Az asztma (és atópiás ekcéma/dermatitis szindróma) genomikai vizsgálatai; különös tekintettel a hisztamin immunmodulációjára
Doktori értekezés
Kozma Tibor Gergely Semmelweis Egyetem Doktori Iskola „A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai” címu, 19. sz. program
Programvezeto:
Prof. Falus András
Témavezeto:
Dr. Szalai Csaba
Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet Budapest, 2004.
73
Tartalomjegyzék 1
Bevezetés ......................................................................................................... 4 1.1
2
Célkituzések .............................................................................................. 6
Irodalmi áttekintés........................................................................................ 9 2.1
Az Ig-mediált allergiás betegségek kialakulásában fontos tényezok........... 9
2.2
Az asthma bronchiale állatkísérletes modellezése.................................... 15
2.3
Th1-Th2 immunpolarizációs egyensúly eltolódása................................... 18
2.4
Az allergiás betegségek patomechanizmusa............................................. 21
2.4.1
Az AEDS patomechanizmusa........................................................................................21
2.4.2
Az allergiás asztma patomechanizmusa.......................................................................22
2.5
Az asztma és (AEDS) szabályozásában szerepet játszó fontosabb citokinek és kemokinek............................................................................................ 32
2.5.1
Citokinek............................................................................................................................32
2.5.2
Kemokinek.........................................................................................................................39
2.6
3
A hisztamin immunmoduláló hatásai....................................................... 45
Kísérleti módszerek ..................................................................................... 51 3.1
Az allergia populációgenetikai vizsgálatainak módszerei......................... 51
3.1.1
A vizsgálatba bevont személyek....................................................................................51
3.1.2
Laboratóriumi paraméterek meghatározása.................................................................52
3.1.3
DNS izolálás......................................................................................................................53
3.1.4
Mutációk azonosítása.......................................................................................................53
3.1.5
Statisztikai módszerek .....................................................................................................55
3.2
Az asztma állatkísérletes modellezésénél alkalmazott módszerek............ 57
3.2.1
A kísérleti állatok .............................................................................................................57
3.2.2
Kísérleti protokoll.............................................................................................................57
3.2.3
Az AHR mérése................................................................................................................58
3.2.4
Tüdo szövettan..................................................................................................................62
3.2.5
A BAL morfológiai vizsgálata.......................................................................................62
3.2.6
A BAL limfocitáinak FACS (Flow Citometria) vizsgálata.......................................62
3.2.7
Szérum IgE mennyiségének mérése..............................................................................63
3.2.8
Citokinek, kemokinek génexpressziójának meghatározása tüdoszövetbol............67
3.2.9
Az INF-? és IL-4 fehérje mennyiségének meghatározása tüdoszövetbol...............70
3.2.10
Statisztikai módszerek .....................................................................................................71
2
4
Eredmények................................................................................................... 73 4.1
Az allergia populációgenetikai vizsgálatai ............................................... 73
4.1.1
Nincs kapcsoltság az asztma/allergia és a RANTES -28G, -403A (74), valamint a CCR5? 32 polimorfizmusok között (83).......................................................................73
4.1.2
Az MCP-1 promoterének -2518G mutációja kapcsoltan öröklodik az asztmával (74) ......................................................................................................................................76
4.1.3
Az MCP-1 -2518G allél csak az asztmával mutat kapcsoltságot, az atópiával nem (74) ......................................................................................................................................78
4.1.4
Az MCP-1 -2518G allél kapcsolatban áll a vér eozinofil granulocita aránnyal/számmal és az asztma súlyosságával (74) ...................................................78
4.1.5
Sem a RANTES, sem az MCP-1 promoterének polimorfizmusai nem öröklodnek kapcsoltan az AEDS-sel (73)..........................................................................................82
4.2
Az asztma állatkísérletes modellezése...................................................... 84
4.2.1
Csökkent marad az AHR a HDC KO egerekben szenzitizálás után........................84
4.2.2
Csak kis mértéku gyulladás alakul ki allergizálás után a HDC KO egerek tüdejében............................................................................................................................85
4.2.3
A gyulladásos sejtek aránya lényegesen kisebb a HDC KO állatok BAL-jában, mint WT társaikéban szenzitizálás után .......................................................................87
4.2.4
A limfociták közül elsosorban a CD3+ T sejtek arányát emeli a kezelés...............89
4.2.5
A KO állatok szignifikánsan kevesebb allergén specifikus IgE-t termelnek az allergizálás után, mint WT társaik .................................................................................90
4.2.6
A KO állatok citokin és kemokin génexpressziós profilja jelentosen eltér a WT állatokétól...........................................................................................................................91
4.2.7
A KO állatok tüdejébol szignifikánsan kevesebb INF-? és IL-4 mutatható ki allergizálás után, mint WT társaikból ...........................................................................97
5
Diszkusszió................................................................................................... 99 5.1
Populációgenetikai vizsgálatok ................................................................ 99
5.1.1
Az asztma populációgenetikai vizsgálatai....................................................................99
5.1.2
Az AEDS populációgenetikai vizsgálatai ..................................................................103
5.2
Az asztma állatkísérletes modellezése.....................................................104
6
Összefoglalás ............................................................................................. 113
7
Summary ..................................................................................................... 114
8
Rövidítések jegyzéke ................................................................................. 115
9
Megjelent publikációk............................................................................... 116
8
Bibliográfia................................................................................................. 117
9
Köszönetnyilvánítás ................................................................................. 146
3
1 Bevezetés A címben említett asztma és atópiás ekcéma/dermatitis szindróma (AEDS), olyan allergiás betegségek közé tartoznak, amelyeket manapság sokan az "atópiás" jelzovel illetnek (1). Az "atópia" kifejezést – amely az "atopos" szóból származik, és jelentése: nem megfelelo – az 1920-as években Coca és Cooke használta eloször (2) az allergiás rhinitis-re és a bronhialis asztmára, hogy elkülönítse az allergiától. Az "allergia" eredetileg az atópiánál tágabb kifejezés volt. Jelentése: eltérés az eredeti állapottól. Eloször von Pirquet vezette be 1906-ban minden olyan túlérzékenységi reakcióra, amelyben antigén (foleg fehérje) játszik szerepet (3). 1968-ban Gell és Coombs az allergiát 4- féle túlérzékenységi reakcióra osztotta (4), az elsobe azokat a túlérzékenységi reakciókat sorolva, melyet IgE (immunoglibulin E) mediál. Ugyanebben az évben a WHO hivatalosan is elismerte, hogy a korábban az atópiáért felelossé tett „ho labilis testek" szintén az IgE molekulák (5). Ezért az atópia eredeti jelentése elveszett, és gyakran az allergia kifejezéssel szinonimaként használták. 2001-ben az EAACI (European Academy of Allergology and Clinical Immunology) újradefiniálta az allergia és atópia kifejezéseket (1). Az EAACI szerint az „atópia" betegségek leírására nem használható. Definíció szerint az atópia: egyéni, vagy családi hajlam IgE izotípusú antitestek termelésre kisdózisú allergénekkel (általában fehérjékkel) szemben; és olyan betegségek
kialakulására,
mint
az
asztma,
a
rhinoconjunctivis,
vagy
az
ekcéma/dermatitis. Az új nomenklatúra szerint az olyan túlérzékenységi reakciókat hívjuk allergiának, melynek kialakulási mechanizmusait többé-kevésbé ismerjük. Allergia kialakulása mögött gyakran áll atópia, azonban számos betegség (pl. AEDS, fetalis erithroblastosis) IgE-tol független mechanizmusok útján alakul ki. Az EAACI új nomenklatúrát javasolt a különféle allergiás betegségekre is: Az immunológiai mechanizmusok által mediált asztmát allergiás asztmának, míg a régebben intrinsic asztmának nevezett betegséget nem allergiás asztmának definiálta. Az eddig atópiás dermatitisként, ill. atópiás ekcémaként nevezett allergiás betegségeket AEDS-nek hívja.
Az allergiás megbetegedések gyakorisága az utóbbi évtizedekben jelentosen emelkedett, különösen a fejlett országokban (6, 7). A gyermekkorban jelentkezo krónikus betegségek közül az asztma, vezeto szerepet tölt be (8). Svédországban például durván 12 évente megduplázódott az allergiás rhinitisben, asztmában vagy ekcémában szenvedo gyermekek száma (9); az Egyesült Államokban az asztma gyógyítása 6 4
milliárd $-t emészt fel évente (10). A respiratorikus mucosa krónikus gyulladása – mely alapveto szerepet játszik az asztma patogenezisében – az iparvidékékben gazdag országokban élok 10%-át érinto betegség (11).
Az asztma a légutak krónikus gyulladásos betegsége, amely reverzibilis légúti obstrukcióval, és légúti túlérzékenységgel (AHR) jár (12). Az antigén a légutakban igen sokféle gyulladásos sejt közremuködésével fejti ki hatását: eozinofil granulociták, B sejtek, hízósejtek, aktivált T sejtek (CD4+) által (13-16). Bár a pontos mechanizmus még mindig ismeretlen, a sejtek közötti komplex kölcsönhatások vezetnek az asztma patogenezisében fontos citokinek, és egyéb gyulladásos mediátorok termeléséhez (17). Az AEDS klinikai képe ugyan eltér az asztmáétól, hiszen a diagnózis alapjául is szolgáló legfobb tünete az ekcémás léziók megjelenése; patomechanizmusa mégis több lényeges ponton átfed vele (18, 19): a magas allergén specifikus IgE szint, és a gyulladás helyére bevándorolt eozinofil granulociták nagy száma közös jelenség. Továbbá mindkét betegség kialakulásának fo irányítójaként egyre inkább a T sejteket teszik felelossé (20-27). A betegségek kialakulásánál elsosorban a Th2 sejtek a nélkülözhetetlenek (22, 23), majd a késobbi, krónikussá alakuló stádiumban az infiltrálódó Th1 sejtek a tünetek súlyosbodásához vezetnek (24-27).
Az allergiát, az immunrendszer irányítását végzo megszámlálhatatlan gén összehangolt muködésében bekövetkezo zavar váltja ki, melyet a többi gén, illetve a környezet kiszámíthatatlanul formál át. Az allergia ugyanis multifaktoriális betegség, melynek kialakulásában mind genetikai, mind környeze ti tényezok szerepet játszanak (28-31). A genetikai tényezok lehetnek az immunválaszt és az IgE termelést (azaz atópiát) és/vagy hatást szabályozó gének polimorfizmusai, míg a környezeti tényezok a különféle allergénekkel való találkozás. Az utóbbi években igen nagy erofeszítéssel, sok kutatócsoport dolgozik az allergiás betegségek kialakulásában fontos genetikai tényezok feltárásán, azonban gyakorlatilag nem lehet olyan eredményrol beszámolni (a legfrissebbektol eltekintve), amit ne cáfoltak volna meg. Ennek legfobb okai, hogy – a rendkívül összetett patomechanizmus mellett – már a fenotípus definiálása és a mintagyujtés is komoly nehézségekbe ütközik, és eltéro földrajzi helyeken élo emberekre eltéro környezeti tényezok hatnak. Az is elképzelheto például, hogyha ugyanaz a polimorfizmus az élet különbözo idoszakában jut érvényre (eltéro környezeti tényezok miatt), más- más allergiás betegség kialakításában vesz részt. Ugyanakkor az 5
egészséges szervezet, öröklodo, kóros hajlam nélkül is válaszolhat nagymennyiségu IgE termeléssel bizonyos körülmények között. Nagydózisú allergén (gyakran adjuvánssal együtt) önmaga is kiválthat (1) allergiás kórképeket. Erre példaként lehet felhozni a szakmai ártalmak következtében fellépo allergiát (32), és ezen az elven alapulnak a kísérleti állatokon eloidézett allergiás modellrendszerek is, amelyek tekintet nélkül az atópiás hajlamra kialakulnak az adott élolényben.
A nagyhatékonyságú molekuláris genetikai módszerek napjainkban ugrásszeru fejlodésen mennek át, és a számítástechnikával együtt alkalmazva megteremtik a genom léptéku molekuláris genetikát: a genomikát. "A humán genomika azt vizsgálja, hogy az ember genetikai állománya hogyan határozza meg az ember fenotípusát." (28) A genomika egyik elsodleges feladata a betegségge l kapcsolatba hozható génváltozatok (allélek) megtalálása, amelyek késobb felhasználhatók lesznek diagnózisra is. Mivel ezek a polimorfizmusok nem minden környezeti feltétel mellett, és nem is minden etnikumban járulnak hozzá egyformán a betegség manifesztációjához, elengedhetetlen, hogy hazánk is részt vegyen ezekben a kutatásokban. A genomika másik igen fontos feladata annak vizsgálata, hogy egy fenotípus (betegség) kialakulását milyen gének megszólalása alakítja ki, és ezeket milyen tényezok módosítják. PhD munkám során az allergia genomikájának mindkét kutatási ágába bekapcsolódtam. Mivel ezek az allergia kutatásának két különálló részét képezik, a kettosség az egész dolgozat során jelen van.
1.1 Célkituzések A
PhD
munkám
elso
felében
ismertetett
kísérleteink
során
olyan
polimorfizmusokat kerestünk magyar gyermekek körében, amelyek kapcsolatban lehetnek az atópia, az asztma, és/vagy az AEDS betegségekkel. Mivel kutatócsoportunk nem veheti fel a versenyt a világ nagy, sok pénzt felemészto kutatásaival, elsosorban a már mások által (gyakran más betegségekben) leírt polimorfizmusok Magyarországon betöltött szerepeinek vizsgálataival foglalkoztunk. Budapesti gyermekek körében azt vizsgáltuk, hogy a TNF-? (tumor necrosis factor-? ), a RANTES (regulated on activatio n normal T cell expressed and secreted), vagy az MCP-1 (monocyte chemoattractant protein) promoterében már leírt polimorfizmusok, amelyek ezeknek a kemokineknek a szintjét befolyásolják a szervezetben, kapcsolatba hozhatók-e az allergiával, vagy az asztmával, az AEDS-sel, illetve a betegek valamely vizsgált 6
klinikai/biológiai jellemzojével. (A TNF-? polimorfizmusainak elofordulását az AEDSben nem vizsgáltuk.) Hasonló jellegu kutatásokat végeztünk továbbá az Fc?RI (nagy affinitású IgE receptor), valamint a CCR5 (kemokin receptor 5) kódoló szakaszában leírt polimorfizmusok kapcsán is. Az elobbi egy aminosav cserét idéz elo a molekula ? láncában, az utóbbi pedig egy 32 bázispárnyi delécióval jár. Mivel sem a TNF-? , sem a Fc?RI említett polimorfizmusai sem hozhatók összefüggésbe a vizsgálat betegségekkel, továbbá eredményeinket nem is publikáltuk, ezekrol csupán érintolegesen ejtek szót dolgozatomban.
A PhD munkám második felében azokról a kísérletekrol írok, melyekben a hisztamin késoi asztmás fázisban betöltött hatásait vizsgáltuk. A hisztamin az allergiás válasz egyik fo effektor molekulája. Részt vesz a légúti simaizomzat kontrahálásában, a microvasculáris permeabilitás növekedésében (33, 34). Az asztmásoknak magasabb a szérum hisztamin koncentrációja, mint a nem asztmás, kontroll egyéneknek (35). A provokálás utáni emelkedett plazma hisztamin szint pedig együtt jár a bronhiális obstrukcióval (36). Érdekes azonban, hogy az antihisztaminok mégsem elég hatékonyak az asztma kezelésében (37). In vitro kísérletek szerint számos alapveto, az immunrendszer muködésének egészére ható szerepe van a hisztaminnak: pl. hatással van a dendritikus sejtek és makrofágok érésére (38-40). Azonban még mindig nem ismert, hogy immunregulációja in vivo hogyan befolyásolja az asztma kialakulásának patomechanizmusát; mivel az in vitro rendszerekben kapott eredmények a kísérleti körülmények, és az alkalmazott sejtek függvényében meglehetosen ellentmondásosak. Pedig az asztma késoi fázisában megnyilvánuló hatásai valószínuleg inkább az immunrendszert szabályozó, mintsem az effektor funkciói révén jutnak érvényre. A hisztamin receptorok átfedo, de sokszor ellentétes funkciói miatt, a receptorok blokkolásával nem lehet teljesen, az összes hisztamin hatást megszüntetni. Bár a hisztamin szintézisét blokkoló ? -fluorometil hisztidin jelentosen csökkenti a hisztamin szintet számos élolényben, még annak használatával is nehézségekbe ütközik a hisztamin hosszú távú in vivo eliminálása. Korábbi kísérletek, amelyeket hízósejt hiányos egereken végeztek, egyenesen azt sugallják, hogy a késoi asztmás fázisban a hisztaminnak nincs is komoly szerepe: a hisztamin legfobb forrásainak számító hízósejtek nélkül is kifejlodött a légúti gyulladás és késoi AHR (41). Kísérleteink során elsoként vizsgáltuk a hisztamin allergiával/asztmával kapcsolatos abszolút hatásait in
7
vivo körülmények között, állatkísérletes asztma- modell rendszerben. A genetikailag módosított egerek létrehozatala különösen nagy lehetoséget rejt magában az egyes mediátorok allergiás reakcióban betöltött szerepeinek megértésében, mivel olyan állatokon lehet vizsgálatokat végezni, melyekben egy adott géntermék hiányzik, vagy túlexpresszált. Kísérleteinket mi is ilyen állatokon (HDC KO egerek) végeztük (42): olyan egereken, melyek képtelenek muködoképes hisztidin-dekarboxiláz (HDC) expresszióra. Mivel ez az enzim (jelenlegi tudásunk alapján) az egyedüli, amely képes a hisztamin eloállítására, ezekben az állatokban hiányzik az endogén hisztamin. Az exogén hisztamin bevitelét hisztamin- mentes táppal akadályoztuk meg. Kísérleteink során ezeknek a KO egereknek az allergizálás utáni (asztmára jellemzo) fenotípusát, és – az asztmában valószínuleg szerepet játszó – citokin és kemokin expressziós profilját hasonlítottuk össze az allergizált vad típusú állatokéval, illetve a kontroll csoportokkal, a hisztamin asztmában betöltött szerepeinek pontosabb megértéséhez.
8
2 Irodalmi áttekintés 2.1 Az Ig-mediált allergiás betegségek kialakulásában fontos tényezok Az allergia kialakulásáért a gazdaszervezet és a környezeti tényezok közötti kölcsönhatások a felelosek (28-31). Az asztma kialakulásában résztvevo legfontosabb rizikótényezoket 1995-ben a GINA (Global Initiative on Asthma) a WHO-val (World Heath Organization) közösen foglalta össze (43), de ezek közül egyesek valószínuleg nem valós okok, hanem inkább következmények. Általánosságban elmondható, hogy az allergia poligénes- multifaktoriális betegségeket foglal magába. Ez azt jelenti, hogy kölcsönhatás van a specifikus immunválaszt és IgE termelést befolyásoló gének között, amelyet erosen befolyásolnak a különbözo, nem genetikai tényezok, különösképpen a számos környezeti allergén szintje, és a velük való találkozás gyakorisága.
Az allergiára hajlamosító, vagy ellene védo tényezok egy jelentos csoportját azok alkotják, amelyek az immunpolarizációs viszonyok (lsd. 2.3 fejezet) megváltozására hatnak. Epidemiológiai kutatások is alátámasztják az atópiával szembeni védelemben azoknak a gyermekkori fertozéseknek a fontos szerepét, amelyek a szervezetben Th1 irányú eltolódást hoznak létre (44). Ebben a bélflóra baktérium összetételének is igen fontos szerepet tulajdonítanak (45). Más környezeti tényezok kifejezetten a Th2 immunpolarizációnak kedveznek, így fokozzák az atópia kialakulásának valószínuségét (1. ábra): ilyenek például a diéta, a pollenszezonban való születés (46, 47). De fontos, allergiára hajlamosító tényezonek tartják az élet elso pár hónapjában az állatok közelségét (48), a vírusinfekciót (49), a levegoszennyezést (50) és az anya dohányzását (51) is.
A legtöbb allergén olyan fehérje, amely természetes körülmények között enzimként funkcionál, vagy pedig egyszeruen csak nagy szemcseméretu. Az enzimaktivitású allergének növelhetik a mucosa permeabilitását (proteolízis), az utóbbiak pedig, irritálhatják a légutakat (44). Számos allergén (ún. szuperantigének) az adjuvánsokhoz hasonlóan poliklonális IgE termelést is beindíthat. Ilyen pl. : a Staphylococcus aureus, amely a poliklonális IgE válasz mellett képes még eozinofil granulociták által mediált gyulladást is kiváltani AEDS-ben. A fejlett (nyugati)
9
országokban eloforduló leggyakoribb allergének: a házipor atka (Der p 1 és Der p 2), a macskából származó allergének (pl. Fel d 1), a különféle fák (pl. Bet v 1: nyír) és fufélék allergénjei (parlagfu: Amb a 1-6), de egyre fontosabbak az amerikai mogyoró allergénjei (Ara h 1-3) is (44). Genetikai tényezok
Környezeti tényezok
Specifikus HLA allélek jelenléte Különféle gének polimorfizmusai
Allergén szenzitizálás Testvérek Túlzott higénia Az élet elso 2 évében kapott antibiotikumok, oltások, betegségek
Atópia Betegség a célszervben
Kiváltó tényezok
Bronhiális epitélium Bor Bél
Vírus infekció Allergénnel való találkozás Dohányfüst "Indoor és outdoor" szennyezok
Th2-mediált allergiás gyulladás
1. ábra Az atópia és a Th2 sejtek által mediált allergiás gyulladás kialakulásra ható tényezok (44)
Már az 1960-as években végzett kutatások alapján feltételezték, hogy az allergia öröklodo jelleg. Mikor még populációs gyakorisága 20% körül mozgott, a betegek 4668%-nál lehetett kimutatni családi hátteret (52). Annak érdekében, hogy a genetikai tényezok allergiában betöltött szerepeit vizsgálni lehessen, azonosítani kell a rokonsági kapcsolatokat, szét kell választani a környezeti, a kulturális és a genetikai tényezoket (53). Ezekhez a családkorrelációs vizsgálatok (54); az egy, illetve kétpetéju ikrek összehasonlító vizsgálatai (55) és a szegregációs analízisek jelentenek segítséget. A családkorrelációs vizs gálatok szerint – míg az asztma populációs gyakorisága 4%; 2025%-os valószínuséggel lesz valaki asztmás, ha valamely elsofokú rokona beteg (54). Az AEDS konkordanciája (együttes elofordulása) 77% egypetéju ikreknél, míg kétpetéjueknél 15%, ami szintén jelzi a betegség genetikai hátterét (56). Szegregációs analízisekkel megállapították, hogy az allergiás betegségek iránti hajlamban szerepet játszó sokféle gén között vannak kiemelkedoen fontos, úgynevezett "major" (meghatározó, dönto) gének, azonban ezek öröklésmenete még mindig nem teljesen egyértelmu (57).
10
Egy betegség genetikai kutatásának elso lépése a beteg fenotípus egyértelmu, objektív elkülönítése az egészségestol, mivel a rossz diagnózis a genetikai analízis statisztikáját rontja. Az allergiában már ennek a feltételnek a teljesítése nehézségekbe ütközik. Például nincs olyan fiziológiai mérés, amellyel abszolút módon diagnosztizálni lehetne az allergiás rhinitist, vagy az AEDS-t. Talán leginkább az asztma diagnózisában vannak olyan objektíven mérheto jellegek, amelyeket – az asztma pont (58) és az asztma algoritmus (59) módszerekkel – feldolgozva, viszonylag éles különbség teheto az egészséges és a beteg fenotípus között. A diagnózist tovább nehezíti, hogy egy egyénnek sokszor több allergiás betegsége is van, ami maga után vonhatja, hogy a betegség "specifitását" adó géneket még nehezebb megtalálni. Becslések szerint az AEDS-es újszülöttek 40%-ában 3-4 éves korára asztma alakul ki (60), más tanulmány szerint az asztmás betegek 35%-ának van AEDS-e (61), megint mások szerint az allergiás rhinitis-esek 20-38%-ának van asztmája (62). Jelenleg az allergia kialakulásában szerepet játszó gének és azok mutációinak azonosítása még az elején tart. Az 1. táblázatban (lsd. 14. oldal), 5 kutatócsoport által publikált teljes genom szurés eredményeibol, valamint több száz genetikai kapcsoltsági és asszociációs tanulmány eredményeibol azokat a kromoszóma területeket emeltük ki, melyek több tanulmányban
is
konzekvensen
szerepeltek,
és
jelenlegi
tudásunk
alapján
jelentoségteljesnek tunnek. A fejezet további részében azokkal a kromoszóma területekkel foglakozunk részletesebben, amelyek az általunk is vizsgált génterületeket tartalmazzák. 6p21.3 A 6p21.3 kromoszóma régió és az atópia/asztma között már viszonylag régóta ismeretes szoros összefüggés (63-65). Az itt lokalizált gének foleg az MHC (fo hisztokompatibilitási gén komplex) osztályba tartoznak. Közülük mi az MHC III osztályba tartozó TNF-? vizsgálataival foglalkoztunk. A TNF-? promoterének -308A polimorfizmusát (a szám a starthelytol való távolságot jelzi downstream irányban), amely emelkedett TNF-? szintet idéz elo, több tanulmány is összefüggésbe hozta már az asztmával (66, 67), viszont az atópiával nem. Mivel az asztma kóros gyulladásos immunválasz következtében kialakuló betegség, elméleti megfontolások alapján is lehetséges, hogy ez a gyulladásos citokin fontos funkciót lát el az asztma patomechanizmusában. Mivel gyulladás IgE-tol függetlenül is kialakulhat, értelmezheto az is, hogy pusztán az atópiával miért nem mutat kapcsoltságot. Saját kísérleteink, 11
melyeket budapesti asztmás gyermekek vérmintáiból végeztünk, nem támasztották alá, hogy ez a polimorfizmus befolyásolná az asztma kialakulását (nem publikált eredmények). 11q13 Több tanulmány megerosítette a kapcsolatot a 11q13 kromoszómarégió és az atópia között (68, 69). Az elsodleges jelölt gén ezen a területen az Fc?RI ? alegységének génje volt. Az Fc?RI 4 alegységbol épül fel: egy-egy ? és ? , valamint két ? láncokból. Az IgE molekula megkötéséért az ? lánc felelos. A ? lánc a receptor keresztkötése révén keletkezo szignál amplifikálásában vesz részt. Az atópiával kapcsolatba hozott polimorfizmus a ? lánc fehérjéjének 181. aminosavában okoz egy Ile/Leu szubsztitúciót (70). A mutáció a hízósejtekben és bazofilekben – a korábbi feltételezések szerint – emelkedett hisztamin szintézist is kivált. Azonban számos, más kutatócsoport által végzett tanulmány, képtelen volt a kapcsoltságot kimutatni (71) a 181 Leu szubsztitúció és az allergiás betegségek között, sot a molekula kóros, hisztamin szintet emelo tulajdonságát sem tudták igazolni (72). Ezeket az eredményeket erosítették meg az általunk végzett kísérletek is (nem publikált eredmény): ez a polimorfizmus nem fordul elo sem nagyobb, sem kisebb gyakorisággal a Budapesten élo asztmás gyermekekben, mint az egészségesekben. 17p11.1-17q11.2 Több etnikumban is találtak összefüggést a 17-es kromoszóma és az asztma között (64). Ezen a kromoszómán nagyszámú jelölt gén található, de közülük kiemelkedo fontosságúak a 17q11.2 pozícióban található kemokin géncsaládba tartozók, melyek közül mi a RANTES, és az MCP-1 promoter régióinak polimorfizmusait vizsgáltuk (73, 74). A RANTES az egyik leginkább tanulmányozott kemokin. Három különbözo afrikai és amerikai etnikai csoporton végzett teljes genom szurés eredménye szerint van kapcsoltság az asztma és az említett 17q11.2 kromoszóma régió között (6365). Fontos azonban megjegyezni, hogy fehérboru csoportokban nem sikerült kimutatni a kapcsoltságot. A RANTES promoterében két olyan polimorfizmust írtak le, amely sejtvonalakban befolyásolják a transzkripcióját (75, 76): a -28-as pozícióban egy C/G, és a -403-asban egy G/A szubsztitúciót. Mindkét polimorfizmus (-28G és -403A) növelte a RANTES promoter erosségét, így feltételezhetoen a molekula szö veti szintjét is. Német gyermekeknél ki is mutatták, hogy a -403A allél kapcsoltságot mutat az
12
AEDS-sel (75). Azonban a Budapesten élo asztmás és AEDS-es gyermekekben nem sikerült a kimutatnunk a kapcsoltságot egyik vizsgált lókuszra sem (73, 74).
A kemokinek a leukocitákon speciális sejtfelszíni receptorokon keresztül fejtik ki a hatásukat, melyek a G proteinhez kapcsolt receptorok szupercsaládjába tartoznak (7479). Bár teljes genom szuréssel nem mutattak ki kapcsoltságot a kemokin receptorokat tartalmazó kromoszóma területek és az allergiás betegségek között, mégis – a patomechanizmus ismeretében – feltételezheto fontos szerepük (jelölt gén klónozás). A RANTES egyik receptora az utóbbi idoben a HIV-1 fertozéssel kapcsolatos szerepe miatt sokat vizsgált CCR5. A kaukázusi populációban egy rendkívül elterjedt 32 bp deléciót találtak a CCR5 génben (CCR5? 32) (80). A mutáns gén terméke nem jelenik meg a sejtfelszínen, így, mint receptor, nem képes muködni. A mutációnak védo szerepe van a HIV-1 fertozéssel szemben, és hasonló szerepe lehet az allergiában is. Errol azonban ellentmondásos eredményeket láttak napvilágot: Hall és mtsai. szerint, akik skót gyermekek vizsgáltak, kapcsoltság van a CCR5? 32 allél és az asztma kialakulásának csökkent kockázata között (81), míg Mitchell és mtsai. nem találtak szignifikáns kapcsolatot az atópia és az asztma között nyugat-ausztráliai és dél-angliai családokban (82). A magyar gyermekeken végzett vizsgálataink Mitchell és mtsai.- val vannak összhangban. Ezek szerint tehát szintén nem tulajdonítható védo szerep az asztmával szemben ennek a deléciónak (83).
Az MCP-1 a RANTES mellett az asztma/allergia szempontjából egy másik igen fontosnak vélt kemokin a 17q11.2 génterületen. Az MCP-1 transzkripcióját, úgy tunik, két különálló génterület szabályozza az 5`- flanking régióban (84). A disztális regulációs terület a transzkripciós starthelytol 1,8-2,7 kb.-ra helyezkedik el upstream irányban, és két NF?B köto motívumot tartalmaz, amelyek esszenciális szerepeket töltenek be az MCP-1 transzkripciójának iniciálásában. Ezen a területen, -2518-as pozicióban, leírtak egy olyan biallélikus A/G polimorfizmust (85), amely a monocitákban GG homozigóta formában emelte ennek a kemokinnek az IL-1? (interleukin) indukált expresszióját az AA genotípushoz képest. Úgy tunik a G allél hatása dózisfüggo: a GG homozigóta allélpárt tartalmazó sejtek több MCP-1-et termeltek, mint a GA heterozigóták. Kísérleti eredményeink szerint az MCP-1 -2518G polimorfizmus valószínuleg kapcsoltságban van az asztmával a budapesti populációban (74), azonban az AEDS-sel nincs (73).
13
Krom. régió 2q 5q31-q33
Jelölt gének IL-1 géncsalád
Feltételezett funkció Gyulladási válasz befolyásolása IL-4, IL-13, GM-CSF B sejtek átkapcsolása IgE termelésre, Th2 válasz kiváltása IL-5 Eozinofil felszabadítása a csontvelobol, eotaxin (eozinofil kemoattraktáns) termelés fokozása IL-9 CD14
6p21.3
HLA-D
Bakteriális LPS köto receptor Antigén bemutatás
TNF-a
Fenotípus Asztma Emelkedett IgE szint, asztma Asztma, AHR
asztma, AHR, hízósejt hiperplázia Emelkedett IgE szint Specifikus IgE, vagy IgG antitestek Asztma
Gyulladási válasz közvetítése 7q31 CFTR Tüdoben transzmembrán Allergiás kloridion csatorna bronhopulmonalis aspergillosis 11q13 FceRI-ß Basophil, dendritikus és Atópia, asztma, hízósejteken IgE anyai öröklodés receptor CC16 Légúti gyulladás Asztma szabályozása 12q14.3-q24.31 INF- ? IL-4 aktivitás gátlása Asztma, atópia, össz IgE SCF IL-4 termelés STAT6 Esszenciális citokinregulált transzkripciós faktor NFY-ß IL-4 és a HLA-D gének transzkripcióját növeli NNOS Az NO vasodilatator, és Asztma légúti gyulladási regulátor 14q11.2-q13 T sejt receptor a és d Kölcsönhatásba lép az Specifikus IgE MHC-peptid antitestek komplexekkel 16p21 IL-4R IL-4-nek (és az a Atópia, asztma alegység az IL-13-nak is) receptora 17p11.1RANTES, MCP-1 Leukociták gyulladáshoz Asztma, AEDS 17q11.2 eotaxin vonzása (kemokinek) 1. Táblázat Az allergiás megbetegedésekkel kapcsoltságot mutató jelölt gének kromoszóma lokalizációja és feltételezett funkciója
14
2.2 Az asthma bronchiale állatkísérletes modellezése Az állatkísérletes modellek kituno lehetoségeket kínálnak a komplex betegségek vizsgálataira, és az asztma modellezésére is gyakran alkalmazzák, foleg egereken. Ezekben a kísérletekben az egereken az emberi asztmához hasonló tünetek figyelhetok meg: allergén specifikus IgE-t termelnek, tüdejükbe eozinofil granulociták és hízósejtek infiltrálódnak, Th2 irányba polarizált citokintermelést folytatnak, és nem specifikus bronhokonstriktorokra (pl. metakolin) légúti túlérzékenységet mutatnak (86). Az állatokon kiváltott asztma tanulmányozásának különös jelentosége a humán asztmához képest, hogy a szövetek invazív vizsgálatai is megoldhatók, valamint a rendelkezésre álló különféle genotípusú egerek segítséget nyújtanak az asztma genetikai tényezoinek feltárásához si . Ugyanakkor az állatkísérletek kapcsán új nehézségekkel is számolni kell, melyeket két csoportba sorolhatunk: Az elsobe azok tartoznak, amelyek az állatok emberekhez képesti eltéro allergiás válasza miatt megkérdojelezik az állatmodellek relevanciáját. Talán a legfontosabb, ilyen jellegu problémák, hogy az egéren lejátszódó asztma lényegesen rövidebb lefolyású az emberinél (87); és az eozinofil granulociták – az emberiektol eltéroen – a gyulladás helyén valószínuleg nem degranulálódnak (88). A második csoportba az „allergizálás” kimenetelét befolyásoló, nagyszámú paraméter miatt felmerülo nehézségek sorolhatók, melyek részben az eltéro kísérleti protokollból, részben az állatok eltéro genotípusából származnak. Ezek ugyanakkor elonyt is jelentenek az asztmakutatásban: az eltéro kísérleti protokollokkal a különféle környezet, az eltéro genotípussal pedig a genetikai tényezok modellezhetoek. Az elobbit elsosorban szenzitizáláshoz felhasznált allergénnel (89), és adjuvánssal (90-91) lehet befolyásolni. Ez a következoképpen illusztrálható: egy fehérje-Ag szubkután injekciója fötális borjú albuminnal (CFA) eros Th1 immunválaszt vált ki; ugyanakkor ovalbumin (OVA) szubkután injekciója adjuváns nélkül, vagy orálisan adott OVA kolera toxin adjuvánssal,
illetve
intraperitoneálisan
(i.p.)
adott
OVA
alumínium- hidroxid
adjuvánssal Th2 reakciót vált ki (89, 92). A különféle genetikai hátteru egértörzsekben – még azonos kísérleti körülmények közt is – más mértékben fejezodik ki az AHR, különbözo mennyiségu allergén specifikus IgE termelodik, és eltéro összetételu gyulladásos sejt és citokin (93-95) mérheto. Az általunk is alkalmazott BALB/c egerek pl. viszonylag eros AHR-t mutatnak (93), és – a gyakorta alkalmazott C57BL/6 egerekhez képest – magas IgE, gyulladásos sejt és citokin szintjük van (96) a szenzitizálás és provokáció után. A nehézségek ellenére, az állatmodellek révén az
15
allergiás gyulladásról és a légúti túlérzékenységrol szerzett ismereteink nagyrészt felhasználhatóak a humán asztma patomechanizmusának megismerésére, azonban nem helyettesíthetik, csupán megalapozhatják a humán asztma vizsgálatát. Szenzitizáló reagens OVA
OVA OVA
"T sejt"
Szenzitizáló Szisztémás szenzitizálás adjuváns — 3 egyhetes per kután szenzitizálás 2 hetes idoközönként — Antigén inhaláció 10 napig naponta Al(OH) 3 Al(OH) 3 , OVA szuszpenzió kezelés i. p. a 0. és 14. nap —
Hovel elölt B. pertusis -szal, OVA-val és Al(OH)3 -dal szenzitizált állat T sejtjeinek átoltása i. p. a szenzitizált egérbe
Lokális szenzitizálás, provokáció Porlasztott OVA inhaláció
Kiváltott fenotípus asztma
A szenzitizálási protokollba foglalva A 28., 29., 30. napon 1%-os OVA inhaláció, a 32. napon 5%-os porlasztott OVA inhaláció
asztma asztma
késoi asztmás reakció
2. táblázat Az asztmás tünetek eloidézésére szolgáló néhány protokoll összehasonlítása. Kísérleteinkben a dolt betus protokollt alkalmaztuk.
Az allergiás tünetek kiváltására sokféle protokoll terjedt el (2. táblázat). Ezekben a kísérletekben közös, hogy a többszöri szenzitizálás során az állat immunrendszere „megismerkedik" egy adott allergénnel, amelyre a következo alkalommal (provokáció) kórosan túlreagál. A szenzitizálást leggyakrabban szisztémásan (i.p.), majd lokálisan (inhaláció) végzik. A lokális/inhalációs szenzitizálás után átlagosan 4-8 órával emelkedik meg a csontveloi eozinofilek száma, majd ezek a sejtek a tüdobe vándorolnak (97). Itt 48 órával a szenzitizálás után érik el maximális számukat, de már 8 óra elteltével is kimutathatók. 24 óra múlva a tüdomosó folyadékban (BAL) is megjelennek, ahol számuk a 2-3. napon tetoz (98). A T sejtek valamivel az elsoként megjeleno eozinofilek után vándorolnak az állatok tüdejébe. Ezeken a sejteken kívül neutrofil granulociták is elég nagy számban kimutathatók a BAL-ban, de az elobbi sejtféleségekhez képest kevéssé ismert az AHR-ben betöltött funkciójuk. Egyszeri inhalációs szenzitizálás után az AHR kb. 24 órával jelentkezik (97). Ha a szisztémás szenzitizálást több allergén inhaláció is követ – mint ahogy az általunk alkalmazott protokollban is (87) –, az AHR két csúcsban mutatkozik: A kora fázisra jellemzo AHR az inhaláció után 5-30 perccel jelentkezik, amit a 3-12 óra múlva kialakuló – késoi fázisra jellemzo – AHR kísér (maximumát kb. 6 órával az inhaláció után éri el). Az utolsó szenzitizálás/provokáció után 5-6 héttel már nem mutatható ki eozinofil granulocita a BAL-ból, és az AHR is megszunik. 16
2. ábra Az AHR kialakulásának 3 feltételezett mechanizmusa eltéro egértörzsekben (86)
Az asztma modellezésében talán leginkább vizsgált paraméter az AHR. Ha az állatokat csak lokálisan szenzitizálják, szisztémásan nem: az AHR szöveti gyulladás nélkül is kialakul (99) bennük. Nem minden esetben igaz tehát az, hogy az allergiás, eozinofil gyulladás szükséges feltétele az AHR kialakulásának (100). Az asztmával kapcsolatos állatkísérletekbol az AHR kialakulásának háromféle mechanizmusát írták le (86) (2. ábra), amelyek magyarázatot adhatnak arra, hogy az eozinofil gyulladás és AHR között miért nincs mindig egyértelmu korreláció. Az elso út IL-4-tol és hízósejtektol függo: az IL-4 hatására IgE izotípusú antitestek termelodnek, amelyek – az allergénnel való találkozás után – aktiválják a hízósejteket, ezáltal hisztamin és egyéb, az AHR kiváltásáért felelos mediátor (pl. leukotriének) szabadul föl. Ez az asztmás egyénekben lejátszódó korai asztmatikus reakció analógja. A második folyamatban a T sejtek
irányításával
termelt
IL-5
az
eozinofil
granulociták
révén
vezet
szövetkárosodáshoz és AHR-hez. Ez tekintheto a humán késoi típusú asztmatikus reakció analógjának. Az asztma kialakulá sának harmadik útját az IL-13 mediálja, az IL4-tol és IL-5-tol is függetlenül. Ezzel a mechanizmussal játszódik le az asztma az IL-5 hiányos állatokban. A különbözo egértörzsekben (lsd. ábra jobb oldala) a különféle utak másképpen jutnak érvényre. Közös bennük azonban, hogy a légúti gyulladást végso soron a T limfociták irányítják, és ezek a sejtek felelosek az AHR kialakulásáért is. Az eozinofil granulociták, a hízósejtek, vagy az IL-13 csupán csak közvetíto szerepet látnak el. Mindazon által feltételezhetoen az eozinofilek az AHR egyik legfontosabb sejtes mediátorai (86). 17
2.3 Th1-Th2 immunpolarizációs egyensúly eltolódása Az asztma minden típusában – a frissen diagnosztizált, enyhétol kezdve egészen a súlyos asztmáig – gyakori jelenség a bronhiális mucosa-ban megjeleno nagyszámú limfocita, melyek jelentos részét a T sejtek alkotják (13, 14). A környezet allergénjeire adott adaptív immunválaszt a T limfociták koordinálják és közvetítik. A T limfocitákat – effektor funkcióik és sejtfelszíni markereik alapján – két csoportba lehet osztani. Azok a T sejtek, amelyek CD4-et expresszálnak "helper" T sejteknek (Th) hívjuk; amelyek pdig CD8-at fejeznek ki felszínukön citotoxikus/szuppresszor T sejteknek nevezzük (Tc/s). Ez utóbbi sejtek irányítják a sejtközvetített immunválaszt az endogén úton feldolgozott, MHC I molekulával perzentált antigének ellen. Ezzel szemben a CD4+, limfociták, az MHC II-vel asszociált, szervezettol idegen antigénekkel reagálnak. A Th sejtek csoportja két további szubpopulációra osztható: A még el nem kötelezett Th0 sejtekbol IL-12, IL-1 és IL-18 hatására IFN-?-t, TNF-? -t, IL-18-at és IL-2-t expresszáló sejtekre, amelyeket Th1 sejteknek hívnak; valamint Th2 sejtekre, amelyek a Th0 sejtekbol IL-4 hatására differenciá lódnak, és IL-4-et, IL-5-öt, IL-6-ot, IL-9-et és IL-13at termelnek (101-103). A Th1 sejtek a bakteriális és virális fertozésekkel szembeni védekezésben vesznek részt a sejtes immunválasz révén; a Th2 sejteknek – normál muködésük közepette – a terhesség fenntartásában, a szervezet féregfertozések elleni védelmében, továbbá – a Th1 sejtekhez hasonlóan – a bakteriális/virális fertozések által kiváltott különféle gyulladások kialakításában és fenntartásában (1) lehet szerepük. (A fertozések attól függoen alakítanak ki Th1, vagy Th2 választ, hogy konkrétan milyen baktérium, vagy vírus okozza oket.) A Th1-Th2 szabályozásában bekövetkezo hiba a legkülönfélébb immunopatológiai eltérések kialakulását idézheti elo (104, 105).
Általában a nem atópiás emberek az allergénekkel szemben kisfokú immunválaszt tanusítanak, amely IgG1 és IgG4 izotípusú ellenanyag megjelenésével (106), valamint T-sejtjeik (Th1 sejtek) in vitro mérsékelt proliferációjával és INF-? (interferon-?) termelésével jellemezheto (107). Az atópiás emberek – ezzel szemben – jelentos mennyiségu IgE és allergén specifikus IgE termeléssel válaszolnak az illeto allergénre, és pozitív borpróbát adnak aeroallergénekbol készült kivonat borbe juttatására (18-19). T-sejtjeik in vitro elsosorban Th2 típusú citokin termeléssel (IL-4, IL-5, IL-13) válaszolnak (17). Sot, a betegség egyik igazi immunopatológiai bizonyítékának a Th2 sejtek szöveti infiltrációja (22, 23) tekintheto. A Th1 sejtek, amelyek INF-?-t 18
szecernálnak, ezzel szemben – a legelfogadottabb elméletek szerint – az allergiás betegségek ellen védelmet nyújtanak a Th2 effektor sejtek gátlása révén (108). Így azokban az egyénekben, akik immunrendszere Th1 irányban el van tolódva, kisebb valószínuséggel alakulnak ki allergiás megbetegedések (109, 110). Erre utal az is, hogy az allergia konvencionális terápiájában (szteroid kezelés) – azzal együtt, hogy csökken az IL-4 termelo Th2 sejtek száma –, az INF-?-t termelo Th1 sejtek száma és a Th1 citokinek szintje no (111, 112). Állatokon végzett kísérletek szerint az IL12/IL-18 kezelés képes megakadályozni a Th2 sejtek kialakulását, az AHR-t, és az eozinofil gyulladást az asztmát modellezo rendszerben (113). Ezekhez hasonló megfigyelések vezettek a Th1-Th2 paradigma kialakulásához: mely szerint a Th1 és Th2 sejtek ellensúlyozzák egymást. A Th1 sejtek védenek, vagy megakadályozzák a Th2- mediált allergiás választ, a Th2 sejtek kialakulását (103), valamint számos esetben gátolják az IgE termelést (114) is. Más esetekben azonban a Th2 sejtek is antagonizálhatják a Th1 sejteket (101).
Az magzatok immunrendszere – a placentán átjutó közönséges környezeti allergének miatt – Th2 irányban van eltolódva, ezért az újszülöttekben is ez a túlsúly dominál (115). Az egészséges gyermekek immunpolarizációjában ezután – valószínuleg a különféle fertozések által – egy Th1 irányú eltolódás alakul ki. Atópiás gyermekekben ez a Th1 irányú repolarizáció nem jön létre (116). A gyermekkori fertozések fontos szerepére utal az is, hogy az allergia civilizációs betegség. Feltehetoen a fejlett országokban túlságosan "steril" körülmények között nevelkednek a gyermekek, mivel a környezet relatíve tiszta, és a legcsekélyebb mikrobiális fertozések ellen is antibiotikumokat használnak. Pedig a mikrobiális antigének kulcsfontosságúak lehetnek a Th1 sejtek stimulálásában (117). Korábban például a kevésbé fejlett NDK-ban a betegség
elofordulási
gyakorisága
messze
alulmaradt
a
fejtett
országokban
tapasztaltakhoz képest, de az egyesülés után fokozatosan elérte a németországi értéket (118). A Th1 repolarizációban kiemelkedo szerepet kapnak például a dendritikus sejtek és a makrofágok, amelyek IL-12 szekrécióval a Th1 sejtek érését stimulálják, vagy a természetes ölosejtek, amelyek INF-? termeléssel az immunrendszer egyensúlyát helyrebillentik (119-122). Azonban számos olyan fertozés ismeretes, mely az allergia súlyosbításához vezet: ilyen pl. az influenza vírus, a rhinovírus (RV)-14, vagy RV-16,
19
melyek a Th2 sejtek által termelt mediátorok (RANTES és IL-6) termelését vonják maguk után (123, 124).
Azonban nincs adat arról, hogy a Th1 sejtek közvetlenül, aktívan elfojtanák a Th2 dominanciával létrejött gyulladást (25). A nem allergiás egyénekbol létrehozhatók ugyan allergén specifikus Th1 kló nok (125), de ezek nem mutathatók ki a nem allergiás egyének nazális, vagy pulmonáris mucosa-jaban, ezért védo szerepük nem bizonyítható. A légúti gyulladást állatkísérletes modellrendszerben kevert, Th1- Th2 immunreakció váltja ki (25), valamint emberekben is megfigyelheto a Th1 válasz (126). Azt is bizonyították (25), hogy az allergén specifikus Th1 sejtek súlyos légúti gyulladást okoznak T sejt hiányos (SCID) egerekben, és az allergén specifikus Th2 sejtek általi gyulladást nemhogy gyengítik, hanem még súlyosbítják is. Kimutatták továbbá, hogy az IL-18 (Th1 citokin) fokozta a tracheába és a BAL-ba az eozinofil infiltrációt (127). Ennek fordítottjáról, mármint a Th2 sejtek Th1 irányú serkento hatásairól, az autóimmun encephalomyelitis-ben (128) és diabetes mellitus-ban (129) láttak meglepo eredmények napvilágot: a Th2 sejtek nemcsak hogy egyes esetekben képtelenek ellensúlyozni a Th1 választ, hanem még súlyosbíthatják, vagy modulálhatják is azt. Bár az állatkísérletekbol nyert eredmények nem vihetok át egy az egyben az emberi szervezet leírására, mégis elgondolkoztatók, és valószínusítik, hogy a Th1-Th2 paradigma lényegesen komplexebb, mint azt korábban feltételezték.
Azt, hogy az immunrendszer polarizációja mely irányba tolódik el, nem elore determinált, azoktól a szignáloktól függ, melyek az egyik, vagy a másik Th szubpopulációra
hatnak.
A
leginkább
talán
az
IL-4 és az IL-12 kezdeti
koncentrációviszonyai szabják meg, (bár ezek pontos sejtes forrásai még mindig nem ismertek), de egyéb molekuláknak, például a hisztaminnak is, fontos szerepet tulajdonítanak (130-132). Összefoglalva a Th1 és Th2 sejtek szerepét a jelenlegi ismeretek alapján, a következoket állapíthatjuk meg: A Th1 sejtek az asztma/allergia kifejlodése elott, védelmet nyújthatnak a betegség kialakulásával szemben. Azonban, ha a kór már kialakult, és a Th2 sejtek terminálisan differenciálódtak – kialakítva saját citokin (133) és citokin receptor (IL-12R, IL-18R) (134-135) profiljukat –, akkor az aktív Th1 sejtek már nem képesek változtatni rajtuk; ezért – funkcióik révén – csak további tüneteket váltanak ki.
20
2.4 Az allergiás betegségek patomechanizmusa 2.4.1 Az AEDS patomechanizm usa Az AEDS a leggyakoribb borbetegségek közé tartik. Az élet hosszát akár 20%-al is megrövidítheti (136), és a betegség elofordulási gyakorisága egyre no (137). Klinikailag krónikus, vagy krónikussá alakuló, jellegzetes ekcémás léziókkal jellemezheto, erosen viszketo borbetegség; ami magas szérum össz IgE, illetve allergénspecifikus IgE koncentrációval, valamint dermális eozinofiliával jár együtt (18). A borléziók hisztopatológiai képén sejtes beszurodés figyelheto meg, amelyben az eozinofil
granulocitákon
kívül
foleg
aktivált
CD4+
memória
T
sejtek,
és
monociták/makrofágok (138) találhatók meg. Az allergiás egyének allergén provokációs vizsgálataiból származó kísérletek szerint mindenesetre kétségkívül az eozinofil granulociták alkotják az infiltrálódott sejtek többségét (akár 60%-át is) (139). A léziókban ezenkívül nagyszámú Langerhans sejt, és Fc? receptort expreszáló dermális dendritikus sejt is van (140, 141).
Az utóbbi idoben a T limfocitáknak egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a betegség kialakulásában (20, 24). A kezdodo borgyulladásban emelkedett számú, foleg Th2 citokineket termelo (IL-5) limfocita van, majd a krónikus léziókban a Th1 citokinek mennyisége is egyre inkább emelkedik (142, 143). A betegség kezdo fázisában tehát a Th2 sejtekbol származó citokinek a meghatározók, majd az általuk kialakított gyulladás odavonzza és aktiválja a beszurodo sejteket (pl. eozinofil granulocitákat és makrofágokat), amelyek IL-12-t termelnek (24). Ez a citokin a Th1 és Th0 sejtek nem specifikus és allergén-specifikus aktivációjához vezet, majd az általuk szecernált citokinek (INF-?) alakítják ki a betegség krónikus, súlyos fázisát.
A betegség feltételezett molekuláris patomechanizmusának ismert lépéseit a 3. ábra szemlélteti (24, 31): (a) Az AEDS kezdeti szakaszában az allergének (pl. a házi por atka, pollen) bekerülnek (és felhalmozódnak) a borbe és (b) direkt, vagy – allergén-IgE komplex kialakulás révén, az Fc? receptoron keresztül – indirekt úton aktiválják az epidermális (és dermális) dendritikus sejteket. (Az epidermális dentritikus sejt az ábra bal oldalán látható, egy keratinocitától jobbra.) Az aktivált dendritikus sejtek proinflammatorikus
mediátorokat
(TNF-? ,
21
GM-CSF
[granulocita- monocita
kolóniastimuláló faktor] és IL-1? ) bocsátanak ki, melyek által aktiválódnak a keratinociták és dermális fibroblasztok, és így megkezdik saját citokin és kemokin termelésüket. (A keratinociták pl. CTACK-ot (cutaneous T cell-attracting chemokine), a fibroblasztok pl. RANTES-t termelnek.) Ezek a mediátorok a borbe vonzzák a T sejtek elso hullámát (c). A borbe beszurodo allergén specifikus Th2 sejtek és eozinofil granulociták ismételten találkoznak specifikus antigénjeikkel (d) (az eozinofilek az IgE által, az Fc receptoruk segítségével), aktiválódnak, és Th2 citokineket – IL-4-et és IL13-at – és eotaxint termelnek. A Th2 citokinek felszabadulása pozitív visszacsatolást idézhet elo a gyulladásos helyeken. A dermális fibroblasztok által termelt RANTES (e) a CCR3-on keresztül újabb és újabb Th2 sejteket (és eozinofil granulocitákat) vonzhat a gyulladás helyére a vérbol (f). Majd a dendritikus sejtek a lokális nyirokcsomókba vándorolhatnak (g), ahol beindíthatják a limfociták proliferációját. A RANTES nemcsak a Th2, hanem – a CCR5 közremuködésével – a Th1 sejtek toborzásában is részt vehet. A dermális léziókba vonzott aktivált Th1 sejtek Th1 citokineket (pl. INF-?) szecernálnak, így – a keratinociták és Langerhans sejtek révén (az ábra jobb felso sarka) – hozzájárulnak a betegség krónikus fázisának kialakításában.
3. ábra Az AEDS feltételezett molekuláris patomechanizmusa (21) 2.4.2 Az allergiás asztma pato mechanizmusa Az asztmával kapcsolatos legkorábbi ismereteink az asztmában elhunytak tüdejének postmortem vizsgálataiból származnak (144, 145), melyek a légutak 22
nagymértéku patológiás elváltozásairól számolnak be: a tüdo puffadásáról, elasztikus rugalmasságának elvesztésérol. Ezeket, – a tüdoben sok helyen megtalálható – hámlott epitéliumot, makrofágot, és aktivált eozinofil granulocitát tartalmazó viszkózus nyákdugók ho zzák létre. A légutak elváltozásain kívül megfigyeltek simaizom hipertrófiát és hiperpláziát, bazalmembrán megvastagodást, kehelysejt hiperpláziát is. Asztmának a mindezekhez vezeto patofiziológiai elváltozásokat hívják, amelynek diagnosztizálható patológiai képe: a légúti gyulladás és túlérzékenység (12, 146-148). Az elsoként említett tünetet, amely már az enyhén/frissen diagnosztizált asztmások tüdejében is megfigyelheto (R-2/4-6), egyedülálló sejtkompozíció alakítja ki: a légutak falába limfociták, eozinofil granulociták és hízósejtek szurodnek be (149) (13-16, 149). Egyes adatok szerint ennek a gyulladásnak a mértéke korrelál az asztma súlyosságával (149). A gyulladásos sejtek mediátoraik (pl. citokinek és kemokinek) és sejtfelszíni molekuláik
révén
hatnak
egymásra:
befolyásolják
egymás
proliferációját,
differenciációját, kemotaxisát, aktivációját. A számtalan mediátor sokféle gyulladásos sejtre gyakorolt hatása jelenlegi tudásunk alapján értelmezhetetlen, csupán az egyes komponensek kiragadásával sejthetünk meg törvényszeruségeket a folyamatból.
Epidemiológiai és klinikai megfigyelések egyaránt kapcsolatba hozzák az IgE molekulát az asztma súlyosságával, és a légutak allergének által okozott kezdeti károsodásával (150). Az allergén specifikus IgE molekulák kialakulásának kezdeti lépéseinél az antigénbemutató sejtek (APC-k) (foleg éretlen dendritikus sejtek) bekebelezik az allergént, megérnek, majd bemutatják a T sejteknek, amelyek interakcióba lépnek a B sejtekkel (151). A T sejt–B sejt interakcióban kétféle szignál nélkülözhetetlen az IgE szintézishez. Az elso (152) az IL-4 és IL-13, melyeket a B sejtek kötnek meg – hasonló szignalizációs utat beindító – receptoraikon. A második szignál kialakulásában a sejtfelszíni molekulák vesznek részt (153): a T sejt felszínén CD40L expresszálódik, ami a B sejt felszínén levo CD40-nel komplexet alkot. Ezek után más receptor- ligand párok (CD28 és B7, ? 1 ? 2 integrin és ICAM-1) közötti kölcsönhatások kiegészítik, ill. felerosítik a B sejtek aktiválódását. A B sejtekbol kialakuló plazmasejtek ezután foleg IgE izotípusú antitestet termelnek.
Az asztmának két fázisát lehet elkülöníteni: az allergénnel való találkozás után 1 órán belül a korai, 4-6 órával azután a késoi asztmatikus reakciót (154). Foleg a korai
23
asztmatikus reakció tevodik össze IgE-tol és hízósejtektol függo folyamatokból (155, 156). Kulcslépése, hogy az allergén keresztköti a hízósejtek és bazofil granulociták felszínén lévo, Fc?RI-en kötött IgE molekulákat (157). Ennek következtében a sejtekbol felszabadulnak az akut allergiás reakció tüneteiért felelos mediátorok (pl. hisztamin és lipid mediátorok). Bár egerekben az IgG1 is képes a hízósejtek szenzitizálására (158, 159), valószínuleg az IgE-nél lényegesen kisebb szerepe van (160). Állatkísérletek eredményi szerint az AHR egészséges állatokra allergén specifikus IgE-vel (és IgG1gyel) át is viheto az Fc?RI-en keresztül (155, 158). A kis affinitású IgE receptor (Fc?RII, vagy CD23) többféle – az asztmáért felelos – sejttípuson (limfocita, eozinofil granulocita, makrofág) expresszálódik, azonban nem bizonyított, hogy részt vesz-e a sejtek aktiválásában és a gyulladásban. (Szolubilis változatáról feltételezik, hogy szerepe lehet az IgE szintézis szabályozásában.) A késoi asztmás reakciót elsosorban az allergiás gyulladás hozza létre, melyben a hízósejtek, T sejtek és különösképpen az eozinofilek, valamint azok mediátorai vesznek részt (12), és az IgE-nek kisebb szerep jut. Mivel kísérleteink során az asztma patomechanizmusait részletesebben vizsgáltuk, az említett sejtek asztmával kapcsolatos szerepeit kissé részletezve is tárgyaljuk. Limfociták Az utóbbi években egyre több megfigyelésbol és kísérletebol származó eredmény szerint a T sejtek az asztmás reakció „karmesterei”, az emelkedett légúti túlérzékenység elsodleges okozói (21, 25). Az asztmások légútjaiban, az allergén hatására no a limfociták száma és ezek a sejtek aktívak, expresszálják az IL-2 receptort (CD25) (13, 14). Bár általában nincsenek egyértelmu, egyetemesen elfogadható megfigyelések a CD4+, vagy a CD8+ T sejtek szelektív akkumulációjával kapcsolatban, annyi mindenesetre bizonyos, hogy azoknak az atópiás asztmás egyéneknek a BAL-jában, akik korábban már átestek késoi asztmás rohamon, az allergénnel való találkozás utáni 6-48 óra között megfigyelheto a CD4+ sejtek szelektív toborzása (161). A CD4+ Th2 szubpopuláció különösen elemi szerepére utal, hogy az általuk szecernált IL-3, IL-4, IL-5 és GM-CSF központi szerepet játszik az asztmás válasz beindításában és fenntartásában: a hízósejtek, bazofil és eozinofil granulociták differenciálódásának, toborzásának, növekedésének és proliferációjának (162), valamint az ellenanyag termelésének (151) a szabályozásában.
24
Egyes korábbi elméletek a CD8+ sejteket az asztmával szembeni védelem fontos résztvevoinek állították be (108), ugyanis részt vehetnek az intraalveoláris nyáktermelés csökkentésében, továbbá valamelyest védelmet jelenthetnek a BAL-ban kialakuló eozinofiliával szemben is. A jelenlegi álláspont szerint (26, 86, 163) azonban ezek a sejtek, nemhogy anti- inflammatorikus tulajdonságokkal rendelkeznek, hanem a celluláris válasz beindításával (makrofágok aktiválása) a szövetek (pl. epitél) degradálása révén az asztmatikus tüneteket súlyosbítják. A CD8+ T sejtek önmaguk is képesek az asztmában szerepet játszó citokinek (164, 165) termelésére, de mivel az egész T sejt populációban csak viszonylag kis arányban vannak jelen a CD4+ sejtekhez képest, készségeik ezen a téren elhanyagolhatóak (26).
Az asztma állatmodellezéseinek legfobb tanulságai szintén alátámasztják a humán eredmények által festett képet: miszerint az asztma patomechanizmusának kialakulását a T sejtek koordinálják (86). CD4+, vagy CD8+ sejtek hiányában nem alakulnak ki asztmás tünetek (166). T sejt hiányos (SCID) egerekben pedig, az allergén specifikus Th2 (és Th0) limfociták önmagukban, minden más sejttol (és IgE-tol) függetlenül képesek kiváltani az AHR-t (25). A különféle egértörzsek eltéro mértéku AHR-jei is valószínuleg részben T sejtjeik eltéro genotípusával magyarázhatók a leginkább. A C57BL/6 egerek AHR-je megduplázódik, ha C57BL/6XA egerekbol származó csontveloi sejteket kapnak, azonban ugyanakkora marad, ha donor állatokban nincs T sejt (167). A szenzitizált állatok tüdejében – az asztmás egyénekhez hasonlóan – a fo sejtpopulációt a T sejteken belül a CD4+ sejtek alkotják (168), melyek neutralizálása CD4-ellenes ellenanyaggal (169), vagy a CD4 gén „kiütése” (170) megszünteti az asztmás tüneteket. Több tanulmány szerint a légúti gyulladás az AHR-tol szétkapcsolható. Valószínusítheto, hogy az AHR kialakításában és fenntartásában ilyen esetben is a Th2 limfociták által termelt mediátorok az elsodlegesek, mivel ezek egyedül is képesek az AHR mediálására még eozinofil granulociták, hízósejtek, ellenanyagok, és Th2 citokinek nélkül is (171). Ugyanakkor a Th0 és Th1 sejtek által stimulált CD8+ T sejtek alapvetoen fontos szerepeire is vannak bizonyítékok (25, 166, 172): T sejt hiányos (SCID) egerekben, az allergén specifikus Th1, vagy Th0 sejtek önmagukban is kiváltanak légúti gyulladást, sot a Th1 sejtek még súlyosabbá teszik a Th2 limfocitákáltal kialakított gyulladásos tüneteket.
25
B sejtek hiányában C57BL/6 egereken kialakíthatók a humán asztmához hasonló tünetek, bár az eozinofil granulociták nem aktiválódnak (173). Más kísérletek szerint azonban, B sejt, IgE (174) és ?? T sejt (175) szükséges az AHR és a légúti gyulladás kiváltásához. Azonban valószínusítheto, hogy a B és a ?? T sejtek csak az allergén specifikus, érett Th2 limfociták kialakulásához szükségesek, így feloldható az ellentmondás a különbözo kísérleti rendszerekbol származó eredmények között.
Az asztmás légutakban meglehetosen kisszámú apoptotizáló limfocita található (176) az egészségesekhe z képest. Ennek egyik oka, hogy (pl. az asztmások mucosájában található T sejtek esetén) az apoptózis beindításában fontos Fas antigén expressziója gátolt, míg az antiapoptotikus bcl-2 túlexprexpresszált. Ez a jelenség azonban nem igaz a lumenbe már megérkezett T sejtekre: az asztmások majdnem összes T sejtje expresszálja a Fas antigént a BAL-ban (177), annak ellenére, hogy az apoptotizáló sejtek száma itt sem emelkedik. Az itt tapasztalt csökkent apoptotizáló képességet, a limfocitákat éro nagyszámú stimuláló tényezovel magyarázzák: ugyanis mindazok a tényezok, melyek a T sejteket aktiválják (IL-4, IL-5 GM-CSF), csökkentik apoptotizáló képességüket (26). Eozinofil granulociták A keringésben lévo eozinofil granulocita szint együtt változik az asztma súlyosságával (74, 178). Az eozinofilek nemcsak egyszeruen jelen vannak, hanem aktívan muködnek is az asztmás egyénekben: szekrétumaik még a BAL-ból is kimutathatóak (14, 179). Az Th2 citokinek termelése (IL-4, IL-5) pedig nemcsak az asztma súlyosságával, hanem az eozinofilek infiltrációjával (19, 180) is korrelál.
Bár az eozinofil gyulladás a korai és késoi asztmás válasznak is kíséroje (161, 181), igen kérdéses, hogy aktív kiváltó tényezoje, vagy csak véletlen egybeesés vele. Az allergén ind ukált eozinofil gyulladás és a légzésfunkciós elváltozások között ugyanis általában nincs egyértelmu összefüggés: 24 órával az allergén inhaláláció után, azon egyének légútjaiban is megjelennek az eozinofilek, akik csak korai asztmatikus reakciót mutatnak, anélkül, hogy AHR-t váltanának ki ebben az idoben (181). Azonban az inhaláció után 3-4 órával megjeleno eozinofileket kapcsolatba hozzák a LAR-ral (late airway reaction). A manapság talán leginkább elfogadott nézet szerint az eozinofil granulociták nem kizárólagosan felelosek a LAR kialakulásáért, hanem a T sejtekre 26
irányuló pozitív visszacsatolással aktívan hozzá is járul (183) ahhoz.
Az asztmás gyulladás kialakításában sokkal inkább értheto az eozinofilek funkciója, mint az AHR-ben. Már korábban is az eozinofil granulocitákat vélték a bronhiális mucosa sérülésében és a bronhiális obstrukcióban elsodlegesen fontos sejtféleségnek az asztmás válaszban (184, 185) emberekben és egerekben egyaránt. Az allergiás gyulladás során az eozinofilek aktiválódnak, majd a keringésbol a gyulladt tüdobe vándorolnak, miközben felszabadulnak mediátoraik. Az eozinofil sejtek aktiválódását pl. a komplement rendszer egyes elemei (C3a), bizonyos CC kemokinek (eotaxinok, MCP-3, MCP-4, RANTES), egyes citokinek (GM-CSF, IL-3, IL-5) és az IgE molekulák válthatják ki (185, 186). Az asztmás egyének eozinofiljein a kis affinitású IgE receptoron (Fc?RII) kívül, (a monocitákhoz hasonlóan) megtalálható a nagy affinitású IgE receptor (Fc?RI) is, amely szintén részt vehet aktiválásában (187). Az aktivált eozinofilek hatásait jól tükrözik az IL-5-öt túlexpresszáló transzgenikus egerek (188), amelyekben spontán szövetkárosodás és korai mortalitás figyelheto meg az eozinofil akkumuláció miatt. Az eozinofilek célszövet felé irányuló vándorlásának leginkább feltérképezett lépése a transzendotheliális migráció, amely irányításában – a többi gyulladásos sejthez hasonlóan – számos citokin és kemokin vesz részt (148, 189, 190). Elso lépése, a "rolling", az eozinofil felszínén megjeleno P-szelektin által jön létre. Kimutatták, hogy míg a vad típusú (WT) egerek tüdejében jelentosen felszabályozódik e molekula expressziója allergén szenzitizálás után, a „hisztidin dekarboxiláz génkiütött” (HDC KO) egerek tüdejében alapszinten marad (191). A Pszelektin aktiválja, a citokinekkel és kemokinekkel együttesen, az eozinofilek felszínén lévo ? 1 és ? 2 integrineket, melyek a migráció további elemei. Fontos kiemelni, hogy az integrinek expressziója konstitutív, csupán aktivitásuk szabályozott. A ? 1 integrin a VLA-4 (vascular-cell adhesion molecule 1)alkotójaként az endotélen expresszálódó VCAM-1-hez (vascular-cell adhesion molecule 1) köt. A ? 2 integrint, a Mac-1 (CD11b/CD18) részeseként, az érfalon található ICAM-1 ismeri fel. Az elobb említett kölcsönhatás által csökken az eozinofilek ingerküszöbe (192). A RANTES, az IL-5-tel együtt hatva, tranziens módon aktiválhatja a ? 1 integrint; az IL-4 pedig VCAM-1 mennyiségét növelheti (193). Az MCP-3 a Mac-1 molekulában idéz elo olyan konformációváltozást, mely emelkedett ICAM-1 adhézióval jár (194). A molekulák közötti kölcsönhatások növelésén kívül, a kemokin indukált integrin dezaktiváció is
27
fontos a leukociták szövet felé irányuló mozgásában. A célszövetbe migrált aktivált eozinofilek granulomaiból felszabadulnak az asztmás tüneteket kiváltó effektor molekulák: az EMBP (eosinophilic major basic protein), az ECP (eozinofil kationos fehérje) és az eozinofil peroxidáz. Az eozinofilek ezenfelül a leukotriének (foleg leukotrién C4) legfobb forrásai is, melyek kontrahálják a légúti simaizomzatot, növelik a vaszkuláris permeabilitást, és újabb eozinofil sejteket toboroznak a gyulladás helyére (195). Ezek – a celluláris citotoxicitás révén – súlyosan károsítják a respiratorikus epitéliumot, megváltoztatván a mucosa felszínének ozmolaritását és kikezdve az alatta fekvo idegeket; továbbá allosztérikusan modulálhatják a muskarin M2 receptorát, kiválthatják a hízósejtek és bazofilek degranulációját, és serkenthetik a nyák szekréciót. Így aktívan részt ve hetnek a légúti simaizomzat nemspecifikus bronhokonstriktorokkal szembeni túlérzékenységének kialakításában (148, 197) is. Bár az asztmás gyulladást foleg a limfocita eredetu mediátorok irányítják (26), az eozinofilek önállóan is bekapcsolódnak a szabályozási folyamatokba, pl. a következo citokinek és kemokinek termelésével: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, MIP-1? (macrophage inflammatory protein-1? ), RANTES. Így belátható, hogy az eozinofil granulociták nemcsak egyszeruen fizikailag károsítják a szöveteket, hanem immunreguláló hatásaik is vannak. Az említett mediátorok pozitív visszacsatolással emelhetik is az eozinofil granulociták érésére és aktiválására ható citokinek (IL-3, IL-5, GM-CSF) (147, 197) szintjét. A T limfocitákhoz hasonlóan az eozinofil granulociták apoptotizáló képessége is csökken az asztmás emberek légútjaiban, az egyéb eozinofil gyulladással járó betegségben szenvedokkel (pl. krónikus bronhitis) összehasonlítva (176). Számos citokinrol (GM-CSF, IL-3, IL-5, IL-9, IL-15) megállapították, hogy növeli az eozinofilek túléloképességét (198-200).
Az asztmás tünetek kialakulásában nemcsak az érett, hanem a még éretlen, differenciálatlan eozinofil progenitor sejteknek is szerepet tulajdonítanak. Az eozinofil granulociták két úton alakulhatnak ki az éretlen, CD34+, EO/B CFU-ból (eozinofilbazofil közös eloalak); és juthatnak el a gyulladás helyére (201). Vagy a csontveloben érnek (202) IL-3, IL-5, GM-CSF hatására a bazofil eloalakokkal közösen, majd IL-5-re érett eozinofil granulocitákká differenciálódnak (nem bazofillé) (202, 203) és a célszövetbe migrálnak (204); vagy az éretlen CD34+ sejt a tüdoben (célszövet) érik meg (205). Az utóbb említett út az "in situ" hemopoézis. Az eozinofil/bazofil progenitor
28
szint az atópiások szérumában magasabb (206), mint a kontroll egyénekben. A keringésben lévo eozinofil-bazofil sejtek száma pedig az akut asztmás tünetekkel párhuzamosan emelkedik (207). A késoi asztmatikus reakciót mutató betegek szérumában a CD34/IL-5R? kettos pozitív sejtek emelkedett számban jelennek meg a provokálás utáni 24 órán belül (208). Mivel ezek a sejtek fokozottan érzékenyek az IL5-re, valószínuleg eozinofil irányba differenciálódnak. De nemcsak a keringo, hanem a csontveloi eozinofil-bazofil progenitor sejtek száma is no az atópiás egyénekben allergén inhaláció következtében (209). Sot, az atópiás emberekben, az asztma státuszától függetlenül, emelkedett a csontveloben mind a CD34+ sejt, mind az érett és az éretlen eozinofil granulocita szám (210). A kettos választ (korai és késoi asztmás reakció) mutató egyének csontveloi sejtjei az IL-5-re való érzékenységüket tekintve különböznek a csak korai választ mutatókétól. Ez vagy az eozinofil-bazofil irányba elkötelezett progenitor sejtek nagyobb fokú válaszkészségével magyarázható, vagy a sejtfelszíni IL-5 receptor expressziójának felszabályozásával. Valószínu az utóbbi feltételezés a hitelesebb, ami összecseng azzal a megfigyeléssel is, hogy az IL-5 termelés szoros kapcsolatban áll a késo asztmatikus reakcióval (211). Az atópiás légutak bronhiális biopsziáiban is emelkedett számú CD34+ sejt van jelen. Bár közülük azoknak a sejteknek a száma, amelyek az IL-5R ? -alegységét is expresszálják, csak asztmás egyé nekben volt kimutatható (210). Egér asztma modellben – az eozinofil sejtszám növekedéséhez hasonlóan - az eozinofil progenitor szint is no a tüdoben, a BAL-ban és a csontveloben (212). Ezek a megfigyelések alátámasztják az eozinofil granulociták érésének mindkét útját az asztma patofiziologiájában. Dendritikus sejtek A naiv T sejtek Th1, vagy Th2 irányú polarizációjának szabályozásában talán a dendritikus sejt az egyik foszereplo. A perifériás szöveteket, melyek eloször találkoznak a szervezettol idegen anyagokkal, olyan éretlen dendritikus sejtek népesítik be, melyek endocitotikus képessége különösen fejlett, így képesek az antigének bekebelezésére. Az éretlen dendritikus sejtek még nem tudnak azonban antigént prezentálni. A helyszínen levo mikrobiális termékek, vagy a gyulladásos citokinek hatására az éretlen dendritikus sejtek csökkentik antigén felvételüket, a nyirokcsomókba vándorolnak és megérnek. Érésük során sejtfelszíni MHC, adhéziós és kostimulációs molekuláik expressziója fokozódik, és a T sejtek aktiválásában, polarizálásában szinte egyedüli szerepet betölto sejtekké válnak (213-215). Bár a dendritikus sejteket több szubpopulációra különítették 29
el Th indukáló képességük szerint (216), mégis elsosorban a perifériás szövetben levo gyulladásos mediátorok szabályozzák döntoen a nyirokcsomóba került érett sejt citokin termelését (119). Azok a dendritikus sejtek, melyek éretlen alakjukban az érést stimuláló hatásokon kívül INF-?-val találkoztak, az antigénprezentáció során IL-12-t termelnek, így a Th1 sejtek kialakulásának kedveznek (217). A prosztaglandin E2- vel, vagy IL-10-zel találkozott éretlen dendritikus sejtek érésük után csupán csökkent mennyiségu IL-12-t szecernálnak, így Th2 immunpolarizációt okoznak (120). A hisztamin szintén Th2 irányba tolja el az érett dendritikus sejtek immunpolarizációs képességét (39). Hízósejtek A hízósejtek az azonnali- típusú allergiás reakciók elsodleges effektor sejtjei. A belolük származó triptáz részleges AHR-t mediál (147, 149). Különösen az asztma korai fázisának kialakulásában töltenek be kulcsszerepet: hízósejt hiányos állatokban szenzitizálás után kifejlodik légúti gyulladás és késoi AHR, viszont korai nem (41). Az utóbbi évtizedben a hízósejtek egyéb immunológiai szerepeire is fény derült: szerepet játszanak a gyulladásban, a fejlodésben (218), és a malignus folyamatokban (219) is.
Bár még mindig nem teljesen bizonyított, de feltételezheto, hogy a hízósejtek ugyanabból a csontveloi progenitor sejttípusból alakulnak ki, mint a bazofil granulociták (220). A csontve loi prekurzor sejtekbol CD34+, c-kit+, Fc?RI+ mononukleáris sejtekké fejlodnek, a keringésbe jutnak, majd a bronhusok mucosális, és szubmukózális rétegeiben telepszenek meg (221). Itt megy végbe szövet-specifikus differenciációjuk, érésük és expanziójuk. A hízósejtek korai differenciációjához növekedési faktorok (IL-3, SCF) (SCF: stem cell factor) szükségesek (222), a szövetspecifikus differenciációhoz az IL-4 esszenciális (156). Ezután az érett hízósejtek a lumen felé tovább vándorolva már készen állnak az aktivációra. Tehát a dendritikus sejtekhez hasonlóan – a perifériás szö vetekben lokalizálva – ok is az elsok között vannak, akik találkoznak a külso környezettel.
Kétféle úton aktiválódhatnak: vagy nagy affinitású IgE receptoraikkal (Fc?RI), amelyek megkötik felszínükön az antigénnnel keresztkötött specifikus IgE molekulákat, vagy IgE-tol független módon (pl. mikrobiális termékek, ill. komplement komponensek révén). Az aktivált hízósejtek nagymennyiségu hisztamint, citokineket (TNF-? , GM30
CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), leukotriéneket, proteoglikánokat, és egyéb mediátorokat termelnek. Ezek a mediátorok esszenciálisak az akut asztmás válasz kialakításában és fenntartásában, azáltal, hogy újabb és újabb gyulladásos sejteket vonzanak a helyszínre, valamint beleszólnak az ott lévo gyulladásos és struktúrsejtek (simaizomsejt, stb.) alapveto életjelenségeibe is: pl. proinflammatorikus hatásokat váltanak ki (156, 223). Bár a hízósejtek in vitro képesek antigén prezentációra (224), in vivo a nyirokcsomókba nem vándorolnak el, ezért valószínuleg nem képesek közvetlenül hatni a naiv T sejtek érésére. Azonban szecernált mediátoraik közvetetten – pl. a dendritikus sejtek révén – befolyásolhatják ezeket a folyamatokat (39) is.
4. ábra : Az allergiás asztma feltételezett molekuláris patomechanizmusa (21)
Összefoglalva a 4. ábrán mutatjuk be az allergiás asztma patomechanizmusairól szerzett legfontosabb ismereteket (21): Az asztmában a makrofágok és a dendritikus sejtek találkoznak eloször az allergénnel: vagy direkt módon, vagy pedig IgE- vel burkoltan az immunkomplex részeként. Az allergén hatására az alveoláris makrofágok (M) aktiválódnak, és proinflammatorikus citokin termelésbe kezdenek (TNF? , IL-1? /? ) (a). Majd – az allergén-IgE komlex kialakulása után – a makrofágok, az eozinofil granulociták, a bazofilek és a hízósejtek az Fc receptoraik által direkt, vagy a proinflammatorikus citokinek révén indirek módon tovább aktiválódhatnak. Az eozinofilek és makrofágok felszínén ugyanis kifejezodik a kis affinitású IgE receptor (CD23), amely fokozza proinflammatorikus citokin termelésüket, és a makrofágok peptid prezentációs képességét a T sejtek felé. A bazofileken, hízósejteken, és az
31
aktivált eozinofileken az Fc?RI fejezodik ki. Az aktivált sejtek élénk kemokin termelésre is képesek, így általuk közvetlenül, vagy mediátoraik (pl. reaktív oxigén gyökök, leukotriének) által közvetetten felszabadul a kemokinek elso "hulláma" (b), melyek foleg a Th2 típusú sejtekre hatnak. A (c) keringésbol a kemokin receptorokat viselo újabb gyulladásos sejtek – aktivált limfociták (L), eozinofil granulociták, bazofilek, hízósejtek – vándorolnak a szövetbe, amelyek szintén proinflammatorikus mediátorokat szecernálnak, így még nagyobb mennyiségu és még többféle típusú kemokin termelését indítják be. Az (d) alveoláris makrofágok (M) és dentritikus sejtek (DC) megérnek, a nyirokcsomókba vándorolnak, (e) ahol APC-kként antigén specifikus T sejt aktivációt és proliferációt indukálnak. Az aktivált T sejtek felszínén Th2 típusú kemokin receptorok jelennek meg, ezért miután a keringésbe kerültek (f), a kemokin gradiens a gyulladt légutakba vonzza (g) oket. Ott a T sejtek találkoznak specifikus allergénjeikkel, differenciálódnak és (h) Th2 citokineket (IL-4, IL-13) termelnek, melyek serkentik a struktúr sejtek (fibloblasztok, simaizomsejtek, epitél sejtek) kemokin termelését. Ez által az ördögi kör nyomán – mely a proinflammatorikus mediátor— kemokin tengely révén jön létre – alakul ki a krónikus asztma.
2.5 Az asztma és (AEDS) szabályozásában szerepet játszó fontosabb citokinek és kemokinek 2.5.1 Citokinek A citokinek kis méretu (8-80 kDa), szokatlanul glikozilált fehérjék, amelyeket elsosorban az immunrendszer sejtjei, de egyéb sejtek is – pl. fibroblasztok, keratinociták, asztrociták – termelnek (225). A sejtek közötti kommunikációban vesznek részt. Funkcióikat elsosorban az immunválasz szabályozásában töltik be autokrin, parakrin, vagy endokrin úton (226, 227). Befolyásolhatják az immunsejtek növekedését, proliferációját, differenciációját, apoptózisát, kemotaxisát, vagy a B sejtek által termelt ellenanyag izotípusát. Részt vesznek a szövetek morfogenezisében és az angiogenezisben (228) is. Jellemzo tulajdonságuk a pleiotrópia (egy citokinnek többféle funkciója van) és a redundancia (több különbözo molekula, hasonló funkcióval rendelkezik), melyek igen megnehezítik a különféle betegségekben betöltött szerepeik pontos azonosítását. Ráadásul nagy affinitású receptoraikon hatva kölcsönösen befolyásolják egymás hatását és expresszióját. Receptoraik általában nagyon heterogén 32
csoportot képeznek, és szignáltranszdukciós útjaik is igen eltéroek (226). A citokin hatás szabályozása receptoraik expressziójának szabályozása, szolubilis receptorok szintézise, valamint citokin antagonisták révén valósul meg (229). Mivel az asztma kialakulásban az immunrendszer különösen elemi szerepet játszik, a citokineknek egyedülálló szerepe van e betegség kialakításában és fenntartásában. Általánosan elmondható, hogy elsosorban azok a citokinek növelik az asztma kialakulásának esélyét, illetve súlyosbítják a betegséget, amelyek az immunpolarizációs egyensúlyt Th2 irányba billentik, valamint az asztmában résztvevo gyulladásos sejteket aktiválják, érését stimulálják. Az ezzel ellentétes hatású citokinek általában védo szerepeket látnak el. A fejezet további részében az asztma patomechanizmusával kapcsolatba hozható citokinekrol részletesebben szót ejtek.
Az asztma a tüdoben kialakuló speciális gyulladás (146). A gyulladás és akut fázis reakciók „karmesterének” három citokint tartanak: a TNF-? -t, az IL-1-et (? és ? ), és az IL-6-ot (230), melyeket sokféle sejttípus képes termelni. Mindhárom citokin más immunfolyamatokba is beleszólhat: pl. az IL-1 az immunpolarizáció kezdeti kialakulásában is elemi (102), az IL-6 pedig a plazmasejt differenciáció legfontosabb irányítója (225) is egyben. Ezekhez a citokinekhez sorolható az IL-11 is, mely az IL-6hoz hasonló hatású (231).
A Th2 típusú sejtek fejlodéséhez az IL-4 nélkülözhetetlen citokin. Sot aktívan gátolja a Th1 immunpolarizációt, pl. azáltal, hogy gátolja az IL-12R ? -alegységének expresszióját a T sejteken (232). Az IL-4 legfobb forrásai a CD4+ T sejtek; de a CD8+ T sejtek, eozinofil granulociták és hízósejtek is termelik (112, 233). Alapveto funkciói – melyek
bármelyikének
túlzott
elotérbe
kerülése
kedvez
az
allergia/asztma
kialakulásának – a következok: ?
a B sejtek ellenanyag termelésének izotípus váltása IgG-rol az asztmában kulcsfontosságú IgE-re (151)
?
a légutakban kehelysejt metaplázia eloidézése és a nyák szekréció növelése (234)
?
egyes sejtek differenciálódásának elomozdítása (kofaktorként pl. a hízósejtek fejlodésében nélkülözhetetlen (156))
?
a pulmonáris endotél sejtek felszínén a VCAM-1 expressziójának növelése, ezáltal az eozinofilek tüdobe toborzásának és proliferációjának serkentése (234)
33
?
az AHR kialakítása (235) Az IL-4-et erosen túltermelo transzgenikus egerek tüdejében nagy mennyiségu
b220+ B sejt felhalmozódás figyelheto meg (236). Szenzitizált BALB/c állatokban, IL-4 ellenes antitest kezeléssel az AHR megszüntetheto, de a légúti eozinofilia nem (237). Feltételezheto, hogy a kezelés a hatást elsosorban az immunpolarizációs viszonyok megváltoztatásával éri el, mivel csak akkor vezet sikerre, ha "idoben" megkezdik; de minden bizonnyal a többi IL-4 funkció (pl. hízósejt differenciáció) gátlása is fontos tényezo lehet. Az IL-4 gén "kiütése" (238) szintén jelentosen enyhíti az asztma tüneteit, bár teljesen nem szünteti meg azokat. Az állatmodellek szerint tehát az IL-4 szükséges, de nem elengedhetetlen az asztmás tünetek kialakulásához. Ezért nem meglepo, hogy csupán az IL-4 szabályozása alatt álló egyes folyamatok (pl. az IgE termelés) gátlásával (239), nem lehet teljes egé szében visszaállítani az egészséges fenotípus t.
Az IL-13 egy olyan citokin, amely többféle immunfolyamatban helyettesítheti az IL-4-et, hiszen receptoruk ? -alegysége azonos (240). Asztmás egyénekben emelkedett expressziója (241); valamint az IL-4-gyel közös receptor alegységének expressziója (242). Amellett, hogy IL-4-gyel együtt az egyik legfontosabb Th2 citokinnek tartják, szintén képes stimulálni az IgE termelést, serkenteni a nyák produkciót és a VCMA-1 expresszióját az endotél sejteken, továbbá elosegíteni az AHR kialakulását (26, 241, 243-245). Közvetlenül befolyásolja egyes citokinek és kemokinek expresszióját is: csökkenti az INF-? és IL-12, fokozza az eotaxin szintjét (244); az IL-6 termelést a makrofágokban csökkenti (246), de a bronhiális epitél sejtekben növeli (247). A magas IL-13 – az NF?B révén – képes csökkenteni az IL-5 transzkripcióját is (248). Így közvetetten az egész citokin mintázatot megváltoztathatja az antigén-prezentáció során, és
szabályozza
az
eozinofil
gyulladást
is.
Az
állatkísérletek
vizsgálatainak
eredményeibol is felfedezheto az IL-4-gyel való hasonlóság. Az IL-13 gátlása részlegesen csökkenti az AHR-t és a kehelysejt hiperpláziát, viszont a légúti gyulladást nem (249) állatmodell rendszerben. Azonban, ha az állatok immunrendszere – ugyanazon antigén hatására – már Th2 irányban polarizált (az INF-? szintje csökkent), a légúti gyulladást is gátolja. A tüdobe bejuttatott IL-13 – valószínu az eotaxin indukció által – spontán lokális eozinofiliát okoz, anélkül, hogy a csontveloben és a szérumban megemelné az eozinofil granulocita számot (250).
34
Az IL-3, GM-CSF és IL-5 az eozinofil granulociták érésben tölt be lényeges szerepet, közülük az IL-5 kiemelkedo fontosságú. (Az IL-3 egyben a hízósejtek fontos növekedési faktora is.) Egyértelmu kapcsolat áll fönn az IL-5-öt expresszáló sejtek száma és az eozinofil gyulladás között (251). Az IL-5 mRNS-t tartalmazó sejtek száma szorosan korrelál az asztmások légzésfunkciós elváltozásaival (252). Az IL-5 direkt bejuttatása humán légutakba mucosális eozinofiliát és bronhiális túlérzékenységet vált ki (253). Az IL-5 stimulálja az eozinofilek keringésbe jutását, meghosszabbítja élettartamukat; továbbá amellett, hogy az eozinofilek gyenge kemoatraktánsának is tekintheto, elosegíti az eotaxin általi toborzásukat is (254). A plazmasejtek antitest termelését IgA izotípusra kapcsolja át, így elosegíti ez eozinofilek antigén általi degranulációjának egyik leghatékonyabb útját (26, 148). Az IL-5 fontosabb celluláris forrási az IL-4 forrásaival azonosak.
Állatkísérletek eredményei szerint az IL-5 még az IL-4-nél is fontosabb szerepeket tölthet be az asztma patomechanizmusában. Az IL-5 gén "kiütése" (255), vagy neutralizálása antitesttel (256) általában az IL-4-nél markánsabban csökkenti, csaknem teljesen eltörli az AHR-t és az eozinofiliát szenzitizált egerekben; ugyanakkor a T sejtek muködésre és az IgE termelésre nincs hatással (255, 257). Érdekes, hogy BALB/c törzsben csak az egyik tünetféleségre gyakorolt hatását figyelték meg (237). Az IL-5 még a STAT6 (az IL-4 jelátviteli útjában szereplo molekula) génkiütése által létrehozott egerekben is, amelyeken lehetetlen asztmás reakciót kiváltani (258), képes visszaállítani a betegségre jellemzo tüneteket állatmodellben (259); továbbá az asztma kialakulásában
esszenciális
T
sejteket
is
helyettesítheti
(260).
Az
IL-5
túlexpresszáltatása transzgenikus egerekben spontán AHR-t okoz (236), továbbá a bronhus-asszociált limfoid szövet expanziójához vezet, amely az – IL-4 transzgenikus egerekben
tapasztaltakhoz
hasonlóan
–
elsosorban
B
sejteket
tartalmaz.
Valószínusítheto, hogy az IL-5 más úton vezet az asztmás tünetek kialakulásához, mint az IL-4 (147) (lsd. 2.2 fejezet): míg az IL-4 inkább a hízósejtek és IgE révén fejti ki hatását, az IL-5 az eozinofilek közremuködésével.
Az IL-17 egy viszonylag frissen felfedezett citokin, amely kapcsolatba hozható az asztma patomechanizmusával. Az asztmás egyének plazma IL-17 koncentrációja enyhén (261), a tüdoszövetben mért szintje pedig szignifikánsan emelkedett a kontroll egyénekhez képest (262). Az aktivált memória T limfociták által termelt IL-17 a 35
neutrofil granulociták aktiválásában és gyulladásos helyre irányításában esszenciális (261, 263), és lehetséges, hogy közvetlenül részt vesz az AHR kialakításában is (264). Kemotaktikus hatásait feltételezhetoen közvetve, a CXC kemokinek által fejti ki (263). Állatkísérletek szerint az IL-17 expressziója a tüdoben a szenzitizálás után hamarosan megkezdodik, és együtt jár a neutrofil granulociták infiltrációjával (265). Szenzitizálás elott adott IL-17 ellenes ellenanyag jelentosen csökkentette a bronhusokba irányuló neutrofil infiltrációt, ugyanakkor – az IL-5 emelkedésével párhuzamosan – eros bronhiális eozinofilát okozott.
Az IL-9 szintén a Th2 típusú T sejtek által termelt pleiotróp citokin (266), melynek mennyisége az asztmásokban emelkedett (26). Különösen az aktivált T limfociták (267, 268), a hízósejtek (269), és a hemopoetikus progenitor sejtek (270) egyik növekedési faktoraként tartják számon. Ismeretes róla, hogy serkenti a B sejtek ellenanyag szekrécióját is (271). In vivo túlexpresszáltatása transzgenikus állatok tüdejében: légúti epitélium hipertrófiát, szubmukózális kollagén felhalmozódást, – eozinofil granulocitákban és limfocitákban dús – sejtes infiltrációt, hízósejt hiperpláziát, és eros AHR növekedést idézett elo (272); miközben a hízósejtek intaktak maradnak. IL-9 génkiütött egereken végzett kísérletek alátámasztották a mastocitózisban betöltött szerepét, viszont e kísérlet szerint, a szöveti eozinofiliában, valamint a T sejtek fejlodésében, vagy differenciációjában nem létfontosságú (273).
Az IL-10 egy szuppresszor citokin, a gyulladásos reakciók "fékje". A mononukleáris fagociták (274), a természetes ölosejtek (275), a dendritikus sejtek (39) és a Th1-Th2 sejtek (276) termelik. Jóllehet korábban egyértelmuen a Th2 citokinek közé sorolták, gátló hatásait mindkét segíto T limfocita szubpopuláció proliferációjára és citokin termelésére kifejti (277) a CD28 szignáltranszdukciós út inhibíciója révén (278). Az állatkísérletek eredményei egyelore még elég ellentmondásos képet festenek az IL-10 in vivo funkcióiról. Az exogén IL-10 gátolja a T sejtek IL-5 termelését és az eozinofil gyulladást (277, 279). Viszont az IL-10 hiányos egerekben is, az elobbihez hasonlóan, gátolt az eozinofil gyulladás, az AHR pedig ki sem alakul (280). Lehetséges, hogy az IL-10 másképpen hat az asztma különbözo fázisaiban, illetve lokálisan, vagy szisztémásan, amikor sokféle citokin expressziójának szintjét befolyásolja. A hisztamin a T sejtekben és a dendritikus sejtekben emeli az expresszióját (39).
36
Az INF-?-át az allergia/asztma egyik legfontosabb inhibitorának tartották, mivel az INF-?-t expresszáló sejtek száma csökken az asztmában (281). Ráadásul az asztmás egyének szteroid kezelése a betegség tüneteinek enyhítésével párhuzamosan növeli az IFN-? szintjét (111, 112). Egér asztma modellben az INF-?-t expresszáló sejtek száma negatívan korrelált a légúti hiperreaktivitással (249); továbbá az INF-?-t indukáló Th1 citokinek (INF-?, IL-12, IL-18) szintén csökkentik az AHR-t (282, 283). Mindezen hatásait elsosorban kétségkívül az immunpolarizáció Th1 irányú eltolásával válthatja ki, mivel – az eros Th1 polarizációra képes – BCG- vel (Bacilus Calmette-Guérin) (284) és a CpG-vel (citozin- guanozin dinukleotid) (285) analó g változásokat képes eloidézni (lsd. 2.3 fejezet). Napjaink elképzelései szerint azonban, ennek a Th1 sejtek által termelt citokinnek más szerep is jut az allergiás betegségek szabályozásában, mint pusztán az immunpolarizáció befolyásolása. Állatokon végze tt kísérletek szerint, az INF-? csupán akkor nyújt védelmet az asztma kialakulásával szemben, ha lokálisan, a szenzitizálási protokoll meghatározott pontján adják be (286). Sot, ha nem megfelelo idopontban juttatnak be INF-?-át szecernáló Th1 sejteket, nemhogy neutralizálja az IL-4 és IL-5 hatásait, hanem még az asztmás tünetek súlyosbításához is vezethet (25). Ezeknek a megfigyeléseknek a hátterében a többi citokin expresszió jára gyakorolt egyedi hatások feltételezhetok: az IL-13 hatását potencirozva a tüdoben növelheti az antigénprezentáló sejtek és az NK sejtek számát (249); illetve – feltételezhetoen a bronhiális epitél sejtek révén – a BAL-ban az IL-6 szintjét (247). Ezen tanulmányok alapján kétségbe vonható a korábbi álláspont, mely szerint – az asztmá sok BAL-jából is kimutatható INF-? (287) – mindig az allergiás betegségek kialakulásának kedvezne. Valószínusítheto, hogy jótékony, vagy káros hatásai a többi mediátor expressziós mintázatának és a szervezet homeosztázisát befolyásoló egyéb paramétereknek a függvénye.
A T sejtek növekedési faktorai, amelyek gyakran autokrin módon hatnak, általában a Th1 típusú citokinekhez sorolhatók. Az IL-7 a limfoid progenitor sejtbol a T és B sejtek kialakulásának kezdeti lépéseinél (288), a GM-CSF pedig a myeloid progenitor sejtek fejlodésében szükséges. (Az SCF mindkét hempoetikus érési vonal növekedési faktora.) Az IL-15 az IL-2-vel együtt, a T sejtek éréséhez nélkülözhetetlen (289). Az újabb kutatások az IL-15-öt – mely mind szerkezetileg, mind szignáltranszdukciós útjaiban egyaránt hasonlít az IL-2-re – is kezdik bevonni az asztmakutatás középpontjába. Az IL-15, az IL-2-vel ellentétben, azonban nemcsak az 37
aktivált T sejtekben, és az azokat tartalmazó szövetekben expresszálódik, hanem számos más sejtféleségben (290) is. Bár Th1 citokinnek tartják (291), mivel stimulálja az INF-? expresszióját (292), és tüdoben mért expressziója a Th1 sejtek által kialakított gyulladásos megbetegedésekben emelkedik inkább (293), valamint AEDS-ben az IgE izotípusú antitest kialakulását szuppresszálja (294); az asztmás egyének tüdejének szubmukóza rétegében is megfigyelték emelkedett expresszióját (295). Az allergiás betegségekben az IL-15 részt vehet a T sejtek IL-5 termelésének szabályozásában, továbbá – az IL-18-cal együttesen – az NK sejtek GM-CSF szintézisének indukálásában (296, 297) is. Az IL-15-nek (az IL-3, IL-5, IL-9, GM-CSF molekulákkal együtt (198, 200) megfigyelték az eozinofilekre irányuló antiapoptotikus hatását is (295). Az IL-15öt túlexpresszáló egereken végzett asztma kísérletek szerint (298), az IL-15 a betegség kialakulásával szemben véd: emelkedett expressziója az eozinofil sejtszám és a Th2 citokin szint csökkenésével jár.
Az IL-16 a CD4+ sejtek kemoatraktánsa és növekedési faktora. Immunreguláló tulajdonságai közé tartozik a CD25 (IL-2R ? -lánca), és az MHC II osztályba sorolt molekulák expressziójának az indukálása. Asztmás emberek BAL-jában szintje jelentosen megemelkedik allergén provokáció hatására (299), amit a hízósejtekbol felszabaduló hisztaminnak tulajdonítanak (300). Az epitél sejtek termelik, de asztmásokban a legfobb forrásuk a CD3+ T sejtek és az eozinofil granulociták (301).
Az IL-12, az IL-18-cal együtt, a még el nem kötelezett Th0 sejtek Th1 irányú differenciálódásában esszenciális citokin. Mindkettojükrol hamarosan kiderült, hogy indukálják az IFN-? szintézisét is (lsd. 2.3 fejezet). Az IL-12 receptorának ? 2 alegységét a Th1 sejteket markerének tekintik. Elsosorban a dendritikus sejtek, makrofágok és B sejtek termelik, melyek expressziójával döntoen befolyásolhatják az immunpolarizációt az antigénprezentáció során. Az IL-12 szintje az asztmásokban csökken (111, 112), amit a szteroid kezelés fokoz. Az IL-12 elsodleges hatása az atópiás betegségekkel kapcsoplatban az IgE szintézis gátlása és Th1 típusú sejtek differenciációjának elosegítése, valamint IFN-? szintézisük stimulálása (302).
Az IL-18 egy igen pleiotróp citokin (303, 304). Minden bizonnyal fontos szerepet lát el a gazdaszervezet infekciókkal szembeni védelmének (304) szabályozásában.
38
Korábban egyértelmuen Th1 immunválaszban tulajdonítottak neki fontos szerepeket INF-? indukciós képességei miatt. Állatkísérletek alapján azonban in vivo az IL-18 önmagában nem indukál Th1 irányú differenciációt, csupán gyorsítja azt (305). Igen összetett módon szól bele az immunpolarizációs viszonyokba. Az IL-12-vel együtt – még a TCR-tol függetlenül is – valóban eros Th1 irányú hatásai vannak (306, 307), sot együttesen teljesen blokkolják az IgE termelést férgekkel fertozött egerekben (308); viszont az IL-12 hiányában – sokféle sejttípuson – a Th2 citokinek termelését stimulálja. A naiv T sejteken csekély mértékben kifejezodo receptora már elegendo ahhoz, hogy hatására IL-4, IL-13 és GM-CSF termelodjön, különösen, ha IL-2 és IL-4 is jelen van környezetében (309, 310). A csontveloi bazofilek és hízósejtek szintén expresszálják receptorát; és IL-3-al együttes jelenlétében: IL-4, IL-13 citokin termelésébe kezdenek (310). Az IL-18 az NK és CD8+ T sejtek citotoxikus aktivitását is növelheti (311, 312).
Az asztmában az IL-18-nak igen ellentmondásos funkcióit írták le: hiányában a tüdobe infiltrálódó eozinofil granulociták száma emelkedik (313), ugyanakkor az exogén úton bevitt IL-18 – az eotaxin szintjének emelése által – szintén hasonló hatásokat képes kiváltani (127, 314, 315), sot növelheti a szérum allergén-specifikus IgE szintjét is (315). Ez utóbbi hatás kifejezodéséhez az IL-4-hez kötodo szignáltranszdukciós utakra is szükség van, viszont az IL-13-éra nincs (310). Az állatkísérletek eredményei tehát az in vitro eredményekkel együtt arról tanúskodnak, hogy az IL-18 az IL-12-vel együttesen valóban részt vehet a Th1 irányú polarizációban, de az IL-12 hiányában az immunrendszer Th2 irányú eltolódást is eloidézheti (303). Valószínuleg – a többi citokinhez hasonlóan – attól függoen dominál egyik, vagy másik funkciója, hogy milyen citokin és kemokin milio veszi körül. 2.5.2 Kemokinek A kemokinek kis molekulatömegu (8-10 kDa) szecernált fehérjék, amelyek az akut és krónikus gyulladás fontos résztvevoi és a leukociták egyik legfontosabb "forgalomirányítóinak" tekinthetok (316). Olyan citokineknek is felfoghatók, melyek nagyfokú strukturális és funkcionális hasonlóságot mutatnak. Nemcsak a különféle sejtek kemotaxisában vesznek részt, hanem fontos szerepük van a transzendoteliális migráció (lsd. eozinofil granulociták), a hemopoezis és az angiogenezis irányításában is (228). Pl. az SDF-1 (stromal cell derived factor-1), vagy receptora, a CXCR4 39
hiányában: az egerekben sérül a mielopoézis, a B sejt fejlodés és az organogenezis (317). Az allergia kapcsán talán legtöbbet említett eotaxin pedig, az SCF szinergistájaként, elosegíti az érett hízósejtek és a Mac-1 pozitív myeloid progenitor sejtek kialakulását (318).
Napjainkig több mint 40 különbözo kemokint, és több mint 20 kemokin receptort azonosítottak (26, 228). A legtöbb kemokin gén 2 intronból és 3 exonból áll. Legfontosabb konzervált csoportjaik azok a cisztein aminosavak, melyek hidrogénhidak révén a molekula harmadlagos szerkezetének kialakításában vesznek részt (21). A cisztein csoportok elhelyezkedése szerint 4 családba sorolják oket (26, 21): CC, CXC, C és Cx3C kemokinekre. Az allergia szempontjából talán a legérdekesebb családot a CC és CXC családok alkotják. A CC kemokinek a T sejtekre, az eozinofil granulocitákra és a monocitákra hatnak (26); a CXC kemokinek, N-terminusukon E- L-R motívumot tartalmazó tagjaik: a neutrofilek kemoatraktánsai, míg az ilyen motívumot nem tartalmazók: a mononukleáris sejteket vonzzák, súlyosbítva az asztmás gyulladást és a légúti túlérzékenységet (228, 319). A kemokinek valószínuleg egymástól erosen függo módon hatnak, és együttes mintázatuk dönti el, hogy az egészséges, vagy a beteg fenotípus alakul-e ki (21). A citokinekhez hasonlóan jellemzo rájuk a pleiotrópia és redundancia. Egyedi hatásuk sokszor nehezen vizsgálható, mivel gyakran közösen használják receptoraikat (320).
Receptoraik a 7 transzmembrán szakasszal rendelkezo, G fehérjéhez kapcsolt receptorok családjába tartoznak; hatásaikat kifejthetik foszfolipáz A2 és C, foszfatidilinozitol-3-kináz, protein-kináz C, STAT (signal tranducer and activator of transcription 6), Ca2+ flux, és citoszkeletális remodelling révén (74-79); valamint más kinázokat is aktiválhatnak. A kemokin receptorok többségének kódoló régióját egy exon alkotja (321).
Mivel a kemokineket elsosorban az allergiás betegségek kapcsán vizsgálták, az egészséges, nem gyulladt szövetek bazális kemokin expressziójának funkciójáról kevesebbet tudunk. Nem ismert például a tüdoszövetben konstitutívan expresszálódó SDF-1? pontos funkciója, melynek mennyiségét az allergizálás nem befolyásolja (322). Továbbá ismeretlen, hogy a limfoid szövetekben expresszálódó 6-Ckine- nek (MIP-2),
40
vagy a többféle szövetféleségben állandó jelleggel termelodo SDF-2-nek (323) mi a funkciója. Az eotaxin fiziológiás körülmények között az intesztinális rendszer eozinofil granulocita összetételét szabályozhatja (324). A PF-4 (platelet factor-4) pedig elsosorban nem az allergiás betegségekben, hanem az akut vaszkuláris sérülések, ill. az aktivált vérlemezkék által okozott krónikus betegségekben szabadul fel (325).
Az allergiás betegségek patomechanizmusában résztvevo sejtek többsége képes kemokineket termelni (26). A gyulladt légutakban a kemokinek egyik legboségesebb forrásának az epitél sejteket tartják, és úgy gondolják, hogy – mivel az eozinofilek és az egyéb gyulladásos sejtek gyakran találhatók közeli kontaktusban az epitél borítással – az ezekbol származó kemokinek esszenciálisak a krónikus gyulladással együtt járó beszurodés kialakításában. A RANTES, MCP-1, MCP-4, és eotaxin forrásainak konkrét vizsgálatai megerosítették ezt az elképzelést (254, 319, 326, 327).
A citokinekhez hasonlóan a kemokinek is feloszthatók aszerint, hogy a Th1, vagy inkább a Th2 immunpolarizációban vesznek részt (322, 328). A Th2 irányú polarizációt eloidézo kemokinek emelkedett expressziója növelheti az allergiás megbetegedések kockázatát, míg a Th1 kemokineknek az allergiával szemben védo hatásuk lehet (329). Az IL-4 termelo sejtek CCR3-at expresszálnak, így ez Th2 immuneltolódás egyik markere (330). Legfontosabb ligandjai az eotaxin, az eotaxin-2 és az MCP-3. Bár a RANTES is mediálhat jeleket rajta, más receptora is ismert (CCR5), mely inkább a Th1 sejtekre jellemzo, így ez a kemokin egyértelmuen nem Th2 hatású. Az MDC (macrophage-derived chemokine) és TARC (thymus and activation-regulated) a CCR4en hatva szintén Th2 sejtek kemotaxisára hat (331). A CCR8 a Th2 sejtek aktivált csoportjain figyelheto meg a leginkább, és in vitro szintén a Th2 sejteket vonzza (332). A CXCR3, CCR1 és CCR5 a Th1 fenotípussal (331, 333, 334) hozhatók összefüggésbe. A CXCR3 és CCR5 receptorok ligandjai az IP-10 (INF-? inducible protein), a MIG (monokine induced by interferon (IFN)-gamma), és a MIP-1? Th1 sejteket vonzanak in vitro (331, 333, 335). Azonban a Th1 sejtek kemotaxisának stimulálása nincs minden esetben jótékony hatással az asztmás tünetek kialakulására. Az IP-10 szintje az asztmás egyénekben (336) és állatmodellben is egyaránt emelkedett a légutakban (337). Transzgenikus, az IP-10-et tüdejükben túlexpresszáló egerekben, a kontrollhoz képest emelkedett AHR, szöveti eozinofilia, IL-4 szint, valamint – az IL-4-et szecernáló –
41
CD8+ T sejt figyelheto meg (337). Az IP-10 génkiütött egerekben viszont az elobbiekkel ellentétes hatások érvényesülnek (337).
A kemokin és citokin rendszer szoros összefonódásban áll egymással. A kemokinek nemcsak a különféle sejtek migrációjának irányítói, hanem indukálhatják a Th1 vagy Th2 irányú differenciációt, ezáltal citokin termelést is. Pl. az MCP-1-nek (Th2) és MIP-1? -nak (Th1) ismeretesek ilyen tulajdonságaik (337). Ugyanakkor a citokinek is hatással vannak a kemokin termelésre: Az IL-4, és IL-13 kulcsfontosságúak a tüdo fibroblasztok MCP-1 termelésének in vitro (339) és – atópiás egyénekben – in vivo (244) beindításában, valamint az eotaxin expresszióban (244, 340). Ez utóbbi hatást a TNF-? potencírozza (341). Az IL-4 az eozinofilek toborzásában nemcsak közvetetten, az eotaxin révén vesz részt, hanem stimulálja az endotél sejtek felszínén a VCAM-1 expressziót is (342), így e tekintetben szinergizálja a RANTES és IL-5 hatását (193) (lsd. 2.4 fejezet). Az IL-5 a sejtek szenzitizálása révén fokozza az IL-8, RANTES és PAF (platelet-activating factor) hatásait (343, 344). A TNF-? és az IL-1 in vitro mind a CC (pl. eotaxin), mind a CXC kemokinek potenciális induktorai (345). Az INF-? pedig fokozza az IP-10 (346), a RANTES (327), az MCP-4 (319), és a – TNF-? által indukált – eotaxin (347) termelést.
Mindezek az immunbiológiai szempontból dönto jelentoségu mechanizmusok elorevetítik a kemokineknek az allergia kialakításában és fenntartásában betöltött fontosságát, amelyeket legszélesebb körben talán az asztmával kapcsolatban tanulmányoztak. Ezen belül is, azoknak a kemokineknek és receptoraiknak kutatása folyik eroteljesebben, amelyek az eozinofilek kemotaxisában fontosak (21). Ezek a következok: MCP-1, MCP-3, MCP-5, MDC, MIP-1? , eotaxin, eotaxin-2 és RANTES, amelyek gyakran azonos receptorokat használnak (348). A kemokinek AEDS-ben betöltött szerepeirol viszonylag kevesebb adat áll rendelkezésünkre.
A CC kemokinek egy részének neutralizálása – az asztma állatkísérletes modellrendszerében – jelentosen csökkenti az aszt más tüneteket (349, 350). Az MCP-1-nek, amely leginkább a monociták kemotaxisára hat, az asztmás válaszban betöltött lehetséges szerepét számos kísérlet megerosítette humán vonatkozásban is (74, 326, 351): Asztmás egyének tüdejében az MCP-1 fehérje szintje szignifikánsan
42
emelkedett volt, a nem asztmásokéhoz viszonyítva (326). Az MCP-1 promoterének – 2518G polimorfizmusa pedig, amely emelkedett MCP-1 expresszióval jár (85), növelheti az asztma kialakulási kockázatát (74). Érdekes, hogy az MCP-1 úgy vesz részt az eozinofil kemotaxis irányításában, hogy fo receprora, a CCR2, nem expresszálódik a keringésben lévo eozinofil granulociták felszínén. Feltételezheto, hogy ezt elsosorban közvetett módon valósítja meg: Th2 immmunpolarizációt eloidézo tulajdonságai nyomán a differenciálatlan T sejtek érését Th2 irányba mozdítja el (352), így az IL-5 (353) és az IL-4 (320, 354) révén (eotaxin termelés szabályozása) hathat az eozinofilek kemotaxisára. Megfigyelések szerint, az aktívált eozinofilek felszínén kimutható a CCR2 (320), így elképzelheto, hogy ezeket a sejteket közvetlenül is a gyulladás helyére vonzhatja. Az MCP-1, több CC kemokin társával együtt (MCP-k, MIP-1? , RANTES) az asztma szempontjából azért is különösen jelentos, mert állatkísérletekben, dózisfüggo módon az AHR növekedését is eloidézik (355). Valószínusítheto, hogy ezt hízósejt aktivációs tulajdonságaik révén képesek kifejteni, amelyre IgE-tol függetlenül is képesek. Az így felszabaduló leukotrién C4 és hisztamin közvetlenül válthatják ki az AHR-t (354-356). Ez a hipotézis az egerekben mérheto emelkedett szérum hisztamin szintre is magyarázatot ad. Az alveoláris makrofágok IgE függo aktivációja (CD23-on) pedig tovább emelheti a TNF-? , IL-1? , IL-8, MCP-1, és MIP-1? szintjét, ami pozitív visszacsatolási kört indíthat be.
Az MDC és MIP-1? (az MCP-1-hez hasonlóan) leginkább a monocitákra fejtenek ki kemotaktikus hatásokat (350), bár – ahogy említettük – az eozinofilekre is hatnak, sot a T sejteket is a gyulladás helyére vonzhatják. Az MDC neutralizálása állatkísérletes modellben meggátolja az AHR-t, és csökkenti az eozinofil granulocita számot a tüdo interstíciumban, de érdekes módon, a lumenben nem (350). A CXCR4 receptoron ható SDF-1 (357), és a CCR7 ligandja a naív T sejtek irányításában vesznek részt (358).
Az eozinofil kemotaxis szabályozá sában az eotaxin központi szerepet tölt be. Az asztmások bronhiális mucosajában az epitél és endotél sejtek által termelt eotaxin koncentrációja magasabb szintet ér el, mint egészségesekben (359). Továbbá az allergén-indukált eotaxin felszabadulás az asztmások BAL-jában korrelált az össz és az aktivált eozinofil granulocita sejtszámmal, valamint a légúti obstrukcióval (360) a késoi
43
asztmatikus reakcióban. Az asztmásokban az eotaxin fo forrása, a tüdoben lévo gyulladásos és struktúrsejtek, mint pl.: a makrofágok, az eozinofil granulociták, a hízósejtek, a T sejtek, a simaizomsejtek és a fibroblasztok (361, 362). Az eotaxint in vitro a humán fibroblaszt sejtek IL-4 és/vagy TNF-? hatására szecernálják (340, 362); az epitél sejtek TNF-? -t, IL-1? -t, INF-?-t igényelnek termelésükhöz (347). Az eotaxin az eozinofil granulociták gyulladásos helyre vonzását azonban csak az IL-5-tel (363), és néhány (eozinofilre ható) kemokinnel együttesen képes kiváltani, önmagában képtelen. A humán eotaxin ezenkívül okozhat eozinofil degranulációt is, illetve az IL-2-vel, IL-4gyel stimulált T sejtek kemotaxisában is szerepet játszik (364). Az eotaxin eddig ismert egyedüli receptora a CCR3 (359), amely – a többi eozinofil kemoatraktáns receptorához hasonlóan – nemcsak eozinofileken, hanem más – foleg a Th2 immunválaszban résztvevo – sejteken is kimutatható (348). A CCR3 külön említésre méltó, hiszen a legtöbb kemokin többféle receptorral rendelkezik. A CCR3 szintje emelkedett az asztmások légútjaiban (165), és az allergiások eozinofiljein kb. kétszeres az expressziója a nem-allergiásokéhoz képest (365). Az AEDS kialakulásában is az egyik legjelentosebb szerepet a CCR3- nak és eotaxinnak tulajdonítják, amelyek mennyiségei a borléziókban jelentosen emelkednek a nem-atópiás kontroll egyénekhez képest (366). Valószínuleg mindkét molekulát a CD3+ T sejtek termelik, így pozitív feed back révén a Th2 limfociták kemotaxisára hat (366). Állatkísérletes asztma modellben, a kemokinek redundáns hatása miatt, az eotaxin génjének „kiütése" (367), vagy a fehérje neutralizálása eotaxin ellenes antitesttel (349) nem függeszti fel, csak részlegesen csökkenti a szöveti eozinofiliát és az AHR-t. Az eotaxint szisztémásan adva eozinofiliát okozott rágcsálókban (368), a tüdobe lokálisan bejutatva pedig, a légutak szelektív eozinofiliájához vezetett tengerimalacokban (369).
A RANTES az asztmás emberek BAL-jából kimutatható, – az eotaxinhoz hasonlóan –
szintén eozinofil kemoatraktáns anyag (370). Ezenkívül
nagy
mennyiségben jelen van az AEDS-ben szenvedo betegek borében is (371). A légutakban a simaizomsejtek és a szubmucosalis aktivált T sejtek (372), a borben a dermális fibroblasztok (371) termelik a legnagyobb mennyiségben. Az eozinofilek toborzásán (373) kívül az asztmás egyénekben fontos szerepe lehet a T sejtek légúti infiltrációjában (179, 372); valamint az AEDS-ben szenvedokben, a CD45R0+ memória T sejtek borbe gyujtésében (374) is. A RANTES háromféle receptort is használhat: a
44
CCR-1-et, CCR-3-at és CCR5-öt. Lehetséges, hogy közvetlen módon részt vesz a Th2es válasz Th1/Th2 kevert immunválasszá történo átalakításában: eloször a Th2 sejteket vonzza a CCR3-on, majd a Th1 sejteket a CCR5-ön (371). A RANTES neutralizálása Met-RANTES-szel állatkísérletes asztma modellben nemcsak az eozinofil, hanem limfoid beszurodést is jelentosen csökkenti a tüdoben, és a (RANTES termelésén kívül) az eotaxin szintjét is down-regulálja (349). Ugyanakkor, a MIP-1? (ami szintén a RANTES CCR5 receptorát használja) neutralizálása alig okoz tünet csökkenést (349). Ez azzal magyarázható, hogy a RANTES nemcsak a CCR5-ön, hanem a CCR3-on is képes hatni az eozinofilekre és Th2 sejtekre.
2.6 A hisztamin immunmoduláló hatásai A hisztamin (lsd. 5. ábra) olyan biogén amin, amely számos aktivitással rendelkezik különféle fiziológiás és patofiziológiás körülmények között: szerepet játszik az 5. ábra A hisztamin
ingerület vezetésében, az agyi folyamatok szabályozásában, a hipofízis hormonok szekréciójában, a gasztrointesztinális
rendszer irányításában, keringéssel kapcsolatos funkciókban, a növekedés és differenciáció szabályozásában, a gyulladásos és az azonnali típusú túlérzékenységi reakciókban (375, 376). Az utóbbival függ össze az allergiás/asztmás válaszban betöltött viszonylag ismert effektor szerepe: az allergiás tünetek végso soron, közvetlenül az immunsejtekbol felszabaduló mediátor anyagok okozzák, melyek egyik fo összetevoje. Részt vesz a légúti simaizomzat kontrahálásában, a mikrovaszkuláris permeabilitás növekedésében, a vazodilatációban és a nyák szekrécióban (33, 34). Az asztma patomechanizmusában betöltött szerepeire utal, hogy az asztmásoknak magasabb a szérum hisztamin szintje, mint a nem asztmás, kontroll egyéneknek (35). Több tanulmány jelent meg arról is, hogy az antihisztaminok képesek megakadályozni az allergiás tünetek kialakulását; különösen az AEDS-es gyermekek, valamint a rhinitisben szenvedok körében (377). Azonban ezekkel ellentétben, a súlyos perzisztáló asztmások állapotát a H1 hisztamin receptor antagonisták nem javítják említésre méltóan (378, 379). Az asztmások hatékony gyógyítása antihisztaminokkal, még napjainkban sem megoldott. A hisztamin az említett folyamatokon kívül, az immunválasz modulálása révén is befolyásolhatja az allergia/asztma kialakulását: szabályozhatja
az
antigén
specifikus
immunválasz 45
kialakulását
(130,
380);
befolyásolhatja számos mediátor expresszióját, hatását; serkentheti a csontveloi ossejtek IL-3 indukált proliferációját (218).
A hisztamin legfobb forrásai a hízósejtek és a bazofil granulociták, amelyek felszínén az allergén keresztköti az Fc?RI- gyel fogva tartott IgE molekulákat, ezáltal váltva ki a vezikulumokban tárolt hisztamin szekrécióját. Valamennyi hisztamin szintézisére azonban sokféle sejtféleség képes (dendritikus sejt, T sejt, vérlemezke, stb.) (381), bár ezek ez elobbiekkel ellentétben nem tudják tárolni azt. A hisztamin általános elofordulása a szervezetben felveti annak lehetoségét, hogy – ismert funkcióin kívül – alapveto sejtbiológiai folyamatokban is részt vehet (382).
A hisztamin metabolizmusában háromféle enzim vesz részt. Az L-hisztidin dekarboxiláz (HDC) az egyedüli enzim mely képes szintézisére (383), hatástalanításáért két enzim felelos: a hisztamin N- metil transzferáz és a diamino oxidáz (384). A hisztamin négyféle receptoron fejtheti ki hatását, amelyek mindegyike a G fehérjékhez kapcsolt, 7 transzmembrán szakasszal rendelkezo receptorok családjába tartozik (383, 385). A H1R és a H2R sokféle sejttípuson megtalálható: idegsejten, légutak és erek simaizomsejtjein, hepatocitákon, kondrocitákon, endotélsejteken, neutrofil és eozinofil granulocitákon, monocitákon, dendritikus sejteken, T és B limfocitákon (376). A H1Rról érkezo szignál a G fehérjék Gq/11 tagján keresztül foszfolipáz C-t aktivál, így a jel inozitol- trifoszfát, diacil- glicerol és Ca2+ révén továbbítódik (386). Az allergiás tünetek kialakulásáért foleg ezt a receptort teszik felelossé: simaizom kontrakciót vált ki és fokozza a vaszkuláris permeabilitást (382). A H2R képes a H1R által közvetített szignáltranszdukciós út beindítására is, de inkább az adenilát-cikláz általi cAMP másodlagos hírvivot veszi igénybe. A hisztamin ezen a receptoron fejti ki a gasztrin termelés szabályozásával kapcsolatos funkcióit. A hisztamin a H1R-on általában serkentoen, míg a H2R-on hatva csillapítóan hat (130, 387). A H3R és H4R viszonylag frissen felfedezettek. A H3R a hisztaminerg neuronokon az agyban, és néhány perifériás szövetben expresszálódik. Fo funkciója a neurotranszmisszióban a preszinaptikus modulátor jelek közvetítése (376, 388). A H4R, mely a H3R-hoz nagymértékben hasonlít, a hemopoetikus sejteken található meg foleg (389, 390); hatását a cAMP felhalmozódásának gátlásával és intracelluláris Ca2+ szint növelésével fejti ki.
46
A hisztamin a citokin/kemokin rendszerrel szoros funkcionális interakcióban van: nemcsak a hisztamin hat rájuk, hanem azok vissza is hatnak a hisztamin expressziójára, szekréciójára. Ezek alapján valószínusítheto, hogy a hisztamin nem csupán az immunfolyamatok effektor fázisában, hanem az egész immunválasz kialakulásában egyaránt fontos. Mind az éretlen, mind az érett dendritikus sejteken valamennyi fajta hisztamin receptor megtalálható (39, 385, 380), de az érés során elvesztik szerepüket. Az éretlen dendritikus sejteken a hisztamin – H1R-on és H3R-on hatva – emeli az intracelluláris Ca2+ szintet, aktin polimerizációt idéz elo és kemotaktikus hatásokat is kifejt; valamint emeli a CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) és MHC II sejtfelszíni expresszióját (39), melyek esszenciálisak az APC—T sejt interakcióban. A hisztamin ezenfelül képes a dendritikus sejtek által szecernált citokinmintázat megváltoztatására is: csökkenti az IL-12, az IL-1? és IL-1? , az IL-6, az IL-18, az IP-10, a MIP-3? és a RANTES szintjét; serkenti az IL-10 és az IL-8 termelését. Így a hisztamin a H2R-on hatva, különösen az IL-10
és
IL-12
révén
közvetve,
képes
az
immunpolarizációs
viszonyok
megváltoztatására: hatására az érett dendritikus sejtek a T sejteket Th2 irányba polarizálják az antigénprezentáció során a nyirokcsomókban (39), ami az allergiás betegségeknek kedvez. Monocitákon és fehérvérsejt tenyészeten a hisztamin a dendritikus sejteken megfigyeltekhez igen hasonlóan hat: H2R-on szintén gátolja az IL12 (és TNF-? ) termelést, viszont fokozza az IL-10 szekréciót (391, 392). Mivel azonban ezek a sejtek a nyirokcsomókban nem találhatók meg, valószínu általuk kevésbé vesz részt az immunpolarizáció kialakításában. Fontos megemlíteni, hogy a hisztamin önmagában nem képes kiváltani a fent említett hatásokat, csupán az érést eloidézo stimulusokkal (pl. LPS) együtt. A citokinekkel gerjesztett dendritikus sejtek önmaguk is képesek differenciációjuk során endogén hisztamin szintézisére, amely autokrin és parakrin módon hat (38). Ennek gátlása, valószínuleg az eddig részletezett mecha nizmusok által, befolyásolja az éro dendritikus sejtek citokin termelését (380).
A hisztamin nemcsak közvetetten – az APC-k révén –, hanem közvetlenül is képes a T sejtekre hatni, befolyásolva polarizációs viszonyukat, de a hatás, nem Th2, hanem inkább Th1 irányú immunpolarizációs eltolódáshoz vezet. A Th1 sejtek elsosorban ugyanis a H1R-t expresszálják (de valamennyi H2R-t is), mely által a hisztamin serkentoen hat rájuk. A Th2 sejteken ezzel szemben foleg H2R-ok vannak, melyek révén a hisztamin gátolja muködésüket (130). Ezt bizonyítják a H1R hiányos
47
egerek vizsgálatai, amelyekben a Th1 sejtek kevésbé aktívak, így alacsonyabb az INF-? szintjük, míg IL-4 és IL-13 szintjük emelkedett. Továbbá IgG1 és IgE izotípusú antigén-specifikus ellenanyagot termelnek inkább, amelyek egyaránt Th2 fenotípusos jellegek. A H2R hiányos egerekben viszont, bár mind a Th1, mind a Th2 citokinek upregulálódnak (130), csökken az IgG3 és IgE ellenanyag szint vad társaikhoz képest, ezért inkább Th1 irányban polarizáltnak tekinthetok. A T sejtek IL-2 és INF-? termelését a hisztamin serkenteni és gátolni is képes a kísérleti körülmények függvényében (393-395). A legfontosabb Th2 citokinnek tekintett IL-4 szintjét a hisztamin a kísérletek többségében csökkenti, vagy nem befolyásolja (396, 397). Az IL5 szekrécióra a hisztamin pozitívan hat (397).
A hisztamin képes a gyulladásos citokinek termelését is kiváltani azáltal, hogy emeli a különbözo sejtek és szövetek proinflammatorikus citokin (IL-1? és IL-1? , IL-6, IL-11), CC kemokin (MCP-k, RANTES) (és a CXC IL-8) termelését (364, 387, 398401). A hisztamin ezen funkciói párhuzamba állíthatók az IgE-hatással: asztmás emberekben a pro- és antiinflammatorikus egyensúlyt az IgE függo mechanizmusok szintén proinflammatorikus irányba tolják el (402). A gyulladásos mediátorok szintjének emelése által a hisztamin a gyulladásos sejtek számát is növeli, illetve aktiválhatja is oket. Közvetlenül, vagy közvetve stimulálja az alveoláris makrofágok neutrofil granulocita és monocita kemoatraktáns aktivitását (40). Perifériás vér mononukleáris sejtjeinek H2R-án keresztül fokozza az IL-1? indukált IL-1? szintézist (398), így megteremtheti a lehetoségét, hogy a hízósejtek elosegítsék önmaguk érését az IL-1 segítségével. Az IL-1 autokrin módon IL-6 expressziót is képes kiváltani ezeken a sejteken (403), amely a plazmasejt differenciációban nélkülözhetetlen (225), ugyanakkor a hisztamin közvetlenül is képes stimulálni az IL-6 termelést (399, 405). Sot, ezzel párhuzamosan a vér mononukleáris sejtjeinek GM-CSF termelését is növelheti (405), amely több gyulladásban fontos sejt proliferációjára és aktiválására is hatásal lehet.
A citokineknek és kemokineknek a hisztamin termelésének szabályozásában betöltött funkcióiról még egyáltalán nincs letisztult képünk. Valószínusítheto, hogy az IL-1, IL-3, IL-18 és a GM-CSF citokinek; és a CC kemokinek (MCP-k, RANTES, MIP1? , eotaxin) (382, 401) a legfontosabb résztvevoi. Az IL-3-ról ismeretes például, hogy
48
atópiás egyénekben erosebben fokozza a hisztamin termelést, mint egészségesekben (406). Továbbá a hisztamin szint emelésén kívül szimultán emeli a Th1 sejtek H1R expresszióját is, amelyen keresztül a hisztamin aktiválhatja oket (407). Feltételezheto, hogy ezek a mechanizmusok foleg a gyulladásos sejtek mikrokörnyezetében emelik számottevoen a hisztamin szintet, és így vezetnek pozitív visszacsatolással egyre erosödo lokális gyulladáshoz (382, 401). A szövetekre, vagy az egész szervezetre kiterjedo, szisztémás hisztamin szint emelésében ezeknek a molekuláknak valószínuleg sokkal kisebb a szerepük, mint az antigén specifikus IgE- nek, amelyek aktiválják a hisztamin legfobb forrásának számító bazofil granulocitákat (408).
Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a hisztamin az immunválasz során több ponton, komolyan beavatkozik a végso Th1-Th2 egyensúly kialakulásába és az asztma szempontjából
jelentos
gyulladásos
folyamatokba.
A
végso
eredmény,
az
immunrendszer komplexitása miatt, azonban az eddig ismertetett tanulmányok alapján nem becsülheto fel, mivel az in vitro kísérletek eredményei nagyban függenek a kísérleti feltételektol, az alkalmazott sejtek típusától, ill. leegyszerusítik az élo rendszert. Ezért elengedhetetlen feladat a szervezet egészét figyelembe vevo in vivo vizsgálat. A hisztamin pontosabb, in vivo szerepeinek megismeréséhez nyújt segítséget hisztidin dekarboxiláz "génkiütött" (HDC KO) egértörzs (42), melynek hisztamin tartalma a WT egerek 0,2%-a. Ebben az egértörzsben, a – hisztamin egyedüli szintézisére képes – HDC enzimnek a génjét úgy módosították egy plazmid vektorral való homológ rekombináció segítségével, hogy az arról átíródó fehérje ne tudja kötni a HDC aktivitás szempontjából esszenciális koenzimet, a piridoxál- foszfátot (6. ábra). Ráadásul, mint késobb kiderült, az így módosított, „megbénított” enzim kifejezodése valamilyen módon már a transzkripció szintjén gátolva van. A HDC gén kiütéséhez egy körülbelül 2,4 kb hosszú génszakaszt cseréltek ki, amely magában foglalta a 6-8-as exonokat, valamint részben a kilencest. Az így kapott génben ezek helyett az exonok helyett egy neomicin rezisztencia gén helyezkedett el.
Ezeknek az állatoknak a vizsgálata megteremtette a lehetoségét az endogén hisztamin normál és kóros folyamatokban betöltött funkcióinak tanulmányozásához. Bár a HDC KO egerek látszólag egészségesek, és normálisan fejlodnek, alapos vizsgálatukkal több érdekes fenotípusukra is fény derült: ? Csökken H2R- uk expressziója (409). 49
? Jelentosen csökken hízósejtjeik száma (a borben és peritoneumban), illetve azok granulum tartalma és citokin termelése (410); továbbá abnormális a degranulációjuk is (411). Az IL-3-mal és SCF- fel kezelt csontveloi sejtjeik hízósejtekké történo differenciációjának korai lépései is már rendellenesek. ? Emelkedett leptin és viszcerális zsírsav szintjük van, azonban glükóz toleranciájuk csökkent (412). ? Gyomorsav tartalmuk csökkent, viszont gasztrin szintjük emelkedett (413). ? Csontdenzitásuk emelkedett, és ez együtt jár az osteoklasztok csökkent számával (414). ? Androgén szintjük emelkedett (415). ? Az állatok immunrendszere összességében Th1 irányú polarizációt mutat (411, 416, 417) (Búzás E. és mtsai. pub likálás alatti eredményei), ami együtt jár spontán abortuszok emelkedésével (418) is.
PhD munkám második felében én is ezeknek a génkiütött egereknek a fenotípus vizsgálatában vettem részt, egy eddig még nem vizsgált oldalról: azt kutattuk egy asztmát modellezo rendszerben, hogy módosul-e az asztma manifesztációja a hisztamin hiányában, és ha igen, akkor milyen molekuláris mechanizmusok állhatnak a háttérben.
6. ábra : A HDC-t kódoló gén a WT és a KO egerekben
50
3 Kísérleti módszerek 3.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatainak módszerei 3.1.1 A vizsgálatba bevont személyek A vizsgálatokat Budapesten élo nem allergiás; allergiás, de a vizsgált allergiás betegség tüneteit nem mutató; valamint az adott allergiás betegségben szenvedo 18 éven aluli egyéneken végeztük. Minden egyes vizsgálathoz rendelkeztünk szüloi engedéllyel, és egy intézményes vizsgálóbizottság is jóváhagyta azokat.
Az allergiás betegségben nem szenvedo, kontroll csoportba tartozó gyermekeket a Heim Pál Gyermekkórház azon pácienseibol választottuk ki, akiknek nem volt semmilyen allergiás tünetük, vagy múltjuk; illetve IgE szintjük a korosztályuknak megfelelo átlagos populációs szint alatti volt.
A nem-asztmás allergiás egyének a Heim Pál Gyermekkórház allergiás rendelésére jártak, mindegyiküknek dia gnosztizált allergiája volt, viszont asztmája nem; és ezenfelül atópiásak is voltak. Azokat az egyéneket tekintették atópiásnak, akik legalább egy allergénre pozitív borpróbával válaszoltak és pozitív volt az össz, illetve allergén specifikus IgE szintjük.
Az
asztmás
betegek
Budai
Gyermekkórházból
és
az
I-es
számú
Gyermekklinikáról származtak. Klinikailag igazolt asztmájuk volt és kielégítették a következo elvárásokat: 1. kezelésre szoruló expiratorikus dyspnea-juk volt, és gyakran fulladtak 2. orvos által igazo ltan zilálva lélegeztek 3. a zilálás és dyspnea bronho dilatátorokkal visszafordítható volt Az utóbb említett tüneteket spirométerrel mérték és a FEV1 -gyel (eroltetett kilégzési térfogat a kilégzés elso másodpercében) jellemezték (419, 420). Az asztmás gyermekeket (vagy szüleiket) megtanították arra, hogy pontosan jegyezzék föl két héten keresztül tüneteiket, és kezelésüket; valamint egy nap kétszer (este és reggel) mérjék meg PEF (kilégzési csúcsáramlás) értékeiket. (Az 5-évesnél fiatalabb gyermekeknél – akik nél általában nem volt lehetséges se a PEF, se a FEV1 mérése – a betegség
51
diagnózisát (és klasszifikálását) az egyéb tünetek alapján végezték el.) Bizonyos vizsgálatoknál szükség volt az asztma súlyosság szerinti klasszifikálására is, amelyhez a GINA (Global Initiative for Asthma) ajánlását (419) vettük segítségül, gyermekekre módosítva. Az asztmás egyéneket 5-féle kategóriába soroltuk (3. táblázat): intermittáló, szezonális enyhe perzisztáló, enyhe perzisztáló, mérsékelt perzisztáló és súlyos perzisztáló asztmás tüneteket mutatókra. A szezonális enyhe perzisztáló kategóriát mi alkottuk: azokat az egyéneket soroltuk ide, akik az allergiás idoszak alatt enyhe perzisztáló asztmás, egyébként viszont csak intermittáló tüneteket mutattak.
Súlyossági fok Intermittáló (1) Szezonális enyhe perzisztáló (1.5) Enyhe perzisztáló (2) Mérsékelt perzisztáló (3) Súlyos perzisztáló (4)
Tünetek
Éjjeli asztma
hetente 1-2-nél ritkább intermittáló és enyhe perzisztáló között hetente 1-2-szer, max. 1szer 1 nap hetente legalább 1-2-szer folyamatos
havonta 2-nél ritkább intermittáló és enyhe perzisztáló között havonta 1-2-szer
PEF vagy FEV1 (variancia) >80 % (<20 %) intermittáló és enyhe perzisztáló között 60-80 % (20-30 %)
hetente legalább 1-2-szer gyakori
60-80 % (>30 %) maximum 60 % (>30%)
3. táblázat Az asztma súlyosság szerinti klasszifikálása a GINA ajánlása alapján, gyermekekre módosítva
Az AEDS-es, valamint a nem- AEDS-es allergiás gyermekek a Heim Pál Gyermekkórházon kívül, a S.E. I. Gyermekklinikáról származtak. Az utóbbi csoportba a nem-asztmás
allergiásokhoz
hasonló
megfo ntolások
alapján
válogattuk
szét
értelemszeruen a pácienseket. Azokat az – orvos által diagnosztizált – gyermekeket soroltuk az AEDS-esek közé, akiken megfigyelheto volt az un. "száraz bor", és legalább három különbözo borterületükön, AEDS legalább 3 különbözo tünetét lehetett megfigyelni.
3.1.2 Laboratóriumi paraméterek meghatározása A fehérvérsejt és az eozinofil granulocita koncentrációit a vérben Coulter MAXM Analyser muszerrel mértük. A szérum össz és specifikus IgE szintjét – több mint 100 allergénre – Pharmacia CAP System muszerrel határoztuk meg. Az össz IgE szintet akkor vettük kórosan magasnak, ha meghaladta a 100 kU/L-t. Az allergén specifikus IgE-t 35 kU/L-t meghaladva vettük pozitívnak.
52
3.1.3 DNS izolálás A genomiális DNS-t a fehérvérsejtekbol izoláltuk Miller és mtsai. (421) módszere szerint: 1,5 ml-es eppendorf csobe 500 ? l, -70 o C-on tárolt, EDTA-val alvadásgátolt
1.
vért pipettáztunk, majd 1 ml 1-szeres vvt. lízis puffert adtunk hozzá és fél percig óvatosan kevertük. 2.
A csövek tartalmát centrifugáltuk (13000 g, 1 perc, RT).
3.
A felülúszót leöntöttük, a csapadékhoz 1 ml deszt. vizet adtunk, majd enyhe keverés után centrifugáltuk (lsd. 2.). A felülúszót leöntöttük, a csapadékot 55 o C-on, 30 percig inkubáltuk rázás
4.
közben 80 ? l 5-szörös proteináz-K puffer, 30 ? l proteináz-K (10 mg/ml), 40 ? l 10%-os SDS és 220 ? l deszt. víz keverékében. 5.
A szuszpenziót szobahomérsékleten néhány percig hulni hagytuk, majd 200 ? l 6 M-os NaCl oldatot adtunk hozzá, és 15 másodpercig erosen rázattuk, hogy a fehérjék kicsapódjanak és koagulálódjanak.
6.
A csövek tartalmát centrifugáltuk (13000 g, 6 perc, RT), majd a felülúszót üres steril csobe pipettáztuk.
7.
A felülúszókkal 6. lépést megismételtük, de csak 3 percig centrifugáltuk a mintákat. 500 ? l izopropanolt adtunk mintáinkhoz, hogy a DNS kicsapódjon. Majd
8.
óvatos keverés után a csövek tartalmát centrifugáltuk (13000 g, 2 perc, RT). 9.
A csapadékot 70%-os etanollal mostuk, majd a szuszpenziót centrifugáltuk (13000 g, 2 perc, RT).
10.
A csapadékról eltávolítottuk az alkoholt, 50 ? l deszt. vízben oldottuk, és -70 o
C-on tároltuk.
3.1.4 Mutációk azonosítása A mutációkat PCR-RFLP-vel azonosítottuk. (Kivétel a CCR5-? 32 mutáció vizsgálata, mivel itt a 32 bp deléció emésztés nélkül is kimutatható elektroforézissel.) A PCR-eket 50 ? l-nyi reakcióelegyben végeztük (a polimeráz térfogata nincs bekalkulálva) a 4. táblázatban feltüntetett vegyszermennyiségek szerint. A kiinduló reakcióelegy összetétele minden esetben hasonló volt, különbséget legfeljebb csak a
53
DNS és/vagy primer minosége okozhatott. A reakcióelegy felszínére 1 csepp paraffin olajat rétegeztünk.
H2 O
dNTP
primer
Dynazime puffer
DNS (minta)
Dynazime polimeráz
37
5
1
5
2
0,5
4. táblázat A különféle mutációk azonosítására használt PCR reakciók összeméréséhez szükséges vegyszerek ? l-ben kifejezett mennyiségei
A PCR reakció körülményei is minden esetben hasonlítottak. Eltérések mindössze az anellációs homérsékletben, illetve a polimerizáció idejében voltak. Ezeket, valamint a PCR-hez felhasznált primerek szekvenciáit az 5. táblázat tartalmazza.
genomiális DNS denaturálás:
94 o C, 4 perc
denaturáció
95 o C, 30 másodperc
anelláció
lsd. 5. táblázat, 1 perc
35-ször
o
polimerizáció
72 C, lsd. 5. táblázat
szálelvarrás
72 o C, 5 perc
Vizsgált polimorfizmus MCP-1 (-2518 G)
Tanelláció
tpol.
Sense primer
Antisense primer
58
30
RANTES (-403 A)
60
30
RANTES (-28 G)
58
20
CCR5-? 32
65
30
417S: 5’-TCT CTC ACG CCA GC ACT GAC C-3’ RANTES-581S: 5’-CAC AAG AGG ACT CAT TCC AAC TCA-3’ -50S: 5’-ACT CCC CTT AGG GGA TGC CCG T-3’ S: 5’-CTT CAT TAC ACC TGC AGC TCT CA-3’
650AS: 5’-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3’ RANTES -376AS: 5’-GTT CCT GCT TAT TCA TTA CAG ATC GTA-3’ 124AS: 5’-GCG CAG AGG GCA GTA GCA AT-3’ AS 5’-CAC AGC CCT GTG CCT CTT CTT CTC A-3’
5. Táblázat: A PCR reakciók anellációs homérsékletei, polimerizációs idoi, és primer szekvenciái Tanelláció : anellációs homérséklet, tpol: polimerizációs ido, aláhúzott bázis: a mismatch helye
Azokban az esetekben, amikor nem állt rendelkezésünkre megfelelo restrikciós endonukláz, a PCR-t olyan mismatch primerrel (a 2., vagy 3. bázisnál nem komplementer) végeztük (lsd. aláhúzva az 5. táblázatban), amely segítségével sikerült enzim hasítóhelyet bevinni. 20 ? l reakcióelegyben a PCR termékeket 8 U aktivitású restrikciós endonuklázzal, az enzimhez javasolt pufferben 37 o C-on, legalább 3 órán át
54
emésztettük. Ezután a 20 ? l emésztett mintához 4 ? l mintapuffert adtunk, majd ebbol 11 ? l-t 3%-os agaróz gélben megfuttatuk. A futtatást 120 V-os feszültséglimittel végeztük 40 cm3 -es gélben. Az emésztéshez használt restrikciós endonukleázokat és puffereket, továbbá azt, hogy az enzim a vad (a populációban gyakoribb), vagy a mutáns (ritkább) allélt hasítja, valamint az emésztett DNS fragmentek hosszúságait a 6. táblázat tartalmazza.
Vizsgált mutáció MCP-1 (-2518) RANTES (-403) RANTES (-28) CCR5-? 32
Restrikciós endonukleáz Pvu II Rsa I Hinc II –
NEB puffer jelölése 2 4 3+BSA –
Melyik allélt hasítja az enzim? Mutáns vad vad –
A hasított fragment hossz (bp) 159 + 75 180 + 26 152 + 23 180*
6. táblázat A restrikciós emésztés specifikálása * A CCR5-? 32 polimorfizmus kimutatásához nem végeztünk emésztést, a táblázatban a vad allél hosszúságát tüntettük fel. (a mutáns allél 32 bp-ral rövidebb)
3.1.5 Statisztikai módszerek Allélszámolással meghatároztuk az alléfrekvenciát, majd a Hardy-Weinberg féle elméleti alléleloszlást. Annak meghatározásához, hogy az allélfrekvencia kielégítoen követik-e az elméleti alléleloszlást ? 2 tesztet alkalmaztunk.
(kapott érték–várt érték)2 ? =?
kapott érték: az adott összes allélszám
2
várt érték
várt érték:
a Hardy-Weinberg egyenletbol kapott várt allélszázalék szorozva a kapott értékkel
Ha a ? 2 -bol meghatározott p (2 gén esetén N=1) 0,05-nél nem volt nagyobb, az elméleti és a kapott allélfrekvenciák között nem volt szignifikáns eltérés.
Annak eldöntéséhez, hogy egy adott allél részt vesz-e a betegség kialakításában Fischer tesztet (Fischer`s exact test) vagy egyszeru ? 2 próbát alkalmaztunk. Az adatok vizsgálatához MedCalc és Arlequin programokat használtunk. Vizsgálatainkat 55
retrospektívan végeztük: egészséges és beteg csoportokat hasonlítottunk össze, azt vizsgálva, hogy hányszor nagyobb a betegség kockázata, ha az adott alélt hordozza az illeto. Ennek kvantifikálása az OR (esélyhányados) értékkel történt, amelyet a 95 %-os konfidencia intervallumnál (CI) számított OR tartomány középértékeként adtunk meg.
Egy adott kvantitatív jelleg és polimorfizmus között akkor tételeztünk fel összefüggést, ha a különféle genotípusokhoz tartozó jellegek átlagértékei egymástól szignifikánsan különböztek (p<0,05). A p értékeket kétmintás t- próbával határoztuk meg, ha csak kétféle genotípushoz tartozó jellegeket vizsgáltunk; ANNOVA teszttel, ha többfélét.
Felhasznált fontosabb vegyszerek, eszközök Agaróz gél (3% -os) 1,2 g agaróz 40 ml, 1-szeres TBE Centrifuga: Heraeus, Biofuge 15 R DNS: lsd. elozo fejezet dNTP: 0,2 mM -os DyNAzime II polimeráz a PCR-hez: 2 U/? l Dynazime puffer a PCR-hez Futtató kád: Pharmacia Gel Electrophoresis Apparatus GNA -100 Futtató puffer 1-szeres TBE etidium-bromid (empírikus mennyiség) Mintapuffer az elektroforézishez 15% -os fikoll oldatban brómfenolkék és xiléncianol (empírikus mennyiségek)
PCR készülék: BIOMETRA Trio-Thermoblock Primer: 15 pM/? l mind a sense, mind az antisense primerbol. Proteináz K-puffer (5-szörös) 750 ? l, 5 M -os NaCl 2,4 ml, 0,5 M EDTA, pH=8,0 Restrikciós endonukleázok New England Biolabs Pvu II, Rsa I, Hinc II TBE (10-szeres) (1 liter) 108 g Tris 55 g bórsav 40 ml, 0,5 M EDTA Vvt. lízis puffer (5-szörös) (1 liter) 548 g szacharóz 50 ml Triton X-100 25 ml 1 M-os MgCl2 x6H2 O 60 ml 1 M-os Tris -HCl, pH=7,5
Minden reagens, amelynél külön nincs feltüntetve a gyártó, a Sigma cég terméke.
56
3.2 Az asztma állatkísérletes modellezésénél alkalmazott módszerek 3.2.1 A kísérleti állatok A kísérleteket 6-10 hetes nostény, beltenyésztett (BALB/c) hisztidin dekarboxiláz „génkiütött" és vad genotípusú egereken végeztük, amelyek genotípusa – a HDC gén kivételével – azonosnak tekintheto. Az állatokat már (1 héttel) a kísérletek megkezdése elott hisztaminmentes tápon tartottuk, hogy a hisztamin teljes (endogén és exogén) hiányában fellépo késoi allergiás reakciót vizsgálhassuk.
3.2.2 Kísérleti protokoll Az allergizálásra szánt állatokat a kísérlet megkezdésekor (0. nap), és a 14. napon szisztémásan, i.p. szenzitizáltuk 100 ? l OVA és aluminium hidroxid adjuváns szuszpenzió keverékével, majd a 28., 29., 30. napon 20 percig 1%-os OVA aeroszolt inhaláltattunk be velük. A 31. nap megmértük az AHR-t. A 32. napon, 5 órával egy 20 perces, 5%-os OVA aeroszol provokáció után, az egereket elaltattuk (Nembutal, dózis: 55 mg/testtömeg kg), és szerveiket különféle vizsgálatokra tettük el, hogy az asztmás reakció késoi fázisát tanulmányozhassuk (7. ábra). A placeboval kezelt/kontroll csoportok (állatkísérleteink ismertetésénél szinonimaként használom a két fogalmat) a szisztémás, és lokális szenzitizálások során csupán az allergén, ill. az adjuváns oldására is szolgáló puffert (PBS/fiz. só) kapták, de minden tekintetben "allergizált" társaikhoz hasonlóan voltak kezelve és tartva. 29 0
14
28
i.p. OVA+
i.p. OVA+
Al(OH)3
Al(OH)3
30 32
OVA inhaláció 1% 5%
7. ábra A kísérleti protokoll
57
Az altatás után eloször az IgE koncentrációjának meghatározásához szívbol, zárt mellkason keresztül, EDTA-s csobe (10 ? l, 7,5% EDTA) vért vettünk. Majd BAL nyerése céljából tracheostomia után a tüdot kanül segítségével 0,6 ml fiziológiás sóoldattal 3-szor átöblítettük. Más kísérletek alkalmával nem mostuk át a tüdoket, hanem – a mellkas felnyitása után – eltávolítottuk azokat. Egy részüket gén és fehérje expressziós mérésekre azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, más részüket 10%-os formalinban szö vettani vizsgálatokhoz tettük el.
3.2.3 Az AHR mérése Egy élo állat légúti érzékenysége a tracheában lévo simaizomzat kontraktilitásától, a mellkas compliance-tol, a bronhus-ok nyák okozta elzáródásától, a légúti fibrózistól, és egyéb más tényezoktol függ (422). Az AHR (airway hyperresponsiveness, légúti túlérzékenység) mind a légúti hiperreaktivitás (airway hyperactivity, egy adott bronho konstriktorra adott emelkedett válaszkészség), mind pedig a légúti hiperszenzitivitás (hypersensitivity, kisdózisú bronho konstriktorra adott válaszképesség) függvénye (423). Kísérleti állaton való légzésfunkció mérésére alapvetoen 3- féle elven alapuló módszer létezik: a tracheális simaizomzat kontraktilitásának ex vivo vizsgálata (424); az intrapleurális nyomás (és compliance), valamint a tüdo ellenállás in vivo vizsgálata altatott, kanülált állatokon pletizmográffal (99, 425); valamint nem altatott állatok egész testpletizmográfiás vizsgálata (426). Mindegyik módszernek vannak elonyei, de korlátjaik is. Az ex vivo módszerek, bár jól korrelálnak az allergiás légúti érzékenységgel (424), nem veszik figyelembe a nyákot, az ödémát, és az alsóbb légutak, vagy a mellkas falában bekövetkezo elváltozásokat (86, 426). Az eloször említett in vivo módszerek széles körben elfogadottak, de invazívak és viszonylag nehezen kivitelezhetok. Az éber állatokon végzett egész testpletizmográfiás mérések viszonylag egyszeruen megoldhatók, de nincs egzakt matematikai összefüggés a mért paraméter és a légzésfunkció között. Mindezen módszerek közül mi a legutóbbit választottuk kísérleti állataink AHR mérésére: Mive l egyrészt a hisztamin egész szervezetre irányuló hatásaira voltunk kíváncsiak, így az ex vivo módszer szóba sem jöhetett; másrészt – bár kétség kívül nincs teljes mélységben matematikailag megalapozva – viszonylagos egyszerusége mellett mégis meglehetosen hasonló eredményeket szolgáltat a "hagyományos" in vivo technikákhoz (86, 426). A méréseinkhez használt kísérleti berendezés muködési elve a 8. ábrán látható. 58
8. ábra A pletizmográf muködési elve A kísérleti állatot egy olyan kamrába zárjuk, amelyen folyamatosan stacionárius levegomennyiséget szívatunk keresztül. Ez hosszútávon, az állat jelenlétében is, állandó homérsékletet és páratartalmat biztosít. A levego a szabadból áramlik be a kamrába egy fém, kis-pórusméretu szuron (D) keresztül. Ez a szuro úgy van méretezve, hogy az állandó levegoáramot jól átengedi, viszont a kamrában lévo egér által kiváltott hirtelen nyomásváltozásoknak ellenáll. A kamrához erosítettek egy másik kamrát (B), melynek egyedüli, szuk kivezetése a szabadba nyílik, így a benne levo nyomás a kinti légtéri átlagnyomásnak felel meg. Mindkét kamrával kapcsolatban áll egy nyomásméro (C) egy-egy szondája, melybol a nyomásméro a két karában levo nyomáskülönbséggel arányos jelet szolgáltat. Ezt egy analóg/digitál konverter teszi számítógép számára feldolgozható adattá. A mérheto jel tehát a kamrában az egér légzése által kiváltott nyomásingadozásból kivont állandó külso nyomás, amit a stacionárius légáramlás nem 59
zavar. A készüléket, használat elott, a kamrába befecskendezett adott mennyiségu levegovel
kalibrálni
kell,
így
a
mérés
során
a
számítógép
az
érzékelt
nyomásváltozásokból rögtön képes meghatározni az egér légzése által keltett térfogatáramokat. Ez két összetevobol áll: az egyiket a ki- és belélegzett levegomennyiség
által
kiváltott
nyomásváltozás
okozza,
a
másik
az
egér
mellkasmozgásából adódik. Ha az egér élettelen tárgy lenne (pl. léggömb) a két említett nyomásváltozás kioltaná egymást. Azonban állatoknál a kilélegzett levego melegebb és párával telített, így a kilégzésbol adódó nyomásváltozás nagyobb amplitúdójú, mint a mellkas mozgásból származó. Ráadásul a kétféle nyomásváltozás idofüggvényei fázisban is eltolódnak egymáshoz képest, mivel a mellkas elobb mozdul, mint ahogy a levego áramlása megindul a légzoapparátusból. A légzési görbe ideális alakja a 9. ábrán látható. Az ordináta 0 értéke feletti rész a kilégzési, az alatta levo a belégzési térfogatáramokat mutatja. Ahhoz, hogy a mért idofüggvénybol "az asztmásságra" jellemzo kvantitatív értékeket nyerhessünk, egy – a görbe paramétereibol számolt – dimenziónélküli mennyiséget használnak, a Penh-et, amelynek értékét a 9. ábra jelölései alapján a következo képletekkel határozza meg a muszerhez kapcsolt számítógép:
Pause ? Penh ?
Te ? Tr Tr PEP xPAUSE PIP
A Penh-ben nyugalmi állapotban nincs jelentos eltérés az asztmás és a kontroll állatok között. Ezért (az egeret tartalmazó kamrába nyíló külön csövön) egyre növekvo koncentrációjú metakolin (MCh) (kolinerg agonista) aeroszolt lélegeztettünk be az állatokkal, amely az asztmásokon erosebb légzésgörbe torzulást, ezáltal nagyobb Penh értékeket eredményez, mint a kontroll csoporton. Nevezetesen kilégzéskor a görbe keskeny, magas csúcsot mutat, majd hosszan elnyúló plató következik. Ez arra utal, hogy az állat a maradék levegotérfogatot nehezen préseli ki tüdejébol. A mért légzési görbék tipikus alakjai, MCh belélegeztetése után, a 10. ábrán láthatók.
Méréseink a következoképpen történtek: Miután a készüléket 1 ml levego gyors befecskendezésével kalibráltuk, 2 l/perc stacioner légáramot állítottunk be, majd behelyeztük a kamrába az egereket. 10 percig szoktattuk új környezetükhöz, ezután 3 percig mértük alap Penh értékeiket. (Mérési eredménynek mindig a mérés ideje alatti 60
légzések Penh értékeinek átlagát vettük.) Ezután a MCh oldószereként szolgáló PBS-t, további alkalmak során pedig 3,125-50 mg/ml koncentrációjú MCh oldatot (minden alkalommal az elozo duplája) porlasztottunk a kamrába. A porlasztás 1,5 percig tartott 0,35 l/perc „fo" (Trick. Out) és 1,25 l/perc „higító" (Dilution Out) térfogatárammal. Mindegyik porlasztás után 5 percig mértük a Penh-et. Végso eredményeinket mindig a PBS porlasztás után mért Penh értékhez viszonyítottuk.
9. ábra Légzési görbe ideális alakja Ti : belégzés ideje, Te : kilégzési ido, Tr : relaxációs ido, PIP: belégzési nyomás csúcsértéke, PEP: kilégzési nyomás csúcsértéke
10. Ábra Légzési görbék alakjai egészséges és asztmás állatnál azonos koncentrációjú MCh belélegeztetése után (mérésekbol).
61
3.2.4 Tüdo szövettan A 10%-os formalin oldatban fixált a szervekbol a szövetmetszeteket (4 ? m vastag) az S.E. Pulmonológia Intézetében Dr. Appel Judit docens, és Bornemisza Beril készítette a standard hematoxilin-eosin festési protokoll alapján. A metszetek szövettani elemzését, szintén ok végezték el. (Kollegáink a metszetek kódjait ismerték csupán.) A kész metszeteket 400-szoros nagyításban le is fényképeztük, majd állatonként 4 különbözo látótérrol készült fényképen megszámoltuk az eozinofil granulocitákat.
3.2.5 A BAL morfológiai vizsgálata A tüdo öblítésekor kapott BAL-t lecentrifugáltuk (5 perc, 700 g, 40 C), majd az üledéket 5 ml fiz. só oldatban újraszuszpendáltuk. Ebbol a sejt-szuszpenzióból határoztuk meg az össz leukocita számot, majd 500 ? l-jét citocentrifugáltuk (20 perc, 700g, 40 C ), a maradékot pedig FACS vizsgálatokhoz tettük félre. A tárgylemezre centrifugált sejteket a Heim Pál Gyermekkórház Központi Laborjának rutin módszerével festettük: A tárgylemezek felszínét beszárítottuk, ezután elofesto/fixáló oldattal kezeltük, majd az eozinofil és a bazofil struktúrákat festo oldatokba mártogatva megfestettük. Végül vízzel öblítettük, és szárítás után Kanada-balzsam segítségével, fedolemezzel fedtük le. Egy egérbol származó preparátumon legalább 300 sejtet számoltunk meg, hogy viszonylag pontosan határozhassuk meg a különféle sejtek százalékos gyakoriságát.
3.2.6 A BAL limfocitáinak FACS (Flow Citometria) vizsgálata A morfológiai jegyek alapján limfocitának definiált sejtek, sejtfelszíni markereik szerint szubpopulációkra oszthatók: CD3+ T sejtekre, b220+ B sejtekre és NK+ NK sejtekre. Vizsgála tainkban arra is választ kerestünk, hogy ezeknek a szubpopulációknak a megoszlása hogyan alakul a négyféle állatcsoportban.
A FACS méret, granuláltság és fluoreszcens ellenanyaggal jelölt sejtfelszíni antigének
alapján
képes
a
sejtpopulációkat
szétválasztani.
Az
elokészített
sejtszuszpenzió egy kapillárison áramlik keresztül, amelyben a sejteteket a készülék
62
egyenként vizsgálja lézernyaláb segítségével. A fény szórásából a sejtek méretével és granuláltságával arányos jelet ad le a hozzá kapcsolt számítógépnek, mely közremuködésével az adatok értékelhetok. Mivel a különféle limfoid sejtek mérete és granuláltsága hasonló, ezek alapján lehetetlen oket elkülöníteni egymástól. Viszont az egyes szubpopulációkra specifikusan jellemzo sejtfelszíni molekulákat felismero, fluoreszcens festékkel (FITC vagy fikoeritrin) jelölt antitestekkel már lehetséges az elkülönítés. Kísérleteinkben mi is ezt az elvet használtuk ki, a következo sejtfelszíni markerek elleni monoklonáris antitestekkel: CD3, B220, NK.
A morfológiai vizsgálatnál félretett sejtszuszpenziót lecentrifugáltuk (20 perc, 700 g, 4 o C) és 180? l PBS-ben vettük fel. Az így elokészített mintából 50-50 ? l-t használtunk fel egy-egy antitesttel történo FACS vizsgálathoz. A vizsgálathoz a következo elokészületeket végeztük: 1.
1-1 ? l fluorescens festékkel jelölt monoklonális antitestet pipettáztunk a tesztcsövekbe.
2.
Az elozoekben leírt módon elokészített sejt szuszpenzióból 50-50 ? l-t hozzámérünk az antitestekhez.
3.
Összerázás után 30 percig inkubáltuk a csöveket sötétben, szobahomérsékleten.
4.
2 ml BD FACS Lysing Solution-t adtunk a csövekhez, amely 10 perc inkubálás után szelektíven lizálta a vörösvértesteket.
5.
Keverés után, 10 percig inkubáltuk az elegyet szobahomérsékleten, sötétben.
6.
Centrifugálás (300 g, 5 min, RT) után eltávolítottuk a felülúszót.
7.
Az üledéket felvettük 2ml PBS-ben, majd ismételt centrifugálás után, a felülúszó újra leöntöttük.
8.
Végül a sejteket 0,5 ml, 2% paraformaldehid oldatban (PBS) vettük fel.
3.2.7 Szérum IgE mennyiségének mérése A szívbol vett, EDTA-val alvadásgátolt vért lecentrifugáltunk (10 perc, 700 g, 4 o
C), majd a felülúszót kis adagokra szétporciózva -80 0 C-on tároltuk. Ezekbol a
mintákból határoztuk meg az allergén specifikus IgE szintet és a szérum össz IgE koncentrációt klasszikus szendvics-assay elvén muködo ELISA technikákkal. A 63
mérésekhez nem kereskedelemben kapható assay-eket használtunk, hanem a magunk által optimalizált rendszereket.
3.2.7.1 A szérum allergén specifikus IgE mennyiségének meghatározása Az egerek szenzitizálása OVA allergénnel történt. Az ellene termelt IgE izotípusú antitest méréséhez sztreptavidinnel bevont mikrotitráló lemezeket használtunk, amelyhez magát a biotinnal konjugált OVA-t kötöttük. A sztreptavidin–biotin kölcsönhatásnak igen nagy az egyensúlyi állandója (K d? 10-15 M), ezért a következo fejezetben leírt egyszerubb adszorpciós technikához viszonyítva a mérés érzékenysége is nagyobb: ugyanis a lemezbe felvitt elso réteg (OVA) nem válik le a falról, ill. nem kell számolni az OVA és mikrotitráló lemez fala közötti estleges kedvezotlen adszorpciós viszonyokkal sem. Az allergénnel bevont lemezet ezután a mérendo szérummal inkubáltuk, amelybol az OVA-specifikus antitestek lekötodtek. Végül az analitikai jelet az IgE nehézláncra specifikus antitesttel konjugált torma-peroxidáz (HRPO) szolgáltatta (tracer), amely hidrogén-peroxid által, a tetrametil-benzidinbol látható tartományban jól fotometrálható színes terméket ad, és a módszert az IgE-re specifikussá teszi. Mivel OVA specifikus IgE nem kapható kereskedelmi forgalomban, csak relatív értékeket tudtunk mérni. Viszonyítási alapként allergizált egerek egyesített szérumját használtuk, amit – a mintákhoz hasonlóan – szintén -80 0 C-on tároltunk.
Mérési protokoll az elokísérletek alapján: 1.
Az avidinált lemez minden csövébe 200 ? l bevonó oldatot pipettáztunk.
2.
Szobahomérsékleten, rázatás mellett 2,5 órát inkubáltuk.
3.
Gépi mosóval 5-ször mostuk PBST-vel a mikrotitráló lemezt.
4.
A blokkoló oldatban megfeleloen hígított (allergizált: 800-szoros, kontroll: 50-szeres) mintákból 100-100 ? l-t pipettáztunk a csövekbe.
5.
Szobahomérsékleten, rázatás mellett, 1,5 órán át inkubáltuk.
6.
Lsd. 3. pont.
7.
Az 1 ? g/ml- re hígított (blokkoló oldatban) HRPO-mAb (tracer/antiszérum) oldatból 100 ? l-t pipettáztunk a csövekbe.
8.
Szobahomérsékleten, rázatás mellett 1,5 órán át inkubáltuk.
9.
Gépi mosóval 10-szer mostuk PBST-vel.
64
10.
200 ? l TMB szubsztrátot pipettáztunk a csövekbe.
11.
Szobahomérsékleten 30 percig inkubáltuk.
12.
Az enzimreakciót 50 ? l 0,5 N kénsavval leállítottuk.
13.
A reakcióelegyet 450 nm-en fotometráltuk.
A kezelt WT egerek poolozott szérumjainak A hígításának kezelt WT egerek egyesített szérumjainak a reciproka (1/hígitás) hígításának a reciproka (1/hígitás)
11. ábra Az antiszérum hígításának optimalizálása a línearitásra törekedve Az 1 ? g/ml-es koncentrációjú oldatot tekintettük optimálisnak.
A blokkoló oldat viszonylag extrém összetételét (30 % marhaszérum, tween-20) és a nagyszámú mosást az elokísérletek vak méréseinél (nincs OVA bevonat a lemezen) jelentkezo magas abszorbancia értékek indokolták, amit valószínuleg a felhasznált mikrotitráló lemez nagy fehérjeköto képessége okozott. Az assay-ben alkalmazott tracer és mintakoncentrációk optimális mennyiségének beállításához kísérleteket végeztünk, melyek eredményei a 11-13. ábrákon láthatóak. A 11. ábra görbéinek lefutása alapján alkalmaztuk a tracert a protokollban leírt 1 ? g/ml- es koncentrációban: ugyanis ennél a koncentrációnál kezd lineárissá válni a görbe; ugyanakkor a vak mérés (nincs OVA bevonat), valamint a – valószínuleg kevés specifikus IgE-t tartalmazó – placeboval kezelt állatok mintáinak mérése (12. ábra) az alacsony méréstartományokba esik. A minták hígításának optimalizálása az 13. ábrán látható. Ez alapján az asztmás szérummintákat 800-szoros hígításban (lsd. bekeretezett tartomány) inkubáltuk az assay-ben, mivel ennél a hígításnál az OD a magas, de ugyanakkor még a jól mérheto
65
tartományban van. A nem asztmás mintákat 50-szeres hígításban mértük. (Az OVA specifikus IgE így sem volt kimutatható.)
A kezelt WT egerek egyesített szérumjainak hígításának a reciproka (1/hígitás)
Antiszérum koncentráció (?g/ml)
12. ábra Az antiszérum hígításának
13. ábra A minták hígításának
optimalizálása az alacsony háttérre törekedve
optimalizálása
3.2.7.2 A szérum teljes IgE koncentrációjának mérése A mérési protokoll: 1.
A capture anti-egér IgE antitestet 2 ? g/ml-re hígítottuk a bevonó puferben, majd ebbol csövenként 100 ? l-t pipettáztunk a mikrotitráló lemezbe.
2.
Rövid rázatás után, a lemezt szobahomérsékleten 2,5 óráig inkubáltuk.
3.
Gépi mosóval 3-szor mostuk PBST-vel a mikrotitráló lemezt.
4.
A csöveket 200 ? l blokkoló pufferrel 30 percen keresztül rázattuk szobahomérsékleten.
5.
Lsd. 3. pont
6.
A blokkoló oldatban megfeleloen hígított (allergizált: 1500-szoros, kontroll: 2-10-szeres) mintákból, ill. standardból 100-100 ? l-t pipettáztunk a csövekbe és rázatás mellett 1,5 órán át inkubáltuk szobaho mérsékleten.
7.
Lsd. 3. pont.
8.
100 ? l, 0,4 ? g/ml-es koncentrációjú (blokkoló pufferben higított) tormaperoxidázzal konjugált anti-egér IgE-t (signal/tracer antitest) pipettáztunk a csövekbe.
9.
1,5 órán át rázattuk a mikrotitráló lemezt szobahomérsékleten. 66
10.
9-szer mostuk a lemezt gépi mosóval PBST-vel.
11.
150 ? l TMB szubsztrátot pipettáztunk a csövekbe.
12.
A lemezt szobahomérsékleten 30 percig inkubáltuk.
13.
Az enzimreakciót 50 ? l 0,5 N kénsavval állítottuk le.
14.
A reakcióelegyet 450 nm-en fotometráltuk.
IgE koncentráció (ng/ml)
A kezelt WT egerek egyesített szérumjainak hígításának a reciproka (1/hígitás)
14. ábra Az antiszérum hígításának
15. ábra A minta hígítás
optimalizálása
optimalizálása
A 14. ábrán különbözo signal/tracerkoncentrációk esetén láthatjuk a fenti assay összeállítással felvett standardgörbéket. Ezek közül a 0,4 ? g/ml- es koncentrációt választottuk ki kísérleteink megvalósítására, mivel itt még a háttér (vak minta) is viszonylag alacsony (nincs ábra róla) és az egyenes sem túl meredek (jó az érzékenység). A 15. ábrán a mintahígítás optimalizálását mutajuk be. Kiindulópontként azt feltételeztük, hogy a minták IgE koncentrációja a kezelt WT állatok egyesített szérum IgE koncentrációja körüli tartományban lesz, ezért elso közelítésben minden mintát 1500-szeresre hígítottunk meg (bekeretezett tartomány), hogy az OD jel a fotométer mérési tartományának közepén legyen. A késobbiekben a mérési tartományon kívül eso értékeket további hígításokkal (2-szeres, 10-szeres hígítás) pontosítottuk.
3.2.8 Citokinek, kemokinek génexpressziójának meghatározása tüdoszövetbol A vizsgálatokhoz a folyékony N2 -ben lefagyasztott, -80 0C-on tárolt egértüdokbol indultunk ki. A szövetekbol RNS-t izoláltunk; az azonos csoportokba tartozó, egyenlo
67
mennyiségu RNS-t tartalmazó mintákat egyesítettük ; majd egyfajta microarray- vel rokon módszerrel (Super Array) összehasonlítottuk az egyes csoportok különféle citokinjeinek, kemokinjeinek RNS mennyiségeit az egyik housekeeping génjükhöz viszonyítva.
3.2.8.1 RNS-izolálás Az RNS izoláláshoz a SIGMA TRI reagens kitjét használtuk. Homogenizálás: 1.
1 ml TRI reagensben 50-100 mg szövetet teflonos homogenizátorral homogenizáltunk, majd az elegyet 5 percig szobahomérsékleten állni hagytuk.
2.
Hozzáadtunk 0,2 ml kloroformot, majd 15 másodpercig intenzíven rázattuk. Ezután 2-15 percig szobahomérsékleten állni hagytuk.
3.
12000 g-vel 15 percig centrifugáltuk. Az alsó vörös fázisban találhatók meg a fehérjék, a középsoben a DNS, a felso fázisban az RNS molekulák.
RNS izolálás 4.
A felso fázist leszívtuk és steril eppendorf csobe tettük.
5.
Hozzáadtunk 0,5 ml izopropanolt és szobahomérsékleten 5-10 percig állni hagytuk.
6.
12000 g-vel 10 percig 4o C- on centrifugáltuk a kicsapódott RNS-t.
7.
A csapadékot 1 ml 75%-os etanollal mostuk, majd a szuszpenziót centrifugáltuk (7500 g, 5 perc, 4 °C).
8.
Leöntöttük a felülúszót, 5-10 percig szobahomérsékleten szárítottuk a csapadékot.
9.
30 ? l RN-áz mentes vízben feloldottuk az RNS-t.
10.
Mintánk egy részét 100-szorosára higítottuk, 260 nm-en, 1 cm-es küvettában fotometráltuk,
majd
kiszámoltuk
a
mintakoncentrációt.
(C minta=A260 *4)
3.2.8.2 A génexpresszió mérése: Super Array A módszer elve a következo (16. ábra): A szövetbol izolált RNS-rol radióaktívan jelzett cDNS-t írunk át. Ennek a transzkripciónak fontos jellemzoje, hogy a kiindulási 68
RNS-sel közel azonos számú jelölt cDNS szintetizálódik (tehát nincs amplifikáció). Az átírás nem történik meg az összes RNS-rol, csupán azokról, amelyeket az adott kittel mérni lehet, ugyanis csak ezek transzkripciójának megkezdéséhez szükséges oligonukleotidokat tartalmazza a rendszer. A jelölt cDNS-t tartalmazó mintát ezután hibridizáltatjuk egy olyan membránnal, amelynek felületére meghatározott rendben, kis korong alakban felvitték az átírt RNS egy darabjával komplementer DNS szálat. A membrán mosása után tehát, az egyes részein mért radioaktív jel erossége arányos az átírt, jelölt cDNS-sel, ezáltal a mérendo RNS mennyiségével. A radioaktív jeleket autoradiográfiás
módszerrel
tesszük
láthatóvá,
majd
denzitometriás
méréssel
kvantifikáljuk. Végül, a vizsgálat során meghatározott egyik housekeeping gén (GAPDH) expressziójának százalékában fejezzük ki. Erre azért van szükség, mivel nehéz pontosan ugyanannyi RNS-t felvinni a különbözo membránokra, valamint a mérés folyamán is számtalan különbség adódhat két array között. A módszer tehát nem abszolút mennyiségeket ad, hanem különbözo állapotok összehasonlítására szolgál, és a számtalan hibaforrás miatt szemikvantitatívnak tekintheto. Két gén expressziója között általában akkor fogadnak el szignifikáns különbséget, ha végeredményként kapott viszonyszámaik között legalább kétszeres különbség van. A technika a microarray (DNS-chip) módszerrel rokon, viszont nem igényel drága felszerelést. Az elterjedtebben használt RT-PCR, Northern blot expressziós vizsgálatokkal szemben nagy számú gén kifejezodése vizsgálható párhuzamosan, egyszerubben és gyorsabban.
Assay protokoll (lsd. http://www.superarray.com ): 1.
Az RNS izolálás (lsd. elozo fejezet) során kapott RNS 5-10 ? g-jából reverz transzkriptázzal [? - 32 P]–cDNS-t írtunk át a kit- hez adott oligonukleotid keverékrol kiindulva.
2.
Közben a membránokat 68 o C-on 1-2 órán át blokkoltuk (a hibridizáló oldatban oldott) denaturált lazacsperma DNS-el az aspecifikus kötések megakadályozása céljából.
3.
A blokkolt membránokat a hibridizáló oldatban oldott cDNS-el egy éjszakán át inkubáltuk.
4.
A hibridizált membránokról lemostuk az aspecifikus radioaktivitást.
5.
A hibridizált array-t fóliazacskóba hegesztettük, majd egy röntgenfilm elé helyeztük, és -80 o C-on kb. 1 hétig exponáltuk.
69
6.
A röntgenfilmet elohívtuk egy automata elohívóval, homogén fényforrással átvilágítottuk, majd digitális fényképezogéppel lefényképeztük.
7.
Szoftver segítségével megmértük a digitális fényképen található foltok denzitásit, az azonos génekhez tartozókat átlagoltuk (2 párhuzamos minden mérendo molekulánál, a GAPDH esetén 6 párhuzamos). Ezután az átlag denzitásokból kivontuk a vakként szolgáló pUC plazmid denzitás értékeinek átlagát, majd a GAPDH-nak megfelelo foltok denzitásának átlagaihoz viszonyítva fejeztük ki eredményként, mivel azok expresszióját a kísérlet (elméletileg) nem változtatja meg.
5?l RNS A és B mintából RNS átírása DNS-é reverz transzkripcióval Hibridizálás az array-el
Expressziós profil
16. ábra A Super Array elve
3.2.9 Az INF-? és IL-4 fehérje mennyiségének meghatározása tüdoszövetbol A génexpressziós mérésekhez hasonlóan, a folyékony N2 -ben fagyasztott, -80 0 Con tárolt tüdoszövetekbol végeztük a vizsgálatot. Kb. 150 mg szövetet 2 ml PBS-ben homogenizáltunk (lsd. RNS izolálás), majd a szuszpenziót centrifugáltuk (3000 g, 20 perc, 4
0
C). A felülúszót szétporciózva –80
0
C-on tároltuk. Ezekbol gyárilag
optimalizált szendvics ELISA-val – határoztuk meg az INF-? és IL-4 mennyiségét, amit mintáink össz fehérje tartalmára normalizáltunk. Az ELISA elve hasonló a szérum össz
70
IgE meghatározásánál ismertetett assay- hez. Részletes leírása megtalálható a kit-hez adott leírásban. Ezért pontos ismertetésétol eltekintek.
3.2.10 Statisztikai módszerek Az adatokat MedCalc® programmal elemeztük. Az egyes állatcsoportok AHR-jét (n=7-10) ANOVA teszttel hasonlítottuk össze, a sejtösszetétel és IgE szint (n=7) vizsgálatához
párosítatlan Student-féle
t-próbát
alkalmaztunk.
A
konfidencia
intervallumot 95 %-os szinten határoztuk meg. A szignifikancia értéket (p) legalább 0,05-nek vettük. Kísérleti eredményeinket a következoképpen adtuk meg: átlag + szórás (SEM).
A Super Array vizsgálatoknál (n=7) akkor tekintettük egy adott molekula mérési eredményeit értékelhetonek, ha – egy csoporton belül – a 2 pontban mért denzitások közötti különbség nem haladta meg az átlagdenzitás értékének a másfélszeresét. Ha ez a feltétel nem teljesült, az összes állatcsoport ilyen molekuláját "nem összehasonlítható"nak tekintettük, és további értékelésével nem foglalkoztunk. Ha nem létezett olyan állatcsoport, amelyben a mért átlagdenzitás értéke elérte a GAPDH átlagdenzitásának 1 %-át, az illeto molekulát a "nem kimutatható" kategóriába soroltuk. Szignifikánsan különbözonek akkor vettük egy gén expresszióját két csoport között, ha a különbözo minták denzitás-átlagai legalább egymás kétszeresei voltak. A Super Array adatok egyéb statisztikai kiértékelésének nincs értelme, mivel a különbözo egércsoportok egyesített mintáit mindössze egyszer mértük csak meg, szórást pedig csak az egy mérésen belüli két párhuzamos mérési pontból számíthattunk volna.
Felhasznált fontosabb vegyszerek, eszközök [a-32p] dCTP a Super Array-hez: 10 MBq, Izotóp Intézet Kft. BAL morfológiai vizsgálatához használt reagensek: DIA -FIX PANOPTIC, DIA-BLUE, DIA-RED; DIAGON Kft. BD FACS Lysing Solution a FACS mintaelokészítéshez Bevonó oldat az IgE mérésekhez: 70% OVA-Biotin törzsoldat (5 mg/ml OVA -Bi 0,1 M PBS-ben, 1 g/l NaN3 , 1% BSA)
30% marhaszérum Blokkoló oldat az IgE mérésekhez: 9 ml marhaszérum 21 ml 0,1%PBST (0,1 g/l NaN3 ) 300 mg BSA Capture antitest az IgE mérésekhez: SEROTEC rat anti mouse IgE heavy chain Centrifuga: Heraeus, Biofuge 15 R
71
Citocentrifuga rotor a BAL morfológiai vizsgálatához: Hettich zentrifugen – cytosystem ELISA plate az IgE mérésekhez: MaxiSorp-Nunc Immuno plate avidinálva, vagy anélkül ELISA-mosó: Sorin Biomedica ETI SYSTEM - Washer ELISA-reader: BIO-TEK INSTRUMENTS INC., ELX 800 Fehérje méro muszer: Hycel, Lisa 300 automata Fiziológiás sóoldat Flowcitométer: BD FACScalibur Fluorescens festékkel jelzett monoklonális antitestek a BAL FACS vizsgálataihoz: Pharmingen anti mouse CD3 Phycoeritrin, anti mouse B220/CD45 Phycoeritrin, anti mouse NK-1.1 FITC
Reverz transzkriptáz a Super Array-hez: PROMEGA , 200U/? l SFT1410 BioSystem XA Software a pletizmográfhoz SFT1811 A/D Card a pletizmográfhoz Röntgenfilm elohívó autómata: Fu ji Salmon Sperm DNS a Super Array-hez: INVITROGEN Life Technologies Standard antitest az össz IgE meghatározáshoz: BD Pharmingen anti mouse IgE(? ) Super Array GEArrayTM Kit Mouse Common Cytokine-1; Chemokine; Interleukin Receptor; Chemokine Receptor Szisztémás szenzitizáláshoz használt oldat 50 ? l PBS 20 ?g ovalbumin 50 ? l Imject? Alum
Homogenizátor az RNS és fehérje izoláláshoz: HEIDOLPH DIAX 100
Szoftver a Super Array kiértékeléséhez Kodak Scientific Imaging Systems 1D v3.5.0.
IgE nehézlánc elleni monoklonális antitest az IgE mérésekhez SEROTEC rat anti mouse IgE HRP
Termosztát a hibridizáláshoz (Super Array): Biometra OV 11 Hybridisation Oven
IL-4 és INF-? ELISA: R&D systems, Quantikine? M murine Inhalációs provokáláshoz használt oldat 5% ovalbumin fiziológiás sóoldatban
Termosztát a jelöléshez (Super Array) BIOMETRA Trio-Thermoblock TRD5100 Flow Transducer a pletizmográfhoz TRI reagens az RNS izoláláshoz
Inhalációs szenzitizáláshoz használt oldat 1% ovalbumin fiziológiás sóoldatban Leukocita számoláshoz használt automata: Coulter® Counter MAX1320 Interface a pletizmográfhoz MAX2270 Preamplifier a pletizmográfhoz
Minden reagens, amelynél külön nincs
Metakolin (SIGMA) a pletizmográfiás méréshez Mikroszkóp és digitális fényképezogép a szövettani vizsgálatokhoz: Olympus® microscope and photographed with an Olympus® camera
feltüntetve a gyártó, a Sigma cég terméke.
PBS (1 liter, pH=7,4) NaCl 8g Na 2 HPO4 1,44 g KH2 PO4 0,24 g KCl 0,2 g PBST: PBS+0,5% Tween-20 PLY3211 Whole Body Unrestrained Single Chamber Plethysmograph a pletizmográfhoz PLY1020 Bias Flow Supply a pletizmográfhoz Porlasztóberendezés a állatok inhaláltatásához MEFAR S.P.A. Bovezzo-Aerosan-3 inhalator
72
4 Eredmények 4.1 Az allergia populációgenetikai vizsgálatai 4.1.1 Nincs kapcsoltság az asztma/allergia és a RANTES -28G, -403A (74), valamint a CCR5? 32 polimorfizmusok között (83) A 17. ábrán a RANTES promoter -28-as és -403-as polimorfizmusainak PCRRFLP-s kimutatásáról készült fénykép látszik. Egyik vizsgált polimorfizmus, ill. a polimorfizmushoz tartozó genotípus, sem fordult elo statisztikailag szignifikánsan különbözo gyakorisággal az asztmás, vagy a nem-asztmás allergiás gyermekek körében a kontroll csoporthoz képest (7. táblázat). Továbbá nem találtunk összefüggést a vizsgálatba
bevont
egyének
RANTES
-28-as,
vagy
-403-as
lókuszainak
polimorfizmusai, valamint életkoruk, asztmájuk elso diagnózisának ideje, nemük, atópiájuk megléte, szérum össz IgE szintjük, össz fehérvérsejt számuk, vagy vér eozinofil szintjük között sem (az adatokat nem ismertetjük).
MW
1
2
3
4
5
6
17. ábra A RANTES -28 C/G és -403 G/A polimorfizmusainak kimutatása MW: molekulasúly standard, 1: RANTES -403 A/A, 2: RANTES -403 G/A, 3: RANTES -403 G/G, 4: RANTES -28 G/G, 5: RANTES -28 C/G, 6: RANTES -28 C/C
73
A
RANTES -28 C/G Populáció
Asztmás Nem-asztmás allergiás Kontroll
B
Genotípus C/C
Genotípus C/ G
Genotípus G/G
Összesen
Allélfrekvencia (G)
n (%) 144 (90,0) 136 (90,1)
n (%) 16 (10,0) 14 (9,3)
N (%) 0 (0,0) 1 (0,7)
N 160 151
% 5,0 5,3
284 (93,7)
19 (6,3)
0 (0,0)
303
3,1
Genotípus G/G
Genotípus G/ A
Genotípus A/A
Összesen
Allélfrekvencia (A)
n (%) 122 (76,3) 100 (66,2)
n (%) 32 (20,0) 47 (31,1)
N (%) 6 (3,8) 4 (2,7)
N 160 151
% 13,8 18,2
211 (69,6)
84 (27,7)
8 (2,6)
303
16,5
RANTES -403 G/A Populáció
Asztmás Nem-asztmás allergiás Kontroll
7. táblázat A három vizsgált gyermekcsoport (asztmás, nem-asztmás allergiás, kontroll) (A) RANTES -28, és (B) RANTES -403 genotípusainak elofordulása, továbbá a ritkábban eloforduló allélfrekvenciái
182 bp 150 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
18. ábra A CCR5/CCR5? 32 polimorfizmusának kimutatása 1, 4, 7, 8: CCR5 WT/WT, 2: CCR5 ? 32/? 32, 3, 5, 6: CCR5 WT/? 32
A 18. ábrán CCR5? 32 polimorfizmus kimutatására szolgáló PCR-RFLP fénykép látható, a 8. táblázatban pedig az asztma, allergia szempontjából 3 kategóriába sorolt vizsgált egyének CCR5 genotípusai és allélfrekvenciái. A RANTES promoterének vizsgált mutációihoz hasonlóan sem a genotípus eloszlásban, sem pedig az allélfrekvenciában nem találtunk szignifikáns különbséget a csoportok között. A kontroll csoportban mért allélfrekvencia (11,2 %) nagyon hasonló volt ahhoz, amit korábban a magyar újszülöttekben már meghatároztunk (11,6 %). A CCR5? 32 allél asztmában
betöltött
esetleges
szerepeinek
pontosabb
vizsgálatához
szintén
meghatároztuk a különbözo genotípusú asztmás gyermekek néhány klinikai és 74
laboratóriumi paraméterét, de szignifikáns összefüggést itt sem kaptunk. A legnagyobb eltérés a különbözo genotípusú emberek között a vér eozinofil granulocita összetételében tapasztaltunk (19. ábra). A legtöbb eozinofil granulocitát a homozigóta deletált
formát
hordozó
egyénekben
lehetett
kimutatni,
a
legkevesebbet
a
heterozigótákban.
Populáció
Genotípus WT/WT
Genotípus WT/? 32
Genotípus ? 32/? 32
Összes en
Allélfrekven-cia (? 32)
n (%)
n (%)
n (%)
N
%
Asztmás Nem-asztmás allergiás
95 (80,5) 116 (80,0)
19 (16,1) 26 (17,9)
4 (3,4) 3 (2,1)
118 145
11,4 11,0
Kontroll
240 (79,2)
58 (19,1)
5 (1,7)
303
11,2
8. táblázat A három vizsgált gyermekcsoport CCR5 genotípusainak elofordulása és a ritkábban eloforduló allél frekvenciái
Vér eozinofil összetétel (%)
homozigóta mutáns
heterozigóta
homozigóta vad
0
2
4
6
8
10
12
14
16
19. ábra A CCR5-re nézve különbözo genotípusú asztmás gyermekek vér eozinofil granulocita összetétele A CCR5? 32-t a mutáns allél tartalmazza
Eredményeink 2 ponton is ellentmondanak Hall és mtsai. (81) eredményeinek. Egyrészt lényegesen több CCR5? 32-re homozigóta egyént találtunk (3,4%), másrészt nem tudtuk kimutatni, hogy a mutációnak szerepe lenne az asztma kialakulásában. Ugyanakkor vizsgálataink és azok eredménye teljes mértékben kielégítették a HardyWeinberg egyensúlyt; továbbá elméletben statisztikailag éppen úgy alkalmasak lettek volna Hall és mtsai.- i által mért OR érték (OR=0,36) kimutatására.
75
4.1.2 Az MCP-1 promoterének -2518G mutációja kapcsoltan öröklodik az asztmával (74) A vizsgált asztmás egyének legfobb jellemzoit a 9. táblázat, a vizsgálatba bevont személyek genotípusait az 10. táblázat tartalmazza. A polimorfizmus detektálására szolgáló PCR-RFLP fényképe a 20. ábrán látható. A -2518-as A/G polimorfizmus az MCP-1 promoter régiójában, statisztikai elemzések szerint, eltéro gyakorisággal van jelen a vizsgált gyermekek különbözo csoportjaiban (p<0,001). A -2514G allél frekvenciája szignifikánsan na gyobb az asztmások csoportjában mind a kontroll (p<0,001, OR=2,0 [95% CI: 1,4-2,6]), mind pedig nem-asztmás allergiás (p<0,001, OR=2,0 [95% CI: 1,4-2,9]) egyénekbol álló csoporthoz képest.
MW
1
2
3
20. ábra Az MCP-1 A/G polimorfizmusainak kimutatása PCR-RFLP-vel MW: molekulasúly standard, 1: MCP-1 -1518 G/G, 2. MCP-1 -2818 A/G, 3: MCP-1 -2518 A/A
Az alléleloszlások – a nem-asztmás allergiás csoport kivételével – megfeleltek a Hardy-Weinberg elméleti alléleloszlásnak. A kivételként említett esetben a ? 2 teszt alapján (? 2 =7,15; p<0,01) megállapítottuk, hogy a G/G homozigóta genotípus gyakorisága szignifikánsan magasabb az elméletben várt értéknél. (Fischer teszttel nem volt szignifikáns különbség (p=0,6, OR=1,3 [0,6-2,7]).) Mivel a nem-asztmás allergiás homozigóta GG csoport ige n kicsi volt, valószínuleg nagyobb populáció vizsgálatára lenne szükség a mutáció asztmában betöltött pontosabb szerepének tisztázásához.
76
Klinikai és biológiai tulajdonságok Összes asztmás beteg MCP-1 -2518 genotípus Genotípus A/A A/G G/G Vizsgálatba vont személyek száma 160 68 74 18 Életkor (3-18 év) 10,1 + 3,5 9,8 + 3,1 8,7 + 4,5 13,3 + 1,8 Az asztma 1. diagnózisának ideje 3,5 + 2,2 3,7 + 2,3 3,4 + 2,7 3,6 + 1,5 (0.5-9 éves kor) Nem (fiú/lány) 90 / 70 34 / 34 46 / 28 10 / 8 Össz IgE kU/l (9-1001) 266 + 231 243 + 227 278 + 256 301 + 228 Vér fehérvérsejt szám (*106 /ml) 6,9 + 1,5 6,7 + 1,5 7,1 + 1,7 7,2 + 1,0 Vér eozinofil granulocita arány (%) 5,4 + 3,1 3,9 + 2,2* 5,9 + 3,7* 9,3 + 4,8* Eozinofil granulocita mennyiség (*106 /ml) 0,35 + 0,24 0,27+0,20§ 0,36+0,27§ 0,64+0,26§
9. táblázat Az MCP-1 -2518-as lókuszra nézve különbözo genotípusú, vizsgált asztmás gyermekek klinikai és biológiai tulajdonságai * p<0,001 AA és AG között; p<0,001 AA és GG között; p=0,001 AG és GG között § p=0,030 AA és AG között; p<0,001 AA és GG között; p<0,001 AG és GG között
MCP-1 -2518 A/G Populáció
Asztmás Nem-asztmás allergiás Kontroll
Genotípus A/A
Genotípus A/G
Genotípus G/G
Összesen
Allélfrekven-cia (G)
n (%) 68 (42,5) 100 (66,2)
n (%) 74 (46,3) 39 (28,8)
n (%) 18 (11,3) 12 (8,0)
N 160 151
% 34,4* 20,9*
194 (64,0)
90 (29,7)
19(6,3)
303
21,1*
10. táblázat A három vizsgált gyermekcsoport MCP-1 -2518 genotípusainak elofordulása és a ritkábban eloforduló allél frekvenciái * p<0,001, és OR=2,0 (1,4-2,9) az asztmás és a nem-asztmás allergiás gyermekek között; p<0,001, és OR=2,0 (1,4-2,6) az asztmás és a kontroll allergiás gyermekek között
Az öröklodésmenet típusának feltárásához megvizsgáltuk, hogy a homozigóta mutáns, illetve heterozigóta allélkombinációk milyen gyakorisággal fordulnak elo az asztmás, és a kontroll populációban. Mindkét genotípus elofordulási gyakorisága esetén szignifikáns különbséget találtunk a két csoport között. A heterozigóta genotípusnál az OR: 2,4 (1,6-3,6) (p<0,001) (46,3 % az asztmás, 29,7 % a kontroll csoportban), homozigóta mutáns genotípusnál az OR: 2,7 (1,4-5,5) (p<0,001) (11,3 % az asztmás, 6,3 % a kontroll csoportban). Az OR értékek hasonlósága azt jelzi, hogy az egyik genotípus sem fordult elo nagyobb valószínuséggel a betegséghez kapcsoltan. Ez arra utal, hogy az autoszómán található MCP-1 -2518-as polimorfizmus domináns módon befolyásolja az asztma kialakulásával.
77
4.1.3 Az MCP-1 -2518G allél csak az asztmával mutat kapcsoltságot, az atópiával nem (74) Az eddigi eredmények arra is utalnak, hogy az MCP-1 -2514G mutáció csupán az asztma kialakulására hajlamosít, de az atópia esélyét nem növeli. Ugyanis a mutációt tartalmazó allél frekvenciája hasonló a nem-asztmás allergiás és kontroll csoportban (lsd. elozo fejezet); viszont mindkét csoportban szignifikánsan alacsonyabb, mint az asztmások körében. (A nem-asztmás allergiás csoportba tartozó gyermekek atópiásak is.) Ennek a feltételezésnek a megerosítése érdekében további vizsgálatokat végeztünk. Az asztmás gyermekekbol álló csoportot 2 részre osztottuk: atópiás és nem-atópiás asztmásokra; majd ezekben vizsgáltuk a G allél elofordulási gyakoriságát.
A 160 vizsgált asztmás közül 35 személy (21,9 %) tartozott a nem-atópiás kategóriába. A G allél frekvenciá ja szignifikánsan magasabb volt az atópiás asztmások körében, mint a nem-asztmás allergiás gyermekek csoportjában (p<0,001, OR=2,1 [95% CI: 1,4-3,0]). Az atópiás asztmásokhoz hasonló magas allélfrekvenciát kaptunk a nematópiás asztmások alcsoportjában is, de – az alacsony esetszám miatt – a nem-asztmás allergiásokhoz viszonyított különbség nem volt statisztikailag szignifikáns. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy az MCP-1 -2518G allél kapcsoltan öröklodik az asztma fenotípussal, de az atópiával nem.
4.1.4 Az MCP-1 -2518G allél kapcsolatban áll a vér eozinofil granulocita aránnyal/számmal és az asztma súlyosságával (74) Az MCP-1 -2518G mutáció vizsgálatának kapcsán arra is választ kerestünk, hogy az milyen mechanizmusok által járulhat hozzá az asztma kialakulásához. Ennek érdekében az asztmás gyermekek különbözo genotípusú alcsoportjait összehasonlítottuk néhány klinikai és biológiai paraméterük alapján (9. táblázat). Megállapítottuk, hogy az egyének koreloszlásában, az asztma elso diagnózisának idejében, a nemek eloszlásában, a vér össz IgE koncentrációjában, valamint fehérvérsejt számában nincs szignifikáns eltérés a különbözo genotípusú csoportok között. Azonban a vér eozinofil granulocita százalékos arányában, valamint ez eozinofil sejtszámban szignifikáns különbségek adódtak. A G/G homozigótákban volt a legmagasabb, az A/A homozigótákban pedig a legalacsonyabb az eozinofilek mennyisége. Az A/G heterozgóta allélokat tartalmazó betegekben pedig a két homozigóta csoport közötti volt. 78
A vér eozinofil mennyiségében és összetételében az asztmásokhoz hasonló jellegu jelenség volt megfigyelheto a különféle genotípusok között, ha a nem-asztmás allergiás egyéneken (21. ábra) végeztük el a csoportosítást, bár a különbségek nem érték el a statisztikailag szignifikáns értéket. Úgy látszik tehát, hogy a G allél, a betegség kialakulásától függetlenül, gyakrabban jár együtt magasabb eozinofil granulocita
A nem-asztmás allergiás egyének vér eozinofil összetétele (%)
A nem-asztmás allergiás egyének vér eozinofil száma (*106/ml)
10
1,2
9
Vér eozinofil szám *10 6/ml
Vér eozinofil összetétel (%)
összetétellel, és e tekintetben nem domináns, hanem inkomplett domináns hatású.
8 7 6 5 4 3 2 1
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
0 A/A
A/G
A/A
G/G
A/G
G/G
21. ábra Az MCP-1 -2518-as lókuszára nézve különbözo genotípusú nem-asztmás allergiás gyermekek vér eozinofil granulocita összetétele és mennyisége
Az asztmás gyermekek csoportját, betegségük súlyossága szerint, alcsoportokra osztottuk (22. ábra). A 160 asztmás egyén közül 32-nek (20,0 %) volt intermittáló, 22nek (13,8 %) szezonális enyhe perzisztáló, 74-nek (46,3 %) enyhe perzisztáló és 32-nek (20,0 %) mérsékelt perzisztáló asztmája. Súlyos perzisztáló asztmában egy beteg sem szenvedett. A különbözo alcsoportokban a G allél elofordulási gyakorisága jelentosen különbözött: a betegség súlyosbodásával párhuzamosan emelkedett (22. ábra). Az (1) – (2), (1) – (3), (1.5) – (3), (2) – (3) súlyossági kategóriákba tartozók között a G allél elofordulási gyakorisága statisztikailag szignifikánsan eltéro volt (p<0,05). Az MCP-1 2518G allél asztma súlyosságában betöltött funkciójának megerosítése érdekében megvizsgáltuk,
hogy a
különbözo
genotípusú asztmások,
milyen
súlyossági
kategóriákba sorolhatók (23. ábra). A homozigóta G alléllel rendelkezok körében szignifikánsan többen (p=0,003) szenvednek mérsékelt perzisztáló (55,6 %), mint 79
intermittáló (5,6 %) asztmában. Ugyanakkor a homozigóta A allélt hordozók között fordított volt a helyzet: szignifikánsan több (p=0,002) egyénnek volt intermittáló (30,9 %), mint mérsékelt perzisztáló (8,8 %) asztmája. A heterozigóták e tekintetben is a két másik genotípus között álltak, és a intermittáló és mérsékelt perzisztáló betegségben szenvedok számában nem volt szignifikáns az eltérés. Ezek a megfigyelések alátámasztják, hogy az MCP-1 -2518G allél, homozigóta formában, szignifikáns kapcsolatban áll az asztma súlyosságával, míg a G allél hiánya jótékonyan befolyásolja az asztmás tüneteket. mérsékelt perzisztáló (3) enyhe perzisztáló (2) szezonális enyhe perzisztáló (1.5) intermittáló (1) 0
10
20
30
40
50
60
G allél frekvencia (%)
22. ábra Az MCP-1 -2518 G allél frekvenciája a különbözo súlyosságú asztmások körében (A statisztikailag szignifikáns különbségeket lsd. a szövegben.)
enyhe perz. szezonális enyhe perz.
mérsékelt perz.
23. ábra A különbözo MCP-1 genotípusú asztmások súlyossági kategóriákba sorolása (A statisztikailag szignifikáns különbségeket lsd. a szövegben.)
80
24. ábra Különbözo súlyosságú asztmás egyének vér eozinofil granulocita mennyisége (A statisztikailag szignifikáns különbségeket lsd. a szövegben.)
Az MCP-1 -2518G allél tehát befolyásolja mind a vér eozinofil mennyiségét, mind az asztma súlyosságát. Ezekkel az eredményekkel kapcsolatban felmerült a kérdés, hogy a két paraméter kapcsolatban áll- e egymással. A 24. ábrán a különbözo súlyosságú asztmás egyének vér eozinofil granulocita koncentrációját ábrázoltuk. Megfigyelheto, hogy – más tanulmányokkal összhangban (353, 354) – az eozinofilek koncentrációja korrelál a betegség súlyossági fokával. A intermittáló és a mérsékelt perzisztáló tüneteket mutató asztmásoknál a különbség statisztikailag szignifikáns (p=0,003) volt. Ezek után arra is választ kerestünk, hogy az eozinofil sejtszám emelkedése a genotípussal, vagy pedig a súlyossággal van-e inkább kapcsolatban. A 25. ábrán a különbözo genotípusú gyermekek vér eozinofil granulocita koncentrációját mutatjuk be az eltéro súlyosságú asztmás csoportokban. Megállapíthatjuk, hogy az összes súlyossági kategóriában az eozinofilek átlagmennyiség az A/A genotípusú egyéneknél volt a legkisebb, a G/G genotípusúaknál pedig a legnagyobb. Másrészt azonban, egy genotípuson belül is, jelentos eltérés figyelheto meg az eozinofilek számában az egyes súlyossági kategóriák között: minél súlyosabb asztma kategóriáról van szó, annál magasabb az eozinofil granulocita szint. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy statisztikailag szignifikáns különbség (p<0,05), feltehetoleg az egy alcsoportba sorolt gyermekek kis száma miatt, csak az A/A – G/G, valamint A/G – G/G csoportok szezonális enyhe perzisztáló, enyhe perzisztáló és mérsékelt perzisztáló egyéneinek eozinofil granulocita mennyiségei között volt kimutatható. Egy genotípuson belül a különbségek nem voltak szignifikáns ak a különbözo súlyossági kategóriákba tartozó 81
egyének eozinofil mennyiségében. Ezek alapján tehát feltételezheto, hogy az MCP-1 2518G allél nem kizárólagosan az eozinofil granulociták által váltja ki az asztmás tünetek súlyosbodását.
25. ábra A különbözo genotípusú gyermekek vér eozinofil granulocita mennyisége az eltéro súlyosságú asztmás csoportokban (A statisztikailag szignifikáns különbségeket lsd. a szövegben.)
4.1.5 Sem a RANTES, sem az MCP-1 promoterének polimorfizmusai nem öröklodnek kapcsoltan az AEDS-sel (73) Az asztmával kapcsolatban vizsgált RANTES és MCP-1 polimorfizmusok elofordulási gyakoriságát az AEDS-ben szenvedok körében is felmértük, hátha valamelyik mutáció e másik allergiás betegség hátterében is szerepel. Erre a hipotézisre utaltak Nickel és mtsai. eredményei (75), melyek szerint a RANTES -403A, nagyobb gyakorisággal fordul elo az AEDS-es, mint az egészséges emberek körében. Az MCP-1 -2518G-rol pedig mi mutattuk ki, hogy kapcsoltságban van az asztmával (74). A 11. táblázatban a vizsgált AEDS-es, illetve a nem-AEDS-es allergiás gyermekek fontosabb klinikai és biológiai paramétereit foglaltuk össze. A személyek genotípusát a 12. táblázat tartalmazza. (A kontroll csoportot ugyanazok a személyek alkották, akik genotípusát
az
asztmával
kapcsolatos
vizsgálatok
révén
már
ismertettük.)
Megállapíthatjuk, hogy – bár eredményeink követik a Hardy Weinberg egyensúlyt – egyik allél, vagy genotípus sem fordult elo szignifikánsan eltéro gyakorisággal az
82
AEDS-ben szenvedokben, mint a kontroll populációban, vagy a nem-AEDS-es allergiások körében. Másképpen kifejezve: nem tudtunk kimutatni kapcsoltságot az egyik vizsgált polimorfizmus és az AEDS között. Ezenkívül nem találtunk összefüggést a polimorfizmusok és a 11. táblázatban ismertetett egyik klinikai, vagy biológiai tulajdonságok között sem.
Klinikai és biológiai tulajdonságok Vizsgálatba bevont s zemélyek száma Életkor (3-18 év) Nem (férfi/no) Össz IgE kU/l (9->5000) Vér fehérvérsejt szám (*106 /ml) Vér eozinofil granulocita arány (%)
AEDS-es betegek 128 6,3 + 4,4 68 / 60 474 + 465 7,1 + 1,9 4,0 + 1,9
Nem-AEDS-es allergiás betegek 102 7,5 + 4,0 56 / 46 572 + 621 6,9 + 1,6 3,6 + 1,5
11. táblázat A vizsgált AEDS-es és nem allergiás AEDS-es gyermekek klinikai és biológiai tulajdonságai
A
MCP-1 -2518 A/G Populáció
AEDS-es Nem-AEDS-es allergiás Kontroll
B
Genotípus A/G
Genotípus G/G
Összesen
Allélfrekven-cia (G)
n (%) 83 (64,8) 64 (62,7)
n (%) 35 (27,3) 32 (31,4)
n (%) 10 (7,8) 8 (7,8)
N 128 102
% 21,5 23,5
194 (64,0)
90 (29,7)
19(6,3)
303
21,1
Genotípus C/C
Genotípus C/ G
Genotípus G/G
Összesen
Allélfrekven-cia (G)
n (%) 120 (93,7) 90 (88,2)
n (%) 8 (6,3) 12 (11,8)
n (%) 0 (0,0) 0 (0,0)
N 128 102
% 3,1 5,9
284 (93,7)
19 (6,3)
0 (0,0)
303
3,1
RANTES -28 C/G Populáció
AEDS-es Nem-AEDS-es allergiás Kontroll
C
Genotípus A/A
RANTES -403 G/A Populáció
AEDS-es Nem-AEDS-es allergiás Kontroll
Genotípus G/G
Genotípus G/ A
Genotípus A/A Összesen
Allélfrekven-cia (G)
n (%) 86 (67,2) 71 (69,6)
n (%) 38 (29,7) 29 (28,4)
n (%) 4 (3,1) 2 (2,0)
N 128 102
% 18,0 16,2
211 (69,6)
84 (27,7)
8 (2,6)
303
16,5
12. táblázat A három vizsgált gyermekcsoport (A) MCP-1 -25185, (B) RANTES -28, (C) RANTES -403 genotípusainak elofordulása és a ritkábban eloforduló allél frekvenciái 83
4.2 Az asztma állatkísérletes modellezése 4.2.1 Csökkent marad az AHR a HDC KO egerekben szenzitizálás után
PBS-hez viszonyított relatív Penh válasz
12,00 10,00 WT kezelt WT OVA
8,00 6,00
*
KO kezelt KO OVA WT kontroll WT control KO kontroll KO control
4,00 2,00 -
0 PBS 3,125 6,25
12,5
25
50
Metakolin konc. (mg/ml)
26. ábra Légzésfunkciós vizsgálatok *: a WT kezelt és a többi állatcsoport között (p<0,001) szignifikáns a különbség
A 26. ábra alapján megállapíthatjuk, hogy az állatokkal belélegeztetett egyre nagyobb koncentrációjú MCh, az elvárásoknak megfeleloen, egyre jelentosebb nagyságú – az AHR-rel szorosan összefüggo – relatív Penh értéket idézett elo. Azonban az egyes csoportok relatív Penh-jének azonos mértéku változása eltéro dózisú MCh belégzésénél következett be. Leginkább a WT és KO placeboval kezelt csoportok álltak ellen a növekvo koncentrációjú MCh- nak (görbéik teljesen párhuzamos lefutásúak); a legérzékenyebbek pedig a szenzitizált WT állatokból álló csoport bizonyult. Az utóbb említettek a 25 mg/ml koncentrációjú MCh belélegzésére szignifikánsan nagyobb PBShez viszonyított Penh választ adtak, mint a placeboval kezeltek (p<0,001, n=7-10), a legnagyobb koncentrációjú MCh-t pedig már be sem lélegeztettük velük, mivel az már súlyosan veszélyeztette volna életüket is.
84
A HDC KO egerek szenzitizálás utáni válaszgörbéje a placeboval kezelt csoportok és szenzitizálás utáni WT egerek görbéi között fut, bár a statisztikai elemzések szerint a placeboval kezelt csoportok görbéitol nem különül el szignifikánsan. Az allergizálás utáni WT egerek relatív Penh válasza azonban a 25 mg/ml-es MCh belégzésénél szignifikánsan nagyobbnak (p<0,001, n=7-10) bizonyult, mint KO társaiké. A HDC KO egerek tehát kezelés nélkül hasonlóan viselkednek WT társaikhoz az AHR tekintetében, viszont a szenzitizálás szignifikánsan kevésbé hat rájuk, mint a WT társaikra.
4.2.2 Csak kis mértéku gyulladás alakul ki allergizálás után a HDC KO egerek tüdejében A különféle csoportokba tartozó egerek tüdometszeteirol készített fényképek (27. ábra, lsd. 86. old.) a szövettanilag alátámasztják a légzésfunkciós eredményeket. Tekintet nélkül a genotípusra, a placeboval kezelt csoportok tüdoszövetein nem lehetett kimutatni kóros elváltozásra utaló jeleket. Azonban a szenzitizálás és provokáció után a WT állatok tüdejében sok helyen peribronhialis, és különösen jelentos perivascularis, beszurodéseket lehet megfigyelni, amelyekbe nagyszámú eozinofil granulocita, limfocita és hízósejt látható. Ezek a jellemzok a tüdo allergiás gyulladására utalnak. A szövettani eredmények értékelését teljesen vakon végeztük, mégis – az allergiás gyulladás alapján – csaknem teljes biztonsággal el lehetett különíteni a szenzitizált WT állatok mintáit a többi csoporttól.
A kezelt KO állatok tüdoszövettani képei leginkább a placeboval kezelt állatokból készített metszetekhez hasonlítanak, bár a csoport néhány tagjánál ritkán, és viszonylag kis kiterjedésben megfigyelhetok az asztmára jellemezo szövettani jegyek is. Ezeket a viszonylag
szubjektívnek
tekintheto
eredményeket
számszeru
adatokkal
is
alátámasztottuk: 400-szoros nagyításnál megszámoltuk az egy fénymikroszkópos látótérben található eozinofil granulociták szá mát. A HDC KO egerek tüdejében szignifikánsan kevesebb (p<0,001, n=7) eozinofil granulocita volt látható egy látótérben, mint WT társaikéban (28. ábra, lsd. 87. old.) a szenzitizálás és provokáció után. (A placeboval kezelt egerek tüdoszövettani képein nem lehetett eozinofil granulocitát megfigyelni.)
85
27. ábra Az allergizált, ill. kontroll WT és KO egerek tüdejének jellemzo szövettani képei (festés: HE, objektív: 40X) A és B: allergizált WT és KO, C és D: kontroll WT és KO 86
K O k e z e lt
W T k e z e lt
0
5
1 0
1 5
2 0
28. ábra A kezelt állatok tüdometszetén egy látótérben megfigyelheto eozinofil granulociták száma *: A két csoport között szignifikáns a különbség (p<0,001, n=7)
4.2.3 A gyulladásos sejtek aránya lényegesen kisebb a HDC KO állatok BALjában, mint WT társaikéban szenzitizálás után A szenzitizálás és provokálás egyaránt megemelte a WT és a KO állatok tüdejébol kimosható sejtek számát, bár a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns: WT kontroll sejtszám: 0,8 x 106 + 0,6 x 106 sejt/ml BAL WT kezelt sejtszám:
1,2 x 106 + 0,8 x 106 sejt/ml BAL
KO kontroll sejtszám: 0,8 x 106 + 0,4 x 106 sejt/ml BAL KO kezelt sejtszám:
1,1 x 106 + 0,4 x 106 sejt/ml BAL
A különbözo csoportokba tartozó egerek tüdomosó folyadékából preparált sejtek fénymikroszkópos képei a 29. ábrán láthatók, a sejtösszetételek alakulását a 30. ábrán ábrázoltuk. Megállapíthatjuk, hogy a legnépesebb sejtpopulációt a makrofágok alkották az összes csoportban, azonban az allergizálás megnövelte a gyulladásos sejtek számát mind a WT, mind a KO egerekben. Míg a WT állatokat tekintve a kezelés mind a háromféle – morfológiai jegyek alapján elkülönített – sejttípus számbeli növekedésére statisztikailag szignifikáns hatást fejtett ki (az eozinofil granulocitáknál: p<0,001, a neutrofil granulocitáknál és a limfocitáknál: p<0,05), a KO állatokban egyik sejtféleség száma sem emelkedett szignifikánsan. A kezelés utáni állatcsoportokat összehasonlítva, a WT állatok BAL-jában lényegesen több gyulladásos sejt volt jelen, mint KO társaikban. A különbség az eozinofil és neutrofil granulociták esetén statisztikailag szignifikáns (p<0,05) volt, a limfocitáknál nem.
87
29. ábra Az allergizált, ill. kontroll WT és KO egerek BAL-jának jellemzo citológiai képei (festés: HE, objektív: 40X) A és B: allergizált WT és KO, C és D: kontroll WT és KO
Sejtszám x 105
12
WT control WT kontroll KO control KO kontroll WT OVA WT kezelt KO OVA KO kezelt
10 8
*
6
‡
4
†
2 0 MF
Eo
Ne
Ly
30. ábra Az allergizált, ill. kontroll WT és KO egerek BAL-jának sejtösszetétele *: A WT egerek allergizált ill. placeboval kezelt csoportjai között (p<0,001), továbbá a kezelt WT és HDC KO egerek között (p<0,05) szignifikáns az eltérés. †: A WT egerek allergizált ill. placeboval kezelt csoportjai között (p<0,05), továbbá a kezelt WT és HDC KO egerek között (p<0,05) szignifikáns az eltérés. ‡: A WT egerek allergizált ill. placeboval kezelt csoportjai között (p<0,05) szignifikáns az eltérés. 88
A BAL sejtösszetételének elemzése beleilleszkedik az eddigi eredmények által festett képbe. A hisztamin hiányában kisebb mérvu AHR tud csak kialakulni a szenzitizálás és provokáció hatására, amelynek egyik fo oka valószínu a tüdo kisebb mértéku allergiás gyulladásában keresendo. Ez együtt jár azzal is, hogy a BAL-ban kevesebb gyulladásos sejt jelenik meg. Érdekes, hogy a tüdoszövetben megfigyelt elváltozások sokkal szembeötlobbek, mint a BAL-ban bekövetkezok.
4.2.4 A limfociták közül elsosorban a CD3+ T sejtek arányát emeli a kezelés A BAL sejtes elemeinek morfológiai vizsgálatai szerint különbségek vannak a különbözo egércsoportok között a limfociták számában. Ez felveti a kérdést, hogy milyen arányban vannak érintve a különféle limfocita szubpopulációk. A kérdés megválaszolására a sejteket FACS készülékkel analizáltuk. A 31. ábrán a különbözo markereket viselo limfociták BAL-ban mért arányai láthatók.
12,0
WT placebo KO placebo
10,0
WT kezelt KO kezelt
Százalék
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0 CD3
b220
NK
31. ábra Az allergizált, ill. kontroll WT és KO egerek BAL-jában található limfociták vizsgálata FACS-szal
Az összes állat BAL-jában a legnagyobb populációt a CD3+ T sejtek alkották, de mellettük a b220+ B sejtek is jelen voltak. Az NK sejtek száma ebben a rendszerben a detektálási határ körüli volt. Bár mérési eredménye ink nem bizonyító erejuek, mivel az egyik markerrel jelölt sejtek elofordulási gyakorisága (és száma) között sincs
89
statisztikailag szignifikáns különbség, mégis valószínusítheto, hogy a leginkább CD3+ T sejteknek köszönheto az egyes állatcsoportok limfocita számai közötti különbségek.
4.2.5 A KO állatok szignifikánsan kevesebb allergén specifikus IgE-t termelnek az allergizálás után, mint WT társaik A
B Szérum OVA-specifikus IgE tartalom
9000
0,9
8000
0,8
7000
0,7
6000
0,6
5000
0,5
Unit
(ng/ml)
Szérum IgE koncentráció
4000
0,4
3000
0,3
2000
0,2
1000
0,1
0
*
0 WT placebo KO placebo WT kezelt
KO kezelt
WT placebo KO placebo WT kezelt
KO kezelt
32. ábra Az allergizált, ill. placeboval kezezelt WT és KO egerek szérumának A: össz IgE koncentrációja, B: OVA specifikus relatív IgE mennyisége *: a kezelt WT és HDC KO egerek között (p<0,001) szignifikáns az eltérés.
Az allergiás immunválaszban a szervezet IgE izotípusú ellenanyagot termel az allergén ellen, amely megfigyelheto volt kísérleti rendszerünkben is: a kezelt állatok szérum össz IgE koncentrációja magasabb volt a kontroll csoportokénál (32/A. ábra). Bár – a nagy szórás miatt – egyik állatcsoport szérum össz IgE mennyisége között sem volt szignifikáns különbség, a legmagasabb koncentrációt kétség kívül az allergizált WT állatokban érte el.
A szérum allergén specifikus IgE szintje (32/B. ábra) hasonló trend szerint alakult kísérleteinkben, mint az össz IgE koncentráció; azonban igen markáns különbségek voltak megfigyelhetok. A WT állatok szérumja szignifikánsan több OVA specifikus IgE-t tartalmaztak, mint a HDC KO-ké (p<0,001) a szenzitizálás és provokáció után, bár kétségkívül valamennyi ellenanyag az utóbbi csoportban is kimutatható volt. Az 90
allergénnel nem érintkezett, kontroll csoportokban – a vártnak megfeleloen – nem lehetett allergén specifikus IgE-t észlelni, még akkor sem, ha a mintákat 750-szer töményebben mértük, a kezelt csoportok szérumainál. Ezek a megfigyelések egyértelmuen alátámasztják, hogy a HDC KO egerek IgE termelo képessége abnormálisan gyenge.
4.2.6 A KO állatok citokin és kemokin génexpressziós profilja jelentosen eltér a WT állatokétól
33. ábra A különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. kontroll egerek tüdejében expresszálódó kemokinek mérése Super Array-vel. Az egyes pontokban levo kemokinek neveit a 13. táblázat, a housekeeping génekhez (G3-G8, E8, G8 pontok) viszonyított relatív expresszióját a 34. ábra tartalmazza. A: WT kontroll, B: HDC KO kontroll, C: WT kezelt,
Annak
érdekében,
D: HDC KO kezelt
hogy
pontosabb
magyarázatot
adhassunk
eddigi
megfigyeléseinkre – tudniillik hogy a HDC KO egerekben lényegesen gyengébb késoi asztmás tünetek alakulnak ki, mint WT társaikon – génexpressziós vizsgálatokat 91
végeztünk a különbözo genotípusú allergizált és placeboval kezelt egerek tüdejébol. A 33. ábrán a kemokinek expressziós méréseinél kapott Super Array membránok autoradiogramjainak fényképeit mutatjuk be.
4.2.6.1 Kemokin expresszió (34. ábra) Összesen 18- féle kemokin volt kimutatható a vizsgált állatcsoportok tüdejébol izolált egyesített RNS mintáik valamelyikébol, de közülük 4- féle kemokin (nem összehasonlítható kemokinek) szintje csak bizonytalanul volt detektálható az egyes csoportokban. 5-féle kemokin szintje az összes állatcsoportban a kimutathatóság alatt volt (13. táblázat).
Értékelheto kemokinek Nem összehasonlítható kemokinek
Nem kimutatható kemokinek
6 Ckine-ser MCP-3 Lymphotactin MIP-1r GRO-1 MIP-3? Eotaxin MIG I-309 MIP-2 MCP-5 TECK Eotaxin-2 MIP-1? MIP-1? Fractalkine PF-4 IP-10 RANTES MCP-1 SDF-1 MCP-2 SDF-2 13 táblázat Az allergizált, ill. kontroll WT és KO egerek tüdejébol Super Array-vel vizsgált kemokinek
A WT csoportokat összehasonlítva egymással 12- féle kemokin expressziójában volt szignifikáns különbség. A 6 Ckine-ser, PF-4, SDF-1 és SDF-2 szintje allergizálás elott; az IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIG, MIP-1? , eotaxin és eotaxin-2 szintje pedig utána emelkedett szignifikánsan.
A KO csoportok között 7- féle kemokinexpresszióban volt szignifikáns eltérés. A 6 Ckine-ser, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIG expressziós változásai hasonló irányúak voltak a WT egerekben tapasztaltakhoz. (A MIP-1? , PF-4 és SDF-1 expresszióban nem volt szignifikáns eltérés.) Az SDF-2 az allergizálás után ért el nagyobb mennyiséget a KO csoportoknál. A fractalkine mennyisége a kezelés következtében csökkent. (Éppen szignifikáns eltérés.)
92
Az allergizált csoportok esetén szintén 6 kemokin expressziója tért el egymástól szignifikánsan. Az eotaxin, eotaxin-2 és MCP-3 szintje a WT; az MCP-2, MIG és SDF2 a KO állatok tüdejében ért el magasabb szintet.
4.2.6.2 Citokin expresszió (35. ábra) A vizsgált 23- féle citokin közül 15-nek volt mérheto és értékelheto szintje. 4- féle citokin expresszióját a méréspontok közötti nagy hibáknak köszönhetoen nem lehetett értékelni, bár ezek is kétségkívül kimutathatóak voltak; és további 4- féle citokin expressziója egyik állatcsoportban sem haladta meg a kimutatási határnak definiált 1 %os értéket (a GAPDH- hoz viszonyítva) (14. táblázat).
Értékelheto citokinek
Nem összehasonlítható citokinek
Nem kimutatható citokinek
IL-15 IL-4 IL-11 G-CSF IL-9 IL-1? IL-16 IL-10 IL-3 IL-12B IL-1? INF-? IL-2 IL-17 IL-5 IL-18 IL-6 LT-? IL-7 TNF-? IL-12A TNF-? IL-13 14. táblázat Az allergizált, ill. kontroll WT és KO egerek tüdejébol Super Array-vel vizsgált citokinek
A WT csoportokat összehasonlítva 7- féle kemokin expressziójában volt szignifikáns különbség. Az IL-2, IL-7, IL-13 RNS mennyisége allergizálás elott; az IL1? , IL-1? , IL-5, IL-6 szintje pedig utána volt szignifikánsan magasabb. Az IL-6 az allergizálás elott ki sem volt mutatható a WT állatokban.
A KO csoportok között 8- féle citokinexpresszióban volt szignifikáns eltérés. Az IL-1? és IL-5 expressziós változásai hasonló irányúak voltak a WT egerekben tapasztaltakhoz. (Az IL-1? expresszióban nem volt szignifikáns eltérés.) Az IL-2, IL-7 szintjei – a WT csoportoktól eltéroen – az allergizálás után értek el szignifikánsan nagyobb mennyiséget a KO csoportoknál. (Az IL-13 szintjei is hasonlóan alakultak, de a változás nem érte el a kétszerest, ezért nem volt szignifikáns.) Az IL-15, IL-17, IL-18
93
expressziójára az allergizálás szintén serkentoleg hatott. Az IL-12A pedig csak allergizálás elott volt kimutatható a KO csoportokban, így az allergizálás szignifikánsan gátolta expresszióját.
Az allergizált csoportok 9 citokin expressziójában tértek el egymástól szignifikánsan. Az IL-1? , IL-1? , IL-5, IL-6 szintje a WT; az IL-2, IL-7, IL-13, IL-17, TNF-?
a KO állatok tüdejében ért el magasabb szintet. (A TNF-? expressziós
különbsége éppen nem volt szignifikáns.) Allergizálás után az IL-5-öt és IL-6-ot csupán a WT állatcsoportban, az IL-12A-t és IL-17-et pedig a KO-kban lehetett detektálni.
94
GAPDH-hoz viszonyított expresszió (%)
34. ábra A különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. kontroll egerek tüdejében expresszálódó kemokinek relatív expressziója *: WT kontroll: 56, KO kontroll:58
§: KO allergizált: 80
95
GAPDH-hoz viszonyított expresszió (%)
35. ábra A különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. kontroll egerek tüdejében expresszálódó citokinek relatív expressziója *: WT allergizált: 158 §: WT kontroll: 121, KO kontroll: 72, WT allergizált: 74, KO allergizált: 85
96
4.2.7 A KO állatok tüdejébol szignifikánsan kevesebb INF-? és IL-4 mutatható ki allergizálás után, mint WT társaikból
Mivel a Super Array vizsgálatokkal a két legfontosabbnak tartott citokin, az INF-? és IL-4 RNS expressziója nem volt megbízhatóan mérheto a kísérleti állatok tüdejeibol, fehérjeszintu vizsgálatikat is elvégeztük (36. ábra).
Megállapíthatjuk, hogy a kezeletlen állatcsoportok tüdejében közel egyforma mennyiségu INF-? volt jelen. Azonban míg allergizálás hatására az INF-? szintje szignifikánsan megemelkedett a WT állatokban, addig a KO-kban továbbra is alapszinten maradt. Ezáltal nemcsak a kétféle WT csoportban mérheto INF-? mennyiségek tértek el szignifikánsan egymástól, hanem a KO és WT állatok között is szignifikáns a különbség allergizálás után.
Az IL-4 mind a kontroll, mind a kezelt egércsoportok esetén szignifikánsan kisebb koncentrációban volt jelen a KO állatok tüdejében, mint a WT egerekben. Az allergizálás hatására mindkét genotípusú csoportban szignifikánsan emelkedett a mennyisége.
97
WTcontrol kontroll WT KOcontrol kontroll KO WTOVA allergizált WT KO KOOVA allergizált
pg/mg tüdo fehérje
14 12
* †
10 8 6
‡
4
§
2 0
INF-?
IL-4
36. ábra Az INF-? és IL-4 fehérje mennyisége a különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. kontroll egerek tüdejében, a tüdo fehérjetartalmára vonatkoztatva *: A WT egerek allergizált ill. placeboval kezelt csoportjai között, továbbá a kezelt WT és HDC KO egerek között szignifikáns az eltérés (p=0,02). †: A WT egerek allergizált ill. placeboval kezelt csoportjai között (P=0,004), továbbá a kezelt WT és HDC KO egerek között (p=0,04) szignifikáns az eltérés. ‡: A KO egerek allergizált és placeboval kezelt csoportjai között (P<0,001) szignifikáns az eltérés. §: A kontroll WT és HDC KO egerek között szignifikáns az eltérés (p=0,02).
98
5 Diszkusszió 5.1 Populációgenetikai vizsgálatok 5.1.1 Az asztma populációgenetikai vizsgálatai Számos tanulmány bizonyította már, hogy a kemokinek és receptoraik az asztma patomechanizmusának aktív résztvevoi. A RANTES promoterében (75, 76) leírtak két olyan polimorfizmust – a -28 C/G-t és -403 G/A-t –, amelyek – in vitro rendszerben – a RANTES transzkripciójának növekedéséhez vezettek. Ráadásul a RANTES – az MCP1-gyel együtt – az asztmával kapcsoltságot mutató génklaszterban helyezkedik el (31). Kísérleteinkben azonban ne m tudtunk semmilyen kapcsoltságot kimutatni a RANTES promoterének egyik vizsgált mutációja és az asztma, vagy allergia között a Budapesten élo
asztmás
gyermekek
körében.
Nem
találtunk
továbbá
összefüggést
a
polimorfizmusok és a betegek vizsgált klinikai, vagy biológiai jellemzoi között sem. Eredményeink alapján lehetséges, hogy in vivo a RANTES sokkal kevésbé fontos az asztma, vagy allergia kialakulásának szempontjából, mint azt korábban gondolták. Távolról erre utalnak állatkísérletes eredményeink is, melyek szerint a lokális, majd a szisztémás szenzitizálás alig indukálja a RANTES expresszióját a tüdoben.
A RANTES promoterében számos cis z-aktivációs elemet találtak (427), amelyek befolyásolják expresszióját, valamint az is ismert, hogy a különféle sejttíp usokban igen eltéro mennyiségben termelodik. Lehetséges, hogy azokban a sejtekben (pl. légúti epitél sejtek), melyek az asztma/allergia patomechanizmusának aktív és tömeges résztvevoi, az általunk vizsgált lókuszok kevésbé fontos szabályozó szerepet töltenek be. Az is elképzelheto, hogy – a polimorfizmusok által kiváltott – emelkedett RANTES szint elenyészoen kicsi ahhoz képest, melynek kimutatható fiziológiás hatása lenne.
A
RANTES
receptorának,
a
CCR5-nek,
egy
32
bp-nyi
deléciójáról
ellentmondásos kísérleti eredmények láttak napvilágot: Hall és mtsai. szerint – akik skót gyermekeket vizsgáltak – a CCR5? 32 allélt hordozó egyének kisebb kockázattal lesznek asztmások (81), mint az azt nem hordozók. Mitchell és mtsai. eredményei (82) alapján azonban – nyugat-ausztráliai és dél-angol családoknál –, nincs kapcsolat a deléció és az atópia, vagy asztma között. Mivel a CCR5 – a RANTES hatásának fo 99
közvetítojeként – az allergiában/asztmában valószínuleg meghatározó szereppel rendelkezik, a deléció pontos szerepeinek tisztázása elengedhetetlen genomikai feladat. Eredményeink szerint (83) – összhangban Mitchell és mtsai. eredményeivel – a deléció nem véd az asztmával, vagy allergiával szemben, és nem csökkenti a betegség kialakulásának kockázatát sem. Megfigyeléseink tehát ellentmondanak Hall és mtsai. (81) eredményeinek. Ennek pontos okai ismeretlenek, valószínuleg a skót és magyar egyének eltéro génállományában, illetve az eltéro környezeti feltételekben keresendok.
Az eddigiekhez hasonlóan nem tapasztaltunk eltérést sem az allélfrekvenciában, sem pedig a genotípus eloszlásban az egészséges kontroll, a nem-asztmás allergiás, vagy az asztmás egyének között: a TNF-? promoterének -308A, vagy a nagy affinitású IgE receptor ? láncának +541C polimorfizmusa vizsgá lata során. (Az eredmények ismertetésétol eltekintettünk.) Az elobb említett polimorfizmus a TNF-? promoterének erosödéséhez vezethet (66, 67), így növelve a TNF-? szintjét a szervezetben. Az utóbbi a receptor molekula ? láncában aminosav cserével jár (181 Ile/Leu) (70), ezáltal – egyes feltételezések szerint – a hízósejtekbol és bazofil granulocitákból emelkedett hisztamin szintézist válthat ki. A Budapesten élo gyermekek körében végzett kísérleteink azt támasztják tehát alá, hogy ezeknek az – amúgy is vitatott jelentoségu – polimorfizmusoknak sincs univerzális, jelentos szerepe az allergia, vagy asztma kialakulásában.
Az MCP-1-rol több klinikai tanulmányban is leírták már, hogy mennyisége az asztmás válsz során emelkedik (351). Stimuláció által kiváltott termelésében (pl. citokin stimuláció) pedig igen jelentos eltérések mutatkozhatnak a különbözo egyének között (351). Vizsgálataink szerint, amelyeket a Budapesten élo asztmás gyermekeken végeztünk, az MCP-1 promoterének -2518-as lokuszában G nukleotidot hordozó gyermekek körében az asztma kialakulásának kockázata szignifikánsan emelkedik. Továbbá az MCP-1 G allél megléte szoros összefüggésben van az asztma súlyosságával is. A megfigyelés valószínuleg a mutáció következtében a szervezetben megemelkedett MCP-1 mennyiségével áll közvetlen összefüggésben. Ugyanis in vitro kísérletek szerint az MCP-1 -2518-as mutációja A-ról G nukleotidra a molekula transzkripciójának emelkedéséhez vezet (85). Az MCP-1-et elsosorban a tüdo endotél és epitél sejtjei termelik (319, 326, 327). A Th2 kemokinek közé tartozik (338, 352), mivel képes a
100
differenciálatlan T sejtek érését Th2 irányba tolni (352), és receptorát – a CCR2-t – foleg Th2 sejtek hordozzák. Hatásait pl. bazofil granulociták és hízósejtek (355) aktiválása révén fejti ki, amelyekbol leukotrién C4-et és hisztamint szabadít fel. Ezek a mediátorok állhatnak annak hátterében is, hogy az MCP-1 – állatkísérletek szerint – igen fontos szerepet tölt be az AHR kialakulásában (349, 354, 355). Az MCP-1 neutralizálása eredményeként draszt ikusan csökkent az AHR, a limfocita eredetu gyulladásos mediátorok szintje, valamint a T sejt és eozinofil granulociták tüdobe toborzása (349, 350). Az MCP-1 kezelés viszont a légúti ellenállás szignifikáns, dózisfüggo emelkedéséhez vezetett és magas hisztamin szinttel járt (354, 355). Állatkísérletes rendszerünkben is, melyben az allergia/asztma modellezése volt az egyik cél, az MCP-1 expressziója drasztikusan megemelkedett az allergén kezelés következtében az állatok tüdejében. Kísérleti eredményeink tehát az irodalmi adatokkal együttesen alátámasztják, hogy a mutáció következtében létrejött emelkedett MCP-1 szint valóban a betegség kialakulásának nagyobb kockázatához és súlyosabb fenotípus kialakulásához vezethet.
Annak érdekében, hogy pontosabb magyarázatot találjunk a G allél klinikai szerepeire, megvizsgáltuk asztmás betegeink néhány klinikai és biológia jellemzoit. Az MCP-1 promoterének genotípusa egyedül a vér eozinofil granulocita összetételével és mennyiségével mutatott statisztikailag szignifikáns összefüggést. Az MCP-1-rol feltételezik, hogy az eozinofil granulociták kemotaxisának mind közvetlen (320), mind közvetett (352-354) szabályozásában egyaránt fontos szerepet tölt be. Az eozinofil sejtszint emelkedését is már többen bizonyították az asztmában. Kísérleteink alátámasztják, hogy az eozinofil granulociták számbeli növekedése, és a mutáció következtében megemelkedett MCP-1 szint között összefüggés lehet. Ugyanis, bár az asztma súlyossága és az eozinofilek mennyisége között – az irodalmi adatokho z hasonlóan (354) – mi is találtunk összefüggést, az egy súlyossági kategóriába sorolt asztmásokban mért eozinofil szint a G allél megjelenésével együttesen is emelkedett. Az eozinofil sejtszám növekedése mindenesetre, nem kizárólagosan a mutációnak, hanem a betegség súlyosbodását eloidézo egyéb tényezoknek is köszönheto, hiszen komplex jelenségrol van szó. Erre utal, hogy az egyes betegségkategóriák közötti átlag eozinofil sejtszám a genotípustól függetlenül is változott. A G alléllal összefüggésben meg kell említenünk, hogy kisebb mértékben ugyan, de a nem-asztmás allergiás betegekben
is
korrelált
az
eozinofilek
mennyisége 101
az
allél
frekvenciájával
(statisztikailag nem szignifikáns különbség). Lehetséges, hogy az MCP-1 -2518 G allél a nem asztmások körében sokkal kisebb hatást fejt ki.
Vizsgálataink szerint az MCP-1 G allél kizárólagosan az asztmával mutatot kapcsoltságot, az atópiával nem. A mutáció elofordulási gyakorisága ugyanis a nemasztmás allergiás gyermekek körében – akik vizsgálatainkban atópiásak is voltak – statisztikailag nem különült el a kontroll csoporttól. Sot, az asztmás egyénekben nemcsak a kontroll csoportnál volt szignifikánsan nagyobb volt a G allél elofordulási gyakorisága, hanem a nem-asztmás allergiás csoportokhoz viszonyítva is; tehát az atópia meglététol függetlenül. Továbbá a G allél frekvenciája azok körében is magasabb volt, akik asztmások ugyan, de nem atópiások. Ezek az eredmények hasonló irányba mutatnak a kapcsoltsági analízisekbol származókkal (31), amelyek az asztma és a 17p11.1-q11.2 kemokin génklaszter közötti kapcsoltságra rámutatnak, viszont az atopiával nem hozzák összefüggésbe ezt a génterületet. (Az MCP-1, az említett klaszterban a 17q11.2 helyen található.)
Eredményeink szerint az MCP-1 promoterének -2518-as G mutációja domináns öröklodésmenetet mutat az asztma kialakulásának kockázatával kapcsolatban, mivel a homozigóta GG genotípus, a heterozigóta GA genotípushoz hasonló nagyságú esélyhányadossal (OR a GA genotípusnál: 2,4; OR a GG genotípusnál: 2,7) járult hozzá a betegség kialakulásához. A betegség súlyosságával, és az eozinofil granulociták szintjével
kapcsolatban
viszont
nem
domináns,
hanem
inkább
intermedier
öröklodésmenet mutatható ki, hiszen a heterozigóta GA genotípushoz tartozó mennyiségek általában a homozigóta allélokhoz tartozók közöttiek. Az utóbbi megfigyelések
összhangban
vannak
a
polimorfizmus
in
vitro
vizsgálatainak
eredményével (85), amely szerint a G allél dózisfüggoen emeli a molekula expresszióját.
Természetesen, eredményeink alapján, egyáltalán nem zárható ki, hogy az MCP-1 -2518 G allél teljesen ismeretlen mechanizmusok útján vezet az eddig ismertetett jelenségekhez. Lehetséges, hogy nem is az eozinofil granulociták révén jut érvényre. (Így az öröklodésmenetben lévo ellentmondást is megmagyarázható.) Sot kísérleti rendszerünkben az sem nyert bizonyítást, hogy ez a mutáció a valós oka
102
megfigyeléseinknek, és nemcsak egyszeruen egy markere az asztmának, amely kapcsoltságban van egy – az asztmában tényleg nagy fontossággal bíró – alléllel.
5.1.2 Az AEDS populációgenetikai vizsgálatai Nickel és mtsai. szerint az AEDS és a RANTES -403A allél közözött kapcsoltság van a német gyermekek körében (75). Ez az eredmény beleillik a RANTES eddigiekben ismertetett lokalizációja, valamint az allergia és az AEDS patome chanizmusában betöltött esszenciális funkciói alapján kialakított elképzelésbe, mivel a -403A allél – a 28G allélhez hasonlóan – növeli a RANTES transzkripcióját (75, 76). Saját kísérleteinkben (amelyeket a Budapesten élo magyar gyermekeken végeztünk) azonban nem tudtuk reprodukálni a Németországban kapott eredményeket. Sem a RANTES 403A, sem pedig a -28G allél és az AEDS között nem tudtunk semmilyen kapcsolatot kimutatni. Az ellentmondásos eredmények sokféleképpen magyarázhatóak, bár kétségkívül igaz, ho gy a vizsgált német és magyar populáció genetikai állománya hasonló, mivel egyaránt kaukázusi; továbbá történelmünk során többször volt német bevándorlás hazánkba. Az egyik leghihetobb magyarázatot talán az eltéro környezeti feltételek adják, mivel ezek felbecsülhetetlenül fontosak a betegség kialakulásában, és expresszivitásában. Ezt szembetunoen illusztrálja az a német példa, miszerint a korábbi NDK-ban az allergia elofordulási gyakorisága alulmaradt a fejtett országokban tapasztaltakhoz képest, de az egyesülés után fokozatosan elérte szintjüket (118). Továbbá azok a tények is alátámasztják, hogy az AEDS országok között igen eltéroen manifesztálódik. A RANTES promoter mutációinak pontos szerepeinek tisztázásához további, nagyszabású vizsgálatokra lenne szükség többféle népcsoport bevonásával.
Az MCP-1 allergiában/asztmában betöltött szerepérol már boven esett szó. Az AEDS patomechanizmusa sok ponton átfed az asztmáéval, melyek nagy részében az MCP-1-nek is fontos feladatok jutnak. Az MCP-1 ilyen funkciói közé tartozik pl.: az immunrendszer Th2 irányú polarizálása (352), az eozinofil granulociták migrációjának szabályozása (21, 353, 354), a bazofilek és hízósejtek aktiválása (355). Mivel az MCP-1 promoterének -2518 G allélja és az asztma között kapcsolatot találtunk, lehetségesnek tartottuk, hogy a G allél az AEDS kialakulásában is szerepet játszik. Vizsgálatainkban azonban nem tudtuk megerosíteni hipotézisünket: az MCP-1 -2518G allél nem
103
öröklodik kapcsoltan sem az AEDS-sel, sem pedig a betegség egyik vizsgá lt klinikai vagy biológiai jellemzojével sem (73).
5.2 Az asztma állatkísérletes modellezése Az egyhónapos szenzitizálás után 1 nappal a WT állatokban szignifikánsan megemelkedett az AHR, viszont a KO egerekben csak gyenge emelkedést mutatott az allergénnel nem kezelt, kontroll csoportokhoz képest. Míg az allergizált WT állatok tüdejében a szenzitizálást követo allergénprovokáció után 5 órával az asztma hisztopatológiai jegyei voltak felismerhetok, addig a KO állatok tüdoi szintén a kontroll csoportokhoz hasonlítottak inkább. A KO állatok csökkent allergiás válaszát támasztották alá a BAL sejtes elemeinek vizsgálatai is. A KO állatok BAL-jában a gyulladásos sejtek kisebb számban és arányban voltak jelen a szenzitizálás és provokáció után, mint a WT állatokéban.
Az allergiás/asztmás betegségekben a domináns, a tünetek kialakulásáért leginkább felelos sejttípusok: az eozinofil granulociták és a hízósejtek. Aktivációjuk során olyan mediátorok szintetizálódnak és termelodnek, melyek a tüdo akut, allergiás gyulladásához vezetnek (147, 223). Az eozinofil granulociták, kísérleti eredményeink szerint, szignifikánsan kisebb arányban voltak megfigyelhetok az allergizálás után a HDC KO egerek BAL-jában és tüdejében a WT csoporthoz képest. Bár a hízósejtek direkt nyomonköve tésével kísérleteinkben nem foglalkoztunk, korábbi eredmények szerint, a HDC KO egerek hízósejtjeinek fejlodése, degranulációja és granulum összetétele egyaránt abnormális (411). A hízósejteket a leghatékonyabban az allergénekkel keresztkötött IgE molekulák képesek aktiválni, melyeket a hízósejtek nagy affinitású IgE receptorukkal (Fc?RI) kötnek meg felszínükön. A KO állatokban nemcsak a hízósejtek fejlodésében és muködésében vannak problémák, hanem – kísérleteink szerint – allergén specifikus IgE szintjük is messze alulmarad a WT egerekhez képest az allergizálás után. Tehát a hízósejtek aktiválódása két úton is gátolt a KO egerekben: a hízósejt és az IgE oldaláról. Feltételezheto tehát, hogy ezek a jelenségek direkt módon hozzájárulnak az állatokban megfigyelt csökkent allergiás válaszhoz, bár lehetetlenség megjósolni, milyen mértékben. Mások által végzett kísérletek szerint, hízósejt hiányos állatokon OVA szenzitizálással a WT egerekhez hasonló asztmás tünetek (AHR, szérum OVA-specifikus IgE szint, BAL és tüdo 104
eozinofilia) idézhetok elo (41). Továbbá a krónikus asztma kialakulásához az IgE sem nélkülözhetetlen (12, 25). Meg kell azonban jegyeznünk, hogy az elobb említett eredményeket részben C57BL/6 törzshöz tartozó egereken végezett kísérletekbol kapták, amelyek egyébként is jelentos genotípusbeli eltéréseket (pl. pont mutáció a hízósejt proteáz 7 génj ében) hordoznak az – általunk is alkalmazott – BALB/c törzshöz képest, ezért még ezek az állatkísérletes eredmények sem vihetok át egy az egyben saját rendszerünkre. Egyes feltételezések szerint ugyanis, a C57BL/6 törzsben az AHR nem hízósejt-függo útvonalon alakul ki (86), míg a BALB/c állatokban a hízósejteknek fontos szerepet tulajdonítanak az asztma kialakulásában.
Eredményeink szerint az endogén hisztaminnak megkülönböztetoen fontos hatásai vannak az exogén hisztaminhoz képest. Ha ugyanis a HDC KO állatoktól megvontuk a hisztamin mentes diétát, és "normál" táppal etettük oket, hasonlóan csökkent asztmás tüneteket mutattak, mint diétán tartott társaik, noha – korábbi kísérletek szerint – a hisztamint tartalmazó tápon élo egerek szöveteiben a hisztamin kimutatható (409).
Amellett, hogy az asztma effektor fázisában az eozinofilek és hízósejtek esszenciálisak – a mai álláspont szerint – a betegség kialakulásának irányításában a T sejtek az elsodlegesek (21, 25). Bár a WT és KO állatok BAL-jában a vizsgált limfociták számában a különbség nem volt statisztikailag szignifikáns, kétségkívül több limfocita volt a WT, mint a KO állatokban az allergizálás után. A limfociták FACS elemzései szerint a domináns limfocita típust valóban a CD3+ T sejtek alkották, és nem a B sejtek. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hisztamin in vivo, komplex módon, az asztma kialakulásában fontos csaknem valamennyi sejtféleség muködésére hatást gyakorol: nemcsak az effektor sejtek, hanem már az immunreguláló T sejtek révén is részt vesz az asztma patomechanizmusának szabályozásában. A hisztamin egész asztmás választ átható szerepeinek pontosabb megértéséhez megvizsgáltuk a gyulladás helyén expresszálódó fontosabb citokinek és kemokinek az expresszióját, valamint az immunpolarizációs egyensúlyban legfontosabbnak tartott két citokin – az IL-4 és az INF-? – fehérjéjének mennyiségeit a különbözo állatcsoportokban.
A vizsgált 23-23-féle citokin és kemokin expressziója közül 15 citokin és 14 kemokin volt értékelhetoen jelen az összes állatcsoportban. Mivel az egyes
105
állatcsoportok között jelentos különbségek adódtak a génexpressziós mintázatban, bebizonyosodott, hogy valóban az immunrendszer komplex megváltozása lehet a KO állatok csökkent allergizálhatóságának (és IgE termelésének) alapja. A nagyszámú mért citokin és kemokin relatív mennyiségeit többféle oldalról is megpróbáltuk értelmezni: külön vizsgáltuk az immunpolarizációban szerepetjátszó molekulákat, valamint az asztma patomechanitmusában már ismerteket, különös tekintettel azokra, amelyek expressziós változásait – más tanulmányok szerint – a hisztamin befolyásolja.
Az allergia/asztma kialakulása elotti immunpolarizációs viszonyok dönto mértékben befolyásolhatják az allergia/asztma kialakulását. A legvalószínubbnek tuno feltételezések szerint a Th1 irányba eltolódott immunrendszerben lényegesen nehezebben alakulnak ki allergiás betegségek. Azonban a kór kialakulása után a Th1 immunpolarizáció már nem védo, hanem súlyosbító hatásokat fejt ki. A hisztamin hiányos HDC KO egerek Th1 immunpolarizációjának már több bizonyítékát is ismerjük (411, 416-418). Kísérleteink kiértékelésénél mi is megvizsgáltuk, hogy az allergia modellrendszerében is megfigyelheto-e ez a jelenség. Az immunpolarizációban fontosabbnak vélt kemokinek és citokinek expresszióját az 37. és 38. ábrán mutatjuk be. Mivel az IL-4 és INF-? RNS mérése nem volt értékelheto az összes csoportban, ezeknél a citokineknél a fehérje expressziót vettük alapul (36. ábra).
A kemokinek expressziói elég egyértelmuen alátámasztják, hogy hisztamin hiányában az immunrendszer Th1 irányba polarizálódik. Már a placeboval kezelt csoportokat összehasonlítva is a Th1 kemokinek a KO, a Th2 kategóriába tartozók pedig, a WT egerekben expresszálódnak inkább. (Jelentosebb kivételt csak a MIG képez a kontroll csoportok között.) A szenzitizálás és provokáció ráadásul még emelte is ezeknek a kemokineknek a tüdoben mért expresszióját, de több kemokinnél oly módon, hogy a Th1 kemokinek a KO állatokban, a Th2-k pedig a WT egerekben emelkedtek inkább.
Az immunpolarizációban fontosnak tartott citokinek kontroll csoportokban mért expressziójából nem vonható le olyan éles következtetés, mint a kemokin expressziókból. Mindenesetre a Th1 immunpolarizációban legfontosabbnak vélt INF-? fehérjéjének mennyiségei egyformának tekinthetok a két kontroll csoportban; a Th2
106
eltolódás karmestereként számontartott IL-4 fehérjeszintu megjelenése viszont egyértelmuen a WT egerek tüdejében a magasabb. A szenzitizálás és provokáció a citokin mintázatban olyan változást idézett elo, amely – a kemokinek expressziójához hasonlóan – nagyban alátámasztja a hisztamin Th2 immunpolarizáló szerepét: a Th1 citokinek a KO, a Th2 citokinek pedig a WT állatok tüdejében domináltak inkább. Kétféle citokin expressziója – az INF-? és az IL-13 – azonban eltér a várt trend tol: a KO állatok tüdejébol kevesebb INF-? fehérje és több IL-13 RNS volt mérheto. Az IL-13-nak különösképpen összetett szerepe van mind az immunpolarizációs viszonyok, mind az asztma/allergia tüneteiért felelos molekulák szabályozásában, ezért expressziós változásaival még részletesebben foglalkozunk. Az asztma korai fázisa Th2 immuneltolódás közepette jön létre, de – az általunk is vizsgált – késoi fázist kevert Th1 és Th2 reakciónak tartják, melyben az INF-?-nak alapvetoen fontos szerepet tulajdonítanak (25, 126). Lehetséges, hogy a késoi fázisban azért alakult ki alacsonyabb INF-? szint a HDC KO egerekben a WT állatokhoz képest, mert szervezetükben az asztma kialakulása egy korai ponton elakadt, ezért immunrendszerükben nem figyelheto meg a kevert reakció. Th1
Th2
GAPDH-hoz viszonyított expresszió (%)
100 WT placebo 90
KO placebo WT allergizált
80
KO allergizált
70 60 50 40 30 20 10 0 IP-10
MIG
MIP-1alfa
MCP-1
MCP-3
Eotaxin
Eotaxin-2
37. ábra Az immunpolaritációs egyensúlyben fontosnak tartott kemokinek expressziója a különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. placeboval kezelt egerek tüdejében : A WT és KO kontroll csoportok között szignifikáns (2-szeres) az eltérés. : A WT és KO allergizált csoportok között szignifikáns (2-szeres) az eltérés. 107
Th1
Th2
GAPDH-hoz viszonyított expresszió (%)
35
WT placebo KO placebo WT allergizált KO allergizált
30
25
20
15
10
5
0 IL-2
IL-7
IL-15
IL-18
IL-5
IL-13
38. ábra Az immunpolaritációs egyensúlyben fontosnak tartott citokinek expressziója a különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. kontroll egerek tüdejében : A WT és KO kontroll csoportok között szignifikáns (2-szeres) az eltérés. : A WT és KO allergizált csoportok között szignifikáns (2-szeres) az eltérés.
Nem utolsó sorban még egyszer fontos megemlíteni, hogy allergizálás után a KO egerekben szignifikánsan kevesebb szérum OVA specifikus IgE antitestet és BAL eozinofil granulocita volt kimutatható, mint WT társaikban. Mivel ezeket szintén a Th2 irányú immunválasszal hozzák összefüggésbe, ezek az eredmények szintén utalnak az immunrendszer hisztamin hiányában történo Th1 irányú eltolódására. Összefoglalva az immunpolarizációban szerepet játszó citokinek és kemokinek expresszióiról alkotott elképzeléseinket: a hisztamin hiánya nagy vonalakban, globálisan valóban kedvez a Th1 irányú immunpolarizációnak, és ezáltal védelmet jelent az asztma kialakulásával szemben; de ez a szabály nem alkalmazható mechanisztikusan minden egyes molekulára. Továbbá – mint ahogyan az irodalmi bevezetésbol is kitunik – tisztán az immunpolarizációs
státusszal
lehetetlen
megbetegedéseket.
108
jellemezni
az
allergiás/asztmás
GAPDH-hoz viszonyított expresszió (%)
39. ábra Az allergizált csoportok között szignifikáns expressziós különbséget mutató citokinek és kemokinek relatív expressziója a különbözo genotípusú (WT és KO) allergizált ill. kontroll egerek tüdejében *: WT allergizált: 158
§: KO allergizált: 80 109
A 39. ábrán azoknak a citokineknek és kemokineknek a relatív expresszióját mutatjuk be, melyek között szignifikáns (kétszeres) különbségek adódtak a különféle állatcsoportok
között.
Ha
összevetjük
ezeket
a
molekulákat
az
asztma
patomechanizmusával (lsd. 2.4.2. fejezet), érdekes következtetést vonhatunk le: mind a 3 proinflammatorikus citokinnek: a TNF-? -nak, IL-1-nek (? és ? ) és IL-6-nak a génexpressziója igen eroteljesen csökkent a hisztamin hiányának következtében. Ezek az eredményeink megerosítik korábbi hipotézisünket, hogy a hisztamin az asztma patomechanizmusának kezdeti lépéseinél már alapveto immunreguláló funkciókkal rendelkezik, és nem csupán az effektor fázisban, a tünetek egyik kiváltójaként vesz részt. Eredményeinket számos kísérlet támasztja alá (387, 398-400, 404, 405), melyek szerint a hisztamin emeli a proinflammatorikus citokinek és kemokinek szintjét. Ezenfelül az érett hízósejtek (amelyek kialakulása a KO egerekben nem megfelelo) a WT egerekben szintén képesek proinflammatorikus mediátorok termelésére (156), így részt vehetnek a kétféle állatcsoport allergizálás utáni fenotípusának kialakításában. A három említett citokin közül az IL-6 tüdoben mért relatív expressziójában volt a legnagyobb különbség: míg a KO állatokban kimutathatatlan volt, a WT egerek tüdejében elérte a GAPDH expressziójának 24%-át. Ez a hisztamin közvetlen (404), valamint – az IL-1 által megvalósuló – közvetett (403) hatásainak összegzodésére utalhat. Korábbi vizsgálatainak eredményei szerint is, az IL-6 indukálhatósága jelentosen alulmarad a HDC KO egerekben (410) WT társaikhoz képest. A hisztamin hiányában kialakuló csökkent proinflammatorikus citokin mennyiség az asztma egészének kialakulását megváltoztathatja, mivel a citokinek kaszkád-szeruen kapcsolják be és ki egymás termelését.
A proinflammatorikus citokineken kívül, foleg az immunsejtek éréséhez nélkülözhetetlen citokinek relatív RNS mennyiségei között voltak még szignifikáns különbségek: a limfocitákra ható IL-2 és IL-7 a KO állatokban expresszálódott inkább, míg az eozinofilek érésében kulcsfontosságú IL-5 a WT egerekben. Ez utóbbi citokint külön ki kell emelni a többi közül, hiszen a KO állatokban egyáltalán nem volt kimutatható, így a tüdejükben és BAL-jukban kialakuló csökkent eozinofil gyulladást és AHR-t közvetlenül is magyarázhatja. Ezek az eredmények tehát arra utalnak, hogy a hisztamin IL-5 szekréciót stimuláló hatása (397) in vivo jelentosen módosíthatja az asztmásokban kialakuló eozinofil gyulladást. A hisztamin hiányában létrejövo kisebb
110
mérvu eozinofiliának további direkt okozója, az eotaxin és az eotaxin-2 expressziójának hiánya a KO állatok tüdejében. Ezeknek a specifikus eozinofil granulocita kemoatraktáns anyagoknak az RNS molekulái szintén a kimutathatósági határ alatt voltak a KO egerek tüdejében, míg jól mérhetok a WT állatokéban. A TNF-? az IL-4gyel együtt nélkülözhetetlen az eotaxin expresszióban (341). Mivel a hisztamin hiányos egerekben mindkét citokin mennyisége szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a WT állatokban, az eotaxin expresszió csökkenése is valamelyest értelmezheto. Az eotaxin – az eozinofilek kemotaxisának szabályozásán kívül – az SCF szinergistájaként közvetlenül is elosegítheti az érett hízósejtek és a Mac1 pozitív myeloid progenitor sejtek kialakulását (318). A KO állatok tüdejében tapasztalt csökkent eozinofilia harmadik oka a csökkent P-szelektin expresszió lehet. Bár ennek, az eozinofil granulociták transzendoteliális migrációjának korai lépéseinél esszenciális szerepet betölto molekulának az expresszióját nem mértük, korábbi kísérletek alátámasztották, hogy az endogén hisztamin indukálja a P-szelektin expresszióját (191). Így feltételezheto, hogy a HDC KO egerekben csökkent mértékben expreszálódik.
Állatmodellünkben az MCP-1, MCP-2 és MCP-3 szintén kiemelkedo fontosságú a kemokinek közül, mivel az asztmában betöltött immunregulatív hatásainak egy részét a hisztamin mediálja (354, 355). Expressziójuk mindkét állatcsoportban szignifikánsan emelkedett az allergizálás után. (Az MCP-2 a KO, az MCP-3 WT egerekben emelkedett inkább.) Mivel a HDC KO egerekbol hiányzik a hisztamin, feltételezhetoen hatásuk egy részrol erosen gátolt. Ugyanakkor hisztamintól függetlenül is részt vehetnek az asztmás tünetek menifesztációjában: képesek foleg az eozinofilek (de egyéb más Th2 sejtek) kemotaxisát indukálni (21). Ezzel a magyarázható például, hogy a KO állatokban is valamelyest kialakul légúti eozinofilia, még IL-5 és eotaxin hiányában is.
Az IL-13 az IL-4 és az IL-5 három olyan Th2 citokin, mely az asztma kialakulásának három különféle mechanizmusáért felelos az állatkísérletes rendszerben (86, 248). A KO állatokban – az IL-4-gyel és IL-5-tel ellentétesen – szignifikánsan emelkedett az IL-13 expressziója (39. ábra). Ez azt jelenti tehát, hogy a hisztamin hiánya nemcsak enyhíti az asztma kialakulásáért felelos mechanizmusokat, hanem egészen más mederbe is tereli azokat állatmodell rendszerünkben. A magas IL-13 expresszió ezenkívül más oldalról is magyarázatul szolgálhat a KO állatokban
111
megfigyelt gyengébb allergiás gyulladásra, csökkent AHR-re és a megváltozott expressziós mintázatra. A magas IL-13 szint csökkentheti INF-? expressziót és – az NF?B révén – az IL-5 szintjét is (248). Az INF-? csökkent expressziója – azon kívül, hogy a késoi asztmás reakció tüneteit szintén tompíthatja – a KO egerekben, csökkentheti az IL-13 hatásait is, potencírozó képességének kiesésével: a tüdoben csökkenheti az APC-k (pl. NK sejt) (249) infiltrációját, és BAL-ban – a bronhiális epitélsejtek révén – az IL-6 szintjét (247).
Összes
expressziós
mérésünket
jelenlegi
tudásunk
alapján
lehetetlenség
értelmezni. Az itt tárgyaltak is pusztán hipotézisek, amelyek a sok más kutatócsoport által végzett kísérletekkel együtt jelentenek valamit, de csak nagyon keveset, egy rendkívül összetett patofiziológiai folyamat megértésében. (Nem tudjuk többek között értelmezni pl., hogy az általában konstitutívan expresszálódó SDF-2 expressziója miért csökken az allergizálás hatására.) Ugyanakkor – mások kísérleteivel összehasonlítva – rámutathatnak azokra a molekulákra is, amelyek szabályozásában a hisztamin általános érvényu lehet, vagy pusztán csak egyedi. Az IL-16 expressziójában pl. nem volt jelentos különbség allergizálás után a KO és WT egerek között, ami megkérdojelezi Mashikian és mtsai. feltételezését (300), amely szerint ennek a citokinnek az expressziója hisztamintól függ. Kísérleteink, bár elsosorban a hisztamin késoi asztmás fázisra gyakorolt in vivo hatásainak feltárására irányultak, segítséget nyújthatnak az asztma patomechanizmusának hisztamintól független részeinek késobbi megértésében is. Eredményeink – összhangban a mások által végzett kísérletek eredményeivel (336, 337) – megerosítik, hogy az IP-10 valóban erosen expresszálódik az asztma késoi fázisában.
Végezetül meg kell említeni eredményeink helyes színben látásához a genetikailag módosított állatok vizsgálatának talán egyik legnagyobb hibáját. Nem szabad elfelejteni, hogy HDC KO egerekben a hisztamin hiánya az állat fejlodésének teljes szakaszában kifejti az adott hatást, ha az exogén hisztamin nem képes azt kompenzálni. Tehát – pl. az embrionális fejlodés révén – befolyásolhatja az egész szervezet kialakulását. Másrészt tekintettel kell lennünk arra is, hogy egy gén expressziójának a megváltoztatása akár az egész citokin mintázatban bekövetkezo változást is maga után vonhat, valamint hogy ugyanaz az antigén más citokin mikrokörnyezetben eltéro sejtes gyulladást válthat ki.
112
6 Összefoglalás A különbözo földrajzi helyeken élo egyének immunrendszere a legkülönfélébb környezeti nyomásoknak van kitéve, amely napjainkban egyre gyakrabban allergiás válasz kialakulásához vezet. A környezethez az immunrendszer a különféle mediátorok révén képes alkalmazkodni. PhD munkám egyik felében közvetlenül vizsgáltuk az immunválaszban részt vevo néhány ligand és receptor genetikai variációit PCR-RFLP technikával. Azt kutattuk a Budapesten élo gyermekeket tanulmányozva, hogy néhány – már ismert – polimorfizmus, kapcsolatba hozható-e az asztmával, az atópiás ekcéma/dermatitis szindrómával, vagy egyéb (atópiás típusú) allergiás megbetegedésekkel. Kutatásaink során nem találtunk összefüggést sem a RANTES, sem a CCR5, sem a TNF-? , sem a nagy affinitású IgE receptor vizsgált polimorfizmusai és az említett kórok között. Azonban az MCP-1 promoterének -2518 G allélja kapcsolatban áll az asztma kialakulásának kockázatával és az asztma súlyosságával. Az autoszomális domináns módon öröklodo allél kóros funkciói feltételezhetoen részben az eozinofil granulociták számának emelése révén valósulnak meg, mivel összefüggés mutatható ki a vérben levo eozinofil sejtszám és a polimorfizmus között. Eredményeink – bár kétségkívül bizonyításra szorulnak – különösen jelentosek, hiszen elsoként írtunk le fontos kapcsolatokat a kemokin rendszer egyik mutációja és az asztmára való hajlam között.
PhD munkám második részében az allergiában egyik kulcsfontosságú mediátor: a hisztamin alaposabb vizsgálatát tuztük ki a késoi asztmás válaszban, egy állatkísérletes modellrendszer segítségével. Azt tanulmányoztuk egy genetikailag módosított egértörzsön (HDC KO), hogy hogyan módosul az állatok fenotípusa allergizálás után, ha szervezetükbol teljesen hiányzik a hisztamin. Kísérleti eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a hisztamin teljes hiánya ugyan önmagában nem akadályozza meg, de markánsan csökkenti az asztma késoi fázisában fellépo légúti túlérzékenységet és a tüdo allergiás gyulladását. Eredményeinket citológiai módszerekkel elemezve megállapíthatjuk, hogy a HDC KO egerek csökkent asztmás válasza elsosorban az effektor sejtek csökkent száma miatt alakul ki. Ráadásul az allergén specifikus IgE termelésében is eros defektusok mutatkoztak, ami tovább mérsékelheti
ezeknek
a
sejteknek
az
aktiválódását.
Expressziós
mérésekkel
(Super
Array)
megállapítottuk, hogy a hisztamin hiánya az immunpolarizációs egyensúly Th1 irányú eltolódásával jár, amely már eleve védettséget jelent az asztma kialakulásával szemben. Továbbá foleg az asztma korai fázisában nélkülözhetetlen proinflammatorikus citokinek expresszióját csökkenti drasztikusan, valamint közvetlenül is képes az eozinofil granulociták aktiválódását és kemotaxisát gátolni. A HDC KO egerekben ezenkívül valószínuleg egészen más útvonalra is terelodik az asztma patomechanizmusa. Eredményeinket összegezve: a hisztamin, in vivo, nemcsak mint effektor molekula, hanem mint az immunrendszer egészére kiható metabolom vesz részt az asztma patomechanizmusában.
113
7 Summary The immune system of human beings at different geographical areas is challenged by various environmental factors, which might evoke allergic responses . The immune system can adjust itself to the environment milieu through different mediators. In the first part of my PhD thesis we investigated some genetic variations of ligands and receptors taking part in the immune response. The objective of my particular study was to find out whether in children living in Budapest the prevalence of some common genetic polymorphism can be related to asthma, atopic eczema/dermatitis syndrome or some other (atopic) allergic diseases. We did not find any connection between the studied polymorphisms of RANTES, CCR5, TNF-? or high affinity IgE receptor and the abovementioned diseases. However, the -2518G allele of the MCP-1 promoter was associated with the susceptibility and the severity of asthma. It is assumed that the malfunction of the allele inherited in an autosomal dominant way takes place via increasing the number of the eosinophil granulocytes. There was clear correlation between the number of eosinophiles in the blood and the presence of this polymorphism. The results are especially important since this is the first demonstration and discovery that connection between one of the chemokine system’s polymorphism and the susceptibility to asthma.
In the second part of my PhD thesis we aimed for a deeper analyse of histamine, a key mediator in the allergic response. We used an animal model to investigate the role the histamine in the late asthmatic response. A genetically modified mouse strain (HDC KO) was applied to check phenotype changes after sensitization and challenge in the absence of histamine in the animal. We concluded that in the late phase of asthma the total lack of the histamine does not prevent entirely the airway hyperresponsiveness and the allergic inflammation of the lung however it decreases them. Using cytological methods, we found that this finding can be explained by reduced number of the effector cells . A small number of cells elicited only a mild asthmatic response in the HDC KO mice. Furthermore, there were pronounced defects in the production of the allergen specific IgE, which, in turn can decrease the activation of these cells. Micro array (Super Array) analysis of the RNA expression profile revealed that the lack of histamine shifts the immune polarization balance toward a Th1 direction, which can protect against the development of asthma ab ovo and significantly reduces the expression of pro-inflammatory cytokines as well. Moreover in the absence of histamine the activation and chemo taxis of the eosinophil granulocytes were directly inhibited. Besides, it is probable that in HDC KO mice the pathomechanism of asthma is shifted to another way. Summarizing our results: histamine acts in vivo not only as an effector molecule, but also as a part of the “metabolom” it affects the entire immune system thus taking part in the pathomechanism of asthma.
114
8 Rövidítések jegyzéke 6-Ckine: MIP-2, exodus-2, SLC
IL: interleukin
AEDS: atópiás ekcéma/dermatitis szindróma
INF: interferon
Ag: antigén, allergén
IP-10: INF-? inducible protein
AHR: légúti túlérzékenység (airway
kDa: kilodalton
hyperresponsiveness)
KO: „génkiütött”, „knock out"
APC: antigénprezentáló sejt (antigen presenting
LAR: késoi asztmás válasz (late airway reaction)
cell)
Mac-1: CD11b/CD18
BAL: tüdomosó folyadék (broncho alveolar
MCh: metakolin
lavage)
MCP: monocita kemoatraktáns fehérje (monocyte
BCG: a turberkolózis oltóanyaga (Bacilus
chemoattractant protein)
Calmette-Guérin)
MDC: macrophage-derived chemokine
bp.: bázispár
MHC: fo hisztokompatibilitási gén komplex
C, CC, CXC, CX3C: kemokinek
(major histocompatibility complex)
CC16: Clara cell protein 16
MIG: monokine induced by interferon (IFN)-?
CCR, CXCR: kemokin receptorok
MIP: macrophage inflammatory protein
CD: cluster of differentiation
NFY-ß: a nukleáris faktor Y ß alegysége
CFU: kolónia formáló egység (colony forming
NNOS: neurá lis nitrogén-monoxid szintetáz
unit)
(neuronal nitric oxid synthase)
c-kit: CD117
OR: esélyhányados (odds ratio)
CpG: citozin-guanozin dinukleotid
OVA: ovalbumin
CTACK: cutaneous T cell-attracting chemokine
PAF: platelet-activating factor
EAACI: European Academy of Allergology and
PEF: kilégzési csúcsáramlás (peak expiratory
Clinical Immunology
flow)
ECP: eozinofil kationos fehérje (eosinophilic
Penh: enhanced pause
catioinic protein)
PF: platelet factor
EMBP: eosinophilic major basic protein
RANTES: regulated on activation normal T cell
FceRI: nagy affinítású IgE receptor
expressed and secreted
FceRII: kis affin ítású IgE receptor (CD23)
RT: szobahomérséklet (room temperature)
FEV1 : eroltetett kilégzési térfogat a kilégzés elso
SCF: stem cell factor
másodpercében (forced expiratory volume)
SDF: stromal cell derived factor
GM -CSF: granulocita-monocita kolóniastimuláló
STAT6: signal tranducer and activator of
faktor (granulocyte-monocyte colony-stimulating
transcription 6
factor)
TARC: thymus and activation-regulated
GRO: growth-regulated oncogene
chemokine
HDC: hisztidin dekarboxiláz
TCR: T sejt receptor
HE: hematoxilin-eozin
TECK: thymus-expressed chemokine
HLA: human leucocita antigén
Th: segíto (helper) T sejt
i.p.: intra peritoneális
TNF: tumor necrosis factor
I-309: a CCR8 ligandja
VCAM-1: vascular-cell adhesion molecule 1
ICAM-1: intracellular adhesion molecule 1
WT: vad típusú (wild type)
Ig: immunoglobulin
115
9 Megjelent publikációk 9.1 Az értekezés körében megjelent publikációk 1
Kozma G T, Losonczy G, Keszei M, Komlosi Z, Buzas E, Pallinger E, Appel J, Szabo T, Magyar P, Falus A, Szalai C. Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen- induced airway hyper-responsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol. 2003; 15(8): 963-73. IF: 3,595
2
Falus András, Kozma T Gergely, Wiener Zoltán, Hegyesi Hargita, Pós Zoltán, Szalai Csaba, Buzás Edit. A hisztamin, mint a th2 irányú immunreguláció része; Posztgenomikus kilátások a metabolomika irányában. Magyar Tudomány (Immunológia) 2003/04
3
Nagy A, Kozma G T, Bojszko A, Krikovszky D, Falus A, Szalai C. No association between asthma or allergy and the CCR5Delta 32 mutation. Arch Dis Child. 2002; 86(6): 426. IF: 2,095
4
Kozma G T, Falus A, Bojszko A, Krikovszky D, Szabo T, Nagy A, Szalai C. Lack of association between atopic eczema/dermatitis syndrome and polymorphisms in the promoter region of RANTES and regulatory region of MCP-1. Allergy. 2002; 57(2): 160-63. IF: 3,666
5
Szalai C, Kozma G T, Nagy A, Bojszko A, Falus A. Az allergiás megbetegedések genomikai megközelítése; lehetoségek és távlatok. Orv Hetil. 2002; 143(8): 381-90. Markusovszky díj 2003.
6
Szalai C, Kozma G T, Nagy A, Bojszko A, Krikovszky D, Szabo T, Falus A. Polymorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol. 2001; 108(3): 375-81. IF: 6,28 Az értekezés körében megjelent publikációk összes IF-a: 15,638
6.1 Nem az értekezés körében megjelent publikációk 7
Nagy A, Kozma G T, Keszei M, Treszl A, Falus A, Sza lai C. The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. J Allergy Clin Immunol. 2003; 112(4): 729-34. IF: 6,282 A publikációk összes IF: 21,144
116
8 Bibliográfia 1.
Johansson S G O, Hourihane J O'B, Bousquet J, Bruijnzeel-Koomen C, Dreborg S, Haahtela T, Kowalski M L, Mygind N, Ring J, Cauwenberge P van, Hage-Hamsten M van, Wüthrich B. A revised nomenclature for allergy. Allergy. 2001; 56: 813-24
2.
Coca A F, Cooke R A. On the classification of the phenomena of hypersensitiveness. J Immunol. 1923; 8: 163-82
3.
Falus A, Merétey K. Histamine: an early messenger in inflammatory and immun reactions. Immunol Today. 1992; 13: 154-56
4.
Gell P G H, Coombs R R A. Clinical aspects of immunology. 2nd ed. Oxford, England: Blackwell Scientific, 1968; 575-96
5.
Bennich H H, Ishizaka K, Johansson S G O, Rowe D S, D R Stanworth, Terry W D. Immunoglobulin E, a new class of human immunoglobulin. Bull Wold Health Organ 1968; 38: 15152
6.
Bruce I N, Harland R W, McBride N A, MacMahon J. Trends in the prevalence of asthma and dyspnea in first year university students. Q. J. Med. 1993; 86: 425-30
7.
Cookson WO, Moffatt MF. Asthma: an epidemic in the absence of infection? Science. 1997; 275: 41-42
8.
Mannino D M, Homa D M, Petrowski C A, Ashizawa A, Nixon L L, Johnson C A, Ball L B, Jack E, Kang D S. Surveillance for asthma: United States. 1960-1995. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998; 47: 1-27
9.
Aberg N, Hesselmar B, Aberg B, Eriksson B. Increase of asthma, allergic rhinitis and eczema in Swedish schoolchildren between 1979 and 1991. Clin Exp Allergy 1995; 25: 815-19
10. Smith D H, Malone D C, Lawson K A, Okamoto L J, Battista C, Saunders W B. A national estimate of the economic cost of asthma. Am J Respir Crit Care Med 1997; 156: 787-93 11. Gergen P J, Weiss K B. Changing patterns of asthma hospitalization among children: 1979 to 1987. JAMA 1990; 264: 1688-92 12. Kay A B. Asthma and inflammation. J Allergy Clin Immunol 1991; 87: 893-910 13. Bradley BL, Azzawi M, Jacobson M, Assoufi B, Collins JV, Irani AM, Schwartz LB, Durham SR, Jeffery PK, Kay AB. Eosinophils, T-lymphocytes, mast cells, neutrophils, and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma: comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma and normal control subjects and relationship to bronchial hyperresponsiveness. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: 661-74 14. Azzawi M, Bradley B, Jeffery PK, Frew AJ, Wardlaw AJ, Knowles G, Assoufi B, Collins JV, Durham S, Kay AB. Identification of activated T lymphocytes and eosinophils in bronchial biopsies in stable atopic asthma. Am Rev Respir Dis. 1990; 142: 1407-13 15. Lukacs N W, Strieter R M, Kunkel S L. Leukocyte infiltration in allergic airway inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 13: 1-6
117
16. Barnes P J. Cytokines as mediators of chronic asthma. Am J Respir Crit Care Med 1994; 150: S42S49 17. Lukacs N W, Strieter R M, Chensue S W, Kunkel S L. Activation and regulation of chemokines in allergic airway inflammation. J Leukocyte Biol. 1996; 59: 13-17 18. Bos J D, Van Leent E J, Sillevis Smitt J H. The millennium criteria for the diagnosis of atopic dermatitis. Exp Dermatol 1998; 7: 132-138 19. Corrigan C J, Cay A B. T cells and eosinophils in the pathogenesis of asthma. Immunol Today. 1992; 13: 501-07 20. Hamid Q A, Naseer T, Minshall E M, Song Y L, Boguniewicz M, Leung D Y. In vivo expression of IL-12 and IL-13 in atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 1996; 98: 225-31 21. Homey B, Zlotnik A. Chemokines in allergy. Curr Opin Immunol. 1999; 11: 626-34 22. Kay A B, Ying S, Varney V, Gaga M, Durham S R, Moqbel R, Wardlaw A J, Hamid Q. Messenger RNA expression of the cytokine gene cluster interleukin 3 (IL-3), IL-4,
IL-5 and
granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, in allergen-induced late-phase cutaneous reactions in atopic subjects. J Exp Med 1991; 173: 775-78 23. Robinson D S, Hamid Q, Yind S, Tsicopoulos A, Barkans J, Bentley A M, Corrigan C, Durham S R, Kay A B. Predominant TH2 -type bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992; 326: 298-304 24. Grewe M, Bruijnzeel-Koomen C A, Schopf E, Thepen T, Langeveld-Wildschut A G, Ruzicka T, Krutmann J. A role for Th1 and Th2 cells in the immunpathogenesis of atopic dermatitis. Immunol Today 1998; 19: 359-61 25. Hansen G, Berry G, DeKruyff R H, Umetsu D T. Allergen-specific Th1 cells fail to counterbalance Th2 cell-induced airway hyperreactivity but cause severe airway inflammation. J Clin Invest 1999; 103: 175-83 26. Hamid Q A, Minshall E M. Molecular pathology of allergic disease I: Lower airway disease. J Allergy Clin Immunol. 2000; 105: 20-36 27. Thepen T, Langeveld-Wildschut EG, Bihari IC, van Wichen DF, van Reijsen FC, Mudde GC, Bruijnzeel-Koomen CA. Biphasic response against aeroallergen in atopic dermatitis showing a switch from an initial Th2 response to a Th1 response in situ: an immunocytochemical study. J Allergy Clin Immunol 1996; 97: 828-37 28. Szalai Cs, Kozma G T, Nagy A, Bojszkó Á, Falus A. Az allergiás megbetegedések genomikai megközelítése; lehetoségek és távlatok. Orvosi Hetilap 2002; 143: 381-390 29. Barnes K C, Marsh D G. The genetics and complexity of allergy and asthma. Immunol Today. 1998; 19: 325-32 30. Marsh D G, Meyers D A, Bias W B. The epidemiology and genetics of atopic allergy. N Eng J Med 1981; 305: 1551-59 31. Barnes K C. Evidence for common genetic elements in allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: S192-S200 32. Quirce S, Sastre J. Occupational asthma. Allergy. 1998; 53: 633-41 33. Falus A. Histamine and inflammation. CRC Press. 1994: 99-11
118
34. White M V, Slater J E, Kaliner M A. Histamine and asthma. Am Rev Respir Dis. 1987; 135: 116576 35. Simon R A, Stevenson D D, Arroyave C M, Tan E M. The relationship of plasma histamine to the activity of bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol 1977; 60: 312-16 36. Durham S R, Lee T H, Cromwell O, Shaw R J, Merrett T G, Merrett J, Cooper P, Kay A B. Immunologic studies in allergen-induced late-phase asthmatic reactions. J Allergy Clin Immunol 1984; 74: 49-60 37. van Ganse E, Kaufman L, Derde M P, Yernault J C, Delaunois L, Vincken W. Effects of antihistamines in adult asthma: a metaanalysis of clinical trials. Eur Respir J. 1977; 10: 2216-24 38. László V. Inhibition of effects of endogenously synthesized histamine disturbs in vitro human dendritic cell differentation. Immu nol Lett 2001; 76: 175-82 39. Mazzoni A, Young H A, Spitzer J H, Visintin A, Segal D M. Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells, resulting in altered T cell polarization. J Clin Invest 2001; 108: 1865-13 40. Nomura H, Sato E, Koyama S, Haniuda M, Kubo K, Nagai S, Izumi T. Histamine stimulates alveolar macrophages to release neutrophil and monocyte chemotactic activity. J Lab Clin Med 2001; 138: 226-35 41. Takeda K, Hamelmann E, Joetham A, Shultz LD, Larsen GL, Irvin CG, Gelfand EW. Development of eosinophilic airway inflammation and airway hyperresponsiveness in mast cell-deficient mice. J Exp Med. 1997; 186: 449-54 42. Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Hori Y, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G, Tchougounova E, Hellman L, Gertsenstein M, Hirasawa N, Sakurai E, Buzas E, Kovacs P, Csaba G, Kittel A, Okada M, Hara M, Mar L, Numayama-Tsuruta K, Ishigaki-Suzuki S, Ohuchi K, Ichikawa A, Falus A, Watanabe T, Nagy A. Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Lett. 2001; 502: 53-56 43. Sheffer A L., Global Initiative for Asthma, NHLBI/WHO Workshop report, National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, 1995; Publication No, 95-3659 44. Kay A B. Allergy and allergic disease (First of two part). N Eng J Med. 2001; 344: 30-37 45. Bjorksten B, Naaber P, Sepp E, Mikelsaar M. The intestinal microflora in allergic Estonian and Swedish 2-year-old children. Clin Exp Allergy. 1999; 29: 342-46 46. Cookson W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 1999; 402: Suppl: B5-B11 47. Kimpen J, Callaert H, Embrechts P, Bosmans E. Cord blood IgE and month of birth. Arch Dis Child. 1987; 62: 478-82 48. Vanto T, Kovikko A. Dog hypersensitivity in asthmatic children. Acta Pediatr Scand. 1983; 72: 57175 49. Welliver R C, Sun M, Rinaldo D, Ogra P L. Predictive value of respiratory synctial virus-specific IgE responses for recurrent wheezing following bronchiolitis. J Pediatr 1986; 109: 776-80 50. Holgate S T. The epidemic of allergy and asthma. Nature. 1999; 402: Suppl: B2-B-7
119
51. Blumenthal M N, Blumenthal M, Bosquet J. Evidence for an increase in atopic disease and posible causes. Clin Exp Allergy 1993; 23: 484-92 52. Rajka G. Prurigo Besnier (atopic dermatitis) with special reference to the role of allergic factors. Acta Derm Venereol. 1960; 40: 285-306 53. King M C, Lee G M, Spinner N B, Thomson G, Wrensch M R. Genetic epidemioligy. Annu Rev Public Health 1984; 5: 1-52 54. Sandford A J, Shirakawa T, Moffatt M F, Daniels S E, Ra C, Faux J A, Young R P, Nakamura Y, Lathrop G M, Cookson W O, és mtsai. Localisation of atopy and beta subunit of high-affinity IgE receptor (Fc epsilon RI) on chromosome 11q. Lancet. 1993; 341: 332-34 55. Coleman R, Trembath R C, Harper J I. Genetic studies of atopy and atopic dermatitis. Br J Dermatol. 1997; 136: 1-5 56. Schultz L F, Holm N V, Henningsen K. Atopic dermatitis. A genetic epidemiologic study in population-based twin sample. J Am Acad Derm. 1986; 15: 487-94 57. Dizier M H, Hill M, James A, Faux J, Ryan G, le Souef P, Lathrop M, Musk A W, Demenais F, Cookson W. Detection of a recessive major gene for high IgE leveles acting independently of specific response to allergens. Gen Epidemiol. 1995; 12: 93-105 58. Wilkinson J, Grimley S, Collins A, Thomas N S, Holgate S T, Morton N. Linkage of asthma to markers on chromosome 12 in a sample of 240 families using quantitative phenotype scores. Genomics. 1998; 53: 251-59 59. Panhuysen C I, Bleecker E R, Koeter G H, Meyers D A, Postma D S. Characterization of obstructive airway disease in family members of probands with asthma. An algorithm for the diagnosis of asthma. A J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1734-1742 60. Bergmann R L, Edenharter G, Bergmann K E, Forster J, Bauer C P, Wahn V, Zepp F, Wahn U. Atopic dermatitis in early infancy predicts allergic airway disease at 5 years. Clin Exp. Allergy. 1998; 28: 965-70 61. Dawson B, Illsley R, Horobin G, Mitchell R. A survey of childhood asthma in Aberdeen. Lancet. 1969; 1: 827-30 62. Kapsali E, Horowitz F, Diemer F, és mtsai. Rhinitis is ubiquitous in allergic asthmatics. J Allergy Clin Immunol. 1997; 99: S138 63. Daniels SE, Bhattacharrya S, James A, Leaves NI, Young A, Hill MR, Faux JA, Ryan GF, le Souef PN, Lathrop GM, Musk AW, Cookson WO. A genome wild search for quantitative trait underlying asthma. Nature. 1996; 383: 247-50 64. Collaborative Study on the Genetics of Asthma (GSGA). A genom-wild search for asthma susceptibility loci in ethnically diverse populations. Nature Genet. 1997;15: 389-92 65. Wjst M, Fischer G, Immervoll T, Jung M, Saar K, Rueschendorf F, Reis A, Ulbrecht M, Gomolka M, Weiss E H, Jaeger L, Nickel R, Richter K, Kjellman N I, Griese M, von Berg A, Gappa M, Riedel F, Boehle M, van Koningsbruggen S, Schoberth P, Szczepanski R, Dorsch W, Silbermann M, Wichmann H E, és mtsai. A genome-wild search for linkage of asthma. Genomics. 1999; 58: 1-8
120
66. Li Kam Wa T C, Mansur A H, Britton J, Williams G, Pavord I, Richards K, Ca mpbell D A, Morton N, Holgate S T, Morrison J F. Association between -308 tumor necrosis factor promoter polymorphism and bronchial hyperreactivity in asthma. Clin Exp. Allergy. 1999; 29: 1204-08 67. Moffat, M F Cookson W O C M. Tumor necrosis factor haplotypes and asthma. Hum Mol Genet. 1997; 6: 551-54 68. Young R P, Sharp P A, Lynch J R, Faux J A, Lathrop G M, Cookson W O, Hopkin J M. Conformation of genetic linkage between atopic IgE responses chromosome 11q13. J Med Gen. 1992; 29: 236-38 69. Cookson W O, Young R P, Sandford A J, Moffatt M F, Shirakawa T, Sharp P A, Faux J A, Julier C, Nakumuura Y, Nakumura Y, et al. Maternal inheritance of atopic IgE responsiveness on chromosopme 11 q. Lancet. 1992; 340: 381-84 70. Hill M R, James A L, Faux J A, Ryan G, Hopkin J M, le Souef P, Musk A W, Cookson W O. Fc?RI-b polymorphismand risk of atopy in a general population sample. B M J. 1995; 311: 776-779 71. Thomas N S, Holgate S T. Genes for asthma on chromosome 11: an update. Clin Exp Allergy. 1998; 28: 387-91 72. Li A R, Mackay G A, Hopkin J M. Functional analysis of histamine release from basophils and mast cells in subjects with the Ile-181>Leu variant of the Fc epsilon RI-beta. Clin Science. 1997; 93: 27986 73. Kozma G T, Falus A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Nagy A, Szalai C. Lack of association between atopic aczema/dermatitis syndrome and polymorphisms in the promoter region of RANTES and regulatory region of MCP-1. Allergy. 2002; 57: 1-5 74. Szalai C, Kozma G T, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polymorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with the asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol. 2001; 108: 375-81 75. Nickel R G, Casalaro V, Wahn U, Beyers K, Barnes K C, Blunkett B S, és mtsai. Atopic dermatitis is associated with a functional mutation in the promoter of the C-C chemokine RANTES. J Immunol. 2000; 164: 1612-16 76. Liu H, Chao D, Nakayama E E, Taguchi H, Goto M, Xin X, Takamatsu J K, Saito H, Ishikawa Y, Akaza Juji T, Takebe Y, Ohishi T, Fukutake K, Maruyama Y, Yashiki S, Sonoda S, Nakamura T, Nagai Y, Iwamoto A, Shioda T. Polymorphism in RANTES chemokine promoter affects HIV-1 disease progression. Proc Natl Acad Sci. 1999; 96: 4581-85 77. Wong M, Fish E N. RANTES and MIP-1a activate STATS in cells. J Bio l Chem. 1998; 273: 309-14 78. Haribabu B, Richardson R M, Fisher I, Sozzani S, Reiper S C, Horuk R, Ali H, Snyderman R. Regulation of human chemokine receptors CXCR4: role of phosphorylation in desensitization and internalization. J Biol Chem. 1997; 272: 28726-31 79. Zhao J, Ma L, Wu Y L, Wang P, Hu W, Pei G. Chemokine receptor CCR5 functionally couples to inhibitory G proteins and undergoes desensitization. J Cell Biochem. 1998; 71: 36-45 80. Dean M, Carrington M, Winkler C, Huttley G A, Smith M W, Allikmets R, Goedert J J, Buchbinder S P, Vittinghoff E, Gomperts E, Donfield S, Vlahov D, Kaslow R, Saah A, Rinaldo C, Detels R,
121
O'Brien S J. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Science. 1996; 273: 1856-62 81. Hall I P, Wheatley A, Chistie G, McDougall C, Hubbard R, Helms PJ. Association of CCR5? 32 with reduced risk of asthma. Lancet. 1999; 354: 1264-65 82. Mitchell T J, Walley A J, Pease J E. Delta 32 deletion of CCR5 gene and association with asthma or atopy. Lancet 2000; 356: 1491-92 83. Nagy A, Kozma G T, Krikovszky D, Falus A, Szalai C. No association between asthma or allergy and the CCR5? 32 mutation. Arch Dis Child. 2002; 86: 426-27 84. Ueda A, Okuda K, Ohno S, Shirai A, Igarashi T, Matsunaga K, Fukushima J, Kawamoto S, Ishigatsubo Y, Okubo T. NF-kappa B and Sp-1 regulate transcription of the human monocyte chemoatractant protein-1 gene. J Immunol. 1994; 153: 2052-63 85. Rovin B H, Lu L, Saxena R. A novel polymorophism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1 expression. Biochem Bioph Res Commun. 1999; 259: 344-48 86. Khai P L, David P. Understanding the pathogenesis of allergic asthma using mouse models. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001; 87: 96-110 87. Cieslewicz G, Tomkinson A, Adler A, Duez C, Schwarze J, Takeda K, Larson K A, Lee J J, Irvin C G, Gelfand E W. The late, but not early, asthmatic response is dependent on IL-5 and correlates with eosinophil infiltration. J Clin Invest. 1999; 104: 301-08 88. Stelts D, Egan R W, Falcone A, Garlisi C G, Gleich G J, Kreutner W, Kung T T, Nahrebne D K, Chapman R W, Minnicozzi M. Eosinophils retain their granule major basic protein in a murine model of allergic pulmonary inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 1998; 18: 463-70 89. Denis P S, Jean S M, Mary H P, Hong L. Production of IgE antibody and allergic sensitization of intestinal and peripheral tissues after oral immunization with protein Ag and cholera toxin. The Journal of Immunology. 1994; 153: 647-57 90. Bomford R. The comparative selectivity of adjuvants for humoral cell-mediated immunity. Clin Exp Immunol. 1980; 39: 426-34 91. Patric G H, Alison H R, Janet E B, Keven J T. Induction of adjuvant independent IgE responses in inbred mice: primary, secundary, and persistent IgE responses to ovalbumin and ovomucoid. Int. Archs Allergy Appl Immun. 1981; 65: 42-50 92. Jonathan M S, Emiko M, Joanne P B, Thomas R M, Atul K B, Raif S G. Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to methacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice. J. Clin Invest. 1998; 101:1614-22 93. Brewer J P, Kisselgof A B, Martin T R.Genetic variability in pulmonary physiological, cellular, and antibody responses to antigen in mice. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 1150-56 94. Hogan S P, Matthaei K I, Young J M, Koskinen A, Young I G, Foster P S. A novel T cell-regulated mechanism modulating allergen-induced airways hyperreactivity in BALB/c mice independently of IL-4 and IL-5. J Immunol. 1998; 161: 1501-09
122
95. Zhang Y, Lamm W J, Albert R K, Chi EY, Henderson W R, Lewis D B. Influence of the route of allergen administration and genetic background on the murine allergic pulmonary response. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155: 661-69 96. Herz U, Braun A, Ruckert R, Renz H. Various immunological phenotypes are associated with increased airway responsiveness. Clin Exp Allergy. 1998; 28: 625-34 97. Tomkinson A, Cieslewicz G, Duez C, Larson K A, Lee J J, Gelfand E W. Temporal association between airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia in ovalbumin-sensitized mice. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 163: 721-30 98. Kung TT, Jones H, Adams GK 3rd, Umland SP, Kreutner W, Egan RW, Chapman RW, Watnick AS. Characterization of a murine model of allergic pulmonary inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 1994; 105: 83-90 99. Renz H, Smith H R, Henson J E, Ray B S, Irvin C G, Gelfand E W, Aerosolized antigen exposure without adjuvant causes increased IgE production and increased airway responsiveness in the mouse. J Allergy. Clin. Immunol. 1992; 89: 1127-38 100. Wills -Karp M. Immunologic basis of antigen-induced airway hyperresponsiveness. Annu Rev Immunol. 1999; 17: 255-81 101. Mosmann T R, Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol Today. 1996; 17: 138-46 102. Tominaga K, Yoshimoto T, Torigoe K, Kurimoto M, Matsui K, Hada T, Okamura H, Nakanishi K. IL-12 synergizes with IL-18 or IL-1beta for IFN-gamma production from human T cells. Int Immunol. 2000; 12: 151-60 103. Abbas A K, Murphy K M, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature. 1996; 383: 787-93 104. Mosmann T R. Cytokine patterns during the progression to AIDS. Science. 1994; 265: 193-94 105. O'Garra A, Murphy K. T-cell subsets in autoimmunity. Curr Opin Immunol. 1993; 5: 880-86 106. Kemeny D M, Urbanek R, Ewan P, McHugh S, Richards D, Patel S, Lessof M H. The subclass of IgG antibody in allergic disease: II. The IgG subclass of antibodies produced following natural exposure to dust mite and grass pollen in atopic and non-atopic individuals. Clin Exp Allergy. 1989; 19: 545-49 107. Ebner C, Siemann U, Najafian N, Scheiner O, Kraft D. Characterization of allergen (Bet v 1)specific T cell lines and clones from non-allergic individuals. Int Arch Allergy Immunol. 1995; 107: 183-85 108. Gonzalez M C, Diaz P, Galleguillos F R, Ancic P, Cromwell O, Kay AB. Allergen-induced recruitment of bronchoalveolar helper (OKT4) and suppressor (OKT8) T-cells in asthma. Relative increases in OKT8 cells in single early responders compared with those in late-phase responders. Am Rev Respir Dis. 1987; 136: 600-04 109. Oro A S, Guarino T J, Driver R, Steinman L, Umetsu DT. Regulation of disease susceptibility: decreased prevalence of IgE-mediated allergic disease in patients with multiple sclerosis. J Allergy Clin Immunol. 1996; 97: 1402-08
123
110. Shirakawa T, Enomoto T, Shimazu S, Hopkin J M. The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder. Science. 1997; 275: 77-79 111. Wilkinson J R, Lane S R, Lee T H. The effects of corticosteroid on cytokine generation and expression of activation antigens by monocytes in bronchial asthma. Int Arch Allergy Clin Immunol. 1991; 94: 220-21 112. Robinson D S, Hamid Q, Ying S, Tsicopoulos A, Barkans J, Bentley A M, Corrigan C, Durham SR, Kay A B. Predominant Th2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Eng J Med. 1992; 326: 298-304 113. Hofstra C L, van Ark I, Hofman G, Kool M, Nijkamp F P, van Oosterhout A J. Prevention of Th2like cell responses by coadministration of IL-12 and IL-18 is associated with inhibition of antigeninduced airway hyperresponsiveness, eosinophilia, and serum IgE levels. J Immunol. 1998; 161: 5054-60 114. Coffman R L, Seymour B W, Lebman D A, Hiraki D D, Christiansen J A, Shrader B, Cherwinski H M, Savelkoul H F, Finkelman F D, Bond M W, és mtsai. The role of helper T cell products in mouse B cell differentiation and isotype regulation. Immunol Rev. 1988; 102: 5-28 115. Prescott S L, Macaubas C, Holt B J, Smallacombe T B, Loh R, Sly P D, Holt PG. Transplacental priming of the human immune system to environmental allergens: universal skewing of initial T cell responses toward the Th2 cytokine profile. J Immunol. 1998; 160: 4730-37 116. Holt P G, Macaubas C, Stumbles P A, Sly P D. The role of allergy in the development of asthma. Nature. 1999; 402 (Suppl): B12-B17 117. Rook G A, Stanford J L. Give us this day our daily germs. Immunol Today. 1998; 19: 113-16 118. von Mutius E, Martiney F D, Fritzsch C, Nicolai T, Roell G, Thiemann H H. Prevalence of asthma and atopy in two areas of East and West Germany. Am J Respir Crir Care Med. 1994; 149: 358-64 119. Kalinski P, Hilkens C M, Wierenga E A, Kapsenberg M L. T-cell priming type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of the third signal. Immunol Today. 1999; 20: 561-67 120. Whittaker D S, Bahjat K S, Moldawer L L, Clare-Salzler M J. Autoregulation of human monocytederived dendritic cell maturation and IL-12 production by cyclooxygenase-2 mediated prostanoid production J Immunol. 2000; 165: 4298-304 121. Constant S L, Bottomly K. Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Annu Rev Immunol. 1997; 15: 297-22 122. Rogers P R, Croft M. Peptide dose, affinity, and time of differentiation can contribute to the Th1/Th2 cytokine balance. J Immunol. 1999; 163: 1205-13 123. Subauste M C, Jacoby D B, Richards S M, Proud D. Infection of a human respiratory epithelial cell line with rhinovirus. Induction of cytokine release and modulation of susceptibility to infection by cytokine exposure. J Clin Invest. 1995; 96: 549-57 124. Matsukura S, Kokubu F, Noda H, Tokunaga H, Adachi M.Expression of IL-6, IL-8, and RANTES on human bronchial epithelial cells, NCI-H292, induced by influenza virus A. J Allergy Clin Immunol. 1996; 98: 1080-07 125. Wierenga E A, Snoek M, Jansen H M, Bos J D, van Lier R A, Kapsenberg M L. Human atopenspecific types 1 and 2 T helper cell clones. J Immunol. 1991; 147: 2942-49
124
126. Holtzman M J, Sampath D, Castro M, Look D C, Jayaraman S. The one-two of T helper cells: does interferon-gamma knock out the Th2 hypothesis for asthma? Am J Respir Cell Mol Biol. 1996; 14: 316-18 127. Kumano K, Nakao A, Nakajima H, Hayashi F, Kurimoto M, Okamura H, Saito Y, Iwamoto I. Interleukin-18 enhances antigen-induced eosinophil recruitment into the mouse airways. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 873-78 128. Lafaille J J, Keere F V, Hsu A L, Baron J L, Haas W, Raine C S, Tonegawa S. Myelin basic proteinspecific T helper 2 (Th2) cells
cause experimental autoimmune encephalomyelitis in
immunodeficient hosts rather than protect them from the disease. J Exp Med. 1997; 186: 307-12 129. Pakala S V, Kurrer M O, Katz J D. T helper 2 (Th2) T cells induce acute pancreatitis and diabetes in immune-co mpromised nonobese diabetic (NOD) mice. J Exp Med. 1997; 186: 299-306 130. Jutel M, Watanabe T, Klunker S, Akdis M, Thomet OA, Malolepszy J, Zak-Nejmark T, Koga R, Kobayashi T, Blaser K, Akdis CA. Histamine regulates T-cell and antibody responses by differentia l expression of H1 and H2 receptors. Nature. 2001; 413: 420-25 131. Elliott K A, Osna N A, Scofield M A, Khan M M. Regulation of IL-13 production by histamine in cloned murine T helper type 2 cells. Int Immunopharmacol. 2001; 1: 1923-37 132. Osna N, Elliott K, Khan M M. The effects of histamine on interferon gamma production are dependent on the stimulatory signals. Int Immunopharmacol. 2001; 1: 135-45 133. Murphy E, Shibuya K, Hosken N, Openshaw P, Maino V, Davis K, Murphy K, O'Garra A. Reversibility of T helper 1 and 2 populations is lost after long-term stimulation. J Exp Med. 1996; 183: 901-13 134. Szabo S J, Dighe A S, Gubler U, Murphy K M. Regulation of the interleukin (IL)-12R beta 2 subunit expression in developing T helper 1 (Th1) and Th2 cells. J Exp Med. 1997; 185: 817-24 135. Xu D, Chan WL, Leung BP, Hunter D, Schulz K, Carter RW, McInnes IB, Robinson JH, Liew FY. Selective expression and functions of interleukin 18 receptor on T helper (Th) type 1 but not Th2 cells. J Exp Med. 1998; 188: 1485-92 136. Kay J, Gawkrodger D J, Mortimer M J, Jaron A G. The prevalence of childhood atopic eczema in a general population. J Am Acad Dermatol. 1994; 30: pp. 35– 39 137. Williams H C. Is the prevalence of atopic dermatitis increasing? Clin Exp Dermatol 1992; 17: pp. 385–91 138. Bos J D, Hagenaars C, Das P K, Krieg S R, Voorn W J, Kapsenberg M L. Predominance of "memory" T cells (CD4+, CDw29+) over "naive" T cells (CD4+, CD45R+) in both normal and diseased human skin. Arch Dermatol Res. 1989; 281: pp. 24–30 139. Liu M C, Hubbard W C, Proud D, Stealey B A, Galli S J, Kagey-Sobotka A, Bleecker E R, Lichtenstein L M. Immediate and late inflammatory responses to ragweed antigen challenge of the peripheral airways in allergic asthmatics. Cellular, mediator, and permeability changes. Am Rev Respir Dis. 1991; 144: 51-58 140. Bos J D, van Garderen I D, Krieg S R, Poulter L W. Different in situ distribution patterns of dendritic cells having Langerhans (T6+) and interdigitating (RFD1+) cell immunophenotype in
125
psoriasis, atopic dermatitis, and other inflammatory dermatoses. J Invest Dermatol. 1986; 87: pp. 358–61 141. Wollenberg, S. Kraft, D. Hanau and T. Bieber. Immunomorphological and ultrastructural characterization of Langerhans cells and a novel, inflammatory dendritic epidermal cell (IDEC) population in lesional skin of atopic eczema. J Invest Dermatol 1996; 106: pp. 446– 53 142. van Reijsen F C, Bruijnzeel-Koomen C A, Kalthoff F S, Maggi E, Romagnani S, Westland J K, Mudde G C. Skin-derived aeroallergen-specific T-cell clones of Th2 phenotype in patient with atopic dermatitis J Allergy Clin Immunol. 1992; 90: 184-93 143. Grewe M, Gyufko K, Schopf E, Krutmann J. Lesional expression of interferon-gamma in atopic eczema. Lancet. 1994; 343: 25-26 144. Dunnill M S. The pathology of asthma, with special reference to changes in the bronchial mucosa. J Clin Pathol. 1960; 13: 27-33 145. Dunnill M S, Massarela G R, Anderson J A. A comparison of the quantitative anatomy of the bronchi in normal subjects, in status asthmaticus, in chronic bronchitisand in emphysema. Thorax. 1969; 24: 176-79 146. Bousquet J, Jeffery P K, Busse W W, Johnson M, Vignola A M. Asthma: from bronchoconstriction to airways inflammation and remodeling. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: 1720-45 147. Drazen J M, Arm J P, Austen K F. Sorting out the cytokine of asthma. J Exp Med. 1996; 183: 1-5 148. Busse W W, Lemanske R F. Asthma. N Eng J Med. 2001; 344: 350-62 149. Broide D H, Gleich G J, Cuomo A J, Coburn D A, Federman E C, Schwartz L B, Wasserman S I. Evidence of ongoing mast cell and eosinophil degranulation in symptomatic asthma airway. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: 637-648 150. Burrows B, Martinez F D, Halomen M, Barbee R A, Cline M G. Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens. N Eng J Med. 1989; 320: 271-77 151. Geha RS. Regulation of IgE synthesis in humans. J Allergy Clin Immunol. 1992; 90: 143-50 152. Wills -Karp M, Luyimbazi J, Xu X, Schofield B, Neben TY, Karp CL, Donaldson DD. Interleukin13: central mediator of allergic asthma. Science. 1998; 282: 2258-61 153. Bacharier L B, Jabara H, Geha R S. Molecular mechanism of immunoglobin E regulation. Int Arch Allergy Immunol. 1998; 115: 257-69 154. Durham S R. The significance of late responses in asthma. Clin Exp Allergy. 1991; 21: 3-7 155. Blythe S, Lemanske R F. Pulmonary antigen challenge in rats passively sensitized wit a monoclonal IgE antibody induces immediate but not late changes in airway mechanics. Am Rev Respir Dis. 1988; 138: 1152-56 156. Galli S J. New concepts about mast cell. N Eng J Med. 1993; 328: 257-265 157. Kinet J P. The high affinity IgE receptor (Fc epsilon RI): from physiology to pathology. Annu Rev Immunol. 1999; 17: 931-72 158. Oshiba A, Hamelmann E, Takeda K, Bradley KL, Loader JE, Larsen GL, Gelfand EW. Passive transfer of immediate hypersensitivity and airway hyperresponsiveness by allergen-specific IgE and IgG1 in mice. J Clin Invest. 1996; 97: 1398-408
126
159. Daeron M, Danon A P, Voisin GA. Mast cell membrane antigens and Fc receprors in anaphylaxis II: functionally distinct receptors for IgG and for IgE on mouse mast cell. Cell. Immunol. 1980; 49: 178-89 160. Joachim S., Harald R., Gideon L., Katherine L.B., Julia L.G., Gray L., Erwin W.G., Development and transfer of immediate cutaneous hypersensitivity in mice exposed to aerosolized antigen. 1993; 91: 133-40 161. Metzger W J, Sjoerdsma K, Richerson H B, Moseley P, Zavala D, Monick M, Hunninghake G W. Platelets in bronchoalveolar lavage from asthmatic patients and allergic rabbits with allergeninduced late phase responses. Agents Actions Suppl. 1987; 21: 151-59 162. Umetsu D T, DeKruyff R H. TH1 and TH2 CD4+ cells in human allergic diseases. J Allergy Clin Immunol. 1997; 100: 1-6 163. Hamelmann E, Gelfand E W. IL-5-induced airway eosinophilia --the key to asthma? Immunol Rev. 2001; 179: 182-91 164. Till S, Li B, Durham S, Humbert M, Assoufi B, Huston D, Dickason R, Jeannin P, Kay AB, Corrigan C. Secretion of the eosinophil-active cytokines interleukin-5, granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 by bronchoalveolar lavage CD4+ and CD8+ T cell lines in atopic asthmatics, and atopic and non-atopic controls. Eur J Immunol. 1995; 25: 2727-31 165. Ying S, Humbert M, Barkans J, Corrigan C J, Pfister R, Menz G, Larche M, Robinson D S, Durham S R, Kay A B. Expression of IL-4 and IL-5 mRNA and protein product by CD4+ and CD8+ T cells, eosinophils, and mast cells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic (intrinsic) asthmatics. J Immunol. 1997; 158: 3539-44 166. Hamelmann E, Oshiba A, Paluh J, Bradley K, Loader J, Potter T A, Larsen G L, Gelfand E W. Requirement for CD8+ T cells in the development of airway hyperresponsiveness in a marine model of airway sensitization. J Exp Med. 1996; 183: 1719-29 167. De Sanctis GT, Itoh A, Green F H, Qin S, Kimura T, Grobholz J K, Martin T R, Maki T, Drazen JM. T-lymphocytes regulate genetically determined airway hyperresponsiveness in mice. Nat Med. 1997; 3: 460-62 168. Kennedy J D, Hatfield C A, Fidler S F, Winterrowd G E, Haas J V, Chin J E, Richards I M. Phenotypic characterization of T lymphocytes emigrating into lung tissue and the airway lumen after antigen inhalation in sensitized mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 1995; 12: 613-23 169. Gavett S H, Chen X, Finkelman F, Wills -Karp M. Depletion of murine CD4+ T lymphocytes prevents antigen-induced airway hyperreactivity and pulmonary eosinophilia. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994; 10: 587-93 170. Gonzalo J A, Lloyd C M, Kremer L, Finger E, Martinez-A C, Siegelman M H, Cybulsky M, Gutierrez-Ramo s J C. Eosinophil recruitment to the lung in a murine model of allergic inflammation. The role of T cells, chemokines, and adhesion receptors. J Clin Invest. 1996;98: 2332-45 171. Haselden B M, Kay A B, Larche M. Immunoglobulin E-independent major histocompatibility complex-restricted T cell peptide epitope-induced late asthmatic reactions. J Exp Med. 1999; 189: 1885-94
127
172. Randolph D A, Stephens R, Carruthers C J, Chaplin D D. Cooperation between Th1 and Th2 cells in a murine model of eosinophilic airway inflammation. J Clin Invest. 1999; 104: 1021-29 173. MacLean J A, Sauty A, Luster A D, Drazen J M, De Sanctis G T. Antigen-induced airway hyperresponsiveness, pulmonary eosinophilia, and chemokine expression in B cell-deficient mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 1999; 20: 379-87 174. Hamelmann E, Vella A T, Oshiba A, Kappler J W, Marrack P, Gelfand E W. Allergic airway sensitization induces T cell activation but not airway hyperresponsiveness in B cell-deficient mice. Proc Natl Acad Sci. USA. 1997; 94: 1350-55 175. Zuany-Amorim C, Ruffié C, Hailé S, Vargaftig B, Pereira P, Pretolani M. Requirement for gd T cells in allergic airway inflammation. Science. 1998; 280: 1265-67 176. Vignola A M, Chanez P, Chiappara G, Siena L, Merendino A, Reina C, Gagliardo R, Profita M, Bousquet J, Bonsignore G. Evaluation of apoptosis of eosinophils, macrophages, and T lymphocytes in mucosal biopsy specimens of patients with asthma and chronic bronchitis. J Allergy Clin Immunol. 1999; 103: 563-73 177. Krug N, Tschernig T, Balke K, Erpenbeck V J, Meyer L, Bode U, Hohlfeld J M, Pabst R, Fabel H. Enhanced expression of fas ligand (CD95L) on T cells after segmental allergen provocation in asthma. J Allergy Clin Immunol. 1999; 103: 649-55 178. Walker C, Kaegi MK, Braun P, Blaser K. Activated T cells and eosinophilia in bronchoalveolar lavages from subjects with asthma correlated with disease severity. J Allergy Clin Immunol. 1991; 88: 935-42 179. Wardlaw AJ, Dunnette S, Gleich GJ, Collins JV, Kay AB.Eosinophils and mast cells in bronchoalveolar lavage in subjects with mild asthma. Relationship to bronchial hyperreactivity. Am Rev Respir Dis. 1988 Jan;137(1):62-69 180. Walker C, Virchow JC Jr, Bruijnzeel PL, Blaser K.T cells and asthma. II. Regulation of the eosinophilia of asthma by T cell cytokines. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1991; 94: 248-50 181. Aalbers R, Kauffman H F, Vrugt B, Koeter G H, de Monchy J G. Allergen-induced recruitment of inflammatory cells in lavage 3 and 24 h after challenge in allergic asthmatic lungs. Chest. 1993; 103: 1178-84 182. Sulakvelidze I, Inman M D, Rerecich T, O'Byrne P M. Increases in airway eosinophils and interleukin-5 with minimal bronchoconstriction during repeated low-dose allergen challenge in atopic asthmatics. Eur Respir J. 1998; 11: 821-27 183. Denzler K L, Farmer S C, Crosby J R, Borchers M, Cieslewicz G, Larson K A, Cormier-Regard S, Lee N A, Lee J J. Eosinophil Major Basic Protein-1 does not contribute to allergen-induced airway pathologies in mouse models of asthma. J Immunol. 2000; 165: 5509 184. Gleich G J, Adolphson C R, Leiferman K M. The biology of the eosinophilic leukocyte. Annu Rev Med. 1993; 44: 85-101 185. Busse W W, Sedgwick J B. Eosinophils in asthma. Ann Allergy. 1992; 68: 286-90 186. Elsner J, Kapp A. Regulation and modulation of eosinophil effector functions. Allergy. 1999; 54: 15-26
128
187. Gounni A S, Lamkhioued B, Delaporte E, Dubost A, Kinet JP, Capron A, Capron M. The highaffinity IgE receptor on eosinophils: from allergy to parasites or from parasites to allergy? J Allergy Clin Immunol. 1994; 94: 1214-16 188. Lee N A, McGarry M P, Larson K A, Horton M A, Kristensen A B, Lee J J. Expression of IL-5 in thymocytes/T cells leads to the development of a massive eosinophilia, extramedullary eosinophilopoiesis, and unique histopathologies. J Immunol. 1997; 158: 1332-44 189. Bochner B S. Cellular adhesion and its antagonism. J Allergy Clin Immunol. 1997; 100: 581-85 190. Wardlaw A J. Molecular basis for selective eosinophil trafficking in asthma: A multistep paradigm. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104: 917-26 191. Koarai A, Ichinose M, Ishigaki-Suzuki S, Yamagata S, Sugiura H, Sakurai E, Makabe-Kobayashi Y, Kuramasu A, Watanabe T, Shirato K, Hattori T, Ohtsu H. Disruption of L-histidine decarboxylase reduces airway eosinophilia but not hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 2003; 167: 7758-63 192. Nagata M, Sedgwick J B, Bates M E, Kita H, Busse W W. Eosinophil adhesion to vascular cell adhesion molecule-1 activates superoxide anion generation. J Immunol. 1995; 155: 2194-202 193. Ebisawa M, Yamada T, Bickel C, Klunk D, Schleimer RP. Eosinophil transendothelial migration induced by cytokines. III. Effect of the chemokine RANTES. J Immunol. 1994; 153: 2153-60 194. Carr M W, Alon R, Springer T A. The C-C chemokine MCP-1 differentially modulates the avidity of beta 1 and beta 2 integrins on T lymphocytes. Immunity. 1996; 4: 179-87 195. Rothenberg M E. Eosinophilia. N Engl J Med. 1998; 338: 1592-600 196. Gleich G J, Flavahan N A, Fujisawa T, Vanhoutte P M. The eosinophil as a mediator of damage to respiratory epithelium: a model for bronchial hyperreactivity. J Allergy Clin Immunol. 1988; 81: 776-81 197. Kita H, Ohnishi T, Okubo Y, Weiler D, Abrams J S, Gleich G J. Granulocyte/macrophage colonystimulating factor and interleukin 3 release from human peripheral blood eosinophils and neutrophils. J Exp Med. 1991; 174: 745-48 198. Her E, Frazer J, Austen K F, Owen W F. Eosinophil hematopoietins antagonize the programmed cell death of eosinophils: cytokine and glucocorticoid effects on eosinophils maintained by endothelial cell-conditioned medium. J. Clin. Invest. 1991; 88: 1982-87 199. Hoontrakoon R, Chu H W, Gardai S J, Wenzel S E, McDonald P, Fadok V A, Henson P M, Bratton D L. Interleukin-15 inhibits spontaneous apoptosis in human eosinophils via autocrine production of granulocyte macrophage-colony stimulating factor and nuclear factor-? B activation. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002; 26: 404-412 200. Nutka E, Soussi-Gounni A, Hazcku A, Holroyd K, Nicolaides N, Levitt R, Hamid Q. Stimulation of IL-9 receptors on human eosinophils upregulates IL-5 receptor mRNA expression. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 103: S113 201. Baatjes A J, Sehmi R, Saito H, Cyr M M, Dorman S C, Inman M D, O'Byrne PM, Denburg J A. Anti-allergic therapies: effects on eosinophil progenitors. Pharmacol Ther. 2002; 95: 63-72
129
202. Denburg J A.Cytokine-induced human basophil/mast cell growth and differentiation in vitro. Springer Semin Immunopathol. 1990; 12: 401-14 203. Clutterbuck E J, Hirst E M, Sanderson C J. Human interleukin-5 (IL-5) regulates the production of eosinophils in human bone marrow cultures: comparison and interaction with IL-1, IL-3, IL-6, and GMCSF. Blood. 1989; 73: 1504-12 204. Mechanisms of acute eosinophil mobilization from the bone marrow stimulated by interleukin 5: the role of specific adhesion molecules and phosphatidylinositol 3-kinase. J Exp Med. 1998; 188: 162132 205. Robinson D S, Damia R, Zeibecoglou K, Molet S, North J, Yamada T, Kay AB, Hamid Q. CD34(+)/interleukin-5Ralpha messenger RNA+ cells in the bronchial mucosa in asthma: potential airway eosinophil progenitors. Am J Respir Cell Mol Biol. 1999; 20: 9-13 206. Denburg J A, Telizyn S, Belda A, Dolovich J, Bienenstock J. Increased numbers of circulating basophil progenitors in atopic patients. J Allergy Clin Immunol. 1985; 76: 466-72 207. Gibson P G, Dolovich J, Girgis -Gabardo A, Morris M M, Anderson M, Hargreave F E, Denburg J A. The inflammatory response in asthma exacerbation: changes in circulating eosinophils, basophils and their progenitors. Clin Exp Allergy. 1990; 20: 661-68 208. Sehmi R, Wood L J, Watson R, Foley R, Hamid Q, O'Byrne P M, Denburg J A. Allergen-induced increases in IL-5 receptor alpha-subunit expression on bone marrow-derived CD34+ cells from asthmatic subjects. A novel marker of progenitor cell commitment towards eosinophilic differentiation. J Clin Invest. 1997; 100: 2466-75 209. Wood L J, Inman M D, Watson R M, Foley R, Denburg J A, O'Byrne P M. Changes in bone marrow inflammatory cell progenitors after inhaled allergen in asthmatic subjects. Am J Respir Crit Ca re Med. 1998; 157: 99-105 210. Robinson D S, Damia R, Zeibecoglou K, Molet S, North J, Yamada T, és mtsai. Presence of CD34+/IL-5+ eosinophil precursor cells in airways of asthmatic individuals. J Allergy Clin Immunol. 1999; 103: 9-13 211. Zangrilli J G, Shaver J R, Cirelli R A, Cho S K, Garlisi C G, Falcone A, Cuss F M, Fish J E, Peters S P. sVCAM-1 levels after segmental antigen challenge correlate with eosinophil influx, IL-4 and IL-5 production, and the late phase response. Am J Respir Crit Care Med. 1995; 151: 1346-53 212. Inman M D, Ellis R, Wattie J, Denburg J A, O'Byrne P M. Allergen-induced increase in airway responsiveness, airway eosinophilia, and bone-marrow eosinophil progenitors in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 1999; 21: 473-79 213. Rescigno M, Granucci F, Citterio S, Foti M, Ricciardi-Castagnoli P. Coordinated events during bacteria-induced DC maturation. Immunol Today. 1999; 20: 200-03 214. Banchereau J, Steinman R M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392: 24552 215. Lanzavecchia A, Sallusto F. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics. Curr. Opin. Immunol. 2001; 13: 291-98
130
216. Pulendran B, Smith J L, Caspary G, Brasel K, Pettit D, Maraskovsky E, Maliszewski C R. Distinct dendritic cell subsets differentially regulate the class of immune response in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 1036-41 217. Hilkens C M, Kalinski P, de Boer M, Kapsenberg M L. Human dendritic cells require exogenous interleukin-12-inducing factors to direct the development of naive T-helper cells toward the Th1 phenotype. Blood. 1997; 90: 1920-26 218. Schneider E, Piquet-Pellorce C, Dy M. New role for histamine in inteleukin-3-induced proliferation of hematopoetic stem cells. J Cell Physiol. 1990; 143: 337-343 219. Bolton E, King J, Morris D L. H2-antagonists in the treatment of colon and breast cancer. Semin Cancer Biol. 2000; 10: 3-10 220. Lunderius C, Xiang Z, Nilsson G, Hellman L. Murine mast cell lines as indicator of early events in mast cell and basophil development. Eur J Immunol. 2000; 30: 3396-402 221. Castells M C, Friend D S, Bunnell C, Austen K F. Identification and immunotyping of committed non-granulated mast cell precursors in the peripherial blood of a patient with aggressive systemic mastocytosis. Feb Am Soc Exp Biol. 1995; 9 222. Hiragun T, Morita E, Tanaka T, Kameyoshi V, Yamamoto S. A fibogenic cytokine, platlet derived growth factot (PDGF) enhances mast cell growth indirectly via a SCF- and fibroblast dependent pathway. J Invest Dermatol. 1998; 111: 213-17 223. Hart P H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunol Cell Biol. 2001; 79: 149 224. Malaviya R, Twesren N J, Ross E A, Abraham S N, Pfeifer J D. Mast cells process bacterial Ags through a phagocytic route for class I MHC presentation to T cells. J Immunol. 1996; 156: 1490-96 225. Akira S, Taga T, Kishimoto T. Interleukin-6 in biology and medicine. Adv Immunol. 1993; 54: 1-78 226. Kishimoto T, Taga T, Akira S. Cytokine signal transduction. Cell. 1994; 76: 253-62 227. Jones T H. Interleukin-6 an endocrine cytokine. Clin Endocrinol (Oxf). 1994; 40: 703-13 228. Nickel R, Beck L A, Stellato C, Schleimer R P.Chemokines and allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104: 723-42 229. Heaney M L, Golde D W. Soluble cytokine receptors. Blood. 1996; 87: 847-57 230. Besedovsky H O, del Rey A. Immune-neuro-endocrine interactions: facts and hypotheses. Endocr Rev. 1996; 17: 64-102 231. Hirano T, Matsuda T, Nakajima K. Signal transduction through gp130 that is shared among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem Cells . 1994; 12: 262-77 232. Himmelrich H, Parra-Lopez C, Tacchini-Cottier F, Louis J A, Launois P. The IL-4 rapidly produced in BALB/c mice after infection with Leishmania major down-regulates IL-12 receptor beta 2-chain expression on CD4+ T cells resulting in a state of unresponsiveness to IL-12. J Immunol. 1998; 161: 6156-63 233. Ying S, Durham S R, Corrigan C J, Hamid Q, Kay A B. Phenotype of cells expressing mRNA for TH2-type (interleukin 4 and interleukin 5) and TH1-type (interleukin 2 and interferon gamma) cytokines in bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies from atopic asthmatic and normal control subjects. Am J Respir Cell Mol Biol. 1995; 12: 477-87
131
234. Favre C, Saeland S, Caux C, Duvert V, De Vries J E. Interleukin-4 has basophilic and eosinophilic cell growth-promoting activity on cord blood cells. Blood. 1990; 75: 67-73 235. Shi H Z, Deng J M, Xu H, Nong Z X, Xiao C Q, Liu Z M, Qin S M, Jiang H X, Liu G N, Chen Y Q. Effect of inhaled interleukin-4 on airway hyperreactivity in asthmatics. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 1818-21 236. Lee J J, McGarry M P, Farmer S C, Denzler K L, Larson K A, Carrigan P E, Brenneise I E, Horton M A, Haczku A, Gelfand E W, Leikauf G D, Lee N A. Interleukin-5 expression in the lung epithelium of transgenic mice leads to pulmonary changes pathognomonic of asthma. J Exp Med. 1997; 185: 2143-56 237. Corry D B, Folkesson H G, Warnock M L, Erle D J, Matthay M A, Wiener-Kronish J P, Locksley R M. Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity. J Exp Med. 1996; 183: 109-17. Erratum in: J Exp Med 1997; 185: 1715 238. Brusselle G G, Kips J C, Tavernier J H, van der Heyden J G, Cuvelier C A, Pauwels R A, Bluethmann H. Attenuation of allergic airway inflammation in IL-4 deficient mice. Clin Exp Allergy. 1994; 24: 73-80 239. Mehlhop P D, van de Rijn M, Goldberg A B, Brewer J P, Kurup V P, Martin T R, Oettgen H C. Allergen-induced bronchial hyperreactivity and eosinophilic inflammation occur in the absence of IgE in a mouse model of asthma. Proc Natl Acad Sci. 1997; 94: 13444-49 240. Grunig G, Warnock M, Wakil A E, Venkayya R, Brombacher F, Rennick D M, Sheppard D, Mohrs M, Donaldson D D, Locksley R M, Corry D B. Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma. Science. 1998; 282: 2261-63 241. Humbert M, Durham S R, Kimmitt P, Powell N, Assoufi B, Pfister R, Menz G, Kay A B, Corrigan C J. Elevated expression of messenger ribonucleic acid encoding IL-13 in the bronchial mucosa of atopic and nonatopic subjects with asthma. J Allergy Clin Immunol. 1997; 99: 657-65 242. Kotsimbos T C, Ghaffar O, Minshall E M, Humbert M, Durham S R, Pfister R, Menz G, Kay A B, Hamid Q A. Expression of the IL-4 receptor alpha-subunit is increased in bronchial biopsy specimens from atopic and nonatopic asthmatic subjects. J Allergy Clin Immunol. 1998; 102: 85966 243. Cohn L, Homer R J, MacLeod H, Mohrs M, Brombacher F, Bottomly K. Th2-induced airway mucus production is dependent on IL-4Ralpha, but not on eosinophils. J Immunol. 1999; 162: 6178-83 244. Li L, Xia Y, Nguyen A, Lai Y H, Feng L, Mosmann T R, Lo D. Effects of Th2 cytokines on chemokine expression in the lung: IL-13 potently induces eotaxin expression by airway epithelial cells. J Immunol. 1999; 162: 2477-87 R-8/90 245. Wills -Karp M, Luyimbazi J, Xu X, Schofield B, Neben T Y, Karp C L, Donaldson D D. Interleukin13: central mediator of allergic asthma. Science. 1998; 282: 2258-61 246. Doherty T M, Kastelein R, Menon S, Andrade S, Coffman R L. Modulation of murine macrophage function by IL-13. J Immunol. 1993; 151: 7151-60 247. Striz I, Mio T, Adachi Y, Romberger D J, Rennard S I. Th2-type cytokines modulate IL-6 release by human bronchial epithelial cells. Immunol Lett. 1999; 70: 83-88
132
248. Webb D C, McKenzie A N, Koskinen A M, Yang M, Mattes J, Foster P S. Integrated signals between IL-13, IL-4, and IL-5 regulate airways hyperreactivity. J Immunol. 2000; 165: 108-13 249. Ford G J, Rennick D, Donaldson D D, Venkayya R, McArthur C, Hansell E, Grünig G. IL-13 and INF-?: interaction in lung inflammation. J Immunol. 2001; 167: 1769-77 250. Pope S M, Brandt E B, Mishra A, Hogan S P, Zimmermann N, Matthaei K I, Foster P S, Rothenberg M E. IL-13 induces eosinophil recruitment into the lung by an IL-5- and eotaxin-dependent mechanism. J Allergy Clin Immunol. 2001; 108: 594-601 251. Hamid Q, Azzawi M, Ying S, Moqbel R, Wardlaw A J, Corrigan C J, Bradley B, Durham S R, Collins J V, Jeffery P K, és mtsai. Interleukin -5 mRNA in mucosal bronchial biopsies from asthmatic subjects. Int Arch Allergy Appl Immunol. 1991; 94: 169-70 252. Yasruel Z, Humbert M, Kotsimbos T C, Ploysongsang Y, Minshall E, Durham S R, Pfister R, Menz G, Tavernier J, Kay A B, Hamid Q. Membrane-bound and soluble alpha IL-5 receptor mRNA in the bronchial mucosa of atopic and nonatopic asthmatics. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155: 141318 253. Shi H Z, Xiao C Q, Zhong D, Qin S M, Liu Y, Liang G R, Xu H, Chen Y Q, Long X M, Xie Z F. Effect of inhaled interleukin-5 on airway hyperreactivity and eosinophilia in asthmatics. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 204-09 254. Lamkhioued B, Renzi P M, Abi-Younes S, Garcia -Zepada E A, Allakhverdi Z, Ghaffar O, Rothenberg M D, Luster A D, Hamid Q. Increased expression of eotaxin in bronchoalveolar lavage and airways of asthmatics contributes to the chemotaxis of eosinophils to the site of inflammation. J Immunol. 1997; 159: 4593-601 255. Foster P S, Hogan S P, Ramsay A J, Matthaei K I, Young I G. IL-5 deficiency abolishes eosinophilia, airways hyperreactivity and lung damage in a mouse asthma model. J Exp Med. 1996; 183: 195-201 256. Hamelmann E, Cieslewicz G, Schwarze J, Ishizuka T, Joetham A, Heusser C, Gelfand EW. Antiinterleukin 5 but not anti-IgE prevents airway inflammation and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 934-41 257. Kopf M, Brombacher F, Hodgkin P D, Ramsay A J, Milbourne E A, Dai W J, Ovington K S, Behm C A, Kohler G, Young I G, Matthaei K I. IL-5-deficient mice have a developmental defect in CD5+ B-1 cells and lack eosinophilia but have normal antibody and cytotoxic T cell responses. Immunity. 1996; 4: 15-24 258. Kuperman D, Schofield B, Wills -Karp M, Grusby M J. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (Stat6)-deficient mice are protected from antigen-induced airway hyperresponsiveness and mucus production. J Exp Med. 1998; 187: 939-48 259. Tomkinson A, Kanehiro A, Rabinovitch N, Joetham A, Cieslewicz G, Gelfand E W. The failure of STAT6-deficient mice to develop airway eosinophilia and airway hyperresponsiveness is overcome by interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 1283-91
133
260. Hamelmann E, Oshiba A, Schwarze J, Bradley K, Loader J, Larsen G L, Gelfand E W. Allergenspecific IgE and IL-5 are essential for the development of airway hyperresponsiveness. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997; 16: 674-82 261. Wong C K, Ho C Y, Ko F W, Chan C H, Ho A S, Hui D S, Lam C W. Proinflammatory cytokines (IL-17, IL-6, IL-18 and IL-12) and Th cytokines (IFN-gamma, IL-4, IL-10 and IL-13) in patients with allergic asthma. Clin Exp Immunol. 2001; 125: 177-83 262. Chakir J, Shannon J, Molet S, Fukakusa M, Elias J, Laviolette M, Boulet LP, Hamid Q. Airway remodeling-associated mediators in moderate to severe asthma: effect of steroids on TGF -beta, IL11, IL-17, and type I and type III collagen expression. J Allergy Clin Immunol. 2003; 111: 1293-98 263. Linden A, Hoshino H, Laan M.Airway neutrophils and interleukin-17. Eur Respir J. 2000; 15: 97377 264. Barczyk A, Pierzchala W, Sozanska E. Interleukin-17 in sputum correlates with airway hyperresponsiveness to methacholine. Respir Med. 2003; 97: 726-33 265. Hellings P W, Kasran A, Liu Z, Vandekerckhove P, Wuyts A, Overbergh L, Mathieu C, Ceuppens J L. Interleukin-17 Orchestrates the Granulocyte Influx into Airways after Allergen Inhalation in a Mouse Model of Allergic Asthma. Am J Respir Cel Mol Biol. 2003; 28: 42-50 266. Renauld J C, Goethals A, Houssiau F, Merz H, Van Roost E, van Snick J. Human IL-9 expression in activated CD4+ T cells, genomic organization, and comparison with the mouse gene. J Immunol. 1990; 144: 4235-41 267. Uyttenhove C, Simpson RJ, van Snick J. Functional and structural characterization of P40, a mouse glycoprotein with T-cell growth factor activity. Proc Natl Acad Sci. 1988; 85: 6934-38 268. Houssiau F A, Renauld J C, Stevens M, Lehmann F, Lethe B, Coulie P G, van Snick J. Human T cell lines and clones respond to IL-9. J Immu nol. 1993; 150: 2634-40 269. Hultner L, Druez C, Moeller J, Uyttenhove C, Schmitt E, Rude E, Dormer P, van Snick J. Mast cell growth-enhancing activity (MEA) si structurally related and functionally identical to the novel mouse T cell growth factor P40/TCGFIII (interleukin 9). Eur J Immunol. 1990; 20: 1413-16 270. Williams D E, Morrissey P J, Mochizuki D Y, de Vries P, Anderson D, Cosman D, Boswell H S, Cooper S, Grabstein K H, Broxmeyer H E. T-cell growth factor P40 promotes the proliferation of myeloid cell lines and enhances erythroid burst formation by normal murine bone marrow cells in vitro. Blood. 1990; 76: 906-11 271. Dugas B, Renauld J C, Pene J, Bonnefoy J Y, Peti-Frere C, Braquet P, Bousquet J, Van Snick J, Mencia-Huerta J M. Interleukin-9 potentiates the interleukin-4-induced immunoglobulin (IgG, IgM and IgE) production by normal human B lymphocytes. Eur J Immunol. 1993; 23: 1687-92 272. Temann U A, Geba G P, Rankin J A, Flavell R A. Expression of interleukin 9 in the lungs of transgenic
mice
causes
airway
inflammation,
mast
cell
hyperplasia,
and
bronchial
hyperresponsiveness. J Exp Med. 1998; 188: 1307-20 273. McMillan S J, Bishop B, Townsend M J, McKenzie A N, Lloyd C M. The absence of interleukin 9 does not affect the development of allergen-induced pulmonary inflammation nor airway hyperreactivity. J Exp Med. 2002; 195: 51-57
134
274. Fiorentino D F, Zlotnik A, Mosmann T R, Howard M, O'Garra A. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol. 1991; 147: 3815-22 275. Hsu D H, Moore K W, Spits H. Differential effects of IL-4 and IL-10 on IL-2-induced IFN-gamma synthesis and lymphokine-activated killer activity. Int Immunol. 1992; 4: 563-69 276. del Prete G, de Carli M, Almerigogna F, Giudizi M G, Biagiotti R, Romagnani S. Human IL-10 is produced by both type 1 helper (Th1) and type 2 helper (Th2) T cell clones and inhibits their antigen-specific proliferation and cytokine production. J Immunol. 1993; 150: 353-60 277. Amorim C Z, Creminon C, Nevers M C, Nahori M A, Vargaftig B B, Pretolani M. Modulation by IL-10 of antigen-induced IL-5 generation, and CD4+ T lymphocyte and eosinophil infiltration into the mouse peritoneal cavity. J Immunol. 1996; 157: 377-84 278. Akdis C A, Joss A, Akdis M, Faith A, Blaser K. A molecular basis for T cell suppression by IL-10: CD28-associated IL-10 receptor inhibits CD28 tyrosine phosphorylation and phosphatidylinositol 3kinase binding. FASEB J. 2000; 14: 1666-68 279. Zuany-Amorim C, Haile S, Leduc D, Du marey C, Huerre M, Vargaftig BB, Pretolani M. Interleukin-10 inhibits antigen-induced cellular recruitment into the airways of sensitized mice. J Clin Invest. 1995; 95: 2644-51 280. Makela M J, Kanehiro A, Borish L, Dakhama A, Loader J, Joetham A, Xing Z, Jordana M, Larsen G L, Gelfand E W. IL-10 is necessary for the expression of airway hyperresponsiveness but not pulmonary inflammation after allergic sensitization. Proc Natl Acad Sci. 2000; 97: 6007-12 281. T-1/30 Tang M L, Kemp A S, Thorburn J, Hill D J. Reduced interferon-gamma secretion in neonates and subsequent atopy. Lancet. 1994; 344: 983-85 282. Bruselle G G, Kips J C, Peleman R A, Joos G F, Devos R R, Tavernier J H, Pauwels R A. Role of IFN-gamma in the inhibition of the allergic airway inflammation caused by IL-12. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997; 17: 767-71 283. Maecker H T, Hansen G, Walter D M, DeKruyff R H, Levy S, Umetsu D T. Vaccination with allergen-IL-18 fusion DNA protects against, and reverses established, airway hyperreactivity in a murine asthma model. J Immunol. 2001; 166: 959-65 284. Erb K J, Holloway J W, Sobeck A, Moll H, le Gros G. Infection of mice with Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) suppresses allergen-induced airway eosinophilia. J Exp Med. 1998; 187: 561-69 285. Broide D, Schwarze J, Tighe H, Gifford T, Nguyen M D, Malek S, Van Uden J, Martin-Orozco E, Gelfand E W, Raz E. Immunostimulatory DNA sequences inhibit IL-5, eosinophilic inflammation, and airway hyperresponsiveness in mice. J Immunol. 1998; 161: 7054-62 286. Lack G, Renz H, Saloga J, Bradley KL, Loader J, Leung DY, Larsen G, Gelfand E W. Nebulized but not parenteral IFN-gamma decreases IgE production and normalizes airways function in a murine model of allergen sensitization. J Immunol. 1994; 152: 2546-54 287. Cembrzynska-Nowak M, Szklarz E, Inglot A D, Teodorczyk-Injeyan J A. Elevated release of tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma by bronchoalveolar leukocytes from patients with bronchial asthma. Am Rev Respir Dis. 1993; 147: 291-95 288. Herrod H G. Interleukins in immunologic and allergic diseases. Ann Allergy. 1989; 63: 269-72
135
289. Burton J D, Bamford R N, Peters C, Grant A J, Kurys G, Goldman C K, Brennan J, Roessler E, Waldmann T A. A lymphokine, provisionally designated interleukin T and produced by a human adult T-cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells. Proc Natl Acad Sci. 1994; 91: 4935-39 290. Kennedy M K, Park L S. Characterization of interleukin-15 (IL-15) and the IL-15 receptor complex. J. Clin. Immunol. 1996; 16: 134-43 291. Fehniger T A, Caligiuri M A. Interleukin 15: biology and relevance to human disease. Blood. 2001; 97: 14-32 292. Seder R A. High-dose IL-2 and IL-15 enhance the in vitro priming of naive CD4+ T cells for IFNbut have differential effects on priming for IL-4. J Immunol. 1996; 156: 2413-22 293. Muro S, Taha R, Tsicopoulos A, Olivenstein R, Tonnel AB, Christodoulopoulos P, Wallaert B, Hamid Q. Expression of IL-15 in inflammatory pulmonary diseases. J Allergy Clin Immunol. 2001; 108: 970-75 294. Ong P Y, Hamid Q A, Travers J B, Strickland I, Kerithy M A, Boguniewicz M, Leung D Y M. Decreased IL-15 may contribute to elevated IgE and acute inflammation in atopic dermatitis. J Immunol. 2002; 168: 505-10 295. Hoontrakoon R, Chu H W, Gardai S J, Wenzel S E, McDonald P, Fadok V A, Henson P M, Bratton D L. Interleukin-15 inhibits spontaneous apoptosis in human eosinophils via autocrine production of granulocyte macrophage-colony stimulating factor and nuclear factor-kappaB activation. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002; 26: 404-12 296. Fehniger T A, Shah M H, Turner M J, vanDeusen J B, Whitman S P, Cooper M A, Suzuki K, Wechser M, Goodsaid F, Caligiuri M A. Differential cytokine and chemokine gene expression by human NK cells following activation with IL-18 or IL-15 in combination with IL-12: implications for the innate immune response. J. Immunol. 1999; 162: 4511-20 297. Mori A, Suko M, Kaminuma O, Inoue S, Ohmura T, Nishizaki Y, Nagahori T, Asakura Y, Hoshino A, Okumura Y, Sato G, Ito K, Okudaira H. IL-15 promotes cytokine production of human T helper cells. J. Immunol. 1996; 156: 2400-05 298. Ishimitsu R, Nishimura H, Yajima T, Watase T, Kawauchi H, Yoshikai Y. Overexpression of IL-15 in vivo enhances Tc1 response, which inhibits allergic inflammation in a murine model of asthma. J Immunol. 2001; 166: 1991-2001 299. Cruikshank W W, Long A, Tarpy R E, Kornfeld H, Carroll M P, Teran L, Holgate S T, Center D M. Early identification of interleukin-16 (lymphocyte chemoattractant factor) and macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP1 alpha) in bronchoalveolar lavage fluid of antigen-challenged asthmatics. Am J Respir Cell Mol Biol. 1995; 13: 738-47 300. Mashikian M V, Tarpy R E, Saukkonen J J, Lim K G, Fine G D, Cruikshank W W, Center D M. Identification of IL-16 as the lymphocyte chemotactic activity in the bronchoalveolar lavage fluid of histamine-challenged asthmatic patients. J Allergy Clin Immunol. 1998; 101: 786-92 301. Laberge S, Pinsonneault S, Ernst P, Olivenstein R, Ghaffar O, Center D M, Hamid Q. Phenotype of IL-16-producing cells in bronchial mucosa: evidence for the human eosinophil and mast cell as cellular sources of IL-16 in asthma. Int Arch Allergy Immunol. 1999; 119: 120-05
136
302. Hilkens C M, Kalinski P, de Boer M, Kapsenberg M L. Human dendritic cells require exogenous interleukin-12-inducing factors to direct the development of naive T-helper cells toward the Th1 phenotype. Blood. 1997; 90: 1920-06 303. Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, Okamura H. Interleukin-18 is a unique cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses depending on its cytokine milieu. Cytokine Growth Factor Rev. 2001; 12: 53-72 304. Ohkusu K, Yoshimoto T, Takeda K, Ogura T, Kashiwamura S, Iwakura Y, Akira S, Okamura H, Nakanishi K. Potentiality of interleukin-18 as a useful reagent for treatment and prevention of Leishmania major infection. Infect Immun. 2000; 68: 2449-56 305. Robinson D, Shibuya K, Mui A, Zonin F, Murphy E, Sana T, Hartley S B, Menon S, Kastelein R, Bazan F, O'Garra A. IGIF does not drive Th1 development but synergizes with IL-12 for interferongamma production and activates IRAK and NF-B. Immunity 1997; 7: 571– 81 306. Okamura H, Tsutsui H, Komatsu T, és mtsai. Cloning of a new cytokine that induces IFN production by T cells. Nature 1995; 378: 88–91 307. Yoshimoto T, Takeda K, Tanaka T, és mtsai. IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1 cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-production. J. Immunol. 1998; 161: 3400–07 308. Yoshimoto T, Okamura H, Tagawa Y I, Iwakura Y, Nakanishi K. Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon production from activated B cells. Acad Sci Proc Natl. 1997; 94: 3948–53 309. Hoshino T, Wiltrout R H, Young H A. IL-18 is a potent coinducer of IL-13 in NK and T cells: a new potential role for IL-18 in modulating the immune response. J Immunol. 1999; 162: 5070–77 310. Yoshimoto T, Mizutani H, Tsutsui H, Noben-Trauth N, Yamanaka K, Tanaka M, Izumi S, Okamura H, Paul W E, Nakanishi K. IL-18 induction of IgE: dependence on CD4+ T cells, IL-4 and STAT6. Nat Immunol. 2000; 1: 132–37 311. Hyodo Y, Matsui K, Hayashi N, Tsutsui H, Kashiwamura S, Yamauchi H, Hiroishi K, Takeda K, Tagawa Y, Iwakura Y, Kayagaki N, Kurimoto M, Okamura H, Hada T, Yagita H, Akira S, Nakanishi K, Higashino K. IL-18 up-regulates perforin-mediated NK activity without increasing perforin messenger RNA expression by binding to constitutively expressed IL-18 receptor. J. Immunol. 1999; 162: 1662–1668 312. Okamoto I, Kohno K, Tanimoto T, Ikegami H, Kurimoto M. Development of CD8+ effector T cells is differentially regulated by IL-18 and IL-12. J Immunol. 1999; 162: 3202–11 313. Kodama T, Matsuyama T, Kuribayashi K, és mtsai. IL-18 deficiency selectively enhances allergeninduced eosinophilia in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 2000; 105: 45–53 314. Campbell E, Kunkel S L, Strieter R M, Lukacs N W. Differential roles of IL-18 in allergic airway disease: induction of eotaxin by resident cell populations exacerbates eosinophils accumulation. J Immunol. 2000; 164: 1096–102
137
315. Wild J S, Sigounas A, Sur N, Siddiqui M S, Alam R, Kurimoto M, Sur S. IFN-? inducing factor (IL18) increases allergic sensitization, serum IgE, Th2 cytokines, and airway eosinophilia in mouse model of allergic asthma. J. Immunol. 2000; 164: 2701–10 316. Baggiolini M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 1998; 392: 565-68 317. Ma Q, Jones D, Borghesani P R, Segal R A, Nagasawa T, Kishimoto T, Bronson R T, Springer T A. Impaired B-lymphopoiesis, myelopoiesis, and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4- and SDF-1-deficient mice. Proc Natl Acad Sci. 1998; 95: 9448-53 318. Quackenbush E J, Wershil B K, Aguirre V, Gutierre z-Ramos J C. Eotaxin modulates myelopoiesis and mast cell development from embryonic hematopoietic progenitors. Blood. 1998; 92: 1887-97 319. Stellato C, Collins P, Ponath PD, Soler D, Newman W, la Rosa G, Li H, White J, Schwiebert LM, Bickel C, Liu M, Bochner B S, Williams T, Schleimer R P. Production of the novel C-C chemokine MCP-4 by airway cells and comparison of its biological activity to other C-C chemokines. J Clin Invest. 1997; 99: 926-36 320. Lukacs N W, Oliveira S H, Hogaboam C M . Chemokines and asthma: redundancy of function or a coordinated effort? J Clin Invest. 1999; 104: 995-99 321. Combadiere C, Ahuja S K, Murphy P M. Cloning and functional expression of a human eosinophil CC chemokine receptor. J Biol Chem. 1995; 270: 16491-94 322. Qiu B, Frait K A, Reich F, Komuniecki E, Chensue S W. Chemokine expression dynamics in mycobacterial (type-1) and Schistosomal (type-2) antigen-elicited pulmonary granuloma formation. Am J Pathol. 2001; 158:1503-15 323. Campbell J J, Hedrick J, Zlotnik A, Siani M A, Thompson D A, Butcher E C. Chemokines and the arrest of lymphocytes rolling under flow condition. Science. 1998; 279: 381-84 324. Matthews A N, Friend D S, Zimmermann N, Sarafi M N, Luster A D, Pearlman E, Wert S E, Rothenberg M E. Eotaxin is required for the baseline level of tissue eosinophils. Proc Natl Acad Sci. 1998; 95: 6273-78 325. Scheuerer B, Ernst M, Durrbaum-Landmann I, Fleischer J, Grage-Griebenow E, Brandt E, Flad H D, Petersen F. The CXC-chemokine platelet factor 4 promotes monocyte survival and induces monocyte differentiation into macrophages. Blood. 2000; 95: 1158-66 326. Sousa A R, Lane S J, Nakhosteen J A, Yoshimura T, Lee T H, Poston R N. Increased expression of the monocyte chemoattractant protein-1 in bronchial tissue from asthmatic subjects. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994; 10: 142-47 327. Wang J H, Devalia J L, Xia C, Sapsford R J, Davies R J. Expression of RANTES by human bronchial epithelial cells in vitro and in vivo and the effect of corticosteroids. Am J Respir Cell Mol Biol. 1996; 14: 27-35 328. Park M, Hoffmann K F, Cheever A W, Amichay D, Wynn T A, Farber J M. Patterns of chemokines expression in models of Schistosoma mansoni inflammation and infection reveal relationship between type 1 and type 2 responses and chemokines in vivo. Infect.Immun.2001; 69: 6755-68
138
329. Gangur V, Simons F E, HayGlass K T. IP-10 mediated reinforcement of human type 1 cytokine synthesis to environmental allergens among non-atopic subjects. Int Arch Allergy Immunol. 1999; 118: 387-90 330. Sallusto F, Mackay C R, Lanzavecchia A. Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2 cells. Science. 1997; 277: 2005-07 331. Bonecchi R, Bianchi G, Bordignon P P, D'Ambrosio D, Lang R, Borsatti A, Sozzani S, Allavena P, Gray P A, Mantovani A, Sinigaglia F. Differential expression of chemokine receptors and chemotactic responsiveness of type 1 T helper cells (Th1s) and Th2s. J Exp Med. 1998; 187: 129-34 332. Zingoni A, Soto H, Hedrick J A, Stoppacciaro A, Storlazzi C T, Sinigaglia F, D'Ambrosio D, O'Garra A, Robinson D, Rocchi M, Santoni A, Zlotnik A, Napolitano M.The chemokine receptor CCR8 is preferentially expressed in Th2 but not Th1 cells. J Immunol. 1998 ; 161: 547-51 333. Sallusto F, Lenig D, Mackay C R, Lanzavecchia A. Flexible programs of chemokine receptor expression on human polarized T helper 1 and 2 lymphocytes. J Exp Med. 1998; 187: 875-83 334. Loetscher P, Uguccioni M, Bordoli L, Baggiolini M, Moser B, Chizzolini C, Dayer J M. CCR5 is characteristic of Th1 lymphocytes. Nature. 1998; 391: 344-45 335. Loetscher M, Gerber B, Loetscher P, Jones S A, Piali L, Clark-Lewis I, Baggiolini M, Moser B. Chemokine receptor specific for IP10 and mig: structure, function, and expression in activated Tlymphocytes. J Exp Med. 1996; 184: 963-69 336. Miotto D, Christodoulopoulos P, Olivenstein R, Taha R, Cameron L, Tsicopoulos A, Tonnel A B, Fahy O, Lafitte J J, Luster A D, Wallaert B, Mapp C E, Hamid Q. Expression of IFN-gamma inducible protein; monocyte chemotactic proteins 1, 3, and 4; and eotaxin in TH1- and TH2mediated lung diseases. J Allergy Clin Immunol. 2001; 107: 664-70 337. Medoff B D, Sauty A, Tager A M, Maclean J A, Smith R N, Mathew A, Dufour J H, Luster A D. IFN-gamma -inducible protein 10 (CXCL10) contributes to airway hyperreactivity and airway inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 2002; 168: 5278-86 338. Karpus W J, Lukacs N W, Kennedy K J, Smith W S, Hurst S D, Barrett T A. Differential CC chemokine-induced enhancement of T helper cell cytokine production. J Immunol. 1997; 158: 412936 339. Doucet C, Brouty-Boye D, Pottin-Clemenceau C, Canonica GW, Jasmin C, Azzarone B. Interleukin (IL) 4 and IL-13 act on human lung fibroblasts. Implication in asthma. J Clin Invest. 1998; 101: 2129-39 340. Mochizuki M, Bartels J, Mallet A I, Christophers E, Schroder J M. IL-4 induces eotaxin: a possible mechanism of selective eosinophil recruitment in helminth infection and atopy. J Immunol. 1998; 160: 60-68 341. Stellato C, Matsukura S, Fal A, White J, Beck LA, Proud D, Schleimer R P. Differential regulation of epithelial-derived C-C chemokine expression by IL-4 and the glucocorticoid budesonide. J Immunol. 1999; 163: 5624-32 342. Schleimer R P, Sterbinsky S A, Kaiser J, Bickel C A, Klunk D A, Tomioka K, Newman W, Luscinskas F W, Gimbrone M A Jr, McIntyre B W, és mtsai. IL-4 induces adherence of human
139
eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium. Association with expression of VCAM-1. J Immunol. 1992; 148: 1086-92 343. Schweizer R C, Welmers B A, Raaijmakers J A, Zanen P, Lammers J W, Koenderman L. RANTES and interleukin -8-induced responses in normal human eosinophils: effects of priming with interleukin-5. Blood. 1994; 83: 3697-704 344. Warringa R A, Mengelers H J, Raaijmakers J A, Bruijnzeel P L, Koenderman L. Upregulation of formyl-peptide and interleukin-8-induced eosinophil chemotaxis in patients with allergic asthma. J Allergy Clin Immunol. 1993; 91: 1198-205 345. Chung K F. In: Barnes P J, Grunstein M M, Leff A R, Woolclock A J, editors. Asthma. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1997. p 673-82 346. Luster A D, Unkeless J C, Ravetch J V. Gamma -interferon transcriptionally regulates an earlyresponse gene containing homology to platelet proteins. Nature. 1985; 315: 672-76 347. Lilly C M, Nakamura H, Kesselman H, Nagler-Anderson C, Asano K, Garcia -Zepeda E A, Rothenberg M E, Drazen J M, Luster A D. Expression of eotaxin by human lung epithelial cells: induction by cytokines and inhibition by glucocorticoids. J Clin Invest. 1997; 99: 1767-73 348. Hamid Q A, Minshall E M. Molecular pathology of allergic disease: I: lower airway disease. J Allergy Clin Immunol. 2000; 105: 20-36 349. Gonzalo J A, Lloyd C M, Wen D, Albar J P, Wells T N, Proudfoot A, Martinez-A C, Dorf M, Bjerke T, Coyle A J, Gutierrez-Ramos J C. The coordinated action of CC chemokines in the lung orchestrates allergic inflammation and airway hyperresponsiveness. J Exp Med. 1998; 188: 157-67 350. Gonzalo J A, Pan Y, Lloyd C M, Jia G Q, Yu G, Dussault B, Powers C A, Proudfoot A E, Coyle A J, Gearing D, Gutierrez-Ramos J C. Mouse monocyte-derived chemokine is involved in airway hyperreactivity and lung inflammation. J Immunol. 1999; 163: 403-11 351. Holgate S T, Bodey K S, Janezic A, Frew A J, Kaplan A P, Teran L M. Release of RANTES, MIP-1 alpha, and MCP-1 into asthmatic airways following endobronchial allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 156: 1377-83 352. Karpus W J, Kennedy K J. MIP-1alpha and MCP-1 differentially regulate acute and relapsing autoimmune encephalomyelitis as well as Th1/Th2 lymphocyte differentiation. J Leukoc Biol. 1997; 62: 681-87 353. Gleich G J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2000; 105: 651-63 354. Bochner B S. Systemic activation of basophils and eosinophils: markers and consequences. Allergy Clin Immunol. 2000; 106: S292-S02 355. Campbell E M, Charo I F, Kunkel S L, Strieter R M, Boring L, Gosling J, Lukacs N W. Monocyte chemoattractant protein-1 mediates cockroach allergen-induced bronchial hyperreactivity in normal but not CCR2-/- mice: the role of mast cells. J Immunol. 1999; 163: 2160-67 356. Leung D Y. Atopic dermatitis: the skin as a window into the pathogenesis of chronic allergic diseases. J Allergy Clin Immunol. 1995; 96: 302–18 357. Oberlin E, Amara A, Bachelerie F, Bessia C, Virelizier J L, Arenzana-Seisdedos F, Schwartz O, Heard J M, Clark-Lewis I, Legler D F, Loetscher M, Baggiolini M, Moser B. The CXC chemokine
140
SDF-1 is the ligand for LESTR/fusin and prevents infection by T-cell-line-adapted HIV-1. Nature. 1996; 382: 833-35 358. Yoshida R, Imai T, Hieshima K, Kusuda J, Baba M, Kitaura M, Nishimura M, Kakizaki M, Nomiyama H, Yoshie O. Molecular cloning of a novel human CC chemokine EBI1-ligand chemokine that is a specific functional ligand for EBI1, CCR7. J Biol Chem. 1997; 272: 13803-09 359. Ying S, Robinson D S, Meng Q, Rottman J, Kennedy R, Ringler D J, Mackay C R, Daugherty B L, Springer M S, Durham S R, Williams T J, Kay A B. Enhanced expression of eotaxin and CCR3 mRNA and protein in atopic asthma. Association with airway hyperresponsiveness and predominant co-localization of eotaxin mRNA to bronchial epithelial and endothelial cells. Eur J Immunol. 1997; 27: 3507-16 360. Brown J R, Kleimberg J, Marini M, Sun G, Bellini A, Mattoli S. Kinetics of eotaxin expression and its relationship to eosinophil accumulation and activation in bronchial biopsies and bronchoalveolar lavage (BAL) of asthmatic patients after allergen inhalation. Clin Exp Immunol. 1998; 114: 137-46 361. Ghaffar O, Hamid Q, Renzi PM, Allakhverdi Z, Molet S, Hogg J C, Shore S A, Luster A D, Lamkhioued B. Constitutive and cytokine-stimulated expression of eotaxin by human airway smooth muscle cells. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 159: 1933-42 362. Teran L M, Mochizuki M, Bartels J, Valencia E L, Nakajima T, Hirai K, Schroder J M . Th1- and Th2-type cytokines regulate the expression and production of eotaxin and RANTES by human lung fibroblasts. Am J Respir Cell Mol Biol. 1999; 20: 777-86 363. Mould A W, Matthaei K I, Young I G, Foster P S. Relationship between interleukin-5 and eotaxin in regulating blood and tissue eosinophilia in mice. J Clin Invest. 1997; 99: 1064-71 364. Jeannin P, Delneste Y, Gosset P, Molet S, Lassalle P, Hamid Q, Tsicopoulos A, Tonnel A B Histamine induces interleukin-8 secretion by endothelial cells. Blood. 1994; 84: 2229-33 365. Heath H, Qin S, Rao P, Wu L, LaRosa G, Kassam N, Ponath PD, Mackay C R. Chemokine receptor usage by human eosinophils. The importance of CCR3 demonstrated using an antagonistic monoclonal antibody. J Clin Invest. 1997; 99: 178-84 366. Yawalkar N, Uguccioni M, Scharer J, Braunwalder J, Karlen S, Dewald B, Braathen L R, Baggiolini M. Enhanced expression of eotaxin and CCR3 in atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 1999; 113: 43-48 367. Rothenberg M E, MacLean J A, Pearlman E, Luster A D, Leder P. Targeted disruption of the chemokine eotaxin partially reduces antigen-induced tissue eosinophilia. J Exp Med. 1997; 185: 785-90 368. Palframan R T, Collins P D, Williams T J, Rankin S M. Eotaxin induces a rapid release of eosinophils and their progenitors from the bone marrow. Blood. 1998; 91: 2240-48 369. Griffiths-Johnson D A, Collins P D, Rossi A G, Jose P J, Williams T J. The chemokine, eotaxin, activates guinea-pig eosinophils in vitro and causes their accumulation into the ul ng in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 1993; 197: 1167-72 370. Teran L M, Noso N, Carroll M, Davies D E, Holgate S, Schroder J M. Eosinophil recruitment following allergen challenge is associated with the release of the chemokine RANTES into asthmatic airways. J Immunol. 1996; 157: 1806-12
141
371. Schroder J M, Noso N, Sticherling M, Christophers E. Role of eosinophil-chemotactic C-C chemokines in cutaneous inflammation. J Leukoc Biol. 1996; 59: 1-5 372. Berkman N, Krishnan V L, Gilbey T, Newton R, O'Connor B, Barnes P J, Chung K F. Expression of RANTES mRNA and protein in airways of patients with mild asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154: 1804-11 373. Venge J, Lampinen M, Hakansson L, Rak S, Venge P. Identification of IL-5 and RANTES as the major eosinophil chemoattractants in the asthmatic lung. J Allergy Clin Immunol. 1996; 97: 1110-15 374. Beck L A, Dalke S, Leiferman K M, Bickel C A, Hamilton R, Rosen H, Bochner B S, Schleimer R P. Cutaneous injection of RANTES causes eosinophil recruitment: comparison of nonallergic and allergic human subjects. J Immunol. 1997; 159: 2962-72 375. Kahlson G, Rosengren E. New approaches to the physiology of histamine. Physiol Rev. 1968; 48: 155-96 376. Leurs R, Smit MJ, Timmerman H. Molecular pharmacological aspects of histamine receptors. Pharmacol Ther. 1995; 66: 413-63 377. Assanasen P, Naclerio R M. Antiallergic anti-inflammatory effects of H1-antihistamines in humans. Clin. Allergy Immunol.2002; 17: 101-39 378. Geha R S, Meltzer E O. Desloratadine: A new, nonsedating, oral antihistamine. J Allergy Clin Immu nol. 2001; 107: 751-62 379. Simons F E. Is antihistamine (H1-receptor antagonist) therapy useful in clinical asthma? Clin Exp Allergy Suppl. 1999; 3: 98-104 380. Idzko M, la Sala A, Ferrari D, Panther E, Herouy Y, Dichmann S, Mockenhaupt M, di Virgilio F, Girolomoni G, Norgauer J. Expression and function of histamine receptors in human monocytederived dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 2002; 109: 839-46 381. Dy M, Lebel B, Kamoun P, Hamburger J. Histamine production during the anti-allograft response. Demonstration of a new lymphokine enhancing histamine synthesis. J Exp Med. 1981; 153: 293-309 382. Igaz P, Novák I, Lázár E, Horváth B, Héninger E, Falus A. Bidirectional communication between histamine and cytokines. Inflamm Res. 2001; 50: 123-28 383. Hill S J. Distribution, properties, and functional characteristics of three classes of histamine receptor. Pharmacol Rev. 1990; 42: 45-83 384. Rangachari P K. Histamine: mercurial messenger in the gut. Am J Physiol. 1992; 262: G1-13 385. Jutel M, Watanabe T, Akdis M, Blaser K, Akdis C A. Immune regulation by histamine. Curr Opin Immunol. 2002; 14: 735-40 386. Hill S J. Histamine receptors and interactions between second messenger transduction systems. Agents Actions Suppl. 1991; 33:145-59 387. Meretey K, Falus A, Taga T, Kishimoto T. Histamine influences the expression of the interleukin-6 receptor on human lymphoid, monocytoid and hepatoma cell lines. Agents Actions. 1991; 33: 18991 388. Del Valle J, Gantz I. Novel insights into histamine H2 receptor biology. Am J Physiol. 1997; 273: G987-96
142
389. Zhu Y, Michalovich D, Wu H, Tan K B, Dytko G M, Mannan I J, Boyce R, Alston J, Tierney L A, Li X, Herrity N C, Vawter L, Sarau H M, Ames R S, Davenport C M, Hieble J P, Wilson S, Bergsma D J, Fitzgerald L R. Cloning, expression, and pharmacological characterization of a novel human histamine receptor. Mol Pharmacol. 2001; 59: 434-41 390. Liu C, Ma X, Jiang X, Wilson S J, Hofstra C L, Blevitt J, Pyati J, Li X, Chai W, Carruthers N, Lovenberg T W. Cloning and pharmacological characterization of a fourth histamine receptor (H(4)) expressed in bone marrow. Mol Pharmacol. 2001; 59: 420-26 391. Elenkov I J, Webster E, Papanicolaou D A, Fleisher T A, Chrousos G P, Wilder R L. Histamine potently suppresses human IL-12 and stimulates IL-10 production via H2 receptors. J Immunol. 1998; 161: 2586-93 392. van der Pouw Kraan TC, Snijders A, Boeije LC, de Groot ER, Alewijnse AE, Leurs R, Aarden LA.Histamine inhibits the production of interleukin-12 through interaction with H2 receptors. J Clin Invest. 1998; 102: 1866-73 393. Horvath B V, Szalai C, Mandi Y, Laszlo V, Radvany Z, Darvas Z, Falus A. Histamine and histamine-receptor antagonists modify gene expression and biosynthesis of interferon gamma in peripheral human blood mononuclear cells and in CD19-depleted cell subsets. Immunol Lett. 1999; 70: 95-99 394. Arad G, Nussinovich R, Na'amad M, Kaempfer R. Dual control of human interleukin-2 and interferon-gamma gene expression by histamine: activation and suppression. Cell Immunol. 1996; 170: 149-55 395. Dohlsten M, Hedlund G, Sjogren H O, Carlsson R.Inhibitory effects of histamine on interleukin 2 and gamma interferon production of different human T helper cell subsets. Scand J Immunol. 1988; 28: 727-33 396. Krouwels F H, Hol B E, Lutter R, Bruinier B, Bast A, Jansen H M, Out T A. Histamine affects interleukin-4, interleukin -5, and interferon-gamma production by human T cell clones from the airways and blood. Am J Respir Cell Mol Biol. 1998; 18: 721-30 397. Khan M M. Regulation of IL-4 and IL-5 secretion by histamine and PGE2. Adv Exp Med Biol. 1995; 383: 35-42 398. Vannier E, Dinarello C A. Histamine enhances interleukin (IL) -1-induced IL-1 gene expression and protein synthesis via H2 receptors in peripheral blood mononuclear cells. Comparison with IL-1 receptor antagonist. J Clin Invest. 1993; 92: 281-87 399. Molnar E L, Hegyesi H, Toth S, Darvas Z, Laszlo V, Szalai C, Falus A. Biosynthesis of interleukin6, an autocrine growth factor for melanoma, is regulated by melanoma-derived histamine. Semin Cancer Biol. 2000; 10: 25-28 400. Zheng T, Nathanson M H, Elias J A. Histamine augments cytokine-stimulated IL-11 production by human lung fibroblasts. J Immunol. 1994; 153: 4742-52 401. Fujikura T, Shimosawa T, Yakuo I. Regulatory effect of histamine H1 receptor antagomist on the expression of messenger RNA encoding CC chemokines in the human nasal mucosa. J.Allergy Clin. Immunol. 2001; 107: 123-28
143
402. Gosset P, Tillie -Leblond I, Oudin S, Parmentier O, Wallaert B, Joseph M, Tonnel A B. Production of chemokines and proinflammatory and antiinflammatory cytokines by human alveolar macrophages activated by IgE receptors. J Allergy Clin Immunol. 1999; 103: 289-97 403. Vannier E, Dinarello C A. Histamine enhances interleukin (IL) -1-induced IL-6 gene expression and protein synthesis via H2 receptors in peripheral blood mononuclear cells. J Biol Chem. 1994; 269: 9952-56 404. Falus A. Interleukin -6 biosynthesis is increased by histamine in human B-cell and glioblastoma cell lines. Immunology. 1993; 78: 193-96 405. Mor S, Nagler A, Barak V, Handzel ZT, Geller-Bernstein C, Fabian I. Histamine enhances granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-6 production by human peripheral blood mononuclear cells. J Leukoc Biol. 1995; 58: 445-50 406. Lie W J, Knol E F, Mul F P, Jansen H M, Roos D, van der Zee J S. Basophils from patients with allergic asthma show a primed phenotype. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104: 1000–07 407. Lantz C S, Boesiger J, Song C H, Mach N, Kobayashi T, Mulligan RC, Nawa Y, Dranoff G, Galli S J. Role for interleukin-3 in mast-cell and basophil development and in immunity to parasites. Nature. 1998; 392: 90-93 408. Liao T N, Hsieh K H. Characterization of histamine-releasing activity: role of cytokines and IgE heterogeneity. J Clin Immunol 1992; 12: 218– 58 409. Fitzsimons C P, Lazar-Molnar E, Tomoskozi Z, Buzas E, Rivera E S, Falus A. Histamine deficiency induces tissue-specific down-regulation of histamine H2 receptor expression in histidine decarboxylase knockout mice. FEBS Lett. 2001; 508: 245-48 410. Horvath B V, Falus A, Toth S, Szalai C, Lazar-Molnar E, Holub M C, Buzas E, Nagy A, Fulop A K. Inverse regulation of interleukin -6 (IL-6) and IL-6 receptor in histamine deficient histidine decarboxylase-knock-out mice. Immunol Lett. 2002; 80: 151-54 411. Wiener Z, Andrásfalvy M, Pállinger É, Kovács P, Szalai C, Erdei A, Tóth S, Nagy A, Falus A. Bone marrow-derived mast cell differentiation is strongly reduced in histidine decarboxylase knockout, histamine-free mice. Int. Immunol. 2002; 14: 381-87 412. Fulop A K, Foldes A, Buzas E, Hegyi K, Miklos IH, Romics L, Kleiber M, Nagy A, Falus A, Kovacs K J. Hyperleptinemia, visceral adiposity, and decreased glucose tolerance in mice with a targeted disruption of the histidine decarboxylase gene. Endocrinology. 2003; 144: 4306-14 413. Hunyady B, Zolyomi A, Czimmer J, Mozsik G, Kozicz T, Buzas E, Tanaka S, Ichikawa A, Nagy A, Palkovits M, Falus A. Expanded parietal cell pool in transgenic mice unable to synthesize histamine. Scand J Gastroenterol. 2003; 38: 133-40 414. Fitzpatrick L A, Buzas E, Gagne T J, Nagy A, Horvath C, Ferencz V, Mester A, Kari B, Ruan M, Falus A, Barsony J. Targeted deletion of histidine decarboxylase gene in mice increases bone formation and protects against ovariectomy -induced bone loss. Proc Natl Acad Sci. 2003; 100: 6027-32 415. Pap E, Racz K, Kovacs J K, Varga I, Buzas E, Madarasz B, Foldes C, Szalai C, Watanabe T, Ohtsu H, Ichikawa A, Nagy A, Falus A. Histidine decarboxylase deficiency in gene knockout mice elevates male sex steroid production. J Endocrinol. 2002; 175: 193-99
144
416. Kozma G T, Losonczy G, Keszei M, Komlosi Z, Buzas E, Pallinger E, Appel J, Szabo T, Magyar P, Falus A, Szalai C. Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol. 2003; 15: 963-73 417. Burian K, Hegyesi H, Buzas E, Endresz V, Kis Z, Falus A, Gonczol E. Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae induces histidine decarboxylase production in the mouse lung. Immunol Lett. 2003; 89: 229-36 418. Par G, Szekeres-Bartho J, Buzas E, Pap E, Falus A.Impaired reproduction of histamine deficient (histidine-decarboxylase knockout) mice is caused predominantly by a decreased male mating behavior. Am J Reprod Immunol. 2003; 50: 152-58 419. NHLBI/WHO Workshop Report 1995. Global strategy for asthma manegement and prevention. National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. Publication No. 95-3659. Bethesda (MD): The Institute; 1995 420. American Thoracic Society. Standardization of spirometry: 1994 update. Am J Respir Crit Care Med. 1994; 152: 1107-36 421. Miller S A, Dykes D D, Polesky H F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleid Acid Res. 1988; 16: 1215 422. Kuhn C 3rd, Homer R J, Zhu Z, Ward N, Flavell R A, Geba G P, Elias J A. Airway hyperresponsiveness and airway obstruction in transgenic mice. Morphologic correlates in mice overexpressing interleukin (IL)-11 and IL-6 in the lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000; 22: 28995 423. Kips J C, Pauwels R A. The use of knockouts to study determinants of airway hyperresponsiveness. Allergy. 1999; 54: 903-08 424. Larsen G L, Renz H, Loader E, Bredley K L, Gelfand E W. Airway response to electrical field stimulation inbred mice: passive transfer of increased responsiveness with peribronchial lymph nodes. J Clin Invest. 1992; 89: 747-52 425. Martin T R, Gerard N P, Galli S J, Drazen J M. Pulmonary responses to bronchoconstrictor agonists in the mouse. J Appl Physiol. 1988; 64: 2318-23 426. Hamelmann E, Schwarze J, Tekeda K, Oshiba A, Larsen G L, Irvin C G, Gelfand E W. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 156: 766-75 427. Nelson P J, Kim H T, Manning W C, Goralski T J, Krensky A M. Genomic organization and transcriptional regulation of the RANTES chemokine gene. J Immunol. 1993; 151: 2601-12 G-2/34
145
9 Köszönetnyilvánítás Mindenek elott hálás szívvel köszönök mindent, amit lehetetlenség megköszönni: Teremtomnek, Feleségemnek és Szüleimnek.
Köszönöm Prof. Falus András programvezetomnek és Dr. Szalai Csaba témavezetomnek a megelolegezett bizalmát, amellyel munkám kezdete óta megajándékoztak; a jól megválasztott kutatási területet, amelyben dolgozhattam; a munkám szakszeru elméleti és gyakorlati irányítását; és mindazt a felbecsülhetetlen szakmai és emberi segítséget, amely végigkísérte együttes munkánkat.
Köszönöm a S. E. Genetikai-, Sejt és Immunbiológiai Intézetének dolgozóinak és PhD hallgatóinak, hogy elfogadtak, és önzetlenül segítettek. Hálás vagyok Dr. Buzás Editnek, Dr. Pállinger Évának és Keszei Mártonnak, akik odaadóan segítették kutatómunkámat.
Köszönöm a Heim Pál Gyermekkórház Központi Laboratóriumának minden dolgozójának, Dr. Szabó Teréznek a laboratórium vezetojének, hogy befogadtak, és igazi munkatársukként kezeltek.
Köszönöm Dr. Losonczy Györgynek, hogy lehetové tette számomra az S. E. Pulmonológiáján az állatkísérleteket, és felbecsülhetetlen elméleti és gyakorlati segítséggel támogatta munkám. Külön köszönöm, hogy lehetové tette számomra a 2002-es ERS-en való részvételt.
Köszönöm az S. E. Pulmonológiai Intézetében dolgozók figyelmes segítségét, Dr. Appel Juditnak és Bornemissza Berillnek a szövettani vizsgálatait.
Köszönöm Dr. Vásárhelyi Barnának és Prof. Tulassay Tivadarnak, hogy támogatták dolgozatom elkészítését.
146
