Ph.D. értekezés
A mátrix metalloproteáz-9 muködése és változása a malignus tumorokban
Dr. Babó István
Témavezeto: Dr. Jeney András Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Onkológiai Program I. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet
BUDAPEST - 2005
TARTALOMJEGYZÉK
Tartalomjegyzék
Oldalszám Címlap……………………………………………………………………………...1 Tartalomjegyzék……………………………………………………………….….2 Bevezetés…………………………………………………………………………...3-11 A mátrix metalloproteázok rövid jellemzése...................….......…...3-10 A mátrix metalloproteázok szerepe a malignus progresszióban……10-11 Vizsgálataink célja és tárgya................................................………………...…...12 Anyag és módszer…………………………………………………………….…...13-21 Eredmények………………………………………………...……………………..22-65 I.
A mátrix metalloproteáz-2 és -9 aktivitás emberi vastagbél daganatokban……………..…………………….……….…..22-32
II.
A mátrix metalloproteáz-9 szerepe az immunszuppresszált egérbe oltott szájüregi bazaloid laphámrák invazív növekedésében ………….……………...33-51
III.
A mátrix metalloproteáz-9 expresszió és a sejtproliferáció kapcsolata HT1080 sejttenyészetben ………………………52-57
IV.
Melphalánhoz kapcsolt kollagén eredetu peptidek citosztatikus hatásának vizsgálata…………..……………. .58-66
V.
Antiszenz oligonukleotid hatása HT1080 humán fibrosarcoma sejtek mátrix metalloproteáz-9 termelésére és invazív növekedésére………………..……....67-76
Megbeszélés ……………………………..……………………………………...…77-86 Az értekezés fobb megállapításai…………………………………………………87 Köszönetnyílvánítás……………………………………………………………….88 Irodalom…………………………………………………………………….……...89-100 Rövidítések ………………………………………………………………………101
2
BEVEZETÉS
Bevezetés A mátrix metalloproteázok rövid jellemzése Az emberi szervezetet felépíto fehérjék közel egyharmadát a kollagének teszik ki, amelyek jelentos szerepet játszanak többek között a sejtek közötti állomány – az extracelluláris mátrix (ECM) - kialakításában, valamint az egyes sejtpopulációk elhatárolásában (bazál membrán). Az ECM folyamatos megújulását és átalakulását lebontó enzimek, a mátrix metalloproteázok (MMP) teszik lehetové. Az ECM megváltozott anyagcseréje, fokozott lebontása fontos szerepet játszik számos patológiai folyamatban. A daganatkutatásban különös figyelmet kapott a tumorsejtek vándorlását akadályozó bazálmembrán, ill. ennek egyik alkotóelemének, a kollagén IV-nek a lebontása. Ezek az ismeretek vezettek a kollagént bontó enzimek szélesköru tanulmányozásához annak reményében, hogy ezek eredményeképpen újabb diagnosztikai és terápiás eszközök bevezetése várható [1]. A mátrix metalloproteázok (MMP) cink- függo endopeptidázok, amelyek részt vesznek az ECM lebontásában a normál szövetek átrendezodésekor, az embrionális fejlodés idején, a sebgyógyuláskor és az angiogenezis folyamán [1, 2]. A MMP-k nagy családja magába foglalja a kollagenázokat, stromelizint, zselatinázt, MT-MMP-ket és a matrilizint, amelyeket a sejtek széles köre termel és szekretál fiziológiás körülmények között pontosan szabályozva. Az MMP-k enzimatikus aktivitását a szövetekben a TIMP család tagjai (t issue inhibitor of matrix metalloprotease), míg a keringo vérben az α2makroglobulin gátolják. A MMP-kat szabályozó mechanizmusok hibái súlyos szöveti károsodásokat okoznak. A mátrix metalloproteázok kutatásának elso eredményeit Gross és Lapiere szolgáltatta 1962-ben, akik kimutatták, hogy a natív fibrilláris kollagénbol eloállított gél enzimekkel bontható [3]. Azóta ezeknek az enzimeknek egész családját azonosították több fajban - a hidrától az emberig – és közösen mátrix metalloproteázoknak (MMP) nevezték el oket. A mátrix metalloproteáz családnév egyrészt abból adódik, hogy a MMP enzimek katalitikus muködéséhez fém ion szükséges, másrészt abból a képességükbol, hogy az ECM fehérjéit képesek bontani. A gerincesekben azonosított 25 MMP közül 22 mutat homológiát az emberben található kollagént bontó enzimekkel [4, 5, 6]. Ezeken kívül számos nem gerincesbol származó MMP-t is leírtak: envelizin [7], a Caenorhabditis 3
BEVEZETÉS
elegans MMP-k, mint a C31, H19 és Y19 [8], a Drosophila MMP [9], a hidra MMP [10], a szójabab levél metalloendopeptidáz-1 [11], az Arabidopsis thaliana MMP [12], a zöld alga MMP [13]. A gerincesekbol származó mátrix metalloproteázokat a 1. táblázat mutatja.
1. táblázat A gerinces fajokból izolált mátrix metalloproteázok Sternlicht § Werb után [14] MMP jelzése
Szokványos elnevezés
Domain szerkezet tipusa
MMP1
Kollagenáz-1
B
MMP2
Zselatináz A
C
MMP3
Stromelizin-1
B
MMP7
Matrilizin
A
MMP8
Kollagenáz-2
B
MMP9
Zselatináz B
C
MMP10
Stromelizin-2
B
MMP11
Stromelizin-3
D
MMP12
Makrofág metalloelasztáz
B
MMP13
Kollagenáz-3
B
MMP14
MT1-MMP
E
MMP15
MT2-MMP
E
MMP16
MT3-MMP
E
MMP17
MT4-MMP
F
MMP18
Kollagenáz-4 (Xenopus)
B
MMP19
RASI-1
B
MMP20
Enamelizin
B
MMP21
XMMP (Xenopus)
G
MMP22
CMMP (csirke)
B
MMP23
-
H
MMP24
MT5-MMP
E
MMP25
MT6-MMP
F
MMP26
Endomeáz, Matrilizin-2
A
MMP27
-
B
MMP28
Epilizin
D
Mivel a gerincesekbol származó MMP-k egységesen a Gly-Ile peptidkötés helyén bontják a kollagént, ezért munkánkban a kollagenáz és mátrix metalloproteáz kifejezéseket egymás szinonímájaként használjuk. A MMP-k részt vesznek patológiai folyamatokban is, mint például a tumor invázió és metasztázis [15 a, b], a gyomorfekély, az izületi gyulladások, a májfibrózis, a 4
BEVEZETÉS
foggyökérhártya gyulladás [16], a csontfelszívódás [17], a tüdogyulladás, a vesegyulladás [18], a hasnyálmirigy gyulladás, az aorta degeneratív elváltozásai [19], stb. A sokféle biológiai folyamatban résztvevo MMP-k különbözhetnek egymástól szerkezetükben, funkciójukban, lokalizációjukban, szubsztrát specifitásukban, molekulasúlyukban és szabályozásukban.
A mátrix metalloproteázok szerkezetének fobb jellemzoi A MMP-k funkcióját fehérje szerkezetük határozza meg. Ebben a rövid összefoglalóban elsosorban az enzimek domén szerkezetét mutatjuk be Sternlicht és Werb [14] felosztása alapján (1. ábra). A mátrix metalloproteázok szerkezetét vizsgálva a fehérje szabad aminocsoportot tartalmazó vége felol a karboxilcsoportot tartalmazó vége felé haladva a következo doméneket különítették el. Az elso az un. szignál szekvencia (Pre) még a sejten belül lehasad az enzimrol, majd az enzim ezután szekretálódik. A szignál szekvenciát a propeptid domén (Pro) követi, ami fenntartja az enzim inaktív állapotát mindaddig, amíg le nem hasad az enzimrol vagy a térbeli elrendezodése meg nem változik (pl.:kiegyenesedik). Ezt követi a katalitikus domén, ami tartalmazza a konzervatív cink-köto régiót; leggyakoribb aminosavsorrendje: HEF/LGHS/ALGLXHS. A félkövér betuk a mindig jelenlévo aminosavakat jelölik [20]. A katalitikus domén úgy biztosítja a hasítási hely specifikusságát, hogy az aktív centrumon belül - egy un. belso zsebben - specifikusan megköti a megbontandó peptidkötés melletti aminosavat. [21]. Az MMP-7, MMP-23 és az MMP-26 kivételével mindegyik MMP tartalmaz hemopexin / vitronektin-szeru domént, ami az un. csukló régión keresztül kapcsolódik a katalitikus doménhez. Az MMP-7-ben és -26-ban egyszeruen hiányzik ez a domén, míg az MMP-23-ban egy cisztein/prolin gazdag, az IL-1 II típusú receptorához hasonló domén található a hemopexin domén helyén [22, 23].
A jelenlévo hemopexin domén kihat az enzim TIMP és szubsztrát kötésére,
membránon történo aktiválódására és néha még a proteolítikus aktivitására is [24, 25].
5
BEVEZETÉS
1.ábra A mátrix metalloproteázok domén szerkezete Sternlicht & Werb után [14]
Pre – szignál szekvencia; Pro – propeptid szabad cink-köto tiol (SH) csoporttal; F – furin érzékeny hely; Zn – cink-köto hely; II – kollagén-köto II típusú fibronektin inzert; H – csukló régió; TM – transzmembrán domén; C – citoplazmatikus farok rész; GPI – Glikofoszfatidil inozitol köto domén; C/P – cisztein/prolin gazdag, IL-1 receptor-szeru domén. A hemopexin/vitronectin-szeru doménben négyszer ismétlodik ugyanaz a szekvencia. A legegyszerubb domén szerkezetu MMP-k az A csoportba tartoznak: MMP7/matrilizin, MMP26/endomeáz. A B csoportba a Hemopexin domént is tartalmazó MMP-kat sorolták: MMP1/kollagenáz-1, MMP-8/kollagenáz-2, MMP-13/kollagenáz-3, MMP-18/kollagenáz-4, MMP-3/stromelizin-1, MMP-10/stromelizin-2, MMP-27, MMP-12/metalloelasztáz, MMP-19/RASI-1, MMP-20/enamelizin, MMP22/CMMP. A C csoport a zselatint köto MMP-kat foglalja magába: MMP-2/zselatináz-A, MMP-9/zselatinázB. A D csoport azokat a MMP-kat tartalmazza, amelyek a Furin által már intracellulárisan aktíválódnak és ebben az aktív állapotukban szekretálódnak: MMP-11/stromelizin-3, MMP-28/epilizin. Az E csoportba transzmembrán MMP-k tartoznak: MMP-14/MT1-MMP, MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-24/MT5-MMP. Az F csoportba a GPI-vel összekötött MMP-kat sorolták: MMP-17/MT4-MMP, MMP-25/MT6-MMP. A G csoportban találjuk a vitronektin-szeru inzertet tartalmazó MMP-kat: MMP21/XMMP. A H csoportban találjuk a Cisztein/Prolin gazdag, IL-1 receptor-szeru domént tartalmazó MMP-t: MMP-23.
6
BEVEZETÉS
Az egyes MMP-k a csukló régió hosszában és összetételében is különböznek egymástól, amely szintén befo lyásolja a szubsztrát specifitást [26]. A zselatináz A és B (MMP-2 és 9) enzimeket jellemzi a háromszor ismétlodo, ciszteinben gazdag és a fibronektin kollagénköto régiójához hasonló inzert, ami a katalítikus doménen belül található. Ez az inzert szükséges ahhoz, hogy az enzim meg tudja kötni és el tudja hasítani a kollagént és az elasztint [27, 28]. Ezenkívül az MMP-9 tartalmaz egy kollagén V-szeru szekvenciát a csukló régiójában, aminek a szerepe még nem ismert. Végül a membrán-típusú MMP-k rendelkeznek egy transzmembrán doménnel és egy rövid citoplazmatikus farok résszel (MMP-14, -15, -16, -24) vagy egy hidrofób régióval, amit egy glikofoszfatidil inozitol (GPI) tartalmú rész köt az enzimhez (MMP-17, -25) [29, 30]. Ennek a doménnek különösen fontos szerepe van a proteolítikus folyamatoknak a sejtfelszín specifikus helyeihez történo rögzítésében.
A mátrix metalloproteázok ismert szubsztrátjai A közelmúltban vált szélesköruen ismertté, hogy a MMP-k az ECM biopolimerjein kívül más fehérjéket is képesek bontani (2. táblázat). A mátrix metalloproteázok fehérje szerkezetének eltérései adnak magyarázatot arra, hogy milyen sokféle biopolimert képesek hasítani.
2. táblázat A MMP-k hatástani spektruma Sternlicht § Werb után [14]
MMP jelzése: MMP-k szubsztrátjai ECM fehérjék Aggrekán
1
2 3
7
8
9
10
+
+
+
+ +
+
Kollagén I
+
+
-
+ +
-
Kollagén II
+
+
-
Kollagén III
+
+
+
-
+
-
+
Kollagén IV
-
+
+
+
-
+
+
Kollagén V
-
+
+
-
-
+
+
Kollagén VI
-
-
-
Kollagén VII
+
+
+
11
+
-
12
13
14
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
7
16
18
19
26
+
+
-
+ +
+
BEVEZETÉS
2. táblázat MMP Kollagén VIII Kollagén IX Kollagén X Kollagén XI Kollagén XIV Dekorin Elasztin Fibronektin Laminin Zselatin I Fibrillin Entaktin/Nidogén Fibulin Link Protein Mielin Osteonektin Tenaszcin Vitronektin Egyéb fehérjék: α1-AC α2-M α1-PI Kazein C1q E-kadherin Faktor XII Fibrin Fibrinogén IL1α IL1β ProMMP2 ProTGFβ ProTNFα Plazminogén Szubsztancia- P T kininogén
1 + + + + + +
2 + +
3 + + + + + + + + + +
+ +
+ + + + + + + + + + + + +
+ + + + +
+ + +
+ + + + + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + + + +
7 8
9
10
11 12
-
+ + + + + + +
+ + + + + + +
+ + + +
+ + + + + + + +
+ + + +
+ + +
14 16
+ + +
+ + + + + +
+ + +
+ + + + +
+ + + + -
+ + + +
+ + +
19
26
+
+ +
+ +
+ + + + +
+ + -
+
+
+ +
+
+
+ +
+ + +
+
+
+
+
+ + +
+ +
18
+ + +
+ + + + +
13
+ + + + -
+ +
+ -
+
+
+ -
A szimbólumok jelentése: emészti (+), nem emészti (-), α1-antikimotripszin (α1-AC), α2-makroglobulin (α2-M), α1-proteináz-inhibitor (α1-PI)
8
BEVEZETÉS
Szabályozási mechanizmusok A MMP-k szabályozását azért fontos pontosan ismernünk, mert amint azt az elozo táblázatban is láthattuk, szubsztrát specifitásuk gyakran átfedi egymást, így a különbözo biológiai funkciót elsosorban eltéro szabályozásuk biztosíthatja számukra. A mátrix metalloproteázoknak normál funkciójuk betöltéséhez, a megfelelo helyen intracellulárisan vagy extracellulárisan - a megfelelo idoben, a megfelelo aktivitással kell jelen lenniük. Mindez a szabályozás transzkripciós és post-transzkripciós szinten aktívátorokon és inhibitorokon keresztül valósul meg. A MMP-k transzkripcióját számos szignál útvonalon keresztül különféle stimulátor és szuppresszor faktorok szabályozzák [31], pl. forbol észterek, integrinek, ECM fehérjék, a sejt stressz állapota, a sejtek alakváltozása [14, 32] továbbá citokinek és növekedési faktorok, úgymint interleukinek, interferonok, EGF, KGF, NGF, bFGF, VEGF, PDGF, TNFα, TGFβ és EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer) [31]. Mindezek a stimulusok a MMP gének promoter régiójának köto helyein keresztül fejtik ki hatásukat. Munkacsoportunk a mátrix metalloproteázok közül a zselatináz tulajdonságú MMP-2 (zselatináz A) és MMP-9 (zselatináz B) vizsgálataihoz csatlakozott. Az általunk vizsgált neutrális metalloproteázok - MMP-2 (72 kDa zselatináz/kollagenáz IV) és MMP-9 (92kDa zselatináz/kollagenáz IV) génszerkezete hasonló [33]. A két gén között jelentosebb különbség a promoter régiókban található [33, 34]. A 92 kDa zselatináz (MMP-9) gén promoter régiójának a 29 –25- ig terjedo szakaszában TATA-szeru szekvencia (TTAAA) található, amelyet a 72 kDa zselatináz (MMP-2) gén nem tartalmaz [34]. A 92 kDa zselatináz génszintu szabályozásának további lehetoségét szolgálja a promoter régió TRE (TPA response element) szeru szekvenciája a –79 –73 pozícióban. A 72 kDa zselatináz génben nem található ilyen szekvencia [34]. A TGF-ß1-rol kimutatták, hogy gátolja a növekedési faktorok és onkogének MMP expresszióra irányuló indukcióját, amely gátlás Fos-köto szekvencián (GAGTTGGTGA) keresztül valósul meg. Ez utóbbihoz közeli homológiát mutató szekvencia (GNNTTGGNGN) a TGF-ß1 által gátolt 92 kDa zselatináz gén (MMP-9) promoter régiójában is megtalálható. Az MMP-2 gén szabályozása jelenlegi ismereteink szerint az AP2 és két Sp-1 kötohelyeken [35, 36, 37, 38, 39, 40, 41], emellett post-transzkripciós mRNS stabilizáción keresztül [42, 43] valósul meg. A két zselatináz fennen le írt eltéro szabályozása arra utal, hogy eltéro szerepük lehet a malignus tumorokban is. A MMP-k indukciója lehet sejt specifikus is. Egészséges szervezetben az általunk vizsgált MMP-9-t az alveoláris makrofágok, a polimorfonukleáris leukociták, az 9
BEVEZETÉS
oszteoklasztok, a trofoblasztok, a sebszéleken migráló keratinociták és a hippocampus neuronok termelik [40, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50], de a fibroblasztok nem [51, 52]. Az MMP-2-t folyamatosan termelik a bor [53] és a gingiva [47, 54] fibroblasztsejtjei, valamint az endothelsejtek [55] és az osteoblastok [56]. Mindkét enzim inaktív proenzim formában termelodik és egy 80 ill. 87 aminosavból álló, gátló peptidszakasznak a fehérjelánc aminocsoport (-NH2) felöli végérol való lehasadásával aktiválódik [52, 57]. A MMP-k szöveti gátlójának (TIMP) jelenleg négy tagja ismert (TIMP1,2,3,4), amelyek 1:1 arányban, reverzibilisen gátolják a MMP-kat [58]. Míg a TIMP család tagjai lokálisan hatnak, addig a szöveti folyadékban az α2-makroglobulin a MMP-k fo inhibitora [59].
A mátrix metalloproteázok szerepe a malignus progresszióban A malignus tumort az különbözteti meg a jóindulatú, és az in situ elváltozásoktól, hogy képes átlépni a szövethatárokat és beterjedni a szervezet távoli szöveteibe. Az invazív növekedés során a tumo rsejtek az ECM alkotta számos akadályon képesek áthaladni, mert együttmuködve a szervezet mesenchymális sejtjeivel átalakítják az intersticiális stromát és áttörik a bazálmembránokat. Ebben a folyamatban alapveto szerepet játszó MMP-k hozzájárulnak ahhoz, hogy a tumorsejtek a szervezet távoli szerveiben megtelepedve áttétet tudjanak létrehozni. A rosszindulatú tumorszövet kollagenáz aktivitása nagyobb, mint annak az ép szövetnek a kollagenáz aktivitása, amibol a tumor kiindult [60, 61, 62, 63, 64]. A benignus tumorokat ép, folytonos bazálmembrán veszi körül, míg az invazívakat határoló membrán sérült, nem folytonos [65]. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a MMP-k egyszeruen az ECM szerkezetének lerombolásával segítik elo a tumor inváziót és a metasztázist. A kutatók nagy számú in vitro és in vivo kísérletben erosítették meg a MMP-k szerepét a daganatok progressziójában. Ezek közül csak néhányat említünk. Pozzatti [66] és munkatársai patkány embrió fibroblasztokat Ha-ras onkogénnel transzfektálva a sejteket metasztatizálóvá tették és ezzel párhuzamosan a sejtek kollagenáz termelése is megnövekedett. Ugyanerre az eredményre jutott Gabrisa [67] és Collier is humán epitheliális sejteken kísérletezve [52]. Schultz [68] a metalloproteázok termelésének és aktivitásának gátlásával csökkentette a kollagenáz termelo B16-F10 tumorsejtvonal invazív 10
BEVEZETÉS
és metasztatikus képességét. Khokha és munkatársai [69] a kollagenáz- gátló TIMP ellen ható antiszenz oligonukleotiddal fokozni tudták a malignusan transzformált Swiss 3T3 sejtvona l invazív és metasztatikus képességét. Hasonló eredményre jutott Nakajima [70] is 13762NF patkány emlo adenocarcinomán végzett kísérleteivel. A 92 kDa zselatináz metasztázisban betöltött szerepérol
Bernhard és munkatársai szolgáltattak figyelemre
méltó kísérleti eredményt, amikor fokozott 92 kDa zselatináz termelésre kényszerítve a nem metasztatizáló patkány embrió sejteket, azok metasztatizálóvá váltak [71, 72]. A biokémiai vizsgáló eljárások fejlodésével ma már gén szinten is sikerült megerosíteni a MMP-k fontos szerepét az invázióban és a metasztázisban. Az MMP-9 transzgént hordozó egerekben az MMP-9 promoter régiójának indukcióját lehetett kimutatni az in situ neopláziából az invazív elváltozásba történo átmenet során [73]. Az MMP-2-t nem termelo transzgén egerekben pedig szignifikánsan csökkent a tüdokolóniák száma a tumorsejtek intravénás transzplantációját követoen [74]. Kim és mtrsai PCR technikát alkalmazva arra a következtetésre jutottak, hogy a MMP-k is szükségesek a tumorsejtek intravazációjához és a heamatogén terjedésükhöz, miután azt találták, hogy csak az MMP-9-t termelo tumorsejtek képesek bejutni a véráramba [75]. Számos MMP (MMP-, 1, -2, -3, -9, -14) tehát kulcsfontosságú szerepet játszik a tumor invázióban, a metasztázisban és az angiogenezisben [76], azonban a felhalmozódott adatok arra utalnak, hogy szerepük nem korlátozódik pusztán a tumorsejtek invazív terjedését hátráltató gátak - az ECM és ezen belül a bazálmembrán - biopolimerjeinek a lebontására. Genetikailag módosított egereken végezett kísérletek támasztják alá, hogy a MMPk részt vesznek a daganat kialakulásának korai fázisában is [77-91]. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a MMP túltermelés spontán hiperproliferatív elváltozások kialakulásához vezet a genetikailag módosított egerekben. Továbbá, ha a MMP transzgén és „knockout” egereket onkogén behatások érik, az MMP-t túltermelo egerekben több daganat alakul ki, mint a normál egerekben, míg azokban az egerekben, amelyek nem termelik valamelyik MMP-t vagy éppen TIMP-1 túltermelok, azokban kevesebb tumor alakul ki, mint a normál egerekben. Például a MMP-9 hiánya gátolja a HPV-16 által indukált laphámrák kialakulását MMP-9 „knockout” egerekben, ugyanakkor a karcinogenezis helyreállítható MMP-9-t expresszáló csontvelo transzplantációval. Ez a megfigyelés a gyulladásos sejtek által termelt MMP-9 szerepét igazolja a borrák kialakulásának korai szakaszában [85].
11
VIZSGÁLATAINK CÉLJA ÉS TÁRGYA
Vizsgálataink célja és tárgya
Munkánkban a zselatinázoknak - elsosorban a MMP-9-nek – a tumor invázióban betöltött szerepét vizsgáltuk. Kísérleteinket humán biopsziás anyagon, in vivo xenograft modellen és in vitro körülmények között szövettenyészeteken végeztük. Az alábbi kérdésekre kívántunk választ kapni:
1. A kollagenáz IV két típusa – MMP-2 és MMP-9 - közül melyik aktivitása tartható jellemzonek a vastagbél carcinomákban és melyik mutat kapcsolatot a tumorprogresszióval?
2. Játszik-e szerepet a MMP-9 az immunszuppresszált egérbe oltott humán szájüregi bazaloid laphámrák növekedésében, fejlodésében, invazivitásában?
3. Változik-e a MMP-9 expresszió HT1080 szövettenyészetben, a sejtpopuláció növekedése során?
4. Hasznosítható-e a tumorsejtek magas MMP aktivitása a citosztatikumok peptid származékainak aktiválásában? 4.1. Megváltozik-e a melphalán cytotoxicitása, ha az a kollagén peptid fragmentjéhez kötodik? 4.2. A peptid-melphalán konjugátumok mennyiben szubsztrátjai vagy gátlói a kollagenáz enzimnek?
5. A négy MMP-9 antiszenz oligonukleotid (MMP-9 AON) biológiai vizsgálata során három kérdésre kívántunk választ kapni: 5.1. A kollagén IV-et hasító két zselatináz enzim közül jobban gátolható-e a MMP-9 termelodése a CRIC-2 AON kezeléssel, mint a MMP-2-é? 5.2. A CRIC-2 AON kémiai módosítása a pirimidin bázison mennyiben játszik szerepet a MMP-9 termelés gátlásában? 5.3. Megváltozik-e a MMP-9-t termelo HT1080 fibrosarcoma in vitro invazív növekedése ( proliferáció, migráció) CRIC-2 AON kezelés után? 12
A N Y A G ÉS MÓDSZER
Anyag és módszer Kémiai anyagok A vizsgálatainkhoz felhasznált, analitikai tisztaságú vegyszereket az alábbi vállalatoktól szereztük be: N,N,-Metilén biszakrilamid 2x (SERVA Feinbiochemica Gmbh & Co), ammónium-perszulfát (SERVA Feinbiochemica Gmbh & Co.), Coomassie Brillant Blue R250 (SERVA Feinbiochemica Gmbh & Co.), akrilamid (BIO-RAD Laboratories), N,N,N,, (REANAL
N,-Tetrametil-etilén-diamin Finomvegyszergyár
(Bethesda
Research
Részvénytársaság),
Laboratories),
ecetsav
96%
metanol (REANAL
Finomvegyszergyár Részvénytársaság), dimetil-szulfoxid (REANAL Finomvegyszergyár Részvénytársaság), nátrium- hidroxid (REANAL Finomvegyszergyár Részvénytársaság), Glicin (SIGMA CHEMICAL Co.), ammónium-szulfát (SIGMA CHEMICAL Co.), etiléndiamintetra-acetát (EDTA) (SIGMA CHEMICAL Co.), kálium-klorid (SIGMA CHEMICAL Co.), nátrium klorid (MERCK), Tris (ICN Biomedicals, Inc.), urea (ICN Biomedicals, Inc.) agaróz (Transgenomic Ltd.), difenil-oxazol (PPO) (REANAL Finomvegyszergyár
Részvénytársaság),
1,4-di-[2-(5-fenil)-oxazoil]-benzol
(POPOP)
(REANAL Finomvegyszergyár Részvénytársaság), etilén- glikol monoetil-éter (Cellosolve) (SIGMA CHEMICAL Co.), toluol (REANAL Finomvegyszergyár Részvénytársaság), perklórsav
70%
(PCA)
(VEB
LABORCHEMIE
APOLDA),
xilol
(REANAL
Finomvegyszergyár Részvénytársaság), 96% alkohol (REANAL Finomvegyszergyár Részvénytársaság), hidrogén-peroxid (REANAL Finomvegyszergyár Részvénytársaság), a IV típusú bakteriális kollagenáz (Sigma Chemical Co.). A rekombináns humán IV típusú kollagenáz Dr. U. Bergmann (Oulu University, Finnország) nagylelku ajándéka.
Sebészi úton eltávolított emberi tumorok Mutéti biopsziás anyagból származó szájüregi és vastagbél tumorokat a Semmelweis Egyetem Szájsebészeti Klinikájáról, valamint az Országos Onkológiai Intézetbol kaptunk, amelyekért köszönettel tartozunk Professzor Dr. Szabó Györgynek és Dr. Köves István foorvos úrnak. A biopsziás anyagokat patológus szakorvos hisztológiailag jellemezte és kivágta a biokémiai vizsgálatok számára, majd azokat az eltávolítást követo egy órán belül folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A vastagbél tumorokat a patológiai laboratóriumok lelete alapján Astler-Coller [92] által módosított Duke’s stádiumok szerint osztályoztuk, a
13
A N Y A G ÉS MÓDSZER
biokémiai vizsgálati adatokat összevetettük az érintett betegek klinikai adataival, amelyeket Dr. Köves István osztályvezeto foorvos állított össze.
Humán tumor xenograft vonal kialakítása és növekedésének vizsgálata A Semmelweis Egyetem Szájsebészeti Klinikáján 60 éves nobetegbol, aki a mutétet megelozoen sem sugárterápiában, sem kemoterápiában nem részesült 2,5 cm átméroju tumort távolítottak el a szájfenék bal oldaláról. A tumor mintákat egyszer használatos szikével megfelelo méretre daraboltuk (5x5 mm), majd altatásban a timektómizált és ionizációs sugárzással immunszuppresszált CBA/CA egerek hátbore alá oltottuk [93, 94, 95, 98]. A tumort a harmadik passzázstól nemcsak a hátbor alatt (HTB-1a), hanem a szájnyálkahártya alatt (HTB-1b) is fenntartottuk [96]. A tumort kívülrol a pofabor felmetszése után helyeztük a masseter elotti területre a szájnyálkahártya közelébe. A tumor a hetedik passzázsban a hátbor alatt 85%-ban, a szájnyálkahártya alatt 95%-ban megeredt. A tumor növekedési ütemét a jelzett idopontokban történt mérésekkel követtük nyomon. A tumor térfoga tát a V=AB2 p/6 képletbol számoltuk, ahol „A” a legnagyobb átméro, „B” pedig A-ra meroleges átméro. Az adott idopontban mért tumor térfogatot (Vt) mindig a beültetett tumor darabka térfogatára (V0) vonatkoztattuk. Mindegyik csoport Vt/ V0 középértékeit (+ s.d.) az ido függvényében ábrázoltuk [97, 98], a kettozodési idot pedig Kopper és Steel módszere [95] szerint számoltuk. A humán tumor xenograft szövettana A primer tumor egy darabját és mindegyik passzázs egy-egy darabját 10%-os pufferolt formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk, amelybol 5µm vastag metszeteket készítettünk és HE-nal festettük. A mitózis és apoptózis indexeket 400x nagyítással, HEnal festett metszeten, metszetenként 200 látótér átvizsgálása után számoltuk ki.
Immunhisztokémia A metszeteket 2 x 10 percig xilollal, majd 2 x 10 percig 96%-os alkohollal deparaffináltuk. Desztillált vizes öblítés után a metszetben található endogén peroxidázt metanolban oldott 3%-os hidrogénperoxiddal gátoltuk. Csapvizes, majd desztillált vizes mosás után 0.01 Mos citrát pufferben (pH=6.0) 3 x 5 percig forraltuk a metszeteket mikrohullámú sütoben. Ezt követte desztvizes, majd PBS-es (pH=7.4) mosás. Ezután 3%-os normál szérumot cseppentettünk a metszetre, amit 30 percig szobahomérsékleten hagytunk állni rajta. A primer antitestet (Cytokeratin AE1/AE3 (DAKO M3515) 1:50 higításban 1% BSA 14
A N Y A G ÉS MÓDSZER
tartalmú PBS-ben (pH=7.4), 37 Co-on, 1 órát hagytuk a metszeten. 3x 5 perc mosás PBSben, majd a szekunder antitest következett LSAB-2 Peroxidase (DAKO K0675) 30 perc 37 Co-on. 3 x 5 perc mosás PBS-ben, majd elohívás. Az elohívó oldat elkészítése : 4ml N,N,dimethyl- formamid-ban (DAKO) 20 mg AEC-t (3-amino-9-ethyl-carbazol) feloldani, majd ebbol az oldatból
0.05 ml-t elegyíteni 3 ml acetát pufferrel (pH=5.4) és 5 µl 25 %
hidrogénperoxiddal. Az így elkészített elohívó oldatot a metszetre csepegtetjük, majd szobahomérsékleten sötétben 30 percig rajta hagyjuk. Desztvizes mosás, háttérfestés haematoxilinnal (2 perc), kékítés csapvízben, majd lefedés glicerin-zselatinnal (vizesen). Ultrastruktúra vizsgálata Karnovszky-oldatban két órát fixált szöve tmintákat, háromszor 10 percig mostuk PBS-ben, majd 2 %-os ozmium-tetroxid oldatban fixáltuk tovább. A felszálló alkoholsorral történt dehidrálás után Epon 812 mugyantába ágyaztuk a mintákat, majd 60-70 Co-on 24 órát polimerizáltunk. LKB III ultramikrotonnal 100 nm vastag metszeteket készítettünk, amiket ólom citráttal és uranil acetáttal festettünk, majd Philips CM10 elektronmikroszkóppal vizsgáltunk. A humán tumor xenograft LDH- izoenzimeinek vizsgálata A szöveteket (maximum 0,1 g) folyékony nitrogénben fagyasztva mozsárban összetörtük, majd 1 ml 0,9% NaCl-0,66 mM EDTA-t tartalmazó oldatba vettük fel. 15 másodperc ultrahangos kezelés után a mintákat 16.250 x g- vel 4 Co-on 30 percig centrifugáltuk. A keletkezo felülúszó 20 µl-ét 1,5 %-os agaróz gélen futtattuk 4 Co-on 2 mA/cm áramerosséggel 47 mM-os veronal nátrium pufferben (pH=8,6). Az izoenzimek bordó csíkként váltak láthatóvá, miután 37 Co-on 60 percet inkubáltuk a géleket az elohívó reagenseket tartalmazó pufferben (5mg tetrazólium-kék, 5mg KCN, 10mg NAD, 0,25 mg fenazinmetaszulfát, 0,25 M lítium laktát 6 ml PBS-ben; pH=7,6).
A humán tumor xenograft áramlás -citometriai vizsgálata Az emberi és egér eredet vizsgálatokat ill. a ploiditás vizsgálatokat frissen az egerekbol eltávolított szövetmintákon ill. paraffinba ágyazott metszetekbol visszanyert sejteken végeztük el. A formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetekbol 50 µm vastag metszeteket készítettünk, amiket azután deparaffináltunk, rehidráltunk, majd 0,5 % pepszinnel (Boehringer, Mannheim Germany) és 0,5 mg/ml koncentrációjú RNáz- zal (Sigma St. Louis USA) emésztettük 37 C0-on 30 percet. Az így keletkezo sejtmagokat 50 15
A N Y A G ÉS MÓDSZER
µg/ml koncentrációjú propídium-jodid (Sigma, St. Louis, USA) oldattal festettük. Azokban az esetekben, amikor egységes sejtpopulációt szerettünk volna vizsgálni, eloször mikroszkóp alatt azonosítottuk, majd megjelöltük a sejtpopuláció helyét a paraffin blokkban és csak errol a helyrol készítettünk metszetet. A frissen eltávolított tumorszövetbol emésztéses módszerrel (kollagenáz/DNáz/hiarulonidáz) 105-106 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítettünk, amit metanollal fixáltunk 10 percig –20 Co-on. RNáz emésztés után (0,5 mg/ml, 30 perc, 37 Co) a DNS-t 50 µg/ml koncentrációjú propídium jodid oldattal festettük 20 percig. Abból a célból, hogy az egér és az emberi sejteket meg tudjuk különböztetni egymástól, még a propídium jodid festés elott, az egér kötoszöveti sejtjeit egér MHC I-t (H2Kk) felismero IgG- vel jelöltük (Becton-Dickinson 06184D), amit streptavidin fluorescein tett láthatóvá. Ezzel a módszerrel különbséget tudtunk tenni az emberi tumorsejtek (egér MHC I-F.I.T.C. negatív) és az egér kötoszöveti sejtjei között (egér MHC I-F.I.T.C pozitív). A fluoreszcenciát FACStar áramláscitométeren (flow-cytometer Becton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) mértük. Az adatokat egy HP-200 komputeren futó Consort 30-as program értékelte. A gerjesztés 488 nm-en 200mW teljesítménnyel történt, amit egy 2 W-os argon lézer biztosított, a fénykibocsátást pedig 585+21-es hullámsávban mértük. Mintánként 5000 sejtet vizsgáltunk 200-500 sejt/másodperc sebességgel. A sejtciklus egyes fázisaiban lévo sejtek százalékos arányát Rabinovitch Multicycle szoftver segítségével számoltuk. A propídium- jodiddal és anti- mouse IgG- vel együttesen jelölt minták fluoreszcenciáját a propídium-jodidnak megfelelo 585+21 nm-es és a F.I.T.C.-nek megfelelo 533+21 nm-es hullámsávban egyszerre mértük. A diploid sejtek fluoreszcenciájának intenzitását emberi és egér limfociták segítségével kalibráltuk [99]. Immuno-blot technika A PCNA (proliferating cell nuclear antigen) vizsgálatához a sejteket PBS-ben mostuk, majd 20µg/ml aprotinint, 20µg/ml leupeptint és 1 mM fenilmetilszulfonil fluoridot tartalmazó TNES pufferben (Tris-HCl 50 mM pH=7,5 , 2 mM EDTA, 100 mM NaCl 1% NP40) lizáltuk. Egyenlo mennyiségu fehérjét futtattunk 11%-os poliakrilamid gélen, amit elektroblottal nitrocellulózra vittünk át és 3% BSA-val blokkoltuk. A mintákat PCNA ellenes monoklónális egér antitestekkel (PCNA PC-10 DAKO, Gols trup, Denmark) jelöltük (elsodleges antitest), majd alkalikus foszfatázzal konjugált egér ellenes kecske IgG-t (1:3000), mint másodlagos antitestet használtunk az elsodleges antitest kimutatására. 16
A N Y A G ÉS MÓDSZER
Az immunreakcióhoz használt TBS puffer (150 mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH=7,5) 3% BSA-t tartalmazott. A mosáshoz TBST puffert (150mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH=7,5, 0,05% Tween 20) használtunk. Az elohívás folyamán nitroblue tetrazólium (NBT,BioRad, USA) és BCIP (5-bróm-4-klór-3-indolil foszfát, BioRad, USA) reagenseket használtunk. A blot kiértékeléséhez Eagle-Eye II denzitométert (Stratagene, La Jolla,CA,USA) használtunk.
Tumorsejtek tenyésztése in vitro Az emberi eredetu tumor sejtvonalakat
( HT-1080 fibrosarcoma, HT-29 vastagbél
adenocarcinoma, HT168 melanóma) 37 Co -on, 5 % CO2 -t tartalmazó légtérben, 10% FCSt és 50 µg/ml gentamycint tartalmazó RPMI 1640 médiumban tartottuk fenn. Kísérleteinkhez a 48 órás tenyészet sejtjeit 0.02 % EDTA-t tartalmazó Ca2+ és Mg2+ mentes PBS-sel összegyujtöttük, majd
az egyes kísérle tek célkituzésének megfelelo
feltételek mellett (sejtszám, edény, inkubálási ido) 10% FCS-t és 50 µg/ml gentamycint tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban tenyésztettük. Az MMP vizsgálatakor a tenyésztés utolsó 24 órájában a tápfolyadékot FCS mentes RPMI-1640-re cseréltük, így a sejtek által termelt MMP-k meghatározására ebben az un. kondicionált médiumban került sor. Citosztatikus hatóanyagokkal történo vizsgálatokhoz 96- lyukú tenyésztoedénybe 5x103 sejtet helyeztünk, amelyek szaporodását 4, 48, és 72 óra múlva határoztuk meg. Az MTA Peptidkémiai Munkacsoport (vezeto: Dr. Süliné-Vargha Helga) állította elo a melphalánt és peptid származékait, amelyeket 1 % sósavat tartalmazó etanolban oldottunk fel, majd tápfolyadékkal állítottuk be a kívánt koncentrációt. Az elenyészo mennyiségben jelenlévo oldószer sejtnövekedést gátló hatást nem mutatott.
Sejttenyészet növekedésének meghatározása A sejtproliferáció vizsgálatára szulforodamid B (SRB) tesztet és a tetrazólium festést (MTT) használtunk [100]. A szulforodamid B teszt elvi alapja az, hogy a sejtek fehérjéihez kötött festék fotométeren meghatározott abszorbanciájából következtetünk a sejtpopuláció nagyságára. Ezt a módszert a következoképpen alkalmaztuk : A sejttenyészetet 10%-os TCA-val rögzítettük 4 Co -on 60 percig, csapvízzel ötszöri mosás után, 1% ecetsavban oldott 0.4%-os SRB-vel szobahomérsékleten 15 percig festettük, a nemkötött festéket 1%-os ecetsavval végzett ötszöri mosással eltávolítottuk. Az abszorbancia
17
A N Y A G ÉS MÓDSZER
méréshez, amelyet ELISA lemez fotométerrel 570 nm-en végeztünk, 10 mM Tris-ben oldóttuk a fehérje-SRB komplexet. A tetrazólium festés (MTT) elvi alapja az, hogy a sejtek
dehidrogenáz
enzimrendszere az MTT-t (metil-tetrazólium) színes formazánná redukálja, amelynek meghatározásakor
a sejtpopuláció nagyságával arányos abszorbanciát mérhetünk.
Kivitelezés: 0.5 mg/ml töménységben MTT-t adunk a tenyészetekhez, majd 4 órán át inkubáljuk 37 Co -on. Óvatosan eltávolítjuk a sejttenyészetrol a tápfolyadékot, ügyelve arra, hogy a tenyésztoedényben maradjanak a képzodött formazán kristályok, amelyeket DMSO-ban feloldunk. A formazán abszorbanciáját 570 nm-en ELISA lemez fotométeren határoztuk meg.
Mikroinvazivitás vizsgálata Az Albini [101] által részletesen ismertetett kemo- és matrigél invazivitási módszert alkalmaztuk a tumorsejtek migrációjának a vizsgálatakor. A kemoinvazivitási módszer a tumorsejtek membránon keresztüli vándorlásának, míg a matrigél invazivitási módszer a tumorsejtek 3 dimenzióban történo növekedésének a vizsgálatát teszi lehetové. 1 /. Kemotaxis módszer: a 8 µm nagyságú részecskék számára átjárható membrán az un. Boyden kamrát két rekeszre osztja. A kamra felso rekeszébe 5x104 HT1080 sejtet helyeztünk, az alsó kamrába pedig a migrációt serkento kemoattraktánst (fibronektint). A sejteket 3 órai inkubáció végén (37 Co -on) Haemacolor kit-tel (MERCK) fixáltuk, festettük és mikroszkópos vizsgálatban megszámoltuk a membrán egyik oldaláról a másikra átvándorolt sejteket. 2./ Matrigél invazivitási módszer: az irodalomban ismert BM-gél invazivitási módszer intézetünkben módosított változata a tumorsejtek vertikális irányú vándorlására ad lehetoséget. A HT-1080 monolayer sejttenyészetre az EHS tumorból izolált ECM oldatot (10 mg/ml) helyeztünk hidegen, amely a 37 Co -on gél állapotúvá alakult át. A 24 órai inkubáció után a gélbe vándorolt sejteket, valamint a monolayer-ben szaporodott sejteket elkülönítettük és megszámoltuk. 3./ Ko-kultúra tenyészetben vizsgáltuk a jelolt sejtek letapadását a teszt-vegyület jelenlétében. Konfluens patkány embrió fibroblaszt és MRC-5 sejtekre helyeztük a tumorsejteket.
18
A N Y A G ÉS MÓDSZER
DNS és fehérje szintézis vizsgálata A logaritmikus növekedés és a konfluens fázisban lévo tenyészetek DNS szintézisét radioaktívan jelölt timidin (3 H-TdR) beépülésével mértük. A
10 % FCS-t tartalmazó
RPMI 1640 tápfolyadékot tartalmazó 24 lyukú tenyésztoedénybe helyeztük a HT-1080 sejteket (2,5 x 104 sejt/ ml). A 24. és a 96. órás tenyészetekhez 0.037 MBq/ml 3H-timidint ( TRK-120, 37MBq/ml Amersham, G.B.)
adtunk. A fehérjeszintézis vizsgálatra
14
C(U) izotóppal jelölt L-
aminosav keveréket alkalmaztunk 0.0185 MBq / ml koncentrációban (CB-59 1295 MBq / mg atom C, MTA Izotóp Intézete). A táblázaton feltüntetett ideig történo inkubáció után a sejteket 0,02% EDTA- val összegyujtöttük, háromszor mostuk izotóp mentes ("hideg") médiumban, Bürker kamrában megszámoltuk, majd a biopoliméreket 500 µl 0,5 N PCA-val kicsaptuk. A lecentrifugált üledéket há romszor mostuk 500 µl "hideg" 0,5 N PCA-val, majd 200 µl 0,1 N NaOH-ban feloldottuk. Ez utóbbi kivonathoz 5ml szcintillációs folyadékot (20g PPO, 0,2 g POPOP, 1680 ml Cellosolve, 2880 ml Toluol) adtunk, amelynek radioaktivitását Beckman -100LS spektrométerben megmértük.
A biológiai minták elokészítése kollagenáz aktivitás vizsgálathoz A szövetmintákat folyékony nitrogénben fagyasztva, dörzsmozsárban elporítottuk. Az elporított szövet 0.1 g-ját 1ml homogenizáló pufferbe (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5mM CaCl2 ; pH=7.6) vettük fel. A mintákat 15 másodpercig ultrahangoztuk, majd 30 percet állni hagytuk 4 Co-on. Az így elkészített homogenátot lecentrifugáltuk (10 perc, 12000 rpm). A felülúszó fehérjetartalmát meghatároztuk, majd kollagenáz IV aktivitását vizsgáltuk. A szövettenyészeti sejteket 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 médiumban tenyésztettük 37 Co-on, 5%-os CO2 légkörben. Mielott a tenyészet elérte volna a konfluens állapotot, a médiumot eltávolítottuk róla, a sejteket 0,02% EDTA-val összegyujtöttük és 2,5x104 / ml RPMI 1640 (10% FCS)/lyuk koncentrációban 24 lyukú tenyésztoedénybe helyeztük. Minden nap 4 lyukban megszámoltuk a sejteket, miközben másik 4 lyukban szérum mentesre cseréltük a tápfolyadékot és ezeket a tenyészeteket további 24 óráig inkubáltuk. Az így keletkezo szérum mentes kondicionált médiumokat a tenyészet 48., 72., 96. és 120.
19
A N Y A G ÉS MÓDSZER
órájában eltávolítottuk a sejtekrol, 800 g- vel lecentrifugáltuk (15 perc) és a sejtszám alapján normalizálva a kollagenáz aktivitást zimogramon vizsgáltuk. Kollagén IV jelölése [3 H]-ecetsavanhidriddel és emésztése A radioaktívan jelzett kollagén hasításán alapuló kollagená z aktivitás vizsgálatát Nakajima és mtrsai [70] módszere szerint a következoképen végeztük. 10 mg szolubilis humán placenta kollagén IV-et (Sigma Chem. Co., C-7521, Lot 51H3870) oldottunk 5 ml 0.2 M ecetsavban, majd 24 órát dializáltuk 3x300 ml 0.01 M Na2B4O7, 0.2 M CaCl2 (pH=9.0) ellen. Dialízis után 1 mCi [3 H]-ecetsavanhidridet ( spec.akt. 500 mCi/mmol, Amersham UK. TRA381) adtunk a kollagénhez és 4 Co-on 35 percet kevertettük. Ezután ismét dializáltuk 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 5mM Ca-acetát (pH=7.6) ellen, amíg a dializáló oldat radioaktivitása a háttéraktivitás szintjére csökkent. A radioaktív jelölés ellenorzése és a módszer validálása céljából a 3 H-kollagén IV vándorlását enzimemésztés elott és után is poliakrilamid gélelektroforézis kísérletben megvizsgáltuk. A vizsgálandó szövetmintákhoz tríciummal jelölt kollagén IV-et (200 µg/ml) adtunk és emészto oldatban (50 mM Tris-HCl pH=7.6, 200 mM NaCl, 5 mM Caacetát) 48 órát inkubáltuk 37 C o-on. Az emésztést 5 %-os albumin oldat hozzáadása után 40 % triklórecetsavat és 2 % csersavat tartalmazó oldattal állítottuk le. A kicsapódott na gy molekulasúlyú fehérjéket (emésztetlen kollagén, albumin) lecentrifugáltuk (12.000 rpm, 10 perc) és a felülúszóban lévo radioaktív fehérje fragmentumok (emésztett kollagén) aktivitását mértük. A felülúszóból vett aliquotot (max. 100 µl) 5 ml szcintillációs folyadékkal (20g PPO, 0,2 g POPOP, 1680 ml Cellosolve, 2880 ml Toluol) elegyítettük, majd az elegy radioaktivitását BECKMAN LS100 folyadék szcintillációs spektrométerben határoztuk meg. A háttér és a vak próba levonása után az aktivitást 1 mg fehérje mennyiségre vonatkoztattuk. 1 egységnek (U) tekintettük azt az enzim mennyiséget, ami 48 óra alatt 37 oC-on a szubsztrát 50%-át emésztette el.
Zimogram technika A szövetmintákat a „Biológiai minták elokészítése kollagenáz aktivitás vizsgálathoz” címu fejezetben leírtak szerint homogenizáltuk, majd mintapufferrel (0.2 M Tris-HCl, 6.6% SDS, 30% glicerin, 0.02% brómfenolkék) elegyítettük és Laemmli [102] által leírt módon gélelektroforézissel elválasztottuk. Vizsgálatunkban 0.75 mm vastag, 300 µg/ml zselatin tartalmú, SDS-t tartalmazó 10%-os poliakrilamid gélt alkalmaztunk. A kollagenáz 20
A N Y A G ÉS MÓDSZER
aktivitást Yamagata módszere szerint határoztuk meg [103]. A futtatást követoen a gélbol az SDS-t 2.5% Triton X100 oldattal kivontuk (mosás 60 perc), majd a gélt 50 mM TrisHCl-t, 10 mM CaCl2 -t, 0.02% Na-azidot (pH=7.4) tartalmazó oldatban 37 Co -on 18 órát inkubáltuk. A fixálás (50% metanol, 10% ecetsav, 60 perc) után megfestettük a gélt (50% metanol, 10% ecetsav, 0.2% Coomassie Blue R250, 60 perc), majd differenciáltuk (20% metanol, 10% ecetsav). Mivel a gél azon területein, amelyre a kollagenáz vándorolt, az emésztett zselatin nem festodik meg, ezért a sötétkék háttéren fehér csíkok jelennek meg, amelyek
intenzitását az Eagle-Eye ( Stratagene) denzitometeren mértük meg és a
Scananalytics One-Dscan dimensional electrophoresis analysis software alapján számoltuk ki. RT-PCR technika Az MMP-9 mRNS expresszió vizsgálatát
Szarvas Tibor végezte az I. Patológiai és
Kísérleti Rákkutató Intézetben. Az RNS izolálás a HT-1080 sejttenyészetbol a Qiagen RNeasy kittel történt, amely RNS templátként szolgált a végzett eloállításához.
c-DNS reverz-transzkriptázzal
Az MMP-9 mRNS expresszió meghatározásához alkalmazott
primer pár bázis sorrendje a következo : 1./ TGC CCC AGC GAG AGA CTC TA, 2./ AAT GGA AAC TGG CAG GGAT TTC. A ” real-time PCR” készülék (ABI 7000) lehetové teszi a polimeráz láncreakcióra jellemzo görbe exponenciális szakaszának indulása alapján a kiindulási templát mennyiségének megállapítását. Belso kontrollként az MGB próbás GADPH szolgált, melynek mRNS expressziója a tenyésztési idovel nem változik. Az MMP 9 mRNS termék detektálása SYBR Green-nel történt. Statisztikai számítások A vastagbél daganatos beteganyagon szerzett MMP aktivitásra vonatkozó adatainkat Dr. Kralovánszky Judit és Dr. Budai Barna a Graph Pad Prism számítógépes program alapján elemezte. Az emelkedett MMP aktivitás és a betegek túlélése közötti kapcsolat biometriai elemzésének a megjelenítése Kaplan-Meier ábrázolásban történt. Az in vivo kísérleti modell rendszerek csoportjai 4-8 egeret tartalmaztak, az in vitro szövettenyészeti, áramlás-citometriai és a biokémiai vizsgálatok során pedig mindenhol 3 párhuzamossal dolgoztunk és a vizsgálatot legalább egyszer megismételtünk. Az adatokat a 2t próbás Student „ t” teszttel elemeztük, két vizsgálati csoport közötti különbséget szignifikánsnak p<0,05 alatti érték esetén tekintettük. Az in vivo kísérletekben a vizsgált vegyületek hatékonyságát az IC50 érték megállapításával fejeztünk ki, amelyet a ChouChou [104] által leírt komputer program segítségével számítottunk ki. 21
EREDMÉNY EK I.
Eredmények I. A mátrix metalloproteáz-2 és -9 aktivitás emberi vastagbél daganatokban Az elmúlt években jelentosen gazdagodtak ismereteink a kollagenázok kémiai szerkezetérol és biokémiai mechanizmusairól, amelyek alapján összefüggést lehetett megállapítani a daganatok áttétképzo tulajdonsága és kollagenáz aktivitása között [105, 106, 107]. Ezek az eredmények lehetoséget adtak a daganatok progressziójának a megítélését szolgáló újabb módszerek alkalmazására, valamint az áttétképzést gátló gyógyszerek tervezésére. Mivel ezekhez a módszerekhez fuzodo remények még nem valósultak meg, további vizsgálatokra van szükség a kollagenázok onkológiai szerepének a tisztázására. Az emberi tumorok molekuláris sajátosságai és progressziója közötti kapcsolat tanulmányo zására alkalmasnak ígérkeztek a vastagbél daganatok, mivel ennek a malignus kórképnek az egyes kliniko-patológiai stádiumai jól jellemezhetok. Bár az irodalomból ismert a MMP-k expressziójának emelkedése a vastagbél daganatokban, úgy gondoltuk idoszeru adatot gyujteni a magyar lakosság körében eloforduló vastagbél daganatok kollagén-IV bontó aktivitásáról és megállapítani ennek a vizsgálatnak a prognosztikai értékét.
A radioaktív kollagén IV emésztés és a zimogram technika
összehasonlításával pedig
arról tájékozódtunk, hogy a hazai klinikai prognosztikai
vizsgálatok számára melyik
módszer ajánlható és az így szerzett adatokból milyen
következtetés levonása várható.
A vizsgálatainkban résztvevo vastagbél daganatos beteganyag klinikai jellemzését a 3. táblázatban tüntettük fel.
22
EREDMÉNY EK I.
3. táblázat Vastagbél rákos betegek bemutatása Betegek adatai Duke’s Kórlap Nem Kor stádium A 161 353 no 66
CEA ng/m a.) b./ 2,5 3,5
A
Túlélés a Lokalizáció mutét után Rectum 60 hónap Rectum 15 hónap
164 859
no
39
35.9
93,0
B
161 252
no
70
0.5
0,5
60 hónap
Rectum
B
157 362
no
68
2.8
2,6
67 hónap
B
157 121
no
73
0.5
0,5
33 hónap
Flexura lienális Coecum
B
157 044
no
71
2.8
1.8
66 hónap
B B
160 553 166 178
no no
89 51
0.5 0.5
0.4 2,2
60 hónap 51 hónap
Colon transversum Coecum Coecum
B B
159 839 166 807 166 714
no férfi no
63 56 54
0.5 9.2 0.5
0,5 2.6 0,8
60 hónap 48 hónap 44 hónap
Rectum Rectum Rectum
B B
68 179
no
-
2.2
1.9
24 hónap
Colon
B
166 433
no
63
9.2
0,5
49 hónap
Rectum
B B
162 388 167 267
férfi no
66 77
0.7 0.8
0.6 0,5
59 hónap 45 hónap
Rectum Rectum
B B B
164 937 157 479 161 409
férfi férfi no
67 48 76
0.3 0.6 0.9
1,8 0,5 3,1
55 hónap 66 hónap 41 hónap
Rectum Rectum Coecum
B
161 013
férfi
49
0.8
0.6
60 hónap
Rectum
a.) = mutét elott b.) = mutét után
23
Tumor Szövettan Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma coli Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma recti Adenocarcinoma recti Adenocarcinoma tubulare recti Adenocarcinoma coli Adenocarcinoma intestini crassi Adenocarcinoma recti Adenocarcinoma tubulare recti Adenocarcinoma recti Adenocarcinoma recti Adenocarcinoma mucinosum Carcinoma mucinosum intestini crassi
EREDMÉNY EK I.
Duke’s stádium
Kórlapszám
C
161 925
C
160 368
C
163 535
C
160 521
C
160 666
C
162 404
C
132 332
Betegek adatai Tumor Nem Kor CEA Túlélés Lokalizáció Szövettan a.) b.) ng/m ng/m férfi 66 2,5 3,5 Coecum Adenocarcinoma 21 hónap intestini crassi férfi 45 3,9 5,2 64 hónap Rectum Adenocarcinoma tubulare recti férfi 60 12,5 8.5 12 hónap Rectum Adenocarcinoma intestini crassi no 81 1,2 3,0 58 hónap SigmaAdenocarcinoma rectum tubulare coli férfi 64 0,5 0,5 24 hónap Rectum Adenocarcinoma recti férfi 65 1.8 1.3 45 hónap Rectum Adenocarcinoma recti no 42 13,5 10 16 hónap Rectum Adenocarcinoma recti
Betegek adatai Kórlapszám Nem
Kor
D
162 439
no
39
Tumor CEA Túlélés Lokalizáció a.) b.) ng/m ng/m 78 165 14 hónap Sigma
D
160 132
férfi
61
136
Dukes’ Stádium
a.) = mutét elott b.) = mutét után
24
364
8 hónap
Rectum
Szövettan
Ademocarcimon a coli Ademocarcinom a tubulare recti
EREDMÉNY EK I.
Az Országos Onkológiai Intézet Patológiai Osztályán végzett patomorfológiai vizsgálat szerint a jelen tanulmány tárgyát képezo betegek colonjából illetve rectumából eltávolított biológiai minták a szövettani vizsgálat során adenocarcinomának bizonyultak. Az onkológiai szempontból nem szelektált - tehát az idorendi sorrendben érkezo és a biokémiai vizsgálatra elegendo mennyiségu 28 vastagbél mintából 18 származott rectumból. A beteganyag
Duke’s szerinti csoportosításából kitunik, hogy a vizsgált
tumorok többségében (19/28) az invazivitás nem terjedt a nyirokcsomókra (Duke’s A illetve B). A vizsgált anyagunkban látható, hogy a mucosára szorítkozó két daganat között is elofordulhat gyors progresszió. A mutét idején a Duke’s B csoportba sorolt 17 daganatos beteg közül pedig háromban fejlodött ki halálos kimenetelu recidíva. A nyirokcsomók érintettségének a prognosztikai jelentosége látható a 3. táblázatban, amely mutatja, hogy a Duke’s C stádiumú 7 beteg közül csak ketto érte el a mutét utáni 58. illetve 64. hónapot. Megjegyzendo, hogy az 1991-1992 években a vastagbél daganatos betegek adjuváns gyógyszeres kezelésben nem részesültek, napjainkban azonban már kedvezobbek a Duke’s C stádiumú betegek életkilátásai is. Munkánk megkezdésekor elobb arra a kérdésre kívántunk választ kapni, hogy a radioaktív kollagén IV emésztéssel járó módszer alkalmazásakor a kollagenáz aktivitás milyen mértékben
különbözik a
malignus vastagbél daganatban és a környezo,
szövettanilag tumormentesnek ítélt szövetben
és ez hogyan változik
a malignus
progresszió során? A szövetek kollagén IV-t bontó képességének (MMP-2, MMP-9 aktivitás) vizsgálatára 3 H-al jelölt kollagén IV-et állítottunk elo. A Nakayama és mtrsai által leírt módszer [108] validálása céljából megvizsgáltuk a radioaktívan jelölt kollagén IV molekula tömegének kollagenáz kezelés utáni változását (2. ábra).
25
EREDMÉNY EK I.
2. ábra A [3 H]-kollagén IV vándorlása poliakrilamid gélen FCS kollagenáz emésztés elott és után
205
116
Az 1-es csík az emésztetlen [3 H]-kollagén IV vándorlását mutatja. A 2-es csík a borjúsavóval (FCS) eloinkubált, a 3-as a borjúsavóban található és 0.5 M APMA-val (4-aminofenilmerkuriacetát) aktivált kollagenáz által emésztett [3 H]-kollagén IV-t mutatja. A 4-es csík mutatja, hogy az emésztés kollagenáz specifikus, mivel azt a kollagenáz gátló phenantrolinnal gátolni lehetett.
A 2. ábrán látható, hogy a tríciummal jelölt kollagén IV (1) savó (FCS) jelenlétében nem bomlik (2), csak ha enzim aktivátort (APMA) adunk hozzá (3). A savóban jelenlévo, APMA- val aktivált enzimek kollagén IV-t bontó hatása phenantrolinnal, egy kollagenáz gátlóval felfüggesztheto (4). A radioaktív kollagénnel végzett vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a vizsgált tumoros és tumor környéki szövetminták hasonló mértékben hasították a radioaktív kollagént, és nem mutattak számottevo különbséget az egyes Duke’s stádiumok között még az APMA aktiválás után sem (4. táblázat).
26
EREDMÉNY EK I.
4. táblázat A vastagbél daganatok 3 H-kollagén IV-et bontó képessége Tumor
Környéki szövet
Duke’s
Eset
cpm/mg
Aktiválhatóság
cpm/mg
Aktiválhatóság
stádium
szám
fehérje
%
fehérje
%
A
2
1606
400
913
329
(620-3400)
(115-839)
(420-900)
(106-653)
2187
526
2044
648
(180-5240)
(101-2900)
(0-7440)
( 100-4000)
2083
418
1080
726
(1160-3060)
(90-795)
(560-2240)
(155-1432)
B
C
17
7
A fenti vizsgálati eredményeket áttekintve arra gondoltunk, hogy az MMP-2 és az MMP-9, valamint ezek aktív és inaktív formájának az
elkülö nítését lehetové tevo módszer
közelebbi betekintést enged a vastagbél daganatok kollagént hasító képességébe. Ezért a továbbiakban a zimogram technikát alkalmaztuk, amely igazolta várakozásunkat (3. ábra). A vizsgált mintákból az Anyag és Módszerben leírtak szerint homogenátot készítettünk és minden mintából 50 µg fehérje zselatináz tartalmát vizsgáltuk zimogramon. Megállapítottuk, hogy a vizsgált 28 minta közül 27 tartalmazott MMP-9-et, 22 pedig MMP-2-t. A tumor és az ép környezo szövet MMP-2 és MMP-9 tartalmában jelentos különbséget a két enzim aktivált formáiban (62 kDa, 82 kDa) figyeltünk meg. Az MMP-9 aktivált formáját (82 kDa) a tumorban 16, a környezo szövetben 10 esetben, az MMP-2 aktivált formáját (62 kDa) a tumorban 20, a környezo szövetekben 11 esetben észleltünk. A környezo, tumormentes szövetekben MMP-9-t 21 esetben, MMP-2-t 16 esetben észleltünk. A zimogram vizsgálati módszerrel -eltéroen a radioaktív módszertol- meg lehetett állapítani, hogy az MMP-9 aktivitása négyszer- ötször magasabb, mint a MMP-2 aktivitása mind a vastagbél daganatokban, mind azok környzetében. Különösnek tartható, hogy a Duke‘s B stádiumú tumoros szövetben a MMP-2 és MMP-9 aktivitása nem éri el a környzeto szövetekben mért aktivitás kétszeres emelkedését (1.8x), a Duke‘s C stádium esetében pedig ez a különbség még alacsonyabb (5. és 6. táblázat). A tumort körülvevo szövetek magas kollagenázt bontó aktivitása a mesenchymális sejteknek tulajdonítható 27
EREDMÉNY EK I.
vagy a szövettani vizsgálatban nem felismerheto invazív tumo rsejtek nagy mennyiségben termelnek MMP-t.
3. ábra
5. táblázat A MMP-2 és a MMP-9 aktivitás különbözo Duke’s stádiumú vastagbél tumorok környezetében Duke’s
n
Stádiumok
Kollagenáz aktivitás (Int. OD / g nedves súly ±SD) 72 kDa
62 kDa
92 kDa
82 kDa
A
2
0 ; 19.5
0 ; 2.2
0 ; 66.8
0;0
B
17
4.7+3.9
1.7+0.8
24.6+24
7.5+4.5
C
7
10.6+10.3
2.4+2.2
42.8+35
5.3+4.3
D
2
0; 19.8
0; 4.9
0; 64.5
0; 4.2
28
EREDMÉNY EK I.
6. táblázat A MMP-2 és a MMP-9 aktivitás Duke’s stádiumok szerint vastagbél tumorokban Duke’s
n
Kollagenáz aktivitás (Int. OD/ g nedves súly±SD)
stádiumok
72 kDa
62 kDa
92 kDa
82 kDa
A
2
0, 22.3
0 , 2.6
0; 81.3
0; 0
B
17
8.6+8.3
4.7+4.2
44.1+33.4
12.7+11.3
C
7
13.3+12.5
6.1+5.7
53.9+40.4
15.3+13.8
D
2
3.3 , 25.9
3.9 , 28.5
53 , 97.4
1.8 , 17.6
Miután biometriailag alátámasztható emelkedést az MMP-2, MMP-9 aktivitás és a Duke’s stádiumok között nem állapíthattunk meg, kapcsolatot kerestünk a betegek mutét utáni élettartama és az MMP aktivitás között. Összehasonlítottuk a 11 mutét után rövid és a 17 hosszú ideig túlélo betegek tumorainak kollagenáz IV aktivitását (7. táblázat). 7. táblázat A vastagbél tumorok MMP-2 és MMP-9 aktivitása rövid és hosszú túlélésu betegekben Kollagenáz aktivitás (Int. OD / g nedves súly±SD) n
MMP-2
MMP-2
MMP-9
MMP-9
72 kDa
62 kDa
92 kDa
82 kDa
11
16.2 + 12.0
8.3 + 8.2
63.0 + 33.7
13.5 + 18.1
17
7.6 + 10.2
3.8 + 5.0
37.8 + 25.2*
10.4 + 13.0
Rövid ideig túlélok 21 ( 8-45) hónap Hosszú ideig túlélok 57 (44-67) hónap * szignifikancia szint : P < 0.05.
Az öt éves követési ido végén az elvesztett és a túlélo betegek mutétileg eltávolított tumorának kollagenáz aktivitásait összehasonlítva figyelemre méltó különbséget lehetett tapasztalni, amely a 92 kDa zselatináz (MMP-9) esetében elérte a szignifikancia szint határát (P < 0.05).
29
EREDMÉNY EK I.
A vastagbél daganatok MMP aktivitása és a betegek túlélése közötti összefüggés tanulmányozásakor meg lehetett erosíteni az MMP-9 szerepét a tumor progresszióban. A 4. és 5. ábrán látható hogy a Kaplan-Meier ábrázolás szerint azoknak a vastagbél daganatos betegeknek kedvezobb a 60 hónapos túlélése, akiknek a tumorában az MMP-9 aktivitása az átlagnál alacsonyabb. 4. ábra A MMP-9 aktivitás és a vastagbél daganatos betegek mutét utáni túlélése közötti kapcsolat Kaplan-Meier szerinti ábrázolásban
92 kDa tumor
82 k D a tumor
1.0
< átlag
túlélési frakció
> átlag
túlélési frakció
1.0
< átlag > átlag
0.5
0.5
0.0 0
0.0 0
10
20
30
40
50
60
70
10
20
30
92 kDa környezo
60
70
82 kDa környezo
túlélési frakció
< átlag > átlag
túlélési frakció
1.0
< átlag > átlag
0.5
0.5
0.0 0
50
Logrank p = 0 , 2 4 6 test
L o g r a n k p=0,058 test 1.0
40
hónap
hónap
0.0 10
20
30
40
50
60
0
70
20
30
40
hónap
hónap Logrank test
10
p=0,073
Logrank p=0,510 test
30
50
60
70
EREDMÉNY EK I.
5. ábra A MMP-2 aktivitás és a vastagbél daganatos betegek mutét utáni túlélése közötti kapcsolat Kaplan-Meier szerinti ábrázolásban
72 kDa tumor
< átlag > átlag
0.5
0.0 0
1.0
túlélési frakció
túlélési frakció
1.0
0.0 0
10 20 30 40 50 60 70
Logrank p=0,672 test 1.0
< átlag > átlag
túlélési frakció
túlélési frakció
72 kDa környezo
10 20 30 40 50 60 70
hónap
Logrankp=0,559 test
62 kDa környezo
0.5
0.5
0.0 0
< átlag > átlag
0.5
hónap
1.0
62 kDa tumor
0.0 0
10 20 30 40 50 60 70
hónap
10 20 30 40 50 60 70
hónap
Logrank p=0,185 test
Logrank p=0,075 test
31
< átlag > átlag
EREDMÉNY EK I.
Következtetés : A fentiekben bemutatott adatok a kis számú beteganyag miatt természetszeruleg
csak
tájékoztató
jelleguek,
mégis
alátámasztották
a
mátrix
metalloproteázok biokémiai vizsgálatának indokoltságát és módszertani útmutatást nyújtottak. A zimogram technika lehetové tette az inaktív proenzim (92 kDa, 72 kDa) kimutatását, mivel a poliakrilamidba kevert SDS megváltoztatja az inaktív enzim háromdimenziós térszerkezetét és ezen keresztül aktivitását. Ez a módszer a radioaktív kollagén IV hasításán alapuló módszernél elonyösebb, mert így lehetséges a MMP-2 és az MMP-9 aktivitásának a különválasztása, valamint az élo szervezetben muködo aktivált formák (62 kDa, 82 kDa) kimutatása. A MMP-9 aktivitás magasabb értéke a gyorsan progrediáló tumorokban megerosítette számunkra azokat az irodalomban található megállapításokat, miszerint a mátrix metalloproteázok közremuködnek a daganatok progressziójában. Ugyanakkor a zselatináz aktivitásnak csupán jelzés értéku összefuggése a Duke’s stádiumokkal arra utal, hogy egyéb molekuláris tényezok is hozzájárulnak a tumor progresszióhoz.
32
EREDMÉNYEK II.
II. A mátrix metalloproteáz-9 szerepe az immunszuppresszált egérbe oltott szájüregi bazaloid laphámrák invazív növekedésében A MMP-k tumorbiológiai szerepének további tanulmányozására emberi szájüregi bazaloid laphámrákból kialakított xenograft modellt ho ztunk létre. A bazaloid laphámrák (BSCC), amely leggyakrabban a hypopharynxban, a larynxban, az epiglottison, a sinus piriformisban és a nyelv alatt fordul elo, egy igen gyorsan progrediáló rosszindulatú tumor [109, 110, 111]. Ez a tumor két sejtpopulációt - egy érett, elszarusodást mutató laphámrákot és egy bazaloid tumorsejtpopulációt - tartalmaz. Úgy gondoltuk, hogy a mátrix metalloproteázok tumor progresszióban betöltött szerepének a közelebbi megismerését elosegíti a BSCC két sejtpopulációjának az összehasonlítása. Szájüregi BSCC-bol emberi tumor xenograft modellt alakítottunk ki és így a klinikai onkológiában felvetett
néhány kérdésre kísérleti
rendszeren végzett vizsgálatokkal
kívántunk választ kapni. Intézetünkben nagy hagyománya van a rákkutatás egyik in vivo modelljének, az immunszuppresszált egerekbe oltott humán daganatok tanulmányozásának. Munkánkban thymectomián átesett CBA/CA egerek besugárzásával és csontvelo transzplantációjával immunszuppressziót hoztunk létre [95, 98]. Giavazzi [112], Gutman [113] és Nakajima [114] vizsgálatai igazolták a mikrokörnyezet jelentoségét a xenograft tumorok invazív növekedésében, amikor kimutatták, hogy metasztázisra az ortotopikusan, azaz a tumor kiindulási helyével azonos helyre transzplantált tumor képes. Úgy gondoltuk, hogy amennyiben sikerül ortotop xenograft modellt kialakítanunk, akkor lehetoségünk nyílik a szövettani kép, a tumor invazív növekedése és kollagenáz aktivitása közötti kapcsolat megfigyelésére. A Semmelweis Egyetem FOK Szájsebészeti Klinikáján kezelt beteg szájüregi bazaloid laphámrákjának (BSCC) ortotop (szájnyálkahártya alá) és heterotop (hátbor alá) leoltásával arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a BSCC két eltéro lokalizációjú xenograftjában létrejön-e olyan változás a két sejtpopuláció kapcsolatában, ami alapvetoen befolyásolja a tumor malignus viselkedését. Elobb azonban jellemezni kívántuk a HTB-1nek jelölt xenograft tumort és igazolni kívántuk, hogy a tumor megorzi humán és epitheliális eredetét.
33
EREDMÉNYEK II.
Morfológiai vizsgálatok A sebészileg eltávolított primer tumorban két epitheliális tumorsejt típus volt látható, amelyek mind citológiailag, mind hisztológiailag különböztek egymástól. A szövettani képen a laphám típusú tumorsejtek túlsúlya volt látható, amelyek szorosan egymáshoz kapcsolódva, elágazódó trabekulák formájában törtek a mélyebb szövetrétegekbe (1. kép). A laphámráksejtek között keratinizálódott eozinofil sejteket és szarugyöngyöket lehetett látni.
1. kép A primer tumor szövettani képe
A primer tumor szövettani képe, amelyen a laphámrák tumorsejtek és az általuk létrehozott szarugyöngy (nyíl) is látható (HE, 40x)
34
EREDMÉNYEK II.
A tumor mélyebb rétegeiben pedig bazaloid tumorsejteket is felismertünk. A bazaloid tumorsejtek - eltéroen a laphámrák sejtektol - hengeres formájúak, nagy, ovális, helyenként bizarr megjelenésu, erosen bazofil festodésu maggal, citoplazmájuk eozinofil festodést nem mutatott. A tumor a bazaloid laphámrák szövettani képét mutatta (2. kép).
2. kép A primer tumor mélyebben fekvo területének szövettani képe
A primer tumor egy másik területének szövettani képe, amelyen bal oldalon a bazaloid tumorsejtek (nyíl), jobb oldalon a laphámrák sejtek (kettos nyíl) láthatók (HE, 250x).
35
EREDMÉNYEK II.
A primer tumorban tapasztalt laphámrák dominancia ellenére már a xenotraszplantáció elso passzázsában, a szövettani kép a két sejttípus arányának jelentos változását mutatta. Az immunszuppresszált egér hátbore alá oltott tumorban (HTB1-a) a laphámrák sejtek dominanciája megszunt. A laphámrák sejtek a degeneráció számos jelét mutatták. Citoplazmájuk megduzzadt, vacuolák jelentek meg bennük, a sejtmagok kromatin tartalma helyenként összetömörödött, ami az apoptózis elofordulását jelzi. Másrészrol az életképes bazaloid tumorsejtek nagy számban voltak láthatók, helyenként adenoid struktúrákba rendezodve (3. kép).
3. kép A HTB-1a szövettani képe
A HTB-1a szövettani képe, amelyen az elszaporodott bazaloid tumorsejtek között a degeneráció jeleit mutató laphámrák sejtek (nyíl) láthatók (elso átoltás, HE, 100x).
36
EREDMÉNYEK II.
A tumor a második passzázstól kezdve bazaloid tumorsejtekbol állt, amelyek hol adenoid, hol cisztikus formákat mutattak (4. kép).
4. kép A HTB-1a szövettani képe
A HTB-1a szövettani képe (második átoltás, HE, 250)
37
EREDMÉNYEK II.
A negyedik passzázstól a szájnyálkahártya alatt is fenntartottuk a tumort (HTB-1b). A két eltéro lokalizációjú tumor szövettani megjelenésében eltéréseket találtunk, mivel a szájnyálkahártya alatt növekedo tumorban (HTB-1b) újra megjelentek a laphámráksejtek. Ez a jól látható szövettani különbség a tumor invazív fenotípusában is megnyilvánult. A keratinizált, eozinofil festodésu laphámráksejtek megjelenésével párhuzamosan, a szájnyálkahártya alatt fenntartott tumorban (HTB-1b) a tumorsejtek áttörték a kötoszöveti tokot (5. kép) és a környezo izomszöveteket infiltrálták.
5. kép A HTB-1b szövettani képe
A szájnyálkahártya alatt fenntartott tumorban a daganatsejtek áttörik a kötoszövetes tokot (nyíl) és az izomszövetet infiltrálják (HE,40)
Ez a jelenség csak az egér szájnyálkahártyája alatt fenntartott tumorban (HTB-1b) volt megfigyelheto. A hátbor alatt fenntartott tumor (HTB-1a) expanzív növekedést mutatott, a bazaloid tumorsejtek önmagukban nem mutattak infiltratív növekedést.
38
EREDMÉNYEK II.
A HTB-1 xenograft emberi és hám eredetének megerosítése A primer tumornak a fent említett jelentos szö vettani változásait látva, felmerült annak az igénye, hogy kizárjuk egy új, egér eredetu tumor megjelenésének lehetoségét. A módszer, amivel a tumor emberi eredetét vizsgáltuk azon alapszik, hogy az emberi szövetek LDH izoenzimei mind számban, mind a gélelektroforézis során végbemeno migrációjukat tekintve eltérnek az egérszövet LDH izoenzimeitol [115]. Amint azt a 6. ábrán láthatjuk, az ötödik passzázsból származó tumor LDH izoenzim mintázata az emberi LDH izoenzimek jegyeit mutatja és nem az egérét.
6. ábra A HTB-1 LDH izoenzim mintázata
39
EREDMÉNYEK II.
A
szöveti
eredet
meghatározása
érdekében
a
xenograft
negyedik
passzázsán
immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos vizsgálatokat végeztünk. Az epithel sejtekre jellemzo, immunhisztokémiailag kimutatható citokeratin a xenograft mindkét változatában jelen volt (6. kép).
6. kép A HTB-1b pancitokeratin immunhisztokémiai vizsgálata
Az immunreakció rozsdabarna színe a sejtek citoplazmájában látható (nyíl), a sejtmagokat nem érinti (250x).
40
EREDMÉNYEK II.
Az elektronmikroszkópos vizsgálat nagy, szabálytalan alakú sejteket mutatott, amelyek nyúlványokkal kapcsolódtak egymáshoz. A nyúlványok végén a hámsejtekre jellemzo dezmoszómák voltak láthatók. A tonofilamentumok, amelyek a hámsejtek másik jellemzoje, kötegek formájában voltak láthatóak a citoplazmában vagy a dezmoszómákhoz kapcsolódva (7. kép).
7. kép A HTB-1 elektronmikroszkópos képe
A képen az epitheliális eredetre jellemzo dezmoszómák (nyíl) és a hozzájuk kapcsolódó tonogén filamentumok (kettos nyíl) láthatók.
41
EREDMÉNYEK II.
A tumor növekedése A két eltéro lokalizációjú xenograft, lehetoséget nyújtott arra, hogy a bazaloid laphámrák bazaloid és differenciált laphámrák sejtpopulációját elkülönítve vizsgálhassuk. Korábbi tanulmányok azt bizonyították, hogy a xenotranszplantáció helye módosítani képes a tumorsejtek sejtes és biokémiai viselkedését, ide értve a kollagenáz aktivitást is. Ebbol a megfigyelésbol kiindulva összehasonlítottuk a két eltéro lokalizációjú xenograft növekedési jellegét és kollagenáz aktivitását. A
BSCC-bol
kialakított
HTB-1
xenograft
tumor
eltéroen
növekedett
az
immunszuppresszált egerek hátbore alatt (subcutan) és a szájnyálkahártya alatt. A tumor térfogata az ortotopikus transzplantáció esetén kisebb volt, mint a subcután lokalizációban. A subcután és a szájnyálkahártya alatt fenntartott tumorok kettozodési ideje 9,4+0,5 ill. 11,5+0,3 nap. Ez a különbség kétségtelenül több tényezonek is tulajdonítható ( pl. a rendelkezésre álló hely nagysága, lokális növekedési faktorok, vascularizáció ). Azo nban figyelemreméltó, hogy a subcután lokalizációban is lelassul a HTB-1 növekedési üteme, ha a tumorsejtek a szájnyálkahártya alatt növo tumorból származnak. Az a tény, hogy a tumor háromszor akkorára megnott a hátbor alatt, mint a szájnyálkahártya alatt már a növekedés korai szakaszában is megmutatkozik, amikor a tumor további növekedéséhez szükséges hely a szájnyálkahártya alatt is rendelkezésre áll. Jól mutatja ezt a különbséget az adott idopontban (Vt ) és a leoltás idején mért tumor térfogatának hányadosa (Vt /Vo ), ami azt jelzi, hogy az adott ido alatt a tumor hányszorosára nott meg. További érdekes eredményeket kaptunk a tumor "keresztbe oltásával", vagyis amikor a hátbor alatt fenntartott tumort a szájnyálkahártya alá oltottuk és fordítva (8. táblázat). Ha a tumort a hátbor alól oltottuk a szájnyálkahártya alá, akkor az nagyobb növekedési ütemet mutatott, mint a már elozoleg is a szájnyálkahártya alatt fenntartott tumor. A szájnyálkahártya alól a hátbor alá oltott tumor is gyors növekedésnek indult, igaz, az új szöveti környezetben az 50. nap után a tumor nagysága csökkenni kezdett. Ez a jelenség összhangban áll azzal a szövettani megfigyelésünkkel, miszerint a hátbor alatt fenntartott tumorban a laphámrák tumorsejtek degenerálódnak, majd fokozatosan eltunnek.
42
EREDMÉNYEK II.
8. táblázat A HTB-1 növekedése az immunszuppresszált egerek hátbore (subcutan) és szájnyálkahártyája alatt TRANSZPLANTÁCIÓ
TRANSZPLANTÁCIÓ
A SUBCUTAN FENNTARTOTT
A SZÁJNYÁLKAHÁRTYA ALATT
TUMORBÓL
FENNTARTOTT TUMORBÓL
A LEOLTÁS
SUB CUTÁN
Szájnyálkahártya
SUBCUTÁN
Szájnyálkahártya
HELYE
mm3 ±SD
alá
mm3 ±SD
alá
3
mm3 ±SD
mm ±SD Vt
Vt/ Vo
Vt
Vt/Vo
Vt
Vt/Vo
Vt
Vt/Vo
40. nap
1255± 82
37.5
681±173
20.3
382 ± 257
26.7
107± 42
7.4
50. nap
1668±866
49.8
1077± 449 32.1
989± 770
69.1
296± 120
20.6
55. nap
1729±1104 51.6
947±515
28.2
1222±235
85.6
399±116
27.9
60. nap
2292±2052 68.4
977±408
29.2
752±593
52.5
679±319
47.4
Minden csoportban 7-7 CBA/CA immunszuppresszált egér hátbore és szájnyálkahártyája alá oltottunk HTB1 tumort. A megadott idopontokhoz tartozó tumor térfogatok értékeit (Vt mm3 + s.d.) az Anyag és Módszerben leírtak szerint határoztuk meg. Vt/VO hányados a tumor növekedés ütemét jelzi. Vo az implantált tumor térfogata, Vt a tumor térfogata a jelzett idoben.
A proliferáció függo magi
antigén (PCNA) mennyiségének vizsgálata nem
eredményezett olyan adatokat, amelyek a két tumor eltéro növekedését magyarázná, habár a hátbor alatt fenntartott tumorban a PCNA expresszió kis mértékben nagyobb volt (9. táblázat).
9. táblázat PCNA expresszió az immunszuppresszált egér hátbore ill. a szájnyálkahártyája alá oltott HTB1-ben Átoltás
PCNA expresszió
Honnan
Hová
Integr.OD/ 10 µg protein
Hátbor alól
Hátbor alá
1.2
Szájnyálkahártya alól
Szájnyálkahártya alá
0.81
Hátbor alól
Szájnyálkahártya alá
1.0
Szájnyálkahártya alól
Hátbor alá
0.73
43
EREDMÉNYEK II.
A PCNA
(proliferating cell nuclear antigen)
relatív mennyiségét vizsgáltuk a tumorban 40 nappal a
xenotranszplentációt követoen az Anyag és Módszerben leírt Western-blot technikával. A színreakció denzitását Eagle -Eye denzitométeren (Stratagene USA) mértük és az általunk meghatározott egységekben adtuk meg. Az adatok három egymástól független minta értékeinek átlagát mutatják.
Összességében az adatok a hátbor alatt fenntartott (HTB-1a), bazaloid tumorsejtekbol felépülo tumor nagyobb növekedési ütemét jelzik. A bazaloid tumorsejtek szaporodási elonyét tapasztaltuk ugyanazon tumoron belül is az elso passzázsban, ahol a laphámrák sejtek a degeneráció jeleit mutatták (3. kép), míg az életképes bazaloid sejtek nagymértékben felszaporodtak. A mitózis és az apoptózis indexek jelentos különbségeket mutattak a tumor bazofil (bazaloid tumorsejtek) és eozinofil (laphámrák sejtek) területei között. A mitózis index a bazofil területeken magasabb volt, ellentétben az apoptózis indexxel, ami az eozinofil területeken volt magasabb (10. táblázat).
10. táblázat Az immunszuppresszált egerekben fenntartott bazaloid laphámrák (BSCC) mitózis és apoptózis indexei a leoltás helyének függvényében
Sejtpopuláció
Bazofil terület Eozinofil terület
BSCC a hátbor alatt
BSCC a szájnyálkahártya alatt
%±SD
%±SD
Apoptózis
Mitózis
Apoptosis
Mitosis
2,19+3,2%
6,74+3,5%
1,68+1,7%
5,7+3,2%
10,84+3,9%
0,28+0,9%
17,40+4,4%
2,1+0,9%
A hátbor alatt fenntartott tumor az elso leoltásból, a szájnyálkahártya alatt fenntartott tumor a negyedik átoltásból származik. A mitózis és apoptózis meghatározást az Anyag és Módszerben leírtak szerint végeztük.
Az 10. tábláza t mutatja, hogy a szájnyálkahártya alá oltva a tumort, az eozinofilen festodo differenciált laphámrák sejtek mitózisának gyakorisága jelentosen megnövekedett. A HTB két sejtpopulációjának a mikrokörnyezettol függo eltéro növekedését jól mutatja a mitózis/apoptózis arány, amelynek értéke a hátbor alá oltott, bazaloid sejtekbol álló területeken 3, a laphámrák sejtpopuláción belül 0,02, míg a szájüregi lokalizációban 3,4 ill. 0,12.
44
EREDMÉNYEK II.
Ploiditás és sejtkinetikai vizsgálatok A 7. ábra a primer tumor sejtjeinek áramlás-citometriai DNS-analízisét mutatja. Látható, hogy a primer tumor ploiditását tekintve homogén.
7. ábra A primer BSCC tumor áramlás-citometriai DNS vizsgálata
A primer BSCC tumor áramlás-citometriai vizsgálata. Az x tengelyen a G1, S és G2 fázisban lévo sejtek DNS tartalmát láthatjuk, az y tengelyen az adott fázisban lévo sejtek gyakoriságát a mintán belül. G1 fázisban lévo diploid sejteknek nevezzük azokat a sejteket, amelyek mért DNS tartalma megegyezik a véráramban keringo humán limfociták általunk mért DNS tartalmával.
A mérés validálása során a diploid sejtekre jellemzo DNS mennyiséget humán limfocitákkal határoztuk meg. Ez a mennyiség megfelelt a G1 fázisban lévo tumorsejtek DNS tartalmának, tehát a primer tumort diploid tumorsejtek építi fe l.
45
EREDMÉNYEK II.
A xenotranszplantáció során azonban a diploid sejtpopuláció mellett egy aneuploid tumorsejtpopuláció is megjelent a tumorban (8. ábra).
8. ábra A HTB-1a áramlás-citometriai DNS vizsgálata
Az egér hátbore alatt fenntartott tumor (HTB-1a; 4. passzázs) áramlás-citometriai vizsgálatát az Anyag és Módszerben leírtak szerint végeztük. A két G1 csúcs jelzi, hogy a tumorban megjelent a diploid sejtek mellett egy aneuploid populáció is.
A szolid tumorok sejtkinetikai paramétereinek a vizsgálatakor számításba kell venni a sejtpopuláció heterogenitását. A human tumor xenograftok esetében a tumor sejtek és az egér eredetu reaktív kötoszöveti sejtek elkülönítése megvalósítható egér elleni immunsavó alkalmazásával. Ezt a lehetoséget használtuk ki annak az eldöntésére, hogy a HTB-1 tumorban az aneuploiditás a tumor sejtpopuláció sajátossága vagy a gazda szervezet reaktív elemeinek tekintheto. Miután sikerült az egér eredetu kötoszöveti sejteket anti- mouse IgG jelölést használva megkülönböztetni a humán tumor sejtektol megállapíthattuk, hogy az aneuploid sejtek a tumor populációhoz tartoznak. Az anti- mouse IgG pozitív sejtek, azaz az egér eredetu kötoszöveti sejtek, egységesen diploidak voltak (9. ábra). Külön érdekességet jelent, hogy a primér BSCC-ben, tehát a mutétileg eltávolított tumorban aneuploid sejteket nem figyeltünk meg. Az anti- mouse IgG negatív 46
EREDMÉNYEK II.
sejtpopulációban, azaz a xenotransplantált human tumorsejtek között, diploid és aneuploid sejtek
egyaránt
megtalálhatók
(10.
ábra).
Igy
lehetséges,
hogy
a
BSCC
xenotransplantációja során fejlodött ki az aneuploid jelleg.
9. ábra Az egér MHC I pozitív sejtek (egér kötoszöveti sejtek) áramlás-citometriai DNS vizsgálata
Az egér hátbore alatt fenntartott tumor (4. passzázs) egér MHC I (H2Kk) pozitív (egér kötoszöveti sejtek) sejtjeinek áramlás-citometriai vizsgálata.
Említést érdemel továbbá, hogy a primér BSCC alacsony növekedési frakciójával szemben (S+G2) nagy számban (30 %) találhatók tumorban.
47
ciklusban lévo sejtek
a HTB-1
EREDMÉNYEK II.
10. ábra Az egér MHC I negatív sejtek (tumorsejtek) áramlás-citometriai DNS vizsgálata
A következokben arra a kérdésre kívántunk választ kapni, hogy a mikrokörnyezet, jelen esetben az egér hátbore illetve a szájnyálkahártyája alatti kötoszövet hogyan befolyásolja a HTB-1 ploiditását és sejtkinetikai paramétereit. A 11. táblázat adatai mutatják, hogy az ötödik passzázs után a hátbor alatt fenntartott,
bazaloid sejtekbol
felépülo tumor (HTB-1a) sejtjeinek közel 70%-a aneuploid volt. Amennyiben ezt a tumort a szájnyálkahártya alá oltottuk, akkor az aneuploid sejtek gyakorisága 44 %-ra csökkent.
48
EREDMÉNYEK II.
11. táblázat A hátbor és a szájnyálkahártya alatt növekedo HTB-1 ploiditása Sejtpopuláció
HTB-1a (Hátbor alatt)*
HTB-1b (Szájnyálkahártya alatt)**
Diploid (%)
30.7
55.8
Aneuploid (%)
69.3
44.2
A ploiditást, az 5. passzázsból, 40 nappal a leoltást követoen FACStar flow-citométeren (Becton-Dickinson, Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA.) határoztuk meg, ahogy azt az Anyag és Módszerben leírtuk. A százalékos eredmények három egymástól független mérés átlagai. A vizsgált sejtek egér MHC I pozitivitást nem mutattak, ami a vizsgált sejtek emberi eredetére utal. * a szövettani metszeten csak bazaloid tumorsejtek ismerhetok fel ** szövettani metszeten bazaloid és laphám sejtek egyaránt láthatók
A 12. táblázat adatai mutatják, hogy a hátbor alatt jól szaporodó bazaloid sejtpopulációban a növekedési frakciót foleg az aneuploid sejtek alkotják (S+G2=29.2%), mivel a diploid sejtpopulációban 92 % a G1 fázis gyakorisága. A HTB-1 szájnyálkahártya alá oltásával a diploid sejtek visszanyerték azt a képességüket, hogy a sejtciklus fázisain tovább haladjanak (S+G2=29.8 %). Ezzel párhuzamosan a szövettani képben újból megjelentek a laphámrák sejtek. Tehát a szájüreg alatt fenntartott tumor növekedéséhez nemcsak az aneuploid, hanem a diploid tumorsejtek is hozzájárulnak (12. táblázat). 12. táblázat A hátbor és a szájnyálkahártya alatt növekedo HTB-1 sejtpopuláció kinetikai paraméterei Sejtciklus
HTB-1a (Hátbor alatt)*
HTB-1b (Szájnyálkahártya alatt)**
fázisai
Diploid
Aneuploid
Diploid
Aneuploid
G1 (%)
92.7
71.0
70.2
70.0
S (%)
7.3
18.2
4.3
25.0
G2/M (%)
-
11.0
25.5
5.0
A HTB-1 tumort (5. passzázs) immunszuppresszált egerek hátbore és szájnyálkahártyája alá oltottuk, majd 40 nappal a leoltást követoen FACStar áramlás-citométeren (Becton-Dickinson, Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA.) vizsgáltuk. A sejtciklus fázisainak adatait három független mérés átlagaként kaptuk. A sejtek egér MHC I negatívak voltak. * A szövettani metszeten csak bazaloid tumorsejtek ismerhetok fel ** szövettani metszeten bazaloid és laphám sejtek egyaránt láthatók
49
EREDMÉNYEK II.
Zselatináz aktivitás a HTB-1a és a HTB-1b xenograftokban A zselatináz (MMP-2, MMP-9) aktivitást, mint az invazív növekedés egyik biokémiai markerét vizsgáltuk a sebészileg eltávolított primer tumorban, valamint a leoltást követo 40. és 50. napon mindkét lokalizációjú xenograftban. A 11. ábra mutatja, hogy a 72 kDa zselatináz (MMP-2) és aktivált formája mindegyik tumorban jelen volt. Ezzel ellentétben a 92 kDa zselatináz (MMP-9) és aktivált formája csak a primer tumorban és a szájnyálkahártya alatt fenntartott xenograftban (HTB-1b) volt jelen, míg a hátbor alatt fenntartott tumorban (HTB-1a) nem. 11. ábra A BSCC és xenograft vonalainak MMP-2 és MMP-9 aktivitása
11. ábra. A primer tumorból és a xenograftokból az Anyag és Módszerben leírtak szerint homogenátot készítettünk. A tumoronként 3-3 egérbol származó mintákból 50 µg fehérje mennyiség zselatináz aktivitását vizsgáltuk zimogramon.
Következtetés : A fenti vizsgálatokból azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a szájüregi BSCC-ból kialakított xenograft tumor orthotop és heterotop formáinak az összehasonlítása lehetoséget nyújtott a mikrokörnyezetnek a tumorsejtek egyes biológiai sajátosságaira irányuló hatásainak megfigyelésére. A szövettani vizsgálatokban azt tapasztaltuk, hogy ugyanazon tumornak a subcutan vagy a szájnyálkahártya alá történo implantációja a két sejtpopuláció szaporodását eltéroen befolyásolta. Immunhisztokémiai 50
EREDMÉNYEK II.
vizsgálatokban citokeratin pozitív, H&E festett metszeten eozinofiliát mutató sejtpopuláció csak az orthotop fenntartott tumorban, a szájnyálkahártya alatt alakult ki. A diploid jellegu túlnyomóan G1 fázisban lévo sejteket tartalmazó BSCC ploditása és
sejtkinetikai
sajátossága a mikrokörnyezettol függoen változik a xenotranszplantáció során. A hát bore alatt gyorsan növekedo tumor 70 %-ban aneuploid, amelyek egy harmada az osztódási ciklusban (S+G2 fázisban ) vesz részt. A subcután növo tumorban a diploid sejtek nem mutathatók ki az S és a G2 fázisban (92 %
a
G1
fázisban), ezzel szemben a
szájnyálkahártya alatt növo tumorban a diploid sejtek 30 %-a
található az S+G2
fázisokban. Igen elgondolkoztatónak tartjuk azt a megfigyelésünket, hogy csak az orthotopikus tumor mutatott invazív növekedést. A gyorsabban növekedo, szövettanilag túlnyomóan bazofil sejteket tartalmazó, subcutan fenntartott tumor nem mutatott infiltrációt a környezo szövetekbe, helyette az expanzív növekedést figyelhettük meg. Az eltéro jellegu növekedéssel hozható kapcsolatba az orthotopikus tumor MMP-9 aktivitása, amelyet a heterotopikus tumorban nem tudtunk kimutatni. Ez a következtetés kiindulási pontként szolgált vizsgálataink folytatásához, amelyben invazív növekedése és MMP aktivitása között.
51
kapcsolatot kerestünk a tumorsejtek
EREDMÉNYEK III.
III. A mátrix metalloproteáz-9 expresszió és a sejtproliferáció kapcsolata HT-1080 sejttenyészetben A mátrix metalloproteázok termelodésének igen összetett és egymástól különbözo szabályozásáról gyakran eltéro ismeretek lelhetok fel a szakirodalomban. Úgy gondoltuk, hogy ezek az ellentmondások arra vezethetok vissza, hogy a vizsgált sejttenyészetek proliferációs állapota különbözött egymástól. Erre vonatkozó összefüggésrol ugyan Fidler munkacsoportja [116] már megállapította, hogy immunhisztokémiai módsze rrel a tumor szélén mutatható ki a kollagenáz, ott, ahol a legnagyobb a sejtproliferáció is. Mi azonban érdemesnek tartottuk az MMP-2 (zselatináz A) és az MMP-9 (zselatináz B) termelodésének sejtproliferációtól függo változásait in vitro szövettenyészeti körülmények között is megvizsgálni. A 12. ábrán látható, hogy a HT-1080 fibrosarcoma sejtek által termelt és a tápfolyadékba szekretált MMP-2 és MMP-9 zselatináz mennyisége hogyan változik a sejttenyészet növekedése során.
12. ábra A MMP-2 és a MMP-9 aktivitásának változása a HT-1080 fibrosarcoma tenyészet tápfolyadékában
12. ábra. A zimogramok 2 x 103 sejt MMP-2 és MMP-9 termelését mutatják a tenyésztési ido függvényében. A 12. ábra egy reprezentatív képet mutat a párhuzamos kísérletekbol. Az adatok a 13. táblázatban láthatók.
52
EREDMÉNYEK III.
A 13. táblázatban láthatjuk, hogy a konfluens (96 órás) tenyészetben a 3 H-TdRbeépülés a huszad része volt a sejtszaporodás logaritmikus szakaszában (24 órás) lévo tenyészetének. A párhuzamos minták zimogramjainak denzitometriás kiértékelése azt mutatja (13. táblázat), hogy a sejttenyészet növekedése során a tápfolyadék MMP-9 aktivitása hatszorosára emelkedett, az MMP-2 aktivitásváltozás azonban nem mutatott összefüggést a sejtszám emelkedésével és a DNS szintézis csökkenésével.
13. táblázat A MMP-2 és MMP-9 aktivitásának változása HT-1080 sejtek tápfolyadékában a tenyészet növekedése során Tenyésztési ido
24 óra
48 óra
72 óra
96 óra
9+1.5
14+1.7
24.3+2.2
43.7+2.9
42.100±1460
-
-
2.400±355
1.36+0.63
2.25+0.55
2.31+1.3
1.37+0.22
0.5+0.2
0.81+0.28
3.14+1.57
3.06+0.45
Sejtszám (x104 sejt±SD ) 3
H-TdR beépülés a DNS-be (cpm/104 sejt ±SD)
MMP-2 aktivitás (Int.OD/104 sejt±SD)
MMP-9 aktivitás (Int.OD/104 sejt±SD)
A sejtszám változása az ido függvényében, a 3 H-TdR-beépülés és
a kondicionált médiumok zimogramjainak
denzitometriás kiértékelése. n=3. A kísérletet háromszor megismételtük hasonló eredménnyel. 3 H-TdR jelölés a tenyésztés utolsó órájában, 1 µCi/ml koncentrációban történt.
A továbbiakban két olyan szövettenyészeti beavatkozásnak a hatását vizsgáltuk a MMP-2 és MMP-9 termelésre, amelyek módosítják a tenyészet proliferációs állapotát. A borjú savó megvonása a tenyészettol lassítja, a TPA adagolása pedig serkenti a sejtproliferációt. Eloször arra kerestük a választ, hogy mi történik a sejtek MMP-2 és MMP-9 termelésével, ha megvonjuk a tenyészettol a sejtszaporodást serkento savót (13. ábra). A 48 órás gyorsan szaporodó tenyészetben mindkét enzim csak kis mennyiségben mutatható ki a sejtekben, a savó elvonását követoen emelkedett az MMP-9, de csökkent az MMP-2 aktivitás. Az idosebb, surubb tenyészetben (96 órás), ahol a sejtszaporodás lassú, sokkal több MMP-2 és MMP-9 mutatható ki a sejtekben, mint a fiatal tenyészetben. A savó 53
EREDMÉNYEK III.
elvonása ebben az esetben mindkét enzim aktív formáinak - a 62 kDa és a 82 kDa - a fokozott megjelenését, ugyanakkor a 72 kDa MMP csökkenését eredményezte.
13. ábra Az MMP-2 és az MMP-9 aktivitás változása HT1080 sejtekben szérum (FCS) jelenlétében és hiányában
A 13. ábra egy reprezentatív képet mutat a párhuzamos mintákból (n=3).
Eldöntendo kérdésnek tartottuk, hogy a MMP-9 aktivitásnak a HT-1080 sejttenyészet növekedése során megállapított emelkedésében mennyiben játszik szerepet a sejtsuruség változása. A kérdés tisztázására olyan vizsgálati rendszert alakítottunk ki, amelyben összehasonlítottunk két olyan sejtpopulációt, amelyek közül csak az egyiknek volt nagy a proliferációs aktivitása, de mindkettoben közel azonos volt a sejtsuruség. Ismeretes, hogy a sejttenyészetek növekedési üteme függ az induló sejtszámtól, ezért a magas és alacsony induló sejtszámú tenyészetek különbözo proliferációs állapotban érik el az azonos sejtsuruséggel jellemezheto állapotot. Emellett a proliferáció szerepének a további igazolására a tenyészetek egy részét TPA- val stimuláltuk. A 14. táblázat adatai mutatják, hogy a magas sejtszámmal indított tenyészet még TPA jelenlétében is alig növekedett. Az alacsony sejtszámmal indított tenyészet 72 óra alatt a populáció 54
EREDMÉNYEK III.
megháromszorozásával ért el hasonló szintu sejtsuruséget. A MMP-2 összehasonlításában a MMP-9 aktivitása jelentosen alacsonyabb a gyorsan szaporodó tenyészetben, azonban a lassan növekedo tenyészetben a két zselatináz aktivitása közel azonos tehát a csökkent sejtproliferáció mellett megemelkedett az MMP-9 aktivitása. A TPA a lassan szaporodó tenyészetben a MMP-2 aktivitását fokozta, amely arra utal, hogy a két zselatináz PKC (a TPA támadási pontja) függo szabályozását a sejtproliferáció módosíthatja. Ezekbol a változásokból kitunik, hogy a MMP-2/MMP-9 hányados a gyorsan növekedo tenyészetben háromszor nagyobb, mint a nem szaporodó tenyészetben. Figyelemre méltó a TPA ellentétes hatása egyfelol a két zselatinázra, másfelol a proliferáló és a nem proliferáló tenyészetre, amelynek következtében nem érvényesülhet a MMP-2/MMP-9 hányados sejtproliferációtól függo változása. Vizsgálataink eredményei arra utalnak, hogy a MMP-9 aktivitás változása a sejtproliferáció ütemével és nem a sejtsuruséggel hozható kapcsolatba.
14. táblázat TPA hatása a gyorsan és a lassan szaporodó HT1080 tenyészet MMP-2 és MMP-9 aktivitására
Tenyészet
TPA Sejtsuruség a MMP-2 10 nM tenyésztés végén (integ.OD/104 sejt ±SD) ( x 106 /5 ml .) Gyorsan növekedo 5.93±2.41 3.52 tenyészet (induló sejtszám : 3.72±1.34 + 6.53 6 (indulási sejtsuruség)
MMP-9 (integ.OD/104 sejt ±SD)
MMP-2 MMP-9
2.18±1.22
2.7
10.2±2.47
0.36
10 / 5 ml tápfolyadék)
Lassan növekedo tenyészet
-
5.78
7.75±1.77
8.01±1.54
0.96
(induló sejtszám :
+
6.00
15.3±1.68
9.39±1.13
1.62
6
5x10 / 5ml tápfolyadék)
A MMP-9 aktivitásának a sejttenyészet proliferációs állapotával kapcsolatba hozható emelkedésében gén szintu szabályozást sejtettünk, amit késobb, munkacsoportunk vizsgálatát folytatva Szarvas Tibor real time PCR technika alkalmazásával megerosített (14. ábra).
55
EREDMÉNYEK III.
14. ábra A MMP-9 mRNS expresszió a HT1080 sejttenyészet 48. és 96. órájában
Szarvas Tibor vizsgálati adatai
A 14. ábra adatai mutatják, hogy a 48 órás tenyészet sejtjeiben a MMP-9 mRNS-rol átíródó reakciótermékek mennyisége kb. 3 ciklussal le van maradva a 96 órás tenyészethez képest. Mivel a cDNS-rol átíródó nukleotid termékek a polimeráz láncreakcióban ciklusonként megkétszerezodnek a három ciklust kitevo különbség arra utal, hogy ebben a kísérletben a 48 órás tenyészet sejtjeiben kb. hatszor kevesebb MMP-9 mRNS volt, mint a 96 órás tenyészet sejtjeiben. Ezt a kísérletet kétszer megismételve mindig azt láthattuk, hogy az MMP-9 mRNS expresszió a 96 órás HT-1080 tenyészetben többszöröse a 48 órásénak. Miután megállapítottuk a MMP-9 aktivitás sejtproliferációtól függo változását, valamint saját klinikai és kísérleti vizsgálati adataink megerosítik közremuködését a tumor progresszióban, arra gondoltunk, hogy a HT-1080 tenyészetben a lassan osztódó sejtek invazív növekedése kifejezettebb, mint a gyorsabban osztódóké és ez a különbség a vándorlási ( migrációs ) képességük vizsgálatakor kimutatható. Ennek megállapítására 56
EREDMÉNYEK III.
alkalmasnak ígérkezett a tumorsejtek háromdimenziós (3-D) tenyészete, amelyben az egyrétegben (monolayer) szaporodó sejtek invazivitása úgy nyilvánul meg, hogy a rájuk helyezett gél-rétegbe behatolnak. A 15. táblázat adatai mutatják, hogy a 96 órás HT-1080 tenyészet sejtjei, amelyek MMP-9 aktivitása emelkedett ( 13. táblázat), jobban vándorolnak, mint a tenyésztés 48. órájában. A vándorló és nem vándorló sejtek arányának a tenyészet korától függo eltérése azonban csak az EHS-ECM gélbe történo vándorláskor jön létre és nem figyelheto meg, ha a sejtek fibrinbe vándorolnak. Ennek magyarázatát abban látjuk, hogy az EHS-ECM tartalmazza azokat a biopoliméreket, amelyeket a MMP-9 le tud bontani.
15. táblázat
Vándorlás szubsztrátuma
EHS-ECM Fibrin
A HT-1080 sejtek vándorlásának összehasonlítása a 48 és 96 órás 3-D-tenyészetben 48 órás tenyészet 96 órás tenyészet Nem vándorolt Nem vándorolt sejtek száma Vándorolt sejtek sejtek száma Vándorolt sejtek 4 4 (x10 ±SD ) száma (x10 ±SD) száma (x104 ±SD) (x104 ±SD) 9.7±0.5 10.0±1.2 2.3±0.3 41.7±3.5 11.2±0.6 13.0±1.4 24.7±2.3 18.9±2.5
Következtetés : a fenti kísérleti adatok rávilágítanak a MMP aktivitásának sejtproliferációtól függo változására a HT-1080 fibrosarcoma tenyészetben. A MMP-2 és a MMP-9 zselatint bontó képessége azonban eltéroen változott a sejttenyészet növekedése során, amely a szabályozásuk különbözoségére utal. A HT 1080 sejttenyészet tápfolyadékában, a 24. órában, 2.7 volt a MMP-2/MMP-9 hányados, míg a 96 órás tenyészetben ez az érték 0.45. A HT-1080 sejttenyészet növekedési ütemének csökkenésével együtt járó MMP-9 aktivitás emelkedés kapcsolatba hozható a tumorsejtek fokozottabb bevándorlásával az ECM közegbe.
57
EREDMÉNYEK IV.
IV. Melphalánhoz kapcsolt kollagén eredetu peptidek citosztatikus hatásának vizsgálata
A malignus folyamatokban résztvevo mátrix metalloproteázokat vagy maguk a tumorsejtek, vagy a tumort körülvevo mesenhymális sejtek termelik nagy mennyiségben, az un. " tumor-cell-associated " faktorok indukáló hatására [117 a és b, 118]. A daganatok magas kollagenáz aktivitását látva felvetodött az a gondolat, hogy a kollagenázok hasznosíthatók a daganat-ellenes gyógyszerek tervezésében, mint potenciális célpontok, vagy mint aktivátorok. A kollagenázok átalakíthatják a gyógyszermolekulákat azáltal, hogy hasítják azokat, amennyiben megfelelo hasítási helyet találnak rajtuk, így elvileg megvalósítható azok aktiválása is. Ezáltal fokozhatják a gyógyszermolekulák „specifikus ” tumor-ellenes hatását, hiszen csak a magas kollagenáz aktivitású szövetekben – pl. daganatszövet - érik el az aktív molekulák a terápiás koncentrációt. Ehhez azonban a gyógyszermolekuláknak tartalmazniuk kell a kollagén molekula azon szakaszát, amelyet a kollagenázok hasítási helyként ismernek fel [119, 120]. Van Wart és munkatársai [121] megállapították, hogy a kollagenáz hasítási helyének specifikusságát a kollagén molekulában, a 773. aminosavtól a 779. aminosavig terjedo szakasz határozza meg. Megállapították, hogy ezen hexapeptid P'2 pozíciójában lévo alanint módosítani lehet az enzimaktivitás befolyásolása nélkül. Ez a megfigyelés adott útmutatást arra, hogy a hexapeptid P'2 pozíciójában lévo alanint fenilalanin- mustárra (melphalánra) lehetett cserélni (15. ábra). Mivel a korábbi vizsgálatok szerint a melphalánt (Mel) tartalmazó peptidek annál toxikusabbaknak bizonyultak, minél rövidebb volt a peptidláncuk [122,123], ezért Süliné-Vargha Helga feltételezte, hogy a kollagén eredetu peptidet hordozó melphalán szelektív toxicitása megno az emelkedett kollagená z aktivitással rendelkezo tumorszövetekben, amennyiben a hexapeptidbol egy rövidebb tripeptid-Mel konjugátum szabadul fel (15. ábra).
58
EREDMÉNYEK IV.
15. ábra
15. ábra Mel-melphalan, MHP-melphalán-hexapeptid, MTP-melphalán-tripeptid
59
EREDMÉNYEK IV.
A kollagenázok le hetséges hasznosíthatósága eldöntésére a daganatelleni gyógyszerek tervezésében az alábbi három kérdésre kívántunk választ kapni: 1./Hogyan változik a melphalán (fenilalanin- mustárnitrogén) sejtproliferációt gátló hatása ha hozzá kollagenáz hasító helyet tartalmazó peptid kötodik ? 2./A kollagenáz aktivitása változik-e melphalán és peptidjei hatására? 3./A kollagenáz befolyásolja-e a MHP citotoxicitását és átalakulását?
Melphalán peptidek citosztatikus hatásának összehasonlítása A melphalán és két peptid konjugátumának hatását a HT1080 sejttenyészet szaporodására a 16. ábra mutatja. Annak ellenére, hogy mind a három vegyület azonos citotoxikus csoporttal rendelkezik (fenilalanin- mustárnitrogén) és kémiai-reaktivitási sajátságaik azonosak ( Süliné-Vargha Helga tájékoztatása), mégis megegyezo moláris koncentrációkban eltéro mértékben csökkentették a HT-1080 tumorsejtek szaporodását. A MTP a melphalánnál hatékonyabbnak bizonyult, míg a MHP lényegesen kevésbé gátolta a sejtproliferációt. 16. ábra
96-lyukú tenyésztoedényben lyukanként 100 µl tápfolyadékban (RPMI 1640, 10% FCS) 5000 sejttel indítottuk a tenyészetet. A kezelés a tesztanyagokkal a 24. órában történt az ábrán látható végkoncentrációban. A proliferáció változását SRB teszttel (Anyag és Módszer) mértük. n=8. 60
EREDMÉNYEK IV.
A melphalán és a peptid származékai közötti hatástani különbséget számszeruen mutatják az IC50 értékek : MTP 0.6 µM, melphalán : 3µΜ, MHP : 20.5 µM. Hasonlóképpen a HT168/M1 sejttenyészetben is – amely csak MMP-2-t termel - a MTP antiproliferativ hatása volt a legerosebb (IC 50= 0.7 µM), a
MHP
pedig csak 100 µM feletti
koncentrációban érte el az 50%-os gátlást. A melphalán és származékainak antiproliferatív hatását a kollagenázt alig termelo HT 29 sejttenyészeten a 17. ábra mutatja.
17. ábra
A kísérletet ugyanúgy végeztük, mint a HT1080 sejtek esetében (16. ábra). n=8
Várakozásunkkal ellentétben a MHP hatékonysága sejttenyészetekben nem tükrözte a két sejtvonal
a HT-1080 és HT-29
MMP-2 és MMP-9 termelésében
megnyilvánuló különbséget. Lehetségesnek tartottuk, hogy a melphalán és peptid származékai gátolják a MMP-k termelését vagy aktivitását, ezért a melphalán-hexapeptid aktiválása - tehát átalakulása MTP-vé - nem következhet be.
61
EREDMÉNYEK IV.
A melphalán peptidek és a kollagenázok kapcsolata
A következokben összehasonlítottuk a melphalán és peptid származékainak hatását a sejtproliferációra és a kollagenázok aktivitására. Megállapítottuk, hogy a melphalán és a MTP 10-6 és 10-5 M koncentrációban jelentosen csökkenti mind a MMP-2, mind a MMP-9 aktivitását, míg a MHP kevésbé befolyásolja. Ennek a hatásnak egy reprezentatív példáját mutatja a 18. ábra.
18. ábra Melphalán és peptid származékainak hatása a MMP-2 és a MMP-9 aktivitására HT1080 sejttenyészet tápfolyadékában
A HT 1080 sejteket 18 órán keresztül kezeltük a tesztanyagokkal szérumot tartalmazó tápfolyadékban, majd friss szérum-mentes tápfolyadékban 24 órán keresztül „kondicionáltuk” a tenyészetet. A „kondicionált” tápfolyadékok (20-20 µl) kollagenáz aktivitását zselatin-zimogram technikával vizsgáltuk meg.
62
EREDMÉNYEK IV.
A MMP változások denzitometriás kiértékelésekor nyert adatokat összevetve a sejtproliferáció változásaival, megállapítható, hogy a vizsgált citosztatikumok a tumor sejttenyészet növekedését jobban csökkentik, mint a MMP aktivitásokat. A MTP kezelés nem csökkentette a két MMP aktivitását olyan mértékben, mint ahogy azt a kontrollhoz viszonyított proliferáció csökkenéstol vártuk, tehát a túlélo sejttenyészetekben még valamelyest fokozódott a kondicionált tápfolyadék MMP aktivitása. A MHP kezelés hatására pedig a kontroll csoporthoz viszonyítva megnott a kondicionált tápfolyadék MMP-2 és MMP-9 aktivitása. Így nem valószínu, hogy a MMP csökkentése miatt nem aktiválódik a melphalán-hexapeptid. (16. táblázat).
16. táblázat A sejtproliferáció és a MMP-2, MMP-9 expresszió változása melphalán és peptid származékainak hatására HT 1080 sejttenyészetben
HT 1080
Melphalán hatása
MTP hatása
MHP hatása
a kontroll %-ában
a kontroll %-ában
a kontroll %-ában
1 µM
10 µM
1µΜ
10µΜ
1µΜ
10µΜ
Proliferáció
65
38
25
14
85
60
MMP-2 aktivitás
65
50
55
43
135
65
MMP-9 aktivitás
60
42
51
35
128
102
A táblázat a 16. ábrán bemutatott zimogramok kiértékelését mutatja.
A következo kísérletben a MHP hatását próbáltuk módosítani a HT-29, HT-168/M1 sejttenyészethez kívülrol adott bakteriális kollagenázzal. A 10 µM MHP kezelés nem okozott proliferáció csökkenést a HT 29 sejttenyészetben. A HT168/M1 tenyészetben is csak 25%-os volt a sejtproliferáció csökkenése. Ugyanakkor bakteriális kollagenáz hozzáadására ugyanaz a koncentrációjú MHP hatásosabbnak bizonyult, különösképpen a HT-168 sejttenyészetben (17. táblázat).
63
EREDMÉNYEK IV.
17. táblázat A MHP sejttenyészet növekedését befolyásoló hatásának módosítása bakteriális kollagenázzal A sejtproliferáció változása a kezelések hatására (kontroll % ±SD) MHP
Kollagenáz *
10 µM MHP +
(10 µM)
(5 µg/ml)
Kollagenáz 5 µg/ml *
HT 168
74.2 + 3.8
99.8 + 11.9
4.8 + 1.4
HT 29
99.5 + 8.0
112.5 + 12.1
36.7 + 3.2
Sejtek
*Clostridium histolyticumból eloállított kollagenáz. A sejtszaporodást a kezelést követo 48. órában vizsgáltuk SRB teszttel. Az értékeket kontroll százalékban fejeztük ki (n=8).
Melphalan-hexapeptid átalakulása melphalán-tripeptiddé Az elozokben bemutatott kísérlet adatai arra utalnak, hogy a bakteriális kollagenáz felszabadította a sokkal toxikusabb MTP-t az MHP-ból, bár nem zárható ki egyéb hatásmechanizmus szerepe sem. Ennek a kérdésnek az eldöntésére Süliné Vargha Helga munkacsoportja megvizsgálta a MTP megjelenését HT1080 sejttenyészet tápfolyadékában 24 órás MHP kezelés után. A HPLC technika alkalmazásával meg lehetett állapítani, hogy a MHP-ból
MTP szabadul fel, amely kimutatható
a HT-1080 sejtenyészet
tápfolyadékában (19/A ábra). A MTP képzodés kollagenáz függoségére enged következtetni
az
átalakulás
elmaradása
metalloproteázok gátlója (19/B ábra).
64
phenantrolin
jelenlétében,
amely
a
EREDMÉNYEK IV.
19. ábra Melphalán-hexapeptid átalakulása melphalán-tripeptiddé HT 1080 sejttenyészet tápfolyadékában
A HT 1080 sejttenyészet kondícionált médiumában 10 µg/ml koncentrációban inkubáltuk a MHP-t 24 órán keresztül, 37 Co -on, kollagenáz gátló (1 mM phenantrolin) jelenlétében (A) és hiányában (B). Az 1-sel jelölt csúcs a MHP-nak, a 2-sel jelö lt a MTP-nek felel meg. A 19/A ábrán látható a MHP (1. csúcs) dominanciája a kollagenázt gátló phenantrolin jelenlétében. A MTP képzodését bizonyítja a 2. csúcs jelentos emelkedése, amely a HT1080 tenyészet kondícionált médiumában lévo kollagenáznak tulajdonítunk.
Következtetések : a fentiekben bemutatott kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a melphalán citosztatikus hatása a kollagén-peptid kötésben jelentosen módosul, a hexapeptid származéka a melphalánnál kevésbé toxikus, azonban annál hatékonyabb a melphalán-tripeptid. A kollagenáz hasító helyet tartalmazó melphalán-hexapeptid hatékonysága azonban nem hozható egyértelmuen kapcsolatba a tumorsejtek MMP aktivitásával, ugyanakkor az exogén bakteriális kollagenáz jelenlétében a citosztatikus hatása fokozódott. A kollagenáz aktiválás szerepére további utalást jelent az, hogy 65
EREDMÉNYEK IV.
sejtmentes körülmények között a HT1080 tenyészet kondícionált médiuma hatására amely MMP-t tartalmaz - a MHP-bol a toxikusabb MTP-t képzodik. Az egymásnak ellentmondó kísérleti adatok hátterében lévo mechanizmust ugyan nem ismerjük, de a számba jövo lehetséges szempontokat a „Megbeszélés” fejezetben tárgyaljuk.
66
EREDMÉNYEK V.
V. Antiszenz oligonukleotid hatása HT1080 humán fibrosarcoma sejtek MMP-9 termelésére és invazív növekedésére A malignus fenotípus kialakulásáért felelos gének muködésének szelektív gátlása a gyógyszerkutatás egyik feladata napjainkban. Ennek egyik ígéretes lehetosége tárult fel az antiszenz oligonukleotidok (AON) tervezésének, szintézisének és hatástani vizsgálatának széles köru elterjedésével [124]. Az AON-k szelektíven kötodnek a célpontként kijelölt mRNS-hez a Watson-Crick bázis pár komplementaritási elv alapján és ezúton gátolják a mRNS által kódolt fehérje képzodését. Az AON-k gyógyszerfejlesztési hasznosítását azonban a költséges technológia mellett kedvezotlenül befolyásolja a rossz hatékonyságú transzportjuk és a nukleázokkal szembeni érzékenységük. Ez utóbbi tulajdonságok kiküszöbölését szolgálta a perthio származék eloállítása, tehát az oxigén (O) kicserélése kénre (S) az AON foszfodiészter láncában. Ez a módosítás egyfelol elonyos,
mert
csökkentette az AON
nem
nukleázokkal szembeni érzékenységét és
lényegesen
változtatta a hibridizációs képességét [125], másfelol viszont a kémiai módosítás elosegítette kötodésüket a fehérjékhez és ennek következtében toxikus mellékhatások (pl. thrombocytopaenia) léphetnek fel. A Semmelweis Egyetem I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetében Prof. Kopper László és Dr. Kovalszky Ilona megtervezték a MMP-9 enzim aktív doménjének 346-329 közötti szakaszával komplementer AON-t (5’-GGT TTG GAA TCT GCC CAG 3’). A FASTABASE computer adatbankból származó információ szerint ez a génszakasz nem mutatott nagy gyakoriságú homológiát más génszakaszokkal. A megtervezett MMP-9 AON-t, amelyet CRIC-2-nek neveztek el, az MTA KKKI nukleotid munkacsoportja Ötvös, Sági, Gruber vezetésével szintetizálta és jellemezte [126]. A CRIC-2 módosítását Ötvös munkacsoportja nemcsak a már szokványos foszfodiészter láncon, hanem az általuk szabadalmaztatott pirimidin módosítással is elvégezték. A pirimidinhez kapcsolt hexinil csoport, mint eredeti hazai hozzájárulás az AON technológiáho z lehetové tette számunkra, hogy biológiai vizsgálatainkban a CRIC-2-nek négy változatát tanulmányozhassuk: CRIC-2/6 = kémiai módosítás nélküli, natív AON CRIC-2/12 = a primidin 5 helyzetében hexinil csoportot tartalmazó AON. CRIC-2/13 = az AON bázisait foszforotionát köti össze és a pirimidinekhez hexinil csoport kapcsolódik, tehát a módosítás mind a két helyen megtörtént. CRIC-2/14 = az AON foszforotionátot tartalmaz. 67
EREDMÉNYEK V.
Munkacsoportunk számára az elso feladat az volt, hogy a CRIC-2 AON szelektív MMP-9-gátló hatását kimutassa.
A 20. ábrán látható, hogy a MMP-9-t és MMP-2-t
egyaránt termelo HT-1080 sejtenyészetben a CRIC-2/6 szelektíven gátolja a MMP-9-t. Hasonlóképpen a CRIC-2/12, a CRIC-2/13 és a CRIC-2/14 termékek is - még az alkalmazott legmagasabb koncentrációban (30 µg/ml) is - kifejezetten csak a MMP-9-t gátolták (21., 22., 23. ábra).
20. ábra A MMP-2 (72 kDa) és a MMP-9 (92 kDa) szekréció változása HT1080 fibrosarcoma tenyészetben CRIC-2/6 AON kezelés után
µg/ml
A 20., 21., 22., 23. ábrán bemutatott kísérletekben a 24-lyukú tenyésztoedényben lyukanként 105 HT1080 sejtet tenyésztettünk 400 µl RPMI 1640+10% FCS tápfolyadékban. A tenyésztés
24. órájában
a
tápfolyadékokat szérum mentesre cseréltük (3 x mosás után), amelyek tartalmazták a tesztanyagokat az ábrákon látható végkoncentrációkban. A 48. órában leszívtuk a tenyészetekrol a "kondícionált" tápfolyadékokat, majd centrifugálás (1500 rpm, 10 perc) után, a felülúszókból vett, 104 sejtre számított aliquotot vizsgáltuk zselatin zmogramon. Mintánként legalább három párhuzamossal dolgoztunk, amelyekbol az ábrák reprezentatív példákat mutatnak be.
68
EREDMÉNYEK V.
21. ábra A MMP-2 (72 kDa) és a MMP-9 (92 kDa) szekréció változása HT1080 fibrosarcoma tenyészetben CRIC-2/12 AON kezelés után µg/ml
22. ábra A MMP-2 (72 kDa) és a MMP-9 (92 kDa) szekréció változása HT1080 fibrosarcoma tenyészetben CRIC-2/13 AON kezelés után
µg/ml
69
EREDMÉNYEK V.
23. ábra A MMP-2 (72 kDa) és a MMP-9 (92 kDa) szekréció változása HT1080 fibrosarcoma tenyészetben CRIC-2/14 AON kezelés után
µg/ml
A 20., 21., 22., 23. ábrákon látható zimogramok számszeru kiértékelését a 18. táblázat mutatja, amelyen leolvasható, hogy a HT-1080 tenyészet kondícionált médiumában mind a négy antiszenz oligonukleotid csökkenti a MMP-9 aktivitását. Ezzel szemben az MMP-2 figyelemreméltó eltérést csak a CRIC-2/12 20 és 40 µg/ml-es kezelés után mutatott , ahol aktivitása megnott.
70
EREDMÉNYEK V.
18. táblázat A CRIC-2 hatása a MMP-2 és MMP-9 aktivitásra a HT1080 sejttenyészet kondícionált tápfolyadékában Vegyület
Denzitometriás értékek (Int.OD+SD; kontroll%) 92 kDa
72 kDa
193 + 47 (100%)
519 + 48 (100%)
2 µg/ml
94.6 + 11 (49%)
679.9 + 65 (131%)
10 µg/ml
44.4 + 10 (23%)
736.9 + 152 (142%)
16 µg/ml
0
690.3+122 (133%)
30 µg/ml
0
441.2+74 (85%)
1 µg/ml
90.7 + 11 (47%)
638 + 200 (123%)
20 µg/ml
65.6 + 4.0 (34%)
690.2 + 20 (133%)
40 µg/ml
73.3 + 24 (38%)
825.2+ 198 (159%)
2 µg/ml
59.8 + 34 (31%)
503.4+ 76 (97%)
50 µg/ml
52.1 + 4 (27%)
669.5 + 95 (129%)
2 µg/ml
171.7 + 34 (89%)
430.7 + 104 (83%)
10 µg/ml
59.8 + 7 (31%)
586.5 + 110 (113%)
50 µg/ml
65.6 + 11 (34%)
581.3 + 156 (112%)
Kontroll CRIC-2/6
CRIC-2/12
CRIC-2/13
CRIC-2/14
A szelektivitás további igazolására megvizsgáltuk, hogy az AON-k (CRIC-2/6, CRIC-2/13) megváltoztatják-e a proliferációt vagy a fehérjeszintézist a MMP-9-t gátló koncentrációban (19. táblázat).
71
EREDMÉNYEK V.
19. táblázat Az AON hatása a HT1080 sejttenyészet proliferációjára és fehérje szintézisére Sejtszám
14C-aminósav beépülés
Kezelés
(x 104 /sejttenyészet±SD)
(cpm/sejttenyészet±SD)
Kontroll
13.9 + 1.5
17 786 + 3060
CRIC-2/6 1 µg/ml
14.0 + 2.0
19 713 + 2304
CRIC-2/6 10 µg/ml
12.3 + 3.7
15 837 + 5650
CRIC-2/6 20 µg/ml
18.0 + 1.0
18 623 + 4573
CRIC-2/13 1 µg/ml
12.0 + 1.0
18 797 + 1423
CRIC-2/13 10 µg/ml
11.5 + 1.3
22 398 + 6381
CRIC-2/13 20 µg/ml
15.6 + 2.0
21 721 + 6904
24-lyukú tenyésztoedényben lyukanként 105 HT1080 sejtet tenyésztettünk 400 µl RPMI 1640 +10% FCS tápfolyadékban. A 24. órában a tápfolyadékokat szérum mentesre cseréltük (3 x mosás után), amelyek tartalmazták a tesztanyagokat a táblázatban látható koncentrációkban. Fehérjeszintézis vizsgálatra L-aminosavkeverék
14
C(U) izotóp jelzést alkalmaztunk 0.0185 MBq / ml koncentrációban (CB-59 1295
MBq / mg atom C, MTA Izotóp Intézete). A 48. órában leszívtuk a tápfolyadékokat a tenyészetekrol, 0.02 % EDTA-val felszedtük a sejteket, majd Bürker kamrában megszámoltuk. A számolás után lecentrifugáltuk a sejteket (1500 rpm, 10 perc, 4 Co -on) és 0.5 N hideg (4 Co ) perklórsavval kicsaptuk a sejtekbol a makromolekulákat, majd a csapadékot háromszori mosás-centrifugálás után (3 x 1 ml 0.5 N perklórsavval 4 Co , 10000 rpm 10 perc) 0.1 N NaOH-ban feloldottuk. Ebbol a lugos oldatból 104 sejtre számított aliquotban mértük a radioaktivitást Bechman LS -100 szcintillációs spektrometeren.
A 19. táblázat adatai azt mutatják, hogy sem a CRIC-2/6, sem a CRIC-2/13 nem befolyásolja a sejtproliferációt 10 µg/ml koncentrációig. 20 µg/ml koncentrációban CRIC2/6 antiszenz oligonukleotid kis mértékben fokozta a sejtproliferációt, de a 14C-aminósav beépülés mértékét szignifikánsan nem változtatta meg.
72
EREDMÉNYEK V.
A MMP-9 aktivitás szelektív gátlása biológiai következményének a megismerése céljából a HT-1080 tumorsejtek invazív sajátosságát több in vitro modell rendszerben tanulmányoztuk CRIC-2/13 kezelés után.
Elöbb azt vizsgáltuk, hogy befolyásolja-e a
CRIC-2/13 antiszenz oligonukleotid a HT1080 tumorsejtek letapadását fibroblaszt monolayerre (20. táblázat)
20. táblázat A CRIC-2/13 hatása a HT1080 tumorsejtek letapadására MRC-5 fibroblaszt sejttenyészetre A fibroblaszt
A monolayerre tapadt tumorsejtek
monolayerre
(cpm/sejttenyészet±SD)
ültetett
Kontroll
A kezelés
CRIC-2/13
hatásossága
5 µg/ml
(Kontroll %)
tumorsejtek száma
P érték
104
329 + 37
340 + 77
103
5x104
1446 + 165
717 + 106
50
<0.005
105
1938 + 96
750 + 315
39
<0.005
A subkonfluens HT1080 tenyészetet 18 órán keresztül tenyésztettünk savó mentes tápfolyadékban (RPMI 1640)
14
C(U) -L-aminosavkeverék jelenlétében ( 0.0185 MBq/ml, CB-59 1295 MBq / mg atom C, MTA
Izotóp Intézete). Ezzel egyidoben a tumorsejtek egyik felét 5 µg/ ml CRIC-2/13-mal kezeltük. Ezt követoen a radioaktívan jelölt (14 C-) HT-1080 sejteket különbözo sejtszámban fibroblaszt monolayerre (MRC-5) helyeztük, majd 3 óra múlva a tápfolyadékot eltávolítottuk, a sejttenyészetet 2x mostuk tápfolyadékkal, ezt követoen
EDTA-tripszin kezeléssel eltávolítottuk a letapadt sejteket, amelyekben meghatároztuk a
radioaktivitást.
A 20. táblázat adatai mutatják, hogy a fibroblaszt monolayerre felvitt HT1080 tumorsejtek számának tízszeresére emelésével hatszor több kezeletlen tumorsejt tapadt le a fibroblaszt rétegre. Ezzel szemben CRIC-2/13 kezelés után a HT-1080 tumorsejtek letapadása több mint felére visszaesett.
73
EREDMÉNYEK V.
A 21. táblázat annak a kísérletünknek az eredményét mutatja, amelyben a 3H-TdR beépülést vizsgáltuk a HT1080-fibroblaszt kokultúrában.
21. táblázat CRIC-2/13 hatása HT1080-REF kokultúra proliferációjára
Tenyészet
DNS szintézis a ko-kultúrában
Kezelés
HT 1080
(3H-TdR beépülés),
hatása
Sejtszám
cpm/sejttenyészet±SD)
tenyésztoedény
Kontroll
P érték
(kontroll %)
CRIC-2/13 5 µg/ml
HT1080 +
105
3274 + 97
1271 + 498
39
<0.001
5x104
2311 + 314
1231 + 209
53
<0.005
104
715 + 39
744 + 117
104
0
380 + 66
329 + 91
87
REF HT1080 + REF HT1080 + REF REF
A HT1080 tumorsejteket a táblázatban látható sejtszámban a konfluens fibroblaszt monolayerre (REF – patkány embrió fibroblaszt) helyeztük, majd két óra múlva 0.0037 MBq /ml végkoncentrációban 3H-TdR-t ( TRK-120, 37MBq/ml Amersham, G.B.) adtunk a tenyészethez és további egy órát inkubáltuk. 1 óra múlva a letapadt sejteket 0.02% EDTA-val felszedtük, desztillált vízben lizáltuk, 0.5 N hideg perklórsavval kicsaptuk és 3-szor mostuk. Az így keletkezo csapadékot 0.1 N NaOH-ban oldottuk és ennek aliquotjában vizsgáltuk a radioaktivitást.
A 21. táblázat azt mutatja, hogy a CRIC-2/13 antiszenz oligonukleotid kezelés hatására a letapadt tumorsejtek 3 H-TdR aktivitása csökkent, viszont nem szabad elfelejtenünk, hogy az AON kezelés hatására csökkent a letapadt sejtek száma is (20. táblázat).
74
EREDMÉNYEK V.
A következo kísérletben a CRIC-2/13-nak a HT1080 tumorsejtek migrációjára kifejtett hatását vizsgáltuk Boyden kamrában (24. ábra).
24. ábra
HT1080 tumorsejtek migrációja Boyden kamrában CRIC-2/13 AON kezelés után
A kísérletet az Anyag és Módszerben leírtak szerint végeztük.
Ez a kísérleti modell a MMP-9 szelektív gátlását követoen a mikroinvazivitási képesség csökkenésének újabb bizonyítékát szolgáltatta. A MMP-9 AON legutóbb (2001-ben) eloállított sarzsának (CRIC-2/155) hatását tanulmányoztuk az I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Szövettenyészto laboratóriumában kifejlesztett mikroinvazivitást vizsgáló módszerrel. A 22. táblázat adatai mutatják, hogy a MMP-9 AON megváltoztatja a tumorsejtek megoszlását a monolayerben maradt (nem vándorló sejtek) és az ECM gélben megjelent (vándorló) sejtpopulációk között.
75
EREDMÉNYEK V.
22. táblázat A MMP-9 AON hatása a HT1080 sejttenyészet invazív növekedésére Nem vándorolt sejtek Kezelés
Sejtszám(104 +SD
P<
Vándorolt sejtek Sejtszám(104 )+S
Összes sejt
P<
(Sejtszám(104 )+SD)
D
Kontroll
33.2 + 2.9
-
108.9 + 4.7
-
150 + 3.9
1 µg/ml
37.5 + 4.3
0.024
85.1 + 4.5
0.004
148 + 6.8
5 µg/ml
42.4 + 3.5
0.018
78.9 + 3.4
0.009
146 + 4.8
25 µg/ml
49.9 + 2.3
0.00005
71.9 + 3.9
0.0007
152 + 6.6
A mikroinvazivitási kísérleti rendszerben szerzett eredmények megerosítik az elozo vizsgálatainkat (19., 20. táblázat), amelyek arra engednek következtetni, hogy a MMP-9 AON szelektíven a tumorsejtek migrációját csökkenti és nem a proliferációját.
Következtetés: a fenti vizsgálatokat összegezve megállapítható, hogy a célirányosan tervezett antiszenz oligonukleotid szelektíven gátolja az MMP-9 aktivitását, amelynek sejtbiológiai kihatása a migráció gátlásában is megnyilvánult.
76
MEGBESZÉLÉS
Megbeszélés Szemléleti változás a MMP kutatásban Az extracelluláris mátrix (ECM) a szövetek sejtes állományát körülvevo térhálós szerkezet, ami egyrészt kialakítja és fenntartja a szövetek szerkezetét, másrészt elválasztja egymástól a különbözo sejtpopulációkat. Az ECM azonban nemcsak egy passzív térhálóként veszi körül a sejteket, hanem a növekedési faktorok raktározása és célirányos szállítása útján képes információkat közvetíteni feléjük, ezáltal befolyásolni a viselkedésüket. Az ECM tehát részt vesz a sejtek morfológiai megjelenésének és muködésének a szabályozásában (alak, mozgás, kapcsolata környezo sejtekkel, növekedés, differenciáció, életképesség). Az ECM csak úgy tudja ellátni sokoldalú feladatát, ha a szöveti muködésének illetve pato- fiziológiai állapotának megfeleloen megújul illetve átalakul, amelyben kitüntetett szerepet játszanak a mátrix metalloproteázok (MMP), mint lebontó enzimek. Az ECM szerkezeti egységének a fennmaradásához vagy éppen az adaptációs igényeknek megfelelo megújulá shoz a mátrix metalloproteázoknak az adott sejtben illetve pericelluláris lokalizációban a megfelelo idoben és pontosan szabályozott aktivitással kell jelen lenniük. A MMP-k aktivitását korlátozó szöveti gátló fehérjék (TIMP) és a MMP-k közötti egyensúly felborulása esetén a MMP-k szabályozatlan muködésével az ECM-ból olyan eddig „rejtett” szerkezeti elemeket szabadulhatnak fel, amelyek a sejtek viselkedését megváltoztatják. Például a fibroblasztok által szekretált MMP-2 az intakt laminin-5 hasításával γ2- lánc fragmentumokat hoz létre, amely az epitheliális sejteket mozgásra bírja [127]. Az utóbbi években bebizonyosodott, hogy a MMP-k az ECM mellett egyéb fehérjéket is képesek hasítani, így muködésük sokkal szélesebb köru, mint gondoltuk (lásd 2. táblázat). A MMP-k a sejtfelszíni és sejtkörüli fehérjék hasításával receptor molekulák muködését változtathatják meg és ezáltal aktiválnak vagy inaktiválnak jelátviteli szignál mechanizmusokat. A tumorszövetekben megfigyelheto MMP-k nem kizárólag a malignus sejtekben, hanem sok esetben a tumorsejtek indukciós hatására a környezo mesenchymális sejtekben termelodnek. A MMP-k szélesköru vizsgálatok középpontjába kerültek a közelmúltban, amelyet igen jól lehetett érzékelni a jelen értekezésben bemutatott vizsgálatok elvégzése idején. Munkánk megkezdésekor a MMP-2 és a MMP-9 kollagén IV-et hasító tulajdonsága állt a vizsgálatok homlokterében. Ebben az idoben a MMP-kat, tumorbiológiai és klinikai 77
MEGBESZÉLÉS
diagnosztikai jelentoségük mellett, az említett kollagén IV-t hasító tulajdonságuk miatt a daganatelleni terápia ígéretes támadáspontjának lehetett tekinteni. Napjainkban már tudjuk, hogy a MMP-k nagy családja az ECM átalakítása mellett részt vesz egyéb sejtbiológiai eseményben, mint pl. az angiogenezis, az apoptózis, a sejtdifferenciáció [2] és carcinogenezis [14]. Ez a szemléleti változás jelentosen befolyásolta, olykor megzavarta, máskor megtermékenyítette a jelen értekezésben foglalt vizsgálatok tervezését és megvalósítását.
A mátrix metalloproteáz-9, mint kórjósló tényezo az emberi vastagbél daganatokban Az onkológiai kutatás egyik feladata a daganatos folyamatokat meghatározó molekuláris tényezok vizsgálata, amelyek ismerete támpontot nyújthat a betegség várható kimenetelérol. Hagyományosan ezt a célt szolgálják a kliniko-patológiai stádiumok, valamint a tumorok hisztológiai minosítésének a bevezetése az onkológiai ellátásba. A vastagbél adenocarcinómákat Duke szövettanilag
jól
elkülönítheto
prognosztikai
stádiumokra osztotta: Duke’s A stádiumban a carcinoma még nem érinti a muscularis propriát; Duke’s B stádiumban a carcinoma már betört a muscularis propriába; Duke’s C stádiumban a daganatsejtek már a nyirokcsomókat is elérik; Duke’s D stádiumban már távoli metasztázis is kialakult. A vastagbél daganatok esetében a Duke’s beosztás mellett hasznos információt nyújt a tumor elhelyezkedésének leírása, a mucin termelése, a sejtek differenciáltsága és a szérum CEA (carcinoembrionális antigén) vizsgálata. Bár az így kialakított TNM (tumor, node, metasztázis) rendszer megfeleloen tükrözi a malignus kórkép klinikai képét az adott idoben és utal a betegség várható alakulására, egyre nagyobb az igény a kórjóslat eszköztárának a kiegészítésére olyan módszerekkel, amelyek adatokat szolgáltatnak a progressziót meghatározó molekuláris változásokról. A jelenleg folyó vizsgálatok hivatottak feltárni, hogy milyen növekedési faktorok szabályozatlan muködése hajtja a tumorsejteket az osztódási ciklusba vagy melyek azok a molekuláris események, amelyek felelosek az invazív növekedésért. Ebbe a vizsgálati körbe tartozik, az MMP-k családja is, mivel az invazív növekedéshez elengedhetetlen az ECM lebontása, ezért a MMP expresszió illetve aktivitás meghatározása elosegítheti a kórlefolyás jobb elorejelzését. A prognosztikai vizsgálatok szélesítésének fontosságára mutat többek között a Duke’s B stádiumú vastagbél tumoros betegek köre is, akik között egyeseknek a tumora a késobbiekben eléri a nyirokcsomót. Zucker és munkatársai kimutatták a MMP-9 fokozott jelenlétét a vastagbél daganatban szenvedo betegek vérplazmájában [128]. Kim és mtrsainak PCR technika 78
MEGBESZÉLÉS
alkalmazásával szerzett megfigyelései arra utalnak, hogy csak azok a tumorsejtek képesek bejutni a véredényekbe, amelyek MMP-9-t is termelnek [129]. Vizsgálataik szerint az intravazáció korlátozható a MMP aktivitás gátlásával. Kitadai és mtrsai [130] sebészileg eltávolított humán colon adenocarcinómákban vizsgálták a metasztázis különbözo lépéseiben részt vevo gének expresszióját in situ PCR technikával. Azt találták, hogy Duke’s C és D stádiumban a kollagenáz IV, a bFGF, az mdr-1 gének expressziója szignifikánsan magasabb (P<0.05) volt, mint Duke’s B-ben. Megállapításuk szerint Duke’s B stádiumban a kollagenáz IV és a bFGF expressziója az inváziós fronton volt a leginkább kimutatható, míg Duke’s C és D stádiumban az eloszlásuk egyenletes volt a tumorban. A betegség klinikai lefolyásának követésekor [131] pedig azt találták, hogy 22 Duke’s B stádiumú betegbol 5-ben volt fokozott a kollagenáz IV (MMP-9) expresszió. Az 5 éves túlélés után mind az 5 betegben távoli metasztázis fejlodött ki, míg a maradék 17 ugyancsak Duke’s B stádiumú betegben, akikben a kollagenáz IV expresszió alacsony volt, nem fejlodött ki sem recidíva, sem távoli metasztázis. Ezeknek a géneknek ill. termékeiknek
a
vizsgálata
tehát
megjósolhatja
a
nyirokcsomó
negatív,
colon
adenocarcinómában szenvedo betegek klinikai állapotának alakulását. Az elozoekben bemutatott vizsgála tok ösztönöztek minket a vastagbél tumorok kollagenáz IV (MMP-2 és MMP-9) aktivitásának a meghatározására. Célkituzésünk az volt, hogy bemutassuk ezt a vizsgálati módszert a hazai onkológiai közélet elott, ugyanakkor a klinikai anyagon talált megfigyeléseink támpontot nyújtsanak a kísérleti rendszerekben tervezett vizsgálataink számára. A kis számú esetek alapján ugyan általánosítható következtetések levonására nincs lehetoség, mégis figyelemre méltónak tartható tapasztalatokat szereztünk. A kollagenáz IV aktivitás meghatározásának a radioaktívan jelzett kollagén szubsztrát hasításán alapuló és a zimogram módszerek közül az utóbbit találtuk hasznosabbnak, mert lehetové tette a MMP-2 és MMP-9 elválasztását valamint az un. proformáik 92 kDa és 72 kDa kimutatását is. Megállapítottuk, hogy a kollagenáz IV enzimek között a 92 kDa típus (MMP-9) aktivitása a legkifejezettebb a vastagbél daganatokban és ugyanez mutat számottevo emelkedést a rossz prognózisú daganatokban. Nem találtunk összefüggést a daganatok Duke’s szerinti besorolása és kollagenáz aktivitása között. Meg kell jegyezni, hogy a mintavételi technika nem tette lehetové az inváziós front elkülönítését a többi szövetrésztol. Ugyanakkor a MMP-k vizsgálatának a hasznosságát láthattuk, amikor a tumoros mintákban mért kollagenáz aktivitást a mutét utáni élettartamra vonatkoztattuk. A kis számú minta ellenére 79
MEGBESZÉLÉS
szignifikáns összefüggést tudtunk kimutatni a tumorok magas MMP-9 aktivitása és a betegek rövidebb túlélése között.
A mátrix metalloproteáz-9 (MMP-9) szerepe a BSCC invazív növekedésében A kevert sejtes emberi eredetu szájüregi daganatból (BSCC) kialakított xenograft modell alkalmasnak bizonyult a MMP-9 invazív növekedésben feltételezett szerepének a további tanulmányozására. A tumort nemcsak hagyományosan subcután (heterotop), hanem a szájnyálkahártya alá (ortotop) is transzplantáltuk. Ugyanazon tumor heterotop és ortotop lokalizációban növo formái lehetoséget nyújtottak arra, hogy vizsgálni tudjuk a mikrokörnyezet hatását a tumort felépíto két sejtpopuláció növekedésére és MMP aktivitására. A bazaloid laphámrák kísérleti körülmények közötti tanulmányozását indokolja a tumor igen agresszív klinikai lefolyása, valamint a laphámráknál rosszabb prognózisának ma még meglehetosen szerény tumorbiológiai magyarázata [109, 132, 133]. Coppola és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy a betegek várható túlélése valószínuleg a tumorban jelenlévo, differenciálatlan bazaloid daganatsejtek arányától függ. Vizsgálataink megkezdésekor megfigyeltük, hogy ha az emberi szájüregbol eltávolított bazaloid laphámrákot az immunszuppresszált egér hátbore alá oltjuk (heterotop leoltás), akkor az eredetileg kisebbségben lévo bazaloid tumorsejtek többségbe kerülnek, míg a laphámrák sejtek az apoptózis jeleit mutatva fokozatosan elpusztulnak. Bár a bazaloid tumorsejtek jól szaporodnak a hátbor alatt, a tumor elveszti metasztatikus fenotípusát, nem infiltrálja környezetét és nem termel MMP-9-t. A tumor invazivitása csak a laphámrák sejtekkel együtt jelent meg újra, amikor a tumort a hátbor alól, az eredeti kiindulási helyével összevetheto helyre (ortotop leoltás), az egér szájnyálkahártyája alá oltottuk. Igen érdekes volt megfigyelni, hogy az ortotopikus helyen fenntartott tumor visszanyeri MMP-9 termelo képességét és invazivitását. A szövettani vizsgálatok alapján tehát azt mondhatjuk, hogy a bazaloid jegyeket mutató tumorsejteket a vitalitás és a mikrokörnyezettol független jó szaporodó képesség jellemzi. A laphám jelleget mutató tumorsejtek kifejlodése és a tumor invazív növekedése csak a megfelelo szöveti környezetben fenntartott tumorban volt megfigyelheto.
Ez arra utal, hogy a bazaloid
laphámrák mindkét sejttípusa hozzájárul a tumor nagy fokú malignitásához, és a differenciálatlan bazaloid sejtek nem az egyedüli kritikus elemei a tumornak. Tekintettel az elozo megfigyelésünkre, ami szerint a két tumorsejtpopuláció eltéro módon járul hozzá a malignus kórkép kialakulásához, a következokben elemeztük a két tumorsejtpopuláció növekedési ütemét, sejtproliferációs paramétereit és az apoptózis 80
MEGBESZÉLÉS
gyakoriságát. Megállapítottuk, hogy a heterotop (hátbor alatt) fenntartott, bazaloid sejtekbol álló tumor nagyobb növekedési képességgel rendelkezik, mint a laphámrák sejteket is tartalmazó, ortotop (szájnyálkahártya alatt) fenntartott tumor. A bazaloid tumorsejtpopuláció mitózis és apoptózis indexei egyik lokalizációban sem mutattak szignifikáns különbséget, ugyanakkor a laphámrák sejtek mitózis indexe igen jelentosen emelkedik a szájnyálkahártya alatt. E jelenség magyarázatához támpontot nyújthatnak Sarbia és mtrsai [134], akik a bazaloid laphámrákok és a laphámrákok eltéro onkogén profiljára következtettek, miután megállapították, hogy a bcl-2 expresszió a bazaloid laphámrákokban gyakoribb (87%), mint a konvencionális laphámrákokban (17,5%). A cmyc onkogén amplifikációját pedig közel kétszer gyakoribbnak találtak a bazaloid laphámrákokban, mint a laphámrákokban. Feltételezve, hogy a mi kísérleti modell rendszerünkben is érvényesül a c-myc onkogén szerepe a differenciáció gátlásában [135, 136] és a proliferáció serkentésében [137, 138], továbbá a bcl-2 antiapoptotikus tulajdonsága [139], úgy molekuláris szinten magyarázatot kaphatunk a bazaloid tumorsejtek biológiai viselkedésére. Korábbi tanulmányok ugyanis a bcl-2 és a c- myc gének egyideju expressziójáról azt írták le, hogy a bcl-2 elnyomja a c-myc apoptózist indukáló hatását, de nem befolyásolja a proliferációt serkento hatását [140, 141]. Ezek a következtetések kapcsolatba hozhatók a HTB-1 xenograft tumornak a subcután modellen szerzett megfigyelésünkkel, ami szerint a kevésbé differenciált bazaloid sejtjek gyors növekedése kapcsolatba hozható az alacsony apoptózis indexükkel. Ezzel szemben az ortotopikusan transzplantált, differenciált laphámrák sejtek lassan szaporodnak, emellett gyakoribb köztük az apoptózis, amelynek egyik magyarázata lehet a bcl-2 expresszió és a c-myc amplifikáció együttes elofordulásának a hiánya. Ezt a feltételezést alátámasztja Sarbia és mrsai, akik a konvencionális laphámrákok egyikében sem észlelték a bcl-2 expresszió és a c- myc amplifikáció együttes elofordulását [134]. A korábban említett szemléletváltozás tudatában úgy gondoljuk, hogy az ortotopikus környezet indukálhatja a MMP-9 termelést, amely azután olyan molekulákat szabadít fel az ECM-ból, amelyek elosegíthetik a laphámrák sejtek elszaporodását. Az MMP-9 megjelenése egyben kapcsolatba hozható a laphámrák sejtpopulációban megfigyelt magas apoptózis indexel is. Amennyiben a laphámrák sejtek életképességének a fenntartásához szükséges az az egyedi mikrokörnyezet [142], amelyet a szájnyálkahártya alatt található ECM komponensek biztosítanak, úgy a MMP-9 ennek a mikrokörnyezetnek a bontásával hozzájárulhat az apoptózisra hajlamos tumorsejtek elpusztulásához. Így a laphámrák sejtpopulációból kiszelektálódik az a klón, amely a mikrokörnyezettol nem függ 81
MEGBESZÉLÉS
és értelemszeruen apoptózis rezisztens. A MMP-9 ezen a szelekciós mechanizmuson keresztül is hozzájárul a tumor malignus viselkedésének a fenntartásához. A két lokalizációban fenntartott tumor makroszkópos vizsgálatakor szembetuno volt, hogy a hátbor alatt fenntartott, invazivitást nem mutató tumor belsejében óriási nekrotikus területek alakultak ki, amelyek a tumor rossz vascularizációja illetve hiányos tápanyag ellátottsága következtében jöhettek létre. Ezzel szemben a szájnyálkahártya alatt fenntartott tumorban nekrózis nem volt megfigyelheto. Számbavéve a MMP-k többoldalú részvételét az angiogenezisben, nem zárható ki, hogy a MMP-9 megjelenése az orthotopikusan növo tumorban hozzájárulhat a jobb vérellátás és ezen keresztül a jobb tápanyag ellátottság kialakulásához. Ezt a lehetoséget támasztja alá az un. MMP-9 „knockout” egerekben a tumor indukálta angiogenezis hiánya [143], amely nem következett be az MMP-2 genetikai hiánya esetében [144].
A MMP-9 aktivitás és a sejtproliferáció közötti kapcsolat Immáron három évtizeddel ezelott intézetünkben arra a következtetésre jutottak [145], hogy a tumorsejtpopuláció növekedésével a proliferáció üteme csökken, amelyet számos morfológiai és biokémiai változás kísér. Miután megállapítottuk, hogy a HTB-1 ortotopikus xenotranszplantátumában a laphámrák sejtek újbóli megjelenése és elszaporodása a MMP-9 indukciójával jár együtt, kutatási munkánk a sejtproliferáció és a MMP-9 aktivitás közötti kapcsolat jellemzése irányába terelodött. Mivel a HTB-1 xenotranszplantátumból szövettenyészeti vonalat nem sikerült kialakítani, ezt a kérdéskört a MMP-2-t és MMP-9-t egyaránt termelo HT-1080 fibrosarcoma sejttenyészetben tanulmányoztuk. Ebben a vizsgálati rendszerben azt lehe tett tapasztalni, hogy a sejttenyészet MMP-9 aktivitása a sejtproliferáció ütemével ellentétesen változik. Ha a tenyészet proliferációs aktivitása nagy, akkor kevés MMP-9 termelodik, ha kicsi, akkor jelentosen megno a tenyészet MMP-9 termelése. Tehát a tumorsejtpopuláció proliferációs aktivitása, amely egyaránt változik a sejttenyészet korával és nagyságával, tekintheto in vitro körülmények között a MMP-9 termelés egyik szabályozó tényezojének. A proliferációs aktivitás a MMP-2 termelést nem befolyásolta. Így a HT-1080 sejttenyészet növekedésének korai szakaszában a folyamatosan termelodo MMP-2, míg a már lassan szaporodó tenyészetben az indukálódó MMP-9 volt a domináns kollagenáz IV. Hasonlóképpen eltért a TPA hatása a két kollagenáz IV aktivitására. Fenti megfigyelésünk részben megegyezik Xie és mtrsainak [116] az A-431 humán epidermoid carcinóma sejteken tett megfigyeléseivel, akik arról számoltak be, hogy a 82
MEGBESZÉLÉS
diszkrét egyrétegu (monolayer) kolóniákban növekedo tenyészetben csak a MMP-9 termelés indukálható TPA-val és TGF-b-val, a folyamatosan termelodo MMP-2 nem. Megfigyeléseink eltérnek abban, hogy ok, a kolóniák szélén lévo növekedési zónában, a nem kontakt-gátolt sejtekben mutatták ki a MMP-9 indukciót. A mi kísérletünkben éppen a kontakt-gátolt összefüggo sejttenyészetben (konfluens monolayerben) növekedett meg a sejtek MMP-9 termelése. Ennek onkológiai jelentoségét abban látjuk, hogy az általunk alkalmazott mikroinvazivitási modell kísérletben az emelkedett MMP-9 aktivitást mutató, lassan növekedo (konfluens) HT-1080 sejttenyészet sejtjeinek migrációs kapacitása sokkal kifejezettebb, mint a gyorsan növo, MMP-2 dominanciát mutató tenyészet esetében. A MMP-9 génnek a sejttenyészet proliferációs állapotától függo expressziójának a kimutatása felveti annak a lehetoségét, hogy a MMP-9 gén promoter régiójához a transzkripciós faktorok kötodése eltéro a gyorsan és lassan növekedo HT-1080 sejttenyészetben. Ebben a génszabályozási mechanizmusban feltételezhetoen az AP-1 heterodimer komplex játszik szerepet, ame ly közremuködik a MMP-9, de nem a MMP-2 expressziójában. Elképzelheto, hogy egyes növekedési faktorok (pl.:a TNF-alfa) a HT1080 sejttenyészet növekedésének korai és késoi szakában eltéroen képesek indukálni a cjun és c- fos géneket [146], amely gének fehérjéi alkotják az AP-1 heterodimer komplexet. Úgy gondoljuk érdemes ezzel a kérdéssel a továbbiakban részletesen foglalkozni. MMP, mint a daganatelleni gyógyszerek aktivátora Süliné-Vargha Helga peptid-kémiai laboratóriumával együttmuködve feltételeztük, hogy a malignus tumorok magas kollagenáz aktivitása hasznosítható célirányosan tervezett peptid hordozó citosztatikumok szelektív aktiválásában. A peptid kémiai munkacsoport a melphalánt (fenilalanin- mustárnitrogén) 6 tagú peptidhez kötötte, amelynek aminosav szekvenciája megegyezik a kollagenázok hasítási helyével a kollagénben (MHP: Melphalán- hexapeptid). A peptid-kémiai munkacsoport eloállította a melphalán tripeptid (MTP) származékát is, amelyet a MHP kollagenáz hasítási termékének lehetett tekinteni. Több évtizede ismert, hogy a melphalánhoz kötött peptid lánc hosszával csökken a melphalán citotoxicitása, ezért a biológiai vizsgálatok feladata volt a két melphalán-peptid tumorgátló hatásának összehasonlítása a melphalánnal, továbbá kapcsolatot keresni a melphalán peptidek hatékonysága és az érintett tumorsejtvonalak MMP aktivitása között. Vizsgálataink kimutatták, hogy a MTP tumorsejtproliferációt gátló hatása - a várakozásnak megfeleloen - meghaladja a MHP hatását, de meglepetésünkre a melphalánét is, amely a hatásért felelos alkilezo alapvegyületnek tekintheto. Az alkilezo vegyületek biológiai 83
MEGBESZÉLÉS
hatásának az összehasonlításakor figyelembe kell venni kémiai reaktivitásukat, amelyet a peptid-kémiai munkacsoport megvizsgált. Megállapítást nyert, hogy a melphalán, a MTP és a MHP alkiláló kapacitása azonos, ezért úgy gondoljuk, hogy a biológiai hatásuk közötti különbség nem az eltéro kémiai reakcióképességbol ered. A kollagenáz szerepét a MHP biológiai hatásmechanizmusában két megfigyelésünk valószínusíti: 1. Kollagenázt alig termelo sejttenyészetben a MHP sejtproliferációt gátló hatása fokozódott, ha a tenyészethez kollagenázt adtunk. Mivel a mérsékelt toxicitást mutató MHP kollagenáz jelenlétében fokozottabban hatékony, elképzelhetonek tartjuk, hogy ez a vegyület ”prodrug” jellegu. 2. Sejtmentes rendszerben a MHP-bol kollagenáz IV-t termelo HT1080 sejttenyészet kondícionált médiuma jelenlétében MTP képzodik, amelyet a peptid-kémiai munkacsoport HPLC technikával azonosított. Az enzimatikus átalakulás specificitására utal az, hogy a MTP felszabadulása MHP-bol mátrix metalloproteáz inhibitorral, a phenantrolinnal gátolható. Vizsgálataink azonban nem mutattak összefüggést a sejttenyészetek MMP aktivitása és a MHP sejtproliferációt gátló hatása között. A MHP sejtproliferációt gátló hatása várakozásunkkal ellentétben nem fokozódott a MMP-t termelo sejtekben, pedig a MHP-bol a MMP hatására felszabaduló MTP sejtproliferációt gátló hatása jelentosen meghaladja a MHP-jét. Ez az ellentmondás annál inkább is nehezen értheto, mert a MMP-2-t és a MMP-9-t termelo HT1080 sejtek kondícionált médiuma jelenlétében lehetett a MTP képzodést kimutatni a MHP-bol. A két vizsgálati rendszer között az a különbség, hogy a proliferációs kísérletben 10% borjú savó volt jelen, amely a kondícionált médiumból hiányzik. Egyelore csak feltételezni lehet, hogy a borjúsavó, amely
nemcsak
MMP-t hanem az azt gátló
fehérjét (pl. a2-
makroglobulin) is tartalmaz, korlátozza a MHP-MTP enzimatikus átalakulást.
A MMP-9 a tumorgátló gyógyszerek lehetséges támadási pontja Miután az onkológiai alapkutatások egyértelmuen igazolták a MMP-k szerepét a tumorok invazív növekedésében, folyamatosan szaporodtak a klinikai kórlefolyás és a sebészileg eltávolított tumorokban meghatározott MMP aktivitási adatok összevetése, amelyek általában alátámasztották a kísérleti rendszerekben szerzett eredményeket. Ez a felismerés újabb lendületet nyújtott az onko-farmakológiai kutatások számára, mert a MMP olyan molekuláris célpontnak ígérkezett a gyógyszerfejlesztésben, amely az eddigieknél sokkal jelentosebb szerepet játszik a tumor progressziójában. A több laboratóriumban folyó és tetemes ráfordítást igénylo gyó gyszerkutatás eredményeként 84
MEGBESZÉLÉS
rövid idon belül néhány hatóanyag klinikai vizsgálatára is sor került. Ebben az idoben a Semmelweis Egyetem I. Patológiai és Rákkutató Intézete együttmuködésben a MTA Központi Kémiai Kutató Intézet (MTA-KKKI) Nukleotid Osztályá val megkezdte a MMP9 génbol levezetheto antiszenz oligonukleotidok (CRIC-2) vizsgálatát. Jelen értekezés szerzoje a sejtbiológiai vizsgálatok körébol a zimogram technika alkalmazásában szerzett tapasztalatait hasznosítva feladatul kapta a CRIC-2 családba tartozó oligonukleotidoknak a tumorsejtek MMP aktivitására kifejtett hatásának meghatározását. A MTA-KKKI munkacsoportja a bázis analógok eloállításával újszeru származékokat vezetett be az antiszenz oligonukleotid kutatásba, amelyek hatékonyságát összehasonlítottuk a perthiooligonukleotidokkal. A MMP-9 gátlása mellett a MMP-2 aktivitás érintetlensége, valamint a sejtproliferáció, DNS és fehérje szintézis zavartalansága a CRIC-2 szelektív biológiai hatására utal. A MMP-9 termelo HT-1080 tumorsejtek adhezív és migrációs sajátságának a csökkenését igazoló vizsgálati eredmények pedig a további vizsgálatokra is feljogosító farmakológiai tulajdonságra utalnak. A sejtszintu tanulmányok azonban nem tárták fel a bázisanalógok nagyságrenddel elonyösebb biológiai hatását a foszfo-diészter láncon pertio csoportot tartalmazó antiszenz oligonukleotidokkal szemben. A MMP-9 antiszenz oligonukleotid (CRIC-2/3) beépülését a HT-1080 fibrosarcoma sejtekbe in situ hibridizációs módszerrel laboratóriumunkban Dr. Gallai Mónika kimutatta, de a MMP-9 expresszió gátlás pontos mechanizmusának megismerése további vizsgálatot igényel. Úgy gondoljuk, hogy az antiszenz oligonukleotidok vizsgálatával munkacsoportunk gazdagította a MMP-k gátlására kifejlesztett hatóanyag családot és tumorbiológiai megközelítésben újabb adatot szolgáltatott a génterápia lehetoségeirol. Ebben a megközelítésben érdemes röviden megemlíteni, hogy az eddig klinikai vizsgálatra bocsátott mátrix metalloproteáz inhibitorok (MMPI) nem váltották be a preklinikai hatékonyság alapján hozzájuk fuzött várakozást, amely azzal is magyarázható, hogy alkalmazásuk elorehaladt malignus kórképekben történt [147]. A MMPI közül a cink-köto képességu hidroxiamin-sav alapszerkezetuek közül a marimastát (BB-2516) mutatott figyelemreméltó hatást nemcsak human tumor xenograft modellen, hanem klinikai vizsgálatokban is (148). Ez a körülmény további érdeklodésre ösztönöz a nagy szelektivitást mutató MMP-9 antiszenz oligonukleotidok iránt, amennyiben annak nagyüzemi eloállítását alacsony költséggel meg lehet oldani.
85
MEGBESZÉLÉS
A MMP tanulmányozása során szerzett tapasztalatok összegezése és klinikai hasznosításának lehetoségei A mátrix metalloproteázok szerepének a felismerése a tumor progresszióban, az onkogének és a szupresszor gének fehérje termékei mellett, hozzájárult a malignus fenotípus molekuláris mechanizmusának a közelebbi megértéséhez. Ez a körülmény érthetové teszi azt a lelkesedést, amely évekkel ezelott körülvette a MMP diagnosztikai és terápiai vonatkozású vizsgálatát, óvatosságra, mint más molekula esetében is, csupán a tumor specificitás kérdése intett. Idoközben azonban kiderült, hogy a MMP család tagjainak szélesköru szubsztrát bontó sajátossága, valamint nem kizárólagos szerepük a tumor progresszióban korlátozza muködésük közelebbi megismerését és hasznosításukat, mint prognosztikai jelet ( markert) vagy gyógyszer támadási pontot az onkológiában. A MMP több irányú vizsgálata kiváló lehetoséget nyújtott a tumorprogresszióban résztvevo molekulák változásainak a mértéktartó, de a lényegre összpontosító elemzésére. Megerosíthettük , hogy a MMP - kiemelten a MMP-9 - meghatározó szerepet játszik a vastagbél daganatok progressziójában és két tumorsejtvonal ( HTB-1, HT-1080) invazív növekedésében, ugyanakkor nem következtethettünk arra, hogy a kórfolyamatért egymagában felelos lenne. Ebbol következik, hogy vizsgálataink alapján a MMP-9-t csak a tumor prognosztikai vizsgálati kör, valamint a daganatelleni gyógyszerek támadási pontja egyikének helyé nvaló tekinteni . Figyelembe véve, hogy a malignus kórképek prognosztikai vizsgálatának több tényezot kell magába foglalnia és több szempontra kiterjednie, vizsgálataink megerosítik a kollagenáz aktivitás meghatározásának jogosságát a vastagbél daganatok prognózisának a megítélésében . A MMP a tumorok biokémai folyamatainak a szélesebb körében vesz részt, mint azt tíz évvel elobb gondolni lehetett. Ez a körülmény azonban nem zárhatja ki a kollagenázokat, mint az áttétképzés korlátozására irányuló gyógyszerek támadási pontját. Az értekezésben bemutatott vizsgálati eredmények arra utalnak, hogy a MMP-9 szerepe az áttétképzés egyik eseményében - a tumor sejtek vándorlásában - a tumor növekedési ütemének a lelassulása idején érvényesül. Amennyiben ez a megfigyelésünk általánosítható ez azt jelenti , hogy a tumor növekedésének a csökkenésekor ajánlatos a betegek fokozott megfigyelése és ha lehetséges a preventiv célzatú antimetasztatikus terápia megkezdése. Az antiszenz oligo-dezoxinukleotiddal végzett vizsgálati eredményeink arra engednek következtetni, hogy a tumorsejtek migrációja szelektíven csökkentheto az osztódás befolyásolása nélkül. 86
AZ ÉRTEKEZÉS FOBB MEGÁLLAPÍTÁSAI
Az értekezés fobb megállapításai 1. A kollagenáz IV típusú enzimek aktivitása magasabb a rövid túlélésu, mint a hosszú ideig élo betegek vastagbél daganataiban. A Kaplan-Meier által bevezetett számítás szerint összefüggés állapítható meg
a mutéti tumor mint ák 92kDa
típusú mátrix metalloproteáz aktivitása és a betegek 5 éves túlélése között. 2. A bazaloid laphámrák (BSCC) mikrokörnyezete befolyásolta a tumor domináns sejtpopulációját. A bazaloid és a laphámrák sejtpopulációk együttesen csak az ortotopikus lokalizációban (az egér szájnyálkahártyája alatt) fejlodtek ki, míg a heterotop lokalizációban ( subcután) a bazaloid sejtpopuláció volt a domináns. 3. A BSCC malignus fenotípusát a mikrokörnyezeti tényezok befolyásolják, invazív növekedést és a MMP-9 aktivitását csak az ortotopikus lokalizációban növo tumorban lehetett megfigyelni. 4. A MMP-9 képzodése emelkedik a HT-1080 tumorsejtpopuláció lassan proliferáló szakaszában, amikor a tumorsejtek migrációs képessége megnott. 5. A tumorsejtek emelkedett mátrix metalloproteáz aktivitása hasznosítható a kollagén eredetu peptidet hordozó citosztatikumok aktiválásában. 6. A CRIC-2 MMP-9 antiszenz oligonukleotid szelektíven gátolja a 92 kDa kollagenázt (MMP-9) és csökkenti a tumorsejtek migrációját.
87
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
Köszönetnyilvánítás Hálás köszönettel tartozom témavezetomnek Dr. Jeney András egyetemi tanárnak, hogy tudományos muhelyébe befogadott, lehetové téve számomra a kutatásba való bekapcsolódást. Külön köszönöm, hogy munkámat irányította, jó tanácsaival, hasznos ötleteivel ellátott és az értekezés ill. közlemények elkészítésénél idot nem kímélve, fáradságot nem ismerve segítségemre volt. Szeretnék köszönetet mondani Oláh Júliának, aki önzetlen szakmai és emberi segítségnyújtással bevezetett a biokémiai laboratóriumban alkalmazott módszerekbe és önfeláldozó munkatársként vett részt a kísérletek elvégzésében. Köszönöm Dr. Zalatnai Attila egyetemi docensnek, hogy bevezetett a szövettani vizsgáló módszerekbe és jelentosen hozzájárult a pato- morfológiai leletek elkészítéséhez. Köszönöm Dr. Paku Sándor fáradságos munkáját, amellyel a kéziratot alaposan áttanulmányozta és kritikai megjegyzéseit, amelyek a szöveg végleges összeállításában nagy segítséget nyújtottak. Dr. Tímár Ferenc, Csorba Gézáné és Felletár Györgyné áldozatkész segítséget nyújtottak a szövettenyészeti feladataim elvégzésében. Dr. Bocsi Józsefnek és Dr. Tóvári Józsefnek köszönheto a sejtkinetikai vizsgálatok szakszeru elvégzése. A humán tumor xenograft (HTB-1) fenntartásában és az állat kísérletek elvégzésében nagy segítséget kaptam Kovács László és Stodola András technikusoktól. Köszönettel tartozo m az I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet igazgatóinak, Dr. Szende Béla és Dr. Kopper László egyetemi tanároknak, akik munkám elvégzésének feltételeit biztosították. Az értekezésben bemutatott széles köru biokémiai és morfológiai módszerek elsajátítása és célirányos alkalmazása nem lett volna lehetséges az intézet vezetoinek és munkatársainak a felkészültsége és gondos munkája nélkül.
88
IRODALOMJEGYZÉK
Irodalomjegyzék 1.
2.
3.
4. 5.
Brinckerhoff C.E. and Matrisian L.M. ( 2002) Matrix metalloproteinases : a tail of a frog that became a prince. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3 :207-214 Chang C. and Werb Z. (2001 ) The many faces of metalloproteases: cell growth, invasion, angiogenesis and metastasis. Trends Cell Biol (11):S37-43. Review. Goss J, Lapiere CM. (1962) Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 48:1014-22. Nagase H, Woessner JF Jr. (1999) Matrix metalloproteinases. J Biol. Chem. 274: 21491-94. Sternlicht MD, Werb Z. (1999) ECM proteinases. in Guidebook to the Extracellular Matrix, Anchor and Adhesion proteins, ed. T Kreis, R Vale, pp. 503-62. Oxford,UK: Oxford Univ. Press
6.
Lohi J, Wilson CL, Roby JD, Parks WC. (2001) Epilysin: a novel human matrix metalloproteinase (MMP-28) expressed in testis and keratinocytes and in response to injury. J. Biol. Chem. 276: 10134-44
7.
Lepage T, Gache C. (1990) Early expression of a collagenase- like hatching enzyme gene in the sea urchin embryo. EMBO J. 9:3003-12. Wada K, Sato H, Kinoh H, Kajita M, Yamamoto H, Seiki M. (1998) Cloning of three Caenorhabditis elegans genes potentially encoding novel matrix metalloproteinases. Gene 211:57-62.
8.
9.
Llano E, Pendas AM, Aza-Blanc P, Kornberg TB, Lopez-Otin C. (2000) Dm1 MMP, a matrix metalloproteinase from Drosophila with a potential role in extracellular matrix remodeling during neural development. J. Biol. Chem. 275:35978-85.
10.
Leontovich AA, Zhang J, Shimokawa K, Nagase H, Sarras MP Jr. (2000) A novel hydra matrix metalloproteinase (HMMP) functions in extracellular matrix degradation, morphogenesis and the maintenance of differentiated cells in the foot process. Development 127:907-20.
11.
McGeehan G, Burkhart W, Anderegg R, Becherer JD, Gillikin JW, Graham JS. (1992) Sequencing and characterization of the soybean leaf metalloproteinase: structural and functional similarity to the matrix metalloproteinase family. Plant. Physiol. 99:1179-83. Maidment JM, Moore D, Murphy GP, Murphy G, Clark IM. (1999) Matrix metalloproteinase homologues from Arabidopsis thaliana. Expression and activity. J. Biol. Chem. 274:34706-10.
12.
13.
Kinoshita T, Fukuzawa H, Shimada T, Saito T, Matsuda Y. (1992) Primary structure and expression of a gamete lytic enzyme in Chlamydomonas reinhardtii: similarity of functional domains to matrix metalloproteinases. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 4693-97. 89
IRODALOMJEGYZÉK
14.
Sternlicht M.D. and Werb Z. (2001) How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annual Rev. Cell Dev Biol. 17:463-516.
15. a. Liotta, L. A., Steeg, P. S., and Stetler-Stevenson, W. G. (1991) Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation. Cell 64:327-336. Himelstein, B.P., Canete-Soler, R., Bernhard, E.J., Dilks, D.W., Muschel, R.J. (1994-95) b. Metalloproteinases in tumor progression: the contribution of MMP-9. Invasion Metastasis. 14:246-58. 16. Villea, B., Cogen, R.B., Bartolucci,A.A., Birkedal-Hansen, H. (1987) Cervicular fluid collagenase activity in healthy, gingivitis, chronic adult periodontitis and localized juvenile periodontitis patients. J. Periodontal-Res. 22:209-11. 17.
18.
19.
20.
21.
Delaisse, J.M., Engsig, M.T., Everts, V., del-Carmen-Ovejero, M., Ferreras, M., Lund, L., Vu, T.H., Werb, Z., Winding, B., Lochter, A., Karsdal, M.A., Troen, T., Kirkegaard, T., Lenhard, T., Heegard, A.M., Neff, L., Baron, R., Foged, N.T. (2000) Proteinases in bone resorption: obvious and less obvious roles. Clin. Chim. Acta 291: 223-34. Sharma, K., Zijadeh, F.N. (1994) The emerging role of transforming growth factor-ß inkidney diseases. Am. J. Physiol. 266:F829-42. Sinha, S., Frishman, W.H. (1998) Matrix metalloproteinases and abdominal aortic aneurysms: a potential therapeutic target. J. Clin. Pharmacol. 38:1077-88. Woessner JF Jr. (1991) Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling. FASEB J. 5:2145-2154. Overall CM. (2001) Matrix metalloproteinase substrate binding domains, modules and exosites. In : Matrix Metalloproteinase Protocols, ed. IM Clark, pp.79-120. Totowa, NJ:Humana Press.
22.
Gururajan R, Grenet J, Lahti JM, Kidd VJ. (1998) Isolation and characterization of two novel metalloproteinase genes linked to the CdC2L locus on human chromosome 1p36.3. Genomics 52:101-106.
23.
Park HI, Ni J, Gerkema FE, Liu D, Belozerov VE, Sang QX. (2000) Identification and characterization of human endometase (matrix metalloproteinase26) from endometrial tumor. J. Biol. Chem. 275: 20540-20544. Murphy G, Allan JA, Willenbrock F, Cockett MI, O,Connell JP, Docherty AJ. (1992) The role of the C-terminal domain in collagenase and stromelysin specificity. J. Biol. Chem. 267: 9612-9618. Sanchez-Lopez R, Alexander CM, Behrendtsen O, Breathnach R, Werb Z. (1993) Role of zinc-binding- and hemopexin domain-encoded sequences in the substrat specificity of collagenase and stromelysin-2 as revealed by chimeric proteins. J.
24.
25.
90
IRODALOMJEGYZÉK
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
Biol. Chem.268:7238-47. Knauper V, Docherty AJ, Smith B, Tsche sche H, Murphy G. (1997) Analysis of the contribution of the hinge region of human neutrophil collagenase (HNC, MMP-8) to stability and collagenolytic activity by alanine scanning mutagenesis. FEBS Lett.405:60-64. Murphy G, Nguyen Q, Cockett MI, Atkinson SJ, Allan JA, et al. (1994) Assessment of the role of the fibronectin- like domain of gelatinase A by analysis of a deletion mutant. J. Biol. Chem.269:6632-36. Shipley JM, Doyle GA, Fliszar CJ, Ye QZ, Johnson LL, (1996) The structural basis for the elastolytic activity of the 92-kDa and 72-kDa gelatinases. J. Biol. Chem. 271: 4335-41. Itoh Y, Kajita M, Kinoh H, Mori H, Okada A, Seiki M. ( 1999) Membrane type 4 matrix metalloproteinase (MT4-MMP, MMP-17) is a glycosylphosphatidylinositol-anchored proteinase. J. Biol. Chem. 274:34260-66. Kojima S, Itoh Y, Matsumoto S, Masuho Y, Seiki M. (2000) Membran-type 6 matrix metalloproteinase (MT6-MMP, MMP25) is the second glycosyl phosphatidyl inositol (GPI)-anchored MMP. FEBS Lett. 480:142-46. Fini ME, Cook JR, Mohan R, Brinckerhoff CE. (1998) Regulation of matrix metalloproteinase gene expression. In Matrix Metalloproteinases, ed. Wc Parks, RP Mecham. pp. 299-356. New York: Academic Press Kheradmand F, Werner E, Tremble P, Symons M, Werb Z. (1998) Role of Rac1 and oxygen radicals in collagenase-1 expression induced by cell shape change. Science 280: 898-902
33.
Huhtala P, Tuuttila A, Chow L, Lohi J, Keski-Oja J, and Tryggvason K. (1991) Complete structure of the human gene for 92-kDa type IV collagenase. J. Biol. Chem. 266:16485-16490.
34.
Huhtala, P., Chow, L.T., and Tryggvason, K. (1990) Structure of the human type IV collagenase gene J. Biol Chem. 265: 11077-11082. Woessner, J.F., Jr. (1991) Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling FASEB J. 5, 2145-2154 Brinckerhoff, C.E., Gross, R.H., Nagase, H., Sheldon, L., Jackson, R.C., and Harris, E.D., Jr. (1982) Increased level of translatable collagenase messenger ribonucleic acid in rabbit synovial fibroblasts treated with phorbol myristate acetate or crystals of monosodium urate monohydrate. Biochemistry 21, 2674-2679 Postlethwaite, A.E., Lachman, L.B., Mainardi, C.L., and Kang, A.H. (1983) Interleukin 1 stimulation of collagenase production by cultured fibroblasts J. Exp. Med. 157, 801-806 Conca, W., Kaplan, P.B., Krane, S.M. (1989) Increases in levels of procollagenase messenger RNA in cultured fibroblasts induced by human recombinant interleukin 1 beta or serum follow c-jun expression and are dependent on new protein synthesis. J. Clin. Invest. 83, 1753-1757 MacNaul, K.L., Chartrain, N., Lark, M., Tocci, M.J., Hutchinson, N.I. (1990) Discoordinate expression of stromelysin , collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in rheumatoid human synovial fibroblasts. Synergetic effects of
35.
36.
37.
38.
39.
91
IRODALOMJEGYZÉK
40.
41.
42.
interleukin-1 and tumour necrosis factor alpha on stromelysin expression. J. Biol. Chem. 265, 17238-17245 Wilhelm, S.M., Collier, I.E., Marmer, B.L., Eisen, A.Z., Grant, G.A., and Goldberger, G.I. (1989) J. Biol. Chem. 264, 17213-17221 Gaire, M., Magbanua, Z., McDonnell, S., McNeil, L., Lovett, D.H., and Matrisian, L.M. (1994) Structure and expression of human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin.J. Biol. Chem. 269, 2032-2040 Strongin AY, Collier I, Bannikov G, Marmer BL, Grant GA, Goldberg GI. (1995) Mechanism of cell surface activation of 72-kDa type IV collagenase. Isolation of the activated form of the membrane metalloproteinase. J. Biol. Chem. 270: 5331-38.
43.
Overall CM, Wrana JL, Sodek J. (1991) Transcriptional and post-transcriptional regulation of 72-kDa gelatinase/type IV collagenase by transforming growth factor-β 1 in human fibroblast. Comparisons with collagenase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase gene expression. J. Biol. Chem. 266:14064-71.
44.
Mainardi, C.L., Hibbs, M.S., Hasty, K.A., and Seyer, J.M. (1984) Purification of a type V collagen degrading metalloproteinase from rabbit alveolar macrophages.Collagen Relat. Res. 4:479-492. Hibbs, M.S., Hasty, K.A., and Seyer, J.M., Kang, A.H., and Mainardi, C.L. (1985) Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinaseJ. Biol. Chem. 260:2493-2500. Saarialho-Kere, U. K., Welgus, H.G., and Parks, W.S. (1993) Distinct mechanisms regulate interstitial collagenase and 92-kDa gelatinase expression in human monocytic- like cells exposed to bacterial endotoxin J. Biol. Chem. 268:17354-17361. Salo T, Lyons JG, Rahemtulla F, Birkedal-Hansen H, Larjava H. (1991) Transforming growth factor-ß1 up-regulates type Iv collagenase expression in cultured human keratinocytes. J. Biol. Chem;266:11436-41. Reponen, P., Sahlberg, C., Munaut, C., Thessleff, I., and Tryggvason, K. (1994) High expression of 92-kD type IV collagenase (gelatinase B) in the osteoclast lineage during mouse development. J. Cell. Biol. 124: 1091-1102. Reponen, P., Leivo, I., Sahlberg, C., Apte, S.S., Olsen, B.R., Thesleff, I., and Tryggvason, K. (1995) 92-kDa type IV collagenase and TIMP-3, but not 72-kDa type IV collagenase or TIMP-1 or TIMP-2, are highly expressed during mouse embryo implantationDev. Dynamics 202:388-396. Mohan R, Rinehart WB, Bargagna -Mohan P, Fini ME. (1998) Gelatinase B/lacZ transgenic mice, a model for mapping gelatinase B expression during developmental and injury-related tissue remodelling. J. Biol. Chem. 273:25903-14.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
Yamagata S, Tanaka R, Ito Y, Shimizu S (1989) Gelatinases of murine metastatic tumor cells. Biochem Biophys Res Commun 158: 228 92
IRODALOMJEGYZÉK
52.
53.
Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Selzer, J.L., Kronberger, A., He, C., Bauer, E.A., and Goldberger, G.I., (1988) H-ras oncogene-transformed human bronchial epithelial cells (TBE-1) secrete a single metalloprotease capable of degrading basement membrane collagen J. Biol. Chem. 263, 6579-6587 Salo T, Turpeenniemi-Hujanen T, Trzggvason K. (1985) Tumor -promoting phorbol esters and cell proliferation stimulate secretion of basement membrane (type IV) collagen degrading metalloproteinase by human fibroblasts. J. Biol. Chem.;260:8526-31.
54.
Overall CM, Wrana JL, Sodek J. (1989) Independent regulation of collagenase, 72 kDa progelatinase/type IV collagenase by transforming growth factor-ß1 in human fibroblasts. J. Biol. Chem; 264:1860-1869.
55.
Kalebic T, Gabrisa S, Glaser B, Liotta LA. (1983) Basement membrane collagen: degradation by migrating endothelial cells. Science (Washington DC);221:281-283.
56.
Rifas L, Halstead LR, Peck WA, Avioli LV, Welgus HG. (1989) Human osteoblasts in vitro secrete tissue inhibitor of metalloproteinases and gelatinase but not interstitial collagenase as major products. J. Clin Invest; 84: 686694.
57.
Stetler-Stevenson, W.G., Krutzsch, H.C., Wachner, M.P., Marguiles, I.M.K., and Liota, L.A. (1989) The activation of human type IV proenzyme. Sequence identification of the major conversion product following organomercurial activation. J Biol. Chem., 264:13531356.
58.
Gomez DE, Alonso DF, Yoshiji H, Thorgeirsson UP. (1997) Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, egulation and biological function. Eur. J. Cell Biol. 74:111-22
59.
Sottrup-Jensen L, Birkedal-Hansen H. (1989) Human fibroblast collagenase-α-makroglobulin interactions. Localization of cleavage sites in the bait regions of five mammalian α-makroglobulins. J. Biol. Chem. 264:393-401.
60.
Dresden, M.H., Heilman, S.A., and Schmidt, J.D. (1972) Collagenolytic enzymes in human neoplasms. Cancer Res.32:993-996. Hashimoto, K., Yamanishi, J., Dabbous, M.K. (1972) Electron microscopic observations of collagenolytic activity of basal cell epithelioma of the skin in vivo and in vitro. Cancer Res.,32:2561-2567;
61.
62. 63. 64.
Ohyama, H., and Hashimoto, K. (1977) Collagenase of human skin basal cell epithelioma. J. Biochem.82:175-183; Liotta, L.A., Thorgeirsson, U.P., and Gabrisa, S. (1982) Role of collagenases in tumor cell invasion. Cancer Metastasis Rev.,1:277-288;. Liotta, L.A., Tryggvason, K., Gabrisa, S., Hart, I., Foltz, C.M., and Shafie, S. (1980) Metastatic potencial correlates with enzymatic degradation of basement membran collagen. Nature (Lond.),284:67-68; 93
IRODALOMJEGYZÉK
65. 66.
67.
68.
69.
Liotta, L.A., Rao, C.N., and Barsky, S.H. (1983) Tumor invasion and the extracellular matrix. Lab. Invest., 49: 636-649, Pozatti, R., Muschel, R., Williams, J., Padmanaphan, R., Howard, B., Liotta, L., and Khoury, G. (1986) Science 232: 223-227. Gabrisa, S., Pozzatti, R., Muschel, R.J., Saffiotti, U., Ballin, M., Goldfarb, R., Khoury, G., and Liotta, L., (1987) Secretion of type-IV collagenase protease and metastatic phenotype: induction by ransfection with c-Ha-ras but not c-Ha-ras plus Ad2-E1a. Cancer Res.,47:1523-1528 Schultz, R.M., Silberman, S., Persky, B., Bajkoski, A.S., and Carmichael,D.F., (1988) Inhibition by human-recombinant-tissue inhibitor of metalloproteinase of human amnion invasion and lung colonization by murine B16-F10 melanoma cells. Cancer Res., 48:5539-5545 Khokha, R., Waterhouse, P., Yagel, S., Lala, P., Overal, C., Norton, G. and Denhardt, D., (1989) Antisense RNA-induced reduction in murin TIMP levels confers oncogenicity on Swiss 3T3 cells. Science, 243: 947-950
70.
Nakajima, M., Welch, D.R., Wynn, D.M., Tsuruo, T., and Nicolson, G.L. (1993) Serum and plasma Mr 92,000 progelatinase levels correlate with spontaneous metastasis of rat 13762NF mammary adenocarcinoma. Cancer Res., 53:5802-5807,
71.
Bernhard, E.J., Muschel, R.J., and Hughes, E.N., (1990) Mr 92,000 gelatinase release correlates with the metastatic phenotype in transformed rat embryo cells. Cancer Res., 50: 3872-3877,
72.
Bernhard EJ, Gruber SB, Muschel, RJ (1994) Direct evidence linking expression of matrix metalloproteinase 9 (92-kD gelatinase/collagenase) to the metastatic phenotype in transformed rat embrio cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4293-4297
73.
Kupferman ME, Fini ME, Muller WJ, Weber R, Cheng Y, Muschel RJ. (2000) Matrix metalloproteinase 9 promoter activity is induced coincident with invasion during tumor progression. Am. J. Pathol. 157:1777-83.
74.
Itoh T, Tanioka M, Yoshida H, Yoshida T, Nishimoto H, Itohara S. (1998) Reduced angiogenesis and tumor progression in gelatinase A-deficient mice. Cancer Res. 58:1048-51.
75.
Kim J, Kovalski K, Ossowski L. (1998) Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell 94:353-62.
76.
Sternlicht MD, Bergers G. (2000) Matrix metalloproteinases as emerging targets in anticancer therapy: status and prospects. Emerging Ther. Targets 4:609-33.
77.
D’Armiento J, Di Colandrea T, Dalal SS, Okada Y, Huang MT, et al. (1995) Collagenase expression in transgenic mouse skin causes hyperkeratosis and acanthosis and in-creasessusceptibility to tumorigenesis. Mol.Cell. Biol. 15:5732–39
94
IRODALOMJEGYZÉK
78.
79.
80. 81.
82.
Di Colandrea TD, D’Armiento J, Kesari KV, Chada KK. (2000) Collagenase induction promotes mouse tumorigenesis by two independent pathways. Mol. Carcinog. 29:8–16 Sternlicht MD, Lochter A, Sympson CJ, Huey B, Rougier JP, et al. (1999) The stromal proteinase MMP-3/stromelysin-1 promotes mammary carcinogenesis. Cell 98:137–46 Matrisian LM. (1999) Cancer biology: extracellular proteinases in malignancy. Curr. Biol. 9:R776–78 Rudolph-Owen LA, Chan R, Muller WJ, Matrisian LM. (1998) The matrix metallo-proteinase matrilysin influences early-stage mammary tumorigenesis. Cancer Res. 58: 5500–6 Ha HY, Moon HB, Nam MS, Lee JW, Ryoo ZY, et al. (2001) Overexpression of membrane-type matrix metalloproteina se-1 gene induces mammary gland abnormalities and adenocarcinoma in transgenic mice. Cancer Res. 61:984–90
83.
Itoh T, Tanioka M, Yoshida H, Yoshida T, Nishimoto H, Itohara S. (1998) Reduced angiogenesis and tumor progression in gelatinase A-deficient mice. Cancer Res. 58:1048-51.
84.
Wilson CL, Heppner KJ, Labosky PA, Hogan BL, Matrisian LM. (1997) Intestinal tumorigenesis is suppressed in mice lacking the metalloproteinase matrilysin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1402–7 Coussens LM, Tinkle CL, Hanahan D, Werb Z. (2000) MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis. Cell 103:481-90.
85.
86.
Bergers G, Brekken R, McMahon G, Vu TH, Itoh T, et al. (2000) Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nat. Cell Biol. 2:737-44.
87.
Masson R, Lefebvre O, No¨ el A, Fahime ME, Chenard MP, et al. (1998) In vivo evidence that the stromelysin-3 metalloproteinase contributes in a paracrine manner to epithelial cell malignancy. J. Cell Biol. 140:1535–41 Martin DC, R¨ uther U, Sanchez-Sweatman OH, Orr FW, Khokha R. (1996) Inhibition of SV40 T antigen- induced hepatocellular carcinoma in TIMP-1 transgenic mice. Onco-gene 13:569–76 Sternlicht MD, Lochter A, Sympson CJ, Huey B, Rougier JP, et al. (1999) The stromal proteinase MMP-3/stromelysin-1 promotes mammary carcinogenesis. Cell 98:137–46 Buck TB, Yoshiji H, Harris SR, Bunce OR, Thorgeirsson UP. (1999) The effects of sustained elevated levels of circulating tissue inhibitor of metalloproteinases-1 on the development of breast cancer in mice. Ann. NY Acad. Sci. 878:732–35 Heppner-Goss KJ, Brown PD, Matrisian LM. (1998) Differing effects of endogenous and synthetic inhibitors of metalloproteinases on intestinal tumorigenesis. Int. J. Cancer 78:629–35 Dukes, C.E. (1932) The classification of cancer of the rectum. J. Pathol. 35 : 323332.
88.
89.
90.
91.
92/a.
92/b
Astler V.B.
and Coller F.A. (1954) 95
The
prognostic significance of direct
IRODALOMJEGYZÉK
93.
extension of carcinoma of the colon and rectum. Ann. Surg. 846-851., Miller JFAD, Doak SMA, Cross AM (1963) Role of thymus in recovery of the immune mechanism in the irradiated adult mice. Proc Soc Exp Biol Med 112:785-792
94.
Davies AJS (1969) The thymus and the cellular basis of immunity. Transplantation Rev 1:43-91
95.
Kopper L, Steel GG.: (1975) The therapeutic response of human tumor lines maintained in immun-suppressed mice. Cancer Res. 35:2704-2712,
96.
Babó I, Zalatnai A, Schaff Zs, Suba Zs, Szabó Gy, Jeney A. (1998) The pathomorpho logy of a human xenotransplanted basaloid squamous cell carcinoma. Neoplasma, 45, 4:201-215
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104. 105.
106.
Jones AL., Millar SC., Powell BCB, Selby P., Winkley A., Lakhani S., Gore ME., and MccElwain TS. (1990) Enhanced antitumour activity of carmustine (BCNU) with tumour necrosis factor in vitro and in vivo. Br. J. Cancer, 62: 776-780 Jeney, A., Kovalszky, I., Raso, E., Durand , R.E.,Fürész , J., Lapis , K. (1995) The biological activity of cisplatin and dibromodulcitol in combination therapy. Brit. J. of Cancer, 71, 317-321. Lapis K, Bocsi J, Lapis P, Thorgeirsson UP (1995) Flow cytometric DNA ploidity and proliferative activity of diethylnitrosamineinduced hepatocellular carcinoma and pulmonary metastases in monkeys. Hepatology, 22:953. Martin A, Clynes M (1993) Comparison of 5 new colorimetric assays for in vitro cytotoxicity testing and cell proliferation assays. Cytotechnology 11: 49 Albini A. (1998) Tumor and endothelial cell invasion of basement membrane. Pathology Oncology Research:230-241. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685 Yamagata S, Ito Y, Tanaga R, Shimizu S. (1988) Gelatinases of metastatic cell lines of murine colonic carcinoma as detected by substrate-gel electrophoresis. Biochem Biophys Res Comm 151, 158-162 . Chou J, Chou T-C (1988) Dose effect analysis with microcomputers, Elsevier-Biosoft, Cambridge Pyke C, Ralfkiaer E, Huhtala P, Hurskainen T, Dano K, Tryggvason K (1992) Localization of messenger RNA for Mr 72,000 and Mr 92,000 type IV collagenases in human skin cancers by in situ hybridization. Cancer Res., 52: 1336-1341 Sadako Y., Yoshika I., Rie T. and Satoru S. (1988) Gelatinases of metastatic cell lines of murin colonic carcinoma as detected by substrat-gelelektrophoresis Biochim. Biophys. 151: 158-162 96
IRODALOMJEGYZÉK
107.
Turpeenniemi-Hujanen T., Thorgeirsson U.P., Hart I.R., Grant S.S. and Liotta L.A (1985) Expression of collagenase IV activity in murin tumor cell hybrides that differ in metastatic potential J. Nat. Cancer Inst. 75: 99,
108.
Nakajima M, Welch DR, Belloni PN, Nicolson GR (1987) Degradation of basement membrane type IV collagen and lung subendothelial matrix by rat mammary adenocarcinoma cell clones of differing metastatic potentials. Cancer Res 47: 4869
109.
Wain SL, Kier R, Vollmer RT, Bossen EH (1986) Basaloid-squamous carcinoma of the tongue, hypopharynx and larynx: Report of 10 cases. Hum-Pathol,17:1158-1166
110.
McKay MJ, Bilous AM (1989) Basaloid squamous carcinoma of the hypopharynx. Cancer,63,2528-2531; Mario A Luna, Adel El Naggar, Pairoj Parichatikanond, Randall S Weber and John G Batsakis (1990) Basaloid squamous carcinoma of the upper aerodigestive tract. Cancer 66,537-542
111.
112.
Giavazzi, R., Campbell, D.E., Jessup, J.M., Cleary, K., Fidler, I (1986) Metastatic behavior of tumor cells isolated from primary and metastatic human colorectal carcinomas implanted in different sites in nude mice. Cancer Res., 46, , 1928-1933.
113.
Gutman M. and Fidler I.J.(1995) Biology of human colon cancer metastasis. World J. Surgery, 19: 226-234. Nakajima, M., Morikawa , FABRA, A., Bucana, C.D., Fidler , I. (1990) Influence of organ enviroment on extracellular matrix degradative activity and metastasis of human colon carcinoma cells. J. Natl. Cancer Inst. 82, , 1890-1898.
114.
115. 116.
Oca, M. de F., Macy, M.L., Shannon, J.E (1969) Isoensyme characterization of animal cell culture (34238) PSEBM, 132, 462-469. Xie B, Bucana CD, Fidler IJ (1994) Density-dependent induction of 92 kD Type IV collagenase activity in cultures of A431 human epidermoid carcinoma cells. Am J Pathol 144:1058-67.
117. a. Nishio T., Iimuro Y., Nitta, T., Harada N., Yoshida M., Hirose T., Yamamoto N., Morimoto T., Brenner D.A., Yamaoka Y., (2003) Incresed expression of collagenase in the liver induces hepatocyte proliferation with cytoplasmic accumulation of ß-catenin in the rat. J. Hepatology b. Kataoka H, DeCastro R, Zucker S, Biswas C (1993) Tumor cell-derived collagenase-stimulatory factor increases expression of interstitial collagenase, stromelysin, and 72-kDa gelatinase. Cancer Res 53:3154 118. Stahle-Beckdahl M, Sudbeck BD, Eisen AZ, Welgus HG, Parks WC (1992) Expresskon of 92 kDa type IV collagenase m-RNA by eosinophils associated with basal cell carcinoma. J Invest Dermatol 99: 497
97
IRODALOMJEGYZÉK
119.
Hsieh K, Marshall GR (1981) Alkylating angiotensin II analogues: synthesis, analysis and biological activity of angiotensin II analogues containing the nitrogen mustard melphalan in position 8. J Med Chem 24: 1304
120.
Mark J, Marquisse MJ, Kauer JC (1978) Collagenase-sensitive peptidyl- nitrogen mustards as potential antitumor agents. J Med Chem 21: 1188
121.
Van Warth HE, Steinbrink DR (1985) Complementary substrate specificities of class II collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry 24: 6520
122.
Jeney A, Kopper L, NagyP, Lapis K, Süli-Vargha , H, Medzihradszky K (1986) Antitumor action of N-(2-chloroethyl)-N-nitrosocarbamoyl derivatives of biologically active polypeptide hormone fragments. Cancer Chemother Pharmacol 16: 129
123.
Süli-Vargha H, Jeney A, Kopper L, Oláh J, Lapis K, Botyánszki J, Csukás I, Gyorvári B, Medzihradszky K (1990) Investigation on the antitumor effect and mutagenicity of-MSH fragments containing melphalan. Cancer Lett 54: 157
124.
Cohen JS. (1991) Oligonucleotides as therapeutic agents. Pharmacol Ther 52:211-25 Stein CA, Cheng YC. (1993) Antisense oligonucleotides as therapeutic agents- is the bullet really magical? Science 261:1004-12 Ötvös L, Sági J, Sági Gy, Szemzo A, D Tóth F and Jeney A. (1999) Enzymatic hydrolysis and biological activity of oligonucleotides containing 5substituted pyrimidine bases. Nucleosides&Nucleotides 18(6&7): 1665-1666
125.
126.
127.
Giannelli G, Falk-Marzillier J, Schiraldi O, Stetler-Stevenson WG, Quaranta V. (1997) Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5. Science 277:225-28.
128.
Zucker, S., Lysik, R.M., Zarrabi, M.H., and Moll, U. (1993) Mr 92,000 Type IV collagenase is increasd in plasma of patients with colon cancer and breast cancer. Cancer Res 53: 140-146,
129.
Kim J, Yu W, Kovalski K, Ossowski L. (1998) Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell 94:353-62.
130.
Kitadai Y, Ellis LM, Takahashi Y, Bucana CD, Anzai H, Tahara E, Fidler IJ. (1995) Multiparametric in situ messenger RNA hybridization analysis to detect metastasis-related genes in surgical specimens of human colon carcinomas. Clin. Cancer Res. 1: 1095102.
131.
Kitadai Y, Ellis LM, Tucker SL, Greene GF, Bucana CD, Cleary KR, Takahashi Y, Tahara E, Fidler IJ. (1996) Multiparametric in situ mRNA hybridization analysis to predict disease recurrence in patients with colon carcinoma. Am. J. Pathol. 149:1541-51. 98
IRODALOMJEGYZÉK
132.
Coppola, D., CATALANO, E., TANG, C.K., ELFENBEIN, B., HARWICK, R., MORH, R. (1993) Basaloid squamous cell carcinoma of floor of mouth. Cancer, 72, , 2299-2305.
133.
Luna, M.A., EL NAGGAR, A., PARICHATIKANOD, P., WEBER, L.S., BATSAKIS, J.E. (1990) Basaloid squamous carcinoma of the upper aerodigestive tract. Cancer, 66, 537-542.
134.
Sarbia M, Verreet P, Bittinger F, Dutkowski P, Heep H, Willers R, Gabbert HE (1997) Basaloidsquamous cell carcinoma of the esophagus: diagnosis and prognosis. Cancer 79: 1871-1878. Coppola JA, Cele MD (1986) Constitutive c- myc oncogene expression blocks mouse erythroleukaemia cell differentiation but not commitment. Nature, 320: 761-763.
135.
136.
Henriksson M, Luscher B (1996) Proteins of the myc network: essential regulators of cell growth and differentiation. ADV. Cancer Res. 68:109-182.
137.
Askew DS, Ashmun RA, Simmons BC, Cleveland JL (1991) Constitutive c- myc expression in an IL-3-dependent myeloid cell line suppresses cell cycle arrest and accelerates apoptosis. Oncogene, 6: 1915-1922.
138.
Bouchard C, Staller P Eilers M (1998) Control of cell proliferation by myc. Trend Cell Biol. 8:202-206. Strasser A, Huang DCS, Vaux DL (1997) The role of the bcl-2/ced-9 gene family in cancer and general implications of defects in cell death control for tumourigenesis and resistance to chemotherapy. Biochem. Biophys. Acta 1333:F151-F178.
139.
140. 141.
142.
Bissonette RP, Echeverri F, Mahboubi A, Green DR (1992) Apoptotic cell death induced by c-myc is inhibited by bcl-2. Nature 359:552-554. Fanidi A, Harrington EA, Evan GI (1992) Cooperative interaction between c- myc and bcl-2 protooncogenes. Nature, 359:554556. Vu TH, Shipley JM, Bergers G, Berger JE, Helms JA, et al. (1998) MMP9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptózis of hypertrophic chondrocytes. Cell 93:411-22.
143.
Bergers G, Brekken R, McMahon G, Vu TH, Itoh T, et al. (2000) Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nat.Cell Biol. 2:737-44.
144.
Itoh T, Tanioka M, Yoshida H, Yoshida T, Nishimoto H, Itohara S. (1998) Reduced angiogenesis and tumor progression in gelatinase A-deficient mice. Cancer Res. 58:1048-51.
145.
Kopper, L., Jeney A., Takács J., Benedeczky I., Dzurillay É., Lapis K . (1978)., Studies on the growth of an ascites tumour. I. Cellular and subcellular changes during tumour growth Eur. J. Cancer. 14 :59-73.
99
IRODALOMJEGYZÉK
146.
Shin M, Boyd D., (2002) An inhibitor of c-jun aminoterminal kinase (SP600125) represses c-jun activation, DNA binding and PMA inducible 92kDa type IV collagenase expression. Biochimica et Biophysica Acta 1589 : 311-316.
147.
Rothenberg M.L. Carbone D.P. and Johnson D.H. (2003) Improving the evaluation of new cancer treatmentds: Challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer 3 : 303-309.
A Doktori Értekezés alapját képezo publikációk 1.
I. Babó, A. Zalatnai, Zs. Schaff, Zs. Suba, Gy. Szabó, A. Jeney (1998) The pathomorphology of a human xenotransplanted basaloid squamous cell carcinoma Neoplasma. 45, 4, 211-215. IF: 0,657
2.
F. Tímár, J. Botyánszki, H. Süli- Vargha, I. Babó, J. Oláh, G. Pogány, A. Jeney (1998) The antiproliferative action of a melphalan hexapeptid with collagenasecleavable site. Cancer Chemother Pharmacol (1998) 41:292-298. IF: 1,740
3.
I. Babó, J Bocsi, A. Jeney (1999) The site-dependent growth characteristics of a human xenotransplanted basaloid squamous cell carcinoma J. Cancer Res Clin Oncol 125:35-41. IF: 1,052
4.
Jeney, A. Kovalszky I., Kopper L., Tímár J., Sebestyén A., Babó I., Tímár F., Rásó E., Bocsi J., Sági I., Gruber L., Ötvös L. (1996) Anticollagenase oligodeoxynucleotide (CRIC-2) modifies microinvasiveness and drug sensitivity of malignant cells. Annals. Oncol. 7: (Suppl)1.72.
100
