A HISZTAMIN HATÁSÁNAK IN VITRO VIZSGÁLATA A HÍZÓSEJTEK KIALAKULÁSÁBAN ÉS MUKÖDÉSÉBEN
WIENER ZOLTÁN Doktori (PhD) értekezés tézisei Készült a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Tudományok Tudományági Doktori Iskola „Sejt-, extracelluláris mátrix-, rostrendszer változások szív- és érrendszeri és egyes daganatos megbetegedésekben. Kísérletes és diagnosztikus pathomorfológiai vizsgálatok” c. doktori program keretében
Programvezeto: Prof. Dr. Kádár Anna, egyetemi tanár Témavezeto: Prof. Dr. Falus András, egyetemi tanár, Dr. Tóth Sára, egyetemi docens Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Semmelweis Egyetem Budapest, 2004.
BEVEZETÉS Bár a hisztaminnak az allergiában betöltött szerepe már régóta ismert, az újabb kutatások alapján úgy tunik, hogy számos egyéb folyamatban is fontos funkcióval rendelkezik. Ezt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy hisztamin szintézisére a legtöbb sejttípus képes, bár nagy mennyiségu tárolása csak a hízósejtekre és a bazofil granulocitákra jellemzo. A hisztamin hatásainak tanulmányozásában fontos lépést jelentett a képzodésében kizárólagos szereppel rendelkezo hisztidin dekarboxiláz (HDC) enzim génjére nézve deficiens, „knock out” egerek eloállítása. Ezen állatok egyik nem várt fenotípusa a csökkent hízósejt szá m, valamint az, hogy a szöveti hízósejtek granulumai kevésbé elektrondenzek a vad típushoz képest. A hízósejtek szerepe az azonnali típusú túlérzékenységi reakcióban és az allergia korai fázisában megkérdojelezhetetlen, elsosorban a granulumokban tárolt na gy mennyiségu hisztamin miatt. Kiderült azonban, hogy a hízósejtek ennél sokkal többet tudnak, stimulálás hatására Th1-es (pl. tumor nekrózis faktor, TNF-? ) és Th2-es (pl. interleukin (IL)-9, IL-13) citokineket termelnek, ezáltal szabályozhatják a lokális immunválasz Th1, ill. Th2 irányát. Hozzájárulnak a kórokozók elleni védekezo mechanizmusok beindításához a neutrofil granulocitáknak a fertozés helyére történo odavonzásával. A bélrendszeri fertozések során felszabaduló jelentos mennyiségu IL-9 pedig serkenti a mastocytosis megjelenését, vagyis a hízósejtek felszaporodását. Az emberi hízósejtek a csontvelo ill. a köldökvér CD34+/CD117+/CD13+ progenitor populációjából alakulnak ki (hasonló populációt az egér csontveloben még nem sikerült azonosítani), éretlen formában kerülnek ki a perifériás vérbe, terminális differenciációjuk pedig a szövetekben zajlik le. Az egér hízósejtek differenciációjában az ossejt faktornak (SCF) jut kiemelkedo szerep. Ugyanakkor féregfertozés hatására a T-sejtekbol
1
származó faktorok, így IL-3 hatására alakul ki a jellemzo, a bélrendszer mucosájában megfigyelheto hízósejt hiperplázia. Az IL-9 egy pleiotróp citokin, mely foleg az aktivált Tsejtekbol és hízósejtekbol szabadul fel. Az IL-9-et szisztematikusan, vagy tüdospecifikusan túlexpresszáló egerekben az asztmára jellemzo tünetek alakultak ki: a tüdo szöveteiben eozinofil infiltráció, a légútban nyák túltermelés volt megfigyelheto, ezen kívül az intraepiteliális hízósejtek száma és az IgE-szint megemelkedett, valamint fokozott szubepiteliális fibrózist és légúti hiperreaktivitást lehetett kimutatni. Az IL-9 asztmában betöltött fontos szerepére utalnak a genetikai kapcsoltsági elemzések is, melyek során az emberi 5q31-33-as kromoszómaterületre figyeltek fel, mint az IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, több növekedési faktor és receptorának génjeit tartalmazó régióra. Egereken végzett vizsgálatok alapján a légúti hiperreaktivitás a 13. kromoszóma egy kis szakaszához kötheto, ahol az IL-9 génje található. További bizonyíték, hogy az egyes egértörzsekben pozitív korreláció figyelheto meg az IL-9 termelési képesség és az indukált légúti hiperreaktivitás mértéke között Mindezen adatok figyelembevételével az IL-9-et tekinthetjük a légúti hiperreaktivitás és az asztma kialakulásában az egyik legfontosabb kulcstényezonek. Az IL-9-rol ugyancsak ismert, hogy serkenti az egér és emberi hízósejtek proliferációját, valamint egyes hízósejt-specifikus proteázok expresszióját, a nagy affinitású IgE receptor ? -láncának mRNS szintézisét és az IL-6 szekréciót. Ege rekben a mucosa réteg hízósejtjeinek felszaporodása figyelheto meg az IL-9 termelodésének eredményeként például Trichuris muris féregfertozés során. Az embrionális ossejtek (ES sejtek) a blasztociszta embriócsomójából (inner cell mass, ICM) származó pluripotens sejtek, melyek a trofoblasztok kivételével valamennyi differenciálódott sejttípus eloállítására képesek. Az egér ES-sejtek leukémia gátló faktor (LIF) jelenlétében tarthatók fenn differenciálatlan állapotban. A különbözo, a szervezetet felépíto sejttípusok eloállításához speciális környezetre és differenciáltatási technikákra van szükség. Az embrionális ossejtek pluripotens 2
jellegük miatt kiváló modellrendszert biztosítanak az egyes sejttípusok (köztük a hízósejtek) korai embrionális kialakulásának tanulmányozására.
CÉLKITUZÉSEK A hisztaminnak a hízósejtekre gyakorolt hatását két fontos nézopontból vizsgáltuk meg. Abból az érdekes megfigyelésbol indultunk ki, hogy a genetikailag hisztaminhiányos egerekben a hízósejtek csökkent számban vannak jelen. A következo kérdésekre kerestük a választ: ? Kimutatható-e a csökkent hízósejt arány a HDC-/egerek csontvelejébol alapított sejttenyészetekben? ? Ha igen, akkor mely fázisban gátolt a differenciáció? ? Célunk volt a hisztamin hatásának bizonyítása egy másik, független modellrendszerben is az embrionális ossejtek felhasználásával. Ehhez meg kellett határoznunk, hogy a HDC és a hisztamin receptorok a differenciáció mely fázisában expresszálódnak. Ezzel párhuzamosan a HDC-/- hízósejtek muködésbeli eltérései is érdeklodésünk középpontjába kerültek, különös tekintettel az IL-9 stimuláló hatására. Kérdéseink ezzel kapcsolatban: ? Milyen citokineket indukál az IL-9 egyedül, vagy IgE/antigénnel ill. ionomycinnel együttesen? ? Az IL-9 által indukált citokinek milyen idobeli kinetikával jellemezhetok? ? Hogyan fejti ki hatását az IL-9? ? Hogyan befolyásolja az IL-9 a hízósejtek hisztamin felszabadítását? ? Mi a különbség a vad típusú és a HDC-/- hízósejteknek IL-9 stimulusra adott citokinexpressziós válasza között?
3
ALKALMAZOTT MÓDSZEREK A kísérletek során felhasznált állatok Kísérleteink során 2-4 hónapos hím, CD1 és Balb/c genetikai hátteru egereket használtunk. A HDC-/ - genetikailag módosított állatok eloállítása kollaboráció keretében történt. A peritoneális sejtek kinyerése A peritoneális sejtek kinyeréséhez az állatoknál cervikális diszlokációt hajtottunk végre, majd a hasüregüket PBS-sel mostuk ki. Sejttenyészet alapítása Az egerek combcsontjaiból kimosott sejteket 20% Wehi 3B felülúszó (a Wehi 3B IL-3-at termelo sejtvonal), vag y 2-3 ng/ml rekombináns egér IL-3 jelenlétében tenyésztettük. Az SCF-et 40 ng/ml, a hisztamint 10-5 M vagy 200 ?M, az ? -fluorometil-hisztamint pedig az intézet korábbi tapasztalatai alapján hatásosnak bizonyult 5x10-5 M koncentrációban alkalmaztuk. A nem adherens sejteket 5-6 naponként friss tenyészedénybe tettük, közben a tápfolyadék felét lecseréltük. A citokinexpressziós vizsgálatokhoz a hízósejteket rekombináns egér IL-3 és SCF jelenlétében 16-18 napig tenyésztettük. Enzimhisztokémia és alciánkék-safranin festés A triptáz aktivitás detektálásához a sejteket fixáltuk, mesterséges szubsztrát (Z-Gly-Pro-Arg-4-M? NA) és Fast Blue B jelenlétében 37 o C-on inkubáltuk 90 percig. A triptáz pozitív sejtek arányát azután 6-8 véletlenszeruen kiválasztott látómezoben határoztuk meg. A hízósejtek granulumaiban található savas poliszacharidok alciánkék-safranin festéssel történo kimutatásához a sejteket fixálás után 35 percig a festékoldatban szobahomérsékleten inkubáltuk. Szemiszolid kolónia-teszt A csontvelobol kimosott sejteket 1% metilcellulózt tartalmazó médiumban tenyésztettük. A megjeleno különbözo morfológiájú kolóniákat a 14. napon fáziskontraszt mikroszkóp segítségével számoltuk meg. A CCE embrionális ossejtvonal fenntartása és differenciáltatása A kísérletek során a CCE egér embrionális ossejtvonalat 10 ng/ml LIF jelenlétében tartottuk fenn differenciálatlan állapotban. A differenciáltatást 2x104 sejtkoncentrációval olyan bakteriális petricsészékben indítottuk el, melyben a kialakuló sejtaggregátumok (embrioid testek, EB) nem tudtak letapadni. 12 nap után a vörösvérsejteket tartalmazó (hemopoetikus) EB-kat mikroszkóp alatt kiválogattuk, és zselatinnal elokezelt szövettenyészto edényekbe tettük IL-3 és SCF jelenlétében. A letapadt EB-ból megjeleno úszó sejteket 18-20 nap múlva értékeltük.
4
Áramlási citometria (FACS) A mintákat PBS + 1% BSA oldatban jelöltük meg, majd FACSCalibur áramlási citométerrel elemeztük. A triptáz detektálásához a sejteket eloször paraformaldehidben fixáltuk, majd szaponinnal permeabilizáltuk. A hisztamin kimutataása során EDAC-ot használtunk fixálószerként. RT-PCR Az RNS izolálása Chomczyinski fenol-kloroformos módszere szerint történt, majd RT-PCR vizsgálatot végeztünk az mMCP-6, mMCP-5, Fc?RI? , HDC, H1R, H2R és a GAPDH mRNS-ének kimutatására. Hisztamin ELISA A stimulált és nem stimulált hízósejttenyészetek (1x106 sejt/ml) felülúszójának hisztamintartalmát hisztamin ELISA kittel határoztuk meg. A hízósejtek stimulálása A citokinexpressziós profil meghatározásához a hízósejteket 0,5 ?g/ml ionomycinnel és/vagy 30 ng/ml IL-9-cel, vagy ionomycin + 10 ng/ml IL-1? -val stimuláltuk IL-3 és SCF jelenlétében. Néhány kísérletben a sejteket dinitrofenilBSA-ra (DNP11 -BSA) specifikus egér IgE-vel egy éjszakán át szenzitizáltuk, majd a felesleges IgE-t kétszeri mosással távolítottuk el. Ezután a sejteket 37 o C-on 200 ng/ml antigénnel inkubáltuk IL-9 jelenlétében vagy hiányában. RPA (RNase protection assay) Az RPA-hoz mintánként kb. 5 ?g RNS-t használtunk fel. A vizsgálatokhoz az mCK1b (IL-4,5,10,13,15,9,2,3,IFN-?) és mCK2b (IL-12p35,12p40,10,1a,1b,IL1Ra,18/IGIF,6,IFN-?,MIF) multipróba sorozatok, az in vitro transzkripciós kit és az RPA kit a PharMingen-tol származott. Az ? -33 P-uridinnal jelölt emésztetlen próbákat 5%-os poliakrilamid szekvenálógélen választottuk szét egymástól, a sávok radioaktivitását pedig phosphoimager készülékkel határoztuk meg. Az adatok kiértékeléséhez az AIDA és a Microsoft Excel szoftvereket használtuk. Az intenzitásértékeket az L32 riboszomális fehérjét kódoló háztartási gén intenzitásértékével hasonlítottuk össze, így kaptuk a relatív expressziós szinteket. Statisztikai elemzés A statisztikai elemzésekhez Student t-tesztet, egyutas és kétutas ANOVA -t, Tukey-féle többszörös páronkénti összehasonlítást, illetve z-tesztet használtunk, a kiértékelendo adatoktól függoen. A statisztikai tesztek elvégzése elott normalitásvizsgálatot hajtottunk végre.
5
EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK A hisztamin szerepe a hízósejtek differenciációjában Kísérleteinkben célul tuztük ki a hiszt aminnak a hízósejtek differenciációjában betöltött szerepének vizsgálatát. Kimutattuk, hogy a hisztaminhiányos egerek hasüregében a hízósejtek száma szignifikánsan alacsonyabb, mint a vad típusú állatok esetében. Ennek az eltérésnek az egyik lehetséges magyarázata, hogy a csontvelobol kiinduló hízósejt differenciáció valamelyik ponton gátolt a HDC-/- egerekben. Kísérleteink során a HDC-/- egerek csontvelejébol alapított sejttenyészetekben a nem adherens sejteket jellemeztük. A triptáz, mMCP5, c-kit és Fc?RI? expressziójának vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a pozitív sejtek aránya alacsonyabb a HDC-/tenyészetekben, ami csökkent hízósejt differenciációs folyamatokra utal. Minthogy a hízósejt eloalakok, melyek a Thy1.2low/ckithigh /Mac1-/low markerkombinációval jellemezhetok, szintén csökkent arányban voltak jelen a hisztaminmentes tenyészetekben, azt a következtetést vontuk le, hogy a hisztamin a hízósejtek korai differenciációs folyamatait befolyásolja. Ezt megerosítik azon kísérleteink, melyekben vad típusú kultúráknak a HDC enzim gátlószerét, ? -fluorometil- hisztidint (FMH) adtunk, és nem kaptunk változást. Hasonlóan, HDC-/- tenyészetek hisztaminnal való kezelése során sem láttunk emelkedést a triptáz pozitív sejtek arányában. A HDC-/- tenyészetekben a Thy1.2low/c-kithigh /Mac1-/low promastocyták arányának csökkenésével párhuzamosan a Mac1high populáció méretének növekedését lehetett kimutatni. Ezen kívül csontveloi sejtek szemiszolid médiumban való kolóniaképzését is megvizsgáltuk (kolónia-teszt), és azt tapasztaltuk, hogy a HDC-/- és a vad típusú csontvelokben a különbözo kolóniaképzo sejtek aránya eltéro, ami arra utal, hogy a kísérletekben tapasztalt, a hízósejtek differenciációját érinto eltérések a hisztaminhiányos és vad típusú egerek csontvelejének eltéro progenitorsejt összetételével magyarázható. Minthogy irodalmi adatok alapján a csontveloben hisztamin elsosorban különbözo citokinek, például IL-3 hatására 6
termelodik, a vad típusú és HDC-/- egerek között tapasztalt eltérés egy lehetséges magyarázata, hogy az IL-3 a génkiütött állatok hízósejt eloalakjaiban –hasonlóan a bazofil progenitorokhoz- nem képes hisztaminszintézist indukálni, ami befolyásolja az osztódásukat. A hisztamin és a hízósejtek differenciációja közti kapcsolatot egy másik modellrendszeren, az embrionális ossejtek felhasználásával és a HDC enzim differenciáció során való gátlásával is megpróbáltuk bizonyítani. Eloször azonban a HDC és a hisztamin receptorok expressziós mintázatára voltunk kíváncsiak. Eredményeink szerint a HDC expresszálódik mind a differenciálatlan CCE ES sejtvonalban, mind pedig a 4, 8 és 16 napos sejtaggregátumban, az ún. embrioid testekben (EB-k). Differenciálatlan ES sejtekben a H1 receptor jelenléte igazolható volt, a H2 receptoré viszont nem. A H2R expressziójának hiánya jól egyezik korábbi irodalmi adatokkal, melyek szerint az implantálódó egér embriók trofoblaszt rétegében kimutatták a H2R jelenlétét, az embriócsomó sejtjeiben viszont nem. Kísérleteink statisztikai elemzése alapján a hízósejtek ES-sejtekbol való kialakulásában szerepet játszik a hisztamin, hiszen szignifikánsan kevesebb alkalommal jelent meg ez a sejttípus azon EB-k esetében, melyekben a HDC enzimet legátoltuk. Eredményünk alátámasztja a HDC-/- egerek esetében megfigyelteket, miszerint a hisztaminnak jelentos szerepe van a hízósejtek/progenitoraik kialakulásában.
A hisztamin hiánya befolyásolja a hízósejtek funkcióit A hízósejtek funkcionális vizsgálata során figyelmünk az IL-9 felé terelodött. A vizsgált citokinek közül az IL-1? , IL-1? , IL-1Ra, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 és MIF mRNS-ét mutattuk ki IL-9 + ionomycin stimulus hatására RPA módszerrel. Az IL-9, illetve az ionomycin önállóan a mi rendszerünkben nem váltott ki nagymértéku citokinexpressziót. Minthogy az ionomycin nem fiziológiás stimulus, az antigén-specifikus IgE/antigén és/vagy IL-9 hatását is megvizsgáltuk bizonyos citokinek expressziós szintje 7
tekintetében. IgE/antigén stimulus hatására egyes citokinek (pl. IL-3, IL-5, IL-9, IL-13) expressziója kimutatható volt rendszerünkben. IL9-cel való kostimuláció során az IL-5, IL-9 és IL-13 szintjében jelentos emelkedést tapasztaltunk, ami megerosíti, hogy az IL-9 nemcsak az ionomycin, hanem az IgE/antigén hatását is fokozza. Az IL-9 + ionomycin stimulus hatására expresszálódó különbözo citokinek idobeli kinetikáját is megvizsgáltuk, és három csoportot tudtunk kialakítani. Míg az IL-5, IL-6, MIF, IL-1? és az IL-1Ra termelodése a stimuláció elso 12 órája alatt megemelkedett, majd nagyjából állandó maradt, addig az IL-4 és az IL-13 szintjében csökkenést tapasztaltunk. A harmadik csoportba az IL-10 és az IL-9 tartozik; ez utóbbi expressziójában csak 12 óra után lehet drámai emelkedést megfigyelni. Ez arra utal, hogy az IL-9 egy viszonylag késon megjeleno citokin, ami jól egyezik az IL-1 + ionomycin stimulus hatására kapott korábbi, az irodalomból ismert eredményekkel, mely során az IL-9 fehérje szinten csak 24 órás stimuláció után volt kimutatható. Noha az IL-9 önmagában nem képes a hízósejtek nagymértéku citokinexpresszióját kiváltani, a degranulációhoz azonban hozzájárulhat. Ezt a lehetoséget úgy vizsgáltuk, hogy különbözo módon kezelt hízósejt tenyészetek felülúszójában a hisztaminkoncentrációt ELISA- val meghatároztuk. Statisztikai analízisünk szerint az IL-9-cel kezelt és a kezeletlen kontroll hízósejtkultúrák felülúszójában nincs szignifikáns eltérés a hisztamintartalomban, így az IL-9 önmagában nem serkenti a hízósejtek degranulációját. Várakozásunknak megfeleloen ionomycin hatására megnott a felszabaduló hisztamin mennyisége, amely azonban IL-9 kostimuláló hatására tovább fokozódott. Az IL-1 + ionomycin és IL-9 + ionomycin stimulusok hatására a hízósejtekben tapasztalt hasonló citokinexpressziós mintázat arra utalhat, hogy az IL-9 esetleg az IL-1 indukcióján keresztül fejti ki hatását. Minthogy az IL-1? expressziós szintje nem változott IL-9 + ionomycin hatására, ezért hipotézisünket anti-IL-1? neutralizáló ellenanyag felhasználásával vizsgáltuk meg. Kísérleteink azt 8
mutatták, hogy legalábbis a citokinek egy részénél az IL-9 + ionomycin stimulus az IL-1? termelodésén át fejti ki hatását, ami arra utal, hogy az egyes citokinek hálózatszeruen befolyásolják egymás kostimulációs hatását. A hisztamin fontos mediátor az allergiás és asztmatikus reakciókban. Ennek megfeleloen a hisztaminhiányos egerekben megfigyelheto indukált asztmatikus tünetegyüttes kevésbé súlyos, mint a vad típusú állatokban. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a hisztaminmentes hízósejtek IL-9 + ionomycin stimulusra csökkent IL-1? , valamint IL-9 termeléssel válaszolnak. Lényegében hasonló eredményt kaptunk, amikor az ionomycin helyett IgE/antigént alkalmaztunk, és néhány citokin expresszióját néztük. A hisztaminhiányos hízósejtek továbbá, az IL-4, IL-5, IL13-mal ellentétben csökkent IL-9 termeléssel válaszolnak olyan koncentrációjú IL-1? + ionomycin stimulusra, mely esetében irodalmi adatok alapján a citokinexpressziós hatás maximális. Minthogy mind a Th sejtek, mind pedig az IL-1 által aktivált hízósejtek is képesek IL-9 eloállítására, ez azt mutatja, hogy az IL-9 IgE/antigén jelenlétében autokrin vagy parakrin indukciós faktorként szolgál a hízósejtek számára. Ez az autoindukciós kör egészen addig aktív maradhat, amíg IgE/antigén található a hízósejtek környezetében. Az IL-9 termelésért felelos pozitív visszacsatolási kör valószínuleg csökkent mértékben muködik a HDC-/- állatokban, ez magyarázattal szolgálhat a hisztaminmentes egerek kevésbé súlyos asztmatikus tüneteire. Eredményeink alapján tehát arra a következtetésre jutottunk, hogy nem csak a hízósejtek fontosak a hisztamin szintézisében, tárolásában és szabályozott felszabadításában, hanem a hisztamin is befolyásolja a hízósejtek kialakulását és stimulált citokinterme lését.
9
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK Wiener Z, Buzas E, Kovacs P, Csaba Gy, Szabo D, Kittel Á,. Pállinger É, Watanabe T, Ohtsu H,. Ichikawa A,. Nagy A,. Falus A (2001) Highly reduced peritoneal mast cell number and decreased c-kit expressio n in histidine decarboxylase knock out mice. Inflamm Res 50, Supplement 2: S55-56. IF: 1,325 Wiener Z, Andrásfalvy M, Pállinger É, Kovács P, Szalai Cs, Erdei A, Tóth S, Nagy A, Falus A (2002) Bone marrow-derived mast cell differentiation is strongly reduced in histidine decarboxylase knockout, histamine- free mice. Int Immunol, 14: 381-87. IF: 3,595 Wiener Z,. Tóth S,. Gócza E,. Kobolák J,. Falus A (2003) Mouse embryonic stem cells express histidine decarboxylase and histamine H1 receptors. Inflamm Res 52, Supplement 1: S53-54. IF (2002): 1,602 Wiener Z, Falus A, Toth S (2004) IL-9 increases the expression of several cytokines in activated mast cells, while the IL9 induced IL-9 production is inhibited in mast cells of histaminefree transgenic mice. Cytokine 26: 122-30. IF (2002): 2,374
ELOADÁSOK, POSZTEREK ?
?
Wiener Z, Falus A, Tóth S: IL-9 increases the expression of several cytokines in activated mast cells while the IL9 induced IL-9 production is inhibited in mast cells of histamine- free transgenic mice (poszter). Az EHRS (European Histamine Research Society) XXXIII. nemzetközi találkozója, 2004. április, Németország. Wiener Z, Tóth S, Falus A: Histamine and ES cell-derived hematopoietic differentiation (eloadás). Az EHRS XXXI. nemzetközi találkozója, 2002. május, Eger. 10
?
?
?
? ?
?
?
Wiener Z, Andrásfalvy M, Tóth S, Buzás E, Pállinger É, Kovács P, Csaba Gy, Falus A: Mast cell differentiation is inhibited in histamine- free (HDC-KO) mice (poszter). Az ETCS (European Tissue Culture Society) 43. nemzetközi találkozója, Granada, Spanyolország, 2001. szeptember. 30 - október 3. Wiener Z, Andrásfalvy M, Tóth S, Buzás E, Pállinger É, Kovács P, Csaba Gy, Erdei A, Falus A: Highly reduced mast cells and modified differentiation profile in the bone marrow of histaminefree (HDC-KO) mice (eloadás). 11th EFIS Meeting on Signals and Signal Processing in the Immune System. Pécs, 2001. szeptember 2-6. Wiener Z, Ontsouka E, Torgler R, Falus A, Brunner T: A Max és az NF?B szinergisztikusan indukálja a FasL promotert humán nem kis sejtes tüdoráksejtekben (eloadás). A MIT Vándorgyulése, Gyor, 2003. október. Wiener Z, Pós Z, Tóth S, Falus A: Módosult citokinexpressziós mintázat hisztaminhiányos hízósejtekben (eloadás). A MIT Vándorgyulése, Kaposvár, 2002. október. Wiener Z, Tóth S, Falus A: A hisztamin és a hisztidin dekarboxiláz vizsgálata az embrionális ossejtek differenciációjában (eloadás). Semmelweis Egyetem PhD Napok, 2002. április. Wiener Z, Andrásfalvy M, Tóth S, Búzás E, Pállinger É, Kovács P, Csaba Gy, Erdei A, Falus A: A csontveloi eredetu hízósejtek differenciációja gátolt a hisztaminmentes (HDC-KO) egerekben (eloadás). A MIT Vándorgyulése, Eger, 2001. október. Wiener Z Andrásfalvy M, Tóth S, Búzás E, Pállinger É, Kovács P, Csaba Gy, Erdei A, Watanabe T, Ohtsu H, Ichikawa A, Falus A: Eltéro hízósejt differenciálódás vad típusú és hisztaminmentes (HDC- „knock out”) egerekben (eloadás). „Új eredmények a hisztamin kutatásokban” tudományos konferencia, Semmelweis Egyetem, NET, 2001. április 9.
11
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni a doktori munkám elkészítésével kapcsolatban: ? Dr. Falus András Professzor Úrnak, aki tanított, a munkámat végig figyelemmel követte, segített az eredmények értékelésében és publikálásában; ? Dr. Tóth Sárának, aki rengeteg szakmai segítséget nyújtott, elsosorban a szövettenyésztés és az embrionális ossejtek terén; ? Dr. Buzás Editnek és dr. Hegyesi Hargitának az egerekkel kapcsolatos segítségnyújtásért; ? Dr. Pállinger Évának az áramlási citometria módszerének megtanításáért; ? Pós Zoltán doktorandusz társamnak a szakmai beszélgetésekért és molekuláris technikákban való együttmuködésért; ? Farkasné Nagy Krisztina, Ördögh Judit és Orbán Andrea asszisztenseknek a szövettenyésztési munkákban nyújtott segítségükért; ? Családomnak és barátaimnak, hogy türelemmel és szeretettel támogatnak; ? Végül, de nem utolsósorban a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet és az MTA-SE Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport összes dolgozójának, hogy barátsággal és szeretettel vettek körül.
12
