A mitokondrium szerepe a neurodegenerációban és a neuroprotekcióban

A mitokondrium szerepe a neurodegenerációban és a neuroprotekcióban Doktori értekezés

Gál Anikó Semmelweis Egyetem Szentágothai János Doktori Iskola

Témavezetők: Prof. Dr. Nagy Zoltán egyetemi tanár Dr. med. habil. Molnár Mária Judit, tud. főmunkatárs Hivatalos bírálók: Dr. Jávorszky Eszter PhD., tud. munkatárs Dr. Boczán Judit PhD., egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Sasvári Mária, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Báthori György Ph.D., tud. főmunkatárs Dr. Farkas Viktor Ph.D., tud. főmunkatárs

Budapest 2009

TARTALOMJEGYZÉK 1. Rövidítések jegyzéke ………………………………………………………………5 2. Bevezetés …………………………………………………………………………....9 2.1. A mitokondriumok szerepe egyes betegségek kialakulásában………………10 2.1.1. Mitokondriális betegségek általános jellemzői, pervalenciája ……… .10 2.1.2. mtDNS –hez kapcsolt betegségek………………………………..……11 2.1.2.1. mtDNS tRNS-asszociált betegségek……………......................11 2.1.2.2. mtDNS rRNS-asszociált betegségek…………………………. 13 2.1.2.3. mtDNS protein kódoló génekhez kapcsolt betegségek ……….14 2.1.3. Nukleáris genom mutációkhoz kapcsolt betegségek…………………….14 2.1.4. Neurodegenerativ kórképek másodlagos mitokondriális rendellenességekkel... ……………………………………………………….....16 2.1.5. A mitokondrium szerepe a prpgramozott sejthalálban………………….19 2.1.6. A mitokondrium szerepe az agyi ischaemiás folyamatokban …………..21 2.1.6.1. Az agyi ischaemia kezelésének lehetőségei …………………...23 2.2. Az agyi plaszticitás ………………………………………………………..26 3. Célkitűzések………………………………………………………………………...27 4. Anyagok és mószerek………………………………………………………………28 4.1. Mitokondriális DNS mutációk vizsgálata során alkalmazott módszerek… 28 4.1.1. Vizsgált betegek …………………………………………………28 4.1.2. DNS izolálás …………………………………………………… 28 4.1.3. PCR-RFLP vizsgálat ………………………………………….....29 4.1.4. mtDNS tRNSLys gén bidirekcionális szekvenálása ……………...30 4.2. In vitro kísérletekben használt metodikák…………………………………30 4.2.1. PC-12 sejttenyészet ……………………………………………...30 4.2.2. Vírus konstruktok és transzdukció ………………………………31 4.2.3. In vitro hypoxia és re-oxigenizáció ...............................................31 4.2.4. X-gal festés ……………………………………………………...32 4.2.5. Annexin V- propidium jodid kettős festés ………………………32 4.2.6. TMRE festés - Mitokondriális membránpotenciál vizsgálata ….33 4.2.7. RNS izolálás és reverz transzkripció …………………………....33

2

4.2.8. A génexpresszió mérése real-time PCR-rel ……………………..34 4.2.9. Western blot analízis …………………………………………….34 4.2.10. Statisztikai analízis …………………………………………..…34 5. Eredmények………………………………………………………………………...35 5.1.A mitokondriális tRNSLys gén polimorfizmusok jelentősége a hazai mitokondriális betegek differenciáldiagnosztikájában ………………………...35 5.1.1. Az irodalomból ismert bizonyítottan patogén mutációk…..……..35 51.1.1. mtDNS A8344G szubsztitúció …………………………35 5.1.2. Az általunk patogénnek feltételezett, az irodalomban eddig még le nem írt nukleotid szubsztitúciók ……………………………………….38 5.1.2.1. mtDNS A8332G szubsztitúció………………………...38 5.1.2.2. mtDNS T8310G és T8311A szubsztitúciók …………..41 5.1.3. Az irodalomból neurodegeneratív betegségekre hajlamosító szuszceptabilitási SNP …………………………………………………44 5.1.3.1. mtDNS A8347C szubsztitúció ………………………..44 5.1.4. Az irodalomból ismert polimorfizmusok jelenléte ……………...45 5.1.4.1. 9 bázispár deléció (del8271-8280) ……………………45 5.1.4.2. mtDNS G8251A szubsztitúció ………………………..46 5.1.4.3. mtDNS G8269A szubsztitúció ………………………..47 5.1.4.4. mtDNS C8270T szubsztitúció ………………………....47 5.1.4.5. mtDNS G8292A szubsztitúció ………………………..47 5.1.5. Egészséges kontroll egyének tRNSLys génjének vizsgálata ……48 5.1.6. tRNSLys és határoló régióinak vizsgálatakor talált eltérések összefoglalása …………………………………………………………..49 5.2. Az mtDNS tRNSLeu(UUR) gén A3243G mutáció genetikai epidemiológiai vizsgálata ………………………………………………………………………50 5.3. Adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL anti-apoptózis génterápia in vitro PC12 hypoxiás modellben ……………………………………………………………53 5.3.1. A kísérleti körülmények optimalizálása ……………………..…..53 5.3.1.1. Adenovírus alapú vektor bevitel hatékonyságának vizsgálata ……………………………………………………….53

3

5.3.1.2. Bcl-2 és Bcl-XL protein expresszió változása a transzdukciót követően …………………………………………53 5.3.1.3. Hypoxia/re-oxigenizáció hatása a sejtpusztulásra ……..54 5.3.1.4. A hatékony víruskoncentráció mérése ………………...55 5.3.2. Anti-apoptotikus géntranszfer eredményezte cytoprotekció …….57 5.3.2.1. Az argon gáz hypoxia által okozott sejtpusztulás elleni védelem a Bcl-2 és a Bcl-XL gének által……………………….57 5.3.2.2. A mitokondriális membránkárosodás elleni védelem az anti-apoptózis gének által ………………………………………59 5.3.2.3. Bcl-2 fehérje család pro- és anti-apopototikus tagjainak expresszió változása a transzdukciót követően ………………...60 5.3.3. Agyi plaszticitásban szerepet játszó gének és proteinek expesszió változása ………………………………………………………………..63 5.3.3.1. A GAP-43 fehérje expresszió változása ………………63 5.3.3.2. A nestin expresszió változása …………………………63 5.3.3.3. A synapsin-1 expresszió változása ……………………64 5.3.3.4. A c-fos expresszió változása ………………………….65 6. Megbeszélés ………………………………………………………………………...67 6.1. A mitokondriális tRNSLys gén és határoló régióiban talált eltérések jelentősége……………………………………………………………………...67 6.2. Az mtDNS A3243G mutáció genetikai epidemiológiai vizsgálata ……… 70 6.3. Az apoptózist gátló génterápia in vitro PC12 hypoxiás modelljében talált eredmények értelmezése ……………………………………………………….74 7. Következtetések…………………………………………………………………….77 8. Összefoglalás………………………………………………………………………..79 9. Summary …………………………………………………………………………...81 10. Irodalomjegyzék…………………………………………………………………..83 11. Saját publikációk jegyzéke……………………………………………………. .102 12. Köszönetnyilvánítás ……………………………………………………………..110

4

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AIF – apoptosis inducing factor ALS – amyotrophias lateralsclerosis ANT1 – adenin nuckleotid transzlokátor APAF1 - apoptotic protease activating factor 1 ATP – adenozin trifoszfát ATP7A - ATPase, Cu(2+)-transporting, alpha polypeptide AV – annexin V BCS1L – S. Cerevisiae, homolog-like BDNF - brain-derived neurotrophic factor bFGF – basic fibroblast growth factor CaBP – Ca - binding protein CBF – cerebral blood flow CGRP - calcitonin gene-related peptide CO - citokróm oxidáz COX – citokróm oxidáz CPEO – progresszív opthalamoplegia externa CRK2 - Cdc2-related protein kinase DCAR – D-karnitin DCMA – dilatatív cardiomyopathia és ataxia DDP1 - deafness/dystonia peptide 1 dGK – deoxi-guanozin kináz DGUOK - deoxyguanosine kinase DISC – death inducing signal complex DJ1 - Parkinson's disease protein DM – diabetes mellitus DMEM - Dulbecco’s modified Eagle’s medium DNAJC19 - translocase of inner mitochondrial membrane 14 ecSOD - Extracellular superoxide dismutase EEG - electroencephalogram EMG - electromyography

5

ENG - electroneurography eNOS – endotheliális nitrogén oxid szintáz FXN - frataxin GAP-43 – growth associated protein – 43 GLUT1 – glükóz transzporter-1 HADHA - hydroxyacyl-coa dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA thiolase/enoyl-CoA hydratase, alpha subunit HIF - hypoxia inducable factor HMC-CoA-lyase - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase HMGCS2 - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 2 HSPs – hősokk proteinek HSV1 - hipervariábilis régió 1 IL – interleukin IOSCA - infantile-onset spinocerebellar ataxia KGDHC – α-ketoglutarát-dehidrogenáz KIF5A - kinesin family member 5A KSS - Kearns-Sayre szindróma LHON – Leber féle optikus neiropathia LRPPRC - Leucine-Rich PPR Motif-Containing Protein MAP2 - microtubule-associated protein 2 MCAO – middle cerebral artery occlusion MELAS – mitokondriális enchephalopathia laktacidózis stroke szerű tünetekkel MERRF - Myoclonusos Epilepsia Ragged-Red rostokkal MI – myocardiális infarctus MIDD - maternally inherited diabetes and deafness MIRAS mitokondriális recesszív ataxia szindróma MNF2 - mitofuzin MNGIE - mitokondriális neurogastrointestinalis encephalopathia szindróma mtDNS – mitokondriális DNS NAD – Nikotinamid adenin dinkleotid NARP – Neuropathia Ataxia és Retinitis Pigmentosa ND – NADH dehidrogenáz

6

nDNS – nukleáris DNS NDUFS - NADH-ubiquitin oxidoreduktáz Fe-S protein NDUFV - NADH-ubiquitin oxidoreduktáz flavoprotein NFkB - nuclear-factor-kappa-B NGF – neural growth factor NMDA - N-metil-D-aszparaginsav OPA - opticus athrophia OXPHOS – oxidatív foszforiláció PCR – polimeráz láncreakció PDHC – piruvát dehidrogenáz- komplex PFU – plakkformáló egység PI – propidium jodid PINK1 - PTEN-induced putative kinase 1 PINK1 - PTEN-induced kinase 1 POLG . polimeráz- γ PVDF - polyvinil-difluorid RFLP – restrikciós fragmenthossz polimorfizmus RNR1 – riboszómális RNS1 RNR2 – riboszómális RNS2 ROS – reaktív oxigén species rtPA – szöveti plazminogén aktivátor SAG – apoptózis szenzitív gén SAH – subarachnoidális hemorrhagia SANDO - sensory ataxic neuropathy, dysarthria, and ophthalmoparesis SCO1 - S. Cerevisiae, homolog OF, Citokróm oxidáz deficiencia 1 SCO2 - S. Cerevisiae, homolog OF, Citokróm oxidáz deficiencia 2 SDH A-C – szukcinát-dehidrogenáz komplex SDS - sodium dodecyl sulfate SMA – spinalis muscularis atrophia SNP – single nukleoid polimorfizmus SOD1 – Cu/Zn szuperoxid diszmutáz SPG7 - spasticus paraplegia 7

7

SURF1 - Surfeit 1 TGF-β - transforming growth factor-beta TIA – transient ischaemic attack TIMM8A - translocase of inner mitochondrial membrane 8 TK – timidin kináz TMRE - tetramethyl-rhodamine-ethylester TP – timidin foszforiláz tRNS – transzfer RNS VDAC - voltage-dependent anion channel VGEF - vascular endothelial growth factor WFS1 - Wolfram szindróma 1

8

2. BEVEZETÉS

A mitokondrium a sejt energiaközpontja, minden eukarióta sejtben megtalálható. Az ősi bíborbaktérium endocitózisával keletkezett, sejtenkénti száma a sejtek energiaszükségletétől függ. A mitokondrium önálló DNS-sel rendelkezik, amely a prokariótákra jellegzetes cirkuláris molekula. Az emberi sejtben az mtDNS az egyetlen extrakromoszómális DNS, amely mind a nukleáris, mind a mitokondriális genom szabályozása alatt áll. A mitokondriumokban a duplaszálú DNS több kópiában (2-10) van jelen (Dimauro és Davidzon, 2005). A humán mtDNS a nukleáris genomtól eltérően csaknem kizárólag anyai öröklődést mutat. Egér fajok keresztezésekor a paternális átadódás igen alacsony szintjét mutatták ki, ami azonban fajon belül nem jelent meg, és a következő generációnak nem adódott tovább (Gyllensten és mtsai, 1991). Humán megfigyelések is találtak paternális öröklődést, de ezek száma elenyésző (Schwartz és Vissing, 2003). A mitokondriális genom mérete 16 569 bp, amely meglehetősen kicsi a 3,3 milliárd bázispárnyi nukleáris genomhoz képest. Az mtDNS 22 tRNS-t, 2 rRNS-t és 13 polipeptidet kódol, amelyek a légzési lánc egyes alegységei. A légzési lánc komplexeinek további alegységeit (54 polipeptid) és az mtDNS fenntartásához szükséges fehérjéket az nDNS kódolja, a citoplazmában lévő riboszómákon szintetizálódnak és onnan transzporter segítségével szállítódnak a mitokondriumba (Dimauro és Davidzon, 2005). A mitokondriális genom sok tekintetben eltér a magi DNS-től (2.1. táblázat). A humán mtDNS-ben nincsenek intronok, így a kódoló DNS aránya rendkívül magas, míg az egyes gének között csak néhány rövid (néhány bázisból álló), nem kódoló régió és átfedő szekvenciák is találhatók. A mitokondriális genomban nincsenek hisztonok. Az átíródás során a kodon-használat a mitokondrium esetében eltér az élővilágban általánosan használt univerzális kodonétól. Jellemző továbbá a splicing és az exonukleáz-aktivitás hiánya is, így a hibajavító mechanizmus hiánya miatt a mtDNS mutációs rátája a nDNS-hez képest kb. 10-szeres, ezért a mtDNS mutációi nagy számban felelnek az öröklődő betegségek kialakulásáért (Taylor és Turnbull, 2005).

9

A mitokondriumoknak a sejtek energiatermelése mellett fontos szerepe van a szteroid bioszintézisben, az ammónia detoxikálásban, a programozott sejthalálban, a ROS védelemben és az öregedésben (Shoubridge és Molnar, 2002). A mitokondrium működészavara kóros állapotokhoz vezethet, amelyek főként a nagy energia igényű szöveteket érintő neurológiai, endokriniológiai, kardiológai, szemészeti és belgyógyászati örökletes betegségeket eredményeznek Ezek mellett számos neurodegeneratív betegség, stroke, szívinfarktus és a rák kialakulásában játszik szerepet (Wei és Lee, 2002). A mitokondriumoknak fontos szerepe van mind a neurodegenerációban mind a neuroprotekcióban. A mitokondriális betegségek kialakulhatnak az mtDNS (pl. MELAS, MERRF) és a nukleáris DNS károsodása következtében is (pl. Friedreichataxia, SPG7). Egyes neurodegeneratív betegségekben a mitokondrium károsodása másodlagos (pl. Huntington-kór, ALS). A neuroprotektív stratégiák sokszor a kóros mitokondrium működés egyes ismert láncszemét célozzák meg és annak funkcióját próbálják javítani (Beal, 2005).

2.1. A mitokondriumok szerepe egyes betegségek kialakulásában

2.1.1. A mitokondriális betegségek általános jellemzői, pervalenciája A mitokondriális betegségek klinikailag heterogén csoportot alkotnak. A kórfolyamat esetenként csak egy szervet érint, de sokszor multiszisztémás betegség formájában jelentkezik. Elsősorban a nagy energiaigényű szövetek, mint a központi idegrendszer, vázizmok, szívizom, az endokrin szervek, máj, vese és a szem érintettek. A klinikai tünetek specifikusak, de nagyon változatosak (DiMauro és Davidzon, 2005). A klinikai fenotípus hátterében leggyakrabban a mitokondriális légzési transzportlánc zavara áll. A mitokondriális betegség kialakulásához a mitokondriumok működését meghatározó maternálisan öröklődő mitokondriális DNS (mtDNS), és nukleáris DNS (nDNS) mutációi vezethetnek. A mitokondriális DNS mutációja lehet nukleotid-szubsztitúció, ami érinthet tRNS-t kódoló gént vagy stuktúr gént, valamint delécióval/duplikációval járó génátrendeződés (Shoubridge és Molnar, 2002). Estenként az mtDNS depléciója okoz tüneteket.

10

A mitokondriális betegségek átlag prevalenciája mai ismereteink alapján 1: 5000-re becsülhető (Schaefer és mtsai, 2004). Egyes mitokondriális DNS mutációk kifejezetten gyakoriak, ezek közül kimagaslik az A3243G pontmutáció, amelynek előfordulási gyakorisága átlag felnőtt finn populációban elérheti a 16,3/100.000-t (Majamaa és mtsai, 1998). Eddig közel 200 betegség hátterében azonosítottak mtDNS mutációt, és folyamatosan nő azon kórképek száma, amelyek hátterében a nukleáris genom mitokondriumok működéséért felelős génjeinek hibái állnak (www.mitomap.hu).

2.1.2 .Az mtDNS –hez kapcsolt betegségek A mitokondriális genomban az irodalomból eddig közel 500 patogén mutáció ismert, amelyből 321 pontmutáció (2.1. táblázat) (www.mitomap.org). A betegség hátterében álló mutációk érinthetik mind a mitokondriális RNS géneket (tRNS és rRNS), mind a protein kódoló géneket. Mutációk Előfordulási száma gyakorisága

Mutáció lokalizációja RNS Protein kódoló gének

rRNS

12

4%

tRNS

137

NAD

86

42% 27%

ATP

16

5%

Citokróm

70

22%

2.1. táblázat: Patogén pontmutációk megoszlása a mitokondriális genomban (www.mitomap.org)

2.1.2.1. Az mtDNS tRNS-asszociált betegségek Bár a tRNS gének csupán az mtDNS 1/10-ét teszik ki, az ismert pontmutációk 42%-a mégis ebben a régióban lokalizálódik (2.1. táblázat) (www.mitomap.org). A tRNS gének így mutációs hot spotnak tekinthetőek. Gyakori tRNS-asszociált betegségek: myopathia, encephalomyopathia, cardiomyopathia, süketség, ophthalmoplegia externa, ataxia, myoclonus, demencia, depresszió, diabetes mellitus+süketség, terhelési intolerancia,

myoglobinuria,

Leigh

szindróma,

MELAS,

MERRF,

perifériás

neuropathia, Parkinson-kór, vashiányos anaemia és diabetes mellitus. Ezek a betegségek mind a sejt energia-metabolizmusát érintik (Molnar, 2008). A mitokondriális tRNS mutációk az aminoaciláció zavarát okozhatják (aminosav tRNShez való kötődése), ami a mitokondriumban zajló fehérjeszintézis hibás működését

11

eredményezheti.

A

mutáción

átesett

tRNS-ek

mRNS-hez

való

kötődésének

hatékonysága csökkenhet, illetve a molekula konformációja megváltozhat, stabilitása csökkenhet és fragilissá válhat. Ha a mutáció evolúciósan konzervált, – másodlagos, harmadlagos kötésben részt vevő – nukleotidot érint. A mutáció fenotípusban való megjelenésében fontos szerepe van a mutáns tRNS-ek heteroplazmia-arányának. Ha a tRNS-ek normális funkcionális szintje 15-50%-ra csökken patológiás fenotípust kapunk (Levinger és mtsai, 2004).

tRNS gének

Patogén mutációk száma

Előfordulási gyakorisága

Leucin Lizin Izoleucin Szerin Fenilalanin Treonin Glutaminsav Glicin Triptofán Valin Aszpargin Cisztein Glutamin Alanin Hisztidin Metionin Tirozin Arginin Prolin Aszparginsav

34 14 13 12 7 7 6 5 5 5 4 4 4 4 3 3 2 2 2 1

24,81% 10,22% 9,49% 8,76% 5,11% 5,11% 4,38% 3,65% 3,65% 3,65% 2,92% 2,92% 2,92% 2,92% 2,19% 2,19% 1,46% 1,46% 1,46% 0,73%

2.2. táblázat: A különböző tRNS-ekben előforduló mutációk gyakorisága (www.mitomap.org)

A tRNS mutációk leggyakrabban a tRNSLeu, tRNSLys, tRNSIle és a tRNSSer géneket érintik (2.2. táblázat). A tRNSLeu gén több mint 30 patogén mutációval ismert etiológiai hot spotnak tekinthető (Moraes és mtsai, 1993). A második leggyakrabban mutációt szenvedő tRNS a lizin eddig 14 leírt mutációval (www.mitomap.org). A leggyakoribb mtDNS szubsztitúció a tRNSLeu gén A3243G mutációja, amely leggyakrabban MELAS szindrómát (mitokondriális enchephalomyopathia laktát acidózis stroke szerű tünetekkel) okoz (Goto és mtsai, 1990). Ez a mutáció számos

12

klinikai tünetet eredményezhet, mint pl. alacsonynövés, sensoneurális hallásveszés, hypertrophiás cardiomyopathia, ataxia, ophthamoplegia externa, epilepsia és diabetes mellitus (Gál és mtsai, 2008; Finsterer, 2007). A mutáció prevalenciáját különböző beteg-beválasztási kritériumok alapján világszerte számos tanulmányban vizsgálták. A legtöbb vizsgálat diabeteses betegeken történt. Sensoneurális hallásvesztés, fiatalkori ischaemiás stroke szindróma, myopathia és ataxia hátterében a mutáció előfordulását eddig hat tanulmány vizsgálta, amelyekben a mutáció frekvenciája 0,07% és 6,5% között volt (Klemm és mtsai, 2001; Majamaa és mtsai, 1998; Salles és mtsai, 2007; Léveque és mtsai, 2007; Majammaa és mtsai, 1997; Sternberg és mtsai, 2001). A legnagyobb mutációs frekvenciát a finn népesség körében találták, ahol a vizsgált területre vonatkoztatott prevalencia 16,3:100.000 (Majamaa és mtsai, 1998). A tRNSLys génben eddig 14 patogén mutációt azonosítottak, leggyakrabban az A8344G mutációt írták le, amely a leginkább a MERRF (Myoclonus Epilepsia Ragged Red rostokkal) szindróma hátterében ismert, de ezen kívül számos fenotípust is okozhat (Molnár és mtsai, 2009; Wiedemann és mtsai, 2008; Mancuso és mtsai, 2008).

2.1.2.2. Az mtDNS rRNS-asszociált betegségek A mitokondriális genomban két gén kódolja a riboszómális RNS-ket (RNR1 - 12S rRNS és RNR2 - 16S rRNS ). A 12S rRNS-t kódoló génben az irodalomból 13 patogén mutáció ismert, amelyek legnagyobb számban aminoglukozidáz indukálta süketséget eredményeznek, de 1-2 szubsztitúció sensoneurális hallásvesztés és egyéb nagyothallás hátterében is ismert (Bindu és Reddy, 2008). A 16S rRNS-t kódoló mt – RNR2 génben talált 4 különböző nukleotid csere eltérő fenotípusokat eredményez, mint cardiomyopathia, diabetes mellitus, hyperthyreosis, Rett szindróma, MELAS, Alzheimer- és Parkinson kór (Cardaioli és mtsai, 1999; Hsieh és mtsai, 2001; Shoffner és mtsai, 1993).

13

2.1.2.3. Az mtDNS protein kódoló génekhez kapcsolt betegségei A mitokondriális légzési transzportlánc felépítésében kb. 80 fehérje vesz rész. Ezek közül a mitokondriális genomban csak 13 kódoló gén található melyek a légzési transzportlánc egyes alegységeit kódolják (Molnár, 2008). Az mtDNS protein kódoló génjeiben több, kb. 200 patogén mutáció ismert (www.mitomap.org). A legtöbb mutáció a NADH dehidrogenáz (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6) és a citokróm-c oxidáz (CO1, CO2, CO3) különböző alegységeit kódoló génekben található. Emellett kisebb számban találhatóak mutációk a citokróm oxidáz-b és az ATP-áz 6-os illeltve a 8-as alegységeit kódoló génekben is. A protein kódoló gének mutációi leggyakrabban a Leber féle optikus neuropathia (LHON), Leigh szindróma, prosztata rák, terhelési intolerancia, NARP, MELAS szindróma hátterében állhatnak (Wong, 2007). Néhány nukleotid szubsztitúciót motoneuron betegség, ataxia, Kearns-Sayre szindróma, vashiányos anaemia hátterében is leírtak (Wong, 2007; Bykhovskaya és mtsai, 2007).

2.1.3. Nukleáris genom mutációkhoz kapcsolt mitokondriális betegségek A mitokondrium működését döntően a nukleáris genom szabályozza, hiszen az mtDNSben mindössze 13 protein kódoló gén található. A mitokondriális funkciót befolyásoló gének az alábbiak szerint csoportosíthatók: 1.) légzési transzportlánc alegységeit kódoló, 2.) az intergenomiális szignalizációban szerepet játszó, 3.) a mitokondriális dinamikát befolyásoló (hasadás és fúzió), 4.) a lipid milieu-ért felelős, valamint 5.) egyéb a mitokondrium működését befolyásoló fehérjéket kódoló gének (Molnár, 2008) (2.3. táblázat).

14

Klinikai fenotípus Légzési transzportlánc rendellenességei

gén

Komplex I betegségek Gyermekkori encephalopathia

NDUFS1

Encephalopathia, Cardiomyopathia

NDUFS2, NDUFV2

Multiszisztémás komplex I deficiencia

NDUFS4

Letális neonatális komplex I deficiencia

NDUFS6 NDUFS3, NDUFS4 NDUFS7, NDUFS8 NDUFV1

Leigh szindróma Leukodsytrophia, myoclonusos epilepsia

Komplex II betegségek Leigh szindróma

SDHA

Öröklődő paraganglioma, pheochromocytoma

SDHB, SDHC

Komplex III betegségek GRACILE szindróma

BCS1L

Komplex IV betegségek

Intergenomiális szignál hibák

Mitokondriális dinamika defektusai Lipid milieu zavarok Egyéb nDNS által determinált mitokondriális betegségek

Encephalomyopathia, renalis tubulopathia

COX10

Infantilis cardioencephalomyopathia

COX15, SCO2

Hepatoketoacidotikus kóma

SCO1

Leigh szindróma

SURF1

Leigh szindróma - francia, kanadai típus

LRPPRC

Etilmakonsav encephalopathia

ETHE-1

CPEO, myopathia

ANT1

CPEO, myopathia, IOSCA

Twinkle

CPEO, SANDO, ALPERS szindróma, MIRAS

POLG1

CPEO

POLG2

MNGIE

TP

SMA-szerű myopathia

TK

Hepatoencephalopathia

dGK

Charcot Marie-Tooth II típus

MNF2

Herediter spasticus paraplegia

KIF5A

Opticus atrophia

OPA1, OPA2

Barth szindróma

Dilatatív cardiomyopathia és ataxia (DCMA)

Tafazzin Fumarate hydrolase, pyruvate carboxylase DNAJC19

Epilepsia, episodikus ataxia, encephalopathia

Pyruvate dehydrogenase

Encephalopathia, hepatomegalia

HMC-CoA-lyase

Epilepsia, encephalopathia

HMGCS2

Friedreich ataxia

FXN

Hepatopathia, hypotonia

DGUOK

Herediter spasticus paraplegia

SPG7

Retardált fejlődés

Hypocarnitinaemia, hypolysinaemia

DCAR

Menkes betegség, occipitális-szarv szindróma

ATP7A

Mohr-Tranebjaerg szindróma

DDP1/TIMM8A

Myopathia, retinopathia, hepatomegalia

HADHA

Wolfram szindróma

WFS1

Parkinson kór

PINK1

2.3.táblázat: nDNS mutációk okozta betegségek (Molnár, 2008)

15

2.1.4. Neurodegenerativ kórképek másodlagos mitokondriális rendellenességekkel A mitokondriumok központi szerepet játszanak a sok esetben multifaktoriális poligénes etiológiájú neurodegeneratív betegségek kialakulásában is, mint pl. Alzheimer-, Parkinson-, Huntington kór, valamint az amyotrophias lateral sclerosis. Ezen betegségekben jól ismertek a mitokondriumok morfológiai, biokémiai és molekuláris eltérései (Petrozzi és mtsai., 2007). Valamennyi fenti kórképben a mitokondriumok diszfunkciójának következtében csökken az ATP termelés, a Ca2+ tárolás zavart szenved, a reaktív oxidatív szabadgyökök (ROS) mennyisége megemelkedik (Beal, 2005). A megnövekedett ROS mennyiség hatására a fokozott lipid-peroxidáció miatt a membrán sérül, illetve az mtDNS-ben másodlagos hibák halmozódnak fel (szekunder de novo mutációk). A mitokondriális genom mutációinak következtében felgyorsul az öregedés, csökken az energiatermelés, amely tovább emeli a ROS termelést (Petrozzi és mtsai., 2007). A központi idegrendszer különösen érzékeny az oxidatív szabadgyökök károsító hatásával szemben, ugyanis a könnyen peroxidálható zsírsavak aránya rendkívül magas, fokozott O2 fogyasztás, valamint az antioxidáns enzimek viszonylag alacsony szintje jellemzi (Nunomura és mtsai., 2006). A túlzott oxidatív stressz és a magas Ca2+ szint a mitokondrium permeábilis pórusainak nyitását eredményezi, így segíti a citokróm-c kiáramlását, amely a kaszpáz-függő apoptózist indukálja (Stavrovskaya és Kristal, 2005). Az mtDNS-ben a szomatikus mutációk mellett számos olyan gyakori polimorfizmus ismert, amely a mitokondriális funkciót csak minimális mértékben változtatja meg. Ezen polimorfizmusok az egyes haplocsoportokat határozzák meg (Petrozzi és mtsai., 2007), amelyek hajlamosíthatnak neurodegeneratív betegségek kialakulására is (van der Walt és mtsai., 2004) (2.1. ábra).

16

2.1. ábra: Neurodegeneratív betegségek és a mitokondrium kapcsolata - M. Flint Beal nyomán (Beal, 2005)

Az Alzheimer-kór egy progresszív, neurodegenerítv betegség, melyben irreverzibilis neuronpusztulás következik be a kortexben és a hippocampusban, amelynek hatására a kognitív teljesítmény romlik, személyiség és viselkedési zavarok lépnek fel. Az agyban neurofibrilláris degeneráció és szenilis plakkok mutathatók ki. A neuronokban, kórosan foszforilált tau-protein filamentumokból álló aggregátumok találhatók. A szenilis plakkok főleg a hippokampuszban és az agykéregben megfigyelhető, perivaszkuláris elhelyezkedésű, béta-amiloid proteinből álló gömbök. Az Alzheimer kórnak csupán 23%-át teszi ki az öröklődő, familiáris forma. A mutációk leggyakrabban az amiloid

17

prekurzor proteint és a presenilint kódoló géneket érintik. Etiológiájában az oxidatív stressznek nagy jelentősége van. A Krebs ciklus enzimei közül, a piruvát-dehidrogenázkomplex (PDHC), az α-ketoglutarát-dehidrogenáz (KGDHC) és az izocitrátdehidrogenáz aktivitása csökkent. Emellett a mitokondriális elektron transzportlánc tagjai közül a komplex IV és az F1F0-ATPáz aktivitásának csökkenését is igazolták, amelynek következtében az ATP termelés csökken, illetve a ROS szint emelkedik. Mivel a citokróm oxidáz és a KGDHC a β-amiloid inhibitorai, ezen enzimek aktivitásának csökkenésével az Aβ protein expressziója nő. Az Aβ serkenti az mPTP (mitokondriális permeábilitási tranzíciós pórus) Ca-indukálta nyitását, a citokóm-c kiáramlást és a kaszpáz aktivációt (Morais Cardoso és mtsai, 2002). A mitokondriális aktivitás csökkenés végsősoron a ROS felszaporodásához, így neurodegenerációhoz vezethet (Cecchi és mtsai, 2006). A Parkinson-kórban a dopaminerg neuronok pusztulása jellemző, amely főként a substantia nigrát érinti. Patogenezisében többek között szerepe van az oxidatív stressznek, a mitokondriális diszfunkciónak és az excitotoxicitásnak. Idiopathiás Parkinson kórban a substantia nigrában a komplex I. aktivitása 25-30%-kal csökken, amely következtében a keletkezett ATP mennyisége csökken. Az öröklődő Parkinson kór

hátterében

számos

mtDNS-hez

kapcsolt

eltérés

(nagy

átrendeződések,

pontmutációk, és mikrodeléciók) és nDNS által kódolt gének mutációi (α-synuklein, Parkin, DJ-1, PINK1, CRK2, HTRA2) állhatnak.

Ezen nDNS által kódolt gének

közvetlenül vagy közvetve a mitokondriumban hatnak, így mutációik mitokondriális diszfunkcióhoz vezetnek (Petrozzi és mtsai., 2007; Schapira, 2009). Az ALS-ben a neuronok elsősorban a motoros kortexben és a gerincvelő mellsőszarvában pusztulnak el. Az ALS 90%-ban sporadikus, míg a familiáris, örökletes formák az esetek 10%-át teszik ki, amelyek kb. 20%-ban a SOD1 (Cu/Zn szuperoxid diszmutáz)

mutáció

áll.

Az

ALS-ben

a

Ca2+

ionok

akkumlálódnak

a

mitokondriumokban, amely hatására a reaktív oxigén gyökök mennyisége a motoneuronokban emelkedik (Mattiazzi és mtsai, 2002). Huntington-kórban a mutáns huntingtin fehérje a neuronális mitokondriumok külső membránjához kötődik, ami által a mitokondrium Ca2+ felvétel csökkent. Emellett a mutáns huntingtin kötődik az apoptózisban szerepet játszó p53 fehérjéhez is, amelynek következtében a p53 aktiválódik és a mitokondriális membránpotenciál csökken

18

(Brustovetsky és mtsa, 2003). A Huntington-kórban szenvedő betegekben a komplex II/III aktivitásának csökkenése jellemző (Gárdián és Vécsei, 2004; Browne és Beal, 2006). Összességében elmondható, hogy a neurodegeneratív betegségek kialakulásában a különböző egymásra épülő hatások („downstreem” effektusok) következtében a mitokondriumokban megváltozik a Ca2+ homeosztázis és fokozódik a káros oxidatív szabadgyökök felszaporodása. Ezek a tényezők együttesen járulnak hozzá a mitokondrium függő apoptózis aktivációjához.

2.1.5. A mitokondriumok szerepe a programozott sejthalálban A programozott sejthalál a szöveti homeosztázis fenntartásának nélkülözhetetlen folyamata. Az apoptózis elengedhetetlen az egyedfejlődés során a feleslegessé vált szövetek, szervek eltávolításában (pl.: ebihalak farkának, illetve az emlősök előveséjének visszafejlődésében) és az új struktúrák kialakításában (pl.: ujjak keletkezésénél a közöttük levő szövetek felszívódásában) (Raff, 1998; Putcha és Johnson, 2004). Az apoptózis mechanizmusainak hibás működése, szabályozásának zavara kórós következményekkel járhat (pl.: neurodegeneratív kórképek, daganatok, és immunológiai eredetű megbetegedések) (Hengartner, 2000). Az apoptózis indukciója, vagy gátlása az előbbiek miatt terápiás hatású lehet. Az apoptózisra erősen konzervált mechanizmusok jellemzőek, amely legfontosabb elemei faji, és szöveti különbségek ellenére megegyeznek. Az apoptózis mechanizmusában két fő útvonalat különíthetünk el, a halálreceptor mediált és a mitokondriális folyamatokat. A halálreceptor útvonal jellemzője, hogy a halálligand specifikus receptorához kapcsolódva indítja el a sejt apoptotikus programját. Így egy másik sejt által termelt ligand is adhat parancsot arra, hogy az adott sejt pusztítsa el önmagát (Ashkenazi, 2008). A halálreceptorok mellett egy fehérje komplexet találunk, a DISC-et (Death Inducing Signal Complex). Az itt aktiválódott kaszpáz-8 aktiválhatja a kaszpáz-3-at. A kaszpáz-8 a Bid hasításán keresztül a mitokondriális membrán depolarizációjában és a pórusképzésben is szerepet játszhat (Ashkenazi, 2008; Budihardjo és mtsai, 1999).

19

A mitokondriális útvonal jellemzője, hogy az apoptózis a mitokondrium membrán depolarizációja és az ezt követő citokróm-c kiáramlás játsza beindításában a kulcsszerepet (Finkel, 2001). Az apoptózis folyamata során a mitokondrium szerkezete megváltozik, membránja az apoptózis korai fázisában depolarizálódik, és permeábilissá válik (Kroemer, 2003; Brenner és Kroemer, 2000). A mitokondrium olyan fehérjéket tartalmaz, amelyek a citoplazmába jutva elindítói lehetnek az apoptózisnak pl.: prokaszpázok,

apoptózis

indukáló

faktor

(AIF),

citokróm-c,

adenilát

kináz,

DIABLO/SMAC (kaszpáz koaktivátorok), omi, és hősokk fehérjék (Hsp10, Hsp60). (Bernardi és mtsai, 1999; Twiddy és mtsai, 2004). Ha a mitokondriumot apoptotikus inger éri (membránpotenciál csökkenés, ROS stb.) citokróm-c jut ki a mitokondriumból. A citokróm-c kiáramlásakor ATP jelenlétében az APAF-1-hez és a prokaszpáz-9-hez kötődve létrehozza az apoptoszómát. Ez lehetővé teszi az aktív kaszpáz-9 létrejöttét, ami további effektor kaszpázok aktiválódását eredményezi, így a fő effektor kaszpázét, a kaszpáz-3-ét is (Cain, 2003). A citokróm-c, a légzési transzportlánc tagja, a mitokondrium belső membránjában helyezkedik el. Az apoptózis során bekövetkező citokróm-c

kiáramlás

a

mitokondrium

létfontosságú

működését

befolyásolja,

energiatermelő funkcióját gátolhatja, amely a mitokondrium károsodásához vezethet. A mitokondrium károsodása nekezen mutatható ki, de méretében, denzitásában, és a sejten belüli lokalizációjában az apoptózis folyamata során különbségek figyelhetőek meg (Finkel, 2001). Nyugalmi állapotban a mitokondriumok a sejtben elszórtan helyezkednek el, a sejtben indukált apoptózis során a mitokondriumok a sejtmag köré rendeződnek. A mozgás kinezin-közvetített transzporttal megy végbe. Az apoptózis korai jelenségei közé tartozik a mitokondriumok méretének csökkenése, és a mátrixdenzitás növekedése (Finkel és mtsai, 2001). A mitokondrium apoptotikus működésének szabályozásában szerepet játszik a Bcl-2 fehérje család. A családba tartozó fehérjék két nagy csoportba sorolhatók, egyes tagok anti-apoptotikus, míg mások pro-apoptotikus hatással bírnak. A Bcl-2 fehérjét B-sejtes follikuláris lymphomákban fedezték fel (Bcl.: B cell lymphoma). A Bcl-2 fehérje család valamennyi tagjára jellemző, hogy tartalmazza a Bcl-2 homológ fehérjedoménjének (BH1-BH4) valamelyikét (Kuwana és Newmeyer, 2003; Hengartner, 2000). A Bcl-2 család anti-apoptotikus tagjai, mint a Bcl-2, Bcl-XL, Bcl -w, MCL-1, A1, CED-9, E1B19k, BHRF1, BNIP3L legalább három BH doménnel rendelkeznek. A pro-

20

apoptotikus tagok közül viszont a Bad, a Bik, a Bid, csak a BH3 domént tartalmazza. Mutációs vizsgálatok kiemelik a BH3 domén sejthalál indukciójában betöltött fontos szerepét (Gross és mtsai, 1999). A Bcl-2 család tagjai közül több (pl.: Bcl-2, Bcl-XL) a különböző sejtorganellumok (mitokondrium, endoplazmatikus retikulum, sejtmag) membránjában helyezkedik el, illetve vannak olyanok, amelyek a citoplazmában találhatók és csak valamilyen jel hatására vándorolnak az organellumok (általában a mitokondrium) külső membránjába (pl.: Bax, Bid) (Sorenson, 2004). A pro- és antiapoptotikus Bcl-2-fehérjék aránya szabályozza a mitokondrium membrán permeábilitását, a citokróm-c kiáramlását. A Bcl-2 család tagjai egymással homo- és heterodimereket alkotnak. A sejtek sorsa (túlélés vagy sejthalál) a képződött homo- és heterodimerek arányától függ (Green és Reed, 1998). A Bax-Bax homodimer túlsúlya apoptózishoz vezet, amelynek képződése és membránba beépülése gátolható a Bax-Bcl2 fehérje heterodimerének kialakulásával. A Bax fehérje mitokondriumba szállítódása dimerizációjának vagy oligomerizációjának köszönhető: keresztkötő ágensek és Bid hatására a Bax dimereket alkot, miközben a konformációja megváltozik (Hengartner, 2000). A Bax és a tBid lipidekkel is kapcsolatba léphet olyan lipid-, vagy lipid-fehérje pórusokat hozva létre, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy az intermembrán térből a fehérjéket a citoplazmába engedjék (Sorenson, 2004).

2.1.6. A mitokondrium szerepe az agyi ischaemiás folyamatokban Az agyban a leggyakrabban kialakult károsodás ischaemiás / hypoxiás jellegű, ami elsősorban az idegsejtek pusztulását okozza. Minden terápiás próbálkozás végső célja az idegsejt károsodás mértékének, az agyi lézió volumenének csökkentése, a kiesési tünetek súlyosságának mérséklése, a túlélés javítása. A neuronális apoptózis nemcsak az egyedfejlődés során jelentős, hanem különböző sejtpusztulással jellemzett állapotokban is fontos tényező. A neuronokban a sejtpusztulás apoptózis, nekrózis vagy a kettő kombinációja révén alakul ki (Niizuma és mtsai, 2009; Mattson és mtsai, 2001). A leggyakoribb ischaemiás mechanizmus az egy arteria elzáródása következtében kialakuló szövetpusztulás. A szövetpusztulás az alkotó sejtelemeket egyaránt érinti, így az agyi mikroér endotheliumban, a neuronokban, különböző glia elemekben mind a nekrózis, mind az apoptózis kimutatható. Az agyi infarktus centrumában a szövetelhalás nekrotikus jellegű, amely már korán kialakul, míg a marginalis zónában, a penumbra

21

területén az elsősorban apoptózis jellegű neuronpusztulás később következik be. Az agyi infarktus tehát, a különböző kóros sejtbiológiai események kaszkád-szerű, egymásból következő eseményeinek időbeli és térbeli alakulása eredményeként jön létre (Broughton és mtsai, 2009). A sejtpusztulás mérséklésére irányuló kísérletek kivétel nélkül a penumbra megmentését célozzák. A penumbra nem egységes, az ischaemiát követően időben és térben több rétegét különíthetjük el (Sharp és mtsai, 2000). Az egyes rétegekben lezajló biokémiai változások sejtpusztuláshoz, vagy regenerációhoz vezetnek. A penumbra rétegeiben HSP-70, HIF, és fokozott FOS/IEGs expresszió jellemző. A penumbra és az ép agyszövet határán neurális plaszticitást szabályozó fehérjék (GAP43, MAP2) mutathatók ki. A penumbrában 4 órával az ischaemiát követően az apoptotikus sejtek száma a nekrotikus sejtekhez képest 9:1-hez, míg az ischaemia centrumában ez az arány 1:1-hez (Nagy és mtsai, 2002). Az ischaemiát követő apoptózisban főként a belső, mitokondriális útvonal jellemző, de a külső, halálreceptor útvonal szerepe is ismert (Akhtar és mtsai, 2004; Broughton és mtsai., 2009). Az ischemiás területen a Bax expressziója nő és a citoplazmából a mitokondriumokba transzlokálódik, míg a Bcl-2 és a Bcl-XL expressziója csökken, így e fehérjék nem tudják gátolni a pro-apoptotikus Bax transzlokációját (Matsushita és mtsai, 1998; Akhtar és mtsai, 2004; Love és mtsai, 2003). A külső, halálreceptor útvonalnál főként a Fas ligand kötődése a receptorához (Fas-R), amely a kaszpáz-8 és a Bid hasításán keresztül aktiválja a mitokondrium depolarizációt (Love és mtsai, 2003). A neurális apoptózis effektor folyamatában mind a kaszpáz függő, mind a kaszpáz független útvonal – AIF - szerepe ismert (Ferrer és mtsai, 2003; Dubois-Dauphin és mtsai, 2001). befolyásolása

A penumbra régióban zajló különböző biokémiai folyamatok lehetőséget

jelent

az

anti-apoptotikus

kidolgozására.

22

neuroprotektív

terápia

2.2. ábra: A külső apopototikus szignalizáció az agyi ischaemiát követően (Broughton és mtsai, 2009 után)

2.3. ábra: A belső apopototikus szignalizáció az agyi ischaemiát követően (Broughton és mtsai, 2009 után)

2.1.6.1. Az agyi ischaemia kezelésének lehetőségei Az ischaemiás stroke kezelésének két lehetséges stratégiája a véráramlás javítása és az ischaemiás kaszkád közvetlen neuroprotektív befolyásolása. Az agyi ischaemia

23

kezelésére a rekombináns szöveti plazminogén-aktivátor (rtPA) három órán belüli alkalmazása bizonyult a leghatásosabbnak (Köhrmann és mtsai, 2007). A neuroproteiktív stratégiák támadáspontjuk alapján lehetnek: feszültségfüggő Ca2+ csatorna antagonisták, NMDA gátlók, excitatorikus aminosav -, szabadgyök antagonisták, nitrogén-oxid szintetáz gátlók, kaszpázgátlók, növekedési faktorok – bFGF, szerotonin 1A receptor antagonisták, GABA-agonisták, gangliozidok. Ezek mellett egyéb neuroprotekciós probálkozások is ismertek, mint a hipotermia alkalmazása, ösztrogének, statinok, K+-csatorna blokkolók adása (Yuan, 2009). Korábban munkacsoportunk is vizsgált különféle neuroprotekív vegyületeket in vitro hypoxiás modellben (PC12 és primer agyi kapilláris endothel sejteken) valamint in vivo patkány MCAO és gerbil tranziens okklúziós modellben. Az általunk tesztelt molekulák: (-)-BPAP (Dénes és mtsai, 2006), (-)-deprenyl (Simon és mtsai, 2001; Simon és mtsai, 2005; Dénes és mtsai, 2006), Deprenyl-N-oxid (Szilágyi és mtsai, 2009), és talampanel (Dénes és mtsai, 2006) a vizsgált rendszerben hatásosnak bizonyultak a hypoxiás/ischaemiás történések következményeinek enyhítésére. Az agyi károsodások kezelésére különböző génterápiás próbálkozások is történtek. Az eddigi eljárások főként génhelyettesítést (gén replacement) alkalmaztak, amelyek során a génbevitel virális (pl.: retro-, adenovírus konstruktok) és plazmid vektorokkal történt (Chang és mtsai, 2007). Az apoptotikus – nekrotikus kaszkád sok ponton támadható. Elméletileg az ebben szerepet játszó gének módósításával hatékony eredmény lenne elérhető az ischaemiás stroke szindrómák célzott kezelésében. Számos tanulmány említ génterápiás próbálkozásokat cerebrovascularis betegségekben is, bár ezek klinikai alkalmazása még várat magára. Az agyi ischaemiás állapotok génterápiás kezelésének a szűk terápiás ablak szab határt. Az agyi ischaemiák terápiájában a neuroprotekcióban szerepet játszó gének aktivációjának, és a korai folyamatokban aktiválódó gének gátlásának lehet jelentősége (Toyoda és mtsai, 2003). Az eddigi kísérleteket a kívánt kezelési cél és az alkalmazott terápiás géncsoportok szerint osztályozhatjuk (2.6. táblázat). A kezelési cél szerint a génterápia eddigi irányai: a) a subarachnoidális vérzés után a vasospasmus megelőzése, b) a kollaterális erek növekedésének serkentése, és c) az atheroscleroticus plakk stabilizációja, illetve a thrombosis és a restenosis gátlása (2.6. táblázat) (Yenari és mtsai, 2005).

24

Kezlési célpont

SAH

kollaterális keringés

atheroscler osis

agyi ischaemia

Beviteli hely

Vektor

Gén

Adenovírus

eNOS

Adenovírus

ecSOD

Oligodeoxinukleotid

Antisense preproendothelin-1

Adenovírus

Prepro-CGRP

Oligodeoxinukleotid

NF-kB

Adenovírus

bFGF

Kamra

HVJ-liposzóma komplex

Hepatocyta növekedési faktor

Cisterna magna

Plazmid

Anti-MCP1

Láb izomba

Adenovírus

Szöveti faktor útvonal gátló

Carotis

Adenovírus

Hirudin

Carotis

Oligodeoxinukleotid

Decoy of E2F

Carotis

Cisterna magna Cisterna magna Cisterna magna Cisterna magna Cisterna magna

Irodalom Hirooka és mtsai, 2003 Yamaguchi és mtsai, 2004 Ohkuma és mtsai, 1999 Satoh és mtsai, 2002 Ono és mtsai, 1999 Ohara és mtsai, 2001 Shimamura és mtsai, 2004 Schepers és mtsai, 2006 Nishida és mtsai, 1999 Rade és mtsai, 1996 Kawauchi és mtsai, 2000 Yenari és mtsai, 2001

Herpex simplex vírus Herpex simplex vírus Herpex simplex vírus

Calbindin D28K

Striatum

Glukóz transzporter

Striatum

Lawrence és mtsai, 1996

HSP72

Striatum

Adenovírus

IL1-ra

Oldalkamra

Adenovírus

IL-10

Oldalkamra

Adenovírus

TGFβ1

Oldalkamra

HVJ-liposzóma komplex Adeno associated virus

Hepatocyta növekedési faktor

Cisterna magna

Hoehn és mtsai, 2001 Yang és mtsai, 1997 Kumai és mtsai, 2003 Boche és mtsai, 2003 Shimamura és mtsai, 2004

bcl-2

Hippocampus

Adenovírus

Cyclooxigenáz-1

Oldalkamra

Adenovírus

SAG

Ischaemia helyére

Shimazaki és mtsai, 2000 Zoldhelyi és mtsai, 1996 Yang és mtsai, 2001

2.6.táblázat: Génterápiás próbálkozások az agyi ischaemia kivédésére

25

2.2. Az agyi plaszticitás

Az idegrendszert ért sérülés után a neuronokban a kiesett funkciók helyreállítása felé irányuló folyamatok aktiválódnak. A regenerációs képesség nagymértékben függ a sérülés helyétől – az idegrendszer különböző részei és neuron populációi eltérő módon reagálnak az őket ért sérülésekre – és az életkortól. A regeneráció során a felnőtt idegrendszerben, az embrionális fejlődésben jól ismert fehérjéket kódoló gének újra aktiválódnak, így pl. a neuro-, axono- és szinaptogenesisben szerepet játszó proteinek (Gutiérrez és mtsai, 2009). Az ischaemiás károsodás után különböző differenciáló fehérjék (pl. NeuroD) és növekedési faktorok (bFGF, VGEF, BDNF), strukturális fehérjék (pl. nestin, MAP-2), axonogenesist indukáló (GAP-43, synapsyin-1, synaptophisin), valamint a sejtciklus szabályozásában résztvevő proteinek (p53, p53 response protein, cyclinD, c-fos) aktivációjának szerepe ismert (Chopp és mtsai, 1999; Cramer és mtsai, 2000; Chae és mtsai, 2004). Így a neuroprotektív terápiák célja ezen proteinek expressziójának fokozása lehet.

26

3. CÉLKITŰZÉSEK

Kutatásunk céljaként az alábbiakat tűztük ki:

1. Az egyes mtDNS eltérések patogenetikai szerepének valamint a klinikai fenotípusra gyakorolt hatásának elemzése

2. Az együttesen előforduló mtDNS eltérések szinergizmusának elemzése

3. A leggyakoribb mtDNS mutáció, az A3243G nukleotid szubsztitúció genetikai epidemiológiai elemzése

4. Az antiapoptotikus Bcl-2 és Bcl-XL génekkel történő transzdukció kivédi-e a hypoxia által okozott sejtpusztulást a PC12 sejteken

5. Az anti-apoptotikus gének fokozott expressziója milyen hatással van az agyi plaszticiásban

szerepet

játszó

GAP-43,

expressziójára.

27

nestin,

synapsin-1

és

c-fos

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Mitokondriális DNS mutációk vizsgálata során alkalmazott módszerek

4.1.1. Vizsgált betegek Az mtDNS tRNSLys mutációkat elemző vizsgálatainkban 293 (180 nő és 113 férfi) beteg és 150 kontroll személy DNS mintáját elemeztük. A betegek átlagéletkora 39,4 év volt (nők: 40,2 év, ffi: 32,5 év). A tRNSLeu (UUR) A3243G szubsztitúcióját 631 (361 nő és 270 férfi) betegen vizsgáltuk. A betegek átlagéletkora 36,3 év volt (nők: 38,1 év, ffi: 34,4 év).

A mintagyűjtést 1999. január és 2007. december között végeztük. A

vizsgálatba Baranya-, Borsod-Abaúj-Zemplén-, Hajdú-Bihar-, Szabolcs-Szatmár-Bereg megye valamint Budapest ismeretlen etiológiájú ischaemiás stroke, ataxia, maternálisan öröklődő sensoneurialis hallásvesztés, myopathia, vagy hypotonia miatt genetikai vizsgálatra küldött betegeket vontuk be, akiknél a multiszisztémás tünetegyüttes, a családi anamnézis és egyes laboratóriumi értékek felvetették a mitokondriális betegség lehetőségét. A betegek és az egészséges kontroll személyek a vizsgálat előtt részletes felvilágosítás kaptak, amely alapján a genetikai vizsgálatba, a minták további kutatási célú megőrzésébe és az eredmények szakirodalmi megjelentetésébe beleegyeztek. A minták tárolása Európai Uniós követelményeknek megfelelően az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet Molekuláris Neurológiai Osztály, majd későbbiekben a Semmelweis Egyetem Neurológiai Klinika, Molekuláris Neurológiai Központ NEPSY bankjában történt. A vizsgálatokhoz az OPNI intézeti etikai bizottsága bocsátott ki engedélyt.

4.1.2. DNS izolálás Kísérleteink során a DNS-t vérből, illetve 50 beteg esetében posztmitotikus szövetekből (vázizomszövet, vizelet laphámsejt) izoláltuk Qiagen Blood (Qiagen) valamint Qiagen Tissue Kit segítségével a gyártó által megadott instrukciók szerint.

A DNS

koncentrációt UV spektrofotométer segítségével 260 nm abszorbanciánál mértük. A tisztasági fokot a 260 nm-es és a 280 nm-es abszorbancia értékek hányadosával határoztuk meg.

28

4.1.3. PCR-RFLP vizsgálat Az mtDNS leggyakoribb mutációit PCR-RFLP módszerrel határoztuk meg, azaz a mitokondriális genom patogén mutációs hot spot régióit (MELAS: nt. 3160-3296 (MELAS), nt. 8155-8367 (MERRF), nt. 8345-10011 (NARP), nt. 8105-8536 (tRNSLys)) PCR segítségével amplifikáltuk. A reakcióhoz a primereket (4.1. táblázat) 300 nmol/L végkoncentrációban használtuk, 100 nmol/L MgCl2-ot, és 1 unit Taq polimerázt (Immolase, Bioline GmbH, Németország) hozzáadva, a reakcióelegyet RNáz-mentes desztillált vízzel (RT-PCR grade water, AMBION) 50 µl végtérfogatra egészítettük ki. A PCR reakciók során a következő programot használtuk: kezdeti denaturáció 94 °C-on 5 perc, 35 ciklus (denaturáció 94 °C 30 másodperc, anelláció 50-60 °C 30 másodperc, szintézis 72 °C 30 másodperc), majd a végső szintézis 72 °C-on 7 perc. A PCR-terméket TAE pufferrel hígított 2%-os agaróz gélen futtattuk meg. A kapott terméket etídiumbromiddal vizualizáltuk és az így kapott band-ek nagyságát Quantity One Softwer (BIO-RAD) segítségével határoztuk meg.

Primer

Szekvencia

Régió

MERRF-Forward

5’GGTATACTACGGTCAATGCTCT3’

MERRF-Reverz

5’TTTCACTGTAAAGAGGTGTGGG3’

MELAS-Forward

5’AGCGCCTTCCCCCGTAAATG3’

MELAS-Reverz

5’AGAGGAATTGAACCTCTGAC3’

NARP-Forward

5’CCAACACCTCTTTACAGTGA3’

NARP-Reverz

5’ACTATTTATACTAAAAGAGT3’

tRNSLys-Forward

5’GCAATTCCCGGACGTCTA3’

tRNSLys-Reverz

5’GCGAACAGATTTTCGTTCAT3’

Termék-

Anellációs

nagyság hőmérséklet

8155-8367. nt

213 bp

50°C

3160-3296. nt

137 bp

55°C

8345-10011 nt.

1666 bp

60°C

8105-8536. nt

432 bp

60°C

4.1. táblázat: A PCR során használt primerek adatai

Az általunk vizsgált pontmutáció kimutatására a kapott PCR terméket 3 órán keresztül 37 °C-on restrikciós endonukleázokkal (MELAS: HaeIII; MERRF: BanII; NARP: HpaII, AvaI) emésztettük (1unit/reakció). A restrikciós mintázatot 4%-os agaróz vagy 13%-os poliakrilamid gélen analizáltuk. A géleket etidium-bromiddal festettük, majd a kapott band-ek nagyságát a hasítatlan mintához viszonyítva Quantity One Software (BIO-RAD) segítségével határoztuk meg.

29

4.1.4. mtDNS tRNSLys gén bidirekcionális szekvenálása A szekvenálandó PCR termék tisztítását Sure Clean Plus kit (BIOLINE) segítségével végeztük el. A tisztított PCR-termékhez 1 unit 3.1. Big Dye Terminator enzimet adtunk (Big Dye Terminator v 3.1 cycle sequencing RR-24, Applied Biosystems), valamint ugyanennyi térfogat Big Dye puffert, amely a fluoreszcensen jelölt didoexinukleotidokat is tartalmazta. A szekvenáló reakciót az mtDNS tRNSLys-re specifikus 5' GCAATTCCCGGACGTCTA 3' forward és 5' GCGAACAGATTTTCGTTCAT 3' reverz primerekkel végeztük el. A szekvenáló reakció programja a következő: kezdeti denaturáció 95 °C-on 2 perc, 25 ciklus (denaturáció 95 °C 300 másodperc, anelláció 51 °C 15 másodperc és szintézis 60 °C 4 perc) után a végső szintézis 72 °C-on 7 perc. 40 µl térfogatban 16 µl desztillált víz, 2 µl Big Dye enzim, 2 µl Big Dye Terminator puffer, 4 µl oligo (10 pmol/µl koncentrációban) és 16 µl PCR-templát. A szekvenáló PCR elvégzése után a termékek tisztítását NucleoSeq kit (BIOLINE) segítségével végeztük el. A kérdéses régió szekvenálását ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer szekvenátorral végeztük el. A kapott szekvenciákat manuálisan elemeztük, majd az NCBI Blast program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) segítségével a humán mitokondriális referencia genom nukleotid és aminosav sorrendjével hasonlítottuk össze.

4.2. In vitro kísérletekben használt metodikák 4.2.1. PC12 sejttenyészet A patkány pheochromocytoma (PC12) sejtek az American Type Culture Collection-től származtak (ATCC, Manassas, VA, USA). A sejteket 37oC-on 5% CO2 koncentráció mellett Dulbecco’s modified Eagle’s mediumban (DMEM) (GIBCO, Invitrogene GmbH, Austria) tenyésztettük, amely 2 mmól/L L-glutamint, 10% lószérumot (GIBCO), 5% foetális marha szérumot (GIBCO), 0.5% Penicillin-Streptomycin-t (GIBCO) és 0.3% Fungisone-t (GIBCO) tartalmazott. A sejtek differenciáltatását 24 lyukú plate-n végeztük, amelynek felületét előzőleg kollagénnel vontuk be. A sejteket 105 sejt/lyuk koncentrációban ültettük ki, és DMEMet, 2% ló szérumot, 1% Penicillin-Streptomycin-t, 0.3% Fungisone-t, és 100 ng/ml

30

neurális növekedési faktort (NGF) (SIGMA, St. Louis, MO, USA) tartalmazó médiumban 5 napig differenciáltattuk.

4.2.2. Vírus konstruktok és transzdukció A

kísérleteinkben

használt

adenovírus

vektor

csirke

β-aktin

promotert,

Cytomegalovírus korai enhancert, a célgének cDNS szekvenciáit (reportergénként használt β-galactosidase-LacZ, vagy Bcl-2, vagy Bcl-XL), valamint egy poliadenilált nyúl β-globulin szekvenciát (Nakamura és mtsai, 1994; Kanegae és mtsai, 1995) tartalmazott. Valamennyi konstruktban a replilkációért felelős E1A, E1B és E3 gént cserélték ki a terápiás génekre, ezért vektorunk replikálódni képtelen (4.1. ábra). A LacZ és a Bcl-XL-t tartalmazó vektort Prof. Hirofumi Hamada, (Sapporo Egyetem, Japán), a Bcl-2-t tartalmazó vektort Prof. Duda Ernő (Szegedi Egyetem) bocsátotta rendelkezésünkre. A transzdukció során a sejteket 10-200 PFU/sejt koncentrációban fertőztük a különböző gének cDNS-eit tartalmazó adenovirus vektorokkal. A kezelést DMEM oldatban végeztük, majd egy órás inkubáció után a sejteken a tápfolyadékot a megfelelő térfogatra differenciáltató médiummal egészítettük ki.

4.1. ábra: A vizsgálataink során használt adenovírus vektor szerkezete. (CA: CMV promóter, PA: poliadenilált szekvencia)

4.2.3. In vitro hypoxia és re-oxigenizáció A hypoxiát argon gáz kezeléssel idéztük elő 37oC-on hypoxiás kamrában (1-2 óra). A sejtek fölé rétegzett argon gáz az oxigént elvonja (Loffler, 1987) és a kezelés hatására a tápoldatban mért 165.45±1.15 Hgmm-es parciális oxigén nyomás 53.45±2.68 Hgmm-re csökkent, amellyel kb. 30%-os oxigén szintet értünk el. A kezelést követően az argon gázt

eltávolítottuk

a

tenyészetről

és

a

sejteket

további

2-48

órára

re-

oxigenizálciócéljából normál körülmények közé (5%-os CO2-t tartalmazó, 37oC-os termosztátba) helyeztük vissza. A kontroll sejtek folyamatosan normál (p=165.45±1.15 Hgmm) oxigén szint mellett voltak a termosztátban (normoxiás sejtek).

31

4.2.4. X-gal festés A sejteket 80%-os metanolban -20oC-on fixáltuk. A festésnél az X-gal reagenst (X-gal reagens: 1g X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside) (MBI Fermentas, Germany) 10 ml dimethyl formamidban oldva) 1:100 hígításban X-gal oldattal [5 mmól/L K3Fe(CN)6, 5 mmól/L K4Fe(CN)6, 2 mmól/L MgCl2] hígítottuk. A sejteket 37oC-on 4 órán át inkubáltuk. A festés után a sejteket PBS-ben mostuk, majd felszálló alkohol sorban dehidráltuk és ezt követően a sejteket tartalmazó üveglemezeket glicerin-zselatinnal fedtük.

4.2.5. Annexin V- propidium jodid kettős festés Az apoptotikus és nekrotikus sejtek számát annexin V- propidium jodid kettős festéssel határoztuk meg. A kezeléseket követően a sejteket annexin V-FITC-el (AV) (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK) és propidium jodiddal (PI) (SIGMA) jelöltük meg.

A sejtekhez 1:100 koncentrációban annexinV-FITC-et adtunk és

37oC-on

sötétben inkubáltuk. Az annexinV jelölés 7. percében 5µg/mL koncentrációban rátettük PI oldatot, majd ezt követően további 3 percig inkubáltuk. A kiértékelést konfokális laser scanning mikroszkóppal (MRC 1024 Confocal System installed on NIKON Epithet inverted microscope, Bio-Rad Corp. Hertfordshire, England) végeztük. Az annexinV-FITC és PI jeleket 488 nm-en Krypton-Argon laserrel excitáltuk, majd 510 nm-en valamint 625 nm-en emisszáltattuk. A fluoreszcens szignál intenzitást LaserSharp 2000 software (Bio-Rad) használatával értékeltük. A morfometriás analízis során kezelésenként 10 random kiválasztott nem átfedő mikroszkópos képet értékeltünk. Az egyes felvételeken megszámoltuk az annexinV -, PI - pozitív, és a kettős jelölt valamint a nem festődött sejteket és ezeknek a százalékos arányát határoztuk meg (4.2. ábra).

32

4.2. ábra: AnneinV-propidium jodid kettősfestés

4.2.6. TMRE festés - Mitokondriális membránpotenciál vizsgálata A mitokondrium membránműködés vizsgálatakor feszültség függő tetramethylrhodamine-ethylester (TMRE) (SIGMA) fluoreszcens festéket alkalmaztunk. A sejtekhez a kezelés végén 10 µmól/L végkoncentrációban TMRE festéket adtunk, majd 20 percig 37oCon sötétben inkubáltuk. A mérést konfokális laser scanning mikroszkóppal végeztük. A mérés során az exitáció 488 nm-en Krypton-Argon laserrel történt, majd a sejteket 625 nm-en emisszáltattuk. A fluoreszcens szignál intenzitást LaserSharp 2000 software (Bio-Rad) használatával értékeltük. A morfometriás analízis során kezelésenként 10 random kiválasztott, nem átfedő mikroszkópos képet értékeltünk.

4.2.7. RNS izolálás és reverz transzkripció Az RNS izolálást ABIPrims 6100 nukleinsav izoláló automata segítségével végeztük a cég által ajánlott protokoll szerint (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA). A reverz transzkripciót Hight Sensitive cDNA reverse transcriptase kittel (Applied Biosystems) végeztük a gyártó által megadott instrukciók alapján. A recerz transzkripciót az alábbi PCR beállítások mellett (25°C 10 perc, 37°C 120 perc, 85°C 5 másodperc) végeztük.

33

4.2.8. A génexpresszió mérése real-time PCR-rel Az egyes gének expressziójának változását TaqMan® génexpressziós assay-k (Bcl-2 (Rn99999125), Bcl-XL (Rn00580568), bax (Rn01480160), nestin (Rn00564394), synapsin-1 (Rn00569468), c-fos (Rn02396759), és beta-actin (Rn00667869) (Applied Biosystems) segítségével real-time PCR-rel végeztük az alábbi kondíciók mellett: elő inkubáció: 50°C 2 perc, 95°C 10 perc, ciklus: 95°C 15 sec és 60°C for 1 perc 40x. A génexpresszió mértékét ddCT módszer alapján kvantifikáltuk. A mérésekhez β-aktin endogen kontrollt alkalmaztunk és a változásokat a nem transzfektált normoxiás sejtekhez viszonyítva határoztuk meg.

4.2.9. Western blot analízis Protein izolálás: A sejteket 0,5 mól/L Tris (pH: 6,8), 8,7% glicerin, 10% SDS, 0,01% brómfenol-kék és komplett proteáz inhibitor-t (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) tartalmazó lízis pufferrel 3 percig 100oC-on inkubáltuk, majd 12000g-n 3 percig 4oC-on centrifugáltuk. A fehérje koncentrációt Bio-Rad protein assay kittel mértük. A Western blot vizsgálat során minden mintából 10µg fehérjét vittünk fel a gélre, és azt 8-12%-os SDS poliakrilamid gélen szeparáltuk. A szeparációt követően PVDF (polyvinil-difluorid) membránra (Bio-Rad) transzferáltuk. Blokkolást, valamint az elsődleges és másodlagos ellenanyagokkal való kezelést követően a kérdéses fehérjéket ECL Plus protein detection kit (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK) segítségével vizualizáltuk. A kapott jelek denzitását Quantity One analysis Software (Bio-Rad) segítségével határoztuk meg. A mérésekhez β-aktin endogen kontrollt alkalmaztunk és a változásokat a nem transzfektált normoxiás sejtekhez viszonyítva határoztuk meg.

4.2.10. Statisztikai analízis A kísérleteinket 4-8 alkalommal, független sejttenyészetekből végeztük el. Az egyes kísérletek eredményét átlagoltuk, valamint szórást és SEM-et számoltunk. A szignifikanciát Student’s t-test segítségével számoltuk a normoxiás kontroll sejtekhez viszonyítva. A p értéket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha az kisebb volt mint 0,05.

34

5. EREDMÉNYEK 5.1. A mitokondriális tRNSLys gén polimorfizmusok jelentősége a hazai mitokondriális betegek differenciáldiagnosztikájában Munkacsoportunk a leggyakoribb mtDNS mutációkat perifériás vérből izolált DNS-en (MELAS – A3243G, MERRF – A8344G; NARP - T8993C, T8993G) PCR-RFLP módszerrel vizsgálta. Azon betegek esetén, akiknél az RFLP vizsgálatok nem mutattak eltérést, de a klinikai tünetek, a laboratóriumi eltérések, valamint az izombiopszia során látott morfológiai változások során a mitokondriális betegség alapos gyanúja továbbra is fennállt, a fenti pontmutációk és az mtDNS-tRNS gének szekvencia analízisét posztmitotikus szövetből (vázizom) is elvégeztük. A mutációk analízise során az A8344G szubsztitúcióra jellegzetes RFLP hasítási mintán kívül 5 egyéb különböző hasítási mintázatot is észleltünk. Ezeket a fenti nukleotidot is magában foglaló tRNSLys gén és határoló régiók szekvenálásával vizsgáltuk tovább. A szekvencia analízis során összesen 54 esetben 10 különböző mtDNS variációt találtunk, a talált mtDNS SNP-ket és azok klinikai jelentőségét az alábbiakban ismertetjük.

5.1.1. Az irodalomból ismert, bizonyítottan patogén mutációk

5.1.1.1. mtDNS A8344G szubsztitúció A klasszikus MERRF szindrómára tipikus A8344G mutációt (Schoffner et al 1990) a vizsgálataink során 10 esetben találtuk meg. A mutáció izolált előfordulását 7 esetben igazoltuk (5.1. ábra), valamint egy család (3fő) esetében az A8344G nukleotid szubsztitúció mellett a vizsgált régióban további két mtDNS SNP (G8251A, A8347C) is kimutatható volt. Az A8344G mutációt az irodalom egyértelműen patogénnek minősíti (Shoffner és mtsai, 1990). Az A-G szubsztitúció a tRNSLys T-loopjában lokalizálódik a tRNS 55. nt. pozíciójában (5.2. ábra). A mutációt hordozó egyéneknél a BanII restrikciós enzimnek egy plusz kötőhelye alakul ki. A hasítatlan termék 213bp hosszú, a vad 99, 73 és 41bp-os fragmentekre hasad. A mutáció miatt a 73bp-os fragment még kétfelé hasad: 52 és 21bp-ra (5.1. ábra). A PCR –RFLP vizsgálattal kapott eltérést szekvencia analízissel validáltuk (5.2. ábra). Az A8344G mutációt hordozó betegek

35

klinikai tünetei változatos képet mutattak, a myoclonusos epilespia mellett jelen volt a myopathia, nagyothallás, progresszív ophtalamoplegia externa, fiatalkori ischaemiás stroke, és mentális hanyatlás (5.1. táblázat).

5.1. ábra: A: A MERRF mutációra (A8344G) és a normál genotípusra jellegzetes RFLP mintázat (1: 8344A, 2: 8344G, 3: emésztetlen PCR termék); B: az A8344G mutáció lokalizációja a tRNSLys-ben

5.2. ábra: A: normál, B: A8344G MERRF mutáció szekvencia analízis

36

Nem Életkor Klinikai tünetek

Ffi

Ffi

Nő

Ffi

Izombiopszia eredménye

Heteroplazmia aránya vérben A8344G

Családi anamnesis

40%

Ikertestvére enyhébb tünetekkel bír

33 év

Myoclonus epilepsia, fejtremor, enyhe dysarthria, dysphagia, izom atrophia, ataxia, kognitív funkcióromlás

33 év

Myoclonus epilepsia, hypotrophiás izomzat, enyhe végtag tremor

Nem történt biopszia

40%

Ikertestvére súlyosabb tünetekkel bír

59 év

Tünetmentes

Nem történt biopszia

30%

Ikerfiai: Myoclonus epilepsia

48 év

Myopathia, cardiomyopathia, polyneuropathia, ataxia, terhelési intolerancia, mentalis hanyatlás, depresszió, szorongás

Myopathia, ragged red és COX negatív rostokkal, paracristallin mitokondriális inclusiokkal

58%

Mater: súlyos myopathia, ataxia, depresszió Ikertestvér: súlyos anxietás

Izombiopsziás anyagban COX negatív és ragged red rostok találhatóak

Mater: súlyos myopathia, ataxia, depresszió Ikertestvér: depresszió, ataxia, myopathia Ikerfiai: ataxia, myopathia, depresszió, szorongás Maternalis ágon: colon tumor, diabetes mellitus csecsemőhalálozás, vesebetegség

48 év

Súlyos anxietas, fóbia

Minimális nem specifikus elváltozások

44%

nő

68 év

Depresszió. myopathia, nagyothallás, ataxia

Ragged red és COX negativ rostok, paracristallin inclusiokkal

46%

Nő

51 év

TIA, meglassult beszéd

Nem történt biopszia

25%

Ffi

24 év

Ischaemiás stroke

Nem történt biopszia

30%

Negatív

45 év

Ptosis, myopathia, krónikus progressziv ophtalmoplegia externa, hypothyreosis

Myopathia, ragged red rostokkal, vakuolizációval

40%

Negatív

Myopathia, izomgörcsök

Myopathia, COX negatív rostokkal, subsarcolemmális mitokondrium halmozódással

35%

Negatív

Ffi

Ffi

Ffi

45 év

5.1. táblázat: A8344G MERRF mutációval rendelkező páciensek tünetei

37

5.1.2. Az általunk patogénnek feltételezett, az irodalomban eddig még le nem írt nukleotid szubsztitúciók

5.1.2.1. mtDNS A8332G szubsztitúció Tizenhat éves súlyos dystoniában szenvedő fiú került genetikai vizsgálatra, tünetei 9 éves korában egy súlyos infekciót követően kezdődtek. Akkor szérum laktát szintje magas volt, lumbális liquorában emelkedett fehérjeszintet találtak. Jelenleg a dystonia miatt anarthriás, a végtagokban jelentkező dystonia mozgásában súlyosan korlátozza. Neurológiai vizsgálatakor főként a nyelvre és a végtagokra kiterjedő generalizált dystoniát, bilaterális horizontális nystagmust, anarthriás beszédet, diffúz izomatrophiát, és hiányzó reflexeket találtunk. EMG vizsgálat a jobb deltoideus és tibialis anterior izmokban neurogén károsodást igazolt. Az EEG, ENG és a koponya MRI kóros eltérést nem talált. Az izombiopszia során enyhe neurogén károsodást, a rostok 6%-ban módosított SDH festéssel ragged blue, valamint COX festéssel COX negatív rostokat találtunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálat számos izomrostban subsarcolemmális mitokondriális akkumlációt talált. Édesanyjának kisgyermekkorában stroke szerű epizódja volt, jelenleg hypoacusisa, egyensúlyzavara van és a felsővégtagjaiban enyhe dystonia látható, mely csak 40-es éveiben jelent meg. Az audiológiai vizsgálat sensorineurális hallásvesztést, az ENG axonális neuropahiát igazolt (5.3. ábra). A proband idősebb testvérének is volt gyermekkori stroke szerű tünete, amely során hemiparesist, magas laktát és ammónia szintet észleltek. Jelenleg az ő végtagjaiban is enyhe dystonia észlelhető, emellett 11 éves kora óta epilepsiás és viselkedészavara van (5.3. ábra). Az EEG vizsgálat a bal fronto-centralis régióban epileptiform jeleket talált. A család klinikai tüneteit az 5.2. táblázatban mutatjuk be. A 12 éves proband szekvencia analízise során a tRNSLys génben heteroplazmikus formában a 8332. nukleotid pozícióban adenin guanin csere igazolódott (5.4. ábra). A mutáció a tRNS antikodon karjában helyezkedik el. Emellett a vizsgált régióban két polimorfizmus (9-bp-os deléció nt. 8271-8280 és C8270T) valamint egy részben tisztázatlan jelentőségű SNP (A8347C) is jelen volt. A tRNS, a proteinkódoló és a hipervariábilis régió 1 (HSV1) szekvencia analízise során további 13 SNP is igazolódott (5.3. és 5.4. táblázat). A családi szegregációs vizsgálat során a beteg édesanyjánál és az idősebbik testvérénél is megtaláltuk a fenti eltéréseket (5.3. ábra). Az

38

érintett család részletes haplocsoport analízisét elvégezve kiderült, hogy az anya és gyermekei a kelet-ázsiai populációra jellemző B haplocsoportba tartoznak. Az A8332G és mutáció az irodalomból nem ismert, a 150 kontroll személy vizsgálatakor ezt a szubsztitúciót nem tudtuk kimutatni, így ennek alapján ezt patogénnek feltételezzük. A NADH dehidrogenáz 6. alegységét kódoló génben talált heteroplazmikus C14520G sem ismert az irodalomban, de ezt az SNP-t az általunk vizsgált 150 kontroll közül 13 esetben is megtaláltuk, így ezt polimorfizmusnak minősítjük.

5.3. ábra: a vizsgált beteg családfája

Nem

Nő I/1

Ffi II/1

Ffi II/2

Laboratóriumi eredmények

Heteroplazmi a arány A8332G

Anaemia

35%

19 év

4 bal hemiparesis, hyperkinesisek, dystonia, IQ 81, epilepsia

Magas szérum ammónia, laktát és piruvát szint, a lumbális liquor fehérje emelkedett

17%

16 év

Infekció után járászavar, anarthria, hypotrophás izomzat, generalizált dystonia miatt járásképtelenség

Magas liquorfehérje, vizeletben magas glicin

55%

Életkor

49 év

Klinikai tünetek Egyensúlyzavar, hypacusis, dysarthria, anxietas, gyermekkori ischaemiás stroke

5.2. táblázat: A8332G mutációt hordozó család tünetei

39

5.4. ábra: A: normális, B: heteroplazmikus A8332G mutáció szekvencia analízise, C: a mutáció lokalizációja a tRNSLys-ben

Gén

Nt. pozíció

Nt. csere

A.sav csere

Forma

III/ 2

III/ 1

II/ 1

Minősítés

Irodalom

HVS1

16126

T >C

-

Homopl.

+

+

+

Polimorfiz- Dirienzo és Wilson, 1991 mus

+

Polimorfizmus

Horai és

HVS1

HVS1

16140

16183

T >C

A >C

-

-

Homopl.

Homopl.

+

+

+

+

Hayasaka, 1990 Lahermo és

+

Polimorfizmus

+

Polimorfizmus

Hayasaka,

Polimorfizmus

Hayasaka,

mtsai, 1996 Horai és

HVS1

16189

T >C

-

Heteropl

+

+

1990 Horai és

HVS1

16209

T >C

-

Homopl.

+

+

+

1990 Horai és

HVS1

16294

C >T

-

Homopl.

+

+

+

Polimorfizmus

Hayasaka,

Polimorfizmus

Hayasaka,

1990 Horai és

HVS1

16296

C >T

-

Homopl.

+

+

+

1990 Horai és

HVS1

16311

T >C

-

Homopl.

+

+

+

Polimorfizmus

5.3.táblázat: A mtDNS HVS1 régióban talált eltérései a vizsgált családban

40

Hayasaka, 1990

Gén

Nt. pozíció

Nt. csere

A.sav csere

ND1

4216

T>C

Tyr/His

NC7

8270

C>T

-

NC7

Del. nt. 8271-8280

-

-

tRNS Lys

8332

A>G

-

tRNS Lys

8347

A>C

-

ATP6

8697

G>A

-

tRNS Arg

10463

T>C

-

ND4

11812

A>G

-

ND6

14520

C>G

Gly/Arg

Forma

Homopl.

Homopl. Homopl.

III/ 2

III/ 1

II/ 1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Heteropl 55% 17% 35%

Homopl.

Homopl.

Homopl. Homopl.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Heteropl. 40% 25% 15%

Minősítés Nem szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció

Irodalom Torroni és mtsai, 1999 Ruppert és mtsai, 2004 Lorenz és Smith, 1994

Patogén mutáció Nem szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Nem szinonim szubsztitúció Szinonim szubsztitúció Nem szinonim szubsztitúció

Coon és mtsai, 2006

Rieder és mtsai, 1998 Houshmand és mtsai, 1994 Howell és mtsai, 1995

5.4. táblázat: A mtDNS tRNS és proteinkódoló génjeiben talált eltérései a vizsgált családban

5.1.2.2. mtDNS T8310G és T8311A szubsztitúciók Súlyos pszichiátriai tünetegyüttessel rendelkező (bipoláris hangulatzavar, fóbiás szorongás, pánik szidróma) nő kézremegés, szótalálási nehézség, figyelemzavar miatt került hozzánk vizsgálatra. Neuropszichológiai vizsgálata során a téri-vizuális memória és konstrukciók nagyfokú gyengeségét találtuk. Az általános intellektuális funkció az átlagos tartományban alsó határán voltak (IQ=85, PQ=81 VQ=91). A rövidtávú memória, a szekvenciális feldolgozás, a verbális memória-, valamint az exekutiv funkciók romló tendenciát mutatnak. Jobb-baltévesztés, ujjagnosia, ideomotoros és dinamikus apraxia mutatható ki. Spontán beszédben enyhe szótalálási nehézség, írásban

41

és olvasásban betűtévesztés jellemző. A komplexebb matematikai feladatok és nyelvtani mondatok megértése problémás. A pszichológiai vizsgálat diszharmonikus és emocionálisan instabil személyiséget talált, hisztrionikus vonásokkal. A proband esetében az A8344G mutáció elemzésekor a PCR -RFLP-vizsgálat során

nehezen

elkülöníthető mintázatot találtunk, ezért szekvencia analízist végeztünk (5.6. ábra). A szekvencia analízis során az mtDNS tRNSLys génben három nukleotid cserét találtunk. A dihidrouridin karban heteroplazmikus formában a 8310 nt. pozícióban T→G és közvetlen mellette a 8311 nt. pozícióban T→A szubsztitúciók igazolódtak. A mutációk a tRNSLys-ben, a tRNS 16. és 17. nt. pozícióban található (5.7. ábra). Az egyik mutáció (T8310G) a dihidrouridin hurokban, míg a másik (T8311A) a dihidrouridin karban helyezkedik el, amely H-híd kötésben van.

Az adott pozícióban lévő H-kötés

felbomlásával a D-loop nagysága megnő, amelynek következtében degradált tRNS-ek jöhetnek létre (5.7. ábra). Mivel mindkét szubsztitúció a betegekben heteroplazmikus formában van jelen, feltételezzük, hogy a gélképen látott eltérések a normál tRNS-ek melletti degradált fragmensek. Az irodalomból ismert, hogy a tRNS-degradációval a tRNS mérete csökken, ezzel magyarázható a gélképen a dupla csíkok megjelenése. A szegregációs vizsgálat során a családban további 4 esetben tudtuk kimutatni a fenti mutációkat (5.5. ábra). Az érintett családtagok mindegyike rendelkezett klinikai tünetekkel, melyek változó súlyosságúak voltak. A fenti mutációk mellett család minden érintett tagjában homoplazmikus formában az A8347C SNP is jelen volt. A család klinikai tüneteinek megoszlását az 5.5. táblázatban mutatjuk be. A T8310G és a T8311A mutációk az irodalomból nem ismertek, a kontroll személyek vizsgálatakor ezek jelenlétét egy esetben sem tudtuk kimutatni, így ennek alapján patogénnek feltételezzük.

42

Nem

Életkor

Nő I/1

56 év

Nő II/2

Ffi II/3 Ffi III/1 Nő III/2

38 év

35 év 19 év 13 év

Klinikai tünetek Diabetes, hypertonia, szívbetegség, anxietas Osteoid osteoma, bipoláris hangulatzavar, fóbiás szorongás, pánik szindróma, agorafobia, 2005-től kézremegés, szótalálási nehézségek, figyelemzavar, IQ 85, Súlyos depresszió, öngyilkossági kísérletek Gyerekkori hyperaktivitás, depressziós epizódok

Laboreredmények

Heteroplazmia arány 35%

Laktát terheléses vizsgálat aerób metabolizmus zavart igazolt

Izomgörcsök

45%

35% 30% 25%

5.5. táblázat: T8310G, T8311A mutációkat hordozó család tünetei

5.5. ábra: A vizsgált család családfája

5.6. ábra: A tRNSLys dihidrouridin karjában található egymás melletti 8310-11 nt. szubsztitúciókra jellemző gélkép

43

5.7. ábra: A: normális szekvencia, B: T8310G és T8311A heteroplazmikus nukleotid szubsztitúciók szekvencia analízise, C: a talált eltérések lokalizációja a tRNSLys-ben

5.1.3. Az irodalomból ismert neurodegeneratív betegségekre hajlamosító szuszceptabilitási SNP

5.1.3.1. mtDNS A8347C szubsztitúció A szekvencia analízis során a tRNSLys T-loopjában lokalizálódó A8347C szubsztitúciót (5.8. ábra)19 esetben találtuk meg. Ebből izoláltan négy esetben, a G8251A polimorfizmussal kombinálva három esetben, míg további 11 esetben egyéb patogén mutációkkal együtt fordult elő. Ezt az SNP-t Coon és mtsai Alzheimer-kóros betegekben szignifikánsabban nagyobb arányban találták meg, mint az egészséges kontroll egyénekben (Coon és mtsai, 2006). Az általunk vizsgált betegek körében ezen mutáció meglétét nem gondoljuk patogénnek, de nem zárjuk ki annak lehetőségét, hogy egyéb gének mutációival együtt előfordulva degeneratív központi idegrendszeri valamint izom betegségekre hajlamosíthat.

5.8. ábra: A normális és a heteroplazmikus A8347C mutáció szekvencia analízise

44

5.1.4. Az irodalomból ismert polimorfizmusok jelenléte

5.1.4.1. 9 bázispár deléció (del8271-8280) Az mtDNS nt. 8271-8280 közötti szakaszában – a COII és tRNSLys gének között - egy 9 bp-os deléciót négy betegben találtunk meg (5.9. ábra), amely minden esetben a C8270T és az A8347C szubsztitúciókkal társult (5.10., 5.8. ábra). Az 5.1.2.1. pontban ismertetett család három tagjában emellett heteroplazmikus formában az A8332G nukleotidcserét is ki tudtuk mutatni. Az általunk vizsgált beteg és kontroll kohortban ezt a 9 bp deléciót a fenti család tagjain kívül még két esetben találtuk meg. Ezen betegeknél patogén mutációt az mtDNS vizsgálata során nem találtunk, és a deléció mindkét esetekben a C8270T SNP-vel társult.

5.9. ábra: 9bp deléció gélképe

5.10. ábra: 9bp deléció és a közvetlen előtte elhelyezkedő C8270T mutáció szekvencia analízise (A: normális szekvencia, B: deletált és mutált szekvencia

45

5.1.4.2. mtDNS G8251A szubsztitúció Vizsgálataink során a COII terminális szakaszában lokalizálódó G8251A szubsztitúciót 19 esetben találtuk meg. A restrikciós mintázatban a BanII enzim egyik felismerő helye kiesett, így a normálistól eltérő gélképet kaptunk (5.11. ábra). A mutáció pontos helyét bidirekcionális szekvenálással határoztuk meg (5.12. ábra). Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert (Brandstätter és mtsai, 2003), az ősi L és N haplocsoportokra jellemző eltérés. A szubsztitúció 13 esetben izoláltan, 3 esetben az A8344G és A8347C mutációkkal együtt (5.1.1.2.-ban ismertetett család esetén), míg újabb 3 esetben csak az A8347C mutációval kombináltan fordult elő. A kontroll szekvenciák vizsgálata során ezt a polimorfizmust három esetben találtuk meg.

5.11. ábra: A G8251A polimorfizmusra jellegzetes restrikciós mintázat

5.12. ábra: A normál és a G8251A polimorfizmus szekvenogramja

46

5.1.4.3. mtDNS G8269A szubsztitúció A COII/tRNSLys régió szekvenálása során a G8269A szubsztitúció egy beteg és egy kontroll személy esetében volt kimutatható (5.13. ábra). Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert (Rieder és mtsai, 1998), előfordulása a nyugat-európai H4a és J1b haplocsoportokban gyakori.

5.13. ábra A: normális, B: G8269A mutáció szekvencia analízise

5.1.4.4. mtDNS C8270T szubsztitúció A tRNSLys gén szekvencia analízise során a mtDNS C8270T mutációját két család 4 tagjában találtuk meg. Ez az SNP az irodalomból polimorfizmusként ismert (Ruppert és mtsai, 2004). Az SNP a citokróm oxidáz-c 2. alegysége (COII) és a tRNSLys közti hipervariábilis intergénikus régióban lokalizálódik. A mutáció minden betegnél a 9-bpos delécióval társulva homoplazmikus formában volt jelen (5.10 ábra). Egy család esetében (3 fő) az előbbi eltérések mellett heteroplazmikus formában az A8332G szubsztitúciót is detektáltuk, amely a tRNSLys antikodon karján található.

5.1.4.5. mtDNS G8292A szubsztitúció Három beteg vizsgálatakor a restrikciós mintázatban a BanII enzim egyik hasítási helye kiesett, így a normálistól eltérő gélképet kaptunk (5.14. ábra). A szekvencia analízis során ennek hátterében a G8292A szubsztitúció igazolódott, amely a tRNSLys és a COII közti intergénikus régióban helyezkedik el (5.15. ábra). Ezt a mutációt 3 betegnél találtuk meg mind homo-, mind heteroplazmikus formában. Két esetben volt lehetőség családi szegregációs vizsgálatra, amelynek során további 5 esetben tudtuk kimutatni a kérdéses mtDNS alterációt. Mindkét családban maternális halmozódású migrént találtunk. Az egyik vizsgált családban a proband tünetei közül a migrén megléte mellett

47

kiemelendők az ismétlődő tranziens ischaemiás történések, a hypothyreosis és a mélyvénás thrombosis. A proband testvérének és édesanyjának epilepsziás rohamai voltak. A másik családban egy 16 éves szövődményes migrénben szenvedő leány vizsgálata kapcsán derült fény az mtDNS G8292A szubsztitúcióra. A beteg szintén migrénes édesanyja is hordozza a mutációt.

Az irodalomból ez a szubsztitúció

polmorfizmusként ismert (Kleinle és mtsai, 1998), amely az R0 haplocsoportot határozza meg. A G8292A szubsztitúció és a migrain kapcsolatát eddig még nem vizsgálták.

5.14. A G8292A mutáció hasítási mintázata

5.15. ábra: A: normál, B: G8292A szubsztitúció szekvenciája

5.1.5. Egészséges kontroll egyének tRNSLys génjének vizsgálata Az irodalomból nem ismert újonnan talált mtDNS alterációk patogenitásának vizsgálatára az adott régió szekvencia analízisét 150 kontroll személyen végeztük el (67

48

ffi és 83 nő). Ezen csoport átlagéletkora 43,7 év volt (férfiak: 41,1 év, nők: 45,7 év). Az egészséges kontroll csoport szekvenciáit összehasonlítottuk a cambridge-i referencia szekveciával, majd a betegek szekvenciáival. A G8251A polimorfizmust 4 esetben, míg a G8269A SNP-t 2 személynél tudtuk kimutatni. A kontroll csoportban a szekvencia analízissel egyéb mtDNS eltérés nem volt detektálható. 5.1.6. tRNSLys és határoló régióinak vizsgálatakor talált eltérések összefoglalása A vizsgált régióban három heteroplazmikus mutációt elsőként írtunk le, egy ismert patogén mutáció jelenlétét 10 betegben igazoltuk, egy neurodegeneratív betegségekre hajlamosító SNP-t (A8347C), valamint 5 polimorfizmust és antropológiai markert találtunk (5.6. táblázat). Az egyes eltérések nem csak egyedileg fordultak elő, hanem a betegekben ezek kombinációját is megtaláltuk.

Mutáció Lokalizáció

Beteg Kontroll (Össz/kombinált)

Minősítés

Irodalom

A8344G

tRNS Lys T-loop

8/5

0

Patogén

Shoffner és mtsai, 1990

T8310G

tRNS Lys D-loop

5/5

0

Új patogén

Inczédy és mtsai, 2009

T8311A

tRNS Lys D-loop

5/5

0

Új patogén

Inczedy és mtsai, 2009

A8332G

tRNS Lys antikodon-kar

3/3

0

Új patogén

Gál mtsai, 2008

A8347C

tRNS Lys T-loop

19/15

0

G8251A

COII

19/6

3

G8269A

NC7

1/0

1

Polimorfizmus

Rieder és mtsai, 1998

C8270T

NC7

4/4

0

Polimorfizmus

Ruppert és mtsai, 2004

Del 82718280

NC7

4/4

0

Antropológiai marker (polimorfizmus)

Horai és mtsai, 1996

G8292A

NC7

8/0

0

Polimorfizmus

Kleinle és mtsai, 1998

Polimorfizmus Coon és mtsai, (szuszceptabilitási 2006 faktor?) Brandstätter Polimorfizmus és mtsai, 2003

5.6. táblázat: A tRNSLys és határoló régióiban talált mtDNS eltérések összesítése

49

5.2. Az mtDNS tRNSLeu

(UUR)

gén A3243G mutáció genetikai epidemiológiai

vizsgálata

A Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Orvosi Genetikai és Gyermekfejlődéstani Intézetével közösen összesen 631 beteg (361 nő és 270 férfi) DNS mintáját analizáltuk. A minta gyűjtés 1999 januártól 2007 december végéig történt. A vizsgálatba Baranya, Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar, Szabolcs-Szatmár-Bereg Megye valamint Budapest ismeretlen etiológiájú fiatalakori (45 évnél fiatalabb) ischaemiás stroke-os, valamint ismeretlen etiológiájú ataxia, maternálisan öröklődő sensoneurialis hallásvesztés, myopathia, és hypotonia miatt neurológiai osztályon vizsgált betegeit vontuk be, amennyiben a klinikai átvizsgálás során felmerült a mitokondriális betegség lehetősége. Valamennyi betegnél a molekuláris biológiai vizsgálat diagnosztikai célból történt. A betegek átlagéletkora 36,3 év (nők: 38,1 én, férfiak: 34,4 év) volt. A vizsgált betegekből mindössze 5 nő és 1 férfi betegnél igazolódott az A3243G mutáció. A betegek családtagjainak szűrése során további 8 esetben derült fény az A3243G mutációra. Minden érintett családtagnál a klinikai vizsgálat a mitokondriális betegségekre jellemző tüneteket talált. A betegek és családtagjaik klinikai tüneteit az 5.7. táblázatban foglaltuk össze. Egy család esetében a kiskorú gyermekeket tünetmentességére való tekintettel etikai megfontolások miatt nem vizsgáltuk. Az A3243G mutáció frekvenciája a vizsgált időszakban 2,22 % volt.

A betegek klinikai tüneteit az alábbiakban ismertetjük: Egy harminchárom éves nőbetegnél 12 éves korában kétoldali ptosis jelentkezett, majd 19 éves korában, szülést követően generalizált izomgyengeség és terhelési intolerancia és inzulin dependens diabetes mellitus alakult ki. Vizsgálatakor alacsony termetet (testmagasság: 145 cm), kétoldali súlyos ptosist, m. rectus medialis gyengeséget, kétoldali hypacusist, myopathiás arcot, nasalis színezetű beszédet találtunk. A beteg 15 éves lányát csecsemőkorában enyhe cardiális tünetekkel gondozták, 12 éves kora óta észlelik kétoldali enyhe fokú ptosisát, egy éve generalizált izomgyengeséget panaszolt. Három éves kislányánál csecsemőkorában hypotonia jelentkezett, majd fokozatosan izomgyengeség alakult ki. Jelenleg 8 hónapos kisfia légzési elégtelenséggel született és

50

átmenetileg gépi lélegeztetésre szorult. A proband édesanyja súlyos cardiomyopathiában szenved, cukorbeteg, nagyothall és általános izomgyengeséget panaszol (Gál és mtsai, 2008). Az A3243G mutáció a proband izmában 45%-os, míg a vérében 35%-os heteroplazmia arányban volt kimutatható. A családtagok heteroplazmia arányai: 30%, 60%, és 65% Egy esetben a mutációt a súlyos klinikai tünetek ellenére csupán az izomból izolált DNS-ből 20%-os hereroplazmia arányban tudtuk kimutatni. A beteget születést követően azonnal újraélesztették, kisgyermekkorban gyakori infekciói, és collaptiform rosszullétei, járászavara volt. Gyermekkorában kezdődő egyensúlyzavar, majd 15 éves korától szürkületi vakság, gyakori szédülés, elesés jelentkezett. Jelenleg menstruációs zavarai vannak, hypertonia, extrem fokú abdominalis típusú obesitas, facialis dysmorphia, micrognathia, hypotelorismus, mko. tekintésirányú horizonto-rotatoros nystagmus, diplopia, enyhe dysarthria, végtagokban hypotonia, súlyos izületi helyérzészavar, tetraataxia, dysmetria, és akciós tremor észlelhető. A proband édesanyjánál a mutációt nem tudtuk kimutatni. Nővére 20 éves korában ismeretlen eredetű agyi történésben hunyt el. Egy fiatalkori stroke szindróma miatt vizsgált 35 éves nőbetegnél a mutáció vérből 35%-ban volt kimutatható. A betegnek az agyi ischaemia mellett súlyos depressziója és psychozisa is volt. A beteget suicidium miatt elvesztettük, így ez esetben családi szegregációs vizsgálatra nem volt lehetőségünk. Egy évtizedek óta progrediáló leukoaraiosis miatt vizsgált nőbeteg esetében a mutáció 30%-os heteroplazmia arányban volt kimutatható. A beteg astheniás alkatú, kétoldali ptosisa, hypoacusisa van, izomzata hypotrophiás és hanyatló kognitív funkciók észlelhetők. További 2 a PTE-en vizsgált beteg klinikai fenotípusát Komlósi és mtsai. írták le. Az A3243G mutációt egy MELAS-szindrómára jellegzetes tünetekkel vizsgált 9 éves kislány és egy sensoneurális hallásvesztéssel vizsgált 13 éves fiú esetétben mutatták ki.

51

A családi szegregációs vizsgálatokkal további négy esetben igazolták a fenti mutációt (Komlósi és mtsai, 2004; Komlósi és mtsai, 2005).

Család

Nem

Tünetek kezdete

Heteroplazmia vér

Heteroplazmia izom

Klinikai kép

Családi anamnézis

Pozitív családtagok száma

CPEO,

1

nő

12 év

35%

45%

diabetes mellitus,

CPEO,

hypacusis,

diabetes mellitus,

myopathia,

hypacusis,

myalgia,

myalgia,

4

alacsony termet 2

nő

35 év

35%

Nem

Agyi ischaemia,

történt

depresszió,

vizsgálat

psychosis

Nem történt

Nem történt

vizsgálat

vizsgálat

Sensoneuralis 3

ffi

13 év

30%

40%

hallásvesztés,

Hypacusis, MI,

myalgia,

embóliás stroke

2

epilepsia Agyi ischaemia,

Nem 4

nő

6 év

80%

történt vizsgálat

laktát acidózis,

Hypacusis

2

-

0

ptosis

Nem történt

Nem történt

progresszív

vizsgálat

vizsgálat

mentális retardatio Diabetes mellitus,

Nem 5

nő

3év

detektál-

hypogonadismus, 20%

ataxia, mentalis retardatio,

ható

alacsony termet Nagyot hallás,

Nem 6

nő

30 év

25%

történt vizsgálat

leukoaraiosis

5.7. táblázat: Az A3243G mutációt hordozó betegek és családtagjaik klinikai tünetei

52

5.3. Adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL antiapoptózis génterápia in vitro PC12 hypoxiás modellben

5.3.1. A kísérleti körülményeink optimalizálása

5.3.1.1. Adenovírus alapú vektor bevitel hatékonyságának vizsgálata

5.16.ábra: A: kezeletlen (kontroll) sejtek (200x) B: β-galaktozidáz expresszió kimutatása 24 órával a LacZ transzdukciót követően (200x).

Normoxiás kondíciók mellett az idegi növekedési faktorral differenciáltatott PC-12 sejteket 10-200 PFU/sejt víruskoncentrációban β-galaktozidáz reporter gént tartalmazó adenovírus konstruktummal transzdukáltuk. A génbevitelt követően 50 PFU/sejt koncentrációtól szinte valamennyi sejt felvette a LacZ-t tartalmazó adenovírus vektort. A sejtekben az adenovírus jelenléte tartósan kimutatható, a transzdukciót követően 10 nappal a sejtek jelentős százalékában a β-galaktozidáz aktivitás detektálható volt (5.16. ábra).

5.3.1.2. Bcl-2 és Bcl-XL protein expresszió változása a transzdukciót követően Normoxiás kondíciók mellett a PC-12 sejteket 50-200 PFU/sejt víruskoncentrációban Bcl-2 vagy Bcl-XL gént tartalmazó vektorral kezeltük. Mindkét kezelés hatására a bejuttatott vektorok által kódolt gének (5.17. ábra) és fehérjék (5.18. ábra) expressziója emelkedett.

53

5.17. ábra: Bcl-2 (A.) és Bcl-XL (B.) génexpresszió kimutatása real-time PCR-rel

5.18. ábra: Bcl-2 és Bcl-XL fehérjék kimutatása immuncitokémiával (A.) és Western blottal (B.

5.1.1.3. Hypoxia/re-oxigenizáció hatása a sejtpusztulásra A PC12 sejteken vizsgáltuk a különböző idejű argon gáz okozta hypoxia (1 és 2 óra) valamint re-oxigenizáció hatását (0-48 óra). Az apoptotikus és a nekrotikus sejtek százalékos arányát AnnexinV - propidium-jodid (AV-PI) kettősfestéssel mértük. Egyórás hypoxiát követően a sejtek főként apoptózissal, míg 2 óra argon gáz kezelés után főként nekrózissal pusztulnak. Apoptózist legnagyobb százalékban 1 óra hypoxiát és 24 óra re-oxigenizációt követően detektáltuk. Ezek alapján a további kísérleteinkben a sejtpusztulás kiváltására egy óra argon gáz hypoxiát és 24 óra re-oxigenizációt alkalmaztunk (5.19. ábra).

54

5.19. ábra: a sejtpusztulás változása 1 (A.) és 2 óra (B.) hypoxiát követően

5.1.1.4. A hatékony víruskoncentráció mérése PC-12 sejteket 1 órás argon gáz hypoxia előtt 24 órával, vagy a hypoxia után 1 órával különböző koncentrációkban (10-200 PFU/sejt) Bcl-2, vagy Bcl-XL gént tartalmazó adenovírus vektorral kezeltük. Az apoptotikus és a nekrotikus sejtek százalékos arányát AnnexinV - propidium-jodid (AV-PI) kettősfestéssel (5.20. ábra) állapítottuk meg. Mindkét kostruktum hatására 120 PFU/sejt koncentráció felett a sejtpusztulás emelkedése figyelhető meg. A nekrózis mértéke 120-200 PFU/sejt koncentrációk között jelentős, míg az apoptózis kismértékű emelkedést mutat, így ezen koncentrációkban az alkalmazott vektorok toxikusak a sejtekre. A kezelést követően 100 PFU/sejt koncentrációig az apoptózis és a nekrózis mértéke nem változik (5.5. ábra).

55

5.20. ábra: A Bcl-2 (A) és Bcl-XL (B) anti-apoptózis gént tartalmazó vektorok koncentráció függése normoxiás körülmények között

Az argon gáz hypoxia az apoptotikus és nekrotikus sejtek számának szignifikáns emelkedését eredményezi. Hypoxia után 1 órával adott Bcl-2 és a Bcl-XL géneket tartalmazó konstruktumok 100 PFU/sejt koncentrációban, míg hypoxia előtt 24 órával kezelve a sejteket a vizsgált konstruktumok 100 PFU/sejt koncentrációban kivédték a hypoxia/re-oxigenizáció által okozott sejtpusztulást. Az eredmények alapján az optimális vírus titert 100 PFU/sejt koncentrációban állapítottuk meg, ezért a további kísérleteinkben ezen dózist alkalmaztuk (5.21. ábra).

56

5.21. ábra: A Bcl-2 (A) és Bcl-XL (B) anti-apoptózis gént tartalmazó vektorok koncentráció függése hypoxiás körülmények között

5.3.2. Anti-apoptotikus géntranszfer eredményezte cytoprotekció

5.3.2.1. Az argon gáz hypoxia által okozott sejtpusztulás elleni védelem a Bcl-2 és a Bcl-XL gének által PC-12 sejteket 1 órás argon gáz hypoxia után 1 órával 100 PFU/sejt koncentrációban kezeltük a vírusvektorokkal. A re-oxigenizációt követő 4, 24 és 48 az apoptotikus és a nekrotikus sejtek ill. a teljes sejtpusztulás százalékos arányát annexinV – PI kettősfestéssel mértük.

57

5.22. ábra: a sejtpusztulás változása 1 és 2 óra hypoxiát követően (* p<0.05)

A teljes sejtpusztulás (AV-/PI+; AV+/PI+) a Bcl-2 és a Bcl-XL génbevitelt követően minden vizsgált időpontban szignifikánsan csökkent, míg a LacZ kezelést követően a sejtpusztulás szignifikánsan nőtt (5.22A ábra; 5.23. ábra).

LacZ bevitel hatására a

nekrotikus sejtek száma minden vizsgált időpontban szignifikáns emelkedést mutatott a nem kezelt hypoxiás sejtekhez viszonyítva, míg 4 és 24 óra re-oxigenizációnál az antiapoptózis gének hatására a nekrózis mértékében csökkenő tendencia volt detektálható (5.22B ábra; 5.23. ábra). Az anti-apoptózis gének bevitele minden vizsgált időpontban az apoptotikus sejtek számát szignifikánsan csökkentette, míg a LacZ transzdukciót követően az apoptózis mértéke nem változott (5.22C ábra; 5.23. ábra).

58

5.23. ábra: Apoptózis és nekrózis normoxiában és hypoxiában

5.3.2.2. A mitokondriális membránkárosodás elleni védelem az anti-apoptózis gének által A TMRE fluoreszcens szignál intenzitását, amely a mitokondriális membránpotenciál változását jelzi, a kezelést követően 24 és 48 óra elteltével konfokális laser scanning mikroszkóppal

mértük.

A

sejteket

adenovírus

konstrukttal

koncentrációban az argon gáz hypoxia után egy órával transzdukáltuk.

59

100

PFU/sejt

5.24. ábra: Mitokondriális membránpotenciál változása (* p>0.05)

Hypoxia hatására a TMRE fluoreszcenciája szignifikánsan csökkent (160.6±5.2 versus 89±5.1) (p<0.05). A Bcl-2 és a Bcl-XL gén bevitel kivédte a hypoxia által okozott mitokondrium depolarizációt (5.9. ábra).

Argon gázkezelés és re-oxigenizáció után a

TMRE szignál intenzitás a hypoxiás kontrollhoz képest a Bcl-2 és Bcl-XL kezelt sejteken szignifikánsan nőtt, míg a vírushatás kontrolljaként használt LacZ repoter génbevitel után a mitokondriális membránpotenciál nem változott. Normoxiában mindhárom génbevitel hatására a mitokondrium membránpotenciál kismértékben (10%) csökkent (5.24. ábra).

5.3.2.3. Bcl-2 fehérje család pro- és anti-apopototikus tagjainak expresszió változása a transzdukciót követően A Bcl-2 és Bcl-XL génexpresszió változását real-time PCR segítségével TaqMan génexpressziós assay-kel vizsgáltuk. Mindkét vektort a hypoxiát követően 1 órával 100 PFU/sejt koncentrációban adtuk a PC12 sejtekhez. A génexpressziós változást a transzdukciót követően 24 órával mértük. A génexpressziós változást a nem kezelt normoxiás értékekhez viszonyítva adtuk meg, amelynek értékét ddCT módszerrel határoztuk meg. Bcl-2 transzdukciót követően a sejtekben jelentős mértékű expresszió emelkedés tapasztalható

(normoxiában:

1246±85,

hypoxiában:

2253±100).

Normoxiás

körülmények között a LacZ és Bcl-XL transzdukció a Bcl-2 mRNS szintet nem

60

változtatta meg. Egy órás argon gáz hypoxiát követően a kezeletlen és a LacZ transzdukált sejteken a Bcl-2 expresszió csökkent (kezeletlen: 0,47±0,17; LacZ kezelt: 0,36±0,15) (5.25A ábra). Bcl-XL génbevitel hatására a Bcl-XL génexpresszió normoxiában 4,25±0,4 szörös, míg egy órás hypoxiát követően 4,77±11,2 szeres növekedést mutatott. Bcl-XL emelkedést Bcl-2 kezelés után is tapasztaltunk, normoxiában a Bcl-2 kezelt sejtekben a Bcl-XL gén 3,29±1 szeres expresszió fokozódás detektálható (5.25B ábra). A Bcl-2 fehérje mennyisége a Bcl-2 transzdukciót követően normoxiás körülmények mellett 36 szorosra, míg 1 órás argon-gáz hypoxiát és 24 óra reoxigenizációt követően 42-szeresre emelkedett a normoxiás kontrollhoz képest. A Bcl-XL, és a LacZ transzdukció a PC-12 sejtekben a Bcl-2 protein expressziót nem változtatta meg. A Bcl-XL génbevitel mellett az expresszálódott Bcl-XL fehérje normoxiában illetve hypoxiában 2-2,5 - szeresére emelkedett. A Bcl-2 génbevitel után a Bcl-XL fehérje expressziójának kismértékű növekedését detektáltuk (5.26. ábra).

5.25. ábra: Bcl-2 (A) és Bcl-XL (B) változása (* p>0.05)

61

5.26. ábra: Bcl-2 (A, B) és Bcl-XL (A, C) fehérjék Western blot vizsgálata (* p<0.05)

A pro-apoptotikus Bax génexpresszió vizsgálatakor, normoxiás körülmények között a nem kezelt normoxiás kontrollhoz képest sem az anti-apoptotikus, sem a LacZ-t tartalmazó konstruktumok nem változtatták meg a Bax gén expresszióját. Argon gáz hypoxiát követően a Bax gén expressziója a nem kezelt és LacZ transzdukált sejteken szignifikánsan nőtt (p<0.05), míg a Bcl-2 és Bcl-XL gének bevitele ezt a hatást kivédte (5.27. ábra).

5.27. ábra: Bax génexpresszió változása (* p<0.05)

62

5.3.3. Agyi plaszticitásban szerepet játszó gének és proteinek expesszió változása

5.3.3.1. A GAP-43 fehérje expresszió változása

5.28. ábra: A GAP-43 fehérje expresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában (* p<0.05)

Normoxiában és argon gáz hypoxia hatására a GAP-43 fehérje expressziója a Bcl-2 és Bcl-XL transzdukciót követően a kezeletlen kontrollhoz képest szignifikáns emelkedést mutatott (p<0.05) (5.28. ábra). A LacZ reporter gén nem változtatta meg a GAP-43 protein expressziót.

.

5.3.3.2. A nestin expresszió változása

5.29. ábra: A nestin génexpresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában (* p<0.05)

63

Normoxiás körülmények között a Bcl-2 kezelés hatására a nestin protein expresszió emelkedést mutatott. A szignifikáns emelkedés (p<0.05) csak a protein expresszió szintjén volt kimutatható. Az anti-apoptotikus Bcl-XL és a reporter, LacZ génbevitel a Argon gáz hypoxiát követően a nestin

nestin expressziót nem változtatta meg.

génexpresszió 6-szoros, míg a protein szint 4-szeres emelkedést mutatott (p<0,05). Emellett a Bcl-XL kezelés hatására a protein expresszió is szignifikánsan emelkedett (5.29. és 5.30. ábra).

5.30. ábra: A nestin fehérje expresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában (* p<0.05)

5.3.3.3. A synapsin-1 expresszió változása

5.31. ábra: A synapsin-1 gén expresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában (* p<0.05)

64

Normoxiában a synapsin-1 gén- és protein expresszió a Bcl-2 és Bcl-XL konstruktok bevitelét követően emelkedést mutatott. Szignifikáns változást csak a Bcl-XL kezelés után mért gén expressziós értékben mutatható ki. (5.31.; 5.32. ábra)

5.32. ábra: A synapsin-1 fehérje expresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában

5.3.3.4. A c-fos expresszió változása

5.33. ábra: A c-fos génexpresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában (* p<0.05)

65

Hypoxiát követően a c-fos mRNS és protein szint szignifikánsan csökkent a nem kezelt hypoxiás kontrollban és a LacZ kezelt sejtekben. Ezt az expresszió csökkenést az antiapoptózis gének kivédték. Transzkripciós szinten a Bcl-2 vektor hatására a hypoxiás kezelés után a c-fos génexpresszió kétszeresére nőtt (p<0.05), ezzel szemben fehérje szinten csak növekedési tendencia volt megfigyelhető (5.33.; 5.34. ábra).

5.34. ábra: A c-fos fehérje expresszió változása a LacZ, Bcl-2 és Bcl-XL transzfekciót követően normoxiában és hypoxiában (* p<0.05)

66

6. MEGBESZÉLÉS 6.1. A mitokondriális tRNSLys gén és határoló régióiban talált eltérések jelentősége A mitokondriális DNS egyes szakaszain a mutációk előfordulásának gyakorisága különböző. A tRNS gének mutációs rátája rendkívül magas, így ezek a mitokondiális genomon belül hot spot régióknak tekinthetők (www.mitomap.org). A legtöbb mutációt a tRNSLeu (UUR) génben találták. Második helyen áll a tRNSLys gén, amelynek eddig 14 különböző patogén mutációja és 8 polimorfizmusát írták le (www.mitomap.org). Munkánk során a mitokondriális tRNSLys gén és annak közvetlen közelében levő génszakaszok variabilitását tanulmányoztuk, mitokondriális betegség gyanúja miatt vizsgált és egészséges kontroll egyénekben. A talált eltéréseket korreláltattuk a betegek klinikai fenotípusával és az irodalmi adatokkal. Vizsgálataink során a kérdéses régióban 10 különböző mtDNS alterációt találtunk. A vizsgált citokróm oxidáz-c II. alegysége, és tRNSLys gének közötti szakasz az irodalomból is hipervariábilis régióként ismert. Ebben a régióban három családnál (5 fő) az nt. 8271-8280 között egy 9 bp-os deléciót találtunk, amely az irodalomból keletázsiai antropológiai markerként ismert (Horai és mtsai, 1996). Kaukázusi populációban ez az eltérés rendkívül ritka, eddig három esetben írták le Skóciában (Thomas és mtsai, 1998), Spanyolországban (Barrientos és mtsai, 1995) és Finnországban (Lehtonen és mtsai, 2003). Az irodalmi adatok alapján a deléció előfordulása Kínában 14,7% (Yao és mtsai, 2000), Taiwanban 21% (Liu és mtsai, 2005), Thaiföldön 18-45% (Fucharoen és mtsai, 2001), Indiában 2,15% (Thangaraj és mtsai, 2006), Afrikában 0,9% (Soodyall és mtsai, 1996), míg a venezuelai indián populációban 3,39% (Vona és mtsai, 2005). A hypervariabilis génszakasz deléciója feltehetően instabilitást eredményez és így további mtDNS hibák kialakítására hajlamosít. Liu és mtsai (2005) Taiwanban az A8344G patogén szubsztitúcióval bíró betegek 67%-ában találta meg a deléciót, míg az egészséges népességnek mindössze 21%-ában volt jelen. Egy súlyos dystoniában szenvedő fiúban, testvérében és édesanyjában a fenti kelet ázsiai antropológiai marker mellett az A8332G heteroplazmikus mutáció is igazolódott. A kontroll egyének vizsgálata és az irodalmi adatok ismeretében ez a mutáció esetükben patogénnek minősíthető, mert maternális szegregációt mutat, heteroplazmikus formában van jelen, valamint az általunk vizsgált 150 kontroll személyeknél ennek jelenlétét nem

67

tudtuk kimutatni. A 8332 nt. pozícióban elhelyezkedő adenin, evolúciósan nem túl erősen konzervált, azonban a mutáció a tRNS 38.nt-ját érinti, amely mindig a 22. nt.-dal áll H-kötésben. Ez a kötés viszont már evolúciósan konzerváltnak tekinthető, amely ember esetében a 8316 és a 8332 nukleotidok között helyezkedik el (Campos és mtsai, 2000). A T8316C szubsztitúció az irodalomból myopathia, laktát acidózis és strokeszerű állapotok hátterében patogénként ismert (Campos és mtsai, 2000). Az általunk talált A8332G mutáció ezek alapján, az antikodon-kar első H-kötésének felbomlását eredményezi, amely következtében módosulhat az antikodon kar kettős hélixének a szerkezete, így a tRNS másodlagos térszerkezete. A dystoniás családban további polimorfizmusokra is fény derült a 9 bp deléció közelében, C8270T és A8347C szubsztitúciók is igazolódtak. A COII-tRNSLys közötti nem kódoló intergénikus (NC7) szakaszban talált C8270T szubsztitúciót egy ischaemiás szívbetegségben végzett átfogó vizsgálat polimorfizmusnak minősítette (Ruppert és mtsai, 2004). Később Gonzalez (2007) és Thangaraj (2008) vizsgálatai során ezt a mutációt a 9-bp-os delécióval együtt találták meg, és az M szubhaplocsoport determinánsának véleményezték. Coon és mtsai MitoChip resequencing array-el a 8347 nukleotid pozícióban egy bázis szubsztitúciót találtak, amely Alzheimer-kóros betegekben szignifikánsan magasabb arányban volt jelen, mint az egészséges kontroll személyekben (Coon és mtsai, 2006). Ez a mutáció a tRNSLys T-loop-jának katalitikus szegmensében, a tRNS 58. nt. pozícióban helyezkedik el, amely egyike a tRNS-ben elhelyezkedő invariáns purinoknak.

A transzláció során az aminoacil-transzferáz

bekötése során a tRNS T-loopjában, főként az 57. és 58. nt pozícióban kémiailag intakt nukleotidokat igényel. Ezen nukleotidokban, az enzim katalitikus helyén bekövetkező transzverziók jelentősen gátolják az aminoacil transzferáz működését (Li és Pickart, 1995). Visgálatainkban az A8347C szubsztitúciót a fenti család 3 tagján kívül még 15 betegben találtuk meg, míg az általunk vizsgált kontroll személyek esetében nem volt jelen. A vizsgált betegekben a tRNSLys és határoló régióiban talált eltérések mellett a többi tRNS, a proteinkódoló gének és a hipervariábilis régió (HVS1) szekvencia analízise során további 13 SNP is igazolódott (5.3. és 5.4. táblázat). A talált A8332G patogén szubsztitúción kívül további 2 aminosavcserét okozó, illetve 2 tRNS-ben elhelyezkedő un. nem szinonim polimorfizmus is igazolódott (T4216C, A8347C, T10463C,

68

C14520G). Lehtonen és mtsai sensoneurális hallásvesztés hátterében álló mtDNS szekvencia variációkat vizsgált. Vizsgálataik során a betegekben a mitokondriális genomban nagyobb számú eltérést találtak, mint az egészséges kontrollokban. A mi betegeinkben talált eltérések közül három szinonim szubsztitúció (9-bp-os deléció – nt. 8271-8280, G8697A, A11812G) és egy nem szinonimus polimorfizmus (T10463C) az általuk vizsgált betegekben is megtalálható volt (Lehtonen és mtsai, 2003), amely felveti annak lehetőségét, hogy ezen szekvencia variációk hajlamosíthatnak a sensoneurális hallásvesztés kialakulására. A dystoniás magyar család az ázsiai populációra jellemző B haplocsoportba tartozik. A honfoglaló magyarok csontjainak haplotípus elemzése azonban 70-ből csak 1 esetben találta meg a fenti haplotípust (Tömöry és mtsai, 2007), amely alapján nem biztos, hogy az általunk vizsgálat magyar család közvetlen rokonsági kapcsolatban van a honfoglaló magyarokkal. Összefoglalóan megállapíthatjuk, hogy az ázsiai antropológiai marker (9 bp deléció) jelenléte származhat a magyarság történelméből, de nem zárható ki azonos lokalizációjú rekurrens deléció megjelenése sem. A Taiwanban talált korrelációk és az általunk vizsgált esetek alapján feltételezzük, hogy a 9-bp-os deléció jelenléte az mtDNS hipervariábilis szegmensében a mitokondriális genom instabilitását eredményezi és hajlamosíthat patogén mutációk kialakulására is. A klasszikus A8344G MERRF mutációt 10 esetben, csak betegekben találtuk meg. Egy család esetében ehhez az A8347C mutáció és a G8251A polimorfizmus is társult, tüneteik azonban nem lettek súlyosabbak azoknál, ahol nem találtuk meg ezt a társuló SNP-t. Egy családban a D-loopban egymás mellett elhelyezkedő heteroplazmikus T8310G és T8311A mutációi súlyos pszichiátriai és enyhe neurológiai tünetegyütteseket okoztak. A T8311A mutáció H-híd kötésben van a dihidrouridin karban, így a transzverziók miatt a hurok megnagyobbodhat, illetve teljesen felbomolhat. Ennek következtében a tRNS konformációjában változás állhat be, amely az aminoaciláció zavarát vonhatja maga után. Feltételezzük, hogy a kifejezett pszichiátriai tüneteket a T8310G és T8311A mutációk együttes jelenléte eredményezi.

69

A fenti eltéréseken kívül a vizsgált régióban további öt polimorfizmust (G8251A, G8269A, C8270T, del. 8271-8280, G8292A) találtunk, amelyek mindegyike antropológiai markernek minősült. Vizsgálataink során három, az irodalomban eddig még le nem írt patogén mutációt azonosítottunk a korábban már leírt a MERRF szindróma hátterében jól ismert A8344G mutáció mellett. Új patogén mutációnak minősült a T8310G, a T8311A, és az A8332G szubsztitúció. Ezek a tRNSLys működéséhez fontos pozíciókban helyezkednek el, Hkötésben, illetve a riboszómakötő hurokban, konzervált pozíciókban. Megállapítottuk, hogy bizonyos mutációk hajlamosíthatnak más mtDNS rendellenességek kialakulására. Az egyes esetekben, a betegség hátterében társuló patogén mutációk hatását az egyébként nem patogén mutációk módosíthatják. Az mtDNS hipervariábilis szakaszai nem csak a klinikai genetikai diagnosztikában, de a populációgenetikai vizsgálatokban is fontosak, hiszen az általunk talált polimorfizmusok nagy része valamely haplotípust vagy szubhalpotípust jellemzi.

6.2. Az mtDNS A3243G mutáció genetikai epidemiológiai vizsgálata A neurológiai betegségek hátterében az mtDNS A3243G mutációjának előfordulási gyakoriságát Közép-Kelet Európában munkacsoportunk vizsgálta elsőként. A 631 beteg vizsgálata során 14 esetben (2,22%) tudtuk kimutatni a kérdéses szubsztitúciót. A mitokondriális betegségek összprevalenciáját egy spanyol tanulmány a 14 év feletti populációban relative magasnak találta (5.7:100.000) (Arpa és mtsai, 2003), ahol a diagnózist a klinikai tünetek mellett a morfológiai és molekuláris biológiai vizsgálati eredmények alapján állították fel. Az A3243G mutáció több közlemény szerint is az mtDNS betegségek közül a leggyakoribb előfordulású. Pang és mtsai (1999) vizsgálatai is ezt a feltételezést támasztják alá, ugyanis 177 mitokondriális betegből 32-nél találták meg ezt a mutációt, míg 18 esetben G11778A Leber-féle opticus neuropathiára jellemző mutáció, 17 esetben ún. „common” egyes nagy deléció, 9 esetben A8344G MERRF mutáció igazolódott.

A T8993C és T8993G mutációkat mindössze 1-1 Leigh-

szindrómás betegben írták le. Chinnery és mtsai. (2004) a patogén mitokondriális mutációk jelenlétét 1:8.000-re becsülte. A mitokondriális etiológiát a fiatalkori stroke szindrómákban Majamaa és mtsai 38 occipitalis területen lezajlott ischaemiás stroke-os

70

betegnél (18 és 45 év közötti populációban) összesen 2 esetben, azaz az esetek 5,26%ban talált A3243G mtDNS mutációt (Majamaa és mtsai, 1997). Az A3243G mutáció frekvenciája különböző országokban nagy variációt mutat, amely függ a vizsgálatba beválasztott betegek számától és a beválasztás kritériumától. A legtöbb tanulmány a mutáció előfordulását diabetes mellitusos betegekben vizsgálta (6.1. táblázat). Az A3243G mutációval rendelkező Beválasztási kritériumok betegek száma

Mutációs frekvencia

Vizsgált betegek száma

9.09 *

22

2

3.33

90

3.01

Ország

Irodalom

DM2

Horvátország

Martin-Kleiner és mtsai, 2004

3

DM

Kína

Wang és mtsai, 2009

133

4

DM2

Kína

Ng és mtsai, 2000

2.92

240

7

DM

Japén

Ohkubo és mtsai, 2001

2.61

115

3

Korai kezdetű DM

Svéd- és Lehto és mtsai, 1999 Finnország

2.03

148

3

DM1, DM2

Portugália

0.72

138

1

DM1

0.47

428

2

DM2

0.41

244

1

DM2

0.41

733

3

DM1, DM2, MIDD, hallásvesztés

0.07

1460

1

DM, hallásvesztés

0.00

129

0

0.00

184

0

Katalónia, Spanyolország Kína Kína Portugália

Salles és mtsai, 2007 Francisco és mtsai, 2005 Zhang és mtsai, 2004 Zhao és mtsai, 2006 Salles és mtsai, 2007

Németország

Klemm és mtsai, 2001

DM2

Lengyelország

Malecki és mtsai, 2001

DM2

Kína

Tang és mtsai, 2006

6.1. táblázat: Különböző országokban a mtDNA A3243G mutáció frekvenciájának megoszlása diabetes mellitusos és egyéb fenotípusú betegek körében (* Pilot study: szájnyálkahártyából izolált DNS mintákból, ** a betegszelekció a Mitochip microarray eredmények alapján történt)

71

Mutációs frekvencia

Vizsgált betegek száma

44.33 *

97

Az A3243G mutációval rendelkező Beválasztási kritériumok betegek száma

Ország

Irodalom

Wang és mtsai, 2008

43

Mitochondriális encephalomyopathia

Kína

Kórea

Kuba

RodrigezHernández és mtsai., 2000

22.35 *

85

19

Mitochondriális encephalomyopathia, psychomotoros meglassultság, cardiomyopathia, visszatérő stroke-like epizódok, sensorineural hallásvesztés, DM, vesebetegség

12.50 *

8

1

Mitokondriális encephalomyopathia, CPEO

Finnország

Majamaa és mtsai, 1998

Chae és mtsai, 2004

6.5

615

40

DM, sensoneuralis hallásvesztés, epilepsia, occipitalis stroke, CPEO, Intracraniális calcificatio, fehérállomány betegség, ataxia, hypertrophicus cardiomyopathia

6.17

1184

73

KSS, CPEO

Ausztrália

Marotta és mtsai, 2004

3.39

177

6

CPEO, DM

Taiwan

Pang CY és mtsai, 1999

3.45 **

29

1

Sensorineurális hallásvesztés

Franciaország

Léveque, 2007

1.74

230

4

Sensorineurális hallásvesztés

Japan

Nagata és mtsai, 2001

1.2

166

2

Mitochondriális encephalomyopathia

Franciaország

Sternberg és mtsai, 2001

0.81

124

1

Kína

Zhang és mtsai, 2007

0

128

0

Tunézia

MkaouarRebai és mtsai, 2007

0.00

52

0

Idiopathiás cardiomyopathia

UK

Turner és mtsai, 1998

0.00

265

0

Ataxia, SCA

Taiwan

Lee és mtsai, 2007

0.00

270

0

Insulin dependens DM

USA (NY)

Abad és mtsai, 1997

Leigh- betegség, Leigh-like szindróma Mitokondriális betegség MIDD, MELAS, MERRF, PEO, hypertrophiás cardiomyopathia, Leighszindróma

6.2. táblázat: Különböző országokban a mtDNA A3243G mutáció frekvenciájának megoszlása a mitokondriális betegek körében (* A betgek szelekciója az iombiopszia eredménye alapján történt, ** a betegszelekció a Mitochip microarray eredmények alapján történt)

72

Az irodalomból hat olyan tanulmány ismert, ahol a mutáció gyakoriságát multiszisztémás tünetekkel bíró mitokondriális fenotípusok hátterében vizsgálták, és a beválasztási kritériumoknál figyelembe vették a morfológiai eredményeket. A mutáció frekvenciája ezekben az esetekben 0% és 44,33% között volt (Mkaouar-Rebai és mtsai, 2007; Majamaa és mtsai, 1998; Wang és mtsai, 2008;

Sternberg és mtsai, 2001;

Rodrigez-Hernández és mtsai, 2000; Chae és mtsai, 2004). Vizsgálatunkhoz hasonló beválasztási kritériumot 3 munkacsoport alkalmazott. Az eredményeket összehasonlítva a finn népesség körében a mutáció előfordulása lényegesen nagyobb (6,5%) (Majamaa és mtsai, 1998), míg Franciaországban (1,2%) (Sternberg és mtsai, 2001) és Taiwanban (3,39%) (Pang és mtsai, 1999) a magyar népesség körében talált mutációs frekvencia értékekhez (2.22%) hasonló eredményt kaptak (6.2. táblázat). A közép-kelet európai régióban, Horvátországban közöltek egy előzetes (pilot) tanulmányt, amelyben a betegbeválasztási kritérium lényegesen eltért az általunk alkalmazottól, mert 22 maternálisan öröklődő 2-es típusú diabetes mellitusos betegen vizsgálták az A3243G mtDNS mutáció előfordulását (Martin Kleiner és mtsai., 2004). A vizsgált betegek közül kettőnél igazolódott a nukleotid szubsztitúció. Annak ellenére, hogy a tanulmány eredménye nem hasonlítható a mi vizsgálatainkhoz, figyelemre méltó, hogy a mutáció csak a buccalis nyálkahártyából izolált mtDNS mintán volt kimutatható, míg a vérből izolált DNS minta elemzése nem érzékelte annak jelenlétét. Ezek alapján, ha csak a vérből izolált DNS vizsgálati eredményét vennénk figyelembe, akkor a két mutációval rendelkező beteg mtDNS mutációja nem került volna felismerésre. Vizsgálataink során egy esetben az A3243G szubsztitúciót mi is csak izomszövetből tudtuk detektálni, a vérből az nem volt kimutatható. Ez a tény felveti annak lehetőségét, hogy a vérben levő igen alacsony szintű heteroplazmia arány (alacsony mutáns: vad mtDNS arány) miatt nem kerül a pontmutáció felismerésre. Ennek alapján a mutáció legbiztosabban posztmitotikus szövetből mutatható ki. A szájnyálkahártya sejtjei nem posztmitotikus sejtek, de ezek turnovere kisebb, mint a perifériás vér elemeinek turnovere, ami meggátolja a mutáció un. kimosódását, így posztmitotikus szövet hiányában ez is alkalmas lehet a mutáció analízisre. Gondolkodásunkban mind a MELAS szindróma, mind az annak hátterében álló leggyakoribb mtDNS mutáció, az A3243G szubsztitúció is, leginkább a fiatalkori stroke-kal kapcsolódik össze és a maternalis öröklődésű egyéb mitokondriális

73

betegségekre utaló tünetek, mint nagyothallás, ataxia, alacsony termet, endokrin zavarok, basalis ganglion meszesedés, diabetes mellitus már nem kapcsolódnak az mtDNS ezen nukleotidjának genetikai vizsgálatának lehetőségével. A finn adatokhoz képest az általunk vizsgált időszakban az A3243G mutáció előfordulása alacsonynak bizonyult. Nem zárható ki, hogy a finn népességben ténylegesen nagyobb a valószínűsége az mtDNS A3243G mutáció előfordulási gyakoriságának, de az egyéb európai molekuláris epidemiológiai vizsgálatok alapján ennek valószínűsége kicsi. Az A3243G mutáció frekvenciája nagymértékben függ a betegek szelekciójától (6.1. táblázat, 6.2. táblázat). Számos tanulmány a diabetes mellitusos betegekre fókuszál (6.1. táblázat). A kapott frekvencia értékek a különböző országokban nagy varianciát mutatnak. Eddig hat olyan tanulmány készült ahol a vizsgálatba a mitokondriális fenotípus széles palettáját vonták be. Ezekben az A3243G mutáció frekvenciája 0% és 44,33% között adódott (Wang és mtsai,

2008; Chae és mtsai,

2004; Rodrigez-

Hernández és mtsai., 2000; Majamaa és mtsai, 1998; Mkaouar-Rebai és mtsai, 2007; Sternberg és mtsai,

2001). Három tanulmányban a betegeket az izombiopszia

eredménye alapján előszűrték és csak azon betegeknél történt genetikai vizsgálat, akiknél az izombiopszia mitokondriális betegségre utaló morfológiai eltéréseket talált. Ezekben az esetekben a mutáció frekvenciája 12,5% és 44,33% között volt (Wang és mtsai, 2008; Chae és mtsai, 2004; Rodrigez-Hernández és mtsai., 2000). Hasonló betegbeválasztási

kritériumot

alkalmazva

Finnországban

lényegesen

magasabb

mutációs frekvencia értéket mutattak ki, míg Franciaországban és Taiwanban az A3243G mutáció frekvenciája az általunk kapott értékhez nagyon hasonló. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az A3243G mutáció epidemiológiai vizsgálatának eredménye, a kapott frekvencia érték nagyban függ a vizsgált betegek beválasztási kritériumától. Az általunk kapott 2,22%-os frekvencia egyéb országok adataival való összehasonlítás után nem különbözik. 6.1. Az apoptózist gátló génterápia in vitro PC12 hypoxiás modelljében talált eredmények értelmezése Az agyban az idegsejtek pusztulását a leggyakrabban az ischaemiás / hypoxiás jellegű károsodás idézi elő. Az agyi infarktus centrumában a szövetelhalás nekrotikus jellegű,

74

amely már korán kialakul, míg a marginális zónában, a penumbra területén az elsősorban apoptózis jellegű neuronpusztulás figyelhető meg (Broughton, 2009). In vitro rendszerekben az ischaemiás állapotok modellezésére gyakran alkalmaznak hypoxiás modelleket, mint pl. az argon-gáz hypoxiát (Reinhardt és mtsai, 2003; Andreeva és mtsai, 2000). Kísérleteinkben az adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL génbevitel hatását vizsgáltuk PC12 sejtvonalon in vitro argon gáz hypoxiás modellben. Az argon gáz hypoxia és az azt követő re-oxigenizáció csökkentette a mitokondrium membránpotenciált és apoptotikus sejtpusztulást okozott, amelyet az anti-apoptotikus gének bevitele gátolt. Emellett Bax génexpressziót a hypoxiás károsítás szignifikánsan emelte, amely szintén kivédhető volt a bevitt Bcl-2 és Bcl-XL anti-apoptotikus gének expressziójának fokozásával (Gal és mtsai, 2008; Gal és mtsai, 2009). A Bcl-2 és a Bcl-XL fehérjék megőrzik a mitokondrium membrán integritását, ezáltal megakadályozva a citokróm-c kiáramlását a cytosolba (Gollapudi és mtsai, 2003). A Bcl-2 fehérjecsalád több pro-apoptotikus tagja, mint például a Bax és a Bid, a hypoxia hatására aktiválódik (Saikumar és mtsai, 1998). Különböző apoptotikus hatásokra a Bax és a Bid transzlokálódik a mitokondriumba, ahol homo-oligomerizálódnak és pórusokat formálnak a mitokondrium membránjában, ezáltal elősegítik a citokróm-c kiáramlását (Saito és mtsai, 2000). A Bcl-2 család antiapoptotikus tagjai különböző hatásokkal szemben kivédik a mitokondrium membrán depolarizációját, illetve meggátolják a mitokondriális pórusokon keresztül a citokróm-c kiáramlását (Reed, 1998). Az utóbbi években az érdeklődés az agyi plaszticitás felé irányult. Egy microarray vizsgálat szerint, amelyet Liu és mtsai végeztek patkány MCAO modellben a subventricularis zóna progenitor sejtjei az MCAO után olyan géneket expresszálnak, amelyek az embrionális fejlődésre jellemzők (Liu és mtsai, 2007). Vizsgálataink során az agyi plaszticitás egyes folyamataiban, mint pl. az axono-, a neuro-, a szinaptogenesisben és a sejtosztódásban szerepet játszó egy-egy fehérje expresszióját vizsgáltuk. Vizsgálatainkban a Bcl-2 és a Bcl-XL génbevitel hatására mind normoxiában, mind hypoxiában a GAP-43 expresszió szignifikánsan nőtt. A GAP-43 egy savas, membránhoz kötött foszfoprotein (Jacobson és mtsai, 1986), amelynek expressziója a felnőttek központi idegrendszerében igen alacsony szintet mutat (De la Monte és mtsai,

75

1986). Fokozott GAP-43 figyelhető meg az egyedfejlődés során az axonogensis során (Kalil és Skene, 1989; Skene, 1989). A GAP-43 fehérje különböző agyi történések után megfigyelhető regenerációs fázisban reaktiválódik (Lalli és Hall, 2005; Bolognani és mtsai, 2006). A nestin egy intermedier filament fehérje, amely a neurogenesis során a proliferálódó és migráló sejteknek a markere. Az egyedfejlődés korai időszakában expresszálódik, de egyes patológiás folyamatok után is újraindukálódik (Michalczyk és Ziman, 2005). Vizsgálatainkban a Bcl-2 kezelést követően a nestin protein és génexpresszió szignifikánsan nőtt. A synapsin-1 egy neuronális foszfoprotein, amely a főként preszinaptikus vezikulák membránban helyezkedik el, de e mellett kimutatható mikrotubulusokban és a mikrofilamentumokban is. Pontos feladata jelenleg még nem ismert, feltételezett szereppel bír a szinaptikus vezikulák csoportosulásában és a neurotranszmitterek kiáramlásában (Petrucci és Morrow, 1987). A szinaptogenezisben szerepet játszó synapsin-1 expressziójának vizsgálata során normoxiás körülmények között a génexpresszió mind a Bcl-2, mind a Bcl-XL kezelés hatására szignifikánsan nőtt, míg protein szinten csak növekedési tendencia volt kimutatható. Argon gáz hypoxiát követően a synapsin-1 expresszió nem változott. Hypoxiát követően a c-fos mRNS és protein expresszió szignifikáns csökkenést mutatott, amelyet az anti-apoptózis gének bevitele normalizált. A fos fehérjék fontos szereppel bírnak a sejt osztódás szabályozásában, az apoptózisban és a sejtek differenciálódásában (Zhang és mtasi, 2002; Kalra és Kumar, 2004). A c-fos a neuronális aktivitás kimutatására gyakran használt marker (Chen és mtsai, 2003). Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL vektorok bevitele 1) kivédte az argon gáz hypoxia által okozott sejtpusztulást, 2) normalizálta a mitokondriális membrán potenciál értékét, valamint 3) fokozta az agyi plaszticitásban szerepet játszó GAP-43, nestin és c-fos expresszióját, amely arra enged következtetni, hogy a Bcl-2 és Bcl-XL bevitelt követően a neuro- és axonogenesis fokozódik. Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy az anti-apoptózis és a neuro – és axonogenesis útvonal összeköttetésben állhat, de a két szignalizáció közötti kapcsolat jelenleg még nem ismert.

76

7. KÖVETKEZTETÉSEK A mitokondrium neurodegenerációban és neuroprotekcióban betöltött szerepe vizsgálata során az alábbi következtetésekre jutottunk: I. A mitokondriális tRNSLys és határoló régióinak elemzése mitokondriális betegségekben 1. Az általunk vizsgált populációban a mtDNS tRNSLys és a megelőző hipervariábilis intergénikus szakasz genetikai variabilitása nagy. 2. Kilenc nukleotid szubsztitúciót és egy 9-bp-os deléciót találtunk, amelyből 4 patogén mutáció. A patogén mutációk közül hármat az irodalomban elsőként írtunk le. 3. A kelet-ázsiai antropológiai markert (9-bp-os deléció) elsőként találtuk meg a magyar populációban. A vizsgált magyar család az ősi B haplocsoporttal rendelkezik, amely szintén a kelet-ázsiai populációra jellemző. Ezen haplocsoport jelenléte a magyar populációban magyarázható a magyarság történelmével, de nem zárható ki ritka rekurrens mutáció kialakulásának lehetősége sem. II. Az mtDNS A3243G mutáció genetikai epidemiológiai elemzése A vizsgálat kohortban a mutáció 2,22 %-os előfordulási gyakorisága jól korrelál más európai országok eredményeivel, bár a kapott frekvencia érték nagyban függ a vizsgált betegek beválasztási kritériumától.

III. A mitokondrium neuroprotekcióban betöltött szerepének vizsglata 1. PC12 sejteken in vitro hypoxiás modellben az adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL vektorok bevitele •

kivédte az argon gáz hypoxia által okozott sejtpusztulást,

•

normalizálta a mitokondriális membrán potenciál értékét,

•

az agyi plaszticitásban szerepet játszó GAP-43, nestin és c-fos expresszióját fokozta, amely arra enged következtetni, hogy a Bcl-2 és Bcl-XL bevitelt követően a neuro- és axonogenesis fokozódik.

77

2. Az általunk használt hypoxiás modellben az anti-apoptózis és a neuro – és az axonogenesis útvonal összeköttetésben állhat, de a két szignalizáció közötti kapcsolat jelenleg pontosan még nem ismert.

78

8. ÖSSZEFOGLALÁS A

mitokondrium

működésének

zavara

számos

neurológiai,

pszichiátriai

és

belgyógyászati betegséget eredményezhet, amelyek klinikai tünetei sokszínűek lehetnek. Esetenként a fenotípust szinergisztikus polimorfizmusok befolyásolják. A mitokondriális diszfunkció jól ismert az agyi ischaemiás folyamatokban is, így működésének befolyásolása ezen kórképekben neuroprotektív hatású lehet. Munkánk során vizsgáltuk: 1.) 470 mitokondriális betegség gyanújával vizsgált páciensnél a tRNSLys gén és határoló régióinak genetikai variabilitását; 2.) 631 betegben a tRNSLeu

(UUR)

A3243G mutáció előfordulását a magyar népesség körében; 3.) PC12

sejtek in vitro hypoxiás modelljén az adenovírus alapú Bcl-2 és Bcl-XL anti-apoptotikus gének hatását a hypoxiás károsodás kivédésére. A tRNSLys és határoló régióinak vizsgálata során 3 új patogén mutációt (A8332G, T8310G és T8311A), valamint egy ismert patogén mutációt (A8344G), 5 polimorfizmust, egy antropológiai markert és egy feltehetően neurodegenerációra hajlamosító SNP-t (A8347C) találtunk. A mtDNS tRNSLeu (UUR) gén A3243G mutációját 5 nőben és 1 férfiban tudtuk kimutatni. A családi szegregációs vizsgálat során további 8 esetre derült fény, így a mutáció frekvenciája a vizsgált kohortban 2,22%. Az antiapoptotikus gének bevitele kivédte a hypoxia által okozott sejtpusztulást, valamint fokozta az agyi plaszticitásban szerepet játszó GAP-43, nestin és c-fos expressziót. Összességében elmondható, hogy 1.) az általunk vizsgált betegekben a tRNSLys gén és határoló régióinak genetikai variabilitása igen nagy; 2.) az A8332G heteroplazmikus mutáció és az A8347C, T10463C, C14520G nem-szinonim SNP-k szinergisztikus hatása dystoniát és stroke-szerű tüneteket okoz; 3.) a magyar populációban számos multiszisztémás kórkép hátterében igazoltuk az mtDNS A3243G szubsztitúció jelentőségét; 4.) az általunk használt hypoxiás modellben az anti-apoptózis valamint a neuro– és az axonogenesis útvonal összeköttetésben állhat, de a két szignalizáció közötti kapcsolat jelenleg pontosan még nem ismert.

79

9. SUMMARY Mitochondrial dysfunctions have been associated with a variety of clinical manifestations, including neurological, psychiatric and medical disorders. Occasionally the phenotype is modified by other polymorphisms synergistically. The key role of mitochondria in brain ischaemia is well established; therefore the influence of its function could be a beneficial neuroprotective therapeutic opportunity. In our work we investigated: 1) the genetic variability of the mtDNA tRNALys gene and its neighbouring regions in 470 patients suspected to have mitochondrial disease based on their clinical symptoms; 2) the frequency of the tRNSLeu(UUR) A3243G substitution among the Hungarian population with by examining 631 patients; 3) the effect of Bcl-2 and Bcl-XL antiapoptotic genes in reducing hypoxic impairment in PC12 cells in an in vitro hypoxic model. In the course of our investigation of mtDNA tRNALys we found one previously described (A8344G) and three novel pathogen mutations (A8332G, T8310G and T8311A), five polymorphisms and anthropological marker, and one putative susceptibility SNP for neurodegeneration (A8347C). Among 631 Hungarian patients the mtDNA A3243G mutation was found in 5 women and 1 man. The segregation analysis detected further 8 cases, therefore the mutation frequency in the investigated cohort was 2.22%. The delivery of anti-apoptotic genes can decrease hypoxic impairment and enhance the expression of brain plasticity proteins, namely GAP-43, nestin and c-fos. In summary, 1.) high genetic variability was found in the tRNALys gene and its neighbouring regions among our investigated patients; 2.) a heteroplasmic A8332G mutation was found in the background of dystonia and stroke-like symptoms where the synergistic effect of the A8347C, T10463C and C14520G non-synonymous mtDNA substitutions could also be observed; 3.) The mtDNS A3243G substitution was detected as the underlying cause of some multi-systematic, mitochondrial phenotypes in the Hungarian population; 4.) in our in vitro PC12 hypoxic model the mitochondrial antiapoptosis and cell plasticity pathways are linked, however the exact mechanism is not known exactly at the moment.

80

10. IRODALOMJEGYZÉK 1. Abad MM, Cotter PD, Fodor FH, Larson S, Ginsberg-Fellner F, Desnick RJ, Abdenur JE. (1997) Screening for the mitochondrial DNA A3243G mutation in children with insulin-dependent diabetes mellitus, Metabolism. 46: 445-449. 2. Akhtar RS, Ness JM, Roth KA. (2004) Bcl-2 family regulation of neuronal development and neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1644: 189-203. 3. Andreeva NA, Stel'mashuk EV, Isaev NK, Ostrovskaya RU, Gudasheva TA, Viktorov IV. (2000) Neuroprotective properties of nootropic dipeptide GVS111 in in vitro oxygen-glucose deprivation, glutamate toxicity and oxidative stress. Bull Exp Biol Med. 130: 969-972. 4. Arpa J, Cruz-Martínez A, Campos Y, Gutiérrez-Molina M, García-Rio F, PérezConde C, Martín MA, Rubio JC, Del Hoyo P, Arpa-Fernández A, Arenas J. (2003) Prevalence and progression of mitochondrial diseases: a study of 50 patients. Muscle Nerve. 28: 690-695. 5. Ashkenazi A. (2008) Targeting the extrinsic apoptosis pathway in cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 19: 325-331. 6. Barrientos A, Casademont J, Solans A, Moral P, Cardellach F, Urbano-Márquez A, Estivill X, Nunes V. (1995) The 9-bp deletion in region V of mitochondrial DNA: evidence of mutation recurrence. Hum Genet, 96: 225-228. 7. Beal MF. (2005) Mitochondria take center stage in aging and neurodegeneration. Ann Neurol. 58: 495-505. 8. Bernardi P, Scorrando L, Colona R, Petronlóilli V, Di LF (1999) Mitochondria and cell death. Eur J Biochem. 264: 687-701 9. Bindu LH, Reddy PP. (2008) Genetics of aminoglycoside-induced and prelingual non-syndromic mitochondrial hearing impairment: a review. Int J Audiol. 47: 702-707. 10. Boche D, Cunningham C, Gauldie J, Perry VH. (2003) Transforming growth factor-beta 1-mediated neuroprotection against excitotoxic injury in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 23: 1174-1182. 11. Bolognani F, Tanner DC, Merhege M, Deschenes-Furry J, Jasmin B, PerroneBizzozero NI. (2006) In vivo post-transcriptional regulation of GAP-43

81

mRNA by overexpression of the RNA-binding protein HuD. J Neurochem. 96: 790-801. 12. Brandstätter A, Parsons TJ, Parson W (2003). Rapid screening of mtDNA coding region SNPs for the identification of West European Caucasian haplogroups. Int J Legal Med. 117: 291-298. 13. Brenner C, Kroemer G. (2000) Apoptosis. Mitochondria--the death signal integrators. Science. 289: 1150-1151. 14. Broughton BR, Reutens DC, Sobey CG. (2009) Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40: 331-339. 15. Browne SE, Beal MF. (2006) Oxidative damage in Huntington's disease pathogenesis. Antioxid Redox Signal. 8: 2061-2073. 16. Brustovetsky N, Brustovetsky T, Purl KJ, Capano M, Crompton M, Dubinsky JM. (2003) Increased susceptibility of striatal mitochondria to calciuminduced permeability transition. J Neurosci. 23: 4858-4867. 17. Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, Luo X, Wang X. (1999) Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu Rev Cell Dev Biol. 15: 269-290. 18. Bykhovskaya Y, Mengesha E, Fischel-Ghodsian N. (2007) Pleiotropic effects and compensation mechanisms determine tissue specificity in mitochondrial myopathy and sideroblastic anemia (MLASA). Mol Genet Metab. 91: 148156. 19. Cain K. (2003) Chemical-induced apoptosis: formation of the Apaf-1 apoptosome, Drug Metab Rev. 35: 337-363 20. Campos Y, Lorenzo G, Martín MA, Torregrosa A, del Hoyo P, Rubio JC, García A, Arenas J. (2000) A mitochondrial tRNA(Lys) gene mutation (T8316C) in a patient with mitochondrial myopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes. Neuromuscular Disord. 10: 493-496. 21. Cardaioli E, Dotti MT, Hayek G, Zappella M, Federico A. (1999) Studies on mitochondrial pathogenesis of Rett syndrome: ultrastructural data from skin and muscle biopsies and mutational analysis at mtDNA nucleotides 10463 and 2835. J Submicrosc Cytol Pathol. 31: 301-304.

82

22. Cecchi C, Pensalfini A, Baglioni S, Fiorillo C, Caporale R, Formigli L, Liguri G, Stefani M. (2006) Differing molecular mechanisms appear to underlie early toxicity of prefibrillar HypF-N aggregates to different cell types. FEBS J. 273: 2206-2222. 23. Chae JH, Hwang H, Lim BC, Cheong HI, Hwang YS, Kim KJ. (2004) Clinical features of A3243G mitochondrial tRNA mutation, Brain Dev. 26: 459-462. 24. Chae JH, Stein GH, Lee JE. (2004) NeuroD: the predicted and the surprising. Mol Cells. 18: 271-288. 25. Chang YC, Shyu WC, Lin SZ, Li H. (2007) Regenerative therapy for stroke. Cell Transplant. 16: 171-181 26. Chen J, Zhang, ZG, Li, Y, Wang, Y, Wang, L, Jiang, H., Zhang, C., Lu, M., Katakowski, M., Feldkamp, C.S., Chopp, M. (2003) Statins induce angiogenesis, neurogenesis, and synaptogenesis after stroke. Ann. Neurol. 53: 743-751. 27. Chinnery PF, DiMauro S, Shanske S, Schon EA, Zeviani M et al. (2004) Risk of developing a mitochondrial DNA deletion disorder. Lancet. 364: 592-596. 28. Chopp M, Li Y, Zhang ZG. (1999) Protein expression and brain plasticity after transient middle cerebral artery occlusion in the rat. In: Ito U., Fieschi F., Kuroiwa T., Klatzo I. (Eds.), Maturation phenomenon in cerebral ischemia III Springer 29. Coon KD, Valla J, Szelinger S, Schneider LE, Niedzielko TL, Brown KM, Pearson

JV, Halperin R, Dunckley T, Papassotiropoulos A, Caselli RJ,

Reiman EM, Stephan DA. (2006) Quantitation of heteroplasmy of mtDNA sequence variants identified in a population of AD patients and controls by array-based resequencing. Mitochondrion. 6:194-210. 30. Cramer SC, and Chopp M. (2000) Recovery recapitulates ontogeny. Trends Neurosci., 23: 265-271. 31. De la Monte SM, Federoff HJ, Ng SC, Grabczyk E, Fishman MC. (1989) GAP43 gene expression during development: persistence in a distinctive set of neurons in the mature central nervous system. Brain Res Dev Brain Res. 46: 161-168.

83

32. Denes L, Szilágyi G, Gál A, Bori Z, Nagy Z. (2006) Cytoprotective effect of two synthetic enhancer substances, (-)-BPAP and (-)-deprenyl, on human brain capillary endothelial cells and rat PC12 cells. Life Sci. 79: 1034-1039. 33. Denes L, Szilágyi G, Gál A, Nagy Z. (2006) Talampanel a non-competitive AMPA-antagonist attenuates caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebral ischemia. Brain Res Bull. 70: 260-262. 34. Dimauro S, Davidzon G. (2005) Mitochondrial DNA and disease. Ann Med. 37: 222-232. 35. Dirienzo A, Wilson AC. (1991) Branching pattern in the evolutionary tree for human mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88: 1597-1601. 36. Dubois-Dauphin M, Pfister Y, Vallet PG, Savioz A. (2001) Prevention of apoptotic neuronal death by controlling procaspases? A point of view. Brain Res Brain Res Rev. 36: 196-203. 37. Ferrer I, Friguls B, Dalfo E, Justicia C, Planas AM. (2003) Caspase-dependent and caspase-independent signalling of apoptosis in the penumbra following middle cerebral artery occlusion in the adult rat. Neuropathol Appl Neurobiol. 29: 472-481. 38. Finkel E. (2001) The mitochondrion: is it central to apoptosis? Science. 292: 624-626. 39. Finsterer J. (2007) Genetic, pathogenetic, and phenotypic implications of the mitochondrial A3243G tRNALeu(UUR) mutation. Acta Neurol Scand. 116: 1-14. 40. Francisco G., Hernández C., Martínez R., García-Arumí E., Andreu A., Simó R. (2005) Prevalence of mitochondrial A3243G mutation in adult type 1 diabetic patients in Catalonia, Diabetes Metab. 31: 621-622. 41. Fucharoen G, Fucharoen S, Horai S. (2001) Mitochondrial DNA polymorphisms in Thailand. J Hum Genet. 6: 115-125. 42. Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Wappler EA, Safrany G, Skopal J, Nagy Z. (2009) Bcl-2 or bcl-XL gene therapy increases neural plasticity proteins nestin and c-fos expression in PC12 cells. Neurochem Int. 55: 349-353.

84

43. Gál A, Szabó A, Pentelényi K, Pál Z. (2008) Maternálisan öröklődő diabetes mellitus, nagyotthallás, krónikus ophthalmoplegia externa és myopathia mint az mtDNS A3243G mutáció következménye. Orvosi Hetilap. 149: 1593-1598. 44. Gal A, Szilagyi G, Wappler E, Safrany G, Nagy Z. (2008) Bcl-2 or Bcl-XL gene therapy reduces apoptosis and increases plasticity protein GAP-43 in PC12 cells. Brain Res Bull. 76: 349-353. 45. Gal A., Pentelenyi K, Remenyi V, Csanyi B, Tomory G, Rasko I, Molnar MJ. (2008) The coexistence of an East-Asian mitochondrial antropological marker and the C8270T, A8332C, and A8347G mtDNA mutations in a Hungarian family with dystonia and juvenile stroke syndrome. Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics. 16 Suppl. 2: 266-267 46. Gárdián G, Vécsei L. (2004) Huntington's disease: pathomechanism and therapeutic perspectives. J Neural Transm. 111: 1485-1494. 47. Gollapudi S., McCormick MJ., Gupta S. (2003) Change in mitochondrial membrane potential and mitochondria mass occur independent of the activation of caspase-8 and caspase-3 during CD95-mediated apoptosis in peripheral blood T cells. Int. J. Oncol. 22: 597-600. 48. González AM, Larruga JM, Abu-Amero KK, Shi Y, Pestano J, Cabrera VM. (2007) Mitochondrial lineage M1 traces an early human backflow to Africa. BMC Genomics. 8: 223. 49. Goto Yl, Nonaka I, Horai S. (1990) A mutáción in the tRNALeu (UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomiopathies. Nature. 348: 651-653. 50. Green DR, Reed JC. (1998) Mithocondria and apoptosis, Science. 281: 13091312. 51. Gross A, McDonnel JM, Korbmeyer SJ. (1999) BCL-2 family members and the mitochondria in apopoptosis, Genes Develop. 13: 1899-1911. 52. Gutiérrez M, Merino JJ, de Leciñana MA, Díez-Tejedor E. (2009) Cerebral protection, brain repair, plasticity and cell therapy in ischemic stroke. Cerebrovasc Dis. 27 Suppl 1: 177-186. 53. Gyllensten U, Wharton D, Josefsson A, Wilson AC (1991). Paternal inheritence of mitochondrial DNA in mice. Nature. 352: 255-257.

85

54. Hengartner MO. (2000) The biochemistry of apoptosis. Nature. 407: 770-776. 55. Hirooka Y, Sakai K, Kishi T, Ito K, Shimokawa H, Takeshita A. (2003) Enhanced depressor response to endothelial nitric oxide synthase gene transfer into the nucleus tractus solitarii of spontaneously hypertensive rats. Hypertens Res. 26: 325-331. 56. Hoehn B, Ringer TM, Xu L, Giffard RG, Sapolsky RM, Steinberg GK, Yenari MA. (2001) Overexpression of HSP72 after induction of experimental stroke protects neurons from ischemic damage. J Cereb Blood Flow Metab. 21: 13031309. 57. Horai S, Hayasaka K.(1990) Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondrial DNA. American Journal of Human Genetics. 46: 828-842. 58. Horai S, Murayama K, Hayasaka K, Matsubayashi S, Hattori Y, Fucharoen G, Harihara S, Park KS, Omoto K, Pan IH. (1996) mtDNA polymorphism in East Asian Populations, with special reference to the peopling of Japan. Am J Hum Genet. 59: 579-590. 59. Houshmand M, Larsson NG, Holme E, Oldfors A, Tulinius MH., Ersen O. (1994) Automatic sequencing of mitochondrial tRNA genes in patients with mitochondrial encephalomyopathy. Biochimica et Biophysica Acta. 1226: 4955. 60. Howell N, Kubacka I, Halvorson S, Howell B, Mccullough DA, Mackey D. (1995) Phylogenetic analysis of the mitochondrial genomes from Leber hereditary optic neuropathy pedigrees. Genetics. 140: 285-302. 61. Hsieh RH, Li JY, Pang CY, Wei YH. (2001) A novel mutation in the mitochondrial 16S rRNA gene in a patient with MELAS syndrome, diabetes mellitus, hyperthyroidism and cardiomyopathy. J Biomed Sci. 8: 328-335. 62. Inczedy-Farkas G, Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Balla P, Andrejkovics M, Molnar MJ. (2009) Familial depression associated with two novel T8310A and T8311G mtDNA mutations. 9th World Congress of Biological Psychiatry Paris, France

86

63. Jacobson RD., Virag I., Skene JH. (1986) A protein associated with axon growth, GAP-43, is widely distributed and developmentally regulated in rat CNS. J Neurosci. 6: 1843-1855. 64. Kalil K, Skene JH. (1986) Elevated synthesis of an axonally transported protein correlates with axon outgrowth in normal and injured pyramidal tracts. J Neurosci. 6: 2563-2570. 65. Kalra N, Kumar V. (2004). c-Fos is a mediator of the c-myc-induced apoptotic signaling in serum-deprived hepatoma cells via the p38 mitogen-activated protein kinase pathway. J. Biol. Chem. 279: 25313-25319. 66. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, Tanaka M, Nakai M, Sakaki T, Sugano S, Saito I. (1995) Efficient gene activation in mammalian cells by using recombinant adenovirus expressing site-specific Cre recombinase. Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821. 67. Kawauchi M, Suzuki J, Morishita R, Wada Y, Izawa A, Tomita N, Amano J, Kaneda

Y, Ogihara T, Takamoto S, Isobe M. (2000) Gene therapy for

attenuating cardiac allograft arteriopathy using ex vivo E2F decoy transfection by HVJ-AVE-liposome method in mice and nonhuman primates. Circ Res. 87: 1063-1068. 68. Kleinle S, Schneider V, Moosmann P, Brandner S, Krähenbühl S, LiechtiGallati S. (1998). A novel mitochondrial tRNA(Phe) mutation inhibiting anticodon stem formation associated with a muscle disease. Biochem Biophys Res Commun. 247: 112-115. 69. Klemm T, Neumann S, Trülzsch B, Pistrosch F, Hanefeld M, Paschke R. (2001) Search for mitochondrial DNA mutation at position 3243 in German patients with a positive family history of maternal diabetes mellitus. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 109: 283-287. 70. Klemm T, Neumann S, Trülzsch B, Pistrosch F, Hanefeld M, Paschke R. (2001) Search for mitochondrial DNA mutation at position 3243 in German patients with a positive family history of maternal diabetes mellitus. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 109: 283-287.

87

71. Komlósi K, Bene J, Havasi V, Tihanyi M, Herczegfalvi A, Móser J, Melegh B. (2004) Phenotypic variants of A3243G mitochondrial DNA mutation in a Hungarian family. Orv Hetil. 145: 1805-1809. 72. Komlósi K, Kellermayer R, Maász A, Havasi V, Hollódy K, Vincze O, Merkli H, Pál E, Melegh B. (2005) Maternally inherited deafness and unusual phenotypic manifestations associated with A3243G mitochondrial DNA mutation. Pathol Oncol Res. 11: 82-86 73. Köhrmann M, Jüttler E, Huttner HB, Nowe T, Schellinger PD. (2007) Acute stroke imaging for thrombolytic therapy--an update. Cerebrovasc Dis. 24: 161169. 74. Kroemer G. (2003) Mitochondrial control of apoptosis: an introduction. Biochem Biophys Res Commun. 304: 433-435. 75. Kumai Y, Ooboshi H, Kitazono T, Takada J, Ibayashi S, Fujishima M, Iida M. (2003) Brain ischemia augments exo-focal transgene expression of adenovirus-mediated gene transfer to ependyma in hypertensive rats. Exp Neurol. 184: 904-911. 76. Kuwana T, Newmeyer DD. (2003) Bcl-2-family proteins and the role of mitochondria in apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 15: 691-699. 77. Lahermo P, Sajantila A, Sistonen P, Lukka M, Aula P, Peltonen L, Savontaus ML (1996) The genetic relationship between the Finns and the Finnish Saami (Lapps): analysis of nuclear DNA and mtDNA. American Journal of Human Genetics. 58: 1309-22. 78. Lalli G, Hall A. (2005) Ral GTPases regulate neurite branching through GAP-43 and the exocyst complex. J Cell Biol. 171: 857-869. 79. Lawrence MS, Sun GH, Kunis DM, Saydam TC, Dash R, Ho DY, Sapolsky RM, Steinberg GK. (1996) Overexpression of the glucose transporter gene with a herpes simplex viral vector protects striatal neurons against stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 16: 181-185. 80. Lee Y.C., Lu Y.C., Chang M.H., Soong B.W. (2007) Common mitochondrial DNA and POLG1 mutations are rare in the Chinese patients with adult-onset ataxia on Taiwan. J. Neurol. Sci. 254: 65-68.

88

81. Lehto M, Wipemo C, Ivarsson SA, Lindgren C, Lipsanen-Nyman M, Weng J, Wibell L, Widén E, Tuomi T, Groop L. (1999) High frequency of mutations in MODY and mitochondrial genes in Scandinavian patients with familial earlyonset diabetes. Diabetologia. 42: 1131-1137. 82. Lehtonen MS, Moilanen JS, Majamaa K. (2003) Increased variation in mtDNA in patients with familial sensorineural hearing impairment. Hum Genet. 113: 220-227. 83. Lévêque M, Marlin S, Jonard L, Procaccio V, Reynier P, Amati-Bonneau P, Baulande S, Pierron D, Lacombe D, Duriez F, Francannet C, Mom T, Journel H, Catros H, Drouin-Garraud V, Obstoy MF, Dollfus H, Eliot MM, Faivre L, Duvillard C, Couderc R, Garabedian EN, Petit C, Feldmann D, Denoyelle F. (2007) Whole mitochondrial genome screening in maternally inherited nonsyndromic hearing impairment using a microarray resequencing mitochondrial DNA chip. Eur J Hum Genet. 15: 1145-1155. 84. Lévêque M, Marlin S, Jonard L, Procaccio V, Reynier P, Amati-Bonneau P, Baulande S, Pierron D, Lacombe D, Duriez F, Francannet C, Mom T, Journel H, Catros H, Drouin-Garraud V, Obstoy MF, Dollfus H, Eliot MM, Faivre L, Duvillard C, Couderc R, Garabedian EN, Petit C, Feldmann D, Denoyelle F. (2007) Whole mitochondrial genome screening in maternally inherited nonsyndromic hearing impairment using a microarray resequencing mitochondrial DNA chip. Eur. J. Hum. Genet. 15: 1145-1155. 85. Levinger L, Morl M, Florentz C. (2004) Mitochondrial tRNA 3' end metabolism and human disease. Nucleic Acids Research, 32: 5430-5441. 86. Li J, Pickart CM.(1995) Inactivation of arginyl-tRNA protein transferase by a bifunctional arsenoxide: identification of residues proximal to the arsenoxide site. Biochemistry. 34: 139-147. 87. Liu CS, Cheng WL, Chen YY, Ma YS, Pang CY, Wei YH. (2005) High prevalence of the COII/tRNA(Lys) intergenic 9-bp deletion in mitochondrial DNA of Taiwanese patients with MELAS or MERRF syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1042: 82-87.

89

88. Liu, J., Yin, F., Zheng, X., Jing, J., Hu, Y. (2007) Geniposide, a novel agonist for GLP-1 receptor, prevents PC12 cells from oxidative damage via MAP kinase pathway. Neurochem Int. 51: 361-369. 89. Lorenz JG, Smith DG. (1994) Distribution of the 9-bp mitochondrial DNA region V deletion among North American Indians. Human Biology. 66: 777788. 90. Love S. (2003) Apoptosis and brain ischaemia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 27: 267-282. 91. Löffler M. (1987) Restimulation of cell cycle progression by hypoxic tumour cells with deoxynucleosides requires ppm oxygen tension. Exp Cell Res. 169: 255-261. 92. Majamaa K, Moilanen JS, Uimonen S, et al. (1998) Epidemiology of A3243G, the mutáción for mitochondrial encepalooomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes: prevalence of the mutáción in an adult population. Am J. Hum Genet. 63: 447-454 93. Majamaa K, Turkka J, Kärppä M, Winqvist S, Hassinen IE. (1997) The common MELAS mutation A3243G in mitochondrial DNA among young patients with an occipital brain infarct. Neurology. 49:1331-1334. 94. Małecki M, Klupa T, Wanic K, Frey J, Cyganek K, Sieradzki J. (2001) Search for mitochondrial A3243G tRNA(Leu) mutation in Polish patients with type 2 diabetes mellitus, Med Sci Monit. 7: 246-250. 95. Mancuso M, Nesti C, Petrozzi L, Orsucci D, Frosini D, Kiferle L, Bonuccelli U, Ceravolo R, Murri L, Siciliano G. (2008) The mtDNA A8344G "MERRF" mutation is not a common cause of sporadic Parkinson disease in Italian population. Parkinsonism Relat Disord. 14: 381-382. 96. Marotta R, Chin J, Quigley A, Katsabanis S, Kapsa R, Byrne E, Collins S. (2004) Diagnostic screening of mitochondrial DNA mutations in Australian adults 1990-2001. Intern. Med. J. 34: 10-19. 97. Martin-Kleiner I, Pape-Medvidović E, Pavlić-Renar I, Metelko Z, Kusec R, Gabrilovac J, Boranić M. (2004) Pilot study of mitochondrial DNA point mutation A3243G in a sample of Croatian patients having type 2 diabetes mellitus associated with maternal inheritance, Acta Diabetol. 41: 179-184.

90

98. Matsushita K, Matsuyama T, Kitagawa K, Matsumoto M, Yanagihara T, Sugita M. (1998) Alterations of Bcl-2 family proteins precede cytoskeletal proteolysis in the penumbra, but not in infarct centres following focal cerebral ischemia in mice. Neuroscience. 83: 439-448. 99. Mattiazzi M, D'Aurelio M, Gajewski CD, Martushova K, Kiaei M, Beal MF, Manfredi G. (2002) Mutated human SOD1 causes dysfunction of oxidative phosphorylation in mitochondria of transgenic mice. J Biol Chem. 277: 2962629633. 100. Mattson MP, Duan W, Pedersen WA, Culmsee C. (2001) Neurodegenerative disorders and ischemic brain diseases., Apoptosis. 6: 69-81. 101. Michalczyk K, Ziman M. (2005) Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organisation. Histol. Histopathol. 20: 665-671. 102. Mkaouar-Rebai E, Tlili A, Masmoudi S, Belguith N, Charfeddine I, Mnif M, Triki C, Fakhfakh F. (2007) Mutational analysis of the mitochondrial tRNALeu(UUR) gene in Tunisian patients with mitochondrial diseases, Biochem. Biophys. Res. Commun. 355:1031-1037. 103. Molnar MJ, Perenyi J, Siska E, Nemeth G, Nagy Z. (2009) The typical MERRF (A8344G) mutation of the mitochondrial DNA associated with depressive mood disorders. J Neurol. 256: 264-265. 104. Molnar MJ: Further Mitochondrial Cytopathies, Encyclopedia of Molecular Medicine, Ed. F. Lehmann-Horn, Springer, 2008, in press 105. Moraes CT, Ciacci F, Bonilla E, Jansen C, Hirano M, Rao N, Lovelace RE, Rowland LP, Schon EA, DiMauro S. (1993). Two novel pathogenic mitochondrial DNA mutations affecting organelle number adn protein synthesis. J. Clin. Invest. 92: 2906-2915. 106. Morais Cardoso S, Swerdlow RH, Oliveira CR. (2002) Induction of cytochrome c-mediated apoptosis by amyloid beta 25-35 requires functional mitochondria. Brain Res. 931: 117-125. 107. Nagata H, Kumahara K, Tomemori T, Arimoto Y, Isoyama K, Yoshida K, Konno A. (2001) Frequency and clinical features of patients with sensorineural hearing loss associated with the A3243G mutation of the mitochondrial DNA in otorhinolaryngic clinics. J. Hum. Genet. 46: 595-599.

91

108. Nagy Z, Simon L, Nemes Z. (2002) Apoptózis jelentősége az agyi ischaemiás szövetkárosodások kialakulásában. In.: Apoptózis. Szerk. Kopper L, Fésüs L, Medicina 109. Nakamura, Y.. Wakimoto. H.. Abe. J., Kanegae, Y.. Saito. I., Aoyagi, M., Hirakawa. K.. and Hamada. H. (1994) Adoptive immunotherapy with murine tumor specific T lymphocytes engineered to secrete interleukin-2. Cancer Res. 54: 5757-5760. 110. Ng MC, Yeung VT, Chow CC, Li JK, Smith PR, Mijovic CH, Critchley JA, Barnett AH, Cockram CS, Chan JC. (2000) Mitochondrial DNA A3243G mutation in patients with early- or late-onset type 2 diabetes mellitus in Hong Kong Chinese, Clin. Endocrinol. (Oxf).52: 557-564. 111. Niizuma K, Endo H, Chan PH. (2009) Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemic neuronal death and survival. J Neurochem. 109: 133-138. 112. Nishida T, Ueno H, Atsuchi N, Kawano R, Asada Y, Nakahara Y, Kamikubo Y, Takeshita A, Yasui H. (1999) Adenovirus-mediated local expression of human tissue factor pathway inhibitor eliminates shear stress-induced recurrent thrombosis in the injured carotid artery of the rabbit. Circ Res. 84: 1446-1452. 113. Nunomura A, Honda K, Takeda A, Hirai K, Zhu X, Smith MA, Perry G. (2006) Oxidative damage to RNA in neurodegenerative diseases. J Biomed Biotechnol. 2006: 82323. 114. Ohara N, Koyama H, Miyata T, Hamada H, Miyatake SI, Akimoto M, Shigematsu H. (2001) Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in a rabbit model of hind limb ischemia. Gene Ther. 8: 837-845. 115. Ohkubo K, Yamano A, Nagashima M, Mori Y, Anzai K, Akehi Y, Nomiyama R, Asano T, Urae A, Ono J. (2001) Mitochondrial gene mutations in the tRNA(Leu(UUR)) region and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan, Clin. Chem. 47: 1641-1648.

92

116. Ohkuma H, Parney I, Megyesi J, Ghahary A, Findlay JM. (1999) Antisense preproendothelin-oligoDNA therapy for vasospasm in a canine model of subarachnoid hemorrhage. J Neurosurg. 90: 1105-1114. 117. Ono S, Date I, Onoda K, Shiota T, Ohmoto T, Ninomiya Y, Asari S, Morishita R. (1998) Decoy administration of NF-kappaB into the subarachnoid space for cerebral angiopathy. Hum Gene Ther. 9: 1003-1011. 118. Pang CY, Huang CC, Yen MY, Wang EK, Kao KP, Chen SS, Wei YH. (1999) Molecular epidemiologic study of mitochondrial DNA mutations in patients with mitochondrial diseases in Taiwan. J Formos Med Assoc. 98: 326-334. 119. Petrozzi L, Ricci G, Giglioli NJ, Siciliano G, Mancuso M. (2007) Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27: 87-104. 120. Petrucci TC, Morrow JS. (1987) Synapsin I: an actin-bundling protein under phosphorylation control. J. Cell Biol. 105: 1355-1363. 121. Putcha GV, Johnson EM Jr. (2004) Men are but worms: neuronal cell death in C elegans and vertebrates. Cell Death Differ. 11: 38-48. 122. Rade JJ, Schulick AH, Virmani R, Dichek DA. (1996) Local adenoviralmediated expression of recombinant hirudin reduces neointima formation after arterial injury. Nat Med. 2: 293-298. 123. Raff M. (1998) Cell suicide for beginners. Nature. 396: 119-122. 124. Reed JC. (1998) Bcl-2 family proteins. Oncogene. 17: 3225-3236. 125. Reinhardt R, Manaenko A, Guenther A, Franke H, Dickel T, Garcia de Arriba S, Muench G, Schneider D, Wagner A, Illes P. (2003) Early biochemical and histological alterations in rat corticoencephalic cell cultures following metabolic damage and treatment with modulators of mitochondrial ATP sensitive potassium channels. Neurochem Int. 43: 563-571. 126. Rieder MJ, Taylor SL, Tobe VO, Nickerson DA (1998). Automating the identification of DNA variations using quality-based fluorescence resequencing: analysis of the human mitochondrial genome. Nucleic Acids Research. 26: 967-973. 127. Rieder MJ, Taylor SL, Tobe VO, Nickerson DA. (1998) Automating the identification of DNA variations using quality-based fluorescence re-

93

sequencing: analysis of the human mitochondrial genome. Nucleic Acids Research. 26: 967-973. 128. Rodríguez-Hernández M, Hirano M, Arrieta T, Lestayo Z, Estrada R, Santiesteban R, Guerra-Badía R, Galarraga J, Gutierres J, Hechevarría E, Andreu A, Montoya J, DiMauro S. (2000) Molecular studies in Cuban patients with progressive external ophthalmoplegia. Rev. Neurol. 30: 1001-1005. 129. Ruppert V, Nolte D, Aschenbrenner T, Pankuweit S, Funck R, Maisch B. (2004) Novel point mutations in the mitochondrial DNA detected in patients with dilated cardiomyopathy by screening the whole mitochondrial genome. Biochem Biophys Res Commun. 318: 535-543. 130. Saikumar P., Dong Z., Weinberg JM., Venkatachalam MA. (1998) Mechanisms of cell death in hypoxia/reoxygenation injury. Oncogene. 17: 3341-3349. 131. Saito M., Korsmeyer SJ., Schleinger PH. (2000) BAX-dependent transport if cytochrome c reconstituted in pure liposomes, Nat. Cell Biol. 2: 553-555. 132. Salles J.E., Kalinin L.B., Ferreira S.R., Kasamatsu T., Moisés R.S. (2007) Diabetes mellitus associated with the mitochondrial mutation A3243G: frequency and clinical presentation, Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. 51: 559565. 133. Salles J.E., Kasamatsu T.S., Dib S.A., Moisés R.S. (2007) Beta-cell function in individuals

carrying the mitochondrial tRNA leu (UUR) mutation.

Pancreas. 34: 133-137. 134. Salles JE, Kalinin LB, Ferreira SR, Kasamatsu T, Moisés RS. (2007) Diabetes mellitus associated with the mitochondrial mutation A3243G: frequency and clinical presentation. Arq Bras Endocrinol Metabol. 51: 559-565. 135. Satoh M, Perkins E, Kimura H, Tang J, Chun Y, Heistad DD, Zhang JH. (2002) Posttreatment with adenovirus-mediated gene transfer of calcitonin gene-related peptide to reverse cerebral vasospasm in dogs. J Neurosurg. 97: 136-142. 136. Schaefer AM, Taylor RW, Turnbull DM, Chinnery PF. (2004) The epidemiology of mitochondrial disorders--past, present and future. Biochim Biophys Acta. 1659: 115-120.

94

137. Schapira AH. (2009) Neurobiology and treatment of Parkinson's disease. Trends Pharmacol Sci. 30: 41-47. 138. Schepers A, Eefting D, Bonta PI, Grimbergen JM, de Vries MR, van Weel V, de Vries CJ, Egashira K, van Bockel JH, Quax PH. (2006) Anti-MCP-1 gene therapy inhibits vascular smooth muscle cells proliferation and attenuates vein graft thickening both in vitro and in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26: 2063-2069. 139. Schwartz M, Vissing J. (2003) New patterns of inheritance in mitochondrial disease. Biochem Biophys Res Commun. 310: 247-251. 140. Sharp FR, Lu A, Tang Y, Millhorn DE. (2000) Multiple molecular penumbras after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 20: 1011-1032. 141. Shimamura M, Sato N, Oshima K, Aoki M, Kurinami H, Waguri S, Uchiyama Y, Ogihara T, Kaneda Y, Morishita R. (2004) Novel therapeutic strategy to treat brain ischemia: overexpression of hepatocyte growth factor gene reduced ischemic injury without cerebral edema in rat model. Circulation. 109: 424431. 142. Shimamura M, Sato N, Oshima K, Aoki M, Kurinami H, Waguri S, Uchiyama Y, Ogihara T, Kaneda Y, Morishita R. (2004) Novel therapeutic strategy to treat brain ischemia: overexpression of hepatocyte growth factor gene reduced ischemic injury without cerebral edema in rat model. Circulation. 109: 424431. 143. Shimazaki K, Urabe M, Monahan J, Ozawa K, Kawai N. (2000) Adenoassociated virus vector-mediated bcl-2 gene transfer into post-ischemic gerbil brain in vivo: prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronal death. Gene Ther. 7: 1244-1249. 144. Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang CC, Gearing M, Salvo R. (1993) Mitochondrial DNA variants observed in Alzheimer disease and Parkinson disease patients. Genomics. 17: 171-184. 145. Shoffner JM, Lott MT, Lezza AM, Seibel P, Ballinger SW, Wallace DC (1990). Myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease (MERRF) is

95

associated with a mitochondrial DNA tRNA (Lys) mutation. Cell, 61: 931937. 146. Shoubridge E, Molnar MJ (2002). Oxydative phosphorylation defects in structural and molecular basis of skeletal muscle diseases. International Society of Neuropathology and World Federation of Neurology, Ed. G Karpati; 202 -213. 147. Simon L, Szilágyi G, Bori Z, Orbay P, Nagy Z. (2001) (-)-D-Deprenyl attenuates apoptosis in experimental brain ischaemia. Eur J Pharmacol. 430: 235-241. 148. Simon L, Szilágyi G, Bori Z, Telek G, Magyar K, Nagy Z. (2005) Low dose () deprenyl is cytoprotective: it maintains mitochondrial membrane potential and eliminates oxygen radicals. Life Sci. 78: 225-231. 149. Skene JH. (1989) Axonal growth-associated proteins. Annu Rev Neurosci. 12: 127-156. 150. Soodyall H, Vigilant L, Hill AV, Stoneking M, Jenkins T. (1996) mtDNA control-region sequence variation suggests multiple independent origins of an "Asian-specific" 9-bp deletion in sub-Saharan Africans. Am J Hum Genet. 58: 595-608. 151. Sorenson CM. (2004) Bcl-2 family members and disease. Biochim Biophys Acta. 1644: 169-177. 152. Stavrovskaya IG, Kristal BS. (2005) The powerhouse takes control of the cell: is the mitochondrial permeability transition a viable therapeutic target against neuronal dysfunction and death?. Free Radic Biol Med. 38: 687-697. 153. Sternberg D, Chatzoglou E, Laforêt P, Fayet G, Jardel C, Blondy P, Fardeau M, Amselem S, Eymard B, Lombès A. (2001) Mitochondrial DNA transfer RNA gene sequence variations in patients with mitochondrial disorders. Brain. 124: 984-994. 154. Sternberg D, Chatzoglou E, Laforêt P, Fayet G, Jardel C, Blondy P, Fardeau M, Amselem S, Eymard B, Lombès A. (2001) Mitochondrial DNA transfer RNA gene sequence variations in patients with mitochondrial disorders, Brain. 124: 984-994.

96

155. Szilágyi G, Simon L, Wappler E, Magyar K, Nagy Z. (2009) (-)Deprenyl-Noxide, a (-) deprenyl metabolite, is cytoprotective after hypoxic injury in PC12 cells, or after transient brain ischemia in gerbils. J Neurol Sci. Mar 28. 156. Tang DL, Zhou X, Li X, Zhao L, Liu F. (2006) Variation of mitochondrial gene and the association with type 2 diabetes mellitus in a Chinese population, Diabetes Res. Clin. Pract. 73: 77-82. 157. Taylor RW, Turnbull DM (2005). Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6: 389-402. 158. Thangaraj K, Chaubey G, Kivisild T, Selvi Rani D, Singh VK, Ismail T, Carvalho-Silva D, Metspalu M, Bhaskar LV, Reddy AG, Chandra S, Pande V, Prathap, Naidu B, Adarsh N, Verma A, Jyothi IA, Mallick CB, Shrivastava N, Devasena R, Kumari B, Singh AK, Dwivedi SK, Singh S, Rao G, Gupta P, Sonvane V, Kumari K, Basha A, Bhargavi KR, Lalremruata A, Gupta AK, Kaur G, Reddy KK, Rao AP, Villems R, Tyler-Smith C, Singh L. (2008) Maternal footprints of Southeast Asians in North India. Hum Hered. 66: 1-9. 159. Thangaraj K, Sridhar V, Kivisild T, Reddy AG, Chaubey G, Singh VK, Kaur S, Agarawal P, Rai A, Gupta J, Mallick CB, Kumar N, Velavan TP, Suganthan R, Udaykumar D, Kumar R, Mishra R, Khan A, Annapurna C, Singh L. (2006) Different population histories of the Mundari- and Mon-Khmer-speaking Austro-Asiatic tribes inferred from the mtDNA 9-bp deletion/insertion polymorphism in Indian populations. Hum Genet. 116: 507-517. 160. Thomas MG, Cook CE, Miller KW, Waring MJ, Hagelberg E. (1998) Molecular instability in the COII-tRNA(Lys) intergenic region of the human mitochondrial genome: multiple origins of the 9-bp deletion and heteroplasmy for expanded repeats. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353: 955-965. 161. Torroni A, Cruciani F, Rengo C, Sellitto D, López-Bigas N, Rabionet R, Govea N, López De Munain A, Sarduy M, Romero L, Villamar M, del Castillo I, Moreno F, Estivill X, Scozzari R. (1999) The A1555G mutation in the 12S rRNA gene of human mtDNA: recurrent origins and founder events in families affected by sensorineural deafness. Am J Hum Genet. 65: 1349-58. 162. Toyoda K, Chu Y, Heistad DD. (2003) Gene therapy for cerebral vascular disease: update 2003. Br J Pharmacol. 139: 1-9.

97

163. Tömöry G, Csányi B, Bogácsi-Szabó E, Kalmár T, Czibula A, Csosz A, Priskin K, Mende B, Langó P, Downes CS, Raskó I. (2007) Comparison of maternal lineage and biogeographic analyses of ancient and modern Hungarian populations. Am J Phys Anthropol. 134: 354-368. 164. Turner L.F., Kaddoura S., Harrington D., Cooper J.M., Poole-Wilson P.A., Schapira A.H., (1998) Mitochondrial DNA in idiopathic cardiomyopathy. Eur. Heart J. 19: 1725-1729. 165. Twiddy D, Brown DG, Adrain C, Jukes R, Martin SJ, Cohen GM, MacFarlane M, Cain K. (2004) Pro-apoptotic proteins released from the mitochondria regulate the protein composition and caspase-processing activity of the native Apaf-1/caspase-9 apoptosome complex. J Biol Chem. 279: 19665-19682. 166. van der Walt JM, Dementieva YA, Martin ER, Scott WK, Nicodemus KK, Kroner CC, Welsh-Bohmer KA, Saunders AM, Roses AD, Small GW, Schmechel DE, Murali Doraiswamy P, Gilbert JR, Haines JL, Vance JM, Pericak-Vance MA. (2004) Analysis of European mitochondrial haplogroups with Alzheimer disease risk. Neurosci Lett. 365: 28-32. 167. Vona G, Falchi A, Moral P, Calò CM, Varesi L. (2005) Mitochondrial sequence variation in the Guahibo Amerindian population from Venezuela. Am J Phys Anthropol. 127: 361-369. 168. Wang CL, Li F, Hou QZ, Li HZ, Zhang Y, Ning G. (2009) Analysis of mitochondrial DNA

gene tRNALeu(UUR) A3243G mutation in diabetic

pedigrees, Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 26: 74-77. 169. Wang ZX, Luan XH, Zhang Y, Yang YL, Qi Y, Bu DF, Yuan Y. (2008) Mitochondrial DNA mutation analysis in 97 Chinese patients with mitochondrial cephalomyopathy. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 88: 3254-3256 170. Wei YH, Lee HC. (2002) Oxidative stress, mitochondrial DNA mutation, and impairment of antioxidant enzymes in aging. Exp Biol Med. 227: 671-682. 171. Wiedemann FR, Bartels C, Kirches E, Mawrin C, Wallesch CW. (2008) Unusual presentations of patients with the mitochondrial MERRF mutation A8344G. Clin Neurol Neurosurg. 110: 859-863. 172. Wong LJ. (2007) Pathogenic mitochondrial DNA mutations in protein-coding genes. Muscle Nerve. 36: 279-293.

98

173. www.mitomap.org 174. Yamaguchi M, Zhou C, Heistad DD, Watanabe Y, Zhang JH. (2004) Gene transfer of extracellular superoxide dismutase failed to prevent cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 35: 25122517. 175. Yang GY, Pang L, Ge HL, Tan M, Ye W, Liu XH, Huang FP, Wu DC, Che XM, Song Y, Wen R, Sun Y. (2001) Attenuation of ischemia-induced mouse brain injury by SAG, a redox-inducible antioxidant protein. J Cereb Blood Flow Metab. 21: 722-733. 176. Yang GY, Zhao YJ, Davidson BL, Betz AL. (1997) Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist in the mouse brain reduces ischemic brain injury. Brain Res. 751: 181-188. 177. Yao YG, Watkins WS, Zhang YP. (2000) Evolutionary history of the mtDNA 9-bp deletion in Chinese populations and its relevance to the peopling of east and southeast Asia. Hum Genet, 107: 504-512. 178. Yenari MA, Minami M, Sun GH, Meier TJ, Kunis DM, McLaughlin JR, Ho DY, Sapolsky RM, Steinberg GK. (2001) Calbindin d28k overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia. Stroke. 32: 1028-1035. 179. Yenari MA, Sapolsky RM. (2005) Gene therapy in neurological disease. Methods Mol Med. 104: 75-88. 180. Yuan J. (2009) Neuroprotective strategies targeting apoptotic and necrotic cell death for stroke. Apoptosis. 14: 469-477. 181. Zhang XY, Zhang SL, Ke BS, Jiang ZS, Sun R. (2004) Study on mitochondrial DNA gene tRNA(Leu(UUR)) A3243G mutation in type 2 diabetes mellitus. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 21: 168-170. 182. Zhang Y, Yang YL, Sun F, Cai X, Qian N, Yuan Y, Wang ZX, Qi Y, Xiao JX, Wang XY, Zhang YH, Jiang YW, Qin J, Wu XR. (2007) Clinical and molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh or Leigh-like syndrome. J. Inherit. Metab. Dis. 30: 265. 183. Zhang, J, Zhang D, McQuade JS, Behbehani M, Tsien, J.Z., Xu, M. (2002) cfos regulates neuronal excitability and survival. Nat. Genet. 30: 416-420.

99

184. Zhao J, Ji JZ, Wang DW, Zhang J, Wu HJ, Lu JX. (2006) Detecting of mtDNA mutations at position A3243G and G3316A in patients with type 2 diabetes mellitus in Wenzhou. Yi Chuan. 28: 1206-1212. 185. Zoldhelyi P, McNatt J, Xu XM, Loose-Mitchell D, Meidell RS, Clubb FJ Jr, Buja LM, Willerson JT, Wu KK. (1996) Prevention of arterial thrombosis by adenovirus-mediated transfer of cyclooxygenase gene. Circulation. 93: 10-17.

100

11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 11.1. Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Gal A, Szilagyi G, Wappler E, Safrany G, Nagy Z. (2008) Bcl-2 or Bcl-XL gene therapy reduces apoptosis and increases plasticity protein GAP-43 in PC12 cells. Brain Res Bull. 76: 349-353. (Impakt faktor: 2,281) 2. Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Wappler EA, Safrany G, Skopal J, Nagy Z. (2009) Bcl-2 or bcl-XL gene therapy increases neural plasticity proteins nestin and c-fos expression in PC12 cells. Neurochem Int. 55: 349-353. (Impakt faktor: 3,228) 3. Gál A, Szabó A, Pentelényi K, Pál Z. (2008) Maternálisan öröklődő diabetes mellitus, nagyotthallás, krónikus ophthalmoplegia externa és myopathia mint az mtDNS A3243G mutáció következménye. Orvosi Hetilap. 149: 1593-1598. 11.2. Az értekezés témájában megjelent idézhető absztraktok 1. Gal A, Szilagyi G, Wappler E, L. Denes L, Nagy Z: Adenovirus contaning Bcl-2 or Bcl-XL antiapoptosis genes reduce cell loss after hypoxia in PC12 cell culture (2006) Europen Stroke Congress, Brussels, Cerebrovascular Diseases, Vol. 21, Suppl. 4: 83. 2. Gál A, Szilágyi G,. Wappler EA, Bori Z, Skopál J, Nagy Z. (2007) Bcl-2 and Bcl-XL genes therapy increases plasticity and cell cycle genes expression after hypoxia in PC12 cells. 16th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases. 23, Suppl. 2: 59. 3. Gal A., Pentelenyi K, Remenyi V, Csanyi B, Tomory G, Rasko I, Molnar MJ. (2008) The coexistence of an East-Asian mitochondrial antropological marker and the C8270T, A8332C, and A8347G mtDNA mutations in a Hungarian family with dystonia and juvenile stroke syndrome. (2008) Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 16 Suppl. 2, 266267 4. Inczedy - Farkas G, Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Balla P, Andrejkovics M, Molnar MJ. (2009) Familial depression associated with two novel T8310G and T8311A mtDNA mutations, 9th World Congress of Biological Psychiatry, 28

101

June - 02 July, Paris, France. World Federation of Societies of Biological Psychitary, DOI 10.3284/wfsbp.2009.1, 343. 5. Molnar MJ, Pentelenyi K, Remenyi V, Pal Z, Bereznai B, Gal A. (2009) The clincal importance of variability of tRNALYs and its neighbouring mtDNA sequence. Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: 69-70.

11.3. Nem az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Gal A, Siska E, Nagy Z, Karpati G, Molnar MJ: Challenges for the genetic screening in dysferlin deficiency - report of an instructive case. (2008) Clinical Neuropathology. 27: 289-295. (Impakt faktor: 1,2) 2. Gál A, Nagy Z. (2005) A génterápia, mint a neuroprotekció új lehetősége. Agyérbetegségek. 11: 2-8. 3. Denes L, Szilágyi G, Gál A, Nagy Z: Talampanel a non-competetive AMPA antagonist attenuates Caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebralbischemia, Brain Res Bull, 2006; 70:260-262 (Impakt faktor: 1,684) 4. Denes L, Szilagyi G, Gal A, Bori Z, Nagy Z. Cytoprotective effect of two synthetic enhancer substances, (-)-BPAP and (-)-Deprenyl, on human brain capillary endothelial cells and rat PC12 cells, Life Sci., 2006; 79:1034-1039 (Impakt faktor: 2,389) 5. Nagy Z, Bori Z, Gál A, Wappler E. Új célok az agyi ischaemia gyógyszeres kezelésében, Orvosképzés, 2007. LXXXII évf. 1. szám 11-18 6. Wappler EA, Szilagyi G, Gal A, Skopal J, Nyakas C, Nagy Z, Felszeghy K. Adopted cognitive tests for gerbils: Validation by studying ageing and ischemiaAdopted cognitive tests for gerbils: Validation by studying ageing and ischemia, Physiology & Behavior, 2009; 97(1):107-114.

(Impakt faktor:

2,806) 7. Pál Z, Kiss E, Gál A, Csépány T, Lengyel A, Molnar MJ. Genetically determined neuropathy (CMT 1A) accompanied by immune dysfunction: a case

102

report. Inflamm Res. 2009 Mar 10 - DOI 10.1007/s00011-009-0025-7, In press (Impakt faktor: 1,457) 8. Vannay A, Fekete A, Langer R, Tóth T, Sziksz E, Vásárhelyi B, Szabó AJ, Losonczy G, Adori C, Gál A, Tulassay T, Szabó A. Dehydroepiandrosterone pre-treatment alters the ischemia/reperfusion induced VEGF, IL-1 and IL-6 gene expression in acute renal failure, Kidney & Blood Pressure Research, inPress (Impakt faktor: 1,268)

11.4. Nem az értekezés témájában megjelent idézhető absztraktok 1. Denes L, Szilágyi G, Gal A, Nagy Z. (2006) Talampanel, a non-competitive AMPA antagonist attenuates Caspase-3 dependent apoptosis in mouse brain after transient focal cerebral ischemia. 15th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases, Vol. 21, Suppl. 4: 80. 2. Dénes L, Gál A, Szilágyi G, Bori Z, Miklya I, Nagy Z. (2006) Pharmacological attenuation of apoptosis of human brain capillary endothelial cell by (-)BAP in a model of hypoxia / reoxygenation. 15th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases. 21, Suppl. 4: 83. 3. Dénes L, Bori Z, Szilágyi G, Gál A, Nagy Z. (2005) A new neuroprotective drug candidate prevents cell injury induced by hypoxia/reoxygenation (by Benzofuran- propilaminopentan/BPAP), 14th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases, 19, Suppl. 2. 4. Wappler EA, Gal A, Szilagyi G, Vajda J, Skopal J, Felszeghy K, Nyakas C, Nagy Z. (2007) Effect of high-dose oestrogen therapy on cerebral plasticity after transient forebrain ischaemia in gerbil. 16th Europen Stroke Congress, Cerebrovascular Diseases. 23, Suppl. 2: 56. 5. Molnar MJ, Gilbert R, Gal A, Karpati G. (2009) Sonoporation of human biceps muscle as preparation for plasmid-based dystrophin gene transfer. American Academy of Neurology, AAN 61st Annual Meeting Neurology. 72 (Suppl. 3): 306-307 6. Pal Z, Gal A, Remenyi V, Pentelenyi K, Molnar MJ. (2009) No association of oestrogen receptor dene polymorphisms with myasthenia gravis. Europen

103

Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: 251 7. Gal A, Mede K, Remenyi V, Wiess S, Goelnitz U, Molnar MJ. (2009) Synergistic effect of spastin gene mutations in a Hungarian patient with hereditary spastic paraplegia (HSP). Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: 327. 8. Pentelenyi K, Gal A, Wiess S, Friday D, Molnar MJ. (2009) Novel point mutations in the senotaxin gene of three patient with ataxia and oculomotor apraxia type 2 (AOA2). Europen Human Genetics Conference, European Journal of Human Genetics, 17 Suppl. 2: 327. 11.5. Egyéb előadások, poszterek 1. Gál A, Szilágyi G, Wappler E, Dénes L, Nagy Z. (2005) Neurális és agyi kapilláris endothél sejtek hypoxia érzékenysége és kezelésének lehetőségei. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, VII. Ph.D. Tudományos Napok 2. Gál A, Simon L, Nagy Z. (2005) A génterápia lehetőségei adenovírus bevitellel, Magyar Ideg- és Elmeorvosok Társaságának Szakcsoport Ülése, 2005 május 3. Gál A. (2004) A retinsav és származékainak hatása lymphoma sejtvonalakon, Semmelweis Egyetem Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, 2004 4. Gál A, Szilágyi G, Wappler E, Dénes L, Nagy Z. (2005) Adenovírus alapú Bcl2 és Bcl-XL antiapoptózis génterápia in vitro PC12 hypoxiás modellben, Magyar Ideg- és Elmeorvosok Társaságának Nagygyűlése, 2005 5. Gál A, Pentelényi K, Reményi V, Bori Z, Raskó I, Nagy Z, Molnár MJ. (2007) Az mtDNS C8270T és A8347C szubsztitúciók és a nt 8272-8281-deléció együttes jelenléte egy magyar családban, IX. Ph.D. Tudományos Napok, 2007 6. GáL A, Szilágyi G, Skopál J, Nagy Z. (2007) Bcl-2 és Bcl-XL génbevitel hatása a neuronális plaszticitásban szerepet játszó mRNS és protein expresszióra, IX. Ph.D. Tudományos Napok, 2007 7. Gál A, Mede K, Báthori G, Pentelényi K, Reményi V, Valikovics A, Nagy Z, Molnár MJ. (2007) Thrombocyta membrán glikoprotein receptor polimorfizmus

104

hatás vizsgálata fiatalkori ischaemiás stroke szindrómában és TIA-ban. VII Magyar Stroke Kongresszus, 2007 8. Reményi V, Gál A, Báthori G, Pentelényi K, Bori Z, Molnár MJ. (2007) Patogén mitokondriális mutációk együttes jelenlétének következménye: Alzheimer kór és stiffman syndroma. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence, 2007. szeptember 7-8. 9. Pentelényi K, Gál A, Csányi B, Tömöry G, Báthori G, Reményi V, Raskó I, Nagy Z, Molnár MJ. (2007) Kelet-ázsiai antropológiai marker és a tRNSLys gén többszörös szubsztitúciójának együttes jelenléte egy magyar családban. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence, 2007. szeptember 7-8. 10. Báthori G, Gál A, Molnár MJ. (2007) Perifériás Myelin Protein 22 (PMP22) deléció/duplikáció kimutatása real-time PCR metodikával. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence, 2007. szeptember 7-8. 11. Mede K, Gál A, Nagy Z, Molnár MJ. (2007) A spastin gén mutációk szinergisztikus hatása herediter spasticus paraplegias (HSP) betegünkben. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence, 2007. szeptember 7-8. 12. Gál A, Valikovics A, Mede K, Báthori G, Pentelényi K, Reményi V, Nagy Z, Molnár MJ. (2007) Thrombocyta membrán glikoprotein receptor polimorfizmus hatás vizsgálata fiatalkori ischaemiás stroke szindrómában és TIA-ban, A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence, 2007. szeptember 7-8. 13. Valikovics A, Gál A, Semjén J, Lukács T, Molnár MJ. (2007) A mitochondriális DNS típusos MERRF mutációja (A8344G) típusos MELAS hátterében. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence 14. Wappler E, Gál A, Szilágyi G, Skopál J, Felszeghy K, Nyakas C, Nagy Z. (2007) Nagydózisú ösztogén hatása az agyi plaszticitásra tranziens ischaemiát követően különböző életkorú mongóliai ugróegérben. A Magyar Klinikai

105

Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence 15. Szilágyi G, Gál A, Wappler E, Skopál J, Magyar K, Nagy Z. (2007) Deprenil és metabolitjai a neuroprotekcióban. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence 16. Perényi J, Pávics L, Illés Z, Gál A, Nagy F, Molnár MJ. (2007) Új senataxin mutáció következményében kialakuló oculomotorius ataxiával járó ataxia 2 typusának (AOA) klinikai és neuroradiológiai jellemzői. A Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Kongresszusa – Neurogenetika a klinikai gyakorlatban - Velence. 17. Gál A, Valikovics Mede K, Báthori G, Pentelényi K, Reményi V, Nagy Z, Molnár MJ. (2007) Thrombocyta membrán glikoprotein receptor polimorfizmus hatás vizsgálata fiatalkori ischaemiás stroke szindrómában és TIA-ban. A Magyar Thrombosis és Haemostasis Társaság IX. Kongresszusa, Alsópáhok 18. Wappler EA, Gal A, Szilagyi G, Vajda J, Skopal J, Felszeghy K, Nyakas C, Nagy Z. (2007) Effect of oestrogen treatment on cerebral plasticity after transient forebrain ischaemia in female gerbils. Fourth annual meeting of The Global College of Neuroprotection and Neuroregeneration, GarmischPartenkirchen, Germany 19. Gál A, Komlósi K, Maász A, Pentelényi K, Reményi V, Óváry C, Valikovics A, Diószeghy P, Bereczki D, Melegh B, Molnár MJ. (2008) A mitokondriális DNS A3243G szubsztitúció előfordulása a magyar népesség körében. X. Ph.D. Tudományos Napok, 2008 20. Gál A, Pentelényi K, Reményi V, Csányi B, Tömöry G, Raskó I, Molnár MJ. (2008) Az mtDNS C8270T és A8347C szubsztitúciók és a nt 8272-8281-deléció együttes jelenléte egy magyar családban. Magyar Humángenetikai Társaság VII. Kongresszusa, Pécs 21. Gál A, Pentelényi K, Reményi V, Báthori G, Molnár MJ. (2008) A mitochondrialis tRNSLys gén és határoló régióinak jelentősége a mitochondriális betegségek pathogenesisében. Semmelweis Egyetem Genomikai Hálózat - SE Neurológiai Klinika Molekuláris Neurológiai Központjának bemutatkozása, 2008. október 1.

106

22. Valikovics A, Vastag I, Gál A, Semjén J, Lovász R, Molnár MJ. (2008) A mitochondrialis DNS típusos MERRF mutációja (A8344G) juvenilis stroke hátterében. Semmelweis Egyetem Genomikai Hálózat - SE Neurológiai Klinika Molekuláris Neurológiai Központjának bemutatkozása, 2008. október 1. 23. Reményi V, Gál A, Valikovics A, Mede K, Báthori G, Pentelényi K, Nagy Z, Molnár MJ. (2008) Thrombocyta membran glycoprotein receptor polimorfizmus hatás vizsgálata fiatalkori ischaemiás stroke szindrómában és TIA-ban. Semmól/Lelweis Egyetem Genomikai Hálózat - SE Neurológiai Klinika Molekuláris Neurológiai Központjának bemutatkozása, 2008. október 1. 24. György I, Bíró A, Mechler F, Gál A, Molnár MJ. (2008) Herediter nyomásérzékeny neuropathia (HNPP), Semmelweis Egyetem Genomikai Hálózat - SE Neurológiai Klinika Molekuláris Neurológiai Központjának bemutatkozása, 2008. október 1. 25. Mede K, Gál A, Nagy Z, Molnár MJ. (2008) A spastin gén mutációk szinergisztikusus hatása herediter spasticus paraplegiában (HSP). Semmelweis Egyetem Genomikai Hálózat - SE Neurológiai Klinika Molekuláris Neurológiai Központjának bemutatkozása, 2008. október 1. 26. Perényi J, Gál A, Illés Z, Pávics L, Nagy F, Molnár MJ. (2008) Új senetaxin mutatio következtében kialakuló oculomotorius ataxiával járó ataxia 2 typusának (AOA2) klinikai és neuroradiológiai jellemzői, Semmelweis Egyetem Genomikai Hálózat - SE Neurológiai Klinika Molekuláris Neurológiai Központjának bemutatkozása, 2008. október 1. 27. Gal A, Wappler EA, Szilagyi G, Remenyi V, Safrany G, Skopal J, Nagy Z. (2008) Pr-39 gene transfer reduces apoptosis in a gerbil model of transient global brain ischaemia. A possible relationship between pr-39 and bcl-2 genes in neuroprotection. XVII. International, Semmelweis Symposium, Budapest 28. Gál A, Arányi Z, Rudas G, Reményi V, Molnár MJ. (2008) Egy évtizedes rejtély megoldása. Magyar Klinikai Neurogenetikai Társaság Konferenciája, Eger, 29. Gal A, Pentelenyi K, Remenyi V, Wappler EA, Skopal J, Nagy Z. (2009) Bcl-2 or Bcl-XL gene therapy increeases neural plasticity proteins nestin, c-fos and synapsin-1 expresion in PC12 cells. A Magyar Idegtudományi Társaság XII. konferenciája, Budapest

107

30. Gál A, Pentelényi K, Reményi V, Báthori G, Molnár MJ. (2009) A mitochondrialis tRNSLys gén és határoló régióinak jelentősége a mitochondriális betegségek pathogenesisében. A mitochondriális betegségek diagnosztikája, klinikuma és terápiája, Tudományos Ülés, Visegrád

108

12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretném köszönetet kifejezni témavezetőimnek, Nagy Zoltán professzor úrnak és Dr. Molnár Mária Juditnak, akik minden segítséget megadtak és irányt mutattak a kutatásokban és a molekuláris genetikai diagnosztikában. Maximális köszönet jár az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet Sejtbiológaia Laboratóriumának és a SEMolekuláris Neurológiai Központ munkatársainak (Dr. Skopál Juditnak, Lantos Tibornének, Badar Bélánénak, Oroszné Tóth Katalinnak, Báthori Györgyinek, Markó Mariannak, Sáry Mónikának, Magyarósi Szilviának, Stralendorff Mettának) Köszönöm a segítséget PhD hallgató társaimnak Dr. Szilágyi Gézának, Dr. Wappler Edinának, Pentelényi Klárának, Dr. Pál Zsuzsannának, és Dr. Inczédy-Farkas Gabriellának. Külön köszönetet szeretnék kifejzni a transzdukciós munkákhoz nyújtott segítségért Dr. Sáfrány Gézának, a haplotipizálásért Dr. Raskó Istvánnak és munkacsoportjának, valamint az epidemiogiai vizsgálatokban a mintagyűjtésért Dr. Melegh Bélának, Dr. Diószeghy Péternek, Dr. Valikovics Attilának és Dr. Bereczki Dánielnek.

109