AZ INTERLEUKIN-6 (IL-6) ÉS A HISZTAMIN SZEREPE A MELANOMA AUTOKRIN SZABÁLYOZÁSÁBAN
LÁZÁRNÉ MOLNÁR ESZTER Doktori (PhD) értekezés tézisei
Készült a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola „ A humán molekuláris genetika és a géndiagnosztika alapjai” c. PhD program keretében Programvezető: Dr. Falus András egyetemi tanár Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Semmelweis Egyetem Budapest, 2002.
BEVEZETÉS A malignus melanoma egy fokozottan invazív, magas letalitással rendelkező tumor amely a melanocita sejtek kóros elváltozásából jön létre. Kialakulásában kulcsszerepet játszik az UV fény karcinogén és immunszuppresszáns hatása. A melanoma kialakulása és progressziója során növekedési faktorok és citokinek fokozott expressziója figyelhető meg, amelyek autokrin és parakrin hatásaikkal csökkentik az immunválasz hatékonyságát és lehetővé teszik a tumor önálló növekedését. Az interleukin-6 (IL-6) sokféle immunológiai, gyulladásos és hematológiai szerepe mellett szabályozza a melanoma sejtek növekedését is. Az IL-6 kettős hatású növekedési faktor melanomában, mivel gátolja a melanociták és a primer melanoma sejtek osztódását, de a késői metasztatikus melanoma sejtek rezisztenssé válnak, sőt 5060 %-ban saját IL-6-t termelnek, amely autokrin módon fokozza az osztódásukat. A hisztamin [2-(4-imidazolil)-etilamin] egy közismert biogén amin, amelynek élettani és patofiziológiai fontosságát már 1910 óta ismerjük, szerepéről alkotott képünk azóta is egyre bővül. Az utóbbi évek kutatásai bebizonyították, hogy a hisztamin jelen van osztódó sejtekben, szövetekben, és úgy a normál (pl. sebgyógyulás), mint a kóros sejtosztódásban (tumorok) fontos szabályozó szerepet tölt be. Munkacsoportunk korábbi eredményeiből ismert, hogy a hisztamin és az azt kizárólagosan előállító hisztidin dekarboxiláz enzim (HDC) jelen van mind a melanoma szövetmintákban, mind pedig sejtvonalakban, sőt a melanoma sejtek képesek hisztamin felvételre illetve leadásra környezetük felé (Darvas Zs 2000). A sejtosztódásra gyakorolt közvetlen hatása mellett a hisztamin akut gyulladásos és allergiás reakciók fontos mediátora, és szabályozza számos citokin és citokin receptor expresszióját is. Korábbi eredményekből ismert, hogy a hisztamin fokozza az IL-6 bioszintézist glioblastomában és B lymphomában (Falus A, 1992). Ugyanakkor a hisztamin az IL-6 receptor expresszióját is szabályozza humán lymphoid, monocytoid és hepatoma sejtvonalakban (Merétey K, 1991).
CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteink során az IL-6 és a hisztamin szabályozó szerepét vizsgáltuk különböző metasztatikus állapotú humán melanoma sejtek növekedésében. Az alábbi kérdésekre próbáltunk választ keresni: Hogyan befolyásolja a hisztamin a melanoma sejtek autokrin IL-6 termelését? Milyen közvetlen szerepe van a hisztaminnak a melanoma sejtek osztódásában, milyen receptorok és milyen jelátviteli utak vesznek ebben részt? Hogyan hat az IL-6 a melanoma sejtek hisztamin és HDC tartalmára, és hogyan befolyásolja a H1 és H2 hisztamin receptor expressziót?
ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Sejttenyésztés Kísérleteinket négy, különböző metasztatizáló képességgel rendelkező humán melanoma vonalon végeztük, amelyeket Dr.Tímár József bocsátott rendelkezésünkre. Az M1/15 és HT168/91 fokozott, a primer léziókból származó WM983B és a WM35 alacsony (WM983B), illetve nem (WM35) metasztatizáló jellegű. In vitro kezelések A különféle kezelésekhez a következő vegyületeket használtuk: hisztamin (10-510-8 M), H1 agonista 2-(3-fluorofenil)-hisztamin (10-5 M), H2 agonista arpromidin (10-5 M), H1 antagonista triprolidin (10-4-10-6), H2 antagonista ranitidin és famotidin (10-5 M), HDC gátló α-fluoro-metil-hisztidin (α-FMH, 10-4 M), humán rekombináns IL-6 (5100 ng/ml). IL-6 mérés A sejtekről eltávolított felülúszóban az IL-6 koncentrációt ELISA kitek segítségével határoztuk meg.
mRNS izolálás és RT-PCR A teljes celluláris RNS-t a melanoma sejtekből Chomczinsky fenol-kloroformos módszerével izoláltuk, majd RT-PCR vizsgálatokat végeztünk az IL-6, IL-6R, gp130, valamint a H1 és H2 hisztamin receptor mRNS-k kimutatására. Sejtproliferáció mérés kolóniaképződéses módszerrel A sejteket alacsony sejtszámmal szétosztottuk, majd kezelés után tovább tenyésztettük, amíg a kolóniák kialakultak. 8 napos tenyésztés után megszámoltuk a legalább 50 sejtből álló kolóniákat. Sejtproliferáció mérés MTT módszerrel A 96 lyukú tenyésztőedénybe szétosztott sejteket a kezelési idő lejárta után MTT-vel [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difenil tetrazólium bromid] inkubáltuk 4 h-t. Ezután eltávolítottuk a felülúszókat, és a DMSO-ban feloldott csapadékot ELISA reader segítségével lemértük 540, illetve 620 nm-en. cAMP mérés A sejteket hisztaminnal és hisztamin agonistákkal stimuláltuk 10 percig 37°Con, majd a keletkezett cAMP-t etanolos kivonás után radioimmunoassay (RIA) módszerrel határoztuk meg. IP3 mérés A sejteket 3H-mioinozitol jelenlétében tenyésztettük 18 h-t, majd 20 percig hisztaminnal illetve hisztamin agonistákkal stimuláltuk. A sejtekből kloroform-metanolvíz eleggyel kivont inozitolfoszfátot anioncserélő gyantán elválasztottuk, az egyes frakciók aktivitását folyadékszcintillációs számlálóban mértük le.
HDC kimutatása Western blottal A 10 µg fehérjét tartalmazó sejtlizátumokat 10%-os poliakrilamid gélen megfuttattuk (SDS-PAGE), majd a szétvált fehérjéket PVDF nylon membránra
blottoltuk. A HDC fehérje specifikus kimutatásához 100 ng/ml affinitás tisztított poliklonális csirke anti-HDC antitestet használtunk, amelyet intézetünk a Promega céggel közösen fejlesztett ki. Második antitestként HRP-konjugált anti-csirke antitestet alkalmaztunk. Az ECL reagens hozzáadásával kapott fluoreszcencia jelet X-Omat filmmel detektáltuk. HDC és hisztamin kimutatása áramlási citometriával HDC kimutatásához a sejteket paraformaldehiddel fixáltuk, majd szaponinnal permeabilizáltuk. A HDC jelöléséhez poliklonális csirke anti-humán HDC antitestet, majd FITC-konjugált, nyúl anti-csirke IgY antitestet alkalmaztunk. Az intracelluláris hisztamin kimutatásához a sejteket EDAC-kal fixáltuk, szaponin oldattal permeabilizáltuk, majd nyúl antihisztamin antitesttel, ezután pedig FITC-jelölt kecske anti-nyúl antitesttel jelöltük. A mintákat Beckton-Dickinson FACS Calibur áramlási citométerrel mértük le. A hisztaminra festett sejteket kripton/argon lézerrel felszerelt BioRad MRC 1024 konfokális lézer scanning mikroszkóppal is megvizsgáltuk. IL-6 immunohisztokémia A tárgylemezre növesztett sejteket paraformaldehides fixálás majd BSA-val történő blokkolás után nyúl anti-humán-IL-6 antitesttel, majd FITC-jelölt anti-nyúl antitesttel jelöltük. A mintákat ezután konfokális lézer scanning mikroszkóppal vizsgáltuk. Statisztikai módszerek Az eredmények statisztikai elemzéséhez Student féle t próbát és one way ANOVA-t használtunk.
EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK Kísérleteinkben célul tűztük ki a hisztamin és az IL-6 közötti kétoldalú kölcsönhatások tanulmányozását eltérő metasztatikus képességű humán melanoma vonalakban, valamint a hisztamin receptorok közvetlen szerepének a vizsgálatát a melanoma sejtek osztódásának szabályozásában. A vizsgált melanoma vonalak mindegyikében kimutatható az IL-6R (gp80) és a közös jelátvivő elem, a gp130 expresszió. A metasztatikus képességtől függetlenül az IL-6 mRNS is kimutatható mindegyik vonalban, de IL-6 fehérje szekréciót csak a fokozottan metasztatikus M1/15 és HT168/91 vonalakban mértünk ELISA módszerrel. Immuncitokémiával a primer WM35 melanoma sejtekben is ki tudtuk mutatni az intracelluláris IL-6 fehérjét, és ez arra utal, hogy az IL-6 egy szekréciós blokk következtében nem jut ki a primer melanoma sejtek felülúszójába. Hogy tanulmányozhassuk az intracelluláris hisztaminnak a melanoma sejtek IL6 bioszintézisében betöltött szerepét, különböző hisztamin antagonistákkal kezeltük a melanoma sejtkultúrákat, és meghatároztuk a felülúszóba kibocsátott IL-6 mennyiséget. A H1 antagonista triprolidin dózisfüggően csökkentette az IL-6 szekréciót az M1/15 melanoma sejtvonalban, ez a tendencia a HT168/91 vonalban is kimutatható volt. Egy következő kísérletben megvizsgáltuk az intracelluláris HDC enzim irreverzibilis gátlásának a hatását a melanoma sejtek IL-6 termelésére. Tartós α-FMH (HDC gátló) kezelés hatására csökkent az IL-6 szekréció a 8. napon, majd visszatért eredeti értékére. Ez azzal magyarázható, hogy a melanoma sejtek jelentős mennyiségű "előregyártott" hisztamint tartalmaznak, és ugyanakkor az IL-6 bioszintézist más tényezők is szabályozzák (IL-1, TNF-α, adenozin, stb). Kísérleteink azt bizonyítják, hogy a hisztamin H1 receptoron keresztül fokozza az IL-6 bioszintézist metasztatikus melanoma sejtekben. Ez a jelenség összhangban van a hisztamin más sejttípusokban megfigyelt, szintén H1R mediált hatásával, ugyanis ismert, hogy a hisztamin növeli az IL-6 termelést humán tüdő makrofágokban, szem kötőhártya epitél sejtekben, köldökvéna endotél sejtekben is (Triggiani M 2001, Weimer LK 1997, Molet S 1997).
A hisztamin, illetve a HDC enzim fokozott mennyiségben jelen van a melanoma sejtekben, és ez felveti a közvetlen szabályozás lehetőségét is. RT-PCR módszerrel kimutattuk, hogy mindenik melanoma vonalban expresszálódik a H1 és a H2 hisztamin receptor. A hisztamin receptorok funkcionális jellemzése céljából megvizsgáltuk a receptor aktiválás következtében keletkező másodlagos hírvivő molekulákat. Nagy mértékű, az alapérték 30-szorosát elérő cAMP-szint emelkedést mutattunk ki a WM35 primer melanoma vonalban hisztamin, illetve H2 agonista hatására, amely H2 antagonistával blokkolható volt. A fokozottan metasztatikus vonalakban kisebb volt, illetve nem volt kimutatható szignifikáns cAMP szint emelkedés hasonló körülmények között, ami arra utal, hogy a tumor progresszióval a H2 receptorok aktiválhatósága csökken. A H1 receptorok funkcionális vizsgálata céljából inozitol turnover vizsgálatot végeztünk, és azt kaptuk, hogy az M1/15 és HT168/91 metasztatikus vonalakban 30%kal növekedett az intracelluláris IP3 szint hisztamin és H1 agonista hatására. A melanoma sejtekben, illetve a sejtek felülúszójában mérhető hisztamin, mint ligand, valamint a funkcionálisan aktív H1 és H2 receptorok jelenléte felveti annak a lehetőségét, hogy a hisztaminnak autokrin növekedési faktor szerepe lehet ezekben a sejtekben. A jelátviteli mérésekkel párhuzamosan proliferációs vizsgálatokat is végeztünk, monolayerben történő kolóniaképződéses módszert alkalmazva. A hisztamin kis koncentrációban (10-7M) szignifikánsan növelte a sejtkolóniák számát a WM35 primer melanoma vonalban. Hasonlóképpen fokozta a proliferációt a H2 agonista arpromidin, valamint a kontrollként használt forskolin, viszont H2 antagonista jelenléte meggátolta a hisztamin proliferatív hatását. Mindez azt bizonyítja, hogy a hisztamin H2 receptoron, az intracelluláris cAMP szint növekedése, valamint a proteinkináz A enzim aktiválása révén fejti ki mitogén hatását ebben a primer melanoma vonalban. A hisztamin tehát növekedési faktor lehet primer melanomában. Ezzel ellentétesen a nagyobb, 10-5 M hisztamin, valamint a H1 agonista gátolta a proliferációt, csökkentette a kolóniaszámot mind a négy melanoma vonalban. A hisztamin tehát koncentráció függően, eltérő receptorokon ellentétesen szabályozza a melanoma sejtek osztódását. A hisztaminra adott választ a melanoma sejt prognosztikus állapota, valamint a H1/H2 receptor arány határozza meg.
Habár a hisztamin IL-6 és IL-6R expressziót szabályozó szerepe jól ismert, keveset tudunk e szabályozó mechanizmus fordított oldaláról, vagyis arról, hogy milyen szerepe van az IL-6-nak a hiszamin szint, hisztamin metabolizmus, vagy a hisztamin receptor expresszió szabályozásában. További kísérleteinkben a WM35 melanoma vonal tanulmányozásával kerestünk választ ezekre a kérdésekre. Mivel az IL-6 eredményeink és irodalmi adatok alapján - jelentősen gátolja a WM35 melanoma sejtek proliferációját, az a kérdés is felvetődött, hogy van-e szerepe a hisztaminnak az IL-6 gátló hatásában. IL-6 kezelés (5-100 ng/ml) után meghatároztuk a WM35 melanoma sejtekben az intracelluláris hisztamin, illetve HDC tartalmat. Western blot módszerrel kimutattuk, hogy az IL-6 50%-kal növelte a HDC expressziót ebben a sejtvonalban, áramlási citometriás méréssel is hasonló eredményeket kaptunk. Az intracelluláris hisztamin mennyiségét áramlási citometriával határoztuk meg, és azt az eredményt kaptuk, hogy az IL-6 kezelés jelentősen növelte a WM35 sejtekben a hisztamin tartalmat. A lézer konfokális mikroszkópos vizsgálat azt mutatta, hogy a kontrollhoz viszonyítva megnövekedett az erősen hisztamin pozitív sejtek száma. Ezután RT-PCR módszerrel megvizsgáltuk az IL-6 hatását a H1 és H2 receptor expresszióra. Azt találtuk, hogy az IL-6 eltérő módon szabályozza a H1 és H2 receptor mRNS szintet: növeli a H1 receptor expressziót, és csökkenti a H2 receptorok expresszióját, GAPDH housekeeping génre normalizálva, 72 órás kezelés után. Az endogén hisztamin termelés, valamint a H1 receptor expresszió növekedése, másfelől a H2 receptorok szintjének növekedése egy olyan lokális egyensúly kialakulásának kedvez, amely jelentős növekedés gátlást eredményez. Az endogén hisztamin tehát közvetve szerepet játszik az IL-6 sejtproliferációt gátló hatásában a primer WM35 sejtvonalban. Metasztatikus melanomában a hisztamin növeli az IL-6 bioszintézist H1 receptoron keresztül, az IL-6 kezelés hatására viszont megnő a sejtek HDC illetve hisztamin tartalma, mindez arra utal, hogy a hisztamin és az IL-6 kölcsönösen serkenthetik egymás bioszintézisét. Következtetésként elmondhatjuk, hogy a melanoma sejtek által termelt hisztamin és IL-6 fontos szerepet tölt be az eltérő stádiumban levő melanoma sejtek növekedésének szabályozásában. Eredményeink azt mutatják, hogy az IL-6 és a
hisztamin közvetlen hatása mellett a két jelpálya közötti kölcsönhatások és kapcsolatok egy finomabb szabályozási mechanizmust tesznek lehetővé. Mindezek mellett az IL-6 receptor és a hisztamin receptorok jelátvitelét befolyásoló genetikai polimorfizmusok feltárásával tovább bővülhet az egyes melanoma betegekben található komplex szabályozási mechanizmusról alkotott képünk.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK 1. Lázár-Molnár E, Hegyesi H, Tóth S, Falus A: Autocrine and paracrine regulations by cytokines and growth factors in melanoma. Cytokine 2000, 12: 547-554. IF: 2,490 2. Molnár L. E, Hegyesi H, Tóth S, Darvas Zs, László V, Szalai Cs, Falus A: Biosynthesis of interleukin-6, an autocrine growth factor for melanoma is regulated by melanoma derived histamine. Seminars in Cancer Biology 2000, 10: 25-28. IF: 5,841 3. Molnár L. E, Cricco G, Martin G, Darvas Zs, Hegyesi H, Fitzsimons C, Bergoc R, Falus A, Rivera E: Histamine as a potential autocrine regulator of melanoma. Inflammation Research 49(1): S27-S28, 2000. IF: 1,560 4. Falus A, Hegyesi H, Lázár-Molnár E, Pós Z, László V, Darvas Zs.: Duality of paracrine/autocrine interactions around melanoma; histamine is a relevant player in local regulation. Trends in Immunology 22: 648-52, 2001. IF: 14,954 5. Lázár-Molnár E, Hegyesi H, Pállinger É, Kovács P, Tóth S, Fitzsimons C, Cricco G, Martin G, Rivera E., Falus A.: Inhibition of human primary melanoma cell proliferation by histamine is enhanced by interleukin-6. Elfogadva: Eur J Clin Invest. IF: 2,071 6. Hegyesi H, Somlai B, Varga VL, Tóth Gy, Lázár-Molnár E, László V, Kárpáti S, Rivera E, Falus A, Darvas Zs.: High histidine decarboxylase level in melanoma;
suppression of melanoma cell proliferation by specific antisense oligonucleotides. J Invest Dermatol 117(1):151-3, 2001. IF: 4,539 7. Igaz P, Novák I, Lázár E, Horváth B, Héninger E, Falus A.: Bidirectional communication between histamine and cytokines. Inflammation Research 20: 123-128, 2001. IF: 1,560
Más témában megjelent publikációk I. Kőhidai L, Kovács P, Lázár-Molnár E, Csaba Gy: Presence, uptake and localization of an immunoreactively interleukin-6 (IL-6)-like molecule in Tetrahymena pyriformis. Cell Biology International 2000, 24: 749-755. IF: 0,592. II. Horváth B, Héninger E, Hegyesi H, Lázár M E, Radvány Zs, Szalai Cs, Darvas Zs, Falus A: Reciprocal inhibitory interactions between γ interferon and histamine in melanoma Inflammation Research 49(1): S27-S28, 2000. IF: 1,560. III. Fitzsimons CP, Lázár-Molnár E, Tömösközi Zs, Buzás E, Rivera SE, Falus A.: Histamine deficiency induces tissue-specific down-regulation of histamine H2 receptor expression in histidine decarboxylase knockout mice. FEBS Lett 508(2):245-8, 2001. IF: 3,440
ELŐADÁSOK, POSZTEREK 1) The role of IL-6 and histamine in the autocrine regulation of melanoma (Lázár ME, Tóth S, Falus A) -poszterbemutató VII. Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest,1998. 2) The role of IL-6 and histamine in the autocrine regulation of melanoma (E Lázár Molnár, Tóth S, Falus A) - előadás
Alapítvány a hazai hisztamin kutatás támogatására (AHHKT) - Új eredmények a hisztamin kutatásokban, tudományos konferencia, Budapest, 1998. 3) Az IL-6 és a hisztamin szerepe a melanoma autokrin szabályozásában (Lázár M E, Tóth S, Falus A) - előadás SOTE PhD Tudományos Napok, Budapest, 1999. 4) Az IL-6 és a hisztamin szerepe a melanoma autokrin szabályozásában (Lázár M E, Tóth S, Falus A) - poszterbemutató VII. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, SOTE, Budapest,1999. 5)
Reciprocal inhibitory interactions between γ interferon and histamine in
melanoma (Horváth B, Heninger E, Hegyesi H, Lázár M E, Radvány Zs, Szalai Cs, Darvas Zs, Falus A)-előadás 1999 XXVIIIth Annual Meeting of the European Histamine Research Society, Lyon 6) Acción de la histamina sobre la proliferación celular: un modelo de melanoma. (Martin G, Lázár M E., Darvas Zs, Bergoc R, Fitzsimons C, Cocca C, Falus A, Rivera E, Cricco G)-előadás SAIC, Argentine Society of Clinical Investigation, XLIV Scientific Meeting, Mar del Plata, 1999. 7) A hisztamin szerepe a melanoma autokrin szabályozásában (E M Lazar, Cricco G, Martin G, Darvas Zs, Fitzsimons C, Bergoc R, Falus A, E Rivera)- poszterbemutató SE PhD Tudományos Napok, Budapest, 2000. 8) Histamine as an autocrine regulator in melanoma (E M Lazar, G Cricco, G Martin, H Hegyesi, Zs Darvas, C Fitzsimons, R Bergoc, A Falus, E Rivera) poszterbemutató XXIX. Annual Meeting of the European Histamine Research Society, Nemi (Rome), 2000. 9) Az endogén hisztamin és az autokrin interleukin-6 bioszintézis kölcsönhatása melanoma sejetkben (Lázár-Molnár E, Hegyesi H, Tóth S, Falus A) - elõadás A Magyar Immunológiai Társaság Jubileumi (XXX.) Kongresszusa, Budapest, 2000. 10) Az endogén hisztamin és az autokrin interleukin-6 bioszintézis kölcsönhatása melanoma sejetkben (Lázár - Molnár E, Hegyesi H, Tóth S, Falus A) - elõadás IX. Sejt- és Fejlõdésbiológiai Napok, Debrecen, 2001.
11)
Interactions between endogenous histamine and interleukin-6 (IL-6) in
melanoma cells (Lázár-Molnár E, Hegyesi H, Tóth S, Falus A)- poszterbemutató XXX. Annual Meeting of the European Histamine Research Society, Turku (Finland), 2001. 12)
Expression of H1 and H2 histamine receptors in histidine decarboxylase
knockout mice (Fitzsimons C, Lazar-Molnar E, Tomoskozi Zs, Hegyesi H, Darvas Zs, Rivera E, Falus A). -poszter XXX. Annual Meeting of the European Histamine Research Society, Turku (Finland), 2001.
