (nap)

4. ábra. rHuEPO és Gemzar hatása H358 NSCLC sejtek tüdőkolonizációjára (mikrometastasisok) 9 8

tüdőkolóniák száma

7 6 5 4 3 2 1 0

Kontroll

EPO

Gemzar

22

EPO+Gemzar

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ rHuEPO hatása az endotheliális sejtek proliferácójára Korábbi kísérletes megfigyeléseinkhez hasonlóan, az NSCLC xenograftban is megfigyelhető volt, hogy az rHuEPO kezelés hatására nagyobb átmérőjű erek keletkeztek a daganatszövetben. Ezután kísérleteinkben meghatároztuk a subcután H1975 xenograftokban a tumorsejtek és az endotheliális sejtek osztódási indexét. Eredményeink azt mutatják, hogy ugyan mind a két sejttípus expresszálja az EPO receptort, azonban a daganatsejtek proliferációját nem befolyásolja a rHuEPO kezelés, míg az endotheliális sejtek kiugróan magas százalékban osztódnak a kezelt daganatokban (5. ábra). Ez egy lehetséges magyarázatot ad a megfigyelt nagyobb átmérőjű erekre, és ugyanakkor alátámasztja azt, hogy az EPO receptor jelenléte egy daganatsejten nem jelenti egyértelműen az rHuEPO kezelés rossz hatását.

5.ábra. rHuEPO hatása H1975 xenograft tumor- és endotheliális sejtjeinek proliferációjára.

Proliferáló sejtmagok aránya

60% 50% 40%

Kontroll

30%

rHuEPO

20% 10% 0% Daganat sejtek

Endothel sejtek

Összefoglalva megállapítható, hogy preklinikai modellben emberi tüdőrákok in vivo növekedését nem befolyásolja az EPO adagolás. Másrészről, szemben a korábbi vélelmekkel az EPO kezelés nem rontja emberi tüdőrákok kemoterápiás érzékenységét. Harmadszor, a kiegészítő antihypoxia kezelés EPO-val fokozta a kemoterápia progresszió-fékező hatását. Mindezek a hatások a korábban más daganatban megfigyelt daganatos erekre gyakorolt EPO-hatásokon alapul (Tóvári és mtsai Cancer Res, 2005).

23

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2.4. ZD6474 angioszuppresszív szer tesztelése előrehaladott NSCLC tüdőrákos betegeken (dr. Kovács Gábor, dr. Kátai József, AstraZeneca kft.) 2.4.1. A klinikai protokoll kidolgozása

A ZD6474 hatása a keringő endothel őssejtek számára lokálisan kiterjedt és kiterjedt EGFR és VEGFR2 kettős pozitivitást mutató nem kissejtes tüdőrák (planocellularis és adenocarcinoma) harmadvonalbeli kezelésére. Fázis 2 placebo kontrollált vizsgálat Study protocol Sponsor: Researcher initiated study in the National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology, Hungary, with the financial support of NKFP1a-0024-05. Study title: A placebo controlled study on the effect of ZD6474 on the circulating numbers of bone marrow derived endothelial progenitor cells in patients with locally advanced and advanced EGFR and VEGFR2 double positive squamous cell- and adenocarcinoma of the lung pretreated with two different cytotoxic regimens: a phase II trial. Study director: József Tímár MD, PhD, DSc Professor of Pathology, Department of Tumor Progression, National Institute of Oncology, 7-9 Ráth Gy. Street, 1122 Budapest, Hungary, Phone: (36-1)-224-8600, Fax: (36-1)-224-8600, e-mail: [email protected] Principal investigator: Gábor Kovács, MD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Co-principal investigator: Gyula Ostoros MD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Investigators: Balázs Döme MD., PhD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology; Krisztina Bogos MD. Department IV., National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology; János Strausz MD, PhD, DSc., Director, National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Responsible pharmacist: Hegedűsné Lászlóné, National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology Trial monitor: dr. Ágoston Péter Synopsis Title of the study: A placebo controlled study on the effect of ZD6474 on the circulating numbers of bone marrow derived endothelial progenitor cells in patients with locally advanced and advanced EGFR and VEGFR2 double positive squamous cell- and adenocarcinoma of the lung pretreated with two different cytotoxic regimens: a phase II trial. Study site: National Koranyi Inst. of TB and Pulmonology, Piheno Street, 1529 Budapest, Hungary Duration of the study: Enrollment of eligible patients for 24 months. All subjects to be followed for survival. Clinical phase: A placebo controlled phase II. clinical-pathological trial Objectives Primary objective: To demonstrate alterations of circulating endothelial progenitor cell (EPC) numbers in response to ZD6474 treatment, as compared with placebo treated patients Secondary objectives: To demonstrate differences in EPC numbers between squamous- and adenocarcinoma patients in response to ZD6474 treatment, as compared with placebo treated patients Response rate of the ZD6474 treatment. Time to progression. Definition of the correlation between the EPC numbers and the clinical outcome Rationale: Vasculogenesis (defined as the in situ differentiation of vascular ECs from primitive precursor cells) has long been thought to occur only in the early phases of vascular development. Recent studies, however, have demonstrated that circulating bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) home to sites of physiological and pathological neovascularization and differentiate into ECs. EPCs may be mobilized by tumor tissue-derived cytokines from the bone marrow. Best characterized among these cytokines is VEGF. During tumor progression, the level of circulating VEGF has been shown to rise, and this level was found to correlate with the number of EPCs in the circulation. In a recent study of our group (Dome B et al. Identification and clinical significance of circulating endothelial

24

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ progenitor cells in human non-small cell lung cancer. Cancer Res 2006; 66:7341-7.) EPCs labeled with CD34, CD133, and VEGFR2 antibodies were counted by flow cytometry in the peripheral blood of NSCLC patients. Furthermore, by means of a quantitative reverse transcription-PCR approach, we measured VEGFR2, CD133, CD34, and VE-cadherin mRNA in the peripheral blood samples of the same patient population, and identified EPCs in tumor samples were identified by confocal microscopy using CD31, CD34, CD133, and VEGFR2 antibodies. In this study circulating EPC levels before therapeutic intervention were increased in NSCLC patients (P < 0.002, versus healthy controls), and high pretreatment circulating EPC numbers correlated with poor overall survival (P < 0.001). Furthermore, in the subgroup of responders to treatment, the posttreatment EPC numbers in the peripheral blood were significantly lower compared with nonresponding patients. Interestingly, pretreatment mRNA levels of CD133, VE-cadherin, and CD34 were not significantly increased in NSCLC patients, whereas VEGFR2 expression was increased by 80-fold. Moreover, posttreatment VEGFR2 mRNA level in the peripheral blood was significantly higher in the subgroup of nonresponding patients when compared with posttreatment level of patients responding to antitumor therapy. Conclusively, circulating levels of bone marrow-derived EPCs are significantly increased in NSCLC patients and correlate with clinical behavior. Based on these experimental and preclinical results, and on the fact that promising data have been published with the combination of ZD6474 (targeting VEGFR2, EGFR and RET) and chemotherapy in non-small cell lung cancer patients (Morabito A et al. Tyrosine kinase inhibitors of vascular endothelial growth factor receptors in clinical trials: current status and future directions. Oncologist 2006; 11:753-64.), studies are needed to test the effects of multitargeted TK inhibitors such as ZD6474 in lung cancer patients on tumor vascularization processes. Accordingly, the aim of the present clinical trial is to study the effects of ZD6474 treatment in non-small cell lung cancer patients. Since previous clinical experiences suggest that activity of TK inhibitors are higher in adenocarcinoma patients, we plan to investigate the EPC numbers in squamous versus adenocarcinoma patents, concerning the clinical outcome (TTP, OS, RR). Using pre- and post-ZD6474 blood, and pre-ZD6474 tumor tissue samples a detailed flow cytometrical and immunopathological analysis on circulating EPC numbers and tumoral EGFR and VEGFR2 expression will be carried out, respectively. It is expected that EPC numbers will be affected by ZD6474 therapy, and furthermore, that this targeted therapy will modulate positively the TTP and the OS, as correlated with the placebo control, separately examined the squamous and adenocacinoma patients. Methodology: A single center placebo controlled clinical-pathological study in subjects with previously treated stage IIIB and IV non-small cell lung cancers. The study to be conducted in concordance with the ICH-GCP requirements. Type of blinding: double blind placebo controlled trial Sample size: 40 patients receiving ZD6474 (20 patients receiving ZD6474, and 20 patients receiving placebo, randomly distributed) Diagnosis and criteria for inclusion: patients with histologically and/or cytologically proven EGFR/VEGFR2+ stage IIIB/IV non-small cell lung cancer. Age>18 years. ECOG 0-2. Test product, mode of administration: ZD6474 p.o. 300mg Evaluation criteria Primary endpoint: demonstrating alterations of circulating endothelial progenitor cell (EPC) numbers in response to ZD6474 treatment, as compared with placebo treated patients Secondary endpoints: demonstrating different alterations in EPC numbers between squamous- and adenocarcinoma patients in response to ZD6474 treatment, as compared with placebo treated patients Response rate of the ZD6474 treatment. Time to progression. Definition of the correlation between the EPC numbers and the clinical outcome Statistical methods: EPC data is to be analyzed by Fisher’s exact test, chi-squared test, ANOVA, univariate and multivariate COX regression, survival data by Kaplan-Meier method. Phase and visit schedule Screening phase 14 days prior the initiation of treatment. Treatment phase: until tumor progression Follow-up phase: every six weeks until death

25

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Flow Chart of the trial Screening Treatment 2 weeks phase prior visit 1 visit treatment 2 Informed consent Eligibility criteria Medical history Physical examination Demographics Vital signs PS Radiological imaging Hematology Serum chemistry Concomitant Medication

visit 3

visit 4

visit 5

visit 6

visit 7

visit 8

visit 9

visit 10

visit 11

visit 12

+ + + +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ Started here

+ +

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

EPC meghat ZD6474 or placebo medication Adverse + events

Abbreviations: EPC endothelial progenitor cell, EGFR epidermal growth factor receptor, VEGFR vascular endothelial growth factor receptor, PS. Performance status, TTP time to progression, OS overall survival

26

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 3. programcsomag: Új melanoma diagnosztikumok és terápiás eljárások fejlesztése 3.1. Melanóma marker azonosítása globális genomika segítségével (dr. Tímár József) 3.1.1.Új melanóma markerek expressziójának vizsgálata naevusban és melanómában-RT-PCR segítségével Korábbi NKFP programunk keretében jóindulatú melanocita daganat (naevus) és humán melanóma sejtvonalak génexpressziós mintázatát hasonlítottuk össze DNS chip módszerrel az SCBK chip-laborral kooperációban. A vizsgált 3.2 K-s platformon minimum 2x valamennyi sejtvonalban megnyilvánuló, amúgy szignifikáns expressziós eltérés alapján emeltük ki a melanóma-újjlenyomat génjeit. Ennek alapján 10 felülregulálódott és 4 alulregulálódott ismert gén találtunk (1. táblázat) 1.táblázat. Humán melanóma-specifikus génexpressziós mintázat (3.2K DNS chip, SZBK) Cell line WM35 HT168 HT199

Acc. number

Upregulated

D32002 X98330 H15417 U61167 X52851 *M74093 M32886 D436 AF047343 X76057

Nuclear cap binding protein Ryanodine receptor-2 Glutamate receptor 6 Human SH3 domain-containing protein SH3P18 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A (FKBP12.6) Cyclin E Sorcin MTG8a protein NADH:ubiquinone oxidoreductase Mannose phosphate isomerase

AF003837 U53468 X02761 X7812

Fold change

Downregulated Homo sapiens Jagged 1 (HJ1) Human NADGH:ubiquinone oxidoreductase subunit B13 Fibronectin 1 Glycerol kinase 2 (testis specific)

8.69 7.00 4.48 4.41 4.15 3.48 3.17 2.29 2.21 2.02

6.93 4.69 2.31 4.41 4.14 1.85 2.33 2.25 2.51 2.69

6.66 4.66 2.98 3.80 2.85 2.02 2.89 2.16 2.86 4.13

0.44 0.37

0.41 0.43

0.44 0.53

0.111 0.085

0.090 0.055

0.258 0.157

A cyclin E melanóma-specifikus marker-szerepét a pályázat elnyerése óta más csoport leírta (Bales et al, Cancer Res 65:695-697, 2005), ezért programunkat e tekintetlen módosítani kellett. Mindenesetre feltűnő volt, hogy a fokozottan expresszálódó gének közül 3 a CA++ jelátvitelben érintett gén: a szív típusú ER-CA csatorna a RyR2, és annak két szabályozója az FKBP12.6 és a sorcin. Első lépésben nPCR módszerrel kimutattuk a sejtvonalakban az autentikus gén expresszióját (1a. ábra), 2 különböző funkcionális doménre tervezett primerekkel, majd az expresszió szinteket is vizsgáltuk qPCR módszerrel és megállapítottuk, hogy a melanóma vonalakban valóban fokozott a génexpresszió melanocitákhoz képest (1a,b ábra). A PCR termékeket megszekvenálva igazoltuk az autentikus gén expresszióját és azt is, hogy mutációt a vizsgált régiókban nem hordoz. Maga a fehérje elsősorban a citoplazmában, de gyengébben a membránban is jelen volt (1c ábra-inzert) és kolokalizált a SERCA Ca csatornával. 10-10 naevus és primer bőr melanóma esetében immuhisztokémiai módszerrel is megvizsgáltuk, vajon a RyR2 eltérően jelenik-e meg a két lézióban és azt találtuk, hogy a RyR2 fehérje változó arányban, de csak a melanóma-mintákban volt jelen (1c ábra, jobboldali kép, citoplazmatikus zöld jelölés), míg a nevus melanocitái negatívak maradtak (1c ábra, baloldali kép). 1.ábra. RyR2 mRNS és fehérje expressziója emberi melanóma sejtekben (MC) és szövetben

27

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ A RyR2 funkcionális vizsgálata azért volt fontos, mert a fehérje marker szerepe mellett felmerült, hogy esetleg terápiás célpont is lehet. E célból specifikus ligandja segítségével mértük a Ca tranzienst emberi melanocitákban és melanóma sejtekben, de egyik esetben sem igazoltunk működő receptort (2a,b ábra). Ugyanakkor az ER SERCA csatornái működtek a Ca-pool mobilizálható volt mindkét sejttípus esetében (2c ábra). 2.ábra. A RyR2 működésének vizsgálata in vitro emberi melnaocitákban és melanóma sejtekben.

Egy melanóma vonalban korábban leírták a P2X7 purinerg receptor expresszióját. Ugyanakkor az nem volt ismert, hogy ez a jelenség mennyire általános, és hogy melanocitákban mi a helyzet. E célból immuncitokémiai módszerrel megvizsgáltuk a P2X1,2,4,7 receptorok kifejlődését, és azt találtuk, hogy a melanocitákban alig detektálható, (3b ábra), addig a melanóma sejtvonalakban nagy mennyiségben van jelen a P2X7 Ca++ csatorna (3a ábra), és a fehérje a sejtmembránba, illetve a citoplazmába lokalizálódik (3c ábra). A P2X7 két funkcionális doménjére tervezett PCR primerekkel igazoltuk, hogy a megfelelő méretű termékek vannak jelen (3d ábra), és a gén állapotát szekvenálással is megerősítettük. qPCR módszerrel azt találtuk, hogy mennyiségi különbség nincsen a melanocita és a melanóma sejtek génexpressziós szintje között. Ugyanakkor protein szinten Western blott segítségével is azt találtuk, amit az immuncitokémia mutatott, hogy a melanóma sejtekben sokkal több P2X7 fehérje van jelen (3e ábra). 3. ábra. P2X7 purinerg receptor kimutatása emberi melanocitákban és melanóma sejtvonalakban.

28

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Következő kérdésünk az volt, hogy az expresszálódó P2X7 hogyan működik melanocitákban, illetve emberi melanóma sejtekben. E célból a P2X7-agonista ATP, illetve bzATP-vel stimuláltuk a sejteket és vizsgáltuk a Ca++ tranzienseket. Ezek a vizsgálatok az mutatták, hogy a P2X7 melanocitákban nem működik (4a ábra), azonban mind a három melanóma sejtvonalban Ca++-tranziens váltható ki akár ismételt aktivitással is (4b ábra). Kíváncsiak voltunk arra is, hogy van-e valamilyen interakció a RyR2 és a P2X7 között, ezért az ATP stimulus mellé alacsony koncentrációjú 10 µM Ryanodint is adtunk. Meglepő módon azt találtuk, hogy a RyR2 stimulusa gátolja a P2X7 aktiválhatóságát (4c ábra). Tehát bár önmagában nem működött funkcionáló Ca csatornaként a RyR2, mégis modulálta a P2X7 funkcióját melanóma sejtekben. 4. ábra. P2X7 receptor működésének vizsgálata emberi melanocitákbkan és melanóma sejtekben

Mindezek alapján az merült fel, hogy lehet-e terápiás célpontként használni a P2X7 purinerg receptort melanómában? Ez annál is inkább izgalmas volt, mert a tirozin kináz gátlók az ATP kötő helyen kötődnek általában és ez esetben (a később említendő EGFR/CMET projectre gondolva), egy kináz gátlót esetleg fel lehetne ruházni P2X7 receptor blokkoló funkcióra is, amennyiben a P2X7 gátlása hasznos volna terápiás szempontból. 5. ábra. A P2X7 funkció modulálásának hatása emberi melanómasejtek apoptózis készségére A B HT168-M1 HT199

10

5

0

0.0

100.0

300.0

75

% sub-G0 cells

% subG0 cells

15

50

CTR 2ME 2ME+ATP

25

0

ZnSO4 (µM)

Normális sejtekben a P2X7 proapoptotikus funkciót tölt be gyakran. Ugyanakkor emberi melanóma sejtekben ATP stimulálással nem lehetett apoptózist kiváltani, különböző koncentrációkban adagolva a P2X7 agonista ATP-t vagy bzATP-t. Funkconális tesztjeink ugyanakkor meglévő eredményre vezettek: a P2X7 nem-szelektív gátlása Zn++ ionnal képes volt mérsékelten apoptózist indukáló a közismerten apoptózis rezisztens melanóma sejtekben (5. ábra). Másrészről, ha a melanóma sejtekben 2-metoxiösztradiollal masszív apoptózist indukáltunk, a P2X7 bz-ATP aktivitása jelentősen gátolta a kifejlődő apoptózist (5a ábra). Vizsgálataink arra utalnak, hogy emberi melanóma sejtekben a p2X7 Ca++ csatornaként működik és egyúttal hozzájárul a melanómasejtek apoptózis-rezisztenciájának kialakulásához. Mindezek alapján jogosan merül fel az a lehetőség, hogy ez a Cacsatorna potenciális terápiás célpont. A program folytatásaként megkíséreltünk keresni olyan ATP-kazettát felismerő kinázgátlókat, amelyek a P2X7 funkcióját is képesek befolyásolni.

29

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 3.2. Melanóma áttétképzési képességét meghatározó genetikai konstellációk meghatározása.(dr. Tímár József) 3.2.1.A motilitási szignál-útvonal kulcs-elemeinek expressziós mintázatának meghatározása Az emberi melanóma EGFR genomikája A klinikai onkológia fejlődésének motorja a genomika, ami elvezetett az ún. Célzott terápiák kifejlődéséhez. Ezen terület egyik legdinamikusabb fejlődő ága a tirozin kinázgátlók területe, ezek között is az EGFR-gátlók kialakulása. Ezen új gyógyszerek már eddig is megváltoztatták a vastagbélrákok, a tüdőrákok és a fejnyaki daganatok kezelését, de betörésük a mindennapi gyakorlatba most zajlik a veserákok és emlőrákok esetében. Ennek az a genomikai háttere, hogy a fenti daganatok esetében az EGFR gén vagy mutált, és/vagy fokozottan expresszálódik génamplifikáció következtében. Sajnos a melanómák terápiája mind a mai napig nem megoldott probléma, még a leghatékonyabb citosztatikumok sem érnek el 10%-os tartós választ a kezelt előrehaladott daganatos esetekben. A sikertelenség egyik magyarázata, hogy a melanóma kemo- és sugárterápia rezisztens, másrészt nem ismerünk olyan genetikai hibáikat, amelyeket gyógyszerek célpontjául lehetne használni. Korábbi NKFP pályázatunkban figyeltünk fel arra, hogy emberi melanómákban az EGFR expresszálódik, a sejtek ezt a fehérjét túlélésükhöz és migrációjukhoz használják, és hogy az EGFR tirozin kináz konstitutívan aktivált állapotban van. Ez utóbbi jelenség arra utal, hogy a gén esetleg olyan károsodást szenvedett, aminek ez az eredménye. Ezért az általunk használt humán melanóma vonalakban szisztematikusan elemeztük az EGFR gén szerkezetét, expresszióját és szekvenciáját. Első lépésben, a más daganatokban megfigyelt TK-domén aktiváló mutációit kutattuk, majd vizsgálatainkat kiterjesztettük az egész gén kódoló régiójára is. Kapott eredményeinket 28 primer bőr melanóma esetében megkezdtük validálni, azaz leellenőrizni, hogy a sejtvonalak genetikai eltérései mennyiben hasonlítanak a daganatszövetben észlelt állapothoz (reprezentatívak-e). Reverz transzkripciót követő polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) az összes általunk vizsgált humán melanóma sejtvonalból (8) kimutatható (amplifikálható) volt az EGFR gén intracelluláris (tirozin kináz) régiójának expressziója. Az EGFR gén intracelluláris régióját (tirozin kináz domén, és a géntermék C-terminálisát kódoló szakasz) öt, részlegesen átfedő primer pár felhasználásával szekvenáltuk nested-PCR-rel. Mind az öt primer párral végrehajtott nested-PCR-t követően izoláltuk a gélből az amplikonokat, és ezek nukleotid szekvenciáját mindkét irányból leolvastuk. A szekvencia analízis eredményeként kimutattunk három neutrális SNP-t, amelyek nem okoznak aminósav eltérést a géntermékben. Az egyik ilyen SNP a 2607 pozicióban volt (CAG, G/A heterozigóta, Q787), a másik a 2955 pozicióban (ACC, C/T heterozigóta, T903), a harmadik a 3228 pozicióban (GAC, C/x heterozigóta, D994). A HT168 sejtvonal esetében találtunk egy aminósav cserével járó mutációt is a 2570 pozicióban (TGC, G/T heterozigóta, TGC Cys775, TTC Phe775). Ezeken túl a vizsgált szekvenciák megegyeztek/identikusak voltak a génbanki referencia szekvenciával (Acc: NM_005228). A talált SNP-k az alábbiak voltak: 2570 TGC G/T C775 (TGC Cys775) F775 (TTC Phe775): G/T heterozigóta: (HT168): 2607 CAG G/A Q787 (Gln787): A/A homozigóta: (M35): G/A heterozigóta: (HT168, WM35, WM983A): 2955 ACC C/T T903 (Thr903): C/T heterozigóta: (A2058, HT199, WM983B): 3228 GAC C/T D994 (Asp994): C/T heterozigóta: (WM35, WM983A) Mindezek alapján a melanóma sejtvonalakban megfigyelt konstitutív EGFR aktiváció oka nem a TK domén mutációja. Ezek után fordult figyelmünk az EGFR gén extracelluláris doménje felé, mert bizonyos daganatokban (pl. glioblastoma), ennek a szakasznak a mutációja igen gyakori és a melanóma is neuroektodermalis eredetű sejtből indul ki. A 8 vizsgált melanóma sejtvonalban az extracelluláris domén 7 primer párral fedtük le (1= N-terminal, 7=TM-közel) és a PCR termékeket megszekvenáltuk. A nyolcból 2 vonal esetében találtunk szabályos domén-szerkezetet, míg 75%ban az extracelluláris EGFR szakaszon jelentős eltéréseket észleltünk: 25%-ban találtunk splice variánst (EGFR ligand kötő szakaszvesztés: vIII), 25%-ban teljes deléciót 1-1 vonalban mutációt illetve részleges deléciót (1. táblázat). Ez a 75%-os EGFR EC-domén mutációs frekvencia igen magas, és csak a melanómák igen gyakori BRAF mutációjához hasonlítható gyakoriságú genetikai eltérés. 1.táblázat. Humán melanóma sejjtvonalak EGFR extracelluláris doménjének mutáció-gyakorisága (RT-PCR) 1 H T 168M 1 H T 168 A 2058 W M 35

d el

W M 983A

+

W M 983B H T 199 M 35

d el

2 d el

+ d el +

+ +

3 d el

4 d el

5 d el

6 +

+ + exon 4 a lte r n a tív s p lic in g

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

exon 4 a lte r n a tív s p lic in g + d el m u tá c ió

+

+

+

+

+ d el

+ d el

+

+

30

+ d el

+ + M u tá c ió ?

+

+ d el

+

7 d el

+ d el

+

+

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Ugyanakkor felmerült azonnal a kérdés, hogy ez a típusú EGFR mutáció a sebészeti mintákban milyen gyakoriságú, azaz mennyiség tenyésztési műtermék. Ebből a célból megvizsgáltuk 28 primer bőr melanoma mintában az EGFR extracelluláris doménjének mRNS szintű expresszióját RT-PCR segítségével (2. ábra). 2.ábra. Extracelluláris domén mRNS expressziója primer bőr melanómában (nPCR). Pozitív kontrollként a nemzetközi referenciául szolgáló A431 laphámrák sejtvonalat használtuk, amely wt-EGFR-t expresszál. Negatív kontroll: H20

A vizsgált 28 esetből 15 mintában észleltünk kóros terméket, ezek közül 9 esetben (32%: 1,4,10,15,18,19,20,23,25) csak kóros terméket kaptunk (a génhibára nézve homozigóta állapot), míg 6 esetben (21%: 2,8,11,12,14,22) a normális termék mellett volt jelen alternatív termék is (a génhibára nézve heterozigóta állapot, 2 ábra). Tehát mindösszesen több mint 50%-ban mutattunk ki EGFR extracelluláris domén-mutációra utaló terméket primer melanómában. A kóros gén azonosítása illetve szekvenciájának meghatározása jelenleg folyik a melanóma-EGFR gén klónozásának segítségével. Eredményei jelentősége igen nagy. Eddig más daganatokban az EGFR mutációja egyúttal az EGFR gátlók iránti érzékenységet is jelentette. Miután emberi melanómákban igazán hatékony terápiát nem ismerünk, az EGFR melanóma-specifikus génhibájának gyakorisága felveti, hogy a melanómák ezen jelentős csoportja is érzékeny lehet ilyen kinázgátlók iránt, ahogy kísérleti körülmények között ezt már korábban bemutattuk (lsd. előző NKFP pályázatunk zárójelentése). Természetesen a génhiba pontos azonosítása molekuláris diagnosztikai kit kifejlesztését és melanóma-specifikus kinázgátló terápia kidolgozását jelentheti, azaz szabadalmaztatható, amit a következő kutatási periódusban kívánunk megtenni. Az emberi melanóma CMET genomikája Korábbi NKFP pályázatunkban felmerült, hogy humán melanómában a migrációs képességet a CMET onkogén terméke jelentősen befolyásolja/mediálja. Más daganatokban pl. papilláris veserák, a CMET tirozin kináz szakaszának pontmutációja az onkogén konstitutív aktivációjához és daganat kialakulásához vezet. Régebbi kísérleti adatok arra utalnak, hogy kémiai karcinogének a CMET körüli kromoszóma-szakasz törésével olyan fúziós gént hoznak létre, amely szintén konstitutív CMET aktivációhoz vezet. Emberi daganatok közül ilyen fúziós gént a közelmúltban gyomorrákban találtak. Mindezek alapján felmerült6, hogy emberi melanómákban is genetikailag károsodott lehet a CMET gén. Ennek tisztázása céljából a rendelkezésünkre álló genetikailag eltérő hátterű humán melanóma vonalakban megszekvenáltuk a CMET onkogén kitüntetett szerepet betöltő tirozin kináz doménjét 4 részben átfedő primerpár segítségével, valamint megvizsgáltuk, hogy a TRP-MET fúziós gén expresszálódik-e ezen sejtvonalakban. Miután korábbi és újabb Western elemzéseink a melanóma-MET aberráns méretű fehérje jelenlétére utalnak (110-120 kD, szemben a 150-170 kD mérettel), vizsgáltuk az is, hogy az extracelluláris doménekben észlelhető-e genetikai eltérés. 3. ábra. Humán melanómák CMET expressziója (nPCR reakció)

31

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Vizsgálataink szerint a CMET TK doménje valamennyi melanóma sejtvonalban kimutatható és autentikus méretű, és ez igaz az extracelluláris domén vizsgálat szakaszaira is (EC1= semaforin domén, EC2= ITG2 domén). Ugyanakkor látható, hogy az expressziós szint igen eltérő az egyes sejtvonalak esetében (3. ábra). Megállapítottuk azt is, hogy a TRP-MET fúziós gén nincsen jelen emberi melanóma sejtvonalakban (nem mutatott adat). Ezek a vizsgálatok arra nem adtak felvilágosítást, hogy az egyes szakaszokban esetleges pontmutációk vagy kisebb károsodások lennének, ezért a fragmenteket megszekvenáltuk, azonban mutációt egyetlen esetben sem észleltünk. Mindezen vizsgálatok abból a szempontból nagy jelentőségűek, hogy számos piacvezető gyógyszergyár igyekszik megjelenni az onkológiai piacon CMET tirozin kinéz gátló gyógyszerrel, azonban még nem világos, hogy melyik emberi daganat lesz ezen szerek molekulárisan célzott célpontja. Az egyik ilyen cég a Genentech, amely humanizált antitestet állított elő a CMET gén extracelluláris szakasza ellen, melyet rendelkezésünkre bocsátott. In vitro vizsgálataink szerint ezen antitest nem rendelkezett releváns biológiai aktivitással emberi melanóma sejtvonalakon, nem befolyásolta a sejtproliferációt 0,1-10 µg/ml (4a ábra), illetve még stimulálta is a migrációt 0,5-50 µg/ml (4b ábra) dózisokban. Mindezek az információk megerősítették azt a feltevésünket, hogy melanómákban esetleg olyan CMET expresszálódik, amelynek extracelluláris szakasza mutált. Ezt támogatja az az észlelésünk is, hogy a CMET fehérje mérete jelentősen kisebb, mint a normális, és az extracelluláris domén ellenes antitestek alig reagálnak emberi melanóma sejtekkel. Ennek megfelelően a továbbiakban az egész extracelluláris domént meg kívánjuk szekvenálni, hogy világos képet kapjunk a gén esetleges eltéréseiről. A projekt célja tehát ettől fogva a melanóma-specifikus CMET génmutáció meghatározása az extracelluláris doménban, amely módot adhat arra, hogy a CMET gátlókra érzékeny tumorokat lehessen azonosítani molekuláris diagnosztikailag. 5. ábra. Anti-humán CMET antitest hatása humán melanóma sejtek proliferációjára és migrációjára in vitro. A. In vitro sejtproliferáció

Proliferation (according to control)

350%

HT168-M1 HT199

300%

WM983B 250% 200% 150% 100% 50% 0% Control

0,1

1

10

c-Met antibody cc. (µg/ml)

B. In vitro migráció 350%

Migration (according to control)

300%

250%

200%

150%

100%

50%

0% Control

0,5

5

c-Met antibody cc. (µg/ml)

32

50

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Humán melanóma progressziós mintázatának meghatározása és validálása A host áttétképzésben betöltött szerepének vizsgálatára beállítottunk egy olyan állatmodellt, amely alkalmas az áttétképzésben szerepet játszó tumor ill. host/környezet (stróma) eredetű faktorok elkülönítésére. Humán melanóma sejtvonalak szuszpenzióját egyidejűleg kifejlett és újszülött scid egerekbe implantálva mindkét hostban kialakul primer tumor, de áttétképzést csak az újszülöttbe oltott tumorok esetén tapasztalunk. Három, genetikailag eltérő tumorvonallal elvégzett előzetes vizsgálatunk azt mutatta, hogy csak azon géneket figyelembe véve, amelyek legalább két vonal esetén kétszeresnél nagyobb expressziós változást mutatnak (Puskás chip – előző beszámoló), s ezt a különbséget mintegy „etalonként” használva az igazolódott, hogy az újszülött, mint gazdaszervezet olyan tumorpopulációt szelektál, amelyben többségben vannak az áttétképzésre alkalmas sejtek. Azaz lényegesen több gén expressziójában találtunk szignifikáns eltérést a felnőtt és újszülött primer tumor, mint az újszülöttben növő primer tumor és annak tüdőáttéte között. Ebben a modellben ráadásul a „zavaró” változók számát igen nagymértékben sikerült leszorítanunk, hisz genetikailag gyakorlatilag azonos gazdaszervezettel dolgozunk, azonos sejtpopulációból (statisztikailag azonos klóneloszlással) indulunk, a karcinogenezis esetleges eseményei ugyanarra a genetikai alapra épülnek, környezet gyakorlatilag azonos – az egyetlen (fiziológiás) eltérés az életkor és az ebből adódó tumor-környezetbeli eltérésekben van. Mivel ebben a xenograft modellben a tumor humán eredetű, a strómális komponensek pedig a gazdaszervezetből származnak, megfelelően host-specifikus próbákat tartalmazó DNS chip-ek segítségével külön vizsgálhatjuk a „tumor” gazdaszervezetből származó ill. a humán tumorból származó különbségeit összehasonlítva az áttétképző (újszülöttbe implantált tumor) és a nem áttétképző (kifejlett állatba implantált tumor) primer tumorból származó gének expressziós mintázatát. Az összehasonlítást a fentieknek megfelelően az Agilent 20,000 egér gén expresszióját meghatározó Agilent Mouse Oligo Microarray (22,575 60-mer oligo) ill. a 41,000 humán gént meghatározó Whole Genome Oligo Microarray (44,000 60-mer oligo) segítségével végeztük el. A leolvasást követően a továbbiakban csak azon gének kiértékelésével foglalkoztunk, amelyek változása mindkét sejtvonal esetén azonos irányú volt (up vagy down) és legalább kétszeres különbséget mutatott. A humán gének közül 96 validálását a Applied Biosystems real-time PCR elvén működő TaqMan kártyáival végeztük el. 41 gén bizonyult az eredeti mintákon ezzel ez eltérő lokalizációba tervezett próbasorozattal is szignifikánsan eltérőnek a kétféle gazdaszervezetben növő humán tumorban. Ugyanezen nyomtatásból származó kártyák segítségével kvatitatívan meghatároztuk 21 fagyasztva tárolt műtéti humán melanóma mintából ezen gének expresszióját. A minták közül 11 olyan betegből származott, amelyben a követéses vizsgálatok tanúsága szerint a primer tumor eltávolítását követő 5 éven belül nem alakultak ki áttétek, míg 10 minta olyan betegekből, amelyekben igen. A mellékelt táblázat tanúsága szerint a modellekben igazolt 41 génből 5 (IL13RA1- citokin receptor, RAB32 – Gprotein, CHRNB1 – receptor, LYN – protein kináz, TP53BP2 –transzkripciós kofaktor) gén expressziója mutatott a modellnek megfelelő irányú és kétszeres értéknél nagyobb volumenű változást abban az esetben, mikor az áttéteket nem hordozó betegekből származó tumorminták génexpresszióját viszonyítottuk az áttétet hordozó betegekéhez. Tekintve, hogy a humán mintákban a strómális komponenseket nem távolítottuk el a mintákból (ahogy egy potenciális diagnosztikus felhasználás esetén sem lesz rutin eljárás pl. a lézerdisszekció), ezek a génexpressziós változások oly mértékben dominánsak, hogy nagyobb mintaszámon való tesztelést követően, visszaigazolva a protein szintű változásokat is, új prognosztikus faktorrá léphetnek elő humán melanómákban. 2. táblázat. Validált progressziós génexpressziós mintázat humán bőr melanómákban Gene Name

HT168M1

HT199

aquaporin 1 (channel-forming integral protein, 28kDa)

AQP1

BC022486

705.9

213.2

disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 8

ADAMTS8

Gene Symbol

NM_007037

Public ID (Genbank)

Human M/nM

510.6

1952

SRY (sex determining region Y)-box 11

SOX11

NM_003108

279

396

parathyroid hormone-like hormone

PTHLH

NM_002820

30.62

1260

disintegrin and metalloproteinase domain 22

ADAM22

NM_021722

24.52

274

insulin-like growth factor binding protein 7

IGFBP7

9.851

3.183

NM_001553

1.36

interleukin 13 receptor, alpha 1

IL13RA1

U81379

3.01

ligand of numb-protein X

LNX

NM_032622

DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 48

DDX48

NM_014740

forkhead box D3

FOXD3

NM_012183

homeo box C13

HOXC13

NM_017410

hairy and enhancer of split 6 (Drosophila)

HES6

NM_018645

B-cell CLL/lymphoma 3

BCL3

NM_005178

1.28

9.505

13.78

8.868

16.04

8.179

10.52

1.21

5.896 5.194

12.55

0.81

5.118

3.704

4.688

4.813

11.94

BCL6 co-repressor

BCOR

NM_020926

0.997

4.739

6.426

transketolase (Wernicke-Korsakoff syndrome)

TKT

NM_001064

1.194

4.645

18.59

glypican 1

GPC1

NM_002081

Sp2 transcription factor

SP2

BC005914

cut-like 1, CCAAT displacement protein (Drosophila)

CUTL1

NM_181552

E4F transcription factor 1

E4F1

NM_004424

4.48 0.776 0.81

3.359

4.359

4.523

4.247

2.081

4.243

14.71

RAB32, member RAS oncogene family

RAB32

NM_006834

2.13

4.24

8.789

topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa

TOP2A

NM_001067

0.614

4.235

10.18

cholinergic receptor, nicotinic, beta polypeptide 1 (muscle)

CHRNB1

BC011371

3.14

3.78

232.1

Notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila)

NOTCH1

NM_017617

0.722

3.546

5.141

MAX dimerization protein 4; MAD4 homolog

MXD4

AF040963

0.86

3.448

10.64

nidogen (enactin)

NID

NM_002508

RAB13, member RAS oncogene family

RAB13

NM_002870

c-Maf-inducing protein

CMIP

NM_030629

cell death-regulatory protein GRIM19

GRIM19

NM_015965

1.1

3.084

13.66

retinoid X receptor, gamma

RXRG

NM_006917

0.577

3.081

3.879

v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1

AKT1

X61037

1.13

2.757

7.828

BCL2-associated X protein

BAX

NM_004324

1.39

2.672

7.612

death-associated protein kinase 3

DAPK3

NM_001348

1.48

2.659

5.561

v-yes-1 Yamaguchi sarcoma viral related oncogene homolog

LYN

NM_002350

5.615

2.397

integrin, alpha V (vitronectin receptor, alpha polypeptide, antigen CD51)

ITGAV

NM_002210

0.73

2.328

9

RING1 and YY1 binding protein

RYBP

AB029551

0.517

2.327

14.04

frizzled homolog 9 (Drosophila)

FZD9

NM_003508

0.94

2.285

6.736

UV radiation resistance associated gene

UVRAG

NM_003369

1.06

2.148

4.883

topoisomerase I binding, arginine/serine-rich

TOPORS

NM_005802

0.23

2.146

14

tumor protein p53 binding protein, 2

TP53BP2

NM_005426

2.082

2.03

10.46

33

1.433

3.285

6.955

3.218

10.25

3.214

5.544

8.648

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 3.3. A melanóma progressziójának gátlása alacsony mólsúlyú heparinnal. Dr. Mathias Dóra, GSK kft, dr. Szilák László, Szilak Bt. 3.3.1. Klinikai Protokoll kidolgozása, engedélyeztetése. 3.3.1.2.A melanoma sejtek mozgását gátló heparin-szerű un. Oligosaccharidok tesztelése

Miután az ipari partner az alacsony molekulasúlyú heparin készítményt térítésmentesen biztosítja a vizsgálathoz, a protokoll angol nyelven készült, mert a külföldi központot is tájékoztatni kell a vizsgálatról. Study protocol Sponsor: Researcher initiated study in the National Institute of Oncology Budapest, Hungary, with the financial support of NKFP1a-0024-05. Study title: A case control study on the effect of low molecular weight heparin on the progression of stage III/b malignant melanoma. Study director: József Tímár MD, PhD, DSc Professor of Pathology, Department of Tumor Progression, National Institute of Oncology, 7-9 Ráth Gy. Street, 1122 Budapest, Hungary, Phone: (36-1)-224-8600, Fax: (36-1)-224-8600, e-mail: [email protected] Principal investigator: Katalin Gilde, MD, PhD, Investigators: dr. Teodóra Bánfalvy, dr. Gabriella Liszkai, dr. Zsuzsanna Fejős, dr. Kinga Borbola Responsible pharmacist: Éva Vonákné Petrovics Trial monitor: dr. József Lövey MD, PhD Synopsis Title of the study: A case control study on the effect of low molecular weight heparin on the progression of stage III/b malignant melanoma Study site: National Institute of Oncology, 7-9 Ráth Gy. Street, 1122 Budapest, Hungary Duration of the study: Enrollment of eligible patients for 24 months. All subjects to be followed for survival Clinical phase: OBSERVATIONAL Objectives Primary objective: The primary objective is to demonstrate improvement in time to progression compared to the standard treatment with the use of low molecular weight heparin (LMWH) in patients with stage III/b malignant melanoma Secondary objectives: The secondary objectives are: to demonstrate an overall and progression free survival benefit with the application of low molecular weight heparin. Rationale: Malignant melanoma arises from the melanocytes of the sun-exposed skin or rarely from the mucous membranes of the body. In the past decades the incidence of melanoma dramatically increased in the caucasian population. Melanoma is an extremely aggressive disease with one the highest metastatic potential among malignant tumors. This behavior is reflected in survival probabilities to. While localized melanoma can often be cured, the expected survival when visceral metastasis is present is around 7 months despite all treatment efforts. The main scope of adjuvant treatments after the surgical removal of the disease from its primary site or lymph node metastasis is the prevention of the development of distant metastasis. In the recent years the common use of heparin-derivatives in oncology revealed that anti-coagulant therapies may have a beneficiary effect by delaying tumor progression. The underlying mechanisms are not fully elucidated and may involve several mechanisms. Heparins can inhibit thrombin and fibrin formation induced by cancer cells, therefore, may potentially inhibit intravascular arrest of cancer cells and thus metastasis. Besides their anticoagulant function, heparins bind to growth factors and ECM proteins and consequently can affect proliferation and migration of cancer cells and angiogenesis in tumors. Furthermore, heparins have been found to inhibit expression of oncogenes and to affect the immune system. They also have both stimulatory and inhibitory effects on proteolytic enzymes, which are essential for invasion of cancer cells through the ECM. In a preclinical study we have used experimental metastasis models of human melanoma in SCID mice to analyze the effect of heparin and its low molecular weight derivate (LMWH) on tumor progression. Two models have been used: lung colonization following i.v. injection of tumor cells and spontaneous liver metastasis model following intrasplenic injection of tumor cells. In the lung metastasis model low molecular weight heparin significantly inhibited lung colony formation from the concentration of 0.4 IU/animal, whereas heparin was proved to be much less effective even at 40 IU/ml dose. In case of the liver metastasis model neither heparin nor its derivative was able to influence the growth of the primary spleen tumor. However, low molecular weight heparin significantly inhibited the formation of liver metastases from the dose of 20 IU/animal which effect was

34

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ achieved by heparin at a log higher concentration. There was no bleeding disorders detected throughout these experiments at the heparin concentrations applied. All these data suggest a selective antimetastatic effect of LMWH in human melanoma metastasis models. Melanoma patients frequently relapse after surgery especially those with thick tumors. These relapses occur in the skin, in the regional lymph nodes or in visceral organs. To date, these patients are treated by surgical removal of the relapsed tumors and mostly by a consecutive chemotherapy using DTIC for 7 month. We have postulated that a thrombosis prophylactic LMWH treatment of Stage IIIb melanoma patients can attenuate the development of visceral organ metastasis. Methodology: Non-randomized, open label case-control study performed in a single center in subjects with stage III/b malignant melanoma. The study to be conducted in concordance with the ICH-GCP requirements. Type of blinding: non-randomized, open label Sample size: 40 patients to include in the experimental treatment arm and 40 previously treated patients matched in clinical and demographical data serve as historical controls for the study. Diagnosis and criteria for inclusion: patients with histologically proven malignant melanoma, after the removal of the primary tumor and lymph node metastasis, without visceral metastasis. Age<18 years. KPS<70, ECOG 0-1. Test product, mode of administration: nadroparin calcium 1900, 2850, 3800, 5700, 7600 and 9500 IU in prefilled sterile syringes as supplied by the manufacturer. Daily subcutaneous injection with body weight adjusted thrombosis prophylactic dose (9500IU). Reference therapy:DTIC for 6 month Duration of treatment: Observational: 6 weeks FROM SURGERY Evaluation criteria Primary endpoint: time to progression (TTP) Secondary endpoints: progression free survival, overall survival, side effects, quality of life Statistical methods Time to progression will be estimated by the Kaplan-Meier method. Differences will be compared by the logrank test. Furthermore for the analysis of different prognostic and treatment related factors the chi-squared test and Cox proportional hazard model will be used. Phase and visit schedule Screening phase 30 days prior the initiation of treatment. Treatment phase: 6 month treatment with DTIC and concomittant extended use low dose nadroparin calcium treatment. Weekly visit until the end of anticoagulant treatment. Follow-up visits: 6 weeks after completion of experimental treatment, then every 3 months until progression. After progression survival check every 8 weeks. Progression assessment: at every follow-up visit with clinical examination, chest X-ray and ultrasonography. In case of specific symptoms or when further analysis is require appropriate examinations are to be done. All subject will be followed for survival.

35


Flowchart of the trial Screening 2 weeks prior treatment

Treatment phase visit 1 visit 2 w1 m1

visit 3 m2

visit 4 m3

visit 5 m4

visit 6 m5

Treatment phase visit 7 m6

Followup Phase visit 8 m9

Followup Phase visit 9 m12

Informed consent + Eligibility criteria + Medical history + Physical + + + + + + + + + + examination Demographics + + + + + + + + + Vital signs + + + + + + + + + + PS + + + + + + + + + + QoL assessment + + + + + + + + + Chest X-ray + + + CT, MR, + + + cytology Ultrasonography + + + + + Hematology + + + + + + + + + + Serum chemistry + + + + + + + + + + Fecal occult + + + + + + + + + + blood Coagulation + + + + + + + + + + Concomitant + + + + + + + + + + Medication Nadroparine 1wFR 1mFR 1mFR 1mFR 1mFR 1mFR 1mFR calcium Adverse events + + + + + + + + + + Study termination + report Abbreviations: PS. Performance status, QoL: qualitiy of life, CT: computed tomography, MRI: magnetic resonance imaging, 1wF: nadroparin calcium treatment for one week (every day), 1mF: nadroparin calcium treatment for one month (every day) , *: if clinically indicated for full staging

36

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 3.3.1.2.A melanoma sejtek mozgását gátló heparin-szerű un. Oligosaccharidok tesztelése A heparinról már régebben leírták, hogy antikoaguláns dózisban gátolja a daganatos progressziót. Saját korábbi vizsgálatainkban megállapítottuk, hogy a kis molekulatömegű heparinnak (LMWH) is daganatellenes hatása van humán melanóma esetében. Az LMWH ugyan nem befolyásolja a sejtek proliferációját, de szignifikánsan csökkenti a melanóma sejtek in vitro motilitását. In vivo vizsgálatainkban a tumor oltást megelőző és az azt követő 2-2 napon a humán antikoaguláns dózisban adott LMWH szignifikánsan csökkentette a melanóma sejtek tüdőkolonizáció képességét, valamint lép-máj modellben a májmetasztázisok kialakulását. Ebben a folyamatban nem a tumorsejtek adhéziójának gátlása játszott nagyobb szerepet, ugyanis az LMWH kezelés nem volt hatással sem in vitro a különböző mátrix-komponensekre adheráló, sem in vivo a tüdőszövetben kitapadó tumorsejtekre.(Bereczki et al. Clin Exp Metast, 2005). Felmerült a kérdés, hogy az 5000 daltonos LMWH igen heterogén cukorláncaiban azonosítható-e a specifikus antimetasztatikus hatásért felelős cukorszakasz és az jellemezhető-e kémiailag. Jelen vizsgálatainkban a manchesteri rákközpontban kollaborációs patnereink (Dr. Gallagher) által előállított különböző hosszúságú (4-22 cukoralegység) és pontosan jellemzett (szulfatáltság) LMWH eredetű oligoszacharidokat teszteltük a korábbi vizsgálati rendszereinkben. Ezeket az oligoszachriokat a heparinból nyerték folyadék chromatogáfiával. A méret szerint szétválogatott oligoszacharidokat heparanáz enzimmel diszachaidegységekre bontották és anioncserés folyadék chromatgráfiával jellemezték. A biológiai sajátosságaikról ismert, hogy minél kisebb az oligoszacharid lánc, annál kevésbé befolyásolja a koagulációt. Ezen felül néhány oligoszacharidnak angiogenezis gátló hatása van tumor xenograft modellben. Saját vizsgálatainkban megállapítottuk, hogy a vizsgált 10 oligoszacharid (DP4-22) különböző módon befolyásolja humán melanóma sejtek (HT168-M1) in vitro proliferációját és migrációját (1. ábra). Vannak olyan anyagok, amelyek egyikre sem hatnak (p-m-), vannak olyanok, amelyek mindkettőt gátolják (p+m+) és vannak olyanok, amelyek csak a migráció képességét csökkentik (p-m+). A három megfigyelt tulajdonságnak megfelelően választottuk mindegyikből 11 anyagot; p-m-: DP22, p+m+: DP18, és p-m+: DP4. 1. Ábra. Oligoszacharidok hatása humán melanoma in vitro proliferációjára és migrációjára.

140,0

Proliferation Migration

120,0

Control %

100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Fragmin

dp4

dp6

dp8

dp10

dp12

dp14

dp16

dp18

dp20

dp22

Treatment (10 µg/ml)

Ezekkel az anyagokkal a tumor oltását megelőző és az azt követő 1-1 napban (összesen 3 alkalommal) kezeltük intraperitoneálisan az állatokat, majd a humán melanóma sejteket intravénásan oltottuk a farokvénába. A kialakult tüdőkolónikat az oltást követő 7. héten számoltuk le (2. ábra). Az eredményből látszik, hogy az az oligo (DP22), amely in vitro nem befolyásolta sem a proliferációt, sem a migrációt, in vivo sem módosította a melanóma áttétképzését. A DP18, amely mind a proliferációt, mind a migrációt gátolta, csökkentette a kolóniák számát, csakúgy mint a DP4, amely in vitro csak a migrációs képességre hatott.

37


2. ábra. Oligoszacharidok hatása humán melanóma in vivo tüdőkolonizációjára SCID egérben

Modification of tumorous colonization in lung by heparin derivates (HT168-M1 human melanoma cell line) 120

100

80

60

40

20

N umbe

0

Control

dp4

dp18

dp22

Mean ±SE

Treatment

Megállapítható, hogy az in vitro migrációt gátló oligoszaharidok szignifikánsan gátolják a humán melanóma sejtek in vivo tüdőkolonizációját preklinikai modellben. Megjegyzendő, hogy ezen oligoknak nincs anticoagulans hatásuk. Véleményünk szerint sikerült azonosítanunk a heparin egy olyan rövid oligosaccharid láncát, amely szelektíven képes a humán melanóma migráció-gátlására, ás más heparin-szerű hatással nem rendelkezik. Az oligok pontos kémiai sajátosságai ismeretében megindítottuk a szabadalmaztatási folyamatot angol partnereikkel. (ennek megfelelően publikáció az eredményekből nem készült és a folyamat lezárulásáig nem is fog készülni).

38

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 3.3.2. Syndecan-4 knockout human melanoma sejtek előállítása, validálása (Szilak Labor Bt) Irodalmi áttekintés Syndecanok szerepe, és felépítése A sejtfelszíni heparán-szulfátok fehérje kapcsoltak, és fő tulajdonságuk a növekedési faktorok (pl. FGF2, EGF, VEGF), a citokinek (RANTES) és egyéb jelmolekulák kötése, adszorbeálása (TGF-beta, hedgehog fehérjék), ily módon szabályozva a sejtdifferenciációt, a morfogenezist és az egyedfejlődést. Két sejtfelszíni heparán-szulfát proteoglycan család ismert, a glypican és a syndecan. A glypicanok globuláris proteinek, amelyeket foszfolipid kapcsol a sejtek membránjához. A syndecanok, valódi, I. típusú, transzmembrán proteoglycanok. Rendelkeznek egy rövid, kb. 30 aminosavas karboxi-végi citoplazmás szegmenssel, egy transzmembrán domainnel és egy hosszabb, amino-terminális extracelluláris domainnel, amihez a heparán-szulfát oldalláncok kapcsolódnak. A négytagú syndecan családból a syndecan-1, -2, -3 előfordulása szövetspecifikus. Syndecan-1 jellemző az endothel, epithel és simaizom sejtekre, syndecan-2 főként a fibroblasztokban fordul elő, syndecan-3 a perifériás és a központi idegrendszer sejtjeiben fejeződik ki, habár ectopikus megjelenésük szükséges a szövetek differenciációjához. A syndecan-4 viszont sok szempontból eltér a család többi tagjától, mivel az előfordulása nem szövetspecifikus, univerzálisan expresszálódik a sejtekben és különös előszeretettel van jelen melanóma-sejtekben. A syndecanok már a szintézis pillanatában dimerizálódnak, mielőtt a heparán-szulfát oldalláncok szintetizálódnának. Szerkezeti felépítésük azonos. Fő elemeik a variábilis extracelluláris rész (ectodomain), amely a syndecan-1 és -4 esetében a szövetek sejtjeinek összekapcsolásáért felelős, az erősen konzervált transzmembrán (TM) és C-terminális intracelluláris (CD) rész. A transzmembrán rész felelős a dimerizációért, és szerepet játszhat a membrán subdomainek felismerésében is. A citoplazmás domaineknek komplex szerepük van, és bár kb. 80%-os a hasonlóság az egyes tagok között, mégis különböző kölcsönható partnerek kötődnek hozzájuk. Syndecan-4 szerepe a jelátvitelben A syndecan-4 egyik legjobban jellemzett funkciója a PKC alfa (protein kináz C alfa) Ca2+ független aktiválása. A dimer syndecan-4 cytoplazmás domain rásimul a membrán belső részére, és két PIP2 kötődik hozzá. Az így kialakult ternér komplexhez kapcsolódik a PKC alfa katalitikus domainje, amely ez által aktív konformációt vesz fel. A lipid szigetek (raftok) koleszterinben és szfingolipidekben gazdag membránszerveződések, amelyekben főként a jelátvitelben szerepet játszó fehérjék dúsulnak fel, illetve a raftokon keresztül bonyolódik a membrán körforgás, így az endocitózis. Két fajta lipid- szigetet különböztet meg az irodalom, a caveolint tartalmazó és nem tartalmazó szigeteket, az utóbbiakban a PIP2 (foszfatidilinozitol-4,5 bifoszfát) dominál a koleszterin helyett. A syndecan- 4 előfordul a caveolin tartalmú lipid szigetekben, de nem kolokalizál caveolinnal. A syndecan-4 heparán-szulfát oldalláncai több féle citokint, növekedési hormont kötnek specifikusan. A ligand kötés következtében keletkezett szignál nem minden esetben ered csak a saját receptortól, feltételezhető, hogy akár syndecan maga is elindít egy másodlagos szignál utat. Az FGF2 jelátvitelben, mint aktív szállító molekula vesz részt a syndecan-4. Az FGF2 indukció Rac1 és Cdc42- függő endocitózist indított el, amikor a syndecan-4 bekerült a citoplazmába és bevitte az ectodomainjén lévő heparán-szulfáthoz kötődő FGF2-t. A sejtek adhéziója az extracelluláris mátrixhoz meghatározza a sejtek viselkedését, kihatással van az osztódási képességükre. A sejtek az őket körülvevő extracelluláris matrixban főként a fibronektinhez kapcsolódnak az integrin családon, és a transzmembrán proteoglycan családon keresztül. A proteoglycanok és integrinek általában koordináltan működnek, így a syndecan-4 az α5β1 vagy az αvβ3 integrinekhez kötődik, befolyásolva a sejtek kitapadási, illetve a mozgási képességét. Mivel a syndecan-4 részt vesz a fokális adhéziós plakkok kialakításában is, ezért jogosan feltételezhetjük, hogy módosítva a sejtfelszíni syndecan-4 eloszlást megváltoztathatjuk a sejtek mozgási képességét.

Eredmények A syndecan-4 klónozása és a tesztrendszer kidolgozása A syndecan-4 szerepének vizsgálatához izolálni kell a syndecan-4 gént (1. ábra). Ezt egy általunk készített cDNS könyvtárból, PCR technika segítségével tettük. Majd az élő sejtes kísérletekhez láthatóvá alakítottuk fehérjénket úgy, hogy zöld fluorescens fehérjét (GFP) fuzionáltattunk a syndecan-4 extracelluláris domainjébe. A kísérleti műtermékek kiküszöbölésére két különböző helyre is beépítettük a GFP-t, rögtön a szignál peptid mögé: Szignál- GFP- CellBindingDomain (CBD)- Transzmembrán (TM)- CitoplazmásDomain (CD), illetve a plazma membránhoz közel Szignál- CBD -GFP-TM-CD (2. ábra). Működő syndecan-GFP chimérát eddig rajtunk kívül csak egy belga csoport tudott felmutatni (Zimmermann, szem. közl.). Éppen ezért alaposan teszteljük a konstrukcióinkat, vajon minden szempontból megegyeznek-e a vad típussal. Az eddigi vizsgálatok alapján a rekombinánsok a vad típusú syndecan-4-hez hasonlóan viselkednek. MAPARLFALLLFFVGGVAESIR

ETEVIDPQDLLEGRYFSGALPDDEDVVGPGQESDDFELSGSGD

LDDLEDSMIGPEVVHPLVPLDNHIPERAGSGSQVPTEPKKLEENEVIPKRISPVEESEDVSNKVSMSSTVQGSNIF ERTEVLAALIVGGIVGILFAVFLILLLMY 1.

RMKKKDEGSYDLGKKPIYKKAPTNEFYA

ábra Syndecan-4 aminosav sorrendje. A világoskék kiemelés a szignál peptidet, a sárga az extracelluláris, a sötét kék a transmembrán és a rózsaszín a citoplazmás domaint jelzi.

39


Si4 Si4 Si4

Cell Binding Domain CBD GFP

GFP CBD

TM

CD4

TM

CD4

TM

CD4

2. ábra Syndecan-4, és a GFP chimerák szerkezete. A zöld fluorescens protein (GFP) az extracelluláris szegmensbe lett beillesztve. A kostrukciók tesztelése A különböző plazmid konstrukciókat, különböző sejtvonalakban teszteltük. FuGene6 (Roche) transzfekciós reagenssel vittük be a plazmidokat a sejtekbe. A transzfekciós hatásfok függött a sejtvonal típusától, a tenyészet kondíciójától, de összességében a használt HT1080, HEK293, MCF7, M1 vonalakban kb. 40% hatékonyságot értünk el GFP-t tartalmazó vektor plazmiddal. Összehasonlítva a GFP-s alap plazmid és a syndecan-4-et tartalmazó plazmidok expressziós mintázatát látható, hogy míg a GFP homogén módon kifesti az egész sejtet, addig a a syndecan-4 specifikus lokációt mutat, hasonlóan a syndecan-1-hez, főként sejtfelszíni membrán lokalizációt mutat (3. ábra). Az endogén syndecan-4 és a syndecan-4- GFP chimerák ugyan arra helyre lokalizáltak immuncytokémiai festéssel.

3. ábra Syndecan- GFP chimerákat expresszáló sejtek. Az első kocka egy zöld fluorescens proteint termelő (GFP-s) vektor expresszióját mutatja (pEGFP). A GFP majdnem homogén módon tölti ki az egész sejtet. A másodikon egy syndecan-1GFP chimera látható (HuSyndecan-1pEGFP). A harmadikon (135pCBD) és a negyediken (CBD.pSi4GFP) a két különböző syndecan-4- GFP fúziós fehérje mintázata látszik élő sejtekben. A syndecanok főként a sejt plazma membránban lokalizálnak. A syndecan-4 Triton X-100 detergens insolubilis kompartmenekben található a membránban Mivel a sejtfelszín és az azt körül vevő mátrix kapcsolatát vizsgáljuk, ezért fontos vizsgálni, hogy a sejtfelszíni plazma membránban hol foglal helyet a syndecan-4. A Triton X-100 (TX 100) nem ionos detergens, a fehérjék oldhatósága TX 100-ban jellemzi a fehérjék más fehérjékhez való viszonyát. Amennyiben egy fehérje TX 100-ban nem oldható, ez környező fehérjékhez való viszonyára utal, vagyis, pl. kapcsolódik a raft alkotó többi fehérjéhez. A lipid raftok több egymáshoz kapcsolt, koleszterin észter köré szerveződő, transzmembrán fehérjék alkotta csoport, amiben különböző, jelátviteli receptorok is megtalálhatóak. A raft rezidens GM1 és a syndecan-4 immuncytokémiai festése megmutatta, hogy a syndecan-4 egy része lipidraftokban található (4. ábra). Azonban a raftokon kívüli syndecan-4 sem bizonyult TX 100 szolubilisnek.

40


4. ábra Syndecan-4 a lipid raftokban van. Syndecan-4 (zöld) részben kolokalizál (sárga) a lipid raft marker (piros) GM1 fehérjével Triton X-100 extrakció után. A kolokalizációt jelentő sárga foltok mellett előfordul piros, és zöld is, ami azt jelzi, hogy csak egy része a syndecan-4-nek foglal helyet a klasszikus raftokban. Syndecan-4 szerkezeti felépítése és ismert kölcsönhatói Syndecan-4 az I. típusú transzmembrán fehérjékhez tartozó glycoprotein. Az extracelluláris szegmensén 3 heparánszulfát és bizonyos szövetekben kondroitin- szulfát láncok találhatóak. Az extracellularis rész tartalmaz egy kb. 50 aminosav hosszú sejt-kötő domaint (CBD), ami képes volt különböző szövetek sejtjeit egymáshoz rögzíteni. A transzmembrán domainen keresztül dimerizálódik, de nem képes heterodimert képezni más syndecannal. A rövid cytoplazmás domainje (29 amino sav) számos fehérjével lép interakcióba, amik nagyrészt cytoszkeletális proteinek, mint pl.: vinculin, tallin, α-actinin, paxillin, FERM család, kinázok közül, más a membrán-dinamikában fontos fehérjék: synectin, syndesmos, PDZ kötő fehérjék: synbindin, syntenin, CASK, Lin2. Mivel a motilitás képesség kialakításban a PKCα kináznak szerepe van, ezért a syndecan-4 PKCα kötését szabályzó helyét mutáljuk el. A syndecan-4 179Ser foszforilációján keresztül szabályozódik a kötés és aktiváció. Ezt a szerint cseréltük le glutaminsavra, ami mimikálja a foszforilált szerint, ezzel várakozásaink szerint egy domináns negatív syndecan-4-et állítunk elő (5.ábra). A jövőben ennek hatását vizsgáljuk humán melanóma sejtekre. NdeI 235 NcoI 361 5000

1

SalI 596 SmaI 754 BglII 793 XbaI 853

CBD

AlwNI 4430

1000

Glu154pCBD 4000

5316 bp

NheI 1018 NcoI 1023

GFP

NcoI 3761

Glu154 2000

FspI 3431 PvuII 3435

3000 NcoI 3058

BglII 1747 XhoI 1751 HindIII 1760 EcoRI 1957 NotI 1973 XbaI 1983 HpaI 2092

PvuII 2827

Glu154=MSSTVQGSNIFERTEVLAALIVGGIVGILFAVFLILLLMYRMKKKDEGEYDLGKKPIYKKAPTNEFYA

5. ábra Syndecan-4 Ser179Glu mutáns plazmid térképe. A plamid térképen a restrikciós helyek vannak feltüntetve. A plazmidkép alatt a GFP-hez csatlakozó transzmembrán és citoplazmás rész aminosav sorrendje olvasható.

41

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 4. programcsomag: Terápia-individualizálás farmakogenomikai módszerekkel 4.1. Novekedési faktor receptor és hormonreceptor kölcsönhatás farmakogenomikája emlő- és fejnyaki daganatokban (dr. Csuka Orsolya, dr. Józsa Adrinne, Roche Diagnosztika kft) 4.1.1. Molekuláris célpontok screenelése genomikai módszerekkel emlő- és fejnyaki daganatokban Bevezetés, célkitűzések A tirozin kinázok overexpressziója, mutációja lényeges szerepet játszik a daganatok metasztázis képződésében a sejtproliferáció állandósulásában és a terápiás érzékenység meghatározásában. Ennek alapján a tirozin kinázok az úgynevezett célzott terápia kitüntetett gén családjának tekinthetők. A daganatterápia egyik új irányzata az úgynevezett célzott terápia, amely optimális esetben alkalmas a daganat proliferáció, metasztázis képzés, angiogenezis gátlására. A célzott terápiás eljárásra alkalmas innovatív gyógyszer fejlesztésének főbb lépései: 1. molekuláris target meghatározása human daganatokban, 2. potenciális gyógyszerek tesztelése in vitro, in vivo modellekben, 3. új gyógyszerkombinációk kifejlesztése a terápiás hatékonyság növelésére, 4. molekuláris target szint változás monitorizálása terápiás kezelést követően, 5. kifejlesztett gyógyszer-kombinációk human alkalmazása. A receptor tirozin kinázok családjába 58 gén sorolható, amelyek a különböző daganatokban eltérő módon expresszálódnak. A tirozin kinázok gátlására alapozó daganatterápia előfeltétele az, hogy a kezelendő daganat tirozin kináz mintázatát meghatározzuk. Erre ad lehetősége a DNS chip technológia. Emlő tumorok esetében bebizonyosodott, hogy az 52 tirozin kináz gén közül az erbB2 gén overexpressziója az emlődaganatok megközelítőleg 30%-ában előfordul, amely fokozott metasztázis képződéssel és gyógyszerrezisztencia (antiestrogén, aromatáz gátlók, Taxánok, sugárkezelés) kialakulásához vezetett. Ugyanakkor a fejnyaki daganatokban az EGFR fokozott expressziója jellemzi a daganatok >80%-át. Ennek alapján az EGFR gén család szelektív gátlása jelentősen javíthatná a terápia hatékonyságát és ezáltal növelhetné a betegek gyógyulási esélyét is. Beteganyag és módszerek. A vizsgálati periódusban 65 HER2+ és 35 HER- emlő tumor szövet mintát és 78 fejnyak daganat szövet 32 szájüreg, 28 szájgarat, 23 gége daganat mintát archiváltunk -70°C, -180°C fokon. Microarray vizsgálatainkhoz házi készítésű oligo (50-mer)-chipet készítettünk, amihez az 53 tirozin kinázt reprezentáló próbákat illetve 92 ösztrogén-regulált gén próbáit helyeztük el multiplex módon. Belső standardként GAPDH, Her2, cyclinD1 szolgáltak. A mintákból RNS-t izoláltunk, majd CyDye-UTP felhasználásával cDNS-t szintetizáltunk. A hibridizációt hibridizációs kamrában végeztük és a lemezeket Molecular Dynamics Array Scannerrel olvastuk le 2 m felbontásnál. Az adatok feldolgozását ArrayVision programmal végeztük. DNS chip alkalmazása EGFR (tirozin kinázok) jelátviteli mechanizmusának felderítése emlő és fej-nyak daganatokban. 1. Emlő daganatok tirozin kináz gének expressziós mintázatának meghatározása oligo DNS chipel módszerrel. Emlő daganatok biológiai viselkedését, terápiás kezelését alapvetően meghatározza a HER2 expresszió mértéke. Ennek alapján a HER2 pozitív és HER2 negatív emlő daganatok tirozin kináz expressziós mintázatát hasonlítottuk össze. Vizsgálatainkban minden oligo DNS chip 5 azonos szövettani típusú, azonos klinikai stádiumú HER2+, illetve HER2 – emlő daganat RNS mintázatát tartalmazza. A HER2 status meghatározása immunhisztokémiával (Hercept teszt), ezt követően FISH módszerrel, illetve RT-PCR módszerrel történt. Vizsgálataink során 50 HER2+ és 50 HER2 – emlő daganatból izolált RNS mintából cDNS-t állítottunk elő, amelyeket 5-5 mintánként pooloztunk. Az így nyert poolozott 10-10 mintát 10-10 oligo DNS chipre hibridizáltattuk. A HER2+ és HER2 – emlő tumorok tirozin kináz oligo DNS chipek analíziseinek adatait az 1. ábra tartalmazza. A HER2 – emlő daganatokban a *-gal jelölt tirozin kináz gének expressziója magasabb, mint a HER2 + daganatokban. Ezek közé tartozik: DDR2, INSR, KIT, PDGFRß. A HER2 pozitív daganatokban az ERB2 mellett az ERB3, EPHA8, EPHB4, FGFR2, FGFR4, TEK, NTRK3, VEGFR1,2 magasabb, mint a HER2 – daganatokban. Mind a HER2 – , mind a HER2+ emlődaganatokban az EGFR3, az NTRK3 és az AATYK2 kiemelkedően magas és ezen tirozin kináz gének expressziója meghaladja a HER2 + daganatok erbB2 expressziójának mértékét: ezért ezek a tirozin kináz gének új terápiás célpontoknak tekinthetők. 1. ábra Emlő daganatok tirozin kináz gén expressziós mintázata oligo DNS chip analízis alapján

Belső standard GAPDH% 1000 900

800

700

600

500

400

300

200

42

* **

STYK

AATYK

AATYK2

TIE

NTRK3

TEK

*

NTRK1

RYK

ROS1

ROR2

PTK7

*

VEGFR3

*

HER2 pozitív

ROR1

KIT

FLT3

MET

MST1R

INSRR

IGF1R

INSR

*

VEGFR2

*

VEGFR1

*

FGFR4

FGFR3

FGFR2

FGFR1

EPHB4

*

HER2 negatív

PDGFRA

*

EPHB3

EPHB2

EPHA8

EPHB1

EPHA7

EPHA6

EPHA5

EPHA4

EPHA3

EPHA2

EPHA1

ERBB4

ERBB2

ERBB3

*

PDGFRB

*

EGFR

DDR2

DDR1

TYRO3

AXL

LTK

MER

0

ALK

100

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 2. Fej-nyaki daganatok tirozin kináz gének expressziós mintázatának meghatározása oligo DNS chipel módszerrel. 10-10 különböző lokalizációjú (szájüreg, szájgarat, algarat, gége), daganatokból származó mintát pooloztuk és ezek tirozin kináz mintázatát hasonlítottuk össze. A fej-nyak daganatok tirozin kináz gének oligo DNS chip analíziseinek eredményeit a 2. ábrán foglaltuk össze. Megállapítható, hogy az ERbB2 expresszió mértéke a gége tumorokban a legmagasabb, míg az EPHA1, EPHA2, ROR1, ROR2 a száj-garat eredetű daganatokban a legmagasabb. Eredményeink arra utalnak, hogy a különböző anatómiai lokalizációjú fej-nyak daganatok tirozin kináz expressziós mintázata egymástól jelentősen eltérő. Ennek alapján ezen daganatok terápiás kezelésére is eltérő protokollt kellene alkalmazni. A kiemelkedően magas tirozin kináz expressziós gének fej-nyak daganatok esetében az alábbiak: ERbB2, EPHA1, EPHA2, FGFR2, FGFR4, ROR1, ROR2, NTRK3, AATYK2. Ezek a gének terápiás célpontoknak tekinthetők. A tizenkét gént tartalmazó EPH család tagjai közül kiemelendő a szájgarat mintákban igen magas expressziót mutató EPHA1 és EPHA2 gének. Az EPHB 1 és EPHB4 a fej-nyak daganatokban szintén megemelkedik meg. A ROR család mindkét tagja a szájgarat mintákban megemelkedik. Vastagbél tumorokban a ROR2 mRNS szint szintén magas. Összefoglalva megállapítható, hogy a HER2 + és a HER2- emlő daganatos tirozin kináz mintázata egymástól eltérő, amely a HER2+ és HER2- emlő daganatok eltérő biológiai viselkedését jelzi. A fej-nyak daganatok tirozin kináz mintázata is anatómiai lokalizáció szerint változik. Ennek alapján arra lehet következtetni, hogy a fej-nyak daganatok tirozin kináz gátlókkal szembeni érzékenysége a tumorok lokalizációjától függ. 2. ábra. 2. ábra. Különböző anatómiai lokalizációjú fejnyaki rákok TK-expressziós profilja.

Steroid receptorok jelátviteli mechanizmusának felderítése DNS chip módszerrel emlő daganatokban A hormon dependens tumorok kezelésére általában antiestrogen terápiát alkalmaznak. A terápia hatékonyságának előfeltétele azonban, hogy az estrogen receptor működőképes legyen. Mivel az estrogen receptor transzkripciós faktorként működik az általa regulált gén expressziós mintázat felvilágosítást nyújthat a receptor funkcionális állapotáról. A steroid receptorok jelátviteli mechanizmusának vizsgálata hozzájárulhat a környezetünkben lévő estrogen hatású szennyeződések kimutatására, amely a daganatok kialakulásának megelőzéséhez járulhat hozzá. A vizsgálat sorozat alapvető célkitűzése saját fejlesztésű oligo DNS chip kialakítása ER regulált génexpressziós mintázat meghatározására. Az oligo DNS chip fejlesztéséhez a következő munkafázisok szükségesek. Munkafázisaink: ERE tartalmú target szekvenciák meghatározása NCBI adatbázisból. Oligopróbák tervezése, Oligoprobák szintézise és felvitele exoxyvel borított üveg felszínű hordozóra, Oligo DNS chip validálása RT PCR módszerrel, Oligo DNS chip alkalmazása ER regulált génexpresszió vizsgálatára hormon dependens emlő daganattenyészetekben. A 92 génre oligopróbákat terveztünk Array Designer Program (Version 1.1. Premier Biosoft International) segítségével. Minden target szekvenciához 4 próbát terveztünk. Az optimális probe szekvenciát emelkedő RNS koncentráció mellett nyert fluorencens intenzitás alapján határoztuk meg. Az oligo chip kialakításához 50 bp hosszúságú NH2 végén módosított próbákat szintetizáltattunk, amelyeket epoxy réteggel borított üveg hordozóra printeltünk. Az oligo DNS chipek validálását RT-PCR módszerrel végeztük. Az RT-PCR-ral kapott expressziós értékek és az oligo DNS chipen mért fluorescens intenzitás alapján számított génexpressziós értékek szignifikáns korrelációt mutattak. A hibridizált

43

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ oligo chip képét a 3. ábrán mutatjuk be. Azok a gének, amelyek specifikus hibridizációt mutattak, sárga színnel vannak feltüntetve. A vizsgálatokat ZR 75 emlő daganatsejt-tenyészeteken végeztük. Az egymás után elvégzett hibridizációs kísérletek eredményei közötti korrelációs koefficiens 0,928-nak bizonyult. Eredményeink arra utalnak, hogy az általunk tervezett oligo-DNS chip és hibridizációs protokoll alkalmas az ER regulált génexpresszió tanulmányozására. További vizsgálatot igényel ezen az ER regulált génexpressziós mintázat meghatározása humán emlő daganatokban. 3. ábra. ZR75 humán emlőráksejtek ösztrogén-regulált génjeinek expressziós profilja.

ACT CLDN

CTS

ERBB

EGF ESR

ESR GAPD

KRT1

JU

KRT1 MAP2K

MUC NME

MY PG

RA

RPL13

STC

TFF

SLC7A

Csont-markerek kimutatásának infrastrukturális alapjainak megteremtése, a diagnosztikus kitek tesztelése, validálása Roche Diagnosztika kft Az emlődaganatok szervspecifikus metasztázisában a csontvelő kitüntetett szerepet játszik. A csontvelő metasztázist a kiterjedt csontvelő metasztázis CT és MRI vizsgálatokkal nagyrészt azonosítható. Ebben az esetben azonban a beteg gyógyulási esélyei már rohamosan csökkennek. A csontmetasztázis korai felfedezésére ezért olyan szérummarkerek alkalmazása szükséges, amely a csontmetasztázis valószínűségét a progresszió korai fázisában már jelzik. Vizsgálatainkban ennek megfelelően emlő tumoros betegekből vérmintákat gyűjtöttünk, és szérumot preparáltunk. A szérumból Osteocalcint, Parathyroid hormon (PTH), Béta-Cross-Laps és protokollagén aminó-terminális propeptid (total P1NP) meghatározására került sor. 3.1. Csontmarkerek referenciaértékeinek meghatározása nem daganatos betegekben Vizsgálataink alapvető célkitűzése annak meghatározása, hogy a nem daganatos személyek vérmintáiban a csontmarkerek normál értékeit meghatározzuk, és ennek alapján a daganatos betegek emelkedett csontmarkereit értékelni tudjuk. Vizsgálatainkat a Modulare 170 Immunkémiai Automata (Roche) készülékkel végeztük. 444 posztmenopausális személy vérmintáinak analízise alapján megállapítottuk, hogy a total P1NP átlagértéke 40,43 ng/mlnek felel meg. A hormonpótlás terápiában részesült páciensek száma 154 volt, ezen személyeknél az átlagérték 31,74 ng/ml P1NP, míg a hormonpótlás terápiában nem részesülő személyeknél ez az átlagérték magasabb, 45,05 ng/ml volt. A 129 premenopausális személy szérummintáinak vizsgálata alapján a total P1NP átlagérték 30,1 ng/ml-nek bizonyult. Megállapítást nyert, hogy a premenopausális személyek serum Osteocalcin értéke 11-43 ng/ml között változott. Postmenopausális személyeknél az Osteocalcin szérum értéke 15-46 ng/ml érték közé esett. A parathyroid hormon (PTH) normál szérumban mért értéke 15-65 pg/ml közé esett. A Béta-CrossLaps (egyes tipusú Collagén degradációs terméke) szérum értéke premenopausális személyeknél (254 fő átlaga) 299 pg/ml, postmenopausális személyeknél (429 fő) ez az érték 556 pg/ml-nek bizonyult. Csontmarkerek expressziójának bevezetése emlőrákos betegek monitorozására A csontmarkerek normál értékeinek meghatározását követően 50 randomizált emlő daganatos beteg szérum mintáiban határoztuk meg 4 csontmarker szérum értékét (1. táblázat). Vizsgálataink során megállapítható, hogy a Béta-CrossLaps marker csak az M3-as és az M17-es jelű betegek mintáiban mutatott emelkedett értéket. Ezzel szemben a PTH szérum értéke az M4-es, M6-os, M17-es, M23-as mintákban is az átlagértéket meghaladta. A total P1NP érték az M4-es, M8as, M17-es, M23-as és az M35-ös mintákban mutatott emelkedett értéket. A vizsgálat alacsony mintaszáma miatt a klinikai stádium és az emelkedett markerszint közötti korreláció számítására nem nyílt lehetőség. Bebizonyosodott azonban, hogy az M17-es jelzésű betegnél, ahol mind a 4 markerszint szignifikánsan megemelkedett, a csontmetasztázis jelenléte műszeres analízissel is igazolható volt. További követéses vizsgálatot igényel annak eldöntése, hogy az emelkedett csontmarker-szint mennyi idővel jelezheti előre a csontmetasztázisok megjelenését, más szóval az általunk vizsgált markerek alkalmasak-e az emlő daganatok csontvelő metasztázisok predikciójára.

44

1.

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ táblázat Emlőrákos betegek csontmarker szintjeinek meghatározása.

Sorszám 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50.

Minta

β-CrossLaps ng/mL

Osteocalcin ng/mL

PTH pg/mL

total P1NP ng/mL

M1

0,146

17,27

53,95

30,08

M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M 10 M 11 M 12 M 14 M 15 M 16 M 17 M 18 M 19 M 20 M 21 M 22 M 23 M 24 M 25 M 26 M 27 M 28 M 29 M 30 M 31 M 32 M 33 M 34 M 35 M 36 M 37 M 38 M 39 M 40 M 42 M 485 M 538 M 375 M 553 M 555 M 529 M 534 M 504 M 511 M 97

0,174 *0,601 0,361 0,220 0,350 0,369 0,279 0,171 0,358 0,218 0,126 0,545 0,157 0,161 *1,42 0,214 0,141 0,069 0,355 0,263 0,383 0,250 0,226 0,087 0,229 0,130 0,372 0,217 0,583 0,216 0,382 0,139 0,497 0,075 0,082 0,081 0,116 0,081 0,116 0,240 0,243 0,175 0,515 0,278 0,186 0,091 0,076 0,483 *

20,75 24,34 *33,27 18,12 *33,54 29,08 33,98 22,19 *37,79 15,22 18,49 29,57 20,89 26,51 *123,0 26,78 4,24 13,75 14,39 21,97 *47,50 21,77 16,53 17,00 18,20 15,01 21,72 19,24 *35,50 14,87 33,29 12,98 28,25 12,76 14,82 10,03 17,62 19,58 17,49 14,37 30,82 14,65 21,17 17,71 15,33 15,66 6,74 12,56 *

36,49 32,70 *94,27 43,69 *65,21 50,05 39,80 41,61 54,83 42,21 44,75 52,00 49,76 41,15 *120,8 42,42 15,83 28,10 36,14 56,23 *65,64 56,69 51,54 23,63 52,24 24,72 42,12 58,08 48,48 38,84 59,14 44,23 24,79 38,47 59,38 27,86 29,96 42,68 28,24 43,18 32,76 38,84 59,22 48,00 31,53 29,63 29,77 56,47 *

49,41 49,34 *162,2 41,12 49,64 66,21 *84,14 30,16 52,39 16,60 25,80 33,92 67,39 39,56 *215,3 32,42 12,97 19,74 45,32 32,24 *79,68 37,09 32,71 30,79 32,20 24,09 63,51 24,49 66,88 27,71 85,24 26,31 *86,03 24,59 35,70 19,19 34,70 22,60 24,87 20,56 39,89 19,53 18,44 30,98 21,53 19,91 13,12 21,16 *

45

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 4.2. Fejnyaki rákok hormonterápiájának kidolgozása. Dr. Remenár Éva, dr. Kátai József, AstraZeneca kft. 4.2.1. ER+ laphámrákok kiegészítő hormonterápiás protokolljának kidolgozása

Synopsis A vizsgálat címe: Nyílt, kontroll nélküli, fázis II vizsgálat Faslodex-szel végzett palliatív terápia hatásának megítélésére olyan ösztrogén receptor pozitív, recidív, reziduális vagy metasztatikus fej.-nyak laphámrákokban, amelyek legalább egy platina-alapú terápiás kombinációban már részesültek, amellett progrediált a daganatuk, és további kezelésként aktív onkoterápia már nem jöhet szóba. Szponzor: Országos Onkológiai Intézet, NKFP1a-0024-05 program támogatásával A vizsgálat fázisa: klinikai fázis II Résztvevő centrum: Országos Onkológiai Intézet, 1122 Budapest, Ráth Gy u –7-9 A program vezetője: prof. dr. Tímár József, az MTA doktora, Országos Onkológiai Intézet, 1122 Budapest, Ráth Gy. U. 7-9, tel: 224-8786, fax: 224-8706, E-mail: [email protected] A vizgálat vezetője: dr. Remenár Éva főorvos, OOI, Fejnyaksebészeti osztály Résztvevő orvosok: dr. Boér András, dr. Koltai László, dr. Fülöp Miklós dr. Pólus Károly, Főgyógyszerész: Vonákné Petrovics Éva Vizsgálati monitor: dr. Lövey József Tervezett betegszám: 20 Tervezett vizsgálati időszak: 18 hónap: 2007 június - 2008 január Tervezett végső értékelés: 2008. szeptember 30. A vizsgálat célja: Elsődleges végpont: a Faslodex-szel kezelt betegek teljes túlélési idejének meghatározása és összehasonlítása a palliatív platina-alapú kezelés mellett progrediáló daganatos betegek jelenleg észlelt ≤ 4 hónapos median túlélési idejével Másodlagos végpontok: • A Faslodex kezelés biztonságossága, toxicitása • A betegek életminősége • Terápiás válasz (CR=komplett, vagy PR=parciális remisszió,SD=stabil disease) • Progresszió mentes túlélés (PFS) • A kezelés felfüggesztéséig eltelt idő (TTF) Vizsgálati terv Ebben a nyílt, kontroll nélküli, fázis II vizsgálatban olyan reziduális, recidív vagy metasztázissal rendelkező, ösztrogén receptor pozitív fej-nyak laphámrákos betegeket kezelünk a szelektív ösztrogén-receptor blokkoló Faslodex-xel, akik már legalább egy platina alapú terápiás kombinációban részesültek, amellett daganatuk progrediált, és a progresszió kezelésére hagyományos terápiás lehetőség (műtét, sugár) már nem jön szóba. A betegség képalkotó vizsgálattal történő dokumentálása és a gyógyszeres kezelés megkezdése között maximum 28 nap telhet el. A vizsgálatba 20 beteg bevonását tervezzük. A vizsgálatban való részvétel feltételei • A kivizsgálás kezdete előtt aláírt beleegyező nyilatkozat a vizsgálatról történt részletes információt követően. • Szövettanilag vagy cytológiailag igazolt laphámrák, mely a szájüreg, szájgarat, algarat, gége és orrgarat területéről indult ki. • Ösztrogén receptor pozitív daganat (immunhisztokémiailag és/vagy mRNS vizsgálattal) • A daganat recidív, reziduális vagy metasztatikus, és már legalább egyszer részesült a beteg platina alapú kezelésben, amely mellett progrediált a daganat. • Nincs lehetőség a daganat kiterjedése, előzetes sugárkezelés vagy a beteg általános állapota miatt más hagyományos, aktív daganatterápiára • Legalább egy darab, két dimenzióban mérhető daganat jelenléte • Karnofsky státus > 80 18 éves életkor • Aktív antikoncepció, amennyiben esély van terhességre • Vérkép: fehérvérsejtszám ≥ 3 x 109/L, neutrofilszám ≥ 1.5 x109/L, thrombocytaszám ≥100 x 109/L, hemoglobin > 9 g/dL

46

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ • Májfunkció: bilirubin ≤ 1.5 x a labor felső normálértéke (ULN), GOT, GPT ≤ 2.5 x ULN • Vesefunkció: serum kreatinin ≤1.5 x ULN • Legalább 12 hetes életkilátás A vizsgálatban való részvételt kizáró tényezők • Ismert agyi vagy a lágy agyhártyákat érintő daganatterjedés vagy áttét • Dokumentált HIV, hepatitis B vagy C fertőzés • Máj és veseelégtelenség • Terhesség és szoptatás • Súlyos kísérő betegség: keringési, légzési, neurológiai, diabetes • Más primer daganat jelenléte, vagy kórtörténete az elmúlt 5 évben • Más klinikai vizsgálatban történő részvétel aktuálisan vagy 30 napon belül • Szellemi, fizikai, szociális, családi vagy földrajzi tényezők, amelyek kérdésessé teszik, hogy a beteg a vizsgálat során rendszeresen kezelhető és követhető lesz-e A vizsgálati gyógyszer Faslodex (fulvestrant) 250 mg/5 ml injekciós oldat: tiszta, színtelen vagy sárgás viszkózus folyadék adagoló fecskendőben Adagolás: 250 mg Faslodex intramuscularis injekciója = egy adagoló fecskendő havonta egy alkalommal. Eredeti indikáció: posztmenopausában levő nők ösztrogén receptor pozitív, helyileg előrehaladott vagy metasztatikus emlőrákja, adjuváns antiösztrogén kezelés alatt vagy után, vagy daganatprogresszió más antiösztrogénnel történő kezelés mellett. Vizsgálatok és kezelések terve Szűrővizsgálat I.: felvilágosítás utáni beleegyező nyilatkozat aláírása, a beteg demográfiai adatainak rögzítése, a daganat adatainak rögzítése, ER státus meghatározás a primer tumorból vagy az esetleges friss biopsziából Szűrővizsgálat II (amennyiben a tumor ER pozitivitása igazolódott): az első kezelés előtt ≤ 28 nappal • besorolási kritériumok és kizárási feltételek ellenőrzése • általános kórtörténet • a daganatra vonatkozó kórtörténet, előző kezelések, a hagyományos onkoterápiára való alkalmatlanság okai • fizikális és tükörvizsgálat (indirekt, direkt) • CT vagy MRI vagy PET/CT vizsgálat valamennyi ismert daganatos régióról • mellkas rtg vagy CT • hasi ultrahang vizsgálat • hasi CT vagy MRI klinikai gyynú esetén • csont izotóp vizsgálat, CT vagy MRI: klinikai gyanú esetén • a kísérő betegségek rögzítése • dohányos és alkoholos anamnézis • az első kezelés előtt ≤ 7 nappal: • fizikális, és tükör vizsgálat, Karnofsky státus, testsúly, testmagasság, vérnyomás, pulzus, hőmérséklet, a testsúlyvesztés mértéke az elmúlt három hónapban • az életminőség kérdőív kitöltése • laborvizsgálatok, hormonstátus és vérkép • terhességi teszt (ha indokolt) • a kezelés kezdete előtt 4 héten belül megjelent mellékhatások rögzítése Kezelés Amennyiben a beteg megfelelt a beválasztási kritériumoknak, a szűrővizsgálatokban előírt határidőn belül 250 mg Falodexet kap intramuscularisan. A kezelés 28 naponként folytatódik a kezelés befejezését indokló események bekövetkeztéig. A kezelés befejezése • képalkotó vizsgálattal igazolt tumorprogresszió (WHO kritériumok) a klinikai vizsgálat kiindulási állapotához képest vagy • elfogadhatatlan mellékhatások vagy kísérő betegségek kialakulása vagy • a beteg beleegyezésének visszavonása. Betegkövetés A kezelés alatt havonta a következő injeció beadása előtt: fizikális vizsgálat, életfunkciók, vérkép és labor, és hormon kontroll, életminőség kérdőív kitöltés, a mellékhatások, kísérő gyógyszerek rögzítése. CT vagy MRI vagy PET 8 hetente progresszióig. A progressziót követően havonta kell rögzíteni, hogy a beteg életben van-e. A beteg halála esetén a halotti dokumentációt ki kell tölteni. Értékelés Hatásosság:

47

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ túlélés: az első kezelés dátumától a bármely okú halál időpontjáig progresszió mentes túlélés: az első kezelés dátumától az első dokumentált progresszióig a kezelés befejezéséig eltelt idő (TTF): az első kezeléstől a bármely ok miatt abbahagyott kezelés időpontjáig a legjobb terápiás válasz: a kiindulási képalkotó vizsgálatot követően legalább két képalkotó vizsgálat által megerősített terápiás válasz alapján életminőség értékelése Biztonságosság, tolerálhatóság: az összes olyan beteg mellékhatásai, vérképe, labor- és hormonleletei alapján, akik kaptak Faslodex kezelést. Statisztika: az adatok leíró statisztikai elemzése A vizsgálat háttere A fej-nyak laphámrák világszerte a 6. leggyakoribb daganat: évi 600000 új fej-nyak laphámrákot diagnosztizálnak. Az európai incidencia 70000 új eset évente. (3). Hazánkban megközelítőleg 7000 új esetet észlelünk (Nemzeti Rákregiszter). A kombinált kezelési módszerek (műtét, sugár, kemoterápia) mellett is a daganat prognózisa rossz, az 5 éves túlélés nem éri el a 40%-ot, és ez az eredmény nem sokat javult az elmúlt évtizedekben. A daganatok 60%-a bármilyen primer terápiát követően 2-3 éven belül recidívál, többnyire lokoregionálisan, ritkábban távoli áttétet okozva. A recidivák első vonalbeli kezelése a korábbi terápiától függ. A sebészi eltávolítás és a sugárkezelés mellett az utóbbi két évtizedben a leghatásosabbnak bizonyult kemoterápiás kombinációk cisplatint vagy carboplatint tartalmaztak. A platina alapú kezelések mellett kialakult daganatprogresszió esetén általában csak tüneti kezelésre van lehetőség, a túlélés esélye pedig a platina-rezisztens tumoros betegek számára kevesebb mint 4 hónap. A terápiás eredmények javítása érdekében számos új gyógyszerrel próbálkoztak. Ezek közül a leghatásosabbnak a kemoterápiás kombinációk taxánokkal történő kiegészítése, és a molekulárisan célzott kezelések bizonyultak. Ez utóbbiak között fej-nyak laphámrákos betegekben a legtöbb tapasztalat az epidermális növekedési faktor receptort blokkoló ezáltal a tirozin-kinaze jelátviteli folyamatot akadályozó Erbitux –szal áll rendelkezésre. A cisplatin rezisztens esetekben, bár kis számban Erbitux monoterápia eredményezett daganat stabilizációt ill. parciális remissiót. Ennek az az alapja, hogy a laphámráksejteken 90-100%-os az epidermális növekedési faktor pozitivitás. Hormonreceptorok, hormonterápia Az endocrin környezet jelentősen befolyásolja hormonreceptort expresszáló daganatok: emlő, endometrium, prostata, progresszióját. Ezekben a tumorokban hatásosságuk és a cytotoxikus kemoterápiánál jobb tolerálhatóságuk miatt már évtizedek óta klinikai gyakorlattá váltak vagy a hormonreceptorok működését blokkoló, vagy a hormonszintet csökkentő kezelések. A hormonhatást módosító gyógyszerekkel és kezelésekkel kapcsolatos legtöbb tapasztalat az ösztrogén receptor befolyásolására vonatkozik. Ismert, hogy az ösztrogén receptor fontos, a növekedéssel és sejtoszlással kapcsolatos élettani funkciót tölt be, és aktív szerepe van az ösztrogén függő daganatok (emlő, endometrium) progressziójában. Az ER a nukleáris receptor superfamília tagja. E receptorok képesek extacelluláris szignálok közvetítésével transzkripcionális választ kiváltására, azaz ligand-vezérelt transzkripciós faktorok. Az ösztrogén hatás fiziológiás választát kétféle recpetor az ERα és ERβ közvetíti. Ösztradiol receptorokat azonban nemcsak az említett, közismerten hormonfüggő szövetekben mutattak ki. Ismert többek között, hogy a tüdő, az ér-endothelium, bizonyos nyálmirigytumorok és a gége nyálkahártyája is tartalmaz hormonreceptorokat. (1-6) Intézetünkben végzett, PCR analízissel megerősített vizsgálat szerint fej-nyak laphámrák sejteken 50,7%-ban expresszálódott ER és 49,3%-ban PgR. Az ER izoformok között ERα dominált az ERβ fölött. Az ERα splice variánsai között a δ3 ritkábban, míg az Erβ δ5 splice variánsa gyakrabban fordult elő. A funkcionális receptor expresszió, az ER-PgR coexpresszió 40,3%-ban volt jelen. Az ER expresszió nem okozott szignifikáns különbséget a túlélésben, leszámítva a gége+hypopharynx alcsoportot, ezeknek rosszabb volt a betegség 3 éves prognózisa a daganat ER+a esetén. (3) Faslodex ER+ posztmenopauzális emlőrák kezelésében a hormonreceptor gátlás vagy a receptor blokkolása révén tamoxifennel, vagy antioestrogén hatású aromatáz gátlás útján történik. Az ER blokkoló kezelések új formája a Faslodex kifejlesztése. A Faslodex ösztrogén receptor antagonista, mely kompetitiv módon, az ösztradiolhoz hasonló affinitással kötődik az ösztrégén receptorokhoz. Blokkolja az ösztrogén serkentő hatását a sejtre, anélkül hogy részleges agonista (ösztrogénszerű) hatása lenne. Hatására az ER protein downregulációja következik be. Posztmenopauzális, ER+ emlőrákos nőkben végzett klinikai vizsgálatokban Faslodex hatására szignifikáns, dózisfüggő csökkenés következett be az ER protein szintjében placebo kezeléshez viszonyítva. Csökkent a PgR szint is, ami a tamoxifen kezelés mellett ismert, részleges agonista hatás ellen szól. Két fázis III klinikai vizsgálatban összesen 851 posztmenopauzális, előrehaladott emlőrákos nő adatait dolgozták fel, akiknek endokrin kezelés mellett vagy azt követően progrediált a tumoruk. A daganatok receptor státusa 77%-ban ER+, 23%-ban ER- volt. E klinikai vizsgálatokban a Faslodex kezelés hatásosságát és biztonságosságát harmadik generációs aromatáz gátló anastrozole kezeléssel hasonlították össze. A vizsgálatok eredménye azt mutatta, hogy mind a progresszióig eltelt idő (TTP), mind az objektív terápiás válasz (OR), mind a túlélés szempontjából nem volt szignifikáns különbség a két kezelési csoport között. A receptorstátus elemzése arra utalt, hogy csak ER+ tumorokban volt hatásos. A vizsgálatokban nem volt nyilvánvaló, hogy a Faslodex kezelés lényegesen befolyásolná a hypothalamus-hypophysis tengelyt. A Faslodex kezelés hatására létrejött terápiás válasz tartós volt. A kezelést a betegek jól tolerálták.. Sem kezelés alatti halál, sem súlyos mellékhatás nem volt. Emlőrákban a

48

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Faslodex-szel történő hatásos, tartós és jól tolerálható kezelés eredményeként távolabbra került a cytotoxikus kemoterápia bevezetésének szükségessége. A Faslodex hazánkban törzskönyvezett ösztrogén receptor blokkoló ER+ előrehaladott emlőrákok esetében, bizonyos feltételek mellett. A vizsgálatok alapján a Faslodex alkalmazásának kontraindikációi: ismert túlérzékenység, terhesség, szoptatás, súlyos májelégtelenség. Óvatosan adandó: enyhe és közepes májelégtelenségben (a hatásosság-biztonságosság viszonyát nem vizsgálták), enyhe és közepes veseelégtelenségben (a hatásosság-biztonságosság viszonyát nem vizsgálták), a kezelés módja (intramuszkuláris injekció) miatt vérzéses diathesis, thrombocytopenia, antikoaguláns kezelés esetén. A Faslodex hatásmechanizmusa miatt van esély osteoporozis kialakulására, bár ezirányú hosszútávú hatását nem vizsgálták. Mellékhatások. A klinikai vizsgálatok során emlőrákos betegek 47%-ának volt valamilyen mellékhatása, de csak 0,9%-ban kellett a kezelést emiatt abbahagyni. A leggyakrabban panaszolt mellékhatások: nagyon gyakori (>1/10): hőhullám, gyakori (>1/100, <1/10): hányinger, hányás, hasmenés, anorexia, az injekció helyén kialakult fájdalom, gyulladás, bőrkiütés, húgyúti infekció, vénás thromboembolia, fej- és hátfájás, gyengeség, ritka (>1/1000, <1/100): túlérzékenységi reakció, vaginális vérzés, folyás, moniliázis. Platina-rezisztens laphámrák és hormonreceptor gátlás Faslodex-szel ER+ fej-nyak laphámrákokban az ER blokkolása a klinikai vizsgálatokban hatásosnak és jól tolerálhatónak bizonyult Faslodex-szel elvileg célzott terápiaként befolyásolhatja a daganat progresszióját. Preklinikai vizsgálatok szerint az ösztrogén fokozta ER+ fejnyaki laphámrák növekedését in vivo (7), míg az ER blokkoló kezelések gátolták az ilyen laphámrákok növekedését in vitro és in vivo (8,9). Platina rezisztens recidív laphámrákban egyéb hatásos kuratív kezelés nem jön szóba. A betegek általában gyenge egészségi állapotúak, számos kísérő betegséggel rendelkeznek, ezért csak minimális toxicitású kezelések alkalmazhatók. Amennyiben a kezelt betegek medián túlélése 50%-al meghosszabbodik a jelenlegi median 4 hónaphoz képest, és/vagy legalább 2 betegnél észlelünk objektív terápiás választ, a kezelés hatásossága valószínű, és kombinálható más célzott, hasonlóképpen kevéssé toxikus terápiákkal, pl az EGFR blokkolókkal. Irodalom: 1. Ferguson BJ, Hudson WR, McCarty KS, Jr. Sex steroid receptor distribution in the human larynx and laryngeal carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1987;113; 1311-1315. 2. Remenár É, Számel I, Buda B, et al. “Why men?” Hormones and hormone receptors in male head and neck cancer patients. In Klainsasser O, Glanz H, and Olofsson J eds. Advances in Laryngology in Europe. Elsevier, 1997;137-140. 3. Tímár J, Csuka O, Remenár É, Répássy G, Kásler M. Progression of head and neck squamous cell cancer. Cancer Metast Rev 24:107-127, 2005 4. Ögretmenoglu O, Ayas K. Laryngeal carcinoma and estrogen receptor analysis in patients after long-term follow-up. Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 1998;255;457-461. 5. Hagedorn HG, Nerlich AG. Analysis of sex-hormone-receptor expression in laryngeal carcinoma. Eur. Arch. Otohinolaryngol. 2002;259;205-210. 6. Maiorano E, Botticella MA, Marzullo A, Resta, L. Expression of ER-D5 and EGFr in laryngeal carcinoma and malignant epithelium. Acta Otolaryngol. Suppl. 1997;527;595-599. 7. Somers KD, Koenig M, Schechter GL. Growth of head and neck squamous cell carcinoma in nude mice: potentiation of laryngeal carcinoma by 17 β-estradiol. J. Natl. Cancer Inst. 1988;80;688-691. 8. Grenman R, Virolainen E, Sharipa A, Carey, T. In vitro effects of tamoxifen on UM-SCC head and neck cancer cell lines: correlation with the estrogen and progesterone receptor content. Int. J. Cancer 1987;39;77-81. 9. Ferrandina G, Almadori G, Maggiano N, et al. Growth-inhibitory effect of tamoxifen and quercetin and presence of type II estrogen binding stites in human laryngeal cancer cell lines and primary laryngeal tumors. Int. J. Cancer 1998;77;747-754.

49

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 4.3. Daganatok antraciklin terápiájának monitorozása non-invazív molekuláris képalkotó eljárással. Dr. Kásler Miklós, Soós Miklós, Auroscience kft. 4.3.1. Antraciklin sejten belüli lokalizációjának kimutatása humán emlőráksejtekben, fibroblasztban és endotélsejtben Elméleti háttér Az antraciklinek a korszerű daganatterápia alapvető alkotó részei napjainkban így meghatározó elemei az emlőrákok adjuváns, de újabban neo-adjuváns terápiájának is. Különös hangsúlyt ad az emlőrákok antraciklin kezelésének az a tény, hogy kiderült a HER2 amplifikált DIC nemcsak az anti-HER2 antitest-terápiának a molekuláris célpontja. Újabb adatok szerint a HER2 amplifikáció által érintett régió a 17. kromoszómán gyakran magába foglalja a TOPO1A által kódolt régiót is, tehát ezekre a daganatokra HER2/TOPO2A amplifikáció jellemző. Ennek a következménye, hogy ezen daganatok esetében a Herceptin kezelést antraciklinekkel érdemes kombinálni, mert ennek a gyógyszercsaládnak az egyik molekuláris célpontja a TOPO2. A klinikai vizsgálatok igazolták, hogy antraciklin tartalmú kombinációk hatékonyabbak voltak a HER2 amplifikált daganatok esetében. Ez előre vetíti azt, hogy az emlőrákok adjuváns vagy neoadjuváns kezeléséhez meg kell határozni a HER2 és TOPO2 statust, és így célozottan kell alkalmazni a Herceptinantraciklin kombinációkat. A kombináció egyik kritikája azonban az, hogy ennek mindkét alkotó része kardiális mellékhatásokkal jár és attól lehet félni, hogy egymást esetleg potencírozzák is. Sokszor felmerült már korábban, hogy jó volna a kemoterápia során monitorozni a kezelés hatékonyságát és a gyógyszer famakodinamikáját, azonban az erre alkalmas módszerek invazívak, illetve radioaktív izotópokat használnak, tehát szükséges volna non-invazív egyszerű és gyors, lehetőleg képalkotó módszerre. Jelen program keretében ilyen módszer kialakításán fáradozunk. Mivel a citosztatikumok egyik legszélesebb körben alkalmazott családjának tagjai (antraciklinek) fluoreszkáló molekulák, melyek széles spe4ktrumban (zöld) gerjesztve széles spektrumú vörös fluoreszcens fényt emittálnak, ez lehetősége ad arra, hogy a szervezetben, illetve a daganatos szövetben nem-invazív módon is követhessük útjukat. Az emberi szövetek vizsgálatára azok autofluoreszcenciáját már használják. Ennek a típusú nem-invazív képalkotó diagnosztikájának a technológiája, illetve infrastruktúrája kialakult, amelyben a résztvevő partnerek (OOI és az Országos Korányi Tbc és Pulmonológiai Intézet) bizonyos tapasztalatra tettek szert. Másrészt megjelent ezen partnerek kezében a fotodinámiás terápia, amely esetében a daganatszövetet fényérzékeny (adott esetben fluoreszcens) molekulával jelölik és pusztítják. Ez a technológia és annak infrastruktúrája is rendelkezésre áll. A jelen molekuláris képalkotó program célja ezen technológia olyan továbbfejlesztése, amelynek révén kialíthatunk egy az antraciklin citosztatikumok in vivo kimutatására alkalmas endoszkóp prototípusát. (Véleményünk szerint célszerű volna kialakítani egy ún. dermatoszkóp-prototípust is.) Másrészt a program során az in vivo antraciklin imaging diagnosztikus/farmakológiai alapjainak kidolgozását tervezzük. Eddigi eredmények Első lépésként immunhiányos SCID egereket kezeltünk 15 percig az antraciklin származék Epirubicin-nel, humán terápiás dózisban. Ezt követően az álaltokat Nembutállal elaltatva vizsgáltuk a májszövet, a harántcsíkolt, valamint a szívizomzat antraciklin tartalmát és lokalizációját. (Fontos tudnivaló, hogy ezen gyógyszercsalád egyik legfontosabb mellékhatása kardiotoxickitás.) A vizsgálni kívánt szöveteket közvetlenül az eltávolítás után folyékony nitrogénnel hűtött metilbutánban fagyasztottuk le. A szívizomszövet immuhisztokémiai vizsgálatához 5 µm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk, melyeket a fixálást (-20°C metanol, 10 perc) és többszöri PBS-sel történő mosásokat követően anti-desmin antitesttel jelöltünk (1:50, 1 óra, nyúl poliklonális, Dako Corp., Carpenteria, CA). Újabb mosást követően a metszetek megfelelő szekunder antitestekkel történő szimultán kezelése következett (Cy5-konjugált anti-egér IgG, FITC-konjugált anti-patkény IgG, TRITC-konjugált anti-patkány IgG, TRITC-konjugált anti-nyúl IgG, FITC-konjugált anti-nyúl IgG; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, 1:50). Első lépésben fluoreszcens mikroszkópot használtunk annak megállapítására, hogy valóban ki tudjuk-e mutatni mikroszkópos eszközökkel az antraciklineket, azok fluoreszcens képességei alapján, szöveti szinten. A májszövet esetében magfestést is végeztünk (DAPI, 5 µM, 5 perc, MolecularProbes Inc). Ezt a módszert 2005 végén már közöltünk (Tóvári et al, Cancer Res.). A szívizomszövet vizsgálatával párhuzamosan a májból is készítettünk metszeteket, melyek vizsgálatához a magot kék fluoreszcens festékkel tettük láthatóvá (DAPI). Feltehetően a vérellátás egyenetlensége miatt inkább foltos volt a májlebenykék jelölődése, és alacsony intenzitású volt a gyógyszer magi akkumulációja (a sejtmagokat DAPI magfestéssel, kékre jelöltük, (1a. ábra). Ugyanakkor a kezelt állatok szívében 15 perccel az Epirubicin in. beadása után a szívizomsejtek magjában 100% gyakorisággal mutatható ki az antraciklin a friss, fixálatlan fagyasztott metszetekben. Ehhez a mintát zöld gerjesztő hullámhosszú fénnyel kellett megvilágítani, ekkor a gyógyszer vörös (590-615 nm) tartományban történő fluoreszcenciája alapján volt kimutatható, míg a szívizomsejtek zöldben jelölődtek a marker denzinnel (1b. ábra). Mindkét minta esetében egyes területeken megfigyelhető volt a kötőszöveti sejtek, esetenként az ereket bélelő sejtek magjának vörös fluoreszcenciája is. Ugyanakkor megjegyezendő, hogy citoplazmatikus jelölődést ezen mintában egyáltalán nem észleltünk, ami arra utal, hogy a gyógyszer igen gyorsan jut be a normális szövetek sejtjeibe és ott igen specifikusan a sejtmagban DNS-hez kötődve akkumulálódik. Ennek alapján nem olyan nagy csoda, hogy fő mellékhatása a kardiotoxicitás. Ugyanakkor még azt nem tudjuk, hogy mégis akkor miért nem olyan gyakori ez a mellékhatás, hiszen a betegek csak egy kis hányadában jelentkezik. Tehát a normális sejtek magjából feltehetően a repair-képesség révén vagy, más módon a gyógyszer kiürül, és erre utal a későbbiekben bemutatott klinikai vizsgálat is. A folyamat dinamikáját a továbbiakban kísérleti rendszerben tisztázni fogjuk.

50

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ Klinikai vizsgálatok Intézetünkben korábban klinikai vizsgálatok történtek egy nagyobb beteganyagon, amikor is előrehaladott stádiumú emlőrákos betegeket a sebészi kezelést megelőzően neoadjuváns kemoterápiával részesítettek. A vizsgálatban első lépésként képalkotó vizsgálattal, majd core-biopsziával diagnosztizálták az emlőrákot, majd a betegeket antraciklintartalmú (Epirubicin-FEC, Adriamicin-FAC protokoll) kemoterápiás kombinációkkal kezeltek 4 ciklusban 12 héten át (a kummulatív antraciklin-dózis 200 mg/m2). A kezelés után történt a daganat sebészi eltávolítása. Ezen beteganyag patológiai mintáin teszteltük azt, hogy az antraciklinek kimutahatók-e az emlőrákban a kezelés után. Erre a célra a primer diagnosztikus core-bipsziát használtuk fel kontrollként, amennyiben még kimutatható volt a daganatszövet bennük (sok esetben a diagnózishoz elfaragták a blokkot), majd ezt hasonlítottuk a daganat műtéti anyagához. A formalin-fixált paraffinos metszeteket deparaffináltuk, majd ezt a natív készítményt fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk a háttér zöld fluoreszcencia segítségével (strukturális orientáció). Ez az erős zöld flureszcencia a formalinfixálás következménye. Ugyanakkor a korábban használt zöld gerjesztő hullámhossz mellett vizsgáltuk a mintákban a vörös fluoreszcenciát. Sajnos a formalinfixálás e tekintetben is okozott alap-, ún. háttér vörös fluoreszcenciát, ami azonban csak a vörösvértestek esetében volt erős intenzitású, más szöveti elem csak alacsony szinten fluoreszkált. Öt beteg esetében sikerült eddig elvégezni a pre- és posztoperatív minták összehasonlító vizsgálatát, akik antraciklin tartalmú PAC, illetve Epirubicin tartalmú FEC, EC, illetve TXT-Epi kombinációs kezeléseket kaptak. A kezdő corebiopsziákban egyetlen esetben sem észleltünk a vvt-ken kívül más sejtes elem esetében erős magi vagy citoplazmatikus fluoreszcenciát (1c,e ábrák). Ugyanakkor valamennyi műtéti minta esetében észleltünk specifikus szövet fluoreszcenciát, amit vagy magukban a daganatsejtekben találunk (1f ábra), vagy a daganatsejt-fészkek körüli makrofágok citoplazmájában (1d ábra), vagy a pusztuló daganatsejtek citoplazmájában. Feltűnő volt, hogy egyes fészkekben a daganatsejtek magja milyen erős magi vörös fluoreszcenicát adott, ami nagyon hasonlított ahhoz, amit kísérleti körülmények között korábban SCID egerekbe oltott humán laphámrák esetében találtunk Epirubicin beadása után 15 perccel (Tóvári et al, Cancer Res, 2005). Felhívjuk a figyelmet arra, hogy ezekben az esetekben az antraciklinvizsgálat az utolsó kezelés után 7 nappal történt. Feltűnő az is, hogy a műtéti mintákban lévő daganatszövetet alkotó daganatsejtek többségében specifikus magi antraciklin fluoreszcencia nem volt jelen. Ez a jelenség arra utal, hogy az ún. reziduális vagy antraciklin-rezisztens daganatszövet nem tartalmaz antraciklint: azaz a daganatsejtek vagy már fel sem vették a gyógyszert, vagy azt hatékonyan lebontották, vagy kipumpálták, miután az antraciklinek is szubsztrátjai az MDR1 proteinnek. Ez irányba további vizsgálatokat kívánunk végezni immunhisztokémiai módszerrel. A másik értékes megfigyelésünk az, hogy a pusztult daganatszövetet eltakarító makrofágokban úgy tűnik, akkumulálódik az antraciklin, ami jól jelzi a korábbi antraciklin-okozta daganatszövet-pusztulást. Mindezen vizsgálatok alapján célszerű kiterjeszteni az ilyen típusú tanulmányt valamennyi neo-adjuváns antraciklin-kezelésen átesett emlőrákos esetre. Másrészt eredményeink az is mutatják, hogy az antraciklin kezelés után még napokkal is kimutatható szöveti szinten fluoreszcens mikroszkóppal az antraciklin. Kérdés azonban az, hogy ez a fluoreszcencia elegendő-e ahhoz, hogy azt makroszkóposan is detektáljuk. Ehhez a szövettani blokkok makroszkóposan fluoreszcens vizsgálatát fogjuk elvégezni a közeljövőben. Antraciklin detektor kialakítása Konzorciális partnerekkel együttműködve tervünk olyan készülék prototípusának létrehozása, amely alkalmas lehet emberi testben/testfelületen az antraciklin típusú gyógyszerek akkumulációjának kimutatására, annak jellegzetes vörös fluoreszcenciájának felhasználásával. Miután ún. autofluoreszcens lézer-detectoros rendszer már létezik, amely zöld tartományban érzékel, e készülék célirányos módosítását kívánjuk elvégezni. A gyakorlati alkalmazás szempontjából dermatoszkóp, ill. endoszkóp kialakítása jön szóba, hogy a tápcsatornában, illetve a felszínes bőr alatti daganatokat (emlőrák, illetve rektális rák) tudjuk vizsgálni, amelyek esetében ún. műtét előtti (neo-adjuváns) antraciklin kezelést alkalmaznak, és ahol a sikertelenség, szükségtelen műtéti várakoztatást eredményezne. A preklinikai vizsgálatokhoz egyszeri kisösszegű beruházással megteremthető a feltétel a teljes makroszkópiának, ami egy átalakított fluoreszcens mikroszkóp, amely a szükséges gerjesztő fényforrást biztosítja, és digitális kamerával detektálja megfelelő szűrővel az emittált vörös vényt. A fejlesztés első lépéseként meghatároztuk azokat az „ideális” paramétereket, amelyek a gerjesztő és a detektálási hullámhosszra vonatkoznak szöveti körülmények között. Ennek alapján elkészítettük a módosított endoszkóp, ill. dermatoszkóp terveit.

51


1. ábra. Antraciklin kimutatása szöveti szinten fluoreszcens mikroszkópiával A.SCID egér májszövetének fagyasztott metszete 15 perccel Epirubicin beadását követően. DAPI magfestés (kék). A májsejtek magjában egyenetlen intenzitással vörös antraciklin-fluoreszcencia mutatható ki, ami a portális érlumen körül a legintenzívebb. B.SCID egér szívizom fagyasztott metszete 15 perccel az Epirubicin beadását követően. Az izomsejteket anti-desmin marker jel9öli (zöld fluoreszcencial). Feltűnő az izomsejtek magjának egyenletes intenzív vörös fluoreszcenciája. C-E. Ductalis invazív carcinoma core-biopsziái a kezelés megkezdése előtt. Fluorelszcens mikroszkópos felvétel, vörös fluorelszcencia tartomány. Látható a gyenge diffúz háttér szöveti fluoreszcencia, illetve az E ábrán egy-egy vvt intenzív fluoreszcenciája. D. FAC protokollal kezelt emlőrák műtéti anyaga, vörös fluoreszcencia. A daganatsejtfészkek közepesen intenzív diffúz citoplazmatikus fluoreszcenciát ad. Ugyanakkor feltűnő a kötőszövetben elhelyezkedő makrofágok citoplazmájának granuláris intenzív vörös antraciklin-fluoreszcenciája.

52

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ 4.4. Vastagbélrák kemoterápiájának farmakogenomikája. Dr. Kralovánszky Judit. 4.4.1. A vastagbélrák (CRC) adjuváns kezelésének költséghatékony optimalizálása farmakogenomikai vizsgálatokkal Előzmények A colorectalis rákok (CRC-k) gyógyszeres kezelésében az 5-fluorouracil ( 5-FU) mellett az utóbbi 10 évben számos új gyógyszer (irinotecan, oxaliplatin, bevacizumab, cetuximab, stb.) került klinikai használatba amelyek alkalmazása nagy anyagi terhet ró az egészségügyi finanszírozásra ezért a gyógyszermegválasztás optimalizálása ( maximális hatékonyság mellett minimális toxicitás) fontos egészségügyi és gazdasági érdek. Korábbi vizsgálatainkban (Hitre E és mtsai Pharmacogenetics and Genomics, Vol.15., No.10, 723-730, 2005 )megállapítottuk, hogy az 5-FU molekuláris targetje a timidilátszintáz (TS) génpolimorfizmusainak meghatározása az adjuváns kezelésre adott terápiás válasz, a betegségmentes és teljes túlélés predikcióját teszi lehetővé. A rossz prognózisú esetekben az 5-FU kezelés más gyógyszerrel történő kiegészítése indokolt. A TS polimorfizmusok mellett a TS aktivitását a folát kofaktor (5,10metilén-tetrahidrofolát) is befolyásolja ezért a folát anyagcsere egyéb enzimeinek farmakogenetikai vizsgálata is nélkülözhetetlen. Megállapítottuk, hogy a metiléntetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) C677T polimorfizmusa az 5-FU kezelt metasztatikus CRC-s betegek esetében prognosztikai értékkel bír. A rosszabb prognózisú CC genotípusok esetében az 5-FU mellett irinotecan vagy oxaliplatin adása javasolható (Budai B., és mtsai Magyar Onkológia 48/3: 253-257, 2004) A folát anyagcsere másik kulcsfontosságú enzime a szerinhidroximetil-transzferáz (SHMT) amelynek C1420T polimorfizmusa befolyásolja a plazma folát szintet. A fent emített új gyógyszerek közül az irinotecan súlyos, elsősorban a gastrointestinalis rendszert érintő mellékhatásainak kialakulásában fontos szerepet játszanak az UDP glukuronáttranszferáz gén polimorfizmusai, melyek közül az UGT1A1*28 a májban keletkező aktív metabolit az SN-38 inaktiválását végzi. Az oxaliplatin hatékonyságát nagymértékben csökkentő rezisztencia kialakulásában pedig a nukleotoid exciziós repair (NER) géncsalád tagja az XPD (ERCC2) gén polimorfizmusai tehetők felelőssé. Jelen pályázatban vállalt munkánk célja: több – a CRC-k kezelésében alkalmazott gyógyszer metabolizmusában szereplő gén polimorfizmusának vizsgálata alapján egy olyan rutinszerűen alkalmazható és a klinikum részére javasolható vizsgálati rendszer kidolgozása, amelynek alapján az orvos egyénre szabottan dönt a beteg kemoterápiás kezelésében alkalmazott gyógyszerekről, azok alkalmazási sorrendjéről. A pályázat első részbeszámolójában az alábbi feladatok teljesítéséről számolunk be: 1.) Az MTHFR A1298C polimorfizmus vizsgálata CRC-s betegeken 2.) SHMT C1420T polimorfizmus szerepe a gyógyszerhatékonyságban és túlélésben palliatív 5-FU ill 5-FU + irinotecan (FOLFIRI) kezeléseket követően Eredmények 1.) Az MTHFR A1298C polimorfizmust 567 CRC-s beteg és 249 egészséges kontroll esetében PCR technikát követő RFLP-vel határoztuk meg. Az emésztéshez MboII restrikciós enzimet használtunk. ( 1.ábra) A vizsgált beteg és kontroll populáció MTHFR A1298C genotípus megoszlása megfelel a Hardy-Weinberg eloszlásnak, a két csoport között szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk. ( 2.ábra) A betegek követése és összefüggés keresése a túlélés és a genotípus, valamint az ugyancsak meghatározott homocisztein szintek között folyamatban van.

1.ábra MTHFR A1289C génpolimorfizmus meghatározása PCR-RFLP módszerrel 50

esetszám %

40 30

kontroll n=249 beteg n=567

20 10 0

AA

AC

CC

2.ábra MTHFR A1289C genotípusok megoszlása kontroll egyénekben és CRC-s betegekben 2.) Az SHMT C1420T genotípusát valós idejű PCR (MGB-primer) módszerrel határoztuk meg, amint azt korábbi jelentésünkben már bemutattuk. A genotipizált 167 metasztatikus CRC-s beteg közül 102 beteg 5-FU és 65 beteg 5-

53

ONKOGENO-NKFP1a-0024-05 A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel 1.sz részjelentés, 2006. szeptember 30. BIZALMAS INFORMÁCIÓ FU+irinotecan (FOLFIRI) terápiában részesült. A betegek esetében a medián követési idő 26 ± 18 hónap volt. A genotípus megoszlást a következőnek találtuk: CC- 80, CT-74 és TT- 13 beteg. - A kezelésre adott objektív klinikai válasz (CR+PR+SD) szignifikánsan jobbnak bizonyult (p=0,02) a FOLFIRI kezelés esetén. A T alléllel rendelkező (CT+TT) betegek esetében, az objektív klinikai válasz 20 %-kal volt magasabb. (3.ábra) - A Kaplan-Meier módszerrel értékelt progressziómentes és teljes túlélés szignifikánsan hosszabbnak bizonyult a FOLFIRI kezelést kapott CT+TT genotípusú betegek esetében a csak 5-FU kezelésben részesültekhez viszonyítva (4.ábra). - A többváltozós Cox regressziós analízis - figyelembe véve a nem, kor, tumor lokalizáció, differenciáció, metasztázis helye és az előző adjuváns kezelés hatását - igazolta, hogy a T allélal rendelkező betegek esetében a FOLFIRI kezelés a relapszus rizikót mintegy 50 %-kal csökkentette az 5-FU kezeléshez képest. Következtetés: Fenti vizsgálati eredmények alapján megállapítható, hogy az SHMT C1420T polimorfizmus vizsgálata fontos információt szolgáltat a belgyógyász onkológus részére a választandó kezelés eldöntésekor. A CT és TT genotípusú betegek esetében választott kombinált 5-FU + irinotecan kezelés hosszabb betegségmentes túlélést, kezelésmentességet eredményez és ezáltal csökkennek az egészségügy anyagi ráfor-dításai. 3.ábra Összefüggés az objektiv klinikai válasz (CR+PR+SD) az SHMT genotípusok valamint a kezelés között 5-FU-val p=0,02

objektív klinikai válasz (%)

100

5-FU FOLFIRI

75

50 SHMT CC

CT+TT

(n=102) és FOLFIRI-vel (n=65) CRC-s betegeken 5-FU FOLFIRI

túlélési arány

1,00

0,75

0,75

p=0,05

p=0,001

0,50

0,50

0,25

0,25

0,00

1,00

0

5

10

15

20

0,00

0

20

40

60

80

4. ábra A progressziómentes és teljes túlélés az SHMT CT+TT csoportban 5-FU (n=102) és FOLFIRI (n=65) kezelést követően

54


Publikációk (2005-2006) Nemzetközi közlemények 1. Nathanson KL, Kanetsky PA, Hawes R, Vaughn DJ, Letrero R, Tucker K, Friedlander M, Phillips KA, Hogg D, M. AS. Jewett, Lohynska R, Daugaard G, Richard S, Chompret A, BonaïtiPellié C, Heidenreich A, Oláh E, Géczi L, Bodrogi I, Ormiston WJ, Daly PA, Oosterhuis JW, Gillis Ad. JM, Looijenga LHJ, Guilford P, Fossä SD, Heimdal K, Tjulandin SA, Liubchenko L, Stoll H, Weber W, Rudd M, Huddart R, Crockford GP, Forman D, Oliver DT, Einhorn L, Weber BL, Kramer J, McMaster M, Greene M, Pike M, Cortessis V, Chen C, Schwartz SM, Bishop DT, Easton DF, Stratton MR, Rapley EA: The Y deletion GR/GR and susceptibility to testicular germ cell tumor. AM J HUM GENET 77:1034-1043, 2005, (1. programcsomag) IF: 12.649 2. Antoniou AC, Pharoah PD, Narod S, Risch HA, Eyfjord JE, Hopper JL, Loma N, Olsson H, Johannsson O, Borg A, Pasini B, Radice P, Manoukian S, Eccles DM, Tang N, Oláh E, AntonCulver H, Warner E, Lubinski J, Gronwald J, Gorski B, Tulinius H, Thorlacius S, Eerola H, Nevanlinna H, Syrjakoski H, Kllioniemi OP, Thompson D, Evans C, Peto J, Lalloo F, Evans DG, Easton DE et al.: Breast and ovarian cancer risks to carriers of the BRCA1 5382insC and 185delAG and BRCA2 6174delT mutations: a combined analysis of 22 population based studies. J MED GENET 42: 602-603, 2005, (1. programcsomag) IF: 4.330 3. Lakhani SR, Reis-Filho JS, Fulford L, Penault-Llorca F, van der Vijver M, Parry S, Bishop TBenitez J, Rivas C, Bignon YJ, Chang-Claude J, Haumann U, Cormelisse CJ, P. Devilee P, M. Beckmann M, Nestle-Krämling C, Daly PA, Haites N, Varley J, Lalloo F, Evans G, Maugard S, Fiche M, Meijers-Heijboer H, Klijn JGM, Oláh E, et al.: Prediction of BRCA1 status in patients with breast cancer using estrogen receptor and ‘basal’ phenotype. CLIN CANCER RES 11:5175-5180, 2005 (1. programcsomag ) IF: 5.715 4. Adrieu N, Goldgar DE, Easton DF, Rookus M, Brohet R, Antoniou AC, Peock S, Evans G, Eccles D, Douglas F, EMBRACE, Nogués C, Gauthier-Villars M, Chompret A, GENEPSO, Van Leeuwen FE, Kluijt I, GEO-HEBON, Benitez J, Arver B, Oláh E,and IBCCS Collaborators Group, Chang-Claude J: Pregnancies, Breast-feeding, and breast cancer risk in the Intrnational BRCA1/2 Carrier Cohort Study (IBCCS). J NATL CANCER INST 98 (8): 535-544, 2006, (1. programcsomag)IF: 15.171 5. Crockford G, Linger R, Hockley S, Dudakia D, Johnson L, Huddart R, Tucker K, Friedlander M, Phillips KA, Hogg D, Jewett MAS, Lohynska R, Daugaard G, Richard S, Chompret A, BonaitiPellié C, Heidenreich A, Albers P, Oláh E, Géczi L, Bodrogi I, Ormiston WJ, Daly PA, Guilford P, Fossä SD, Heimdal K, Tjulandin SA, Liubchenko L, Stoll H, Weber W, Forman D, Oliver T, Einhon L, McMaster M, Kramer J, Greene MH, Webe BL, Nathanson KL, Cortessis V, Easton DF, Bishop DT, Stratton MR, Rapley EA: Genome-wide linkage screen for testicular germ cell tumour susceptibility loci. HUM MOL GENET 15:443-451, 2006, (1. programcsomag) IF: 7.764 6. Csernák E, Tóth E, Melegh Zs, Schneider T, Rosta A and Szentirmay Z: Detection and quantization of MBR/JH2 t(14;18) bcl-2 gene rearrangement in follicular lymphoma using a combined real time polymerase chain reaction assay. Haematologica, 91:858-859, 1996. (1. programcsomag) IF: 4.527 7. Rényi-Vámos F, Tóvári J, Fillinger J, Tímár J, Paku S, Kenessey I, Ostoros G, Agocs L, Soltész I, Döme B. Lymphangiogenesis correlates with lmyph node metastasis, prognosis, and angiogenic phenotype in human non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 22:7344-7453, 2005, (2. programcsomag) IF 5.715 55


8. Balázs Döme1,2,4, József Tímar1,4, Judit Dobos1,4, Lívia Mészáros4, Erzsébet Rásó4, Sándor Paku5, István Kenessey4, Gyula Ostoros2, Melinda Magyar1, Krisztina Bogos1,2, József Tóvári4: Identification and Clinical Significance of Circulating Endothelial Progenitor Cells in Human NonSmall Cell Lung Cancer. Cancer Res 66:7341-7347,2006 (2.programcsomag) IF 7.616 9. Tóvári J, Gilly R, Rásó E, Paku S, Bereczky B, Varga N, Vágó Á, Tímár J. Recombinant human ertythropoietin α targets intratumoral blood vessels, improving chemotherapy in human xenograft models. Cancer Res 65:71186-71193, 2005, (2/4.programcsomag) IF 7.616 10. Bereczky B, Gilly R, Rásó E, Vágó Á, Tímár J, Tóvári J. Selective antimetastatic effect of heparins in preclinical human melanoma models is based on inhibition of migration and microvascular arrest. Clin Experiment Metast 22:69-76, 2005, (3. programcsomag) IF 2.811 11. Tímár J, Tóvári J, Rásó E, Mészáros L, Bereczky B, Lapis K. Platelet-mimicry of cancer cells: epiphenomenon with clinical significance. Oncology 69:185-201, 2005 (3. programcsomag) IF 1.985 12. Lőrincz T, Tóth J, Szendrői M, Tímár J. Microvascular density of breast cancer in bone metastasis: influence of therapy. Anticancer Res 25:3075-3082, 2005 (4. programcsomag) IF 1.604 13. Lőrincz T, Tóth J, Badalian G, Tímár J, Szendrői M. Her2/neu genotype of breast cancer may change in bone metastasis. Pathol Oncol Res 12:149-152,2006 (4. programcsomag) IF 1.16 14. Tímár J, Csuka O, Remenár É, Répássy G, Kásler M. Progression of head and neck squamous cell cancer. Cancer Metast Rev 24:107-127, 2005 (4. programcsomag) IF 8.017 15. Hitre E, Budai B, Adleff V, Czeglédi F, Horváth Z, Gyergyai F, Lovey J, Kovács T, Orosz Zs, Láng I, Kásler M, Kralovánszky J. Influence of thymidilate synthase gene polymorphysm on the survival of colorectal cancer patients receiving adjuvant 5-fluorouracil. Pharmacogenet Genomics 15:723-730,2005. (4. programcsomag) IF 5.882 Előadások 1. Szentirmay Z: Prognostic pathology of neuroblastoma. XII. Congress of the Association of Serbia and Montenegro Pathologists with International Participation. Palics, May 31 – June 3, 2006 (Abstr. 0-27) 2. Szentirmay Z: Human papillomavirus in head and neck cancer: Molecular biology and clinicopathological correlations. XII. Congress of the Association of Serbia and Montenegro Pathologists with International Participation. Palics, May 31 – June 3, 2006 (Abstr. 0-2) 3. Budai B, Hitre E, Adleff V, Komlósi V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: Role of thymidylate synthase (TS), methylenetertahydrofolate reductase (MTHFR) and cytosolic serine hydroxymethyltransferase (SHMT) gene polymorphisms in the chemotherapy of metastatic colorectal cancer. AACR Special Conference in Cancer Research, Charleston, SC, USA, 2006. Abs.p.5. (4. programcsomag) 4. Komlósi V, Budai B, Hitre E, Adleff V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: The significance of the cytosolic serine hydroxymethyltransferase (SHMT) C1420T polymorphisms in the chemotherapy of metastatic colorectal cancer. EACR 19th Congress, Budapest, 2006. Abs.p.279 (4. programcsomag) 5. Kralovánszky J, Budai B., Adleff V.: A gyógyszerhatékonyság és toxicitás farmakogenetikai jellemzői colorectális rákokban. A Magyar Onkológusok Gyógyszerterápiás Tudományos Társaságának III. Kongresszusa Budapest 2006, Abs. p 9-10 (4. programcsomag) 56


6. Kralovánszky J.: Újabb antimetabolitok a malignus kórképek terápiájában. A Magyar Onkológusok Gyógyszerterápiás Tudományos Társaságának III. Kongresszusa Budapest 2006, Abs. p 8-9 (4. programcsomag)

57

ONKOGENO-NKFP1a A daganatos betegellátás innovatív fejlesztése genomikai módszerekkel

Recommend Documents