AZ INTERLEUKIN-8 SZEREPE A MALIGNUS MESOTHELIOMA PROGRESSZIÓJÁBAN

Ph.D. értekezés tézisei

AZ INTERLEUKIN-8 SZEREPE A MALIGNUS MESOTHELIOMA PROGRESSZIÓJÁBAN

Dr. Gálffy Gabriella

SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Témavezető: Prof. Dr. Magyar Pál

Budapest

2001

I. Tartalomjegyzék ÖSSZEFOGLALÁS.............................................................................................................................................. 3 SUMMARY ........................................................................................................................................................... 5 BEVEZETŐ........................................................................................................................................................... 7 MALIGNUS MESOTHELIOMA ................................................................................................................................. 7 INTERLEUKIN-8.................................................................................................................................................... 9 MUNKAHIPOTÉZIS .............................................................................................................................................. 11 CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................................................................. 11 BETEGEK ÉS KÍSÉRLETI METODIKA....................................................................................................... 12 HUMÁN PLEURÁLIS FOLYADÉK .......................................................................................................................... 12 IN VITRO MODEL................................................................................................................................................ 12 Humán pleurális mesothel és malignus mesothelioma sejtek........................................................................ 12 Sejtek tenyésztése a daganat inokulációhoz .................................................................................................. 12 A sejtek direkt IL-8 termelésének meghatározása ......................................................................................... 13 IL-8 szint meghatározása ELISA technikával: .............................................................................................. 13 IL-8 kimutatása immunhisztokémiai úton...................................................................................................... 13 IL-8 proliferatív hatásának meghatározása .................................................................................................. 13 IN VIVO MODEL ................................................................................................................................................. 14 Nude mice model, mesothelioma sejt intrapleurális injektálása nude mice-ba............................................. 14 STATISZTIKAI FELDOLGOZÁS ............................................................................................................................. 15 EREDMÉNYEK ................................................................................................................................................. 16 A PLEURÁLIS FOLYADÉK IL-8 SZINTJEI ............................................................................................................. 16 A SEJTKULTÚRÁK FELÜLÚSZÓINAK IL-8 MÉRÉSEI ............................................................................................... 1 A SEJTKULTÚRÁK FELÜLÚSZÓINAK IL-8 MÉRÉSEI ............................................................................................. 17 IL-8 HATÁSA A MESOTHEL ÉS MESOTHELIOMA SEJTEK PROLIFERÁCIÓJÁRA....................................................... 18 TUMOR MODELL ................................................................................................................................................ 21 A PLEURÁLIS FOLYADÉK ÉS A SZÉRUM IL-8 SZINTJEI A NUDE EGEREKBEN .......................................................... 1 A PLEURÁLIS FOLYADÉK ÉS A SZÉRUM IL-8 SZINTJEI A NUDE EGEREKBEN ........................................................ 22 A SPECIFIKUS IL-8 ELLENES ANTITEST KEZELÉS HATÁSA A TUMOR NÖVEKEDÉSÉRE ........................................... 1 A SPECIFIKUS IL-8 ELLENES ANTITEST KEZELÉS HATÁSA A TUMOR NÖVEKEDÉSÉRE ......................................... 24 AZ ÁLLATOK SÚLYÁNAK VÁLTOZÁSA .................................................................................................................. 1 AZ ÁLLATOK SÚLYÁNAK VÁLTOZÁSA ................................................................................................................ 25 A TUMOR SÚLYÁNAK ÉS A PLEURÁLIS FOLYADÉK IL-8 TARTALMÁNAK ÖSSZEFÜGGÉSE ..................................... 1 A TUMOR SÚLYÁNAK ÉS A PLEURÁLIS FOLYADÉK IL-8 TARTALMÁNAK ÖSSZEFÜGGÉSE ................................... 26 IMMUNHYSTOKÉMIA .......................................................................................................................................... 27 MEGBESZÉLÉS................................................................................................................................................. 28 KONKLÚZIÓ ..................................................................................................................................................... 31 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................................................ 32 ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK ................................................................. 33 MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK: ................................................................................................................... 34 IRODALOMJEGZÉK........................................................................................................................................ 41

2

Az Interleukin-8 szerepe a malignus mesothelioma progressziójában Dr. Gálffy Gabriella Doktori Értekezés Témavezető: Prof. Dr. Magyar Pál Helye: Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Program: Légzőszervi betegségek klinikai és kísérletes kutatása / Tüdőtumorok…

Összefoglalás Célkitűzések: A malignus mesothelioma a jelenlegi terápiás arzenál ellenére is agresszív tumor, melyben a prognosztikus kilátások gyengék. Az interleukin-8 (IL-8) egy kulcsfontosságú

gyulladást

serkentő

és

angiogenetikus

mediátor,

amelynek

daganatnövekedést potencírozó hatását számos tumorban igazolták. Munkánkban arra kerestünk választ, hogy az IL-8 milyen szerepet játszik a malignus mesothelioma progressziójában illetve ennek ismeretében lehetőség nyílik-e a progresszió befolyásolására. Ennek feltérképezésére meghatároztuk az IL-8 mennyiségét olyan betegek pleurális folyadékában, akiknél malignus mesothelioma vagy krónikus szívelégtelenség állt a folyamat hátterében. Mértük a mesothelioma és mesotheliális sejtek IL-8 termelését és vizsgáltuk szerepét a tumor progresszió autocrin regulációjában, valamint a daganat progressziójának változását az IL-8 szintjének specifikus antitest kezelés hatására a pleurális folyadékban, illetve a szérumban való csökkenésével párhuzamosan. Módszer: ELISA technikával végeztük a pleurális folyadék IL-8 tartalmát szívelégtelenségben és malignus mesotheliomában, ill. in vitro 3 különböző mesothelioma sejtvonal által termelt IL-8 szinteket. Az IL-8 sejt proliferációt befolyásoló hatását a malignus mesothelioma és a mesothel sejtek százalékos 3H-Thymidine (3H-TdR) felvétele és sejtszáma alapján mértük különböző koncentrációjú IL-8 (5, 25, 50, 100 ng/ml) és IL-8 ellenes antitest (5, 10 mg/ml) jelenlétében. Athymiás „nude” egerekbe (60) CRL-2081-es típusú malignus mesothelioma daganatsejteket injektáltunk intrapleurálisan. Az egereket 3 csoportba osztottuk (kezeletlen-daganatos, IL-8 ellenes antitestkezelés, és aspecifikus antitestkezelés). Ezután 15 napon

keresztül

48

óránként

részesültek

a

csoportnak

megfelelő

kezelésben

3

intraperitoneálisan. A pleurális folyadék és a szérum IL-8 szintjét (ELISA, pg/ml), a daganat (mg) és az állatok súlyát (g) a tumor injekció után 5, 10, 15 nappal ellenőriztük, amikor csoportonként 6 állatot leöltünk. Eredmények: Malignus mesothelioma pleurális folyadékban emelkedett IL-8 értékeket találtunk. A 96 órás periódus során malignus mesothelioma sejtfelülúszóban az IL-8 szint szignifikánsan emelkedett, míg mesothel sejtekben nem volt mérhető. A háromból két mesothelioma típus ( CRL-2081, CRL-5915) esetében a proliferáció IL-8 függőnek bizonyult. Az IL-8 dózisfüggően emelte a 3H-TdR felvételt, míg IL-8 ellenes antitest csökkentette a proliferációt. A háromból egy malignus mesotheliomára (CRL-5820) és a mesothel sejtvonal növekedésére nem volt hatással sem az IL-8, sem az IL-8 ellenes antitest.(IL-8 Ab). Az antitest kezelt állatokban 15 nappal az inokuláció után a tumor méret (IL-8 Ab: 342,4±22,9 versus kontrol: 507,9±37,9mg), a pleurális folyadék (IL-8 Ab: 0,49±0,04 versus kontrol: 5,8±0,3ng/ml)

illetve

szérum

IL-8

szintek

(IL-8

Ab:

43,7±6,5

versus

kontrol:

603,2±17,2ng/ml) szignifikánsan (p£0,0001) alacsonyabb értéket mutattak, míg az állatok testtömege magasabb értékeken maradt (20,0±0,8g) a kontrol csoporthoz (14,6±0,8g) viszonyítva. Szignifikáns és direkt negatív korrelációt találtunk a pleurális folyadék IL-8 szintjei és az állatok testtömege között (p£0,0001, r=0,88). Következtetés: Eredményeink alapján megállapítható, hogy az IL-8 direkt proliferatív faktor malignus mesotheliomában, de hatástalan a mesotheliális sejtek növekedésére. Tovább erősítve ennek evidenciáját igazoltuk, hogy az IL-8-at neutralizáló antitesttel történő kezelés jelentősen csökkentette a malignus pleurális mesothelioma növekedését athymiás nudeegerekben. Munkánk eredményeképpen egy újabb terápiás lehetőség körvonalazódik, amelynek megfelelő kidolgozása még előttünk áll.

4

The Role of Interleukin-8 in the Progression of Malignant Mesothelioma Gabriella Gálffy M.D. PhD. Thesis Consultant: Prof. Pál Magyar M. D. Budapest, Semmelweis University, School of PhD Studies

Summary Purpose: Malignant pleural mesothelioma, despite current therapeutic strategies is still an aggressive tumor with a very poor prognosis. Interleukin-8 (IL-8), a pro-inflammatory and angiogenic cytokine, has an important role in the tumor related neovascularization, and also has a direct growth potentiating effect on certain tumors. In our works, we aimed to test the role of IL-8 in the progression of malignant mesothelioma and in the knowledge of that, to interfere this progress. We determined IL-8 levels in human malignant mesothelioma effusions and congestive heart failures pleural fluids. We also investigated IL-8 production by different malignant mesothelioma cell lines and the role of IL-8 in the autocrine growth regulation of mesothelioma cells. We evaluated the effect of IL-8 antibody (IL-8 Ab) on progression of malignant pleural mesothelioma in vivo. Methods: IL-8 levels were measured in malignant mesothelioma and chronic heart failure pleural fluids, and in supernatants of 3 different cultured cell lines, in vitro by an ELISA technique. The proliferative activity was determined by thymidine (3H-TdR) incorporation and also by direct cell counts after incubation with varying concentrations of IL-8 (5, 25, 50 100 ng/ml) and specific polyclonal anti-IL-8 antibody (10 mg/ml, IL-8 Ab). Athymic nude mice (60) were intrapleural injected by human malignant pleural mesothelioma cells (CRL-2081), equally divided into three groups (IL-8 Ab-, control Ab-, untreated) and received intraperitoneal injection of IL-8 Ab, control Ab or no treatment respectively, every 48 hr for 15 days. Pleural fluids and serum IL-8 levels (ELISA, pg/ml), tumor (mg) and body weight (gr) of mice were measured 5, 10, 15 days following tumor injection at sacrifice of 6 mice/group/time point.

5

Results: We found significantly higher levels of IL-8 in mesothelioma pleural fluids than in chronic heart failure and a time dependent increase in IL-8 levels of mesothelioma cell supernatants during 96 h of incubation. In the supernatants mesothel cell lines, IL-8 levels were undetectable. In two of three mesothelioma cell lines, we found IL-8 dependent proliferation. IL-8 caused a dose-dependent increase in (3H-TdR) incorporation, however administration of IL-8 Ab significantly decreased the proliferation. The growth of mesothel and one of mesothelioma cell lines was not responsive either to IL-8 or IL-8 Ab. We found that both pleural fluid (IL-8 Ab: 0,49±0,04 versus control: 5,8±0,3ng/ml) and serum IL-8 levels (IL-8 Ab: 43,7±6,5 versus control: 603,2±17,2ng/ml) were significantly (p£0.0001) depressed in mice with IL-8 Ab treatment, when compared with controls. In IL-8 Ab-treated group, lower IL-8 levels associated with the decreased rate of tumor growth as estimated by particular tumor weights (IL-8 Ab: 342,4±22,9 versus control: 507,9±37,9mg) and mice body weights (IL-8 Ab: 20,0±0,8 versus control: 14,6±0,8g). There was a significant and direct correlation between pleural fluids IL-8 levels and tumor weights of all animals enrolled in this study (p£0.0001, r=0.88). Conclusion: We conclude that IL-8 can mediate malignant mesothelioma but not mesothel cell growth. IL-8 had a direct growth potentiating activity of malignant mesotheliomas. We described that Ab treatment against IL-8 decreased humán malignant pleural mesothelioma progression. Our results suggest that treatments targeting the decrease of malignant pleural mesothelioma associated IL-8 levels or the effects of this protein are promising therapies in the clinical medicine.

6

Bevezető Malignus mesothelioma A mesothelioma definícióját először Eastwood és Martin alkotta meg 1921-ben ( 1) a pleura primér tumorára. A daganat igazi természetének megismerése azonban nem volt még teljes az akkoriban hiányzó boncolások nélkül. Ma már a technika és a tudomány rohamos fejlődésével egyre pontosabban ismerjük meg e daganat természetét, viselkedését, ami elengedhetetlenül fontos a megfelelő kezelés megtervezéséhez. Pathobiológiája komplex; magába foglalja az onco- és tumorgenezist, szöveti inváziót és metasztázis képzést. A malignus mesothelioma a relatíve ritka, de nagyon agresszíven növekvő tumorok közé tartozik. Jellegzetes, hogy nem ad távoli metasztázisokat, míg a lokális elváltozást körülölelő szöveti invázió mértéke jelentős a rekeszizom, a mediastinum és a pleura irányába, magában foglalva a viscerális és parietális pleurát. Ennek megfelelően a prognózis, még az esetleges korai diagnózis, kombinált citosztatikus, radio- és sebészi terápia ellenére is, nagyon rossz. (2) Az USA-ban átlagosan 2000 halál, és 4000 új diagnosztizált eset fordul elő évente (3). A túlélés átlagosan 7-9 hónap a daganat felismerése után. Sajnos incidenciája az utóbbi években folyamatosan növekszik és előfordulása a férfiak között négyszer gyakoribb, mint a nők között. (4) A különböző országokban, eltérő incidencia adatok figyelhetők meg, sőt akár egy országon belül is eltérhetnek, attól függően, hogy ipari vidékről van e szó, vagy nem. Párizs és környékén az incidencia 7.5/millió a férfiak között és 1.5/millió a nők között (5), míg Provance környékén a férfiaké 14.2/millió a nőké pedig 1/millió. Korzikán a nőké ugyanannyi, míg a férfiaké 16.2-re emelkedett (6) Ausztráliában kiemelkedően magas adatok vannak, 66/millió a férfiak között és 7/millió a nők között. (7) Az Egyesült Államokban ez 11.4/1 millió a férfiak és 2.8/1 millió a nők között (4). Az azbeszt expozíciónak nagy szerepe van a daganat kialakulásában, amit először 1960ban Wagner és munkatársai igazoltak a Dél Afrikai bányászok között.(8) A mesotheliomák kb. 80%-áért tehető az azbeszt felelőssé, azonban a mesotheliomák legalább 20 %-a spontán alakul ki. Incidenciája az iparilag fejlett országokban 1975 és 1985 között négyszeresére növekedett és a csúcsot a becslések alapján 2010 és 2020 között fogja elérni. (9) Ennek az emelkedésnek az oka a XX. század első kétharmadában bekövetkezett jelentős azbeszt felhasználás. Az azbesztot a második világháborúban kezdték el intenzíven világszerte használni és az 1970-es évek végéig nem csökkent a használata.(10) Az azbeszt expozíció és a

7

mesothelioma észlelése között általában 20-40 év telik el. Az azbesztrostok méretétől és fajtájától is függ a carcinogenításuk. Az első tünetek a nehézlégzés és a tompa mellkasi fájdalom. A fájdalom a has felső részébe és a vállba sugározhat. Később a fokozódó nehézlégzés, köhögés, láz, és fogyás jelentkezhet. A betegek 75%-nál észlelhető mellkasi folyadék, ami exudátum és 50%-ban véres. A folyadékból 30%-ban mutathatók ki mesothelioma sejtek cytológiai vizsgálattal. Az alacsony Ph és glukóz érték rossz prognózist, nagy tumor masszát jelent (11) Kezdeti stádiumban a pleurális folyadék mellett multiplex fehér vagy szürke csomók észlelhetők a fali pleurán. Ezek összefolyása után a pleura diffúzan, egyenetlenül megvastagodik. A tumor beborítja és infiltrálja a tüdőt, a rekeszt, a pericardiumot a szívet és az ellenoldali pleurát. Megjelenhet peritoneális folyadék, és tumoros göbök a peritoneumon. Hisztológiailag a diffúz malignus mesothelioma epitheliális, mesenchymális, kevert sejtes , anaplasztikus transitionális és desmoplasztikus típusra osztható. Ezek közül az esetek fele epitheliális, amelynek a legjobb a prognózisa. (12). A

mesothelioma

immunhisztokémiai

diagnózisához

vizsgálattal

szövettani

kiegészítve.

Az

vizsgálat

szükséges,

adenocarcinómától

a

gyakran

legnehezebb

elkülöníteni amelyben segítségünkre vannak a következő markerek:vimentin, cytokeratin, EMA, CEA, HBME-1, Calretinin (12, 13). A malignus mesothelioma terápiájának kutatásával folyamatosan foglalkoznak világszerte. Az időben felismert esetek (I és II stádium) kiterjesztett műtéte, ami extrapleurális pulmonectomiát

vagy

parietális

pleurectomiát

jelent,

kiegészítve

kemo-

illetve

radioterápiával, növeli a túlélés lehetőségét. 48%-os két éves túlélésről számolnak be a kombinált sebészi, kemo és radioterápia után (14, 15, 16). Az öt éves túlélés még a rezekált betegek között is csak 10-15% körül van. A kemoterápiák közül a monoterápia nem elég hatásos, ezért a kombinált kezelés javasolható. (Doxorubicin+cyclofoszfamid illetve mitomycin+ciszplatin vagy ciszplatin+ gemcytabin szisztémás kezelésekkel vannak jó eredmények.) Mivel a szisztémás kezelésnek sok a mellékhatása és nem megfelelő az effektivitása, ezért a lokális, intrapleurális kemoterápiával próbálkoznak. Eddig az intrapleurálisan adott ciszplatin, doxorubicin, mitomycin és cytosin arabinosid kezeléssel vannak tapasztalatok (17, 18, 19). Mivel a mesothelioma kevéssé sugár érzékeny daganat, a

8

radioterápiát főleg prevencióként, a metasztázis megelőzésére használják rutinszerűen az invazív beavatkozások után, mint a tűbiopszia, vagy a thoracoscópia (17, 18, 19). A nemzetközi irodalomban a kombinált sebészi, kemo és radioterápiát javasolják együtt, azonban jelentős túlélési adatokat nem kaptak eddig. Mivel a mesotheliomáknak kb. 75%-a pleurális folyadékkal jár, ami a dyspnoet okozza, ezért a pleurodézis elég gyakran használt palliatív terápia. Leggyakrabban bleomycin, tetracyclin, doxicyclin mellet a talcumot használjuk. Az újabb terápiás lehetőségek közül az immunterápia és a génterápia a jövő útja. Eddig interleukin-2 (IL-2) szisztémás és főleg intrapleurális adásával értek el jelentősebb eredményeket. Intrapleurális adással 41%-os 3 éves túlélést igazoltak (20, 21, 22). Emellett intrapleurális interferon gammával vannak említésre méltó sikerek. Átlagosan 20%-os regressziót igazoltak a kezelés után, ami I-es stádiumban 45%-os volt. (17, 18, 23). A géntechnikák közül a herpes simplex vírus thymidine kinase intrapleurális adásával ganciclovir mellett, a vaccinavírus-IL-2 intratumorális adásával (24) és a bakteriális „heat shoch protein”(HSP65) intraperitoneális adásával vannak számottevő sikerek (17, 19). Ígéretes állatkísérleti eredmények vannak az interleukin-12 (IL-12) antitumorális hatásának igazolására. Szisztémás adásával 70 %-kal csökkent a tumor növekedése MPM-ban és a metasztázis képződést is csökkentette. (25, 26) Emberben a folyamatosan magas IL-12 szintet ismételt injektálással nehezen lehet megvalósítani, ezért a gén transferre lenne szükség.(27). Eddig subcután és intravénás rekombináns humán IL-12 adásával próbálkoztak különböző dózisokkal és értek el jelentős eredményeket. Említésre méltó sikerek vannak az intradermális Mycobactérium vaccae és kemoterápiás kezelés kombinálásával malignus mesotheliómában és nem kissejtes tüdőrákban egyaránt fázis II. kísérletben. Az interakció hatására a responz ráta, az átlagos és az egy éves túlélés egyaránt emelkedett mindkét daganatban. (28)

Interleukin-8 Régóta ismert, hogy számos daganatsejt termel a saját progresszióját elősegítő anyagokat. Malignus melanoma sejtek esetében ilyen faktor az MGSA – Melanoma Growth Stimulatory Activity (29). Feltünő szekvencia homológiát mutat az egyébként szintén a CXC géncsaládba tartozó IL-8-val. Mindkettőről kimutatták, hogy melanoma sejtek termelik, és mint autocrin növekedési faktor játszanak szerepet a melanoma növekedésében, tumorgenezisében és mitogén működésében (30,31). Ezt támasztja alá, hogy az IL-8 mRNS ellenes antitestek szignifikánsan csökkentették a melanoma sejtek proliferációját in vitro, és a

9

metasztázis képzést in vivo (32). IL-8 b receptort (CXCR2) igazoltak malignus melanoma sejtben, ami bizonyítottan kritikus szerepet játszik a daganat proliferációjában, illetve a melanoma növekedés regulálásában (30, 31, 33, 34). Abban a melanoma sejtben, ahol igazolták a receptor jelenlétet, az IL-8 proliferatív hatásúnak bizonyult. Az IL-8, habár elsőként gyulladás elősegítő hatását írták le, (35) multifaktoriális hatással rendelkező chemokin, a CXC család tagja. (36, 37). Számos sejt, mint monocyták, neutrophilek, lymphocyták, endothel és mesothelsejtek is termelik bizonyos indukáló faktorok hatására, mint Lipopolysacharidok (LPS), IL-1, IL-6, Tumor Nekrózis Faktor-a (TNF-a), (35, 38). Az IL-8 aktiválja a neutrophil sejteket, és mint erős kemoattraktáns növeli azok migrációs kapacitását és ezáltal az érintett terület invázióját, melynek során az aktivált immunsejtek kötődnek az endothel sejtekhez, és átjutva az érfalon degranulálódnak.(39) Azonban az IL-8 növeli az endothel sejtek szaporodását, migrációját in vitro (40) és növeli az endogén angiogenezist, corneális micropocket modelben (41) és implantált patkány csontvelő esetében (42). A hatás erőssége hasonló volt a Vasculáris Endotheliális Growth Faktor (VEGF), és a Fibroblast Growth Faktor (FGF) effektivításához. IL-8 ellenes antitestek blokkolták az angiogenetikus hatást.(43). Folkman állítása szerint a tumor növekedése és terjedése az angiogenezis függvénye. Egyetlen típusú daganat sem képes 2 mm3 átmérő fölé növekedni megfelelő

érsűrűség

és

ennek

potens

fokozódása

hiányában

(44).

A

daganat

neovaszkularizációját az angiosztatikus és angiogenetikus faktorok felbomlása okozza. Nem kissejtes tüdőrák (non small cell lung cancer: NSCLC - adenocarcinoma, squamosus sejt) esetében jelentős IL-8 szintet találtak a tüdő szövetében és a pleurális folyadékban. Itt szemben a melanomával nem autocrin növekedési faktorként működött, de angiogenetikus hatásán keresztül azonban a pleurális fluidum IL-8 szintje és a daganat progressziója szignifikáns összefüggést mutatott (45). Az IL-8 ellenes antitest kezelés csökkentette a tumor vascularizáltságát, és igy a tumor mérete és metasztázis készsége is csökkent (34). A malignus mesothelioma progressziójában valószínűleg mind a két hatás szerepet játszik. Malignus mesothelioma pleurális fluidumban hasonlóan a NSCLC-hoz, szintén magas IL-8 szintet találtak. Ezek az értékek magasabbak voltak, mint tüdő tumorban. Az IL-8 magas szintje, illetve bizonyos tumorokban megfigyelt angiogenetikus és proliferatív hatása, vezetett bennünket arra a következtetésre, hogy vizsgáljuk meg az IL-8 szerepét a malignus mesothelioma progressziójában.

10

Munkahipotézis Munkahipotézisünk az volt, hogy az IL-8-nak prognosztikai szerepe van a malignus pleurális mesothelioma (MPM) progressziójában, illetve annak feltételezése, hogy az IL-8 blokkolása jótékony hatású e progresszió tekintetében.

Célkitűzések Jelen munkánkban arra kerestünk választ, hogy az IL-8 milyen szerepet játszik a humán malignus pleurális mesothelioma progressziójában. Ennek a vizsgálatához elsőként meghatároztuk az IL-8 mennyiségét pleurális folyadékokban (PF) olyan betegekből, akiknél malignus mesothelioma vagy krónikus szívelégtelenség állt a folyamat hátterében. Szintén megmértük a mesothelioma és mesotheliális sejtek által laboratóriumi körülmények között termelt IL-8 mennyiségét. A proliferatív hatás meghatározásához a sejtek növekedési potenciálját mértük IL-8 és IL-8 ellenes specifikus antitest jelenlétében. (46). Ezek után célul tűztük ki egy olyan kísérletes állatmodell létrehozását,, amely jobban hasonlít a human viszonyokhoz és praktikusabb, mint az előzőek. (48,49). Eddig főleg subcutan injectálták a mesotheliomát a különböző állatokba, ami különböző viszonyokat jelentett, mintha a pleurális üregben lett volna.(50). Mi intrapleurálisan injectáltunk daganatsejteket nude, thymus irtott egerekbe. Specifikus, illetve aspecifikus IL-8 antitest kezelés mellett vizsgáltuk a daganat viselkedésének változását egy esetlegesen későbbi terápiás eljárás feltérképezéséhez. (47).

11

Betegek és Kísérleti Metodika Humán pleurális folyadék Munkánkba A Veterans’ Affairs Medical Center Tüdőgyógyászati Osztályának (Indiana University Medical School, Indianapolis, USA) beteganyagából 12 beteget választottunk be. Írásos beleegyezésük után diagnosztikus thoracocentézissel nyertünk mintát.A pleurális folyadék hátterében malignus mesotheliomát definiáltunk, amennyiben cytológiai vizsgálattal malignus mesothelioma sejteket találtunk a szivadékban, vagy zárt pleurális biopsiával mesothelioma igazolódott. A kontrol csoportot olyan betegek alkották, akik szimptómatikus szívelégtelenségben szenvedtek (cardiac heart failure - CHF). Az ő esetükben a PF LDH / szérum LDH aránya alacsonyabb volt, mint 0.6 és PF protein / szérum protein hányados kevesebb, mint 0.5. A vizsgálatból kizártunk mindenkit, akinek mikrobiális szempontból pozitív PF tenyésztése volt. A PF-okat a mérésekig –70 C°-on raktároztuk.

In Vitro model Humán pleurális mesothel és malignus mesothelioma sejtek Kísérleteink során 1 mesothel (CRL-9444) és 3 különböző humán malignus mesothelioma sejtvonalat (CRL-2081, CRL-5915 és CRL-5820) használtunk, melyeket az American Type Culture Collection-tól (ATCC, Rockville, MD, USA) rendeltünk. A sejtek tenyésztése és kezelése tekintetében röviden: A mesothel sejteket Ham’s 199 culture mediumban (Gibco Lab., Grand Island, NY, USA) resuspendáltuk, míg a mesothelioma sejteket RPMI-1640 culture mediumban tenyésztettük (9). Mindkettő tartalmazott 10%-os fötális bovin serumot (FBS), Penicillint és Streptomycint. A sejteket 37 C°-on 5% CO2-t és 95% körlevegőt tartalmazó inkubátorban tartottuk. Sejtek tenyésztése a daganat inokulációhoz Miután a sejtek elérték a 80%-os konfluenciát, trypszin segítségével resuspendáltuk őket és hemacytométerrel megszámoltuk. Életképességüket Trypan kékkel vizsgáltuk, és csak azokat használtuk, ahol ez meghaladta a 95%-ot. Ezek után a sejteket lecentrifugáltuk (1500 rpm, 6 perc) és kimostuk, illetve resuspendáltuk szérum mentes médiumban (SFM), 25 millió sejtet 200 µl médiumban, ami alkalmas volt az injectálásra.

12

A sejtek direkt IL-8 termelésének meghatározása Az egyes sejtkultúrák sejtfelülúszóinak IL-8 tartalmát mértük. Az összes sejttípust, miután a 75 cm2–es sejtkultúrás edényt konfluensen kitöltötte, azonos (RPMI-1640, 8 ml) sejtmédiumban tenyésztettük tovább. A kondicionált sejtfelülúszót 24, 48, 72 és 96 óra után eltávolítottuk, és centrifugálás után –70 C°-on raktároztuk. IL-8 szint meghatározása ELISA technikával: pleurális fluidumok (Mesothelioma, Congestive heart failure CHF, mint control), mesothelioma sejttenyészet. Az extracelluláris immunoreaktív IL-8 szintet kétszeres „szendvics” technikájú enzim immunoassay segítségével mértük, melyet az R&D System, Minneapolis, MN, USA vásároltunk. A mérés részleteinek tekintetében utalok a gyár katalógusaira. IL-8 kimutatása immunhisztokémiai úton (malignus

mesothelioma

szövetből

illetve

mesotheliális

és

mesothelioma

sejttenyészétből) A tumor minták 10 %-os formalinban voltak fixálva. A paraffinba ágyazott metszeteket xylén, és emelkedő koncentrációjú etanolban dehydráltuk. Ezután avidin-biotin és peroxidase –sal kezeltük.(51). A metszeteket metanolban fixáltuk, majd az endogén peroxidase aktivitást 1 %-os hydrogén peroxidázzal blokkoltuk. Ezután mostuk foszfát pufferrel (PBS) és a nem specifikus kötőhelyeket 1%-os lószérummal blokkoltuk, és Triton-X-100-zal kezeltük, majd 1:500 hígítású specifikus IL-8 antitesttel kezeltük. A negatív kontrollhoz aspecifikus IgG-t adtunk. Mosás, majd avidin-biotin konjugált egér ellenes IgG Vectastain ABC kittel dolgoztunk. A metszeteket ismét foszfát pufferral mostuk, peroxidase szubsztrát oldatot adtunk hozzá, majd Mayars hematoxilinnal fixáltuk. Dehydráláshoz xylén és emelkedő koncentrációjú alkoholt használtunk. IL-8 proliferatív hatásának meghatározása (mesotheliális és mesothelioma sejttenyészeten [3H] Thymidine izotóp felvétel segítségével, b scintillációs mérővel). Sejtvonalak kezelése különböző koncentrációjú IL-8val, specifikus és nem specifikus IL-8 antitesttel, mint kontrollal. A mesothel és mesothelioma sejtek proliferációs kapacitásának meghatározása a Lauber és mtsai által leírt a „[3H] thymidine uptake assay” segítségével történt. Így a sejtekbe

13

beépülő radioaktív izotóppal jelzett thymidin mennyiségét mértük egy ß scintillációs számláló segítségével. Az eredményeket minimum 3 mérés eredményeként kapott percenkénti scintilláció átlagában határoztuk meg, melyeket a szérum mentes mediumhoz (serum free medium, SFM) hasonlítottunk. A feltüntetett értékek tehát a kontrolhoz (SFM) képest a százalékos stimulációt mutatják. A kísérletek során különböző koncentrációjú IL-8-at (5, 25, 50, 100 ng/ml), specifikus poliklonális IL-8 ellenes antitestet (5, 10 µl/ml)és aspecifikus kecske IgG-t adagoltunk az egyebként szérum mentes médiumban (SFM) tenyésztett sejtekhez, melyeket 24 óráig inkubáltunk az előbb említett körülmények között. A sejtek proliferációs aktivitását egyébként még direkt sejtszámlálással is meghatároztuk az egyes esetekben.

In Vivo model Nude mice model, mesothelioma sejt intrapleurális injektálása nude mice-ba. Folyamatos IL-8 antitest adagolása intraperitoneális úton. Hetente a daganat mértékének, progressziójának meghatározása a daganat pontos paramétereinek, súlyának, elhelyezkedésének mérésével. Szérumból és pleurális fluidumból az IL-8 szint folyamatos monitorozása, a daganat szövettani, immunhisztokémiai analízise, a neutrophil invázió meghatározása. A kísérlethez 65 db 4-5 hetes, 24g-os atymiás, nude, hím egereket vásároltunk. Egy hétig patogén mentes környezetben tartottuk őket, 12 óránként váltakozott a sötét és a világos a környezetben. 6 hetes korukban kezdtük a kísérletet. A fent leírt módon tenyésztettük a mesothelioma sejteket (CRL-2081). Egyenként 25 millió daganatsejttel injectáltuk az állatokat, amit előtte 200 µl SFM-ban oldottunk fel. Az injectáláshoz nem alkalmaztunk anesztéziát és a jobb oldali pleurális űrbe injectáltunk. Egy órán keresztül observáltuk őket, majd a ketrecükbe kerültek. A kísérlethez az egereket három csoportba osztottuk. Az egyes csoportot csak daganattal injectáltuk, de nem kapott egyéb kezelést (Tumoros). A kettes csoport daganatsejtet és 48 óránként specifikus IL-8 ellenes antitest kezelést kapott intraperitoneálisan (Ab csoport). A hármas csoport daganatsejtet és aspecifikus IgG ellenes antitestkezelést kapott szintén 48 óránként hasonló módon. 100 µg specifikus, illetve aspecifikus IgG antitestet illetve oldóanyagot (PBS) minden 48 órában. 15 napon keresztül a tumor injectálást követő napon kezdve (IgG csoport). Az egerek testsúlyváltozását folyamatosan monitoroztuk. 5, 10 és 15 naponta öltük meg a megfelelő csoportban levő

14

egereket. Perifériás vérmintából (a. Ophtalmica) és a pleurális folyadékból az IL-8 szintet határoztuk meg. A boncolás során a tumor sejteket összegyűjtöttük és megmértük a súlyát (gban). A további szövettani analízishez 10%-os formalinban fixáltuk a tumor sejteket.

Statisztikai feldolgozás A mért értékből átlag és standard deviációt számítottunk. Szignifikancia érték számításánál a két mintás t próba és ANOVA analízist használtuk. Az eredményeket statisztikailag szignifikánsnak vettük, ha a p érték kisebb, mint 0,05 (p≤0,05).

15

Eredmények A pleurális folyadék IL-8 szintjei A vizsgált 12 beteg egyenlő arányban került az egyes csoportokba (malignus mesothelioma és kontrol, krónikus szívelégtelenség). A 6 mesotheliomás betegnél a szövettan 4 esetben kevert, 1 esetben epitheliális és 1-ben sarcomatosus tumort diagnosztizált. A mért IL-8 szinteket az 1 ábra szemlélteti. A malignus mesotheliomában szenvedő betegeknél szignifikánsan (p≤0,0001) magasabb IL-8 szintet találtunk (8,78±3,59 ng/ml) szemben a CHF betegekkel (0,07±0,05 ng/ml).

11 10 **

9

IL-8 (ng/ml)

8 7 6 5 4 3 2 1 0 CHF

Mesothelioma PLEURALIS FOLYADÉKOK

1. ábra: A pleurális folyadék interleukin-8 (IL-8) tartalma. Az értékek a csoportonkénti n=6 mérések átlagát és a standard deviációt képviselik ng/ml-ben ** p £0.001. (CHF-krónikus szívelégtelenség)

16

A sejtkultúrák felülúszóinak IL-8 mérései A 2. ábrán is látható, hogy mind a három mesothelioma sejtvonalnál található volt ELISA technikával detektálható IL-8 mennyiség, míg a mesothel sejttenyészet esetén még 96 órai inkubáció elteltével sem volt kimutatható IL-8. Megfigyelhető az eltelt napok számával szignifikánsan idő-függő IL-8 növekedés is. 96 órás inkubáció után a CRL-5820 mesothelioma sejtvonalnál 36,2±6,3 pg/ml, a CRL-5915-nél 516,4±19,0 pg/ml és a CRL-2081 sejtvonalnál 2689,4±60,2 pg/ml IL-8 szintet találtunk. Meg kell még említeni, hogy a detektábilítás alsó határa az ELISA mérés tekintetében 31,2 pg/ml, ami a CRL 5820 as mesothelioma sejtvonal IL-8 eredményeit csak a qualitativ mérési pontosság irányába tereli.

2800

Mesothelial CRL-9444

2400

Mesothelioma CRL-5820 Mesothelioma CRL-2081

IL-8 (pg/ml)

2000

Mesothelioma CRL-5915

1600

1200

800

400

0 0

24

48

72

96

TIME (óra)

2. ábra: A CRL-2081, 5915, 5820 mesothelioma és a CRL-9444 mesothel sejtek sejtfelülúszójának ELISA technikával mért inter-leukin-8 (IL-8) tartalma. Az értékek hat független kísérlet dupla meghatározása alapján számított átlag± standard deviáció értékét képviselik pg/ml-ben, 48, 72 és 96 órás inkubáció után. (** p £0.001 szignifikancia a kiindulási értékhez képest.)

17

IL-8 hatása a mesothel és mesothelioma sejtek proliferációjára Különböző koncentrációjú IL-8 (5, 25, 50, 100 ng/ml) és IL-8 ellenes antitest (5, 10 mg/ml) hatását vizsgáltuk mesothel és mesothelioma sejtek proliferációjára a sejtekbe épített radioaktív [3H] thymidine incorporáció mérésével és a sejtek számának növekedése alapján. Két mesothelioma sejtvonal: a CRL-2081 és az 5915 egyaránt szignifikáns és dózisfüggő növekedést mutatott a [3H] thymidine felvétel tekintetében a kontrol szérum mentes médiumhoz képest (3. ábra). A hatás maximuma 50 ng/ml-es IL-8 koncentrációnál jelentkezett (CRL-2081: 146,3±3,6% és CRL-5915: 112,3±1,6%; p≤0,001 a SFM értékeihez hasonlítva). 100 ng/ml IL-8 már nem tudta tovább emelni a proliferációt (CRL-2081: 138,2±2,7% és CRL-5915: 105,9±2,3%; p≤0,001 a SFM értékeihez hasonlítva). A mesothel sejtek (CRL-9444) azonban hasonlóan ahhoz a mesothelioma sejtvonalhoz (CRL-5820) melyek IL-8 termelése az ELISA mérés alsó határán volt nem reagáltak az IL-8 kezelésre és a proliferáció változatlan maradt a kontrolhoz képest.

160%

Mesothelial CRL-9444 Mesothelioma CRL-5820 Mesothelioma CRL-2081 Mesothelioma CRL-5915

3

[ H]-THYMIDINE felvétel (% STIMULATION)

150% 140%

**

**

**

130% 120%

*

** *

110%

*

100% 90% SFM

5

25

50

100

IL-8 (ng/mL)

3. ábra: Mesothelioma CRL-2081, CRL-5915, CRL-5820 és a mesothel (CRL-9444) sejtek proliferációs görbéje különböző koncentrációjú (5, 25, 50, 100 ng/ml) interleukin-8 (IL-8) és szérum mentes médium (SFM-kontrol) esetében. Az eredmények (átlag és standard deviáció) [3H]-thymidine felvétel százalékos növekedését jelentik szérum mentes médiumhoz képest 48 óra inkubáció után. Négy független kísérlet három ismételt mérését használtuk. (** p£0.001, * p£0.05 SFM-hez hasonlítva.)

18

120% SFM

IL-8 Ab

(10 mg/ml)

80% ** 60%

**

40%

3

[H]-THYMIDINE felvétel (% STIMULATION)

100%

20%

0% Mesothelial CRL-9444

Mesothelioma CRL-5820

Mesothelioma CRL-2081

Mesothelioma CRL-5915

CELL LINES 4. ábra: Specifikus poliklonális antihumán interleukin-8 antitest (IL-8 Ab 10 mg/ml) hatása a mesothel és mesothelioma sejtek proliferációjára. Az eredmények (átlag és standard deviáció) [3H]thymidine felvétel százalékos növekedését jelentik szérum mentes médiumhoz képest 48 óra inkubáció után. Négy független kísérlet három ismételt mérését használtuk. (** p£0.001, p£0.05 SFM-hez hasonlítva.)

Továbbiakban megnéztük a specifikus poliklonális antihumán IL-8 antitestek hatását a proliferációra. Az előzőekhez hasonlóan a CRL-2081 (61,8±6,7%; p≤0,001) és a CRL-5915 (50,2±1,5%; p≤0,001) mesothelioma sejtek proliferációja csökkent szignifikánsan és dózisfüggően a sejtfelülúszó IL-8 tartalmának eliminálása révén. Érdemes kiemelni, hogy a kevesebb IL-8-at termelő CRL-5915-ös érzékenyebb volt az IL-8 csökkenésre szemben a sokkal magasabb IL-8 mennyiséget termelő CRL-2081-el. A CRL-5820 és a mesothel sejtek tekintetében nem volt változás a [3H] thymidine inkorporációban az IL-8 ellenes antitestek hatására. A nem specifikus kecske IgG nem mutatott semmilyen hatást (4. ábra).

19

Direkt sejtszámlálással (haemocytometer) megerősítettük a [3H] thymidine mérés eredményeit (5. ábra), amennyiben 50 ng/ml IL-8 növelte és 10 mg/ml IL-8 antitest csökkentette a proliferációt. A 5. ábrán látható, hogy az IL-8 a legeffektívebb a CRL-2081-es sejtvonal (152,1±3,0; p≤0,001) esetében volt (vs. 110,0±2,4; p≤0,05 – CRL-5915), míg az antitest hatékonysága a CRL-5915-ös sejtvonalnál (68,0±2,8; p≤0,001) bizonyult a legerősebbnek (vs. 77,5±2,0; p≤0,05 – CRL-2081). A mesothel és a CRL 5820 mesothelioma sejtek egyaránt érzéketlennek bizonyultak a fenti kezelésre.

180% SFM

160%

**

IL-8 IL-8 Ab

140%

* Sejtszám (%)

120% 100%

* **

80% 60% 40% 20% 0% Mesothelial CRL9444

Mesothelioma CRL- Mesothelioma CRL- Mesothelioma CRL5820 2081 5915 CELL LINES

5 ábra: Az interleukin-8 (IL-8) és specifikus poliklonális antihumán IL-8 antitest (IL-8Ab) a sejtproliferációra a sejtszámok alapján. Az eredmények (átlag és standard deviáció) a sejtszámok százalékos növekedését jelentik szérum mentes médiumhoz képest 96 óra inkubáció után. Négy független kísérlet három ismételt mérését használtuk. (** p£0.001, p£0.05 SFM-hez hasonlítva.)

20

Tumor modell Kísérletünkben összesen 65 nude egeret injectáltunk intrapleurálisan egyenként 25 millió humán CRL-2081 típusú MPM sejttel. Ezek közül 5 perioperatív haláleset történt pneumothorax miatt. Az állatokat három csoportba osztottuk, akik kaptak specifikus IL-8 antitestet, akik csak kontroll antitestet kaptak és végül akik nem kaptak antitest kezelést. A kísérlet alatt 4 egeret vesztettünk el, akik a daganat gyors növekedése miatt a kísérleti idő letelte előtt légzési elégtelenségben pusztultak el, ezek az antitesttel nem kezelt és a kontrol antitesttel kezelt csoportból (IgG) származtak. A boncoláskor az 5 napos csoportban a specifikus IL-8 antitesttel kezelt állatok közül kettőben nem találtunk daganatot. A boncolás során daganatot találtunk a rekeszen, a parietális és a viscerális pleurán és a mediastinumban. A kísérleti időpontokban az 5, 10 és 15 napon leölt állatokból szövettani feldolgozást is végeztünk. A mesothelioma főleg epitheloid túlsúlyú volt, nagy pleomorf sejtmaggal, kifejezett nucleolussal és eosinophill cytoplasmával. Néhány sejt orsó alakú volt, a többi pedig poliglonális. A kísérletet a tumor injectálást követő 15. napon fejeztük be. Az 1. képen látható, hogy a kísérlet végén(15 nap után) a csak tumorral és az IgG-vel injectált állatok mennyivel kisebb súlyúak voltak a specifikus IL-8 antitesttel kezelt állatokhoz képest.

1. kép: IL-8 ellenes és kontrol antitesttel kezelt, illetve nem kezelt állatok a tumor injekciót követő 15. nap.

21

A pleurális folyadék és a szérum IL-8 szintjei a nude egerekben Mint in vitro kísérletünkből ismert a CRL 2081-es típusú malignus mesothelioma, amivel a nude egereket injectáltuk, jelentős mennyiségű IL-8-at termel. Mind a pleurális folyadékban (6. ábra), mind a szérumban (7. ábra) szignifikánsan magasabb IL-8 szinteket mértünk a nem kezelt és a kontroll antitesttel kezelt állatokban, a specifikus IL-8 ellenes antitesttel kezelt állatokkal szemben. Az IL-8 pleurális folyadékszintek 6-10-szer magasabbak voltak, mint a szérum szintek a 15 napos kisérlet során. Az 5 és 10 nap közötti intervallumban sokkal intenzívebb volt az IL-8 emelkedés mind a pleurális folyadékban, (nem kezelt állatokban 659,5±67,2 –től 3012 ±283,5 pg/ml és kontroll antitesttel 541±99,4-től 3120±172,5 pg/ml) mind a szérumban. Az emelkedés intenzitása csökkent, de szignifikánsan magasabb maradt (p≤0,0001) a 10 és 15 nap közötti intervallumban mindkét csoportban. (5830±277,8-ig a nem kezelt csoportban, és 6206-2,7±317,3 pg/ml-ig a kontrol IgG antitesttel kezelt csoportban).

Pleurális Folyadék IL-8 tartalma (pg/m

7000 6000 5000 4000

Ab IgG Tumor

3000 2000 1000 0

5 nap

10 nap tumor injectio után

15 nap

6. ábra A pleurális folyadék IL-8 szintje nude egerekben a tumor injectálást követően IL-8 ellenes antitest kezelés mellett és nélkül: Az eredmények pg/ml-ben, csoportonként és 6-6 kísérleti állatot jelentenek. Az IL-8 szint 5, 10 és 15 napos időpontokban szignifikánsan magasabb volt a nem kezelt és a kontrol antitestnél (p£0,0001), mint a specifikus antitesttel kezelt állatcsoportban.

22

Ezzel szemben a speciális IL-8 ellenes antitesttel kezelt csoportban mind a pleurális folyadékban, mind a szérumban jelentősen alacsonyabb IL-8 szinteket mértünk. Pleurális folyadékban 5-15 napig (64,3 ±8,5-től 490,8 ±41,7 pg/ml-ig) emelkedett fel, míg szérumban az ötödik napon nem volt mérhető IL-8 a tumor injectálást követően, a tizedik és tizenötödik napon sem volt szignifikánsan eltérő változás (35,1 ±3,6 és 43,7±6,5 pg/ml).

700

Szérum IL-8 szintje (pg/ml)

600 500

Ab IgG Tumor

400 300 200 100 0 5 nap

10 nap tumor injectio után

15 nap

7. ábra : A szérum IL-8 szintje nude egerekben a tumor injectálást követően IL-8 ellenes antitest kezelés mellett és nélkül: Az eredmények pg/ml-ben, csoportonként és 6-6 kísérleti állatot jelentenek. Az IL-8 szint 5, 10 és 15 napos időpontokban szignifikánsan magasabb volt a nem kezelt és a kontrol antitestnél (p£0,0001), mint a specifikus antitesttel kezelt állatcsoportban.

23

A specifikus IL-8 ellenes antitest kezelés hatása a tumor növekedésére Ahogy a 8. ábrán is látható, a specifikus IL-8 ellenes antitest kezelés csökkentette a tumor növekedését. A tumor súlya másfélszer nagyobb volt a nem kezelt és a nem specifikus antitesttel kezelt állatokban, szemben a specifikus IL-8 ellenes antitesttel kezelttel szemben a 15 nap alatt. (P≤0,007). Mindhárom csoportban a tumor massza súlya szignifikánsan (p≤0,0001) emelkedett az ötödik naptól. (IL-8 antitest: 120,7±23,0 mg, kontrol nem specifikus antitest: 215 ±15,4 mg, és a nem kezelt csoport: 249 ±22,8 mg) a tizedik napig: (315±28,4 mg, 431±23,2 mg,433±28,6 mg). A tíz és tizenötödik nap közötti eredményekben nem volt szignifikáns eltérés, habár folyamatos emelkedést találtunk.

600

A tumor mérete (mg)

550

Ab

500

IgG

450

Tumor

400 350 300 250 200 150 100 5 nap

10 nap

15 nap

Tumor injectálása után 8. ábra: A malignus mesothelioma injectált egerek tumor méretének változása specifikus IL-8 antitest kezelést követően: Az eredmények csoportonként és időpontonként 6-6 kísérleti állatot jelentenek. A tumor méret növekedése szignifikánsan alacsonyabb speciális IL-8 antitesttel kezelt csoportban (p<0,0001) 5, 10 és 15 nappal az inokulációt követően a nem vagy a kontrol antitesttel kezelt csoportokhoz viszonyítva.

24

Az állatok súlyának változása A kísérleti állatok testsúlya (9. ábra) folyamatosan csökkent mindhárom csoportban a 15 napos kísérlet alatt. Kezdeti testsúlyértékek közel azonosak voltak, azonban a specifikus IL-8 ellenes antitesttel kezelt csoportban jóval kisebb súlycsökkenést találtunk. Az állatok súlya a 15. napon mérve 14,6±0,8 g volt a tumoros, 16,0±0,7 g az aspecifikus IgG kezelésben részesült illetve 20,0±0,8 a specifikus IL-8 antitesttel kezelt csoportban.

29 27 Ab IgG Tumor

Egerek súlya (g)

25 23 21 19 17 15 13 1 nap

5 nap

10 nap

15 nap

tumor injectio után 9. ábra: A malignus mesothelioma injectált egerek testsulyának változása a specifikus IL-8 antitest kezelés mellett: Az eredmények csoportonként és időpontonként 6-6 kisérleti állatot jelentenek. A testsulycsökkenés jóval intensivebb volt a nem kezelt és a kontrol antitesttel kezelt csoportban (P £0,05), mint a speciális IL-8 antitesttel kezelt csoportban.

25

A tumor súlyának és a pleurális folyadék IL-8 tartalmának összefüggése Bivariális lineáris regressziós modellt (10. ábra) használva szignifikáns, direkt korrelációt találtunk az IL-8 értékek és a tumor súlya között. (p≤0,0001, r=0,88, r=0,77). 700 600

Tumor Súlya (g)

500 400 300 200 Regression 95% confid.

100 0 -1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Pleurális Folyadék IL-8 (pg/ml)

10. ábra: A pleurális folyadák IL-8 tartalmának és a tumor sulyának korrelációja nude egérmodellben: Szignifikáns és direkt korreláciot találtunk a két érték között. (P £0,0001, r=0,88 r=0,77

26

Immunhystokémia Ahhoz, hogy az IL-8 jelenlétét ki tudjuk mutatni a tumorsejtekből, a tumor metszeteket fixáltuk,

hogy

a

heterogén

mesothelioma

tumor

sejtek

által

termelt

cytokint

immunhisztokémiai módszerrel is igazoljuk (11. ábra).

11. ábra. Az IL-8 immunhisztokémiai kimutatása malignus mesothelioma sejtekből- A: normál rekesz (100x) B: Normál rekesz IL-8 antitesttel kezelve (100x) C: malignus mesothelioma sejt (100x) D, E, F: Malignus mesothelioma specifikus IL-8 antitesttel kezelve (40x ,60x, 100x). G, H: A malignus mesothelioma infiltrált parietális pleura specifikus IL-8 antitesttel kezelve (60x, 100x)

27

Megbeszélés Eredményeink demonstrálják, hogy malignus pleurális mesothelioma következtében jelentkező pleurális folyadék IL-8 tartalma szignifikánsan magasabb a szívelégtelenség talaján kialakulthoz képest. Ezen emelkedett IL-8 szint forrásaként a mesothelioma sejteket igazoltuk, amennyiben mindhárom mesothelioma sejtvonal termelt detektálható mennyiségű IL-8-at., A mesothel sejteknél ez nem volt kimutatható sem enzim assay-vel, sem immunokémiai módszerekkel. Érdekes az, hogy a CRL-2081-es sejtvonal, amelyik nagyságrenddel (ng/ml vs. pg/ml) több IL-8 at termelt sokkal agresszívebbnek bizonyult a sejtszaporodás tekintetében ill. transzplantált állatmodel esetében (46,47) (az értekezésben nem mutatott adatok). A CRL-5915 alacsonyabb, míg a CRL-5820 a detektálhatóság alsó küszöbét érintve termelte a kemokint. A daganatsejtek növekedési potenciálját IL-8 ill. IL-8 ellenes antitest kezelés mellett, a sejtekbe épített [3H] thymidine inkorporáció és direkt sejtszámlálással vizsgálva a legerősebb agressziót mutató CRL-2081 sejtvonalat találtuk leginkább érzékenynek a külsőleg adagolt IL-8-ra, szemben a mesothel sejtekkel és a CRL5820-as sejtvonallal, ahol nem tudtunk kimutatni semmilyen változást. Hasonló eredményeket detektáltunk az IL-8 ellenes antitest kezelést követően, míg itt a CRL-5915-ös sejtvonal volt a legszenzitívebb a sejtfelülúszó IL-8 tartalmának hiányára. A mesothel ill. CRL-5820-as mesothelioma sejtek IL-8-val szembeni anergiája valószínűleg a sejtfelszíni kötőmolekulák hiányát jelzi, míg a másik két esetben ugyanezen molekulák különböző méretű expressziójával állhatunk szemben. Eredményeink bizonyítják, hogy a specifikus IL-8 antitest kezeléssel effektíven csökkenteni lehet a daganat növekedését a mesotheliomával injectált nude egerekben szemben az antitesttel nem kezelt és a kontroll IgG csoporttal. Munkánkban egy új mesothelioma állat modellt hoztunk létre, amelyben CRL-2081-es mesothelioma sejtek intrapleurális injectálása után 96,7%-os valószínűséggel fejlődött ki daganat. Állatmodellünk előnye az előző subcutan injectált és azbeszt indukálta daganat modellhez képest, hogy egyrészt mivel intrapleurálisan injectáltuk a mesothelioma sejteket, közelebb áll a valóságos humán viszonyokhoz, mint az eddigiek, másrészt sokkal gyorsabb a daganat kifejlődése.(52,53). A subcután és a transzplantált szövetek esetén a mikrokörnyezet teljesen más, mint a pleurában, a biológiai háttér, a metasztatizáló hajlam, valószínűleg a tumor fejlődése és a terápiára való hajlama is eltérő.(50). Modellünkben humán tumor sejtekkel dolgoztunk és a daganat kifejlődése sokkal

28

gyorsabb volt, mintha inhalációban illetve intrapleurálisan azbeszttel fertőztük volna a kísérleti állatokat.(49). Habár a thymus irtott egerek, amiket a kísérlethez használtunk, szintén kicsit eltérő mikrokörnyezetet jelentettek összehasonlítva a humán viszonyokhoz, de mégis a többi kísérlethez képest ez hasonlított leginkább a humán viszonyokhoz. Munkánk talán legfontosabb újdonsága, hogy a specifikus IL-8 ellenes antitestkezelés csökkentette mind a pleurális folyadék, mind a szérum IL-8 szintjét. Az IL-8 szint csökkenésével párhuzamosan a tumor progresszió is csökkent. IL-8 antitesttel kezelt állatokban a tumor növekedése jelentősen alatta maradt illetve az állatok testsúlya kevésbé csökkent a kontrol csoportokhoz képest. Direkt korrelációt mutattunk ki a pleurális folyadék IL-8 szintje és a tumor massza súlya között. Hasonló, bár a mi közleményeinket követően megjelent, eredményeket publikáltak más kutatók néhány egyéb daganattípusban. Eredményeinkkel teljesen egybevágóakat közöltek le két évvel később ovárium carcinomában (54). In vitro környezetben szintén eltérő IL-8 szinteket termeltek a különböző ovárium carcinoma sejttenyészetek. Volt magas és alacsony IL-8-at termelő daganat sejttípus. Az alacsony IL-8-at termelő sejteket ugyanazzal a dózisú rekombináns IL-8-al kezelték, mint mi a mesothelioma sejteket, (50 ng/ml) és szignifikánsan emelte a proliferációt, míg szintén a mesothelioma kísérletünkben használt 10 µg/ml dózisú IL-8

antitesttel kezelve a ovárium carcinoma sejttenyészetet szignifikánsan csökkent a

proliferációs aktivítás mind az alacsony, mind a magas IL-8-at termelő daganatsejtekben. Megállapították, hogy az IL-8-nak ovárium carcinomában direkt és indirekt növekedést potenciáló hatása van. E kísérletsorozat teljesen hasonló a mi eredményeinkhez, csak ovárium carcinómában találtak hasonlót, mint mi malignus mesotheliomában. Nem kissejtes tüdőrákban (NSCLC) az IL-8 in vitro és in vivo egyaránt angiogenetikus faktornak bizonyult. A tumorban kimutatott magas IL-8 szint szoros korrelációt mutatott az előrehaladott stádiummal, a távoli nyirokcsomó metasztázisok megjelenésével és a magas érsűrűséggel, a rövid túléléssel és a korai relapszussal (55). Pancreas adenocarcinoma (56) sejttenyészetben a különböző sejttípusok 67%-a folyamatosan magas IL-8 szintet termel. Promóter analízist végeztek, így az IL-8 promoter aktivitásért a 85-133 bp régió a felelős. Pontmutációval igazolták, hogy az NF kappa B, AP-1 vagy az NF-IL-6 kötőhely pontmutációja szignifikánsan csökkenti a magas IL-8 szintet.

29

Hólyagcarcinomában (57) a VEGF és bFGF mellett szintén az IL-8-at találták a legintenzívebb angiogenetikus faktornak. Endometriósisban (58) a peritoneális folyadékból vett mintából vizsgálták az angiogenesist, az érsűrűség összefüggését nézték a TNF alfa, IL-8, és IL-1 béta szintekkel. Ebben az esetben az IL-8 és az IL-1 béta nem befolyásolta az angiogenetikus választ, viszont a TNF alfa szintje korrelált az érsűrűség változással. Hepatocelluláris

carcinomában

(59)

in

vitro

sejttenyészetben

és

in

vivo

szövetmintákban egyaránt emelkedett IL-8 szinteket igazoltak és angiogenetikus faktornak bizonyult ez a kemokin a daganatban. Kiemelkedően magas IL-8 szint esetében a magas cytokin szint szignifikánsan nagyobb frekvenciát jelentett a v. portae, v. hepatica és a ductus choleductus metasztázisra. In vitro az IL-8 szintet az IL-1 beta és a TNF alfa kezelés emelte jelentősen. Malignus melanomában (60), mint már tárgyaltuk előzőleg direkt növekedési faktor az IL-8. 125 beteg szérumát vizsgálva és a VEGF, IL-8 és bFGF szinteket nézve kezelt és nem kezelt különböző stádiumú betegek esetében azt igazolták, hogy az emelkedett angiogenetikus faktorok szérum szintje szoros korrelációt mutat a szerény általános túlélési eredményekkel és a progresszió nélküli túléléssel. Egy -az értekezésben nem szereplő- vizsgálatunkban (66) érdekes megfigyelést tettünk, mely kapcsolódási pontot jelenthet a jelen értekezés megállapításaihoz. Kimutattuk, hogy a pleuralemezek szimfizisének létrehozására (pleurodesis) leghatásosabbnak bizonyult anyag, a talcum (62) jelentősen megnöveli a programozott sejthalált (apoptosis) in vitro körülmények között. Legérzékenyebben az a sejtvonal (CRL-2081) reagált apoptosis növekedésével, amely a legagresszívebb és egyben vizsgálataink szerint az IL-8-at legerősebben termelő daganattípusnak bizonyult (46), mely utóbbi az 5. ábrából is kitűnik. Ugyanakkor a mesotheliális sejtek életképességét a talcum alig változtatta meg (66), melyek IL-8 termelő képessége a daganat sejtekéhez képest elhanyagolható. Felvetődik tehát a kérdés, hogy vajon a talcum okozta apoptosis fokozódás nem a talcum által esetlegesen okozott IL-8 szint csökkenéssel áll-e összefüggésben. Ez a feltételezés még bizonyításra vár. Ugyanakkor meg kell jegyezni azt is, hogy a pleurodesisben használatos néhány cytostatikumról, igy a doxorubicinról (63) a cisplatinról és a

30

cyclophosphamidról (64, 65) is kimutatták, hogy jelentősen növelik a malignus mesothelioma sejtek apoptosisát. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a talcummal végzett pleurodesis is nemcsak mint palliatív megoldás jöhet szóba malignus mesothelioma esetében, de a tumorsejt apoptosisának fokozása révén a daganat kezelésére is javasolható.

Konklúzió Az előzőekben vázolt munkáinkban elsőként igazoltuk, hogy a malignus mesotheliomák (legalábbis egyes alcsoportjai) által termelt IL-8 fontos növekedést irányító faktor. Ennek megfelelően a mesothelioma progressziója korrelál az autocrin IL-8 produkcióval. Felhasználva ismereteinket igazoltuk, hogy a speciális IL-8 antitest kezelés csökkentette a humán malignus mesothelioma progresszióját. S bár a folyamatban részt vevő receptorok pontos analizálása még megoldásra vár, munkánk fontos mérföldkövet jelenthet a malignus mesothelioma gyógyításában. Az értekezésben célul tűzött vizsgálatokkal nyert új eredmények, megállapítások és gyakorlati hasznuk 1.- Human mesothelioma sejtek intrapleurális inokulálásával a korábbi subcutan inokulátiós modellhez képest egy új mesothelioma állatkísérletes modellt hoztunk létre. 2.- Igazoltuk, hogy a malignus mesotheliomákban az IL-8 termelés fokozott. 3.- Malignus mesotheliomákban (legalábbis egyes alcsoportjaiban) az IL-8 a daganat növekedés fontos faktora. A mesothelioma növekedése szoros pozitív korrelációt mutat a pleurális folyadék és a szérum IL-8 szintjével. 4.- IL-8 antitest kezelés csökkentette a human malignus mesothelioma progresszióját. 5.- A talcum nemcsak mint palliatív megoldás jöhet szóba a malignus mesothelioma esetében, hanem apoptósis fokozása révén a daganat kezelésére is javasolható. Vizsgálati eredményeink a gyakorlati hasznosíthatóságot illetően reményt adnak arra, hogy az interleukin-8 termelésének illetve szintjének csökkentésével a human malignus mesothelioma progressziója jelentősen mérsékelhető lesz és javíthatja a betegek túlélési esélyét, valamint életminőségét.

31

Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Magyar Pál Professzor Úrnak, aki megengedte, hogy éljek a külföldi ösztöndíj lehetőségemmel, biztatott a disszertáció megírására és témavezetőként hasznos tanácsokkal látott el a dolgozat írásakor. Hálásan köszönöm dr. Abonyi Margit docens asszonynak (Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászati klinika), hogy felhívta a figyelmemet a magyar-amerikai ösztöndíj lehetőségre, támogatott, biztatott a megpályázásra és kintlétem alatt mindvégig segített a felmerülő problémákban. Köszönetet szeretnék mondani Prof. dr. Veena B. Antonynak, (Indianapolis, USA) aki lehetőséget adott számomra, hogy kutatólaboratóriumában dolgozhassak és megtervezhessem e kísérletsorozatot, és támogatta a kutatást. Köszönettel tartozom az Indianapolisi kutatólaboratóriumban volt kollegáimnak, akik megtanítottak a kísérleti metodikákra, és jó tanácsaikkal segítettek e munka elkészítésében. Hálásan köszönöm Prof. dr. George Sarosinak (Indianapolis, USA), hogy lehetővé tette számomra hogy megismerhessem Prof. Antonyt, és a Veteran Kórházban kutathassak. Köszönöm biztatását, baráti segítségét, amire bizony időnként nagy szükség volt távol az otthonomtól. Végül de nem utolsósorban köszönöm családomnak, gyermekeimnek, hogy elviselték, hogy amíg a dolgozat el nem készült, kevés időm jutott rájuk, férjemnek, aki segítségével mindig ott állt mellettem, amikor kellett a családban és a dolgozat elkészítésében egyaránt.

32

Értekezés témájában megjelent közlemények I. G. Galffy, KA. Mohammed, N. Nasreen, MJ. Ward, VB Antony: Inhibition of interleukin-8 reduces human malignant pleural mesothelioma propagation in nude mouse model. Oncology Research 1999;11:187-94. II. G. Galffy, KA. Mohammed, PA. Dowling, N. Nasreen, MJ. Ward, VB. Antony: Interleukin-8, an autocrine growth factor for malignant mesothelioma. Cancer Research. 1999;59:367-371. III. Gálffy G., Mohammed KA., Dowling PA., Ward MJ., Antony VB: Interleukin-8, mint direkt növekedési faktor malignus mesotheliomában. Medicina Thoracalis, 1999;52:13-19. IV. N. Nasreen, KA. Mohammed, PA. Dowling, MJ. Ward, G. Galffy, VB. Antony: Talc induces apoptosis in human malignant mesothelioma cells in vitro. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2000;161:595-600. Tézisekhez kapcsolódó előadáskivonatok V. Gálffy G: Az interleukin-8 szerepe a malignus mesothelioma progressziójában, Fiatal Immunológusok II. Foruma, Budapest, szept. 28. VI. G.Galffy, Mohammed KA, Nasreen N, Antony VB, Lantos A, Magyar P: The effect of interleukin-8 in malignant mesothelioma propagation in vivo. Finno-Ugric Conference on Pulmonology, Parnu, Estonia, maj. 24-26, 2000. VII. Gálffy G, Antony VB, Magyar P.: Az interleukin-8 ellenes antitest kezelés és a malignus mesothelioma progresszió kapcsolata nude egér modellben Magyar Tüdőgyógyász Társaság 51. Nagygyűlése Ápr. 12-15, Budapest. VIII. G. Gálffy, KA. Mohammed, N. Nasreen, MJ. Ward, VB. Antony: Inhibition of interleukin8 reduces human malignant pleural mesothelioma propagation in nude mouse model. The European Respiratory Journal. 1999;14:137-138S. IX. G. Gálffy, KA. Mohammed, PA. Dowling, N.Nasreen, MJ. Ward, VB.Antony: The potential role of interleukin-8 in human malignant mesothelioma progression. Lung Cancer 1999;25:S25.

33

X. Gálffy G: A malignus pleurális mesothelioma propagációjának gátlása IL-8 ellenes antitest kezeléssel nude egér modellben. (Tüdőgyógyászati Allergológiai és Immunológia Megbetegedések Konferenciája, TAIM, 1999. aug. Debrecen. XI. Gálffy G, Mohammed KA, Antony VB,: Interleukin-8, mint direct növekedési factor malignus

mesotheliomában

Magyar

Tüdőgyógyász

Társaság

50.

Nagygyűlése,

Balatonfüred, 1998. okt.1-3. Medicina Thoracalis , Suppl. 1998. 51:S18. XII. G. Gálffy, MJ. Ward, PA. Dowling, KA. Mohammed, N. Nasreen, VB. Antony: Interleukin-8, an autocrine growth factor for malignant mesothelioma. Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157;A740. XIII. Nasreen, KA. Mohammed, MJ. Ward, PA. Dowling, G. Gálffy, VB. Antony: Talc induces apoptosis in human malignant mesothelioma cells in vitro. Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157:A63.

Megjelent közlemények: Folyóiratok: 1.

G. Galffy, KA. Mohammed, N. Nasreen, MJ. Ward, VB. Inhibition of interleukin-8 reduces human malignant pleural mesothelioma propagation in nude mouse model.

Oncology

Research 1999;11(4):187-94. 2.

G. Galffy, KA. Mohammed, PA. Dowling, N. Nasreen, MJ. Ward, VB. Antony: Interleukin8, an autocrine growth factor for malignant mesothelioma. Cancer Research. 1999, 59:367371.

3.

Gálffy G., Mohammed KA., Dowling PA., Ward MJ., Antony VB.: Interleukin-8, mint direkt növekedési faktor malignus mesotheliomában. Medicina Thoracalis, 1999,52(1):1319.

4.

Gálffy G., Márk Zs., Hutás I.: Inhalációs allergének elõfordulásának gyakorisága Magyarországon 1990 és 94-es évet összehasonlítva. Medicina Thoracalis, 1996., 49(4):169-175.

5.

Gálffy G., Márk Zs., Hutás I.: Az inhalácios allergének elõfordulása Magyarországon. Tisztiorvos, 1995, II/4:16-18

34

6.

Gálffy G.: Újabb eredmények az asthma immunológiai hátterének értékelésében (folyóirat referáló) Medicina Thoracális 2001;54:191-192.

7.

Márk Zs., Galffy G., Zolnai E., Hutás I.: Asthma bronchiale és rhinoconjunctivitis allergica elõfordulási gyakorisága serdülõkben. Medicina Thoracalis, 1997, 50(2):61-64.

8.

Székely L., Bikk A., Gálffy G.: Akut légúti fertõzések megelõzése egészséges fiatal felnõtt közösségben orális immunmoduláns preventív alkalmazásával.

Orvosi Hetilap.-1997,

138(43):2743-6. 9.

N. Nasreen, KA. Mohammed, PA. Dowling, MJ. Ward, G. Galffy, VB. Antony: Talc induces apoptosis in human malignant mesothelioma cells in vitro. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2000, 161(2):595-600.

10. N. Nasreen, KA. Mohammed, G. Galffy, MJ. Ward, and VB. Antony: MCP-1 in pleural injury: CCR2 mediates haptotaxis of pleural mesothelial cells. Am.J.Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000. Mar:278(3):L 591-8. 11. Orosz M. Gálffy G.: Allergiás felső légúti és tüdőbetegségek Granum 2000/1: 1-5. 12. Gálffy G, Tarján E,:Alsó légúti infekciók Családorvosi Fórum 2000. December 16-22. Könyvfejezet: Petrányi Gy: Klinikai Immunológia: Medicina, Budapest, 2000. Márk Zs. Gálffy G. Pneumoconiosisok. 627-634 Abstract-ok: 1.

Gálffy G, Orosz M, Kereki E, Magyar P: : A gyulladásos mediátorok szerepe az asthma bronchiale terápiájában Magyar Tüdőgyógyász Társaság és a Magyar Kardiologusok Társasága Kardiopulmonális Szekciójának Tudományos Ülése, Sopron, 2000. nov. 24-25. Abstract book.

2.

G. Galffy, M.Orosz, A. Lantos, L. Tamasi, VB.Antony, P.Magyar: The role of interleukin10 in regulation of neutrophil infiltration in malignant mesothelioma Semmelweis Symposium, Oncology 2000, Budapest, nov. 9-10, 2000. Abstract book, L:74.

35

3.

G.Galffy, M,Orosz, E.Kereki, P. Magyar: Changes of pro- and anti—inflammatory cytokines during exacerbation of bronchial asthma ( CHEST. Oct.22-26, 2000, San Francisco, California, USA) Chest, Suppl. Vol. 118/4, 107S, Oct, 2000.

4.

M.Orosz, G.Galffy, E.Kerei, P. Magyar: Complex changes of interferon gamma and rantes levels in bronchial asthma and allergic rhinitis (CHEST. Oct.22-26, 2000, San Francisco, California, USA) Chest, Suppl. Vol. 118/4, 107S, Oct, 2000.

5.

Gálffy G: Az interleukin-8 szerepe a malignus mesothelioma progressziójában, Fiatal Immunológusok II. Foruma, Budapest, szept. 28.

6.

G Galffy, M. Orosz, Erzsebet Kereki, Pal Magyar: Complex changes of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in different states of bronchial asthma (World Congress on Lung health, ERS, -Florence, Italy, Aug.30-Sept.03, 2000), The European Respiratory Journal Vol 16. Suppl.31, Aug. 2000. 161S

7.

M. Orosz G Galffy, M. Orosz, Erzsebet Kereki, Pal Magyar: Rantes level-as it is –during different sstates of bronchial asthma and allergic rhinitis (World Congress on Lung health, ERS, -Florence, Italy, Aug.30-Sept.03, 2000), The European Respiratory Journal Vol 16. Suppl.31, Aug. 2000. 364S

8.

G Galffy, M. Orosz, Erzsebet Kereki, Pal Magyar: The role of interleukin-5 and interleukin12 in exacerbation of bronchial asthma (EAACI. Jul 1-5, 2000, Lisabon, Portugália) Allergy, Suppl 63 Vol 55:244, 2000

9.

M. Orosz, G Galffy, Erzsebet Kereki, Pal Magyar: The Changes of Rantes and Interferon-γ Levels in Response to Steroid Treatment in Bronchial Asthma (EAACI. Jul 1-5 2000, Allergy, Suppl 63 Vol 55:250, 2000)

10. G.Galffy, Mohammed KA, Nasreen N, Antony VB, Lantos A, Magyar P: The effect of interleukin-8 in malignant mesothelioma propagation in vivo. Finno-Ugric Conference on Pulmonology, Parnu, Estonia, maj. 24-26, 2000. 11. OroszM, Galffy G, Kereki E, Magyar P: Changes of anti-inflammatory cytokines in different states of bronchial asthma Finno-Ugric Conference on Pulmonology, Parnu, Estonia, maj. 24-26, 2000.

36

12. Gálffy G, Orosz M, Kereki E, Magyar P: A gyulladásos markerek szerepe az asthma bronchiale therápiájában MAKIT XXVIII. Kongresszus május 17-19, 2000. Balatonfüred. Allergologiai és Klinikai Immunologia III/2. május, 2000. 3:37. 13. Orosz M, Gálffy G Kereki E, Magyar P: A RANTES változásai asthma bronchiale akut exacerbációjában illetve szteroid therápia mellett MAKIT XXVIII. Kongresszus május 1719, 2000. Balatonfüred. Allergologiai és Klinikai Immunologia III/2. május, 2000. 3:43. 14. G. Gálffy, M. Orosz, A Lantos, L. Tamási, VB.Antony, P. Magyar: The role of Interleukin10 in regulation of neutrophil infiltration in malignant mesothelioma. (IUATLD. Budapest Ápr 12-15, 2000, Abstract book 15. Gálffy G, Antony VB, Magyar P.: Az interleukin-8 ellenes antitest kezelés és a malignus mesothelioma progresszió kapcsolata nude egér modellben Magyar Tüdőgyógyász Társaság 51. Nagygyűlése Ápr. 12-15, Budapest. 16. Lantos Á, Kerényi T, Várnai Zs, Márczi V, Muraközy G, Gálffy G, Nagy A, Kiss A, Somoskövi Á: A talcum suspensiós pleurodesis szövődményei Magyar Tüdőgyógyász Társaság 51. Nagygyűlése Ápr. 12-15, Budapest. 17. Gálffy G: Ködmön Cs: Mycobaktérium Avium Complex betegség megjelenése immunkompetens betegnél Fiatal Pulmonológusok Kazuisztikai Fóruma, 1999. dec. 18. G. Gálffy, KA. Mohammed, N.Nasreen, MJ. Ward, VB.Antony: Inhibition of interleukin-8 reduces human malignant pleural mesothelioma propagation in nude mouse model. (ERS Annual Congress, Oct.9-13, 1999, Madrid, Spain;) The European Respiratory Journal. Vo. 14, Suppl.30, Oct 1999. 137-138S 19. G. Gálffy, KA. Mohammed, PA. Dowling, N.Nasreen, MJ. Ward, VB.Antony:

The

potential role of interleukin-8 in human malignant mesothelioma progression (VI. Central European Lung Cancer Conference, Budapest, Hungary, Sept. 1-4, 1999) Lung Cancer Suppl.1, Vol. 25. Sept. 1999.S25. 20. Zs. Márk, I. Hutás, G. Gálffy. Treatment of non small cell lung cancer with paclitaxel (Taxol) in our clinical practice (VI. Central European Lung Cancer Coference, Budapest, Hungary, Sept. 1-4, 1999) Lung Cancer Suppl.1, Vol.25. Sept. 1999.S17.

37

21. Gálffy G: A malignus pleurális mesothelioma propagációjának gátlása IL-8 ellenes antitest kezeléssel nude egér modellben ( Tüdőgyógyászati Allergológiai és Immunológia Megbetegedések Konferenciája, TAIM, 1999. aug. Debrecen. 22. Márk Zs., Gálffy G., Hutás I.: Az inhalációs allergénel előfordulásának gyakorisága beteganyagunkban 1990, 94 és 98-as év összehasonlítása. (A Magyar Tüdőgyógyász Társaság Epidemiológiai, Allergológiai és Légzéspathológiai Szekció Tudományos Ülése, Mátészalka, 1999) Abstract book 23. Gálffy G, Mohammed KA, Antony VB,: Interleukin-8, mint direct növekedési factor malignus

mesotheliomában

Magyar

Tüdőgyógyász

Társaság

50.

Nagygyűlése

,

Balatonfüred, 1998. okt.1-3. Medicina Thoracalis , Suppl. 1998. 51:S18. 24. Márk Zs., Gálffy G.: Boeck sarcoidósis, tények és kétségek. (Magyar Tüdõgyógyász Társaság 50. Nagygyûlése, Balatonfüred, 1998.) Medicina Thoracalis, Suppl. 1998. 51:S77. 25. G. Gálffy, MJ. Ward, PA. Dowling, KA. Mohammed, N.Nasreen, VB.Antony: Interleukin8, an autocrine growth factor for malignant mesothelioma.

(Am. Thoracic Society -

Chicago, IL, Apr. 1998) Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157(3), A740. 26. PA. Dowling, MJ. Ward, G. Gálffy, KA. Mohammed, N.Nasreen, VB. Antony: Mesothelial cells secrete factors that inhibit neutrophil apoptosis. (Am. Thoracic Society - Chicago, IL, Apr. 1998) Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157(3), A740. 27. SJ. McGrath, PA. Dowling, MJ. Ward, G. Gálffy, KA. Mohammed, N. Nasreen, BV. Antony: Mesothelial cell polarity and neotrophil migration onto the pleural space. (Am. Thoracic Society - Chicago, IL, Apr. 1998) Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157(3), A740. 28. KA. Mohammed, N. Nasreen, MJ. Ward, PA. Dowling, G. Gálffy, VB. Antony: MCP-1 expression in mice tuberculous pleurisy is CD4± T-cell dependent: IFN dictates pleural MCP-1 expression. (Am. Thoracic Society - Chicago, IL, Apr. 1998) Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157(3), A741. 29. Nasreen, KA. Mohammed, MJ. Ward, PA. Dowling, G. Gálffy, VB. Antony: Talc induces apoptosis in human malignant mesothelioma cells in vitro.

(Am. Thoracic Society -

Chicago, IL, Apr. 1998) Am. J. Respiratory and Critical Care Medicine, 1998;157(3), A63.

38

30. M. Abonyi, G. Gálffy, Z. Bori, P. Nagy, M. Horányi: Hepatitis C and G virus infections and peripheral cytokines profile in patients with alcohile liver disease in Hungary: Folia Hepatologica, 1998. Vol. 3. Suppl. 1:17. 31. M. Abonyi, G. Gálffy: Enzyme expressions in hepatocellular tumors, thymidine phosphoryase and thymidylate synthase, predict tumor response to 5-fluorouracil. (33. Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver Lisbon, Portugal, April, 1998.) J. Hepatology, Suppl. 1998. 28(1):93. 32. Zs Márk, G. Galffy, E. Zolnay, A. Vámos, I. Hutás, E. Bártfay: Air pollution and bronchial asthma Second Central and East European Interasma Conf. Budapest, 1997. 33. Márk Zs, Gálffy G, Zolnay E, Vámos A, Hutás I, Bártfay E: Légszennyeződés és asthma bronchiale A Magyar Tüdőgyógyász

Társaság Epidemiológiai, Allergológiai és

Légzéspathológiai Szekció Tudományos Ülése, Sopron, 1997. okt.16-18. 34. PA. Dowling, G. Gálffy, MJ. Ward, SW. Goodbey, MA. Kamal, VB. Antony: Role of PH in pleural neutrophil survival: acidic extracellular PH reduces neutrophil. Apoptosis. (Am. Colleges of Chest Physician - New Orleans, LU, Oct. 1997) Chest, 1997;112(3):12S. 35. M Abonyi, G. Gálffy: Change of Signal transduction and differential activation of Tyrosine kinase in liver metastases of human colorectal carcinoma (32. Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver London, UK, April, 1997.) J. Hepatology , Suppl. 1997. 26(1):177. 36. Vámos A, Márk Zs, Gálffy G, Zolnay E, Hutás I, Bártfay E: A légszennyeződés hatása az asthmas betegek egészségi állapotára Környezeti Ártalmak VI. Konf. Hévíz, 1996. okt.2426. 37. Zs. Márk, G. Gálffy, E. Zolnai, A. Vamos, I. Hutás, E Bartfay: Air pollution and asthma bronchiale. (9th Alps-Adria Pannonia Congress of Pneumology, Oct. 3-5,1996, Bled, Slovenia; Abstract book, page 73.) 38. G. Gálffy, Zs. Márk, I. Hutás, P. Magyar: Prevalence of positive allergic skin test in patients with allergic respiratory diseases: Compared of 1990 with 1994. (ERS Annual Congress, Sept. 7-11, 1996, Stockholm, Sweden;) The European Respiratory Journal, Suppl. 1996. 9(23): 182S.

39

39. G. Gálffy, Zs. Márk, I. Hutás: Prevalence of positive allergic skin test in patients with allergic respiratory diseases: Compared of 1990 with 1994. (5th Semmelweis Scientific Conference. Sept. 2-6, 1996 Budapest); Medical Science Monitor ISSN 1234-1010, Suppl. 2(3):54. 40. Gálffy G., Tarján E., Márk Zs., Sápi Z.: Felnõttkori májcirrhosis homozigota alfa 1 antitripszin hiányos pulmonális emphysemaban. (A magyar Tüdõgyógyász Társaság 49. Nagygyülése, Balatonfüred,1996 május 9-12. ) Medicina Thoracalis, Suppl. 1996, 49:73. 41. Gálffy G., Márk Zs., Zolnai E., Hutás I.: Asthma bronchiale és rhinoconjunctivitis allergica elõfordulási gyakorisága serdülõkorban Magyarországon. (Magyar Tüdõgyógyász Társaság 49. Nagygyûlése, Balatonfüred, 1996.május 9-12)

Medicina Thoracalis, Suppl. 1996,

49:21. 42. Márk Zs., Gálffy G., Zolnai E., Vamos A,. Hutás I., Bartfay E.: A légszennyezõdés és az asthma bronchiale. (Magyar Tüdõgyógyász Társaság 49. Nagygyûlése, Balatonfüred, 1996.) Medicina Thoracalis, Suppl. 1996. 49:22. 43. Gálffy G, Márk Zs, Hutás I, Lipcsey A, Besznyák I,: Lambert-Eaton syndroma thymus carcinómában Magyar Tüdőgyógyász Társaság Onkológiai Kazuisztikai Fórum, Budapest, 1996. okt 01. 44. Gálffy G, Márk Zs, Hutás I, Magyar P: Inhalációs allergének előfordulásának gyakorisága Magyarországon MAKIT XXIII: kongresszusa, Budapest, 1995. okt. 12-14. Medicina Thoracalis Suppl. p:45. 45. G. Gálffy, Zs. Márk, I. Hutás: Prevalence of positive allergic skin test in patients with allergic respiratory diseases. (EMSA Int.Symp.May 5-7 1995, Madrid; Abstract book, 46. Gálffy G: Felnőttkori májcirrhosis homozigóta alfa –1 antitripszin hiányos pulmonális emphysemában Fiatal Pulmonológusok Kazuisztikai Fóruma, Budapest, 1995. Dec. 18. 47. P. Kempler, A. Váradi, A. Pap, A. Kádar, P. Vargha, Zs. Hermányi, V. Márczi, G. Gálffy, F. Szalai: Comparative evaluation of autonomic and peripheral sensory nerve function in primary biliary cirrhosis. Gastroenterologie 1993,XXXI/5. 48. P. Kempler, E. Kadár, A. Varádi, Zs. Hermányi, K. Keresztes, J. Petrik, V. Márczy, G. Gálffy, F. Szalai: Alkoholmissbrauch und chronische Leberkrankheiten verschlechtern die

40

autonome kardiale Neuropathie bei Type -II-Diabetikern. Diabetes und Stoffwechsel, 1993 2/Mai 148. 49. Kempler P, Gálffy G, Hermányi Zs, Pap A, Márczi V, Keresztes K: Az autonom és peripheries sensoros neuropathia primer biliáris cirrhosisban Semmelweis Tudományos Fórum, 1993. Budapest. 50.

Kempler P, Keresztes K, Gálffy G, Hermányi Zs, Pap A, Márczi V, A QT távolság megnyúlása autonom neuropathia következtében II-es típusú diabetes mellitusban Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1993.

Irodalomjegzék 1.

Eastwood EH, Marlin JP. A case of primary tumour of the pleura. Lancet 1921;i:172.

2.

Branscheid D, Krysa S, Bauer E, Bulzebruck H, Schirren J. Diagnostic and therapeutic strategy in malignant pleural mesothelioma. Eur. J .Cardio-Thorac. Surg. 1991;5:466 472.

3.

Pisani, RJ, Colby TV, Williams DE. Malignant mesothelioma of the pleura. Mayo Clinic. Proceed. 1988;63:1234-44.

4.

Connelly RR, Spirtas R, Myers MH, Percy CL, Fraumeni JF. Demographic patterns for mesothelioma in the United States. J. Natl. Cancer Inst. 1987;78:1053-60.

5.

Iwatsubo Y, Pairan JC, Archambault de Beaune C, Chainmings S, Bignon J, Brochard P. Pleural mesothelioma: a descriptive analysis based an a case-control study and mortality data in Ile de France 1987—I 990). Am J Ind Med 1994;26:77-88.

6.

Spirtas R, Beebe GW, Connelly RR, et al. Recent trends in mesothelioma incidence in United States. Am J Ind Med 1986:9:397—407.

7.

Armstrong BK, Musk AW, Baker JE, et al. Epidemiology of malignant mesothelioma in Western Australia. Med J Aust 1984;141:86—8.

8.

Wagner JC. Diffuse pleural mesotheliorna arid asbestos exposure in the North-West Cape Province. Br J Ind Med 1960;17:260—71.

9.

Walker AM, Loughlin JE, Friedlander ER, Rothman KJ, Dreyer NA. Projections of asbestos-related disease 1980—2009. .J Occup Med 1983;25:409—25.

41

10. McDonald AD, McDonald JC. Epidemiology of malignant mesothelioma. In: Antman K. Aisner I, eds. Asbetos-related Malignancy. Orlando. Grime and Stratton. 1987:pp:31—55. 11. Magyar P, Hutás I, Vastag E. Pulmonológia, Medicina, 1998. 12. Hasleton PS. Spencer’s Pathology of the Lung, McGraw-Hill, 1996. 13.

Light RW. Pleural Diseases, William and Wilkins, 1995.

14. Rusch VW, Rosenzweig K, Venkatraman E, Leon L, Raben A, Harrison L, Bains MS, Downey RJ, Ginsberg RJ.A phase II trial of surgical resection and adjuvant high-dose hemithoracic radiation for malignant pleural mesothelioma. J Thorac Cardiovasc Surg. 2001;122:788-95. 15. Melloni G, Puglisi A, Ferraroli GM, Carretta A, Ceresoli G, Calori G, Zannini P. Treatment of malignant pleural mesothelioma. Minerva Chir. 2001;56:243-50. 16. Sugarbaker DJ, Norberto JJ, Swanson SJ. Extrapleural pneumonectomy in the setting of multimodality therapy for diffuse malignant pleural mesothelioma. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 1997;9:373-82. 17. Sterman DH, Kaiser LR, Albelda SM. Advances in the treatment of malignant pleural mesothelioma. Chest. 1999;116:504-20. 18.

Boutin C, Schlesser M, Frenay C, Astoul P. Malignant pleural mesothelioma. Eur Respir J. 1998;12:972-81.

19. Ho L, Sugarbaker DJ, Skarin AT. Malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Res. 2001;105:327-73. 20.

Astoul P, Picat-Joossen D, Viallat JR, Boutin C. Intrapleural administration of interleukin-2 for the treatment of patients with malignant pleural mesothelioma: a Phase II study. Cancer. 1998;83:2099-104.

21.

Mulatero CW, Penson RT, Papamichael D, Gower NH, Evans M, Rudd RM. A phase II study of combined intravenous and subcutaneous interleukin-2 in malignant pleural mesothelioma. Lung Cancer. 2001;31:67-72.

22.

Castagneto B, Zai S, Mutti L, Lazzaro A, Ridolfi R, Piccolini E, Ardizzoni A, Fumagalli L, Valsuani G, Botta M.Palliative and therapeutic activity of IL-2 immunotherapy in

42

unresectable malignant pleural mesothelioma with pleural effusion: Results of a phase II study on 31 consecutive patients. Lung Cancer. 2001;31:303-10. 23.

Astoul P. Pleural mesothelioma. Curr Opin Pulm Med. 1999;5:259-68.

24. Treat J, Kaiser LR, Sterman DH, Litzky L, Davis A, Wilson JM, Albelda SM. Treatment of advanced mesothelioma with the recombinant adenovirus H5.010RSVTK: a phase 1 trial (BB-IND 6274). Hum Gene Ther. 1996;7:2047-57. 25. Caminschi I, Venetsanakos E, Leong CC, Garlepp MJ, Scott B, Robinson BW. Interleukin12 induces an effective antitumor response in malignant mesothelioma. American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 1988;19:738-46. 26.

Mu J, Zou JP, Yamamoto N, Tsutsui T, Tai XG, Kobayashi M, Herrmann S, Fujiwara H, Hamaoka T. Administration of recombinant interleukin 12 prevents outgrowth of tumor cells metastasizing spontaneously to lung and lymph nodes. Cancer Research. 1995,55:4404-8.

27. Caminschi I, Venetsanakos E, Leong CC, Garlepp MJ, Robinson BW, Scott B. Cytokine gene therapy of mesothelioma. Immune and antitumor effects of transfected interleukin-12. Am J Respir Cell Mol Biol. 1999 Sep;21(3):347-56.28, 28.

O'Brien ME, Saini A, Smith IE, Webb A, Gregory K, Mendes R, Ryan C, Priest K, Bromelow KV, Palmer RD, Tuckwell N, Kennard DA, Souberbielle BE. A randomized phase II study of SRL172 (Mycobacterium vaccae) combined with chemotherapy in patients with advanced inoperable non-small-cell lung cancer and mesothelioma. Br J Cancer 2000;83:853-7

29. Hayashi S, Kurdowska A, Cohen AB, etal. A synthetic peptide inhibitor for alphachemokines inhibits the growth of melanoma cell lines. J Clin. Invest. 1997;99:2581-7. 30. Forster E, Kirbauer R, Urbanski A, Kock A, Luger TA, Schwarz T. Human melanoma cells produce Interleukin-8, which functions as an autocrine growth factor. Arch. Dermatol. Res. 1991;283:26. 31. Schadendorf D, Moller A, Algermissen B, Worm M, Sticherling M, Czarnetzki BM. IL-8 produced by human malignant melanoma cells in vitro is an essential autocrine growth factor. J. Immunol. 1993;151:2667-2675.

43

32.

Singh RK, Gutman M, Radinsky R, Bucana CD, Fidler IJ. Expression of interleukin-8 correlates with the metastatic potential of human melanoma cells in nude mice. Cancer Res. 1994;54:3242-7.

33. Norgauer J, Metzner B, Schraufstätter I. Expression and growth-promoting function of the IL-8 receptor b in human melanoma cells. J Immunol. 1996;156:1132-1137. 34. Arenberg DA, Kunkel SL, Polverini PJ, Glass M, Burdick MD, Strieter RM. Inhibition of interleukin-8 reduces tumorigenesis of human non-small cell lung cancer in SCID mice. J. Clin. Invest.1996;97:2792-2802. 35. Harada A, Mukaida N, és Matsushima K. Interleukin-8 as a novel target for intervention therapy in acute inflammatory disease. Molec. Med. Today. 1996;2,482-489. 36.

Antony VB, Hott JW, Kunkel SL, et al. Pleural mesothelial cell expression of C-C (monocyte chemotactic peptide) and C-X-C (interleukin 8) chemokines. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 1995;12:581-8.

37. Hebert CA, Baker JB. Interlukin-8: A review. Cancer Invest. 1993;11:743-50. 38. Strieter RM, Koch AE, Antony VB, Fick RB, Standiford TJ, Kunkel SL. The immunopathology of chemotactic cytokines: the role of interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1. J. Lab. Clin. Med. 1994;123:183-197. 39.

Antony VB, Godbey SW, Kunkel SL, Hott JW, Hartman DL, Burdick MD, Strieter RM. Recruitment of inflammatory cells to the pleural space. J. Immunol. 1993;151:7216-23.

40.

Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, Elner S G, Strieter RM. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science. 1992;258:1798-1801.

41. Strieter RM, Kunkel SL, Elner VM, Martonyi CL, Koch AE, Polverini PJ, Elner SG. Interleukin-8: A corneal factor that induces neovascularization. Am. J. Pathol. 1992;141:1279-84. 42. Hu DE, Hori Y, Fan TP. Interleukin-8 stimulates angiogenesis in rats. Inflammation. 1993;17:135-143.

44

43.

Smith DR, Polverini PJ, Kunkel SL, Orringer MB, Whyte RI, Burdick MD, Wilke CA, Strieter RM. Inhibition of interleukin-8 attenuates angiogenesis in bronchogenic carcinoma. J. Exp. Med. 1994;179:1409-1415.

44. Folkman, J. Tumor angiogenesis. Advances in Cancer Res. 1985;43:175-203. 45. Strieter RM, Polverini PJ, Arenberg DA, Walz A, Opdenakker G, Van Damme J, Kunkel SL. Role of C-X-C chemokines as regulators of angiogenesis in lung cancer. J. Leukocyte Biol. 1995;57:752-62. 46. Galffy G, Mohammed KA, Dowling PA, Nasreen N, Ward MJ, Antony VB. Interleukin-8: an autocrine growth factor for malignant mesothelioma. Cancer Res. 1999;59:367 71. 47. Galffy G, Mohammed KA, Nasreen N, Ward MJ, Antony VB. Inhibition of interleukin-8 reduces human malignant pleural mesothelioma propagation in nude mouse model. Oncology Research 1999;11:187-94. 48. Bielefeldt-Ohmann H, Fitzpatrick DR, Marzo AL, Jarnicki AG, Musk AW, Robinson BW. Potential for interferon-alpha-based therapy in mesothelioma: assessment in a murine model. J. Interferon & Cytokine Res. 1995;15:213-23. 49. Kane AB. Animal models of mesothelioma induced by mineral fibers: implications for human risk assessment. Prog. in Clin. Biol. Res. 1992;374:37-50. 50. Kyriazis, A. A.; Kyriazis, A. P. Preferential sites of growth of human tumors in nude mice following subcutaneous transplantation. Cancer Res. 1980;40:4509-11. 51. Standiford TJ, Kunkel SL, Basha MA, Chensue SW, Lynch JP, Toews GB, Westwick J, Strieter RM. Interleukin-8 gene expression by a pulmonary epithelial cell line: a model for cytokine networks in the lung. J. Clinic. Invest. 1990;86:1945-53. 52. Smythe WR, Kaiser LR, Hwang HC, Amin KM, Pilewski JM, Eck SJ, Willson JM, Albelda SM. Successful adenovirus-mediated gene transfer in an in vivo model of human malignant mesothelioma. Annals. Thorac. Surg. 1994;57:1395-1401. 53. Kucharczuk JC, Elshami AA, Zhang HB, Smythe WR, Hwang HC, Tomlinson JS, Amin KM, Litzky LA, Albelda SM, Kaiser LR. Pleural-based mesothelioma in immune

45

competent rats: a model to study adenoviral gene transfer. Annals Thorac. Surg. 1995;60:593-8. 54. Xu L, Fidler IJ: Interleukin-8: an autocrine growth factor for human ovarium cancer. Oncol. Res. 2000;12:97-106. 55. Yuan A, Yang PC, Yu CJ, Chen WJ, Lin FY, Kuo SH, Luh KT.: Interleukin-8 messenger ribonucleic acid expression correlates with tumor progression, tumor angiogenesis, patient survival, and timing of relapse in non-small-cell lung cancer. Am J Respir Crit Care Med 2000 Nov;162(5):1957-63 56. Le X, Shi Q, Wang B, Xiong Q, Qian C, Peng Z, Li XC, Tang H, Abbruzzese JL, Xie K.: Molecular regulation of constitutive expression of interleukin-8 in human pancreatic adenocarcinoma. J Interferon Cytokine Res 2000 Nov;20(11):935-46 57. Inoue K, Slaton JW, Karashima T, Yoshikawa C, Shuin T, Sweeney P, Millikan R, Dinney CP.: The prognostic value of angiogenesis factor expression for predicting recurrence and metastasis of bladder cancer after neoadjuvant chemotherapy and radical cystectomy. Clin Cancer Res 2000 Dec;6(12):4866-73 58. Maas JW, Calhaz-Jorge C, ter Riet G, Dunselman GA, de Goeij AF, Struijker-Boudier HA.: Tumor necrosis factor-alpha but not interleukin-1 beta or interleukin-8 concentrations correlate with angiogenic activity of peritoneal fluid from patients with minimal to mild endometriosis. Fertil Steril 2001 Jan;75(1):180-5 59. Akiba J, Yano H, Ogasawara S, Higaki K, Kojiro M.: Expression and function of interleukin-8 in human hepatocellular carcinoma. Int J Oncol 2001 Feb;18(2):257-64 60.

Ugurel S, Rappl G, Tilgen W, Reinhold U.: Increased serum concentration of angiogenic factors in malignant melanoma patients correlates with tumor progression and survival. J Clin Oncol 2001 Jan 15;19(2):577-83

61. Kim SJ, Uehara H, Karashima T, Mccarty M, Shih N, Fidler IJ.: Expression of interleukin-8 correlates with angiogenesis, tumorigenicity, and metastasis of human prostate cancer cells implanted orthotopically in nude mice. Neoplasia 2001 Jan-Feb;3(1):33-42 62. Rodriguez-Panadero F, Antony VB. State of the Art: pleurodesis. Eur. Respir. J. 1997;10:1648–54.

46

63. Gamen SA, Anel P, Lasierra MA, Alava MJ, Martinez-Lorenzo A, Pineiro, Naval J. Doxorubicin-induced apoptosis in human T-cell leukemia is mediated by caspase-3 activation in a Fas-independent way. FEBS Lett. 1997;417:360–64. 64. Henkels KM, Turchi JJ. Induction of apoptosis in cisplatinsensitive and -resistant human ovarian cancer cell lines. Cancer Res. 1997;57:4488–92. 65. Meyn RE, Stephens LC, Hunter NR, Milas L.. Apoptosis in murine tumors treated with chemotherapy agents. Anticancer Drugs 1995;6:443–50. 66. Nasreen N, Mohammed KA, Dowling PA, Ward MJ, Galffy G, Antony VB: Talc induces apoptosis in human malignant mesothelioma cells in vitro. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2000;161:595-600.

47