A HISZTAMIN METABOLIZMUS ÉS A HISZTAMIN RECEPTOROK VÁLTOZÁSA HUMÁN COLORECTALIS TUMOROKBAN

A HISZTAMIN METABOLIZMUS ÉS A HISZTAMIN RECEPTOROK VÁLTOZÁSA HUMÁN COLORECTALIS TUMOROKBAN Doktori értekezés

Dr. Boér Katalin Fővárosi Önkormányzat Szent János Kórház

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola A human molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai program Témavezető: Dr. Darvas Zsuzsanna, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Szántó János Ph.D. Dr. Dank Magdolna PH.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Gergely Péter, Dsc. tagjai: Dr. Buzás Edit Dsc. Dr. Szántó János Ph.D.

Budapest 2007

TARTALOMJEGYZÉK

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ....................................................................................4 2. BEVEZETÉS ..............................................................................................................6 2.1. A hisztamin metabolizmusa és receptorai ..............................................................7 2.1.1. A hisztamin fiziológiás hatásai................................................................................7 2.1.2. A hisztamin metabolizmusa ....................................................................................8 2.1.3. Hisztamin receptorok...............................................................................................9 2.2. A hisztamin és a rosszindulatú daganatok ...........................................................10 2.3. A hisztamin lehetséges hatásmechanizmusai tumorokban.................................11 2.3.1. A hisztamin közvetlen hatása a tumorsejtekre ......................................................11 2.3.2. A hisztamin immunrendszeren keresztül kifejtett hatásai ....................................16 2.3.3. A tumor angiogenezisén keresztül kifejtett hatások ..............................................20 2.3.4. Metasztázisképzés és tumorsejt-adhézió ...............................................................20 2.4. Gastrointestinalis tumorok és a hisztamin ...........................................................21 2.5. Colorectalis tumorok és a hisztamin.....................................................................23 2.5.1. A vér hisztamin szintje, mint lehetséges tumor marker.........................................23 2.5.2. Hisztamin tartalom a colorectalis tumorokban......................................................23 2.5.3. H2-antagonistákkal végzett vizsgálatok ................................................................24 2.5.4. Colorectalis adenomák és tumorok közötti összefüggés .......................................26 2.6. CD8+ limfociták a tumorokban ............................................................................27 3. CÉLKITŰZÉSEK .....................................................................................................29 4. ANYAG ÉS MÓDSZEREK......................................................................................31 4.1. Betegek és szövettani minták gyűjtése ..................................................................31 4.2. RT- PCR technikák ................................................................................................32 4.2.1. RT- PCR ................................................................................................................32 4.2.2. Valósidejű RT- PCR..............................................................................................33 4.3. Fehérje izolálás és Western blot analízis ..............................................................34 4.3.1. Fehérje izolálás és mérés .......................................................................................34 4.3.2. Western blot...........................................................................................................34 4.4. Indirekt immunhisztokémiai reakciók .................................................................35 4.4.1. HDC enzim indirekt immunhisztokémiai kimutatása ...........................................35 4.4.2. CD8+ indirekt immunhisztokémiai reakció ..........................................................36 4.4.3. Hisztamin receptor (H1R, H2R, H4R) immunhisztokémiai reakció.....................36 4.5. Hisztamin tartalom mérése HPLC módszerrel....................................................37 4.6. DAO aktivitás mérés ..............................................................................................38 4.7. Statisztikai analízisek .............................................................................................38

2

5. EREDMÉNYEK ........................................................................................................39 5.1. Hisztamin kimutatása adenomában és adenocarcinomában. ............................39 5.2. A hisztamin metabolizmus enzimjeinek (HDC és DAO) kimutatása adenomában és adenocarcinomában. ..........................................................................40 5.2.1. A HDC enzim kimutatása immunhisztokémiai módszerrel. .................................40 5.2.2. A HDC enzim kimutatása Western blot analízissel...............................................43 5.2.3. A DAO enzim aktivításának kimutatása ...............................................................45 5.3. A hisztamin receptorok vizsgálata adenocarcinomában és adenomában ........46 5.3.1. RT-PCR vizsgálat eredményei adenocarcinomában .............................................46 5.3.2. Western blot analízis eredményei adenocarcinomában és adenomában ...............47 5.4. A hisztamin receptorok vizsgálata Dukes stádiumok szerint klasszifikált tumorokból származó mintákban ................................................................................49 5.4.1. Valósidejű RT- PCR eredményei ..........................................................................49 5.4.2. Western blot analízisek eredményei ......................................................................50 5.5. Hisztamin receptorok indirekt immunhisztokémiai kimutatása .......................53 5.6. CD8+ T limfociták immunhisztokémiai kimutatása adenomában és adenocarcinomában ......................................................................................................56 5.7. Egy speciális eset ismertetése: multiplex lymphomatosus polyposis. ................57 6. MEGBESZÉLÉS .......................................................................................................58 7. KÖVETKEZTETÉSEK............................................................................................66 8. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................................68 9. IRODALOMJEGYZÉK ...........................................................................................71 10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK .....................................................................................83 10.1. A doktori értekezésben összefoglaltakkal kapcsolatos saját és társszerzős közlemények ...................................................................................................................83 10.2. Poszter prezentációk ............................................................................................84 10.3. A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolódó megjelent közlemények és citálható abstractok:......................................................................................................84 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.................................................................................86

3

1.RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ALL: akut lymphoid leukémia cAMP: ciklikus adeozin-monofoszfát (ciklikus AMP) CEA: carcino-embrionális antigén c-FOS: oncoprotein, traszkripciós faktor CLL: krónikus lymphoid leukémia DAG: diacil glicerol DAO: diamino-oxidáz DC: dendritikus sejtek DPPE: dipalmitoil-foszfatidil-etanolamin ECL: enterokromaffin sejtek Ets-1: erythroblastosis virus E26 onkogén homológ fas: apo1, CD95- halálreceptor a sejtfelszínen 5-FU: 5-fluorouracil αFMH:. alfa-fluorometil-hisztidin bFGF: basic fibroblast growth factor GALT: Gut- Associated-Lymphoid Tissue HR: histamine receptor (hisztamin receptor) H1R: Hisztamin 1 receptor H2R: Hisztamin 2 receptor H3R: Hisztamin 3 receptor H4R: Hisztamin 4 receptor HDC : L-hisztidin-dekarboxiláz HNMT: hisztamin-N-metil transzferáz HNNM: N-nitrozo-N-metilurea HPLC: high-performance liquid chromatography IFN-γ : interferon-γ HUVEC: human umbilical vein endothelial cells IP-10: interferon-induced protein 10 IP3: inozitol triszfoszfát LT-β: limfotoxin MAPK: mitogén akitvált protein-kináz MFMH: monofluorometil-hisztidin NADPH- oxidáz: nikotinamid adenin dinukleotid phosphát-oxidáz NK- sejt: természetes ölő- sejt (natural killer) NMU: N-nitrozo-N-metilurea PKC: protein-kináz C Ras: oncoprotein, guanin-nukleotidkötő-fehérje a jelátviteli útvonalon rho-C: RAS fehérjék családjába tartozó fehérje, motilitási marker ROS: reaktív oxigéngyökök SCLC: humán kissejtes tüdőrák Th-sejtek: T-helper sejtek TIL-sejtek: tumor infiltráló limfociták TNF-α: tumornekrózis-faktor 4

TGF- β: transforming growth factor β TGF-α: transforming growth factor -α VEGF: vasculáris endotheliális növekedési faktor v-RAS: virális RAS

5

2. BEVEZETÉS A hisztamin fontos mediátor a szervezetben, számos fiziológiás és patofiziológiás hatása ismert. Elsődleges szerepe az akut gyulladásos és allergiás reakciókban van, a központi és perifériás idegrendszerben neurotranszmitterként működik, és fontos agyi funkciók szabályozásában is résztvesz. A gastrointestinalis rendszerben a hisztaminnak három hatása ismert, fokozza a gyomorsav termelését, szabályozza a motilitást és a nyálkahártya ion szekrécióját. Az immunválasz jellegének kialakulásában is fontos szerepet tulajdonítanak a hisztaminnak. A hisztamin szabályozza az antigén prezentáló sejtek működését és citokin termelését, modulálja a T-helper limfociták (Th1 és Th2) arányát, és ezáltal fontos szerepe van mind a celluláris mind a humorális immunválasz kialakításában is. A gyorsan proliferáló szövetek sok hisztamint tartalmaznak, és ma már evidenciák állnak rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a hisztamin hatással van a daganatsejtek proliferációjára és az áttétképzésre egyaránt. A hisztamin szerepe bizonyított a carcinogenesisben és a daganatok növekedésében, a komplex reguláció fontos résztvevő eleme, azonban pontos hatásmechanizmusa még nem teljesen tisztázott. A hisztamin a daganatsejtek proliferációját részben növekedési faktorként serkentheti vagy gátolhatja, részben indirekt úton befolyásolhatja az immunkompetens sejtek által termelt citokin-profil modulálásán keresztül. Ezidáig négyféle hisztamin receptor (H1R-H4R) került leírásra és jellemzésre, ezek a receptorok jelentős megoszlásbeli és funkcionális specificitást mutatnak, az általuk közvetített hatások mind a tumorban, mind a daganat mikrokörnyezetében érvényesülnek. Kísérleti és humán tumorokban egyaránt emelkedett hisztamin koncentrációt mutattak ki, a hisztamin metabolizmusában résztvevő enzimek jelenléte mellett. Számos kísérletben vizsgálták és leírták a hisztamin receptorok expressziós profilját és megoszlását a különböző tumorszövetekben, illetve a tumorokat infiltráló immunkompetens sejtekben is. A colorectalis carcinoma incidenciája magas, még mindig sok esetben diagnosztizálják metasztatikus stádiumban a betegséget, az esetek 15-25%- ában a primer tumor diagnózisának időpontjában synchron májmetasztázisok vannak jelen. A korai, operálható vastagbélrák esetében alkalmazott adjuváns kemoterápiák ellenére is gyakoriak a relapszusok, és gyakran alakulnak ki távoli metasztázisok. Klinikai

6

vizsgálatok adatai alapján a pre- vagy posztoperatív időszakban önmagában vagy kemoterápiával kombinációban alkalmazott H2-receptor antagonista terápiák hatására javult a colorectalis tumorban szenvedő betegek túlélése, és szignifikánsan csökkentek a relapszusok és a recidívák. Az észlelt kedvező eredményeket a hisztamin immunszuppresszív hatásának gátlásával magyarázták, és a hisztamin méginkább a figyelem középpontjába került, mint lehetséges tényező a colorectalis tumorok kialakulásában

és

progressziójában.

A

hisztamin

pontos

hatásmechanizmusai

tumorokban még nem tisztázottak, ugyanakkor ezek részletes tanulmányozása rendkívül fontos lehet a colorectalis daganatos betegek ellátásakor számbaveendő új prognosztikai faktorok és terápiák bevezetésének szempontjából. Doktori munkám során a hisztamin metabolizmust és a hisztamin receptorok expresszióját vizsgáltam colorectalis adenocarcinomában és adenomában a normál nyálkahártyával viszonylatban

összehasonlítva. is

elsőként

Tudomásunk

jellemeztük

a

szerint

hisztamin

hazai

és

metabolizmust

nemzetközi vastagbél

adenomában, és a hisztamin receptorok valósidejű RT-PCR és fehérje szintű expresszióját adenoma és adenocarcinoma mintákban. 2.1.A hisztamin metabolizmusa és receptorai 2.1.1.A hisztamin fiziológiás hatásai A hisztamin β-imidazolylethylamin, egy biogén amin melynek szerepe az allergiás és gyulladásos folyamatokban régóta ismert (1). A központi és perifériás idegrendszer neuronjaiban neurotranszmitter funkciót tölt be. Hisztamint szintetizálnak a hátsó hypothalamus tuberomamilláris magjában lévő neuronok is, melyek olyan fontos agyi funkciókban vesznek részt, mint pl. alvás/ébrenlét, hormonális szekréció, kardiovaszkuláris kontroll, hőreguláció, táplálkozás és memória. A gastrointestinalis rendszerben a hisztamin legalább három fiziológiás funkciót szabályoz: fokozza a gyomorsav termelését, szabályozza a gastrointestinalis motilitást és a nyálkahártya ion szekrécióját. Az utóbbi években egyre több adatt gyűlt össze arra vonatkozóan, hogy a hisztamin jelentős szerepet tölt be az immunválasz jellegének kialakításában. A hisztamin szabályozza az antigén prezentáló sejtek működését és citokin termelését,

7

modulálja a segítő T-limfociták (Th), a Th1 és a Th2 sejtek egyensúlyát, és ezáltal jelentős hatással van mind a celluláris, mind a humorális immunválasz kialakulására (1-4). Bizonyos kísérleti rendszerekben a hisztamin hatására a Th1-Th2 sejtek egyensúlya Th2 irányba tolódott el, és ezáltal gyengítette a celluláris immunválasz hatékonyságát. A hisztamin legfontosabb forrását a hízósejtek és a bazofil granulocyták képezik, ezekben a sejtekben a hisztamin intracelluláris granulumokban tárolódik. Egyéb myeloid és lymphoid haemopoeticus sejtek (thrombocyták, dendritikus sejtek és T-sejtek) magas HDC aktivitásuk révén nagy mennyiségű hisztamint termelnek és tárolnak. Ezek a sejtek nem rendelkeznek granulumokkal, a hisztamint szabad, diffúzibilis formában tartalmazzák (5-7). A hisztamin a gastrointestinalis traktusban a nyálkahártyához kapcsolódó immunrendszer (GALT) enterokromaffin sejteiben (EC) szintetizálódik és tárolódik. 2.1.2.A hisztamin metabolizmusa A hisztamin szintézise indukálható, a nem raktározott, diffúzibilis formában lévő hisztamin gyorsan felszabadul olyan helyzetekben, amelyekre a szövetek gyors osztódása a jellemző, mint pl. embrionális fejlődés és szöveti regeneráció. Ismert, hogy nagy mennyiségű hisztamin termelődik bizonyos tumorokban is (8). A hisztamint a sejtek az L-hisztidin aminosav átalakításával, az L-hisztidin-dekarboxiláz enzim (HDC) segítségével állítják elő, amely piridoxál-foszfát koenzimmel működik. Az enzim filogenetikailag erősen konzervatív, és ez az egyetlen útvonal a hisztamin szintézisére. A HDC irreverzibilis inhibitora az alfa-fluorometil-hisztidin (αFMH). A hisztamint két enzim bontja le, a diamino-oxidáz (DAO) és a hisztamin-N-metil transzferáz (HNMT), melyek eloszlása és aktivítása szövetspecifikus (1. ábra) (9). A gastrointestinalis traktusban a hisztamin lebontását végző enzimek közül a DAO- nak van elsődleges szerepe.

1. ábra: A hisztamin metabolizmusa (9)

8

2.1.3.Hisztamin receptorok A hisztamin farmakológiai hatásait a jelenleg ismert négyféle membránhoz kötött hisztamin receptoron (HR) keresztül fejti ki: H1-receptor (H1R), H2-receptor (H2R), H3-receptor (H3R) és H4-receptor (H4R) (10). A hisztamin receptorok a G- proteinhez kapcsolt sejtfelszíni receptorcsaládba tartoznak. A receptorok hét transzmembrán domént tartalmaznak, az extracelluláris aminoterminális vég felelős a ligandkötés specificitásáért. A hisztamin receptorok sejteloszlása és száma nagyfokú heterogenitást mutat a különböző szövetekben. A hisztamin receptorok típusuktól függően más-más jelátviteli útvonalakat aktiválnak. A H1-receptorok főként az agyban, a simaizomsejteken, az endothel sejteken, a mellékvesében és a szívben expresszálódnak. Ez az altípus elsősorban az allergiás reakciókban,

a

simaizom-kontrakcióban,

valamint

a

vascularis

permeabilitás

szabályozásában játszik szerepet. A H1R a Gq-fehérjéhez kapcsolódik, és foszfolipáz C közvetítésével a foszfoinozitol hidrolízisét, valamint IP3 és DAG keletkezését indukálja, melynek eredményeképpen megnövekszik az intracelluláris kálcium ion koncentráció. A H2-receptorok főként a gyomor parietális sejtein találhatóak és Gs- proteinhez kapcsolódnak, mely az adenil ciklázt aktiválja, és ezáltal a cAMP szint növekedését idézi elő (10). A H3R egy idegrendszeri autoreceptor, a központi és a perifériás idegrendszerben preszinaptikusan helyezkedik el, ahol a hisztamin és más neurotranszmitterek felszabadulását gátolja. A H3R-on keresztül közvetített jelátvitelek vagy az adenil-cikláz, vagy a mitogén aktivált protein-kináz (MAPK) aktivitás növekedését idézik elő (11). A H4-receptort 2001-ben fedezték fel, a H3R-hoz hasonlóan a Gi/o proteinhez kötődik, és foszfolipáz C és MAPK jelátviteli útvonalakat aktivál (12). A H3R és a H4R a cAMP foszfodiészterázhoz kapcsolódik, ezáltal csökkenti a cAMP szintet. A H4R expresszióját első alkalommal haemopoeticus sejteken írták le (mint pl. eozinofil-, bazofil granulociták), de magas H4R expresszió van jelen a thymusban, lépben és májszövetben egyaránt. A H4R-nak elsődleges szerepe a T-helper sejtek differenciálódásában van, továbbá modulálja a Th1/Th2 limfocita egyensúlyt is (9-10). Újabb adatok alapján a hisztamin H4R aktivációja eozinofil kemotaxist indukál (1. táblázat) (13). Felvetődött egy ötödik, intracelluláris hisztamin receptor létezése is, egyelőre azonban úgy tűnik, hogy ez a citokróm p450 altípusa lehet, és nem igazi receptor (14).

9

Hisztamin receptorok H1R

H2R

KromoExpresszió szomális lokalizáció 3 Idegsejtek, légúti és vascularis simaizomsejtek, hepatocyták, chondrocyták, endotheliális sejtek, neutrofil és eozinofil granulociták, monociták, dendritikus sejtek, B- és T-sejtek

Jelátviteli útvonalak PLC; PKC; MAPK: (pl. ERK1/2, p38)

G-fehérje típusa Gq/11

5

Gyomor parietális sejtek, PLC; PKA, Gsα és Gq idegsejtek, simaizomsejtek, c-fos neutrofil és eozinofil granulociták, monociták, dendritikus sejtek, B- és T-sejtek H3R 20 Hisztaminerg neuronok, MAPK Gi/o eozinofil granulociták, (pl. p44/42) dendritikus sejtek perifériás szövetek (alacsony expresszió) H4R 18 neutrofil, eozinofil és bazofil PLC; Gi/o granulociták, dendritikus MAPK sejtek, hízósejtek, (pl. p44/42) T-sejtek, idegsejtek, perifériás szövetek (alacsony expresszió) 1. táblázat: Hisztaminreceptorok típusai és a jelátviteli útvonalak (10-12)

2.2.A hisztamin és a rosszindulatú daganatok Évtizedek óta vizsgálják a hisztamin lehetséges szerepét a rosszindulatú daganatok kialakulásában és a tumorok progressziójában. Számos kutatási eredmény áll rendelkezésre, de a pontos hatásmechanizmus még nem tisztázott. A poliaminoknak kulcsfontosságú szerepük van a sejt proliferációjában, több mint 40 évvel ezelőtt merült fel, hogy a hisztaminnak szerepe lehet a carcinogenesisben. Ismert ugyanis, hogy a gyorsan proliferáló szövetek sok hisztamint tartalmaznak, és az osztódó sejtek mellett a tumorsejtek is termelnek és tárolnak hisztamint (9). Továbbá, összefüggés figyelhető meg a HDC aktivitás és a tumor növekedése között. Jelentős HDC fehérje termelődést

10

szolid tumorokban és hematológiai betegségekben egyaránt leírtak (pl. melanoma, ALL, gyomor- és colorectalis carcinoma esetében) (15). Ma már evidenciaként fogadják el, hogy a hisztamin hatással van a daganatsejtek osztódására, továbbá a malignus átalakulás egyik fontos résztvevő eleme (15-16). Hatásait egyrészt a hisztamin receptorokat expresszáló tumorsejteken, másrészt a daganat mikrokörnyezetében jelenlévő immunsejteken keresztül fejti ki. Attól függően, hogy a hisztamin melyik receptorán keresztül kapcsolódik a daganatos sejthez, gátolhatja, vagy éppen elősegítheti az adott sejt proliferációját. A hisztamin hatása tumorsejt

típusonként

is

változó,

ugyanis

a

receptorok

lokális

aránya

és

hozzáférhetősége alapján dől el, hogy fokozza vagy gátolja a daganatsejt osztódását (9). A hisztamin az immunválaszra is hatással van, általában gátolja a szervezet tumor elleni védekezését, és ezáltal is a tumorsejt szaporodását segíti elő. Bizonyított, hogy a hisztamin elősegíti a neoangiogenezist, és feltételezhetően szerepet játszik a metasztázisok kialakulásában is (17-18). A hisztamin tumorképződésben betöltött szerepét számos kísérleti rendszerben vizsgálták. In vitro malignus sejtvonalakon főként a hisztamin receptorokat és az ezeken keresztül

kiváltott

jelátviteli

folyamatokat

tanulmányozták.

Állatkísérletes

tumormodelleken a hisztamin direkt (a tumorra) és indirekt (az immunrendszeren keresztüli) hatásainak pontosabb vizsgálata vált lehetővé. Humán vonatkozásban a hisztamin metabolizmust, a hisztamin receptorokat és a hisztamin receptor-antagonisták hatásait célzó kutatásokat végeztek. A kiterjedt vizsgálatok ellenére azonban igen kevés adat áll rendelkezésre a hisztamin tumor növekedésre kifejtett hatására vonatkozóan. 2.3.A hisztamin lehetséges hatásmechanizmusai tumorokban 2.3.1.A hisztamin közvetlen hatása a tumorsejtekre A hisztamin direkt hatását a tumorsejtre, a metabolizmusában szerepet játszó enzimeket, illetve a receptorait malignus sejtvonalakon viszonylag egyszerűen lehet vizsgálni. A legtöbb malignus sejtvonalban számottevő mennyiségű intracelluláris hisztamint mértek, melyet a sejtek diffúzibilis, nem raktározott formában tartalmaztak. Bizonyos

sejtkultúrákban,

emlőcarcinomában,

az

pl.

N-nitrozo-N-metilurea

extracelluláris

médiumban

11

is

(HNMT) mértek

indukált

nanomoláris

koncentrációban hisztamint, ami azt bizonyította, hogy a hisztamin felszabadul a sejtekből (8). A hisztamin hatását legkiterjedtebben humán melanoma sejtvonalakon vizsgálták. A hisztamint és metabolizmusának enzimeit mind a primer (WM35, WM983) mind a metasztatikus (HT168-M1) humán melanoma-sejtvonalakban kimutatták. A HDC fehérje jelenlétét csak primer tumorból származó sejtvonalakban mutatták ki, míg HNMT-aktivitást mind primer mind áttétes melanoma sejtvonalakban leírtak (19). Ezzel szemben a vizsgált melanoma sejtekben nagyon alacsony DAO szinteket találtak. A vizsgálatok fontos megfigyelése volt, hogy a melanoma sejtek külső stimulus nélkül is mérhető mennyiségű hisztamint juttattak az extracelluláris médiumba. Ezek az eredmények egy autonóm hisztamin metabolizmus fennállása mellett szóltak. Emellett feltételezték, hogy a melanomasejtek által szintetizált hisztamin autokrin és parakrin növekedési faktorként befolyásolja a sejtek proliferációját, és modulálja a lokális immunválaszt is (20). Humán kissejtes tüdőrákban (SCLC biopsziás mintákban) is kimutattak hisztamint és HDC fehérjét. Megfigyelték, hogy a tüdő carcinoma sejtek nemcsak szintetizálnak hisztamint, de azt a környezetbe ki is juttatják (21). Neuroendokrin daganatokban (mint pl. carcinoid, pheochromocytoma, medulláris pajzsmirigyrák és pancreas endokrin tumor), szintén igazolták a HDC enzim expresszióját (22). Az utóbbi időben egyre több malignus tumorban mutatták ki a hisztamin szintézisét jelző HDC fehérjét. Colorectalis carcinomában az enzim jelenléte és mennyisége összefügghet a daganat invazivitásával és metasztatikus potenciáljával (23). Malignus sejtvonalakon is igazolták hisztamin receptorok jelenlétét, legszélesebb körben a H2-receptor sejtproliferáció szabályozásában betöltött szerepét vizsgálták. A legtöbb esetben a sejtek proliferációjának fokozódását a H2R-nak tulajdonították (15). Humán embrionális HEK-293 vesesejtvonalak H2 receptorral való transzfekciója során PKC függő jelátviteli útvonalhoz kapcsolt H2R aktivációt, a c-fos transzkripció és a sejtproliferáció fokozódását írtak le (24). A H2-receptort expresszáló U937 promonocita-sejtvonalon végzett kísérletek eredményei arra utaltak, hogy a hisztamin számos, a sejtosztódás szempontjából fontos mechanizmust aktivál (pl. cAMPprodukció, c-fos- expresszió). Ezekben a kutatásokban a hisztamin receptorok esetleges gyors deszenzitizációja is felmerült (25).

12

Kevesebb kísérleti adat áll rendelkezésre a H1-receptor sejtproliferációban betöltött szerepéről. Funkcionális H1R expressziót írtak le Ras onkogénnel transzformált Balb/3T3 sejtek esetében (26). A H1-receptort expresszáló humán carcinoma (HeLa és A431) és melanoma sejtek (A875) esetében a hisztamin dózisfüggő módon növelte a DNS-szintézist, és ezáltal a sejtosztódást. Ezekben a kísérletekben felvetették a hisztamin kemotaktikus válasz indukálásában betöltött szerepét is (27). Hisztamin hatására humán astrocytoma U373 sejtek proliferációjának fokozódását észlelték, feltehetően H2-receptorokon keresztül történő PKC-MAPK jelátviteli útvonal aktivációjával (28). H1-receptorok aktivációja során a humán DU145 prostata adenocarcinoma sejtek proliferációjának csökkenését írták le (29). Bizonyos malignus sejtvonalakon végzett kísérletek alapján összefüggést találtak a hisztamin és egyes protoonkogének expressziója között is. Embrionális vese- (HEK293) és monocita- (U937) sejtvonalakon több kísérletben is c-FOS expressziót írtak le (24-25). Melanoma sejtvonalakon a hisztamin és Ets-1 (erythroblastosis virus E26 onkogén homológ) protoonkogén expressziója közötti összefüggést vizsgálták (30). Az Ets-1 transzkripciós faktornak szerepe lehet az extracelluláris mátrix átrendezésében, a daganatos sejtmigrációban és a tumor invázióban szerepet játszó metasztázis-asszociált molekulák aktiválásában (31). Az exogén hisztamin hatására elsősorban a H2-receptort expresszáló primér (és nem a metasztatikus) melanoma-sejtvonalakban (VM35) fokozódott az Ets-1 expresszió. A vizsgálat kiértékelésekor azt a következtetést vonták le, hogy a hisztamin a lokális Ets-1 expresszió indukcióján keresztül szerepet játszik a melanoma növekedésének szabályozásában (30). A hisztaminnak a sejtproliferációra gyakorolt hatását hisztamin receptor antagonistákkal is vizsgálták. Melanoma sejtvonalakon a HDC-gátló αFMH és az „intracelluláris hisztamin receptor” antagonista DPPE gátolta a sejtek proliferációját (32). H2-receptort expresszáló áttétes melanomában HDC-specifikus antiszensz oligonukleotidok adásával erősen csökkent sejtproliferációt észleltek. A proliferáció lelassulásával egyidőben a HDC-protein intracelluláris mennyiségének csökkenését is megfigyelték (17). A HDC transzlációs gátlása blokkolta az egyébként stimuláló kapacitással rendelkező hisztamin lokális termelését. Melanomában lokálisan képződő hisztamint is kimutattak, és ez a fajta endogén hisztamin szintézis fontos szerepet játszhat a melanoma növekedésében és progresssziójában (23). Feltételezik, hogy a

13

melanoma sejtekben zajló autonom hisztamin metabolizmus során képződő hisztamin mint növekedési faktor, autokrin szabályozási mechanizmuson keresztül fokozza a sejt proliferációját (19-20). A H1R- és H2R-szelektív agonistákkal és antagonistákkal történt vizsgálatokban azt is leírták, hogy a hisztamin a H1-receptorokon keresztül csökkenti, ugyanakkor a H2R-on keresztül fokozza egyes melanomasejtek proliferációját (33). Végsősoron a H1- és H2-receptorok száma, hozzáférhetősége, aránya és lokális egyensúlya határozza meg a hisztamin hatás eredőjét, azaz, hogy stimulálja vagy gátolja a melanoma növekedését. A melanoma mellett humán carcinoma- és szolid tumorokból származó (prostatarák, astrocytoma) sejtvonalakon is vizsgálták a hisztamin sejtproliferációra kifejtett hatásait, ezek eredményeit a 2. számú táblázatban részleteztük.

Sejtvonal

Hisztaminreceptorok

A hisztamin hatása a sejtproliferációra

Humán carcinoma A431 és HeLa (19)

H1R

H1- receptoron fokozza

Astrocytoma U373 sejtek (28)

H1R

H1- receptoron fokozza

Prosztatarák DU-145 (29)

H1R

H1- receptoron gátolja

Melanoma HT168-M1, HT168/91, WM983, WM35 (24,32)

H1R, H2R

H1- receptoron gátolja, H2- receptoron fokozza

2. táblázat: Hisztamin receptorok expressziója és a hisztamin hatása humán daganatokból származó sejtvonalakra A hisztamin szerepe a carcinogenesisben, a tumorok növekedésében és a daganatos folyamat progressziójában nagyobb pontossággal vizsgálható kísérleti tumormodelleken. Állattumorokban (pl. Lewis egér tüdőcarcinoma, EMT6 egér sarcoma, Morris patkány hepatoma) már a 80-as években leírták a HDC-aktivitás fokozódását, s ezzel együtt a hisztamin tartalom gyors növekedését a daganat korai növekedési fázisában. A HDC fehérje specifikus inhibitorának, az MFMH (monofluorometil-hisztidin)-nek folyamatos adagolása után szignifikánsan lelassult az egérben indukált sarcoma (EMT6) és tüdő carcinoma (Lewis) növekedése, ugyanakkor 14

sarcoma esetében nem alakultak ki tüdőmetasztázisok. A MFMH Buffalo-patkány hepatomában is gátolta a proliferációt. Ezekben a kísérleti tumor modellekben is a de novo szintetizált hisztaminnak tulajdonítottak döntő szerepet a sejtproliferáció szabályozásában (34). Egyes vizsgálatokban HDC-transzfekcióval különböző hisztamin szekréciós kapacitású

B16-F10

egérmelanoma

sejtvonalakat

hoztak

létre,

majd

ezeket

transzgenikus C57BL/6 egerek bőrébe ültették. A primer bőrdaganat növekedésével egyidőben a tüdő metasztázisok számának és méretének növekedését észlelték. Továbbá megfigyelték, hogy a szekretált hisztamin mennyiségének növekedése a H2-receptor és a rho-C motilitási marker expressziójának fokozódásával járt. A hisztamin növekedést serkentő hatását a tumorsejtek fokozott H2-receptor expressziójával magyarázták. A hisztamin a rho-C termelésén keresztül a sejtek motilitását is növelte, ezáltal elősegítve a melanoma sejtek vándorlását és a tüdőáttétek kialakulását. Mindezek alapján feltételezhető, hogy a tumorok növekedése gyorsabb, amennyiben hisztamint termelő sejteket tartalmaznak. Ezek a sejtek az áttétképzés során nagyobb arányban vándorolnak ki a véráramból a célszövetekbe, és képeznek metasztázist (35). Bizonyos esetekben előfordulhat, hogy a hisztamin koncentrációja a magasabb HDC aktivitással párhuzamosan nem növekszik. Ez egyrészt a fokozott hisztamin lebontással, másrészt az újonnan szintetizált hisztamin gyors felszabadulásával (a hisztamin nem raktározódik) magyarázható. A hisztamin intracelluláris hatásait és a receptorokon keresztül aktivált jelátviteli útvonalakat egérben bőr-carcinogenezis modellen vizsgálták. A Sencar egér bőrén indukált tumorképződés promóciós fázisában a H2-receptor aktivációja a foszfatidilinozitol hidrolíziséhez vezetett, míg a H1-receptor agonistákkal történő aktiválása a cAMP-szint növekedését idézte elő. Hasonló H2R aktivációs jelenséget észleltek a tumorok körüli, carcinogénnel nem kezelt cutis területén is. A receptorok (H1R és H2R) és ezáltal a jelátviteli mechanizmusok aktivációját a tumornövekedés fontos tényezőiként értékelték. Az egyidejűleg észlelt hízósejtszám-növekedés és a sejtek fenotípus változásai ismeretében megerősítettnek látták, hogy ezek a sejtek résztvesznek a carcinogenezis folyamatában (36). A hisztamin receptorok által közvetített hatást patkányban N-nitrozo-N-metilurea (NMU) által indukált emlő adenocarcinomán is

15

vizsgálták. Az endogén hisztamin fontos tényezőként számít a sejtek proliferációjának vonatkozásában, és feltételezték, hogy a növekedésre gyakorolt hatását a H2-receptorokon keresztül fejti ki (37-39). Egy ilyen kísérleti tumormodellen az orálisan alkalmazott H2-antagonista ranitidin az emlőtumorok remisszióját és a patkányok szignifikánsan hosszabb túlélését eredményezte. A tumorok komplett remissziója csaknem az esetek 50%-ában bekövetkezett. Ugyanakkor H1-blokkolók hatására fokozódott a tumornövekedés, és megrövidült a patkányok túlélése (38). Immunhiányos SCID egerekbe humán HT168 melanoma-sejtvonalat xenotranszplantáltak, és a tumor növekedését H2-antagonista (cimetidin és ranitidin) és DPPE kombinációjával gátolták. A H2-blokkoló és DPPE kombinációval kezelt egerek túlélése

szignifikánsan

meghosszabbodott.

A

hisztológiai

elemzés

során

az

antihisztaminnal kezelt egerek melanomagraftjaiban interferon termelő makrofágok masszív infiltrációját észlelték (40). Mindezek alapján feltételezhető, hogy a hisztamin a tumornövekedés fokozása mellett a lokálisan jelenlévő immunsejtekre is hatást gyakorol (41). Egy másik vizsgálatban a cimetidin hatására fokozódott a T-limfociták IFN-γ termelése, ennek fontos szerepe lehet a hatékony tumorellenes immunválasz kialakításában és fenntartásában (42). 2.3.2.A hisztamin immunrendszeren keresztül kifejtett hatásai Epidemiológiai megfigyelések alapján az allergiás betegekben alacsonyabb a rosszindulatú daganatok incidenciája (43). Továbbá, a daganatos betegek szérumában alacsonyabb hisztamin koncentrációt mértek, mint az allergiás betegek esetében (44). Mindezek alapján felmerült, hogy a hisztaminnak szerepe lehet a daganatellenes immunvédekezésben. Az immunválasz során a Th-sejtek központi szerepet töltenek be az immunológiai funkciók szabályozásában. A Th1 típusú limfociták (melyek elsősorban IL12, IFNγ, TNFβ, limfotoxin és TNFα termelők) a sejtközvetített immunválaszban, míg a Th2 sejtek (melyek IL-5, IL-10, IL-6, és IL-13 termelők) főleg a humorális immunválaszban vesznek részt. A tumorok mikrokörnyezetében számos citokin termelődik, hatásaikat tekintve a legfontosabbak az IFN-γ (interferon-γ), az IL-12 (interleukin-12) és az IL-10 (interleukin-10).

A

tumorellenes

celluláris

immunválasz

kialakulásában

és

fenntartásában a legfontosabb szerepet feltehetően az IFNγ és az IL-12 tölti be (45-48).

16

Ezzel szemben az IL-10 gátolja a Th1-limfociták proliferációját és ezáltal a sejt közvetítette immunválaszt (49). A tumorsejtek maguk is termelnek citokineket (pl. IL-10, TGFβ), és ezek autokrin növekedési faktorként segítik elő a sejtek proliferációját, egyben megakadályozzák a hatékony daganatellenes celluláris immunválaszt. A tumorban és/vagy a tumor mikrokörnyezetében termelt hisztamin, valószínűleg az

immunkompetens

sejteken

keresztül

(T-limfociták,

dendritikus

sejtek,

monocita/makrofág) hatással van a Th1/Th2 limfociták arányára is (1). Egyes kísérleti rendszerekben hisztamin hatására Th2 túlsúlyú immunválasz kialakulását észlelték, és feltételezték, hogy a Th2-limfociták által fokozottan expresszált citokinek gátolják a hatékony celluláris immunválaszt, és ezáltal is elősegítik a tumor növekedését (15,45). A hisztamin az aktivált monociták és makrofágok IL-12 termelését is gátolja, és ugyanakkor stimulálja a TH2-sejtek IL-10 termelését (2. ábra).

2. ábra: A hisztamin hatásai a citokinekre (50-51)

Melanoma malignumban a tumorszövetet infiltráló T-limfociták (TIL) és a természetes ölő T-sejtek (NK) oxidatív károsodásának jeleit figyelték meg (52). A fagociták (monocita és makrofág) működése során felszabadult reaktív oxigéngyökök

17

(ROS), különösen a hidrogén-peroxid, a malignus tumorokban a NK- és T-sejtek funkcióját gátolták. A T-sejtek és főleg az NK-sejtek érzékenyek az oxidatív stresszre, a reaktív oxigéngyökök apoptózisukat indukálhatják (53). A hisztamin a H2R-on kereszül gátolja a monociták és a makrofágok által termelt ROS képzését és felszabadulását, elsősorban a NADPH oxidáz enzim aktivitásának gátlásán keresztül, mely kulcsfontosságú az oxigén gyökök képződésében. Ezzel a mechanizmussal a hisztamin kivédi a T- és NK-sejtek oxidatív stressz okozta dysfunctióját és apoptózisát (3. ábra).

3. ábra: A hisztamin hatása a reaktív oxigéngyökök által közvetített NK- és T-sejt gátlásra (54-55) Az IL-2 monoterápiához hozzáadott hisztamin-dihidroklorid csökkentette a ROS által okozott toxicitást a tumor mikrokörnyezetében (54). Preklinikai adatok alapján a hisztamin, feltehetően a lokálisan képződő oxigéngyökök termelődésének csökkentése által fokozza az IL-2 antitumorális hatását a tumor infiltráló fagocitákban (56). Egy 305 metasztatikus melanoma malignumban szenvedő beteg bevonásával végzett fázis III klinikai vizsgálatban IL-2 és hisztamin kombinációs kezelést, vagy IL-2 monoterápiát alkalmaztak. A két kezelési csoport túlélése között nem találtak szignifikáns különbséget.

Az

alcsoport-analízis

során

azonban

bebizonyosodott,

hogy

a

májmetasztázisos betegek túlélése szignifikánsan jobb volt a hisztamint is tartalmazó kezelési csoportban (57). A legújabb eredmények szerint a hisztamin-dihidroklorid

18

IL-2-vel együtt fokozza a Th1-típusú immunválaszt, és elősegíti a melanoma specifikus T-sejtek indukcióját. A celluláris immunválasz és a tumorspecifikus T-limfociták indukciója fontos a tumor ellenes védekezésben, így a hisztamin IL-2 kezelés a rák immunterápiájának hatékony része lehet a későbbiekben (58). Az exogén hisztamin limfociták citokin termelésére kifejtett hatását egérbe implantált colon 38 tumorban vizsgálták. Exogén hisztamin hatására a tumorszövetben csökkent a lokális IFN-γ és az IL-12 expresszió, ugyanakkor növekedett az IL-10 mennyisége, és a citokinek ilyen irányú változása a perifériás IFN-γ/IL-4 arányának csökkenéséhez vezetett. Ezek az eltérések az egér szisztémás immunválaszának Th2 túlsúlyú változását jelzik. Utóbb kiderült, hogy a hisztamin hatására csak a tumoros állatban csökkent a Th1-limfociták aránya, ezért feltételezik, hogy a hisztamin gátolja a tumorellenes celluláris immunválaszt. A citokinek nagy valószínűséggel a tumor infiltráló immunsejtekből, és nem a daganatsejtekből származtak (59). Egy másik kísérletben, Balb/c egereken vastagbél adenocarcinoma modellen (Ct-26 sejtvonallal) megfigyelték, hogy a tumorsejtek egérbe történő beoltását követően a HDC fehérje aktivitása jelentősen nőtt, ugyanakkor a tumorban lévő citokin expressziós szintek, mint például a LT-β (limfotoxin), a TNF-α (tumornekrózis-faktor), az IFN-γ, az IL-10 és az IL-15, csökkentek. Megállapították, hogy a tumorszövetben endogén úton szintetizált hisztamin a H2R-on keresztül gátolja a lokális tumorellenes immunitást, és ezáltal elősegíti a daganat növekedését (60). A

tumorszövetet

infiltráló

limfocitákról

(TIL)

feltételezik,

hogy

tumorspecifikusak és erősebb citotoxikus hatással rendelkeznek, mint a vérben keringő limfociták (61). A hisztamin hatása a tumor infiltráló limfocitákra régóta ismert. A C57BL/6 egerekbe implantált MC-38 vastagbéltumoron végzett vizsgálatban leírták, hogy a hisztamin csökkentette a tumorszövetet infiltráló limfociták számát (62). A hisztamin magas koncentrációban csökkenti a T-sejtek adhézióját, citotoxicitását, proliferációját és citokintermelését. A hisztamin a T-limfocitákon keresztül számos olyan immunológiai folyamatot gátol, melyeknek fontos szerepe lenne a tumor elleni védekezésben (63).

19

2.3.3.A tumor angiogenezisén keresztül kifejtett hatások Tumormodellekben és humán tumorokban egyaránt kimutatták, hogy a hízósejteknek fontos szerepük van a malignus transzformációt megelőző angiogenezis elindításában és fenntartásában. A hízósejtből felszabaduló proangiogenetikus faktoroknak (mint pl. VEGF, bFGF, TGF- β, TNF-α, IL-8, heparin és proteázok) bizonyított szerepe van az angiogenezisben, de a hisztamin e téren kifejtett szerepe még kevéssé ismert (64-66). Granulációs szövetben a hisztamin a H2-receptoron keresztül növelte a VEGF expressziót (67). C57BL/6 egerekbe implantált colon 38 sejtvonalon kimutatták, hogy olyan H2-antagonisták, mint roxatidin és cimetidin, szignifikánsan csökkentették a szérum és a tumorszövet VEGF szintjét, valamint a tumor kapilláris denzitását. Leírták, hogy a malignus szövetben növekedett a nekrotikus terület, és lelassult a tumor növekedése (68). Ezzel szemben egy másik vizsgálatban (melyben CMT93 colon sejtvonalakat implantáltak C57BL/6 egerekbe) a cimetidin az érképzés során direkt hatást fejtett ki az endothelsejtekre, és nem befolyásolta a VEGF-szintet (69). A hisztamin más útvonalon keresztül is elősegítheti az angiogenezist. A tumorsejtek IFN-γ hatására IP-10 (interferon-induced protein 10) fehérjét termelhetnek, mely gátolja a daganat progresszióját. A hisztamin humán melanomában és laphámrákban H2-receptorokon keresztül gátolta az IP 10 protein termelését. Összefoglalva, a tumorból és/vagy a hízósejtekből felszabaduló hisztamin fokozza az angiogenezist, és ezáltal elősegíti a tumor növekedését (70). 2.3.4.Metasztázisképzés és tumorsejt-adhézió A tumorsejtek endothelsejthez való adhéziójában az E-szelektin-nek elsődleges szerepe van, az adhézió a szialil Lewis antigén ligandon keresztül jön létre. Humán vastagbél- és májtumoros sejtvonalakon kimutatták, hogy a cimetidin egyrészt gátolta a tumorsejtek

adhézióját

az

endothelsejtekhez,

másrészt

megakadályozta

az

endothelsejtek sejtfelszíni E-szelektin expresszióját. In vitro a cimetidin dózisfüggő módon blokkolta a humán HT-29 vastagbéltumor-sejtek adhézióját HUVEC endothelsejtekhez, in vivo pedig csökkentette a májmetasztázisok incidenciáját HT-29 tumoros nude egéren. A cimetidin antimetasztatikus hatását az endothelsejtek

20

sejtfelszíni E-szelektin expressziójának gátlásával magyarázták. Kísérleti körülmények között a famotidin és a ranitidin esetében nem figyeltek meg ilyen hatást (71). Hasonló eredményeket találtak egy olyan kísérletben, ahol humán endotheliális sejtvonal (ECV304) E-szelektin expresszióját, és ezzel összefüggésben májtumoros (HepG2 és BEL7404) és vastagbél tumoros sejtvonalak (Ls-174) sejtjeinek adhézióját vizsgálták. A cimetidin az E-szelektin expresszióját önmagában is gátolta, emellett E-szelektin antiszensz oligonukleotidokkal való kombinációban csökkentette a tumorsejtek adhézióját (72). Utalunk egy idevágó humán klinikai vizsgálatra, 64 vastagbélrákos betegnél alkalmaztak kuratív műtét után adjuváns kemoterápiát (5fluorouracil) cimetidin kezeléssel kombinálva, vagy anélkül. Azoknál a betegeknél, akiknek daganatában magas szialil Lewis antigén-szintet mértek, a cimetidin terápia különösen hatékonynak bizonyult, mivel csökkent a recidívák száma és javult a túlélés. A cimetidin valószínűleg emberben is gátolja a tumorsejtek adhézióját az endothelsejtekhez (73). 2.4.Gastrointestinalis tumorok és a hisztamin Gastrointestinalis

malignus

sejtvonalakon

(hasnyálmirigy-,

gyomor-,

és

vastagbélrák adenocarcinoma) is vizsgálták a hisztamin receptorok jelenlétét, és a hisztamin proliferációra gyakorolt hatását (3. táblázat). Az egyes sejtvonalakon különböző hisztamin hatásokat észleltek, melyet valószínűleg a sejtek genetikai heterogenitása magyaráz. Sejtvonal

Hisztaminreceptorok

A hisztamin hatása A sejt proliferációra

Hasnyálmirigy carcinoma H1R és H2R Panc-1 (74)

Kis koncentrációban fokozta, nagy dózisban gátolta

Gyomorrák MKN-45, MKN-45G (75)

H2R

Fokozta

Vastagbél adenocarcinoma H2R C-170 (76)

Fokozta

Vastagbél adenocarcinoma H2R CT-26 (60)

Nem befolyásolta

3.táblázat: Hisztamin receptorok expressziója és a hisztamin hatása humán gastrointestinalis daganatokból származó sejtvonalakra

21

Számos kísérlet és klinikai vizsgálat irányult annak megismerésére, hogy a mindennapi gyakorlatban alkalmazott H1- és H2-antagonistáknak milyen hatásuk van a daganatsejtek osztódására, a tumor növekedésére, és ezáltal a betegség kórlefolyására, illetve a betegek túlélésére (62). A gyomornyálkahártyában a hisztaminnak fontos szerepe van a gastrin által stimulált gyomorsav- szekréció mediálásában, melyet a H2-receptorokon keresztül fejt ki. A gastrin az enterokromaffin sejtekben fokozott HDC-expressziót és aktivitást idéz elő, ezáltal fokozódik a hisztamin termelése és felszabadulása (77). Állatkísérletekben megfigyelték, hogy a H2-antagonisták hosszú távú adagolásakor gyomor carcinoid alakulhat ki, embereken ezek a gyógyszerek nem növelték az ilyen típusú tumorok kialakulásának gyakoriságát (78-79). Humán vizsgálatokban nem találtak ok-okozati összefüggést a szérum hisztamin-szintje és a carcinoid tumorok kialakulása között, illetve H2-antagonisták szedése nem fokozta a gyomorrák kialakulását (79-81). Felmerült, hogy H2-antagonisták és hisztamin kombinált adásával ki lehetne védeni a hisztamin immunszupresszív hatását, és ugyanakkor a H1R-on keresztül érvényesülhetne a hisztamin tumorellenes hatása (62). Nagy dózisú H2-blokkoló (cimetidin vagy ranitidin) és hisztamin szubkután kombinációját alkalmazták aktív onkoterápiára már nem alkalmas gyomorrákban szenvedő betegek esetében. A H2-antagonistával kezelt betegeknél a túlélés szignifikáns meghosszabbodását észlelték a csak szupportív kezelésben részesült betegekhez képest, és a legtöbb esetben a tumor mérete is állandósult (82). Egy vizsgálatban intravénásan alkalmazott cimetidin monoterápia is meghosszabbította a gyomorrákos betegek túlélését (83). A ranitidin a cimetidinnél hatásosabb H2antagonista a parietális sejteken, ennek ellenére két olyan multicentrikus vizsgálatot is közöltek, ahol ranitidin adása után nem következett be szignifikáns javulás a gyomorrákos betegek túlélési idejében (84-85). A fentieket összegezve, jelenleg nem áll rendelkezésre elegendő bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a H2-antagonista kezelés önmagában vagy hisztaminnal kombinálva hatásos lenne a gyomorrákos betegek kezelésében.

22

2.5.Colorectalis tumorok és a hisztamin 2.5.1.A vér hisztamin szintje, mint lehetséges tumor marker Számos humán szolid tumorszövetben találtak emelkedett hisztamin-szinteket, ennek ellenére a daganatos betegek szérumában szignifikánsan alacsonyabb hisztamin-szinteket mértek, mint az egészséges egyénekében (86). Továbbá, ismeretes egy olyan vizsgálat melyben szignifikánsan alacsonyabb szérum hisztamin értékeket mértek olyan esetekben, amikor nem történt meg a primér tumor eltávolítása és/vagy metasztázisok voltak jelen. Az utánkövetés ideje alatt a vér hisztamin szintjének csökkenése megelőzte a klinikailag manifeszt metasztázisok megjelenését. A CEA (carcino-embrionális antigén) meghatározás mellett a szérum hisztaminszint további értékes információkat nyújtott a recidívák korai jelzésének tekintetében. Feltételezik, hogy egyes szolid tumorok esetében az utánkövetési időszakban a szérum hisztamin akár érzékenyebb marker is lehetne, mint a CEA (86). Kisebb betegszámon emlő- és vastagbélrákos betegek szérum hisztamin szintjeinek meghatározásával is hasonló eredményeket találtak, és azt a következtetést vonták le, hogy a szérum hisztamin-szint egy értékes, de nem specifikus markere a daganat kialakulásának és a betegség progressziójának (87). Vastagbél carcinomák esetében azt vizsgálták, hogy a szérum hisztamin szintje mennyire pontosan képes jelezni a primer tumor jelenlétét. A colorectalis tumoros betegek szérumszintje szignifikánsan alacsonyabb (134.5 ± 90.3 nM) volt a kontrollcsoporténál (egészséges egyének esetében 180.12 ± 70.4 nM), viszont egyáltalán nem találtak korrelációt a tumor stádiuma és a hisztamin koncentrációja között. A hisztamin vérszintjének csökkenését a granulocitáknak az intravaszkuláris térből a peritumorális régióba irányuló migrációjával magyarázták (88). A vér hisztaminszintje, a klasszikus tumor markerek mellett (CEA és CA 19-9) a vastagbélrákok tumor markere lehet, és segítheti a klinikusokat a betegség monitorozásában. 2.5.2.Hisztamin tartalom a colorectalis tumorokban Colorectalis carcinomában több kutatócsoport mutatott ki hisztamint, általában a tumorban magasabb hisztamin tartalmat írtak le, mint a szomszédos egészséges

23

szövetben. Megfigyelték, hogy a hisztamin koncentráció magasabb volt az aktívan növekvő daganat széli részeiben, mint a tumor közepén és a nekrotikus részekben (89-90). Egy ilyen irányú vizsgálatban 31 colorectalis tumor minta hisztamin tartalmát mérték meg, a mintákat a tumorok széléről vették. A vastagbél tumorszövet hisztamin tartalmának középértéke 8,4 μg/g (7,6×10-5 M) volt, melyet elegendőnek tartottak ahhoz, hogy lokálisan immunszupressziót eredményezzen. A korábbi eredmények ugyanis azt mutatták, hogy a hisztamin 10-6 M-os koncentrációs küszöbérték felett gátolja a limfociták aktivitását. Bizonyos mintákban vizsgálva szignifikáns különbséget észleltek a tumor és az egészséges szövetminták hisztamin tartalma között. A rosszul differenciálódott tumorokban általában magasabb volt a hisztamin tartalom, mint a közepesen differenciálódottakban (91-92). Egy kisebb vizsgálat keretén belül HDC meghatározásokat végeztek műtét során nyert humán colorectalis carcinoma szövetben. A tumorszövetben majdnem kétszer nagyobb aktivitást mértek, mint a normál szövetben (90). Hasonló eredményeket írtak le egy újabb közleményben, és megfigyelték, hogy az áttétes tumorok esetében mind a hisztamin-szint, mind a HDC-aktivítás szignifikánsan magasabb volt, mint a lokalizált stádiumú tumorok (stád. I és II) esetében (93). 2.5.3.H2-antagonistákkal végzett vizsgálatok Több vizsgálatban leírták a H2-antagonisták direkt tumorellenes hatását, azaz, hogy gátolták a daganat növekedését, sőt ezen túlmenőleg meghosszabbították a colorectalis daganatos betegek túlélését. Legszélesebb körben a cimetidin hatásait vizsgálták. Vastagbél adenocarcinoma sejtvonalakon kimutatták, hogy a hisztamin magas koncentrációban, indirekt módon, immunológiai folyamatokat is gátol (lásd részletekben „Hisztamin hatása az immunrendszeren keresztül” című fejezetben). Ezeket a hatásokat cimetidin és más H2-antagonisták adásával ki lehet védeni (62). Állatkísérletben, cimetidin hatására vastagbél adenocarcinoma Ct-26 sejtvonalból származó xenograft növekedése szignifikánsan lelassult, a hatást a tumorban lévő citokinek szintjének (pl. LT-β, TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-15) csökkenésével magyarázták (94). C57BL/6 egerekbe oltott Colon 38 sejtvonalon kimutatták, hogy a H2-antagonisták (roxatidin és cimetidin) szignifikánsan csökkentették a szérum és a tumorszövet VEGF szintjét, a tumor kapilláris denzitását, nőtt a nekrotikus terület a tumorban, és csökkent a tumor növekedése (68). CMT93 vastagbéltumor-sejt modellen,

24

C57BL/6 egéren a cimetidin az endothelsejtekre az érképzés során direkt hatást fejtett ki, de nem befolyásolta a VEGF-szintet (69). Humán vastagbél tumoros betegekből származó dendritikus sejtek (DC) in vitro antigén prezentáló kapacitását növelte a cimetidin (95). A cimetidin antagonizálta a hisztamin tumorszövetet infiltráló limfociták számát csökkentő hatását is (62). Egy vizsgálatban kimutatták, hogy a cimetidin in vitro dózisfüggő módon blokkolta a humán vastagbéltumor-sejtek (HT-29) adhézióját az endothelsejtekhez (HUVEC), in vivo pedig csökkentette a májmetasztázisok incidenciáját HT-29 tumoros nude egéren. A cimetidin antimetasztatikus hatását az E-szelektin gátlásával magyarázták (71,72). Ezeket a megfigyeléseket humán klinikai vizsgálatban is megerősítették, mivel azon betegeknél, akiknek tumorában magas volt az E-szelektin ligandjának, a szialil Lewis antigénnek a szintje, különösen hatékony volt a cimetidin kezelés, és csökkent a metasztázisok és a lokális kiújulások aránya. Feltételezték, hogy a cimetidin emberben is gátolja a tumor sejtek adhézióját az endothelsejtekhez, így megelőzheti a metasztázis képződését (73). H2-antagonisták vastagbél tumorokban történő alkalmazására vonatkozó klinikai vizsgálatok és ezek eredményei az 4. számú táblázatban láthatóak. Colorectalis daganatos betegeknél a preoperatív szakban alkalmazott cimetidin terápia után, 3 éves utánkövetés adatai szerint javult a túlélés (96-97). Egy másik kutatócsoport is hasonló eredményeket közölt, posztoperatív cimetidin kezelés után a Dukes C stádiumú betegek túlélése meghosszabbodott (98). Egy vizsgálatban cimetidinből és 5-fluorouracilból (5FU) álló kombináció alkalmazásának hatékonyságát hasonlították össze az 5-FU monoterápiájáéval, és szintén a túlélés meghosszabbodását észlelték (99). Egy vizsgálatban a cimetidin kezelés viszont nem eredményezett változást a túlélésben (100). Vizsgálták a ranitidin és a famotidin hatását is a túlélésre, az egyik vizsgálatban nem volt jobb az össztúlélés, ezzel szemben az áttétes alcsoportban szignifikánsan meghosszabbodott túlélést figyeltek meg (101-103). Egy újabb vizsgálatban a famotidin terápia nem volt hatással a túlélésre, bár a famotidin fokozta a limfocita-infiltrációt a tumorszövetben (104). A klinikai vizsgálatok eredményeiből azt a következtetést lehet levonni, hogy a H2-antagonisták műtét utáni hosszú távú adagolása nem feltétlenül jár több előnnyel, mint a rövid távú perioperatív kezelés, amely kivédi a műtét során létrejövő

25

immunszupresszív hatást is (105). A H2-antagonisták, esetleg más gyógyszerrel való kombinációban

előnyösek

lehetnek

a

hisztamin

immunszupresszív

hatásának

kivédésében, és emellett a lokális immunválasz fokozásával védelmet jelenthetnek a tumor progressziója ellen.

Tumor stádium

H2A kezelés antagonista időzítése

BetegTúlélés szám

Korai stádiumú colorectalis

Cimetidin 400 mg

192

Dukes C p=0,11

Svendsen és mtsai (98)

Korai stádiumú colorectalis

Cimetidin 400 mg

preop. 1 hét postop.2 nap

34

3 éves túlélés 93% ill. 59% p<0,05

Adams és mtsai (97)

Korai stádiumú colorectalis

Cimetidin 800 mg

postop. 5-FU

64

3,9 éves túlélés p=0,025

Matsumoto és mtsai (99)

Korai stádiumú colorectalis

Ranitidin 100 mg i.v. majd 300 mg p.o.

preop. majd postop.

686

p=0,54

Nielsen és mtsai (101)

Korai stádiumú colorectalis

Cimetidin 400 mg vagy 800mg

preop. 5 nap

125

p=0,2

Kelly és mtsai (100)

Metasztatikus colorectalis

Ranitidin 300 mg

postop. 4 hét

25

p<0,03

Nielsen és mtsai (102)

Metasztatikus colorectalis

Ranitidin 150 mg

postop. 5-FU

117

p=0,2

King és mtsai (106)

Referencia

4.táblázat: H2-antagonistákkal végzett randomizált kontrollált klinikai vizsgálatok vastagbéltumorban 2.5.4.Colorectalis adenomák és tumorok közötti összefüggés A colorectalis daganatok magas incidenciájuk miatt világszerte népegészségügyi problémát jelentenek. A korai stádiumban diagnosztizált colon carcinoma gyógyítható, a betegség prognózisa részben a bélfali érintettség kiterjedésétől, részben a nyirokcsomók beszűrtségétől függ. A műtétet követő adjuváns kemoterápiák ellenére még mindig sok esetben alakul ki relapszus (107).

26

Dukes stádium

TNM rendszer szerint

Jellemzők

Dukes A

T1N0M0 vagy T2N0M0

T1: a tumor a submucosát infiltrálja T2: a tumor a muscularis propriát infiltrálja

Dukes B

T3N0M0 vagy T4N0M0

T3: a tumor a subserosát érinti vagy a pericolicus, ill. perirectalis szövetekbe terjed T4: a tumor a környező szerveket infiltrálja vagy a visceralis peritoneumot perforálja

Dukes C

BármelyT N1-2 M0

Regionális jelenléte

Dukes D

BármelyT Bármely N M1

Távoli áttétek jelenléte

nyirokcsomó

áttétek

5.táblázat: A colorectalis tumorok Dukes stádium szerinti osztályozása (N0: nincs nyirokcsomó áttét, N1: 1-3 nyirokcsomóban áttét, N2:≥ 4 nyirokcsomóban áttét) A klinikai gyakorlatban a colorectalis carcinomák terápiás stratégiájának meghatározása stádiumbesorolás alapján történik, melyet jelen tanulmányban nem részletezünk, tekintve, hogy a terápia nem képezi dolgozatunk tárgyát. Az adenomák, az ún. neoplasztikus típusok nem tartoznak a malignus tumorok közé, azonban a carcinogenesis állomását képezhetik. Jóindulatú epitheliális tumorok, amelyek szerkezetük alapján lehetnek tubulárisak vagy villosusak illetve tubulovillosusak (108-109). Az adenomák három típusát különböztetik meg, a leggyakoribb a tubuláris adenoma (64-75%), a tubulovillózus típus 20-27%-ban fordul elő és a legritkább a villózus adenoma (5-8%)(110). Egy adenoma malignizálódási készsége annál kifejezettebb, minél nagyobb a mérete (1 cm felett), és minél több villosus komponenst tartalmaz. A vastagbélrák rizikója nagymértékben csökkenthető az adenomák, különösen a villózus típusúak, felkutatása illetve eltávolítása által (111). 2.6.CD8+ limfociták a tumorokban A tumorellenes immunválasz mechanizmusai szorosan kötődnek a CD8+ sejtek szerepéhez, melyek effektor sejtekké differenciálódhatnak, és ilyen minőségükben

27

előidézhetik a daganatsejtek pusztulását. A tumorantigénekre specifikus, szerzett immunválasz kialakulásában a CD8+ citotoxikus T-sejtek játsszák a fő szerepet. A tumorsejtek felszínén megjelenő MHC-I-peptid komplexeket felismerő citotoxikus T-limfociták direkt sejtölő mechanizmusok révén fas-dependens és -independens úton egyaránt kiválthatják a tumorsejtek pusztulását. A tumor antigének ellen hatásos T-sejtek

a

daganatos

betegek

vérében,

a

tumorszövetben

és

a

környező

nyirokcsomókban is kimutathatóak. Ennek ellenére a tumorok immunbiológiai hatások következtében létrejövő spontán regressziója nagyon ritka, az effektor T-limfociták jelenléte nem vezet önmagában a tumor eliminációjához. Az epitheliális tumorok többsége expresszálja a MIC fehérjéket, amelyek a CD8+ T-sejt specifikus receptorához kötődnek. A tumorellenes celluláris immunválasz hatékonysága azért is korlátozott, mert a daganatos betegekben sokszor csak funkcionálisan inaktív tumor specifikus T-limfociták vannak jelen (112).

28

3.CÉLKITŰZÉSEK Doktori munkám célja a hisztamin és a colorectalis carcinoma kapcsolatának vizsgálata a hisztamin metabolizmus és a hisztamin receptorok megoszlásának analízisén

keresztül.

adenocarcinomában

A

hisztamin

vizsgáltam

a

metabolizmust normál

vastagbél

vastagbél

adenomában

nyálkahártya

és

hisztamin

metabolizmusával összehasonlítva. Az irodalom erre vonatkozó adatokat csak az adenocarcinoma esetében szolgáltat. A közölt vizsgálatokban mérték a hisztamin metabolizmusában résztvevő enzimek (HDC és DAO) aktivitását és fehérjeszintjét, illetve

ezek

fehérjeszintű

expresszióját.

A

hisztamin

receptorokat

malignus

sejtvonalakon, állatkísérletekben és humán tumorokban egyaránt indirekt módon vizsgálták, agonisták illetve antagonisták használatával. A hisztamin receptorok megoszlását a gastrointestinalis traktusban 2006-ban ismertették először. Leírták a receptorok expresszióját, illetve ezek változását gyulladásos bélbetegségben (IBD) és ételallergiában, viszont nem végeztek összehasonlító vizsgálatokat a normál mucosával. A hisztamin metabolizmusát és a hisztamin receptorok megoszlását colorectalis adenomában és adenocarcinomában más munkacsoportok nem vizsgálták. Vizsgálataink célkitűzései a következők voltak: •

A hisztamin és a colorectalis carcinoma kapcsolatának vizsgálata a hisztamin metabolizmus és receptorok megoszlásának analízisén keresztül vastagbél adenomában, adenocarcinomában és a normál nyálkahártyában.

•

A hisztamin koncentráció és a hisztamin metabolizmus enzimeinek (HDC és DAO) összehasonlító vizsgálata vastagbél adenomában, adenocarcinomában és a normál nyálkahártyában.

•

A hisztamin receptorok (H1R-H4R) expressziójának és megoszlásának vizsgálata vastagbél adenomában, adenocarcinomában és normál mucosában.

•

A hisztamin receptorok (H1R- H4R) expressziójának összehasonlító vizsgálata Dukes stádiumok szerint klasszifikált colorectalis tumorokból származó daganatmintákban és normál nyálkahártyában.

•

CD8+ T-limfociták immunhisztokémiai vizsgálata vastagbél adenomában és adenocarcinomában.

29

A fenti vizsgálatok eredményeit elemezve közelebb juthatunk annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy milyen lehetséges szerepe van a hisztaminnak és a hisztamin receptorok eltérő megoszlásának a vastagbélrákok kialakulásában és progressziójában.

30

4.ANYAG ÉS MÓDSZEREK 4.1.Betegek és szövettani minták gyűjtése Az immunhisztokémiai vizsgálatok (HDC és CD8+ T-limfocita) a Szent Margit Kórház Pathológiai Osztályán készült, formalinban fixált és paraffinba ágyazott szövettani blokkok metszeteinek felhasználásával történtek. Kontrollként normál appendix mintákat használtunk. A HDC Western blot analíziseket, a hisztamin méréseket és a DAO aktivitás meghatározását a Szent Margit Kórház Gastroenterológiai Osztályán colonoscopiás vizsgálatok során nyert vastagbél tumor- és polypmintákból végeztük. Minden esetben megtörtént a bioptátumok szövettani kiértékelése is. Kutatásaink első szakaszában H1R és H2R RT-PCR vizsgálatokat is végeztünk, szintén biopsziás mintákból (6. táblázat). A vizsgált paraméter

Módszer

Vizsgált minták száma Tumor

Polyp

Hisztamin

HPLC

20

20

HDC

Immunhisztokémia Western blot

40 20

20 10

DAO

Enzim aktivitás mérés

20

10

H1R és H2R

RT- PCR

20

–

H1R- H4R biopsziás mintákból

Western- blot

20

18

H1R, H2R és H4R műtéti mintákból

valósidejű RT-PCR 40 Western- blot 40

CD8+T limfocita

Immunhisztokémia

12

– – 12

6.táblázat: Hisztamin metabolizmus, hisztamin receptorok és CD8+ limfociták vizsgálatában használt minták

31

Előzetes vizsgálatainkat követően Dukes stádiumok szerint klasszifikált colorectalis tumormintákból és a hozzájuk tartozó normál mucosa mintákból végeztünk részletes hisztamin receptor analíziseket valósidejű RT-PCR, Western blot és immunhisztokémiai módszerek alkalmazásával. A mintákat az Uzsoki Kórház Sebészeti Osztálya bocsájtotta rendelkezésünkre (Sebészeti Osztály szövettani minta Biobank). A betegek és a tumorok paramétereit (nemek szerinti megoszlás, életkor, tumor típusa, szövettani típus és grade) a 7. számú táblázatban foglaltuk össze. A kísérleti munkák elvégéséhez TUKEB engedéllyel (SE és Uzsoki Kórház) rendelkeztünk.

Nem

Nők

Férfiak

Életkor (átlag, évek)

69.1±10.0 67.9±10.6

Colon tumor

83 %

94 %

Végbél tumor

17 %

6%

Grade I

8%

17 %

Grade II

75%

44 %

Grade III 0% 17 % 7.táblázat: Betegek és vastagbéltumor paraméterek (betegszám=40)

4.2.RT- PCR technikák 4.2.1.RT- PCR H1R és H2R RT PCR RNS preparáláshoz a -80ºC hőmérsékleten vagy folyékony nitrogénben tárolt mintákat homogenizáltuk (Heidolph Instruments DIAX 100, Schwabach, Germany), majd a sejttörmelék eltávolítása céljából lecentrifugáltuk (10.000 rpm, 20 perc, 4 ºC). A felülúszóból TRI-reagenssel (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, MO) totál RNS preparálást végeztünk a gyártó útmutatása alapján. Az izolált RNS-t -80 ºC-on tároltuk. Az RNS mennyiségét spektrofotométerrel (Spectronic Genesys 2, Spectronic Instrument

32

INC, Rochester NY USA) megmértük, és a mintákon DN-áz kezelést végeztünk a gyártó leírása alapján (Promega, Madison, WI). Az RT reakcióhoz 2 µg total RNS-t használtunk és a mintákat cDNS-re írtuk át random hexamer primerek használatával, szintén a gyártó előírása szerint (Promega, Madison, WI, reverz transzkripciós rendszere). A cDNS mintákat a PCR reakció elvégzéséig -20 ºC hőmérsékleten tároltuk. A PCR reakcióhoz a következő programot használtuk: 95 ºC – 4 perc majd 35 ciklus (95ºC – 30 sec, 58 ºC – 30 sec, 72º C – 30 sec) 72ºC – 5 perc: H1R és H2R esetében. A PCR reakciót Perkin-Elmer thermo-cycler készülékben végeztük. A specifikus szensz és antiszensz primerek az alábbiak voltak: H1R: TGGTCACAGTAGGGCTCAAC

CAAGGTGGGCAGGTAGAAGT

H2R: TCGTGTCCTTGGCTATCAC

CCTTGCTGGTCTCGTTCCT

4.2.2.Valósidejű RT- PCR H1R, H2R, H3R és H4R valósidejű RT-PCR A carcinoma és a normál colon szövetminták homogenizálását (Heidolph Instruments DIAX 100, Schwabach, Germany), és centrifugálását (10.000 rpm, 20 perc, 4° C) követően az RNS izolálás TRI-reagenssel (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, MO) történt a felülúszóból, a gyártó előírása alapján. Az izolált totál RNS-t (1μg) DN-ázzal kezeltük (Promega, Madison WI, azaz DNS mentesítés a gyártó útmutatása szerint), majd a mintákat cDNS-re írtuk át random hexamer primerek használatával a gyártó utasítása szerint (Promega, Madison, WI, reverz transzkripciós rendszere). A humán hisztamin-receptor gének (H1R, H2R, H3R és H4R) összehasonlító vizsgálatához TaqMan próbákat és „housekeeping” génként a humán 18S RNS gén próbát használtuk (Applied Biosystems, Foster City, CA, Assay on Demand service). A valósidejű RT- PCR kivitelezésére AbiPrism 700 thermal cycler készüléket használtunk (Applied Biosystems, Foster City, CA). A hisztamin receptor gének expressziós értékeinek kiszámításához, a 18S RNS gén expresszió szintjéhez viszonyított és normalizált összehasonlító Ct (ΔCT) módszert alkalmaztuk, és az értékeket a 18S RNS expresszió szintjének százalékában fejeztük ki.

33

4.3.Fehérje izolálás és Western blot analízis 4.3.1.Fehérje izolálás és mérés A normál, adenoma és adenocarcinoma biopsziás mintákat és a Biobankból származó normál és adenocarcinoma mintákat lízispufferben (10mmol/L TRIS-HCl (pH=8.0), 10 mg/ml Leupeptin, 0.5 mmol/L EGTA, 25 mmol/L PMSF, 2% NaF, 1% Triton X-100, and 2% Na-ortovanadát) homogenizáltuk. Centrifugálást (12.000 g, 20 perc 4 ºC) követően a felülúszóból Bradford módszer szerint (Spectronic Genesys 2, Spectronic Instrument INC, Rochester NY USA) spektrofotometriás fehérje meghatározást végeztünk. A fehérjemintákat alikvotokban felhasználásig -20 ºC, illetve -80ºC hőmérsékleten tároltuk. 4.3.2.Western blot Vastagbél tumorokban és adenomákban a fehérjéket (a HDC és a hisztamin receptorok

fehérjeszintű

expressziójának

vizsgálatakor

egyaránt)

SDS-PAGE

módszerrel szeparáltuk. A 12%-os akrilamid gél zsebeibe 10-15 μg hővel denaturált β-merkaptoetanollal kezelt fehérjét vittünk fel, majd a fehérjéket 35 mA áramerősség mellett kb. 1,5 óráig futtattuk. Molekulasúly markerként Rainbow markert (Amersham Life Science, UK) alkalmaztunk. Az elektroforézist követően a fehérjéket polivinilidén-difluorid membránra (Millipore) átvittük, azaz blottoltuk. HDC esetében pozitív kontrollként bazofil és melanoma sejtvonalat használtunk. Hisztamin receptorok esetében negatív kontrollként BSA-t (bovin serum albumin) alkalmaztunk, pozitív kontrollként az ép bélnyálkahártya szolgált. A blot-membránt egy órás blokkolást követően HDC kimutatására csirkében készült anti humán HDC, poliklonális IgY antitesttel (Promega, Madison, WI, 1:200-os hígítás) kezeltük, a hisztamin receptorok esetében pedig anti-humán nyúlban készült primer H1-, H2-, H3-, ill. H4-receptor antitestekkel (Alpha Diagnostic Intl. Inc., San Antonio TX) 1:200-os hígításban kezeltük a metszeteket. A kontrollként használt β aktin expressziót anti-aktin 1:200-os hígítású, nyúlban készült primer poliklonális ellenanyag (Sigma – Aldrich, Missouri, MO) használatával mutattuk ki. A 6x5 perces mosást követően a HDC esetében nyúlban készült csirke ellenes HRP jelölt másodlagos ellenanyagot (1:250-es hígítás, Promega, Madison, WI) míg a hisztamin receptorok esetében

34

szekunder ellenanyagként kecskében készült, peroxidáz-jelölt nyúl IgG-elleni antitesteket (1:2500-as hígításban, Promega, Madison WI) használtunk. A β-aktin expresszió esetében szekunder ellenanyagként kecskében készült HRP jelölt antitestet (Sigma-Aldrich, Missouri, MO, 1:100,000 hígítás) alkalmaztunk. Röntgenfilmre történő immuno-kemilumineszcens előhívást (ECL plus Western blotting Detection System, Amersham Biosciences, UK) követően az eredményeket denzitometriásan értékeltük ki (Chemilmager 5500 software, Alpha Innotech). A hisztamin receptorok expresszióját

a

„housekeeping”

kontrollként

alkalmazott

β-aktin

fehérjére

standardizálva grafikusan is ábrázoltuk.

4.4.Indirekt immunhisztokémiai reakciók 4.4.1.HDC enzim indirekt immunhisztokémiai kimutatása Immunhisztokémiai vizsgálatokra paraffinba ágyazott colorectalis adenoma és carcinoma minták 4-5 μm vastag metszeteit használtuk. Kontrollként appendix minták metszetei szolgáltak. A metszeteket deparaffináltuk (xylol, alkohol és PBS), majd endogén peroxidáz gátlást végeztünk (90 ml metanolban 1,5 ml H2O2 sötétben, 1 óra). Az antigén feltárására mikrohullámos (Sharp Electronics R- 2Y68, UK, 70%- os teljesítmény) 3x5 perces kezelést, vagy kuktában 2 perces kezelést alkalmaztunk TrisEDTA (pH 8,8) pufferben. Az aspecifikus kötődés blokkolására 2%-os BSA és 2% preimmun nyúlszérum ill. 2%-os BSA és 2%-os kecskeszérum keverékét használtuk (1 óra, sötétben, nedveskamrában). Kétféle humán, HDC elleni primer ellenanyagot használtunk. Az Intézet által a Promega céggel közösen, elsőként kidolgozott, csirkében termeltetett anti-humán HDC ellenes ellenanyagot (1:500 hígításban, Promega, Madison, WI), valamint nyúlban készült anti-humán rekombináns HDC ellenes ellenanyagot (1:2500 hígításban, ICN, Irvine, CA) használtunk. A primer ellenanyagot mosás nélkül a blokkoló oldatban alkalmaztuk (1 óra, sötétben, nedveskamrában). Háromszori 5 perces mosást követően a szekunder ellenanyagot (anti-csirke biotin jelölt, nyúlban készült 1:250-es hígításban, Promega, Madison WI, illetve anti-nyúl biotinilált, kecskében készült 1:300-os hígításban, Sigma –Aldrich, Missouri, MO) használtuk. A metszeteket nedveskamrában, sötétben 1 óráig inkubáltuk. Háromszori 5

35

perces mosást követően 1:400-as hígításban streptavidin/peroxidáz konjugátumot (Dako, Glostrup, Denmark) cseppentettünk a lemezekre és sötétben, nedveskamrában további 1 órán át inkubáltuk a metszeteket. A peroxidáz aktivitás detektálására VIP kitet (Vector laboratoires, Burlingame, CA) alkalmaztunk a gyártó utasításának megfelelően és a metszeteket az optimális színintenzitás előhívását követően csapvízben, majd desztillált vízben mostuk. Háttérfestésként a VIP kithez ajánlott 0, 5%-os metilzöld festést alkalmaztuk (Dako Glostrup, Denmark).

4.4.2.CD8+ indirekt immunhisztokémiai reakció Az immunhisztokémiai reakció elvégzésére a Szent Margit Kórház Patológiai Osztályán paraffinba ágyazott minták 4 μm –es (n=5) imunhisztokémiai célra készített, SuperFrost tárgylemezre felvitt metszeteit használtuk. A metszetek deparaffinálása az 1es pontban leírtakkal megegyező módon történt, úgyanúgy, mint az endogén peroxidáz enzim aktivitás gátlása. A citrát pufferben (pH 6) végzett feltárást követően a metszeteket egérben készült anti humán CD8 primer ellenanyaggal (Pharmingen, San Diego CA) 1: 100-os hígításban, 4 ºC-on, hűtőszekrényben, egy éjszakán át inkubáltuk. Következő lépésként a metszeteket a gyártó által előre hígított biotin jelölt másodlagos ellenanyaggal (multivalens, lóban készült, Immunothech,Vaudreuil-Quebec) sötétben, szobahőmérsékleten és nedveskamrában 30 percig kezeltük, majd végül a streptavidinperoxidáz konjugátummal (1:400-os hígítás, 30 perc, szobahőmérséklet) inkubáltuk. A peroxidáz aktivitás detektálására VIP kitet (Vector laboratoires Burlingame, CA) alkalmaztunk a gyártó utasításának megfelelően és a metszeteket az optimális színintenzitás előhívását követően csapvízben, majd desztillált vízben mostuk. Háttérfestésként a VIP kithez ajánlott 0.5%-os metilzöld festést alkalmaztuk (Dako Glostrup, Denmark).

4.4.3.Hisztamin receptor (H1R, H2R, H4R) immunhisztokémiai reakció Az immunhisztokémiai reakció elvégzésére az Uzsoki Kórház Sebészeti Osztályán végzett műtétek során nyert és paraffinba ágyazott colorectalis tumor mintáknak 4 μm –es (n=40) immunhisztokémiai célra készített, SuperFrost

36

tárgylemezre felvitt metszeteit használtuk. A metszetek deparaffinálása és az endogén peroxidáz enzim aktivitásának gátlása az 1-es pontban leírtakkal megegyező módon történt. A következő lépéseket nedveskamrában, sötétben és szobahőmérsékleten végeztük el. Az aspecifikus kötőhelyek blokkolására vagy a Novostain Universal detection kit (Novocastra Ltd. Newcastle, UK) blokkoló reagensét, vagy szintén ugyanezen cég új immunhisztokémiai kitjének (Novolink Polymer Detection System, Novocastra Ltd. Newcastle, UK) a blokkoló reagensét használtuk, a gyártó előírásának megfelelően. Az antigén feltárás citrát pufferben (pH 6,0) történt, mikrohullám (Sharp Electronics R- 2Y68, UK, 70%- os teljesítmény) felhasználásával 3x 4 percig. A lemezeket 5 perces PBS-ben történt mosást követően a humán hisztamin receptorok (H1R, H2R és H4R) elleni primer, nyúlban készült poliklonális antitestekkel (Alpha Diagnostic International, San Antonio, TX), inkubáltuk 60 percig, melyeket 1:250-es hígításban használtunk. Negatív kontroll esetében a primer ellenanyag helyett PBS-ben inkubáltuk

a

lemezeket,

izotípus

kontrollként

pedig

a

primer

ellenanyag

koncentrációjával megegyező koncentrációban nyúlszérumot használtunk. A további lépésekben a Novolink Polymer Detection kit reagenseit (második HRP jelölt ellenanyag, peroxidáz szubsztrát, hematoxilin) alkalmaztuk, a gyártó útmutatásai szerint. Az immunhisztokémiai reakció által kapott festődést Nikon Eclipse E600 (Nikon, Tokyo, Japan) mikroszkópban vizsgáltuk. 4.5.Hisztamin tartalom mérése HPLC módszerrel A minták előkészítése laboratóriumunkban történt, ezt követően a hisztamin HPLC meghatározást Dr. Bősze Szilvia és munkatársai végezték számunkra (ELTE, TTK, Szerveskémia Tanszék). A humán biopsziás normál, adenoma és adenocarcinoma mintákat (1mg szövet/1ml Bis-Tris-HCl puffer pH 7,0) homogenizáltuk (Heidolph Instruments DIAX 100, Schwabach, Germany) majd centrifugáltuk (10.000 rpm, 20 perc, 4°C), és a felülúszót használtuk hisztamin meghatározására. A minták HPLC mérésének (Knauer, reverz fázisú HPLC) előkészítésekor a mintákhoz 60%-os perklórsavat adtunk (150 μl minta + 7μl perklórsav), tekintve, hogy a hisztamin savas közegben stabil. A mérések elvégzéséig az így előkészített mintákat 4 ºC hőmérsékleten tároltuk. A mintákat közvetlenül a mérés előtt a pH visszaállításának céljából 2M KOHal kezeltük. Méréskor a mintákat és az OPA –t (ortho-phtalaldehyde) a HPLC oszlopra

37

injektáltuk (Hypersil SCX Duet, 5μm). Az eluensek az alábbiak voltak: A:50mM Na acetát puffer pH 7,0 B: metanol. A grádiensek: 15% B 0 percnél, 65% B 20 percnél, 40% B 30 percnél, 70% B 50-55 percnél, a sebesség: 0,8 ml/perc. Detektálás: Fluorescens detektorral 330 nm gerjesztés/450 nm emisszió (Shimadzu, Kyoto ,Japan). 4.6.DAO aktivitás mérés A homogenizált mintákat (Bis- Tris puffer pH 7,0 és 1mM PMSF) lecentrifugáltuk (4ºC, 2 min, 10000 xg). A felülúszót tiszta csőbe helyeztük át, újra lecentrifugáltuk (10 min, 15000 rpm 4ºC), és az így nyert felülúszót használtuk a DAO kimutatására

szolgáló

radiometriás

eljárás

során.

A

minta

fehérjetartalmát

spektrofotometriásan Bradford módszerrel mértük. Szubsztrátként 14C jelölt putreszcint használtunk. Az enzimaktivitás mérése során pufferként Na foszfát puffert (pH 7,5) használtunk és a csöveket 37 ºC-on 30 percig inkubáltuk. A reakciót 10%-os HClO4 és NaHCO3 puffer (pH 12,2) hozzáadásával állítottuk le. A jelölt terméket PPO/toluolban szétválasztottuk a szubsztráttól és centrifugálást követően (4ºC, 10000 rpm, 2 min,) 20 ml-es scintillációs küvettában 5 ml scintillációs folyadékban mértük (dpm, 4 min). Az enzimaktivitást U/mg fehérje értékben fejeztük ki és grafikusan ábrázoltuk. 4.7.Statisztikai analízisek Az egyes mérési eredmények kiértékeléséhez a következő statisztikai eljárásokat alkalmaztuk: 1. HDC fehérje expresszió (adenocarcinoma, adenoma és normál mintában vizsgáltuk) Western blot analízis kiértékelése: kétmintás kétoldalú t-próbával. 2. DAO enzimaktivitás mérése (adenocarcinoma, adenoma és normál mintában vizsgáltuk): egyutas ANOVA-t követő Tukey post hoc- teszttel. 3. Hisztamin koncentráció értékelése: Kruskal- Wallis teszttel. 4. Hisztamin receptor expresszió mérés valósidejű PCR módszerrel, denzitometriás analízissel: kétutas ismétléses varianciaanalízis (ANOVA).

38

5.EREDMÉNYEK 5.1.Hisztamin kimutatása adenomában és adenocarcinomában. Az irodalomból már ismert volt, hogy a colorectalis tumorokban emelkedett hisztamin

tartalom

mérhető.

Jóindulatú

adenomák

hisztamin

tartalmát

más

munkacsoportok korábban nem vizsgálták, erre vonatkozó adatok nem álltak rendelkezésre. Mérési eredményeink szerint az adenoma-szövet hisztamin tartalma nem különbözik a normál szövetétől. Ezzel szemben az adenocarcinoma mintákban szignifikánsan magasabb hisztamin szintet mértünk a normál nyálkahártyához viszonyítva, az irodalomban leírtakkal összhangban (4. ábra).

4. ábra: Hisztamin koncentráció adenomában és colorectalis carcinomaban a normális mucosához viszonyítva (* p<0,01) A humán colon tumor mintákban átlagban 8,95 ± 3,16 nmol/mg szövet hisztamin tartalmat mutattunk ki HPLC módszerrel. Eredményeink szerint humán colorectalis tumorra magas hisztamin tartalom jellemző (9. táblázat), az irodalomban leírtakkal összhangban. A HPLC módszer validálására humán bazofil és melanoma (primer tumorból és áttétszövetből származó) sejtvonalakat használtunk, ugyanis ezekben már korábban igazoltuk mind a hisztamin mind a HDC aktivitás jelenlétét (20). A humán bazofil és melanoma sejtvonalak hisztamin koncentrációját a 9. számú táblázatban szintén feltüntettük, tájékoztatás céljából.

39

Hisztamin tartalom

Szövettípus

(átlag érték)

Colorectalis adenocarcinoma (n=20)

8,95±3,16 nmol/mg szövet

Colorectalis adenoma (n=20)

0,89±0,21 nmol/mg szövet

Sejtvonal típusa Humán bazofil sejtvonal KU 812F

1,52 nmol/106 sejt

Humán primér melanoma sejtvonal WM 983

1,1 nmol/106 sejt

Humán metasztatikus melanoma sejtvonal M 1/15 1,22 nmol/106 sejt

8.táblázat: Hisztamin tartalom átlag értékei colorectális carcinomában és humán sejtvonalakban

5.2.A

hisztamin

metabolizmus

enzimjeinek

(HDC

és

DAO)

kimutatása

adenomában és adenocarcinomában. 5.2.1.A HDC enzim kimutatása immunhisztokémiai módszerrel. A paraffinba ágyazott vastagbél- és végbél adenocarcinoma mintákban indirekt immunhisztokémiai módszerrel végeztünk HDC enzim kimutatást. Eredményeink szerint a rosszindulatú daganatminták 90 % -a bizonyult HDC pozitívnak. Erős pozitívitást a minták 25%-ban, közepes festődést a minták 30%-ában, és gyengébb reakciót a minták 35%- ában észleltünk (10. táblázat).

40

HDC

HDC pozitív

Adenocarcinoma (%, n=40)

Adenoma (%, n=20)

Gyenge pozitivítás 35%

0%

Közepes pozitivítás 30%

0%

Erős pozitivítás HDC negatív

10%

25%

100 % 0%

9.táblázat: HDC immunhisztokémia eredménye colorectalis adenocarcinoma és adenoma mintákban A tumormintákban, a daganatsejtekben kimutatott intenzív festődés mellett a stromában is HDC pozitív sejteket találtunk, ez valószínűleg tumorszövetet infiltráló sejtek, mint pl. limfociták és hízósejtek populációinak jelenlétével függött össze. Adenocarcinomában a tumorsejtek erősebb festődést mutattak, mint a stroma sejtei. Ezzel szemben az adenoma szövetek 100%-ában észleltünk erős HDC pozitívitást. A jóindulatú polyp mintákban az epitheliális sejtekhez hasonlóan jelentős festődés volt megfigyelhető a stroma sejtekben is. Az adenocarcinoma mintákban intenzívebb festődés a tumorsejtekben volt megfigyelhető, míg az adenoma minták esetében a stroma sejtjeiben észleltünk erősebb pozitívitást (5. ábra). A pozitív kontrollként használt appendix mintákban az enterokromaffin sejtek intezív festődése látható az 5. számú ábra 5A paneljén.

41

A

B

D

C

5. ábra: Adenoma és adenocarcinoma minták indirekt immunhisztokémiai reakciója HDC kimutatására. 5A. appendix kontroll: erősen HDC pozitív enterokromaffin (nyíl). 5B. adenocarcinoma minta: HDC pozitív tumorsejtek (pont végű nyíl). 5C. adenoma minta: HDC pozitív hámsejtek és stromasejtek (szaggatott nyíl). 5D. izotípus kontroll (M:400x.)

42

5.2.2.A HDC enzim kimutatása Western blot analízissel

Előzetes vizsgálatainkban colorectalis tumormintákban (n=20) Western blot analízissel is igazoltuk a HDC fehérje jelenlétét. A HDC fehérje monomer formája többnyire 50-53 kDa molekulasúlyú, de sejttípustól függően a 63 kDa, esetleg a 74 kDa molekulasúlyú forma is kimutatható. HDC Western blot vizsgálataink során az 53 kDa molekulasúlyú HDC fehérje monomer formájával találkoztunk, az irodalmi adatokkal összhangban (6. ábra). Pozitív kontrollként M1/15 melanoma sejtvonalat használtunk, amelyben már előzőleg igazoltuk a HDC fehérje jelenlétét Western blot analízissel.

1

2

3

4

5 – 53 kD

6. ábra. HDC fehérje kimutatás Western blot módszerrel 1: M1/15 melanomasejtvonal. 2, 3, 4, 5: reprezentatív tumor biopsziás minták

További kísérleteink során a HDC fehérje kimutatását biopsziából származó adenoma mintákon (n=10) és újabb adenocarcinoma mintákon (n=20) is elvégeztük. Eredményeink a 7-es számú ábrán láthatóak. Eredményeink szerint mind adenomában (7. ábra A panel), mind adenocarcinomában (7. ábra B panel) kimutatható volt a HDC fehérjeszintű expressziója.

43

1

2

3

4

5

6

7

8

9 53 kD

A 1

2 3 4 5 6 7 8

9 53 kD

B 7. ábra: Adenoma és adenocarcinoma biopsziás minták HDC Western blot analízis eredményei. A panel: reprezentatív normál szövet és adenoma minták. Normál szövet: 1, 3, 5, 7. Adenoma: 2, 4, 6, 8, 9. B panel: reprezentatív normál szövet és adenocarcinoma minták. Normál szövet: 1, 2, 3. Adenocarcinoma: 5, 6, 7, 8, 9. A 4-es sáv: Rainbow marker A HDC Western blot fehérje kimutatásokat denzitometriás analízisekkel is kiértékeltük. A denzitometriás analízisek alapján az adenocarcinomában és az adenomában egyaránt emelkedett fehérjeszintű HDC expresszió volt megfigyelhető. A normál nyálkahártya HDC expressziójához képest magasabb HDC expresszió ugyan sem adenomában, sem adenocarcinomában nem érte el a szignifikancia szintet, de az eredmények tendencia értékűek voltak (8. ábra). Adenocarcinomában mért eredményeink összhangban vannak az irodalmi adatokkal, melyek szerint emelkedett HDC aktivitás mutatható ki a colorectalis tumorokban. Vastagbél adenomában ezidáig nem vizsgálták a HDC fehérjeszintű expresszióját.

44

8. ábra: HDC Western blot denzitometriás eredmények. A panel: normál nyálkahártya és adenoma. B panel: HDC denzitometria normál mucosa és carcinoma mintákban 5.2.3.A DAO enzim aktivításának kimutatása A colorectalis traktusban a hisztamint metabolizáló fő enzim a diaminooxidáz (DAO), egy kevésbé jelentős enzim, a hisztamin N-metil transzferáz (HNMT) mellett. Irodalmi adatokkal összhangban, szignifikánsan alacsonyabb DAO aktivitást mértünk adenocarcinomában (n=20) mint a normál szövetben (n=20). A vizsgált 10 adenoma mintában nem észleltünk szignifikánsan eltérő DAO aktivitást a normál szövethez

45

képest. Az adenoma DAO aktivitását korábban más munkacsoportok nem vizsgálták (10. ábra).

9. ábra: DAO aktivitás normál mucosában, adenomában és carcinomában (* p<0,01)

5.3.A hisztamin receptorok vizsgálata adenocarcinomában és adenomában 5.3.1.RT-PCR vizsgálat eredményei adenocarcinomában Kísérleteink kezdetén RT-PCR vizsgálattal igazoltuk H1- és H2-receptorok jelenlétét 20 adenocarcinoma mintában. A 10. ábrán egy reprezentatív tumorminta H1R és H2R expressziója látható. További kísérleteink során adenoma- és Dukes stádium szerint klasszifikált malignus tumorokból származó adenocarcinoma mintákban vizsgáltuk a hisztamin receptorok megoszlását.

46

1

H1R

H2R

700 bp 350

10. ábra: H1R és H2R kimutatása RT-PCR vizsgálattal. 1: DNS létra

5.3.2.Western blot analízis eredményei adenocarcinomában és adenomában

Western blot analízissel a négyféle hisztamin receptor közül hármat (H1R, H2R és H4R) mutattunk ki a normál mucosában, adenomában és adenocarcinomában. A 11. ábrán hisztamin receptorok (H1R, H2R és H4R) fehérjeszintű expressziójának reprezentatív blot képei láthatóak (adenoma és adenocarcinoma biopsziás minták). A normál mucosa minták pozitív kontrollként szolgáltak. A normál mucosa receptor expressziójához képest a tumorok esetében többnyire kisebb mértékű H1R és H4R expresszió volt megfigyelhető. Ezzel szemben az esetek nagy többségében nem észleltünk különbséget az adenoma és a normál nyálkahártyaszövet hisztamin receptor expressziója között. H3R jelenlétét csak igen kevés mintában, és csak nyomokban tudtuk kimutatni (az eredményeket ábrán nem tüntetjük fel). A receptorok fehérjeszintű expresszióját tekintve nem észleltünk különbséget adenomában a normál mucosához képest. Kísérleteinket Dukes stádiumok szerint klasszifikált tumorminták analíziseivel folytattuk.

47

11. ábra: Adenoma és adenocarcinoma biopsziás minták hisztamin receptor Western blot eredményei. A: normál szövetminták: 1, 3, 5, 7, 9, 11. Adenoma minták: 2, 8. Adenocarcinoma minták: 4, 6, 10, 12. B: H2R reprezentatív Western blot kép. C: β aktin kontroll. M vagy RM: Rainbow marker

48

5.4.A hisztamin receptorok vizsgálata Dukes stádiumok szerint klasszifikált tumorokból származó mintákban 5.4.1.Valósidejű RT- PCR eredményei A hisztamin receptorok megoszlásának analízisét valósidejű RT- PCR vizsgálatokkal folytattuk. A vizsgálatokat Dukes stádiumok szerint osztályozott 40 tumorból származó adenocarcinoma mintából végeztük. Dukes stádiumonként (Dukes A, B, C és D) 10- 10 minta vizsgálatát végeztük el. A betegek és a tumorminták paraméterei az „Anyag módszer” fejezetben kerültek leírásra. A receptorok messenger RNS-szintű expressziójának kimutatását a normális szövetmintákkal (ugyanabból a betegből

származó)

történő

összehasonlító

analízis

módszerével

végeztük.

Eredményeink szerint a vizsgált 4 hisztamin receptor (H1R-H4R) közül a H1R, a H2R és a H4R volt kimutatható valamennyi normál és adenocarcinoma mintában (12. ábra). A tumorokban a normál mucosában mérthez képest lényegesen eltérő hisztamin receptor expressziót találtunk. A H1R és H4R szintje (A és D panel) szignifikánsan alacsonyabb volt a tumorokban a normál mintákhoz képest (p<0,001). A H1R és H4R- okra vonatkozó expresszió a 12. számú ábra A és D paneljén látható. A H2R esetében nem találtunk szignifikáns változást (p=0, 05) a normál mucosa receptor expressziójával történt összehasonlítás során. A H3R csak néhány mintában (3/38, azaz 7,9%) volt kimutatható (C panel). Nem találtunk összefüggést a receptor expresszió eltérő szintje és a tumorok Dukes stádiuma között, azaz minden stádiumú tumorra azonos hisztamin receptor expresszió volt jellemző.

49

12. ábra: Hisztamin receptorok valósidejű RT- PCR eredményei. A H1R (A panel) és a H4R (D panel) mennyisége a tumorokban alacsonyabb volt a normál mintákhoz képest (p<0,001). A H2R (B panel) expresszió nem mutatott szignifikáns változást. A H3R (C panel) csak néhány mintában volt kimutatható

5.4.2.Western blot analízisek eredményei A Dukes stádiumok szerint válogatott tumorminták Western blot analíziseinek eredményei alátámasztották a valós idejű RT-PCR vizsgálati eredményeket. Ezzel a metodikával is igazoltuk, hogy a négyféle hisztamin receptor közül fehérje szinten csak a H1R, a H2R és a H4R receptor expresszálódik (13. ábra). A valósidejű RT-PCR

50

vizsgálatok eredményeihez hasonlóan itt sem találtunk Dukes stádiumok szerinti különbséget. Továbbá, stádiumtól független közös jellemzőként a H1R és a H4R megváltozott a normális szövethez képest, míg a H2R változatlan maradt..

13. ábra. Hisztamin receptor fehérje expresszió normál mucosában és adenocarcinomában. A panel: normál colon mucosa: 1-4 és 13-16. Dukes stádium A: 5-6, 17-18, Dukes B: 7-8, 19-20, Dukes C: 9-10, 21-22 és Dukes D: 11-12, 23-24. B panel: reprezentatív H2R blot kép. C panel: β aktin kontroll.

51

A receptorok Western blot eredményeit denzitometriás analízissel is kiértékeltük. A denzitometria során a receptorok expresszióját a béta-aktin expressziós értékéhez standardizáltuk. Ahogyan a 14. számú ábra (A és B panel) mutatja, a tumormintákban a normál mucosához képest megváltozott H1R és H4R fehérjeszintű expressziót figyeltünk meg. A kiértékelésnél az azonos röntgen filmen egyszerre előhívott blottokon kimutatott receptorok értékeit hasonlítottuk össze. Egy röntgen filmre 3 immunoblot-ot tudtunk ráhelyezni. A 14. számú ábrán két reprezentatív blot eredményeinek grafikus ábrázolása látható, amelyek alapján a H4R expressziója tumorokban szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult, mint a normál szövetben (p< 0,001). A H1R fehérjeszintű kifejeződése nem szignifikáns (p=0,06), mégis tendencia értékű változást mutatott. A H2R fehérje szintekben nem volt szignifikáns változás a normál mucosához képest (p=0,36).

52

14. ábra: A hisztamin receptorok Western blot eredményeinek denzitometriás értékelése. A és B panel: 2 reprezentatív blot denzitometriás analízisének értékei

5.5.Hisztamin receptorok indirekt immunhisztokémiai kimutatása A hisztamin receptorok immunhisztokémiai vizsgálatának eredményeit a 15. ábrán mutatjuk be, egy Dukes D stádiumú vastagbél adenocarcinomából és a hozzá

53

tartozó normál mucosából, illetve submucosából származó minták reprezentatív metszetein. Az immunhisztokémiai kimutatások alátámasztották a génexpressziós vizsgálatok eredményeit, mindhárom receptor (H1R, H2R, és H4R) jelenléte kimutatható volt. A normál vastagbél mucosa minták esetében az epitheliális sejtekben és a lamina propriában is láthattunk H1R-, H2R-, illetve H4R- festődést. Intenzívebb pozitívitás volt kimutatható a H1R és H2R esetében. Bár a H4R is jelen volt a normál mucosa szövetminták jelentős részében, pozitívitása azonban kisebb mértékű volt a stromában a H1R és H2R-okhoz képest (15. ábra A, D és G panel). A submucosában mind a három receptor (H1R, H2R, és H4R) esetében gyengébb festődést észleltünk (15. ábra B, E és H panel). Az adenocarcinoma szövetben mind a három hisztamin receptor (H1R, H2R és H4R) kimutatható volt (15. ábra C, F és I panel). A tumormintákon belül a hisztamin receptorok jelenlétét mutató festődés a stroma sejtjeiben nem volt jellemző (15. ábra. C, F és I).

54

15 ábra: Hisztamin receptorok indirekt immunhisztokémiai kimutatása. A: normál mucosa H1R. B:normál submucosa H1R. C: adenocarcinoma H1R. D: normál mucosa H2R. E: normál submucosa H2R. F: adenocarcinoma H2R. G: normál mucosa H4R. H: normál submucosa H4R. I: adenocarcinoma H4R (M=200x)

55

5.6.CD8+

T

limfociták

immunhisztokémiai

kimutatása

adenomában

és

adenocarcinomában Korábbi eredményeink azt mutatták, hogy a HDC pozitív sejtek megoszlása különböző volt vastagbélrákban és adenomában. Adenomában a stromasejtek erősebb pozitívitást mutattak, mint az enterocyták. Irodalmi adatok alapján feltételeztük, hogy a stromasejtek között HDC pozitív T-sejtek vannak jelen. Indirekt immuncitokémiával adenomában CD8+ T-limfocitákat mutattunk ki, melyek arra utalnak, hogy a valóban HDC pozitív sejtek egyes populációit ezek a sejtek képezik. Ezzel szemben adenocarcinomában a stromasejtek közül csak néhány bizonyult CD 8 + T-limfocitának (16. ábra). A CD4 + T-sejtek immunhisztokémiai kimutatásakor nem találtunk különbséget az adenomák és adenocarcinomák között (ezeket az eredményeket nem mutatjuk).

A

B 16.ábra: CD8+ T-limfociták. A panel: adenoma. B panel: adenocarcinoma

56

5.7.Egy speciális eset ismertetése: multiplex lymphomatosus polyposis. A mintagyűjtések kapcsán az egyik biopsziás minta szövettani vizsgálatakor kiderült, hogy nem adenomáról van szó, hanem a vastagbél egy ritka kórképét, multiplex lymphomatosus polyposist diagnosztizáltunk. A 68 éves férfibeteg hasi fájdalom, fogyás, vashiányos anemia és occult gastrointestinalis vérzés miatt került felvételre kivizsgálás céljából. Colonoscopia során számos, különböző méretű vastagbél polypra derült fény. Gastroscopia negatív eredménnyel zárult, a kiegészítő mellkasi és hasi CT vizsgálatok patológiás méretű hiláris és retroperitonealis nyirokcsomók jelenlétét is igazolták. A polypok szövettani vizsgálata köpenysejtes eredetű nonHodgkin malignus lymphoma mellett szólt. A beteg mintáit nem vontuk be a hisztamin receptor analízisekbe. Az elvégzett immunhisztokémiai vizsgálatok (CD20, CD5, CD43 és cyclin D1 pozitívitás, CD79-alfa, CD3 és citokeratin negatívitása) is megerősítették a köpenysejtes lymphoma diagnózisát (17. ábra). Négy széria CHOP kemoterápia utáni kontroll colonoscopiás vizsgálat során a colonban a polypok már nem voltak láthatóak, komplett remisszió alakult ki. A multiplex lymphomatosus polyposis ritka klinikopatológiai tünetegyüttes. A gastrointestinalis tractus lymphomáinak 95%-a nonHodgkin-lymphoma, ezek kb. 25-50%-a extranodális eredetű (ezek közül a leggyakoribb a gastrointestinalis manifesztáció). Betegünk esetében a kemoterápia mind a colon tumormasszájában, mind a generalizált lymphadenomegaliában teljes regressziót eredményezett. Ezt a esetet klinikusként érdekesnek tartottam, ezért utaltam rá röviden a disszertációmban.

17. ábra Multiplex lymphomatosus polyposis colonoscopiás és szövettani képe. A panel: különböző méretű vastagbél polypok láthatóak a colonoscopiás képen. B panel: köpenysejtes non-Hodgkin-malignus lymphoma szöveti képe

57

6.MEGBESZÉLÉS A hisztamint, a szervezet egyik legfontosabb biogén aminját 1910-ben fedezték fel. A hisztaminról az első monográfiát 1930-ban közölték, azóta számos kutatás tárgyát képezte a hisztamin fiziológás és patológiás folyamatokban betöltött szerepének tisztázása. A hisztaminnak a gastrointestinalis rendszerben három jól ismert farmakológiai funkciója van, emellett a neurotransmisszióban, az immunválasz modulációjában és a sejtproliferációban betöltött szerepei is ismeretesek. A hisztamin évtizedek óta áll a kutatók érdeklődésének központjában, különös tekintettel metabolizmusának enzimeire (HDC, DAO és HNMT), a hisztamin receptorokra és a receptorok által aktivált intracelluláris jelátviteli útvonalakra. A hisztamin és a rosszindulatú daganatok közötti kapcsolat kérdése akkor került előtérbe, amikor kiderült, hogy a gyorsan proliferáló normális szövetekben és egyes benignus elváltozásokban egyaránt emelkedett hisztamin koncentráció mutatható ki (15,34). Számos adat áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a hisztamin direkt és indirekt hatásokon keresztül fokozza a tumorsejtek proliferációját, és végső soron a tumor növekedését segíti elő. A hisztamin, mint növekedési faktor, a tumorsejtre direkt hatást fejt ki, ugyanakkor, mint gyulladásos mediátor és immunmoduláns, szintén a daganatsejtek növekedésének irányába hat (18). A hisztamin emellett elősegíti a neoangiogenesist is, és gátolja a hatékony tumorellenes immunválaszt, ezáltal szintén elősegítve a tumor növekedését (65-67). A helyileg képződő hisztamint részben maguk a tumorsejtek, részben a peritumorális térben megjelenő immunkompetens sejtek termelik. Irodalmi adatok alapján a malignus tumorokban észlelt magas hisztamin-szint a lokális termelődés, az emelkedett HDC és a csökkent DAO vagy HNMT aktivitás együttes eredője lehet. A hisztamin szintézisében kulcsszerepet játszó HDC overexpresszióját számos rosszindulatú daganatban leírták, mint pl. colorectalis-, emlő-, gyomor- és tüdőcarcinomában, valamint bizonyos hematológiai betegségekben (8,19, 20-23). A hisztamin fokozza a vastagbél daganatok növekedését, erre vonatkozóan in vivo és in vitro kísérletek adatai szolgálnak bizonyítékul (59,125). Továbbá, ismert, hogy a colon tumorok a hisztamint termelő daganatok csoportjába tartoznak (23). 58

Humán vastagbél adenocarcinomában már korábbi vizsgálatokban is magasabb hisztamin tartalmat mutattak ki a normál szövethez képest, és ezt a hisztamin mennyiséget elegendőnek tartották ahhoz, hogy lokálisan immunszuppresszív hatást is előidézzen. Több közleményben is leírták, hogy colorectalis daganatokban magas a HDC aktivitás, majdnem kétszer olyan magas, mint a normál szövetben (90). Kimutatták, hogy a colon tumor sejtvonalakon a hisztamin hatásait a tumorsejt növekedésére a H2R-on keresztül fejtette ki. Korai és metasztatikus stádiumú colorectalis daganatos betegek bevonásával klinikai vizsgálatok is történtek pre- és/vagy posztoperativ időszakban alkalmazott H2R–antagonistákkal (cimetidin, ranitidin és famotidin), a legtöbb vizsgálatban a túlélés javulását írták le, de az eredmények még ellentmondásosak (81). A colorectalis tumorok és adenomák közötti kapcsolat is régóta ismert, elfogadott tény, hogy a prekancerózus elváltozásnak tekintett vastagbél adenomák bizonyos típusaiból adenocarcinoma alakulhat ki (110). Kutatásunk tárgyát a hisztamin metabolizmus és a hisztamin receptorok vizsgálata képezte humán vastagbél adenocarcinoma és adenoma mintákban. Kísérleteink kezdetén quantitatív hisztamin koncentráció meghatározásokat végeztünk HPLC módszerrel. Az irodalomból már ismert volt, hogy colorectalis tumorokban emelkedett hisztamin tartalom mérhető, ezzel szemben az adenomák hisztamin tartalmát korábban még nem vizsgálták (90). Az adenocarcinoma mintákban szignifikánsan magasabb hisztamin-szinteket észleltünk a normál nyálkahártyával összehasonlítva, az irodalomban leírtakkal összhangban. Az adenomaszövetben mért hisztamin mennyisége nem különbözött a normális szövet hisztamin tartalmához képest (114). Ahhoz,

hogy

teljesebb

képet

kapjunk

a

hisztamin

metabolizmusáról

adenocarcinomában és adenomában, kutatásainkat a HDC kimutatásával és a DAO aktivitás mérésével folytattuk. Colorectalis adenocarcinoma és adenoma mintákból immunhisztokémiai módszerrel és Western blot analízissel HDC kimutatást végeztünk. Vastagbél adenocarcinomában már korábban is igazolták a HDC fehérje jelenlétét Western blot módszerrel, azonban a HDC fehérje sejten belüli (in situ) kimutatása HDC ellenanyag hiányában nem történhetett meg (90). Az első HDC ellen termelt ellenanyag a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet és a Promega cég közös szabadalma volt. Immunhisztokémiai módszerrel mind adenocarcinomában, mind adenomában nagyfokú in situ HDC pozitivitást tudtunk kimutatni. Fontosnak érezzük azt a megfigyelésünket,

59

hogy maguk a daganatsejtek is jelentős HDC festődést mutattak, és ezáltal igazoltnak láttuk, hogy a tumorsejtek is termelhetnek hisztamint. A HDC jelenlétét nemcsak az adenoma epitheliális sejteiben és a tumorsejtekben észleltük, hanem jelentős HDC pozitivítást figyelhettünk meg a stromában, a malignus és a benignus elváltozásokban egyaránt.

Adenocarcinoma

esetében

a

HDC

festődés

kifejezettebb

volt

a

daganatsejtekben mint a stromában, adenomákban viszont a stromában figyelhettünk meg intenzívebb pozitívitást (113). A HDC immunhisztokémiai meghatározások során a lamina propriában észlelt, festődést mutató sejtek populációit tumorszövetet infiltráló sejtek, mint pl. T-limfociták, hízósejtek, stb. képezhették. A CD8+ citotoxikus T-sejtek szerepe vitathatatlan a tumorellenes immunválaszban. A CD4+, segítő (helper) T-limfociták elengedhetetlenül szükségesek a specifikus immunfolyamatok kialakulásához, citokin termelésük révén fontos kapcsolatot teremtenek a természetes és az adoptív immunrendszer között. Irodalmi adatokat is figyelembe véve a stromában az általunk kimutatott HDC pozitív sejtek között CD4+ és CD8+ T-sejtek lehettek jelen. Előbbiekre való tekintettel mind az adenocarcinoma, mind az adenoma mintákban elvégeztük a CD4+ és CD8+ T-limfociták immunhisztokémiai kimutatását. Fontosnak érezzük azon megfigyelésünket, hogy az adenomákban jelentős számban találtunk CD8+ T-limfocitát, ezzel szemben az adenocarcinomákban csak elvétve találtunk egy- egy ilyen típusú sejtet. A CD4+ T- limfociták számát tekintve nem volt különbség az adenoma és carcinoma szövet között (114). További kísérleteink során a vizsgált malignus és benignus elváltozások biopsziás mintáiból igazoltuk a HDC fehérjeszintű expresszióját is. Eredményeinket denzitometriás analízisekkel is kiértékeltük, ezzel a módszerrel is egyértelműen emelkedett HDC expressziót észleltünk mind a carcinoma, mind az adenomaszövetben. Az adenoma és adenocarcinoma minták HDC expressziójában magasabb szinteket észleltünk, mint a normál nyálkahártya esetében; a különbség ugyan nem szignifikáns, de tendecia értékű. A malignus tumorban észlelt eredményeink összhangban vannak az irodalmi adatokkal. Vastagbél adenomában munkacsoportunk mutatta ki elsőként a HDC fehérjeszintű expresszióját. A gastrointestinalis traktusban a hisztamin inaktiválása elsősorban a DAO enzim hatására történik direkt oxidációval, így a hisztamin metabolizmus vizsgálatát a DAO

60

aktivitás mérésével folytattuk. Adenocarcinomában szignifikánsan alacsonyabb DAO enzim aktivitást mértünk az adenomához és a normális mucosához képest (p<0,01). Ezek az eredmények egybehangzanak az irodalmi adatokkal, melyek alapján a tumorban mérhető magas hisztamin tartalom részben a csökkent DAO aktivitás következménye lehet (115). Vastagbél adenomák DAO aktivítását korábban más munkacsoportok nem vizsgálták. A hisztamin és HDC kimutatására vonatkozó eredményeink szerint adenomában az emelkedett HDC expresszió ellenére sem volt magas a hisztamin tartalom, ez részben magyarázatot ad arra, hogy az adenomákban miért volt mérhető magas DAO aktivitás (114). A hisztamin hatásait specifikus receptorain (H1R-H4R) keresztül fejti ki, melyek a G-fehérjéhez kötődő sejtfelszíni receptorcsaládba tartoznak. A hisztamin hatására a receptorokon keresztül különböző jelátviteli folyamatok aktiválódhatnak, és végsősoron a hisztamin hatása az aktiválódott receptorokon és az általuk befolyásolt jelátviteli rendszeren keresztül manifesztálódik. A hisztamin receptorok közül széles körben hármat elemeztek, a H1R-t, H2R-t és H3R-t. A hisztamin ezek aktivációján keresztül fejti ki a legtöbb ismert hatását. A H1R-on keresztül a hisztamin akut gyulladásos folyamatokban és allergiában betöltött funkciója érvényesül, a H2R a gyomorsav szekréciójában vesz részt. A H3R-t idegrendszeri autoreceptorként tartják számon. A H4R a receptorcsalád legújabban felfedezett tagja, jelenlétét először hemopoeticus sejtekben és a csontvelőben írták le; funkcionális jelentősége kevéssé ismert. A H3- és H4-receptor

szerepéről

és

az

általuk

kiváltott

intracelluláris

jelátviteli

mechanizmusokról még igen kevés adat áll rendelkezésre. Experimentális és humán tumorokban egyaránt vizsgálták és leírták a H1R és H2R szerepét, ezzel szemben a H3R és H4R funkciója tumorokban még nem tisztázott (33). Colorectalis carcinomában a

hisztamin

receptorok

megoszlására

vonatkozóan kevés

irodalmi

adat

áll

rendelkezésre, sőt a H4R-szerepét nem is vizsgálták. Ezzel szemben egyes kutatócsoportok kimutatták vastagbél sejtvonalakon, hogy a hisztaminnak a tumorsejt növekedésére kifejtett hatásai a H2R-on keresztül érvényesülnek. Kutatásaink kezdetén RT-PCR vizsgálattal igazoltuk a H1R és H2R-ok jelenlétét vastagbél adenocarcinoma mintákban, majd kísérleteinket a receptorok Western blot analíziseivel folytattuk. A vizsgált adenoma, adenocarcinoma és normál colorectalis mucosa biopsziás mintákban a négy ismert hisztamin receptor közül hármat tudtunk

61

kimutatni (H1R, H2R és H4R). A receptorok fehérjeszintű expressziójának analízise során H3R-t kevés mintában sikerült identifikálni. Ezzel egyidőben, 2006-ban Sander és munkatársai leírták a hisztamin receptorok megoszlását a normál gastrointestinalis szövetben. Eredményeik szerint a normál mucosa enterocytái H1R, H2R és H4R-kat expresszálnak, míg H3R jelenlétét nem tudták igazolni. Ezen kívül elemezték a receptorok expressziós profilját gyulladásos- és allergiás bélbetegségben, viszont nem végeztek összehasonlító vizsgálatokat a normál mucosával (116). A leírt receptor megoszlásokban saját eredményeink megerősítését láttuk arra vonatkozóan, hogy a normál gastointestinalis mucosában nem expresszálódnak H3R-ok. Cianchi és munkatársai 2005-ben valósidejű RT-PCR analízisek alkalmazásával írták le a H1R, a H2R és a H4R jelenlétét humán vastagbél adenocarcinomában (117). Eredeti hipotézisünk szerint az adenoma mintákban már olyan, a normáltól különböző hisztamin metabolizmusra számítottunk mely átmenetet képezhetett volna az adenocarcinomában észlelt eltérésekhez. Tekintve, hogy adenomában sem a hisztaminszint sem az enzim aktivitás (HDC és DAO) értékei nem változtak meg a normál vastagbél mucosához képest, figyelmünket a további kísérleteink során a malignus tumorokra összpontosítottuk. A hisztamin receptorok analízisét műtétek során nyert, Dukes stádiumok szerint klasszifikált tumorokból származó minták elemzésével folytattuk. A receptorok messenger RNS-szintű expressziójának vizsgálata is igazolta, hogy a vizsgált 4 hisztamin receptor (H1R-H4R) közül 3, a H1R, H2R és H4R valamennyi normál és adenocarcinoma mintában kimutatható volt. Továbbá, az analízisek során jelentősen megváltozott receptor expressziót észleltünk a vizsgált tumorokban. A H1R és H4R szintje a normál mintákéhoz képest szignifikánsan alacsonyabb volt a malignus szövetekben (p<0,001). A H2R-ok esetében nem találtunk szignifikáns változást a normál mucosa receptor expressziójával összehasonlítva. A H3R a mRNS analízisek során is csak néhány mintában (3/38, azaz 7,9%) volt kimutatható. A receptor vizsgálatokat fehérjeszintű kimutatásokkal folytattuk. A Dukes stádiumok szerint klasszifikált tumorokból származó minták Western blot analízisei a valós idejű RT-PCR vizsgálati eredményeivel egybehangzóak voltak. A négyféle hisztamin receptor közül fehérjeszinten is három, a H1R, H2R és H4R jelenléte volt kimutatható. Szintén csökkent H1R és H4R expressziót találtunk a Western blot

62

eredmények denzitometriás kiértékeléseinél tumorokban. A H4R kifejeződése a tumorokban a normál szövethez képest szignifikánsan csökkent (p< 0,001), ezzel szemben a H1R csökkenés nem volt szignifikáns, csak tendencia értékű (p=0,06). Érdekes módon a H2R expresszióban nem volt változás a normál mucosához képest (p=0,36). A fehérjeszintű kimutatás is alátámasztotta a receptorok mRNS-szintű expresszióját, a normális nyálhakártyával összehasonlítva szignifikánsan csökkent H4R szintet találtunk (118). Ezek az eredmények határozottan ellentétesek a gyulladásos bélbetegségben leírtakkal, ahol más szerzők H1R és H2R upregulációt észleltek (118). A receptorok valósidejű RT-PCR és Western blot analízisei során egy másik fontos megfigyelésünk is volt: nem találtunk összefüggést a receptorok expressziójának különböző mértéke és a Dukes stádiumok között (118). Az adenocarcinoma mintákban immunhisztokémiai módszerrel is elvégeztük a hisztamin receptorok analízisét, a normál mucosával összehasonlítva. Eredményeink alátámasztották a génexpressziós vizsgálatok eredményeit: mindhárom receptor (H1R, H2R, és H4R) jelenléte kimutatható volt. A normál vastagbél mucosa és submucosa mintákban intenzívebb H1R, H2R és H3R festődést láthattunk az epitheliális sejtekben, míg a stromában csak kisebb mértékű pozitivítás volt megfigyelhető. A tumorszövetben ugyanazok a receptorok (H1R, H2R és H4R) voltak kimutathatóak. A daganasejtek esetében

intenzívebb

festődést

észleltünk,

mint

a

stroma

sejtjeiben

(118).

Immunhisztokémiai eredményeink is egyértelműen azt igazolták, hogy a normál epitheliális sejtekben jelenlévő hisztamin receptorok (H1R, H2R és H4R) a tumorsejtekben is megtalálhatóak voltak. Ismételten megállapítottuk, hogy a tumorszövetben a hisztamin receptorok expressziója mennyiségben és megoszlásban eltért a normál mucosa sejtjeiben észleltektől, elsősorban a H1R és H4R vonatkozásában. További kísérletek szükségesek ahhoz, hogy a hisztamin receptorok által közvetített hatásmechanizmusokat a vastagbél tumorok vonatkozásában jobban megértsük. Eredményeink arra utalnak, hogy a megváltozott receptor expresszió jelentős hatással lehet nemcsak a daganatsejtek proliferációjára, hanem a tumor mikrokörnyezetében zajló immunfolyamatokra is (2). Változatlan H2R expresszió és csökkent H1R és H4R szintek mellett ugyanolyan hatások jöhetnek létre, mint izoláltan magas H2R expresszió esetében. A receptorok jelenléte és aránya a melanoma

63

malignumnál észleltekhez hasonló befolyással lehet a colon tumorsejtekre. Ugyanis melanomában kimutatták, hogy a hisztamin a daganatsejt proliferációját fokozó hatását a H2R-on keresztül fejti ki (35). Tumorok vonatkozásában már jól ismertek a hisztamin immunválaszban kifejtett hatásai, további hatásai pedig az angiogenesis és metastasis képződés elősegítésében érhetők tetten (71). A hisztamin befolyást gyakorol a citokinek képződésére (pl. IL-1, TNF-α, IL-10 és IL-12), továbbá a monocyták, a dendritikus sejtek és T-limfociták érési folyamataira. Kimutatták, hogy az aktin polymerizációját és a kemotaxist is elősegíti (1, 119-121). Egyes

kísérleti

rendszerekben

megfigyelték,

hogy

a

hisztamin

az

immunregulációs mechanizmusra kifejtett hatásai során elősegíti a Th2-limfociták által közvetített humorális immunválaszt. A hisztamin részben a Th2-limfociták citokin termelésének stimulálásával, részben az aktivált monocyták és makrofágok IL-12 termelésének gátlásával gyengíti a tumorellenes citotoxikus immunválasz hatékonyságát (2,122-124). Saját eredményeink is azt sugallják, hogy vastagbél carcinomában a H1R és a H4R downreguláció a tumorsejtek számára teremt kedvező feltételeket, hiszen a relatíve erős H2R expresszió mellett negatív irányban befolyásolja a Th1- limfociták válaszkészségét. A tumorok progressziójában a vasculáris endotheliális növekedési faktor (VEGF) fokozott termelődése, és az ezzel együtt járó fokozott neoangiogenesis is fontos tényező. Evidenciának tekinthetjük, hogy a hízósejtek és tumorsejtek által kibocsájtott hisztamin a H2R-kon keresztül a neoangiogenesist is fokozza (121). Colon tumorban a változatlan H2R expresszió mellett jelen levő H1R downreguláció elősegítheti a tumor neoangiogenesisét, akárcsak a metasztázisok képződését. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, hogy colon carcinomában milyen sejttípusokra és/vagy a tumor infiltráló sejtekre érvényes az általunk észlelt csökkent H1R és H4R expresszió. Ezáltal tisztázni lehetne, hogy melyek a hisztamin legfontosabb hatásai a vastagbélrák kialakulásában és progressziójában, illetve felállíthatnánk direkt és/vagy indirekt hatásainak fontossági sorrendjét a vastagbél tumorok vonatkozásában. Vastagbélrákos betegek esetében H2-antagonistákkal (cimetidin, ranitidin és famotidin) végzett vizsgálatok során leírták ugyan a cimetidin túlélésre gyakorolt pozitív hatását, de ennek a pontos hatásmechanizmusa még tisztázásra szorul; az eredmények ugyanis egyelőre ellentmondásosak.

64

Összefoglalva, elmondhatjuk, hogy az irodalmi adatokkal összhangban a vastagbél carcinomában magas hisztamin tartalmat mértünk, melyet részben a fokozott hisztamin képződés (a kimutatott magas HDC aktivitáson keresztül), és részben a csökkent lebontás (alacsony DAO aktivítás) magyaráz. Annak reményében végeztük az adenomák vizsgálatait, hogy ezekben a prekancerózus elváltozásokban olyan megváltozott hisztaminszinteket, illetve HDC és DAO enzim aktivitást észlelünk, melyek már átmenetet képezhetnek az adenocarcinomában észlelt megváltozott hisztamin metabolizmushoz. Ezzel szemben mégsem tudtuk igazolni, hogy már adenomákban is megváltozna a hisztamin metabolizmusa a normál mucosáéhoz képest. A hisztamin receptorok szintjén meglehetősen sajátos HR jelenlétet találtunk (H1R és H4R downreguláció változatlan H2R expresszió mellett), mely jelentősen eltér a normál nyálkahártyában, illetve a gyulladásos bélbetegségben más szerzők által leírt HR expressziós profiltól. A hisztamin tumorokban manifesztálódó hatásmechanizmusai még nem teljesen tisztázottak, a hatások eredőjét alapvetően a hisztamin receptorok megoszlása és a receptor-típusok aránya határozza meg. A hisztamin hatásmechanizmusainak részletes tanulmányozása rendkívül fontos lehet a vastagbélrákos betegek kezelésekor számba veendő új prognosztikai faktorok és terápiák szempontjából.

65

7.KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeinket összefoglalva az alábbi fontosabb következtetéseket vonhatjuk le: •

A colorectalis tumorokban a HDC enzim aktivitás jelenléte irodalmi adatokból már ismert volt, de a HDC fehérje sejten belüli (in situ) kimutatása HDC ellenes ellenanyag hiányában nem történt meg. A HDC ellenes ellenanyag elsőkénti előállítása a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet és a Promega cég közös szabadalma. A HDC enzimet munkacsoportunk mutatta ki először immunhisztokémiai

módszerrel

colorectalis

adenomában

és

adenocarcinomában. Eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy jelentősen megváltozik a HDC enzim jelenléte és aktivitása a tumorokban és az adenomákban a normális szövethez képest. A tumorsejtekben kimutatott HDC pozitivitással azt igazoltuk, hogy maguk a tumorsejtek is termelnek hisztamint. •

Kimutattuk másokhoz hasonlóan, hogy colorectalis tumorokban megváltozik a hisztamin

metabolizmus.

Következtetésünk,

hogy

a

HDC

aktivitás

fokozódása mellett a hisztamint metabolizáló DAO enzim aktivitása csökken, és ez vezet a tumorokra jellemző emelkedett hisztamin-szinthez. •

Elsőként mutattuk ki, hogy colorectalis adenomákban nincs változás a hisztamin-szint és a hisztamin metabolizmusában szerepet játszó enzimek (HDC és DAO) aktivitásának tekintetében a normál mucosához képest. Adenomákban sem a hisztamin-szint, sem a DAO aktivitás változása nem volt kimutatható. Következtetéseink: adenomában a normális hisztaminszint a normál mucosáéval azonos DAO aktivitás tükröződése lehet; a tumorban észlelt megváltozott

hisztamin

metabolizmus

a

még

nem

malignizálódott

adenomákra nem jellemző. •

Az irodalomban kevés adat áll rendelkezésre a colorectalis tumorok hisztamin receptorainak megoszlására vonatkozóan, ugyanakkor az adenomák receptor expresszióját más munkacsoportok korábban nem vizsgálták. Elsőként írtuk le adenomákban

a

hisztamin

receptorok

fehérjeszintű

expresszióját.

Eredményeink szerint adenocarcinomában, adenomában és a normál

66

nyálkahártyában a hisztamin négy ismert receptorából három (H1R, H2R, H4R) receptor jelenléte mutatható ki. •

A

hisztamin

receptorok

fehérjeszintű

expresszióját

már

vizsgálták

adenocarcinomában. Elsőként mutattuk ki, hogy colorectalis carcinomában megváltozik az expresszált hisztamin receptorok megoszlása (csökkent H1R és H4R szintek mellett változatlan H2R) a normál mucosához képest, és ez a változás minden tumorra jellemző, függetlenül a daganat Dukes stádium szerinti besorolásától. •

Új eredménynek tekinthető a hisztamin receptorok immunhisztokémiai módszerrel történő kimutatása is. Eredményeink alapján a normál vastagbél mucosában és az adenocarcinomában is ugyanaz a 3 receptor (H1R, H2R és H4R) mutatható ki immunhisztokémiai módszerrel.

•

Vizsgálati eredményeink alapján megállapítható, hogy a H1R és H4R receptorok down-regulációja kedvezhet a tumor növekedésének. Tekintve, hogy a hisztamin a H2-receptoron keresztül fejti ki immunszuppresszív hatását, a H2R a daganat ellenes terápia ígéretes célpontját képezheti. Tudomásunk szerint hazai és nemzetközi viszonylatban is elsőként vizsgáltuk az a hisztamin metabolizmust és a hisztamin receptorok fehérjeszintű expresszióját adenoma-szövetben. Továbbá, első ízben írtuk le humán colorectalis carcinomában a hisztamin receptoroknak a normál mucosában észlelttől szignifikánsan eltérő megoszlását.

67

8.ÖSSZEFOGLALÁS A hisztamin és a colorectalis daganatok kapcsolatának vizsgálata széleskörű kutatás tárgyát képezi. Vastagbélrákban korábban már kimutatták a lokálisan képződő hisztamin és a hisztamin szintézisében szerepet játszó HDC enzim jelenlétét. A hisztamin hatását colorectalis tumorban részben a hisztamin receptorok expressziós profilja, részben a receptorokon keresztül közvetített intracelluláris szignálok határozzák meg. Klinikai vizsgálatok tanúsága szerint a pre- és/vagy posztoperatív időszakban alkalmazott H2-receptor antagonisták adásával meghosszabbítható a vastagbélrákos betegek túlélése, igaz, az adatok ellentmondásosak. Ismert, hogy a vastagbél adenomák egyes típusai magukban rejtik a carcinoma kialakulásának potenciális veszélyét. Kutatásunk tárgyát a hisztamin metabolizmusának és a hisztamin receptorok jelenlétének, illetve megoszlásának analízise képezte humán colorectalis tumorokban. A vizsgálatok vezérfonala a vastagbél adenoma és a normál nyálkahártya hisztamin metabolizmusának összehasonlító analízise volt. Eredményeink szerint vastagbél carcinomában a magas hisztamin-szintért a fokozott HDC és a csökkent DAO enzim aktivitás felelős. Eredeti hipotézisünk alapján adenomában a hisztamin metabolizmus olyan eltéréseire számítottunk, melyek átmenetet képezhetnek a rosszindulatú tumorra jellemző

hisztamin

metabolizmus

irányába.

Eredményeink

nem

igazolták

várakozásunkat, a hisztamin metabolizmusa az adenomában és a normál mucosában nem tért el egymástól. A receptorok tekintetében, adataink szerint jelentős eltérés van a normális mucosa és a rosszindulatú daganat hisztamin receptor profilja között. A receptorok kifejeződése meglehetősen sajátosnak bizonyult a Dukes stádiumok szerint válogatott daganatmintákban: változatlan H2R mellett csökkent a H1R és H4R expressziója. Ez ugyanis jelentősen eltér a normál nyálkahártyában, illetve a gyulladásos bélbetegségben, más szerzők által leírt hisztamin receptor profiltól. Ez a megváltozott receptor expresszió teljesen azonos eloszlást mutatott a különböző Dukes stádiumokba tartozó daganatminták esetében. A hisztamin tumorokban manifesztálódó hatásmechanizmusai még nem teljesen tisztázottak, ezek további tanulmányozása fontos

68

lehet a vastagbélrákos betegek kezelésekor számba veendő új prognosztikai faktorok és terápiák szempontjából.

69

SUMMARY It was repeatedly demonstrated that histamine synthesis in tumours is significantly increased compared to the surrounding normal tissues, such as in breast cancer, colon carcinoma, malignant melanoma and hematological malignancies. Previous research has revealed the local production of histamine in colon tumours, and the significance of histamine in the development and progression of cancer. The local effect of histamine is largely determined by the actual histamine receptor (H1R-H4R) expression pattern. It has been shown that in experimental carcinomas endogenous histamine may act as an autocrine growth factor by stimulating tumour cell proliferation via H2 receptors. In humans, several clinical trials have been performed with H2 receptor antagonists as additive treatment to surgical resection, with contradictory results so far. Colon adenomas represent an increased risk for developing colon cancer, it is well documented that adenomatous polyps may undergo malignant transformation. We intented to analyse the histamine metabolism and receptor expression profile in human colorectal carcinoma. In our experiments we perfomed the comparative analysis of histamine metabolism and receptor expression in colorectal cancer, adenoma and normal colonic mucosa. Our results showed an elevated histamine concentration, increased HDC activity and decreased DAO content in adenocarcinoma in comparison to the normal mucosa and adenoma. Based on our original hypothesis we expected to find an altered histamine metabolism in adenomas suggesting a transition to the metabolic pattern found in carcinomas. In contrast we could not demonstrate any altered metabolism in the benign laesions of the colon. The analysis of histamine receptor expression profile showed a marked difference in malignant tumours and normal mucosa. A well defined distribution and expression pattern of receptors was found in selected tumour samples, namely significantly downregulated H1R and H4R, with unchanged H2R expression. These findings are just opposite to the results found in normal colonic mucosa and inflammatory bowel disease published by others. In addition to these results there was no difference between the receptor expression profile according to different Dukes’ stages. The role of histamine with respect to the intracellular mechanisms involved in the colon tumour development and progression has not been clarified yet. More details are needed to clarify the role of histamine and its receptors as prognostic factors in the treatment a colorectal cancer patients.

70

9.IRODALOMJEGYZÉK 1. Jutel M, Watanabe T, Akdis M, Blaser K, Akdis CA. (2002) Immune regulation by histamine. Curr Opin Immun, 14(6): 735-740. 2. Jutel M, Watanabe TJ, Klunker, Akdis M, Thomet OA, Malolepszy J, Zak-Nejmark T, Koga R, Kobayashi T, Blaser K, Akdis CA. (2001) Histamine regulates T-cell and antibody responses by differential expression of H1 and H2 receptors. Nature, 413(6854): 420-425. 3. Mellqvist UH, Hansson M, Brune M, Dahlgren C, Hermodsson S, Hellstrand K.(2000) Natural killer cell dysfunction and apoptosis induced by myelogenous leukemia cells: role of reactive oxygen species and regulation by histamine. Blood, 96(5): 1961-1986. 4. Idzko M, Sala M, Ferrari D, Panther E, Herouy Y, Dichmann S, Mockenhaupt M, Di Virgilio F, Girolomoni G, Norgauer J. (2002) Expression and function of histamine receptors in human monocyte- derived dendritic cells. J Allergy Clin Immunol, 109(5): 839-846. 5. Dy M, Lebel B, Kamoun P, Hamburger J. (1981) Histamine production during the anto-allograft response. (1981) Demonstration of a new lymphokine enhancing histamine synthesis. J Exp Med, 153(2): 293-309. 6. Kubo Y, Nakano K.(1999) Regulation of histamine synthesis in mouse CD4+ and CD8+. Inflamm Res, 48(3): 149-153. 7. Saxena SP, Brandes LJ, Becker AB, Simons KJ, LaBella FS, Gerrard JM. (1989) Histamine is an intracellular messenger mediating platelet aggregation. Science, 243(4898):1596-1599. 8. Rivera ES, Cricco GP, Engel NI, Fitzsimons CP, Martin GA, Bergoc RM. (2000) Histamine as an autocrine growth factor: an unusual role for a widespread mediator. Semin Cancer Biol, 10(1):15-23. 9. Falus A. Histamine, part of the metabolome. (2003) Acta Biol Hung, 54(1):27-34. 10. Hegyesi H. Histamine receptors and signaling. In: Falus A, Darvas Zs, Grosman N. (szerk.), Histamine: Biology and Medical Aspect, SpringMed Publishing LtdKarger, Budapest, 2004: 69-97.

71

11. Drutel G, Peitsaro N, Karlstedt K, Wieland K, Smith JK, Timmerman H, Panula P, Leurs R.(2001) Identification of rat H3 receptor isoforms with different brain expression and signaling properties. Mol. Pharmacol, 59(1): 1-8. 12. Oda T, Morikawa N, Saito Y, Masuho Y, Matsumoto S. (2000) Molecular cloning and characterization of a novel type of histamine receptor preferentially expressed in leukocytes. J Biol Chem, 275(47): 36781-36786. 13. Zhu Y, Michalovich D, Wu H-L, Tan KB, Dytko GM, Mannan IJ, Boyce R, Alston J, Tierney LA, Li X, Herrity NC, Vawter L, Sarau HM, Ames RS, Davenport CM, Hieble JP, Wilson S, Bergsma DJ, Fitzgerald LR. (2001) Cloning, expression, and pharmacological characterization of a novel human histamine receptor. Mol Pharmacol, 59(3) : 434-441. 14. LaBella FS, Brandes LJ. (2000) Interaction of histamine and other bioamines with cytochromes P450: implications for cell growth modulation and chemopotentiation by drugs. Semin Cancer Biol, 1081): 47-53. 15. Pós Z, Hegyesi H, Rivera ES. Histamine and cell proliferation. In: Falus (szerk.), Histamine: Biology and Medical Aspects. Karger & Spinger MedPublishing Ltd, 2004: 199-217. 16. Medina MA, QuesadaAR, Nunez de Castro I, Sanchez-Jimenez F. (1999) Histamine, polyamines, and cancer. Biochem Pharmacol, 57(12):1341-1344. 17. Hegyesi H, Somlai B, Varga TL, Toth G, Kovacs P, Molnar EL, Laszlo V, Karpati S, Rivera E, Falus A, Darvas Z. (2001) Suppression of melanoma cell proliferation by histidine decarboxylase specific antisense oligonucleotides. J Invest Dermatol, 117(1): 151-153. 18. Falus A, Hegyesi H, Lázár-Molnár E, Pós Z, László V, Darvas Zs.(2003) Paracrine and autocrine interactions in melanoma: histamine is a relevant player in local regulation. Trends Immunol, 22812):648-652. 19. Haak-Frendscho H, Darvas Zs, Hegyesi H, Kárpáti S, Hoffman RL, László V, Bencsáth M, Szalai J, Timár J, Csörgő-Bata Zs, Szabad G, Pivarcsi A, Pállinger É, Kemény L, Horváth A, Dobozy A, Falus A. (2001) Histidine decarboxylase expression in human melanoma. J Invest Dermatol, 115: 345-353.

72

20. Darvas Z, Sakurai E, Schwelberger HG, Hegyesi H, Rivera E, Othsu H, Watanabe T, Pállinger F, Falus A. (2003) Autonomous histamine metabolism in human melanoma cells. Melanoma Res, 13(3):239-246. 21. Graff L, Frungieri M, Zanner R, Pohlinger A, Prinz C, Gratzl M. (2002) Expression of histidine decarboxylase and synthesis of histamine by human small cell lung carcinoma. Am J Pathol, 160(5):1561-1565. 22. Tanimoto A, Matsuki Y, Tomita T, Sasaguri T, Shimajiri S, Sasaguri Y. (2004) Histidine decarboxylase expression in pancreatic endocrine cells and related tumors. Pathol Int, 54(6): 408-412. 23. Masini E, Fabbroni V, Giannini L, Vannacci A, Messerini L, Perna F, Cortesini C, Cianchi F. (2005) Histamine and histidine decarboxylase up-regulation in colorectal cancer: correlation with tumor stage. Inflamm Res, 54 (Suppl 1): S80-81. 24. Wang LD, Hoeltzel M, Butler K, Hare B, Todisco A, Wang M, Del Valle J.(1997) Activation of the human histamine H2 receptor is linked to cell proliferation and cfos gene transcription. Am J Physiol, 273(6 Pt 1): C2037-2045. 25. Shayo C, Davio C, Brodsky A, Mladovan AG, Legnazzi BL, Rivera E, Baldi A. (1997) Histamine modulates the expression of c-fos through cyclic AMP production via the H2 receptor in the human promonocytic cell line U937. Mol Pharmacol, 51(6): 983-994 26. Blackmore PF, Oakes SG, Somers KD. (1992) Altered H1 histamine receptor signaling in Balb/3T3 cells transformed by v-K-ras and v-H-ras oncogenes. Oncogene, 7(10): 2053–2057. 27. Tilly BC, Tertoolen LGJ, Remorie R, Ladoux A, Verlaan I, de Laat SW, Moolenaar WH. (1990) Histamine as a growth factor and chemoattractant for human carcinoma and melanoma cells: Action through Ca2+ mobilizing H1 receptors. J Cell Biol, 11:1211–1215. 28. Hernandez –Angeles A, Soria-Jasso LE, Ortega A, Arias-Montano JA. (2001) Histamine H1 receptor activation stimulates mitogenesis in human astrocytoma U373 MG cells. J Neurooncol, 55(2): 81-89. 29. Valencia S, Hernandez-Angeles A, Soria-Jasso LE, Arias-Montano JA. (2001) Histamine H(1)receptor activation inhibits the proliferation of human prostatic adenocarcinoma DU-145 cells. Prostate, 48(3): 179-187.

73

30. Hegyesi H, Horváth B, Pállinger E, Pós Y, Molnár V, Falus A. (2005) Histamine elevates the expression of Ets-1, a protooncogen in human melanoma cell lines through H2 receptor. FEBS Lett, 579(11): 2475-2479. 31. Davidson B, Risberg B, Goldberg I, Nesland JM, Berner A, Trope CG, Kristensen GB, Bryne M, Reich R. (2001) Ets-1 mRNA expression in effusions of serous ovarian carcinoma patients is a marker of poor outcome. Am J Surg Pathol, 25(12): 1493-1500. 32. Falus A, László V, Radvány Z, Hegyesi H, Kiss B, Bencsáth M, Darvas Z. (1997) Histidine decarboxylase and intracellular histamine in melanoma cells and in a T cell line. Inflamm Res, 46(Suppl 1): S51-52. 33. Molnár EL, Cricco G, Martin G, Darvas Z, Hegyesi H, Fitzsimons C, Bergoc R, Falus A, Rivera E. (2001) Histamine as a potential autocrine regulator of melanoma. Inflamm Res, 50 (Suppl 2): S102-103. 34. Bartholeyns J, Fozard JR. (1985) Role of histamine in tumour development. Trends Pharmacol Sci, 6: 123-125. 35. Pós Z, Sáfrány G, Müller K, Tóth S, Falus A, Hegyesi H. (2005) Phenotypic profiling of engineered mouse melanomas with manipulated histamine production identifies histamine H2 receptor and rho-C as histamine-regulated melanoma progression markers. Cancer Res, 65(10):4458-4466. 36. Fitzsimons C, Molinari B, Duran H, Oalmieri M, Davio C, Cricco G, Bergoc R, Rivera E. (1997) Atypical association of H1 and H2 histamine receptors with signal transduction pathways during multistage mouse skin carcinogenesis. Inflamm Res, 46(8): 292-298. 37. Davio CA, Cricco GP, Bergoc RM, Rivera ES. (1995) H1 and H2 histamine receptors in N-nitroso-N-methylurea (NMU)-induced carcinomas with atypical coupling to signal transducers. Biochem Pharmacol, 50(1): 91-96. 38. Cricco G. (1993) Inhibition of tumor growth induced by histamine histamine in-vivo and in-vitro studies. Agents Actions, 38:75-78. 39. Cricco GP, Davio CA, Martin G, Engel N, Fitzsimons CP, Bergoc RM, Rivera ES. (1994) Histamine as an autocrine growth factor in experimental mammary carcinoma. Agents Actions, 43(2): 17-20.

74

40. Szincsák N, Hegyesi H, Hunyadi J, Martin G, Lázár-Molnár E, Kovács P, Rivera E, Falus A, Juhász I. (2002) Cimetidine and a tamoxifen derivate reduce tumour formation in SCID mice xenotransplanted with a human melanoma cell line. Melanoma Res, 12(3): 231-240. 41. Szincsák N, Hegyesi H, Hunyadi J, Falus A, Juhász I. (2002) Different H2 receptor antihistamines dissimilarly retard the growth of xenografted human melanoma cells in immunodeficient mice. Cell Biol Int, 26(9): 833-836. 42. Horváth BV, SzalaiC, Mándi Y, László V, Radvány Z, Darvas Z, Falus A. (1990) Histamine and histamine receptor antagonists modify gene expression and biosynthesis of IFNγ in peripheral human blood mononuclear cells and in CD19-depleted cell subsets. Immunol Lett, 70: 95–99. 43. Eriksson NE, Holmén A, Högstedt B, Mikoczy Z, Hagmar L. (1995) A prospective study of cancer incidence in a cohort examined for allergy. Allergy, 50(9):718-722. 44. Vena JE, Bona JR, Byers TE, Middleton E Jr, Swanson MK, Graham S. (1985) Allergy-related diseases and cancer: an inverse association. Am J Epidemiol, 122(1): 66-74. 45. Schneider E, Rolli-Derkinderen M, Arock M, Dy M. (2002) Trends in histamine research: new functions during immune responses and hematopoiesis. Trends Immunol, 23(5): 255-263. 46. Schroder K, Hertzog P, Ravasi T, Hume D. (2004) Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol, 75(2):163-189. 47. Trinchieri G. (2003) Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat Rev Immunol, 3(2):133-146. 48. Elenkov IJ, Webster E, Papanicolaou DA, Fleisher TA, Chrousos GP, Wilder RL. (1998) Histamine potently suppresses human IL-12 and stimulates IL-10 production via H2 receptors. J Immunol,161(5): 2586-2593. 49. Mocellin S, Panelli MC, Wang E, Nagorsen D, Marincola FM. (2003) The dual role of IL-10. Trends Immunol, 24(1): 36-43. 50. Azuma Y, Shinohara M, Wang PL, Hidaka A, Ohura K. (2001) Histamine inhibits chemotaxis, phagocytosis, superoxide anion production, and the production of TNFalpha and IL-12 by macrophages via H2-receptors. Int Immunopharmacol, 1:1867–1875.

75

51. Osna N, Elliott K, Khan MM. (2001) Regulation of interleukin-10 secretion by histamine in TH2 cells and splenocytes. Int Immunopharmacol, 1: 85–96. 52. Kono K, Salazar-Onfray F, Petersson M, Hansson J, Masucci G, Wasserman K, Nakazawa T, Anderson P, Kiessling R. (1996) Hydrogen peroxide secreted by tumor-derived macrophages down-modulates signal-transducing zeta molecules and inhibits tumor-specific T cell-and natural killer cell-mediated cytotoxicity. Eur J Immunol, 26(6):1308-1313. 53. Hellstrand K, Asea A, Dahlgren C, Hermodsson S. (1994) Histaminergic regulation of NK cells. Role of monocyte-derived reactive oxygen metabolites. J Immunol, 153(11): 4940-4947. 54. Hellstrand K. (2002) Histamine in cancer immunotherapy: a preclinical background. Semin Oncol, 29(3 Suppl 7): 35-40. 55. Hellstrand K, Hansson M, Hermodsson S.(2000) Adjuvant histamine in cancer immunotherapy. Semin Cancer Biol, 10(1): 29-39. 56. Urba WJ, Alvord WG. (2002) Are all hypotheses generated before data analysis prospective? J Clin Oncol, 20(6):1431-1433. 57. Agarwala SS, Glaspy J, O’Day SJ, Mitchell M, Gutheil J, Whitman E, Gonzalez R, Hersh E, Feun L, Belt R, Meyskens, Hellstrand K, Wood D, Kirkwood JM, Gehlsen KR, Naredi P. (2002) Results from a randomized phase III study comparing combined treatment with histamine dihydrochloride plus interleukin-2 versus interleukin-2 alone in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol, 20(1):125-133. 58. Asemissen AM, Scheibenbogen C, Letsch A, Hellstrand K, Thoren F, Gehlsen K, Schmittel A, Thiel E, Keilholz U. (2005) Addition of histamine to interleukin 2 treatment augments type 1 T-cell responses in patients with melanoma in vivo: immunologic results from a randomized clinical trial of interleukin 2 with or without histamine (MP 104). Clin Cancer Res, 11(1): 290-297. 59. Tomita K, Okabe S. (2005) Exogenous histamine stimulates colorectal cancer implant growth via immunosuppression in mice. J Pharmacol Sci, 97/1): 116-123.

76

60. Takahashi K, Tanaka S, Furuta K, Ichikawa A. (2002) Histamine H(2) receptormediated modulation of local cytokine expression in a mouse experimental tumor model. Biochem Biophys Res Commun, 297(5): 1205-1210. 61. Yoong KF, Adams DH. (1996) Tumor infiltrating lymphocytes: insight into tumor immunology and potential therapeutic implications. Clin Mol Pathol, 49(5): 256267 62. Bolton E, King J, Morris DL. (2000) H2-antagonists in the treatment of colon and breast cancer. Semin Cancer Biol, 10(1): 3-10. 63. Gifford RR, Voss BV, Schmidtke JR, Fergusson RM. (1994) Histamine type-2 receptor antagonist immune modulation. I. Increased cell-mediated cytotoxicity in normal and downregulated systems. Surgery, 103: 184–192. 64. Norrby K. (1995) Evidence of a dual role of endogenous histamine in angiogenesis. Int J Exp Pathol, 76(2): 87-92. 65. Norrby K. (2002) Mast cells and angiogenesis. APMIS, 110(5): 355-371. 66. Niethammer AG, Xiang R, Becker JC, Wodrich H, Pertl U, Karsten G, Eliceiri BP, Reisfeld RA. (2002) A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med, 8:1369–1375. 67. Ghosh AK, Hirasawa N, Ohuchi K. (2001) Enhancement by histamine of vascular endothelial growth factor production in granulation tissue via H2 receptors. Br J Pharmacol, 134: 1419–1428. 68. Tomita K, Izumi K, Okabe S. (2003) Roxatidine- and cimetidine-induced angiogenesis inhibition suppresses growth of colon cancer implants in syngeneic mice. J Pharmacol Sci, 93(3): 321-330. 69. Natori T, Sata M, Nagai R, Makuuchi M. (2005) Cimetidine inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth. Biomed Pharmacother, 59(1-2): 56-60. 70. Kanda N, Watanabe S. (2002) Histamine inhibits the production of interferoninduced protein of 10 kDa in human squamous cell carcinoma and melanoma. J Invest Dermatol, 119(6): 1411-1419. 71. Kobayashi K, Matsumoto S, Morishima T, Kawabe T, Okamoto T. (2000) Cimetidine inhibits cancer cell adhesion to endothelial cells and prevents metastasis by blocking E-selectin expression. Cancer Res, 60(14): 3978-3984.

77

72. Tang NH, Chen YL, Wang XO, Li XJ, Yin FZ, Wang XZ. (2004) Cooperative inhibitory effects of antisense oligonucleotide of cell adhesion molecules and cimetidine on cancer cell adhesion. World J Gastroenterol, 10(1): 62-66. 73. Matsumoto S, Imaeda Y, Umemoto S, Kobayashi K, Suzuki H, Okamoto T. (2002) Cimetidine increases survival of colorectal cancer patients with high levels of sialyl Lewis-X and sialyl Lewis-A epitope expression on tumour cells. Br J Cancer, 86(2): 161-167. 74. Martin G, Cricco G, Darvas Z, Croci M, Nunez M, Bergoc R, Falus A, Rivera E. (2002) Histamine inhibits proliferation of a pancreatic carcinoma cell line without inducing apoptosis significantly. Inflamm Res, 51(Suppl 1): S67-68. 75. Watson SA, Wilkinson LJ, Robertson JF, Hardcastle JD. (1993) Effect of histamine on the growth of human gastrointestinal tumours: reversal by cimetidine. Gut, 34(8): 1091-1096. 76. Lawson JA, Adams WJ, Morris DL. (1996) Ranitidine and cimetidine differ in their in vitro and in vivo effects on human colonic cancer growth. Br J Cancer, 73:872– 876. 77. Sandvik AK, Dimaline R, Marvik R, Brenna E, Waldum HL. (1994) Gastrin regulates histidine decarboxylase activity and mRNA abundance in rat oxyntic mucosa. Am J Physiol, 267: 254-258. 78. Haga Y, Nakatsura T, Shibata Y, Sameshima H, Nakamura Y, Tanimura M, Ogawa M. (1998) Human gastric carcinoid detected during long-term antiulcer therapy of H2 receptor antagonist and proton pump inhibitor. Dig Dis Sci, 43(2): 253-257. 79. Bashir S, Gibril F, Ojeaburu JV, Asgharian B, Entsuah LK, Ferraro G, Crafa P, Bordi C, Jensen RT. (2002) Prospective study of the ability of histamine, serotonin or serum chromogranin A levels to identify gastric carcinoids in patients with gastrinomas. Aliment Pharmacol Ther, 16(7): 1367-1382. 80. Farrow DC, Vaughan TL, Sweeney C, Gammon MD, Chow WH, Risch HA, Stanford JL, Hansten PD, Mayne ST, Schoenberg JB, Rotterdam H, Ahsan H, West AB, Dubrow R, Fraumeni JF, Blot WJ. (2000) Gastroesophageal reflux disease, use of H2 receptor antagonists, and risk of esophageal and gastric cancer. Cancer Causes Control, 11(3): 231-238.

78

81. La Vecchia C, Tavani A. (2002) A review of epidemiological studies on cancer in relation to the use of anti-ulcer drugs. Eur J Cancer Prev, 11(2):117-123. 82. Burtin C, Noirot C, Scheinmann P, Galoppin L, Sabolovic D, Bernard P. (1988) Clinical improvement in advanced cancer disease after treatment combining histamine and H2-antihistaminics (ranitidine or cimetidine). Eur J Cancer Clin Oncol, 24(2): 161-167. 83. Tonnesen H, Knigge U, Bülow S, Damm P, Fischerman K, Hesselfeldt P, Hjortrup A, Pedersen VM, Siemssen OJ. (1988) Effect of cimetidine on survival after gastric cancer. Lancet, 2(8618): 990-992. 84. Primrose JN, Miller GV, Preston SR, Gokhale J, Ambrose NS, Ward UM, Mills JG? Ehsanullah ERS, Darekar B, Yorkshire GI. (1998) A prospective randomised controlled study of the use of ranitidine in patients with gastric cancer. Gut, 42: 17–19. 85. Wotherspoon HA, Anderson JR, Morran CG, Murray GD, McArdle CS. (1997) Randomized controlled trial of an H2-receptor in gastric cancer. Br J Surg, 84(8): 1168–1169. 86. Burtin C, Noirot C, Paupe J, Scheinmann P. (1983) Decreased blood histamine levels in patients with solid malignant tumours. Br J Cancer, 47(3): 367-372. 87. Sabolovic D, Dubravcic D, Culo F, Hadzic N. (1989) Histamine levels in the blood in patients with malignant tumors Lijec Vjesn, 111(6-7): 185-187. 88. Previati M, Raspadori A, Bertolaso L, Parmeggiani A, Bindini D, Vitali C, Lanzoni I, Corbacella E, Saviano M, Fagioli F, Blo G, Capitani S. (2002) Determination of histamine in the whole blood of colon cancer patients. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 780(2): 331-339. 89. Chanda R, Ganguly AK. (1987) Diamineoxidase activity and tissue histamine content of human skin, breast and rectal carcinoma. Cancer Lett, 34: 207-212. 90. Garcia-Caballero M, Neugebauer E, Campos R, Nunez de Castro I, Vara-Thorbeck C. (1988) Increased histidine decarboxylase (HDC) activity in human colorectal cancer: results of a study on ten patients. Agents Actions, 23: 357–360. 91. Reynolds JL, Akhter J, Adams WJ, Morris DJ. (1997) Histamine content in colorectal cancer. Are there sufficient levels of histamine to affect lymphocyte function? Eur J Surg Oncol, 23(3): 224-227.

79

92. Roberts AI, Leone VM, Ebert EC. (1994) Intestinal mucosal lymphocytes have H1 receptors: H1 antagonists reduce their proliferative and cytotoxicity. Cell Immmol, 156: 212-219. 93. Masini E, Fabbrioni V, Giannini L, Vannacci A, messerini L, Perna F, Cortesini C, Cianchi F. (2005) Histamine and histidine decarboxylase up-regulation in colorectal cancer: correlation with tumor stage. Inflamm Res, 54 (Suppl 1): S80-81. 94. Takahashi K., Tanaka S., Ichikawa A. (2001) Effect of cimetidine on intratumoral cytokine expression in an experimental tumor. Biochem Biophys Res Commun, 281(5): 1113-1119. 95. Kubota T, Fujiwara H, Ueda Y, Itoh T, Yamashita T, Yoshimura T, Okugawa K, Yamamoto Y, Yano Y, Yamagishi H. (2002) Cimetidine modulates the antigen presenting capacity of dendritic cells from colorectal cancer patients. Br J Cancer, 86(8): 1257-1261. 96. Adams WJ, Morris DL, Ross WB, Lubowski DZ, King DW, Peters L. (1994) Cimetidine preserves non-specific immune function after colonic resection for cancer. Aust N Z J Surg, 64: 847–852. 97. Adams WJ, Morris DL.(1994) Short-course cimetidine and survival with colorectal cancer. Lancet. 1994;344(8939-8940):1768-1769. 98. Svendsen LB, Ross C, Knigge U, Frederiksen HJ, Graversen P, Kjaergard J, Luke M, Stimpel H, Sparso BH. (1995) Cimetidine as an adjuvant treatment in colorectal cancer. Dis Colon Rectum, 38: 514–518. 99. Matsumoto S. (1995) Cimetidine and survival with colorectal cancer. Lancet, 346(8967): 115. 100. Kelly MD, King J, Cherian M, Dwerryhouse SJ, Finlay IG, Adams WJ, KIng DW, Lubowski DZ, Morris DL. (1999) Randomized trial of preoperative cimetidine in patients with colorectal carcinoma with quantitative assessment of tumor-associated lymphocytes. Cancer, 85:1658–1663. 101. Nielsen HJ. (1998) The effect of ranitidine on long-term survival in primary colorectal cancer: A 40 month interim analysis. GI Cancer, 2: 227–233. 102. Nielsen HJ, Christensen IJ, Moesgaard F, Kehlet H, Danish RANX05 Colorectal Cancer Study Group. (2002) Ranitidine as adjuvant treatment in colorectal cancer. Br J Surg, 89(11): 1416-1422.

80

103. Nielsen HJ, Moesgaard F, Hammmer JH. (1996) The effect of ranitidine on immune function, tumor response and survival in patients with liver metastases from colorectal cancer. GI Cancer, 1:183–190. 104. Kapoor S, Pal S, Sahni P, Dattagupta S, Kanti Chattopadhyay T. (2005) Effect of pre-operative short course famotidine on tumor infiltrating lymphocytes in colorectal cancer: a double blind, placebo controlled, prospective randomized study. J Surg Res,129(2): 172-175. 105. Siegers CP, Andresen S, Keogh JP. (1999) Does cimetidine improve prospects for cancer patients?. A reappraisal of the evidence to date. Digestion, 60(5): 415-421. 106. King J, Caplehorn JRM, Seifert JK, Preketes AP, Clingan PR, Morris DL. (2002) A Randomised Placebo Control Double-blind Trial of Ranitidine in Patients with Colorectal Hepatic Metastases: Survival Advantage in Patients with Poor Cell Mediated Immunity. GI Cancer, 4(1): 39-44. 107. Bleiberg H. (2005) Adjuvant treatment of colon cancer. Curr Opin Oncol, 17: 381-385. 108. Huang CS, Lal SK, Farraye FA. (2005) Colorectal cancer screening in average risk individuals. Cancer Causes Control, 16: 171-188. 109. Morson BC. (1974) The polyp-cancer sequence in the large bowel. Proc Roy Soc Met, 67: 451-457. 110. Shinya H, Wolff W. (1979) Morphology, anatomic distribution, and cancer potential of colonic polyps: an analysis of 7000 polyps endoscopically removed. Ann Surg, 190: 679-683. 111. Welch JP, Welch CE. (1976) Villous adenomas of the colorectum. Am J Surg, 131: 185-191. 112. Nagtegaal ID, Marijken CAM, Klein Kranenbarg E, Mulder- Stapel A, Hermans J, van de Velde CJH, van Krieken HJM. (2001) Local and distant recurrences in rectal cancer patients are predicted by the nonspecific immune response; specific immune response has only a systemic effect- a histopathological and immunohistochemical study BMC Cancer, 1: 7-19. 113. Boér K, Darvas Z, Baki M, Kaszás I, Pál Z, Falus A. (2003) Expression of histidine decarboxylase in human colonic cancer cells and adenomatous polyps. Inflamm Res, 52 (Suppl 1): S76-77.

81

114. Boér K, Darvas Z, Bösze Sz, Schwelberger H, Baki M, Bélai F, Pál Zs, Falus A. (2004) Histamine metabolism and CD8+ T cell infiltration in colon adenomas. Inflamm Res, 53 (Suppl 1): S83-84. 115. Linsalata M, Russo F, Cavallini A, Berloco P, Di Leo A. (1993) Polyamines, diamine oxidase, and ornithine decarboxylase activity in colorectal cancer and normal surrounding mucosa. Dis Colon Rectum, 36: 662-667. 116. Sander LE, Lorentz A, Sellge G, Coeffier M, neipp M, Yeres T, Frieling T, Meier PN, Manns MP, Bischoff SC. (2006) Selective expression of histamine receptors H1R, H2R and H4R, but not H3R, in the human intestinal tract. Gut, 55(4): 445447. 117. Cianchi F, Cortesini C, Schiavone N, Perna F, Magnelli L, Fanti E, Bani D, Messerini L, Fabbroni V, Perigli G, Capaccioli S, Masini E. (2005) The role of cyclooxygenase-2 in mediating the effects of histamine on cell proliferation and vascular endothelial growth factor production in colorectal cancer. Clin Cancer Res, 11: 6807-6815. 118. Boér K, Helinger E, Helinger A, Pocza P, Pos Z, Demeter P, Baranyai Zs, Dede K, Darvas Zs, Falus A. (2008)

Decreased expression of histamine H1 and H4

receptors suggests disturbance of local regulation in human colorectal tumours by histamine. Eur J Cell Biol. 119. Buckland KF, Williams TJ, Conroy DM. (2004) Histamine induces cytoskeletal changes in human eosinophils via the H4 receptors. Brit J Pharmacol, 140: 11171127. 120. Gutzmer R, Langer K, Lisewski M, Mommert S, Rieckborn D, Kapp A, Werfel T. (2002) Expression and function of histamine receptors 1 and 2 on human monocyte-derived dendritic cell. J Allergy Clin Immunol, 109: 524-531. 121. Idzko M, Sala M, Ferrari D, Panther E, Herouy Y, Dichmann S, Mockenhaupt M, Di Virgilio F, Girolomoni G, Norgauer J. (2002) Expression and function of histamine receptors in human monocyte- derived dendritic cells. J Allergy Clin Immun, 109: 839-846. 122. Mazzoni A, Young HA, Spitzer JH, Visintin A, Segal DM. (2001) Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells, resulting in altered T cell polarization. J Clin Invest, 108: 1865-1873.

82

123. Caron G, Delneste Y, Roelandts E, Duez C, Herbault N, Magistrelli G, Bonnefoy JY, Pestel J, Jeannin P. (2001) Histamine induces CD86 expression and chemokine production by human immature dendritic cells. J Immunol, 166: 6000-6006. 124. Caron G, Delneste Y, Roelandts E, Duez C, Bonnefoy JY, Pestel J, Jeannin P, (2001) Histamine polarizes human dendritic cells into Th2 cell-promoting effector dendritic cells. J Immunol, 167: 3682-3686. 125. Tomita E, Nakamura E, Okabe S. (2005). Exogenous histamine stimulates colorectal cancer implant growth via immunosuppression in mice. J Pharmacol Sci, 97: 116-123.

10.SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 10.1.A doktori értekezésben összefoglaltakkal kapcsolatos saját és társszerzős közlemények 1. Boér K, Darvas Z, Baki M, Kaszás I, Pál Z, Falus A. (2003) Expression of histidine decarboxylase in human colinic cancer cells and adenomatous polyps. Inflamm Res, 52 (Supplement 1): S76- S77. IF: 1,498 2. Boér K, Darvas Z, Bősze Sz, Schwelberger H, Baki M, Bélai F, Pál Zs, Falus A. (2004) Histamine metabolism and CD8 cell infiltration in colon adenomas. Inflamm Res, 53 (Supplement 1): S83- S84. IF: 1,450 3. Boér K, Helinger E, Helinger A, Pocza P, Pos Z, Demeter P, Baranyai Zs, Dede K, Darvas Zs, Falus A. (2008) Decreased expression of histamine H1 and H4 receptors suggests disturbance of local regulation in human colorectal tumours by histamine. Eur J Cell Biol, epub ahead of print. IF: 3,039 4. Hegyesi H, Colombo L, Pállinger E, Tóth S, Boér K, Molnár V, Falus A. (2007) Impact of systemic histamine deficiency on the crosstalk between mammary adenocarcinoma and T cells. J Pharmacol Sci, 105(1): 66-73. IF: 1,592 5. Penyige J, Farczadi E, Boér K, Kaszas I, Csomor J, Demeter P. (2007) A rare intestinal malignancy: mantel cell lymphoma. Endoscopy, 38: E123. IF: 3,605

83

10.2.Poszter prezentációk 1. Boér K, Darvas Zs, Pál Zs, Falus A. (2002) HDC immunreactivity in human colon and breast cancer tissue samples. XXXI.st Meeting of the European Histamine Research Society. Eger (abstr). 2. Boér K, Darvas Zs, Pál Zs, Bősze Sz, Schwelberger H, Falus A. (2003) The comparison of histamine metabolism in healthy colon mucosa, colon adenoma and adenocarcinoma biopsy samples. XXXII Annual Meeting of the European Histamine Research Society, Noordwijkerhout (abstr). 3. Pál Zs, Boér K, Bősze Sz, Falus A, Darvas Zs. (2003) Hisztamin metabolizmus vizsgálata humán vastagbél tumorokban. A Magyar Onkológusok Társaságának XXV. Kongresszusa, Szeged (abstr). 4. Darvas Zs, Boér K, Falus A. (2004) A hisztamin és receptorainak szerepe humán tumorokban. Sejt és Fejlődésbiológiai Kongresszus. Pécs (abstr). 5. Darvas Zs, Boér K, Molnár B, Hellinger E, Hellinger A, Falus A. (2005) Histamine and its receptors in precancerous stages and in tumours. The comparison of histamine metabolism in healthy colon mucosa, XXXIV Annual Meeting of the European Histamine Research Society, Amsterdam (abstr). 6. Boér K, Penyige J, Hellinger A, Hellinger É, Falus A, Darvas Zs. (2005) A hisztamin és receptorainak szerepe a vastagbél adenomában és carcinomában. A Magyar Onkológusok Társaságának XXVI. Kongresszusa. Budapest (abstr). 7. Darvas Z, Boér K, Pócza P, Helinger É, Helinger A, Kiséry N, Szente N, Falus A. (2007) Down regulation of histamine receptor in human colon cancer. European Histamine Research Society, Florence (abstr). 10.3.A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolódó megjelent közlemények és citálható abstractok: 1. Boér K, Lohinszky J, Szánthó J.(1998) Is there any place of 3rd and 4th line chemotherapy in advanced breast cancer (focus on gemcitabine). International Congress on Anti Cancer Treatment, Paris (abstr). 2. Boér K. Docetaxel az emlőrák adjuváns kezelésében. (2002) Pathology and Oncology Research Suppl, 2: 20-25.

84

3. Boér K, Láng I, Juhos É, Pintér T, Szántó J. (2003) Docetaxel kombinációs kezeléssel (TAC) szerzett tapasztalataink az emlőrák adjuváns kemoterápiájában BCIRG 001 randomizált, multicentrikus fázis III vizsgálat hazai eredményei. Magyar Onkológia, 47(2):142-148. 4. Boér K. Az emlőrák gyógyszeres kezelésének kérdései. (2004) Orvosi Hetilap, 143 (14): 725-730. 5. Boér K. Az emlődaganatok szisztémás gyógyszeres kezelése. (2004) Orvosi Hetilap, 145 (4): 187-192. 6. Boér K, Farczádi E, Lohinszky J, Zsolnay Z, Dobó I, Markó L, Szűcs M, Baki M. (2004) Experience with TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) polychemotherpay in the neoadjuvant treatment of breast cancer (abstr). International Congress on Anti Cancer Treatment, Paris (abstr). 7. Boér K. Időskori emlődaganatok kezelésének lehetőségei. (2005) Orvosi Hetilap, 146(1): 15-21. 8. Pusztai P, Sármán B, Illés G, Székely E, Péter I, Boér K, Tihanyi T, Rácz K. (2006) Hypercalcitoninemia in a patients with recurrent goitre and insulinoma: a case report. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 114: 217-221. IF: 1,356 9. Németh Zs, Farczádi E, Boér K. (2007) Kezdeti tapasztalataink pegfilgastrim szekunder profilaxissal. Curr Opin Oncol Magyar Kiadás, 3(1): 21-24. 10. Boér K, Láng I, Llombart-Cussac A, Andreasson I, Vivanco LG, Sanders N, Pover GM, Murray E. (2007) Vandetanib with docetaxel as second-line treatment for advanced breast cancer: a double-blind, placebo-controlled, randomized Phase II study. San Antonio Breast Cancer Conference (abstr). 11. Douillard J-Y, Adenis A, Boer K, Escudero P, Kim TY, Valladares M, Sanders N, Pover G, Lang I. (2008) AZD6244 (ARRY-142886) vs capecitabine (CAP) in patients (pts) with metastatic colorectal cancer (mCRC) who have failed prior chemotherapy. American Society Cancer of Oncology, (abstr).

85

11.KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom Prof. Dr. Falus András egyetemi tanárnak, a Genetikai, Sejt- és Immunológiai Intézet igazgatójának és akadémikusnak hogy lehetővé tette az Intézetben folyó kutatási programhoz való csatlakozásomat. Tanácsaival mindvégig segítette munkámat. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Darvas Zsuzsanna egyetemi docensnek hogy megismertetett a hisztamin kutatás alapjaival, az ő segítségével szereztem meg a témához szükséges kutatói szemléletet. Prof. Dr. Szántó János egyetemi tanár indította el tevékenységemet a tudományos munka terén, köszönöm, hogy lehetővé tette és támogatta kutatói munkámat. Köszönöm Dr. Pócza Péter-nek az immunhisztokémiai munkákban nyújott segítségét. Külön köszönetemet fejezem ki Dr. Pós Zoltánnak a statisztikai feldolgozás magas színvonaláért. Köszönettel tartozom Dr. Demeter Pál osztályvezető főorvos úrnak, akitől értékes tanácsokat kaptam és lehetővé tette a minták gyűjtését. Dr. Penyige József és Dr. Bélai Ferenc kollegáknak is köszönöm a minták gyűjtésében kifejtett aktív közreműködésüket. Köszönöm Dr. Kaszás Ilona és Dr. Zolnai Zsófia főorvosoknak a patológiai háttérben nyújtott segítségüket. Kollégáim, barátaim – Dr. Farczádi Enikő, Dr. Farkas Elek, Dr. Németh Zsuzsanna, Dr. Pap Mária, Dr. Rumszauer Ágnes, – mindvégig segítettek a betegek ellátásában, és sokszor feladataimból is átvettek, hogy tudományos munkámat végezhessem. Dr. Farkas Elek főorvos úrnak külön köszönöm a lektorálásban nyújtott fáradhatatlan segítségét. Köszönöm Baranyai István-nak a technikai segítséget. Hálás vagyok családomnak, édesanyámnak és testvéremnek, akik biztos hátteret és nyugodt légkört biztosítva tették lehetővé, hogy elkészüljön ez a munka.

86