A kapilláris elektroforézis (CE) technikái dr. Szakács Zoltán ELTE TTK Kémiai Intézet (2013.05.15.) vegyész szak (B.Sc.) műszeres analitika - elválasztástechnika
2.
Elektroforézis, ionvándorlás (migráció)
Anód Katód • Elektroforézis: különböző ionok eltérő irányú v. sebességű elmozdulása, vándorlása (transzportja) folyadékban (vizes pufferben) elektromos tér hatására. • Elektromos erő gyorsítja,
U Fe = q ⋅ E = ze0 ⋅ l
q : az ion töltése [C] z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1,6·10−19 C az elemi töltés E : elektromos térerősség [V cm−1] U : elektr.potenciálkülönbség [V] l: elektródok távolsága [cm]
a közegellenállás („súrlódás”) lassítja az iont:
Fs = k ⋅η ⋅ v 0 η : az oldat dinamikai viszkozitása (cP: 10-3 Pa s) v0: ion vándorlási sebessége [cm s−1]
Stokes törvény (merev gömb, híg oldatban)
Ellentétes irányú erők egyensúlya: Az ion vándorlási sebessége:
k = 6π ⋅ rH
rH: az ion hidrodinamikai sugara [cm]
q ⋅ E = 6π ⋅η ⋅ rH ⋅ v 0 e0 z 1 v = ⋅ ⋅ ⋅E 6π rH η 0
[cm s−1]
3.
Ionok abszolút elektroforetikus mozgékonysága
• Abszolút elektroforetikus mozgékonyság (mobilitás): 0 v e0 z 1 0 µ = = ⋅ ⋅ E 6π rH η
[cm2 V−1 s−1]
• Az ionra jellemző, egyedi fizikai „állandó” (adott oldószerben és hőmérsékleten: η hőmérsékletfüggése: 2-3% / °C !!) • Arányos az ion fajlagos töltésével (z / rH) • Végtelen híg oldatra extrapolált érték diffúziós együtth. (Nernst-Einstein)
RT µ D= ⋅ F z
0
[cm2 s−1]
ion moláris fajlagos vezetése:
λ0 = z ⋅ F ⋅ µ 0
[S cm2 mol−1]
Kation H+ Li+ Na+ K+ NH4+
krist. r ion / Å 0,76 1,02 1,38 1,45
Rb+ Cs+ (C3H7)4N+
1,52 1,67
Mg2+ Ca2+ Sr2+ Ba2+ Fe2+ Cu2+ Ag+ Pb2+ Al3+
0,72 1,00 1,18 1,35 0,61 0,73 1,15 1,19 0,54
rH / Å
0 -5 2 -1 -1 μ / 10 cm V s
3,40 2,76 2,32 1,88
362,5 40,1 51,9 76,2 76,2 80,6 80,1 23,8
3,45 3,08 3,08 2,88
4,39
55,0 61,7 61,6 66,0 56,0 55,6 64,5 72,0 63,2
4.
Az ion effektív elektroforetikus mozgékonysága
• A valóságban nem végtelenül híg pufferoldatban dolgozunk ⇒ elektrosztatikus kcsh. ellenionok felhője (az ionatmoszféra) leárnyékolja az ion töltését, lassítja a migrációját ionatmoszféra “sugara” δ = κ −1
κ=
F⋅√ 2I ε RT
δ = 30 nm
pl. I = 0,1 mM
r
δ = 3 nm
I = 10 mM
(ld. elektrokémia: Debye, Hückel, Onsager elmélete) •
Effektív elektroforetikus mozgékonyság
δ = κ −1
e Q 1 µ = 0 ⋅ eff ⋅ 6π reff η
[cm ·V ·s ] 2
−1
−1
reff ≈ r + δ : effektív ionsugár [cm] Qeff : az ion effektív töltése z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1,6·10−19 C az elemi töltés E : elektromos térerősség [V·cm−1] U : elektr.potenciálkülönbség [V]
- az ionra jellemző empirikus adat, az adott pufferoldatban mérhető mennyiség - becslésére léteznek félempirikus összefüggések
5.
A pH-függő átlagos töltés kiszámítása (disszociáció)
Q
0
Q = zHA ⋅ xHA + z A − ⋅ xA −
COOH
-0,5
0 ⋅ 10pK − pH − 1 Q= 10pK − pH + 1
pKa
-1 1
Q
2
3
4
5
1
6
7
8
9
10 pH 11
Q = zH A+ ⋅ xH A + + zH A ⋅ xH A + zHA− ⋅ xHA− + z A2 − ⋅ xA2 − 3
0,5
pK1
pI
0
C
2
2
1 ⋅ 10pK1 + pK2 + pK3 −3pH + 0 ⋅ 10pK2 + pK3 −2 pH − 1 ⋅ 10pK3 − pH − 2 Q= 10pK1 + pK2 + pK3 −3pH + 10pK2 + pK3 −2 pH + 10pK3 − pH + 1
izoelektromos pont
+
NH3
-0,5
3
pK2
O
HO
-1
pK3
-1,5 HO
-2 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pH
11
6.
Az elektroforézis története dióhéjban
• 1850-1900.
Hittorf, Kohlrausch, Hardy: fizikai-kémiai alapok (elektrolitok vezetése, átviteli szám, mozgó határfelület)
• 1920-1940. 1948.
Svedberg, Tiselius: moving boundary electrophoresis of proteins Tiselius: Nobel-díj (részben az elektroforézisért)
• 1950-
papírelektroforézis, gélelektroforézis „makrométerben” (fehérjék, nukleinsavak)
• 1981. 1983. 1984. 1985. 1991. 1991.
Jörgenson, Lukacs Hjertén, majd Karger Terabe Hjertén Knox, Grant Watarai
kapilláris zóna elektroforézis (CZE) fused silica kapilláris kapilláris gél elektroforézis (CGE) micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) kapilláris elektrokromatográfia (CEC) mikroemulziós elektrokinet.kromatográfia (MEEKC)
• 1990- kereskedelmi CE készülékek & újabb detektorok fejlesztése ⇒ CE rohamos elterjedése, alkalmazások százai, külön folyóiratok, konferenciák • 1999- kereskedelmi mikrochip CE készülékek (mikrofluidika, „lab-on-a-chip”)
7.
Joule-hő, konvekció
1825-27. Ohm-törvény 1841. Joule I. törvénye: áramvezetés során hő termelődik:
P = I 2 R ( = U 2 / R = UI )
NR: nem redukáló, R: redukáló körülmények között
térfogat:
20 – 80 ml
felület:
200 - 800 cm
2
Joule-hő: 150 V * 30 mA = 5 W
Elfo idő:
55min 3,5h 3,5h
rekombináns heterodimer glikoprotein denaturálódása, bomlása
térerősség: 10 - 20 V cm−1 A nem megfelelő hőelvezetés hőmérséklet- és sűrűséggradienshez, konvekcióhoz, a szétválasztott zónák elmosódásához, keveredéséhez vezethet www.dddmag.com/protein-electrophoresis-method.aspx
8.
Elektroforézis kapillárisban: hatékonyabb hődisszipáció
• Virtanen (1969), Everaerts (1970), Jorgenson & Lukacs (1981) • üres olvasztott kvarc (bare fused silica) kapilláris
fused silica
térfogat:
2 – 8 µl
⇒ jóval nagyobb ellenállás
felület:
0,4 - 3 cm2 ⇒ hatékonyabb hőelvezetés
Joule-hő: 30 kV * 50 µA = 1,5 W térerősség: 200 – 600 V cm−1 Ltot = 25 – 100 cm poliimid bevonat (15 µm) – hajlékony, flexibilis 25 – 75 µm Inner Diameter 300 – 400 µm Outer Diameter
• jobb felület / térfogat arány ⇒ nagyobb feszültség használata (kis térfogat) ⇒ nagyobb térerősség ⇒ gyorsabb, élesebb (nagyobb hatékonyságú) elválasztások
9.
Töltött kapillárisfal ⇒ elektroozmotikus áramlás (EOF) δ = κ −1 x + +
+
+
+
+
N
+
+ +
+
+
Si−O− + H+
• Gouy-Chapman réteg (külső határa a zeta-potenciál, ζ) itt még az ellenionok dominálnak
+
+
Si−OH
• Stern réteg (ΨSt): merev, erősen adszorbeált ellenionokból
+
N
• felületi negatív töltés (Ψ0):
+ +
• diffúz elektrokémiai kettősréteg: elmozdulhat ellenionok konc.gradiense → a tömbfázisbeli értékig −1 kettősréteg „vastagsága” (Debye-length): κ ≃0,3 / • Helmholtz-Smoluchowski egyenlet (1903):
N
Ψ0 ΨSt ≈ ζ potenciál
√I
εζ µeo = − 4πη
ψ = ψ St e −κ ⋅x
• Elektroozmózis: a diffúz réteg ellenionjai „magával ragadják” az oldat egészét (electroosmotic flow) és makroszkopikus oldatáramlást hoznak létre a kapillárisban (EOF) (negatívan töltött szilikafelület esetén katódos irányú az EOF)
anód
+
+
veo = µeo ⋅ E
+
katód
10.
EOF: dugószerű áramlási profil
detektorjel
HPLC: nyomás hajtotta eluensáramlás
HPLC
CE: elektrokinetikusan hajtott oldatáramlás
CE: szűkebb zónák, éles csúcsok, ez a nagy hatékonyság egyik oka
retenciós idő
migrációs idő
11.
Az EOF sebességének szabályozása: a puffer pH-ja Si−OH
• a zeta-potenciál pH-függő:
Si−O− + H+
pKa ~ 3 - 5
µeo [10-5 cm2 V−1 s−1]
veo = µeo ⋅ E
60
fused silica
veo = 2 mm s−1
50
500 nl min−1
40
pyrex
(egy adott kapillárisban)
30
20
teflon
veo = 0,2 mm s−1 50 nl min−1
10
0 2
3
4
5
6
pH
7
8
9
10
12.
Az EOF szabályozásának további lehetőségei veo = µeo ⋅ E = −
εζ ⋅E 4πη
Változó
Eredmény
Megjegyzés
Elektr. térerősség
EOF arányosan változik
Joule-hőfejl. megnőhet
Puffer ionerőssége (koncentrációja)
Növelésével csökken a ζ-pot. és az EOF
Növelésével nő az áramerősség és a Joule-hő
Szerves oldószerkomponens
Csökkenti a ζ-potenciált viszkozitást és rel.permett.-t
Komplex hatása van, általában EOF csökken
Tenzid hozzáadása
Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób vagy ionos kcsh.-sal
Anionos tenzid: EOF nő Kationos tenzid: EOF csökken szelektivitás!
Semleges hidrofil polimer hozzáadása
Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób kölcsönhatással
Felületi töltés árnyékolásával csökkenti EOF-et, növeli η-t
Semleges polimer hozzáadása
Növeli a viszkozitást a kapillárisfalnál
pl. polivinilalkohol
Kovalens borítás
A kapillárisfal kémiai bevonata
Sokféle lehetőség, stabilitás?
Hőmérséklet
Viszkozitás érzékenyen változik 2-3% / °C
Könnyű kontrollálni
13.
A kapilláris elektroforézis (CE) készülék felépítése, működése
detektor
termosztát egység
kapilláris Pt-Ir elektród +/- 30 kV
minta
bemeneti (inlet) puffer
nagyfeszültségű tápegység Pt-Ir elektród 0V
kimeneti (outlet) puffer
www.scitopics.com/Capillary_Electrophoresis.html
14.
Kereskedelmi CE készülékek
www.spectralabsci.com/images/HP-3D-CE-G1600AX.jpg http://www.dddmag.com/uploadedImages/Articles/2011_06/CESI8000.jpg
15.
A CE általános jellemzői
miniatürizált („microscale”) elválasztástechnika, anyagtakarékos ! vizes pufferoldatok (környezetbarát), UV átlátszóság (190-220 nm érzékenység!) nincs külön detektorcella, „on-column” detektálás (kivétel: kapcsolt technikák) HPLC-nél több paraméter, gyorsabb módszerfejlesztés gyors analízis (mikrochipen még gyorsabb), kitűnő elválasztás nagyfokú automatizáltság, sorozatanalízisek lehetősége ugyanazon a készüléken többféle elvű elválasztási módszer megvalósítható: töltettel, hordozóval segített
töltetlen kapillárisban
CZE CITP ionok elválasztására
MEKC
CD-EKC CIEF
CGE
biomakromolekulák, oligomerjeik elválasztására
MEEKC CEC semleges molekulák elválasztására
16.
Kapilláris zóna elektroforézis Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Kationok és anionok elválasztása effektív mozgékonyságuk különbsége alapján (semleges molekulák elválasztására nem alkalmas)
a legtöbb ionra:
µ < µeo 10×
animáció: Agilent CE promóciós anyagból
17.
detektorjel→
Kationok és anionok teljes mozgékonysága: elektroforetikus + EOF szuperpozíciója
elektroferogram
„electroosmotic hold-up time”: teo
tm : az ion migrációs ideje
vtot = vep + veo = Leff / tm
veo = Leff / teo
E = U / Ltot
µeo =
idő→
veo Leff Ltot = E teo U
µtot = µ + µeo =
Leff Ltot Leff Ltot + Utm Uteo
az ion (kísérleti) elektroforetikus mozgékonysága:
Leff: kapillárishossz injektálástól a detektorig [cm] Ltot: kapilláris teljes hossza = elektródok távolsága [cm]
µ=
Leff Ltot U
1 1 ⋅ − tm teo
[cm2 V−1 s−1]
IUPAC terminológia: Pure Appl. Chem. 2004, 76: 443-451.
18.
„Mintadugó” injektálása a kapillárisba - alapmódszerek
• Hidrodinamikus injektálás +∆p
• Vákuum injektálás −∆p
vagy
minta
kimeneti puffer
• Gravitációs injektálás („siphoning”)
minta
h
kimeneti puffer
• Elektrokinetikus injektálás +
-
U minta
kimeneti puffer
19.
Hidrodinamikus injektálás +∆p
minta
• injektált mintatérfogat: ∆p nyomáskülönbség [Pa] t
injektálás ideje [s]
Hagen-Poiseuille egyenlet:
103 π d 4 Vinj = ⋅ ⋅ ∆p ⋅ t [ml] 128 Ltotη d Ltot η
kapilláris belső átmérője [cm] kapilláris teljes hossza [cm] minta viszkozitása [cP = 10−3 Pa s]
• a leggyakrabban használt injektálási mód, a minta ionjaira nem diszkriminatív • kapilláris gélelektroforézisben és mikrochipen nem használható • pl. egy d = 75 µm, Ltot = 80 cm kapilláris teljes térfogata: hidrodinamikus injektálás 30 mbar × 10 s az injektált mintadugó hossza:
3,5 µl 33 nl 16 mm (2%)
3-4%-nál hosszabb mintadugó injektálása már csúcsdiszperziót okozhat: σinj • 33 nl injektálás 1 mM oldatból: 33 pmol ha Mt = 100: 3,3 ng
20.
Kvantitatív analízis belső standard módszerrel
• CZE-ben a zónák különböző sebességgel haladnak át a detektoron ⇒ csúcsterület normálása: A’ = A / tm • a nanoliteres hidrodinamikai injektálás ismételhetősége a kapilláris elektroforézis módszerek validálásának egyik gyenge pontja ⇒ belső standard (IS) hozzáadásával kiküszöbölhető 160 140
kalibráló oldatokra mért adatpontok
A’x / A’IS
120 100 80
ismeretlen mintára kapott relatív csúcsterület és koncentráció leolvasása
60 40 20 0 0
5
10
15
20
koncentrációx
25
30
35
40
21.
Elektrokinetikus injektálás
• injektált „x” anyagmennyisége:
κ d 2πUt nx = ( µeo + BGE µ x ) ⋅ cx 4 Ltot κ minta
d: kapilláris belső átmérője [cm] U: injektálási feszültség [V] µeo: EOF mozgékonyság a pufferben [cm2/Vs] κBGE: a puffer vezetőképessége [S/cm]
kimeneti puffer [mmol]
Ltot: kapilláris teljes hossza [cm] t: injektálás ideje [s] µx: x effektív mozgékonysága [cm2/Vs] κminta: a minta vezetőképessége [S/cm] cx : x koncentrációja a mintában [mol/dm3]
• igen érzékeny injektálási mód (field-amplification, ld. sample stacking) • kapilláris gélelektroforézisben vagy chip-en csak ez van • mátrix torzítás (függés κminta-tól) • diszkriminatív injektálás (csak kation/anion)
⇒ nehéz a kvantifikálás (speciális külső v. belső standard kell)
Külső standard módszer nyomanalízisre híg mintákból: A Gáspár, L Gábor, J. Chromat. A 2005, 1091, 163-168. Univerzális belső standard kalibrálás: A Gáspár, E Dudás, J. Chromat. A 2006, 1110, 254-260.
22.
A kapilláris elektroforézis legfontosabb detektorai Detektálási módszer UV-látható fényelnyelés Fluoreszcencia Lézer-indukált fluorszcencia (LIF)
Kimutatási határ
Kimutatási határ 3
koncentráció (mol / dm ) -5
-8
abszolút (mol) -13
10
10-7 - 10-9
10-15 - 10-17
10
-16
- 10
10
-18
- 10
-16
10 - 10
-14
Előnyök / hátrányok
- 10
-20
! kromofór csoport kell (>190 nm) vagy származékképzés + DAD: korlátozott szerkezeti info ! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés ! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés - drága
Amperometria
10-10 - 10-11
10-18 - 10-19
! elektroaktív csoport kell ! speciális hardver, kapilláris kell
Vezetőképesség
10-7 - 10-9
10-15 - 10-16
+ univerzális ! speciális hardver, kapilláris kell
Indirekt UV, fluoreszcencia, amperometria
10-100x rosszabb, mint a direkt
Kapcsolt technikák
(hyphenated techniques)
Tömegspektrometria (ESI-MS) Mágneses magrez. spektroszkópia (NMR)
-8
-9
10 - 10 -4
kb. 10 - 10
-6
+ univerzális
10
-16
10
-12
- 10
-17
+ univerzális + szerkezeti információt nyújt (MSn ) - drága, problematikus
- 10
-14
+ legrészletesebb szerkezeti info - csak CH csoportokról - drága, keresked.nem elérhető
23.
Megoldások az UV-érzékenység növelésére
•
UV-detektor érzékenységi korlátja: optikai úthossz = kapilláris átmérője = 25-75 µm
•
megnövelt úthosszú kapillárisok (Agilent), minimális csúcsdiszperzió „buborékcella”
3-5 × érzékenység
„Z-cella”
10 × érzékenység
képek forrása: Agilent CE brosúrák
24.
A CE nagy felbontása nagy hatékonyságán alapul
• „Ürescső” CE (Free Solution CE, Open Tubular CE) esetén a van Deemter egyenletben:
B HETP = A + + Cu u A=0
mert nincs töltet, amelyben többféle útvonalon (multiple path) vándorolna az elválasztandó komponens
C=0
mert nincs állófázis, amelybe fázistranszfer történhetne
B>0
elvileg a hosszirányú (longitudinális) diffúzió a csúcsszélesedés (diszperzió) egyetlen forrása
• az EOF éles, „dugószerű” profilja is alig szélesíti a csúcsokat a gyakorlatban számos tényező ronthatja a hatékonyságot: 2 2 2 2 2 2 2 σ tot = σ long.diff + σ inj + σ temp + σ wall + σ + σ -ads det EMD + ... EMD: electromigration dispersion (puffer ko-ion vezetőképessége...)
σ tot
25. detektorjel→
Az elválasztás analitikai paraméterei
σ w1/2 wA
wB
tA
tB
• a (Gauss) csúcs std.deviációja: σ = • longitudinális diffúzió dominál:
idő→
w 4
2 2 σ tot ≅ σ long.diff = 2 Dt = 2 D
Leff Ltot ( µeo + µ )U
• elméleti tányérszám:
L2eff ( µ + µeo )ULeff t2 N= 2 = = 5.54 2 σ tot 2 DLtot w1 / 2
• felbontás:
2 ( t B −t A ) Δμ⋅√ N Δμ R s= = ∝ w A + wB 4⋅( μ̄ + μeo ) √ ̄μ + μ eo
> 10 5 is lehet !
26.A puffer pH megválasztására pK ismeretében (Offord-görbék) a +
H3N
pKa
O
HS
OH
becsült µ eff = Q / M 2 / 3 ←Offord-képlet a mozgékonyság becslésére
1,94 8,60 10,28
0,04
Cys 0,02
O 0
4,19
OH
BzOH
-0,02
-0,04
OH S O
O
<0
HO
NH2
-0,06
-0,08 1
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
HO
Elektromigrációs diszperzió EMD !!
pH
PTS Cys
15 mM HCl
BzOH
PTS
Cys
pH 8,3 puffer: 40 mM TRIS és 15 mM „sav”
10
15 mM MES O S O
N
O
OH
becsült µ eff, Cl -
11
BzOH
H3C
becsült µ eff, MES-
PTS
Az elektromigrációs diszperzió (EMD) zónatorzítása
a minta a puffernél:
(jobban vezet)
(azonos vezetőképességű) kisebb vezetőképességű
zóna áramlási iránya
koncentr.profil a „mintadugóban” (elektroferogramon ellentétes irányú torzulás)
+ -
+ -
-
EOF
EOF
EOF
+
„fronting”
„tailing”
katód(-)
detektor
27.
kapilláris
injektálás
idő az elektroferogramon
• A puffer ko-ionjának effektív mozgékonysága legyen kb. azonos a mérendő ionokéval, különben azok csúcsalakja háromszög alakú torzulást szenved (minél jobban összemérhető a minta koncentrációja a pufferével, annál inkább jelentkezik ez a torzulás)
A CE-ben leggyakrabban használt pufferkomponensek
O
NH2
O
-
O S
+
O
HO
β-Ala: 10,24
H3BO3: 9,23 NH4+: 9,25 HO
CHES: 9,55
H2N
TRIS: 8,08
HEPES: 7,50
MES: 6,10
β-Ala: 3,43
H3PO4: 2,16
Ecetsav: 4,76
pKa
H2PO4-: 7,21
28.
+
N H
NH
HO
OH O +
HO
O
S O
N
O
NH2
-
O
S O
O -
↑ „Good” típusú (biológiai) pufferek: kisebb vezetőképesség, de UV-elnyelés 210 nm-ig !
pH
29.
Mozgékony anionok elválasztása: az EOF szerepe bemeneti puffer (inlet) anód
µe
µ app
injektálás helye
kimeneti puffer (outlet) katód
µ µ EOF detektor
szokásos polaritás: a kapillárisfal negatív töltésű (disszociált SiOH-csoportok), az elektroozmózist (EOF) pozitív ionok hajtják (katódos EOF) EOF sebessége (mozgékonysága, µ):
vEOF = µ EOF ⋅ E > 0
anion saját (elektroforetikus) sebessége:
ve = − µe ⋅ E < 0
anion bruttó (látszólagos, apparent) sebessége:
vapp = vEOF − ve = ( µ EOF − µe ) ⋅ E
probléma kisméretű, mozgékony anionoknál µe > µ EOF ha az anion nem a detektor felé vándorol, nem is halad át a detektoron! grafika: HP CE Partner
30.
Mozgékony anionok elválasztása: az EOF megfordítása bemeneti puffer (inlet) anód
µe
µ app
kimeneti puffer (outlet) katód
µ µ EOF
injektálás helye
detektor
a megoldás: az EOF-et el kell nyomni (kapillárisfal borítása, coating) és polaritáscsere bemeneti puffer (inlet) katód
kimeneti puffer (outlet) anód
µ eff = µ app injektálás helye
detektor
vagy az EOF-et meg kell fordítani (kapillárisfal borítása kationos tenziddel, CMC alatt!), ekkor az EOF és az anion sebessége összeadódik, így az anion áthalad a detektoron:
bemeneti puffer (inlet) katód grafika: HP CE Partner
µ EOF injektálás helye
µ eff
µ app detektor
kimeneti puffer (outlet) anód
31.
Növényi karbonsavak elválasztása oxálsav borkősav almasav citromsav borostyánkősav
UV [mAU] 75 µm fused silica 32 nl injektálás fordított polaritás -20 kV a negatív EOF-et megelőzve jönnek a savanionok EOF: kb. 5,3 perc
Br
-
H3C H3C
N
+
CH3
CH3
indirekt detektálás UV, 210 nm koncentrációtart. 0,01 - 1 mM sav
futtató puffer: • 5 mM KHftalát (állandó UV elnyelés a pufferben) • 20 mM N-morfolino-etánszulfonsav (MES), pH 5,3-ra titrálva NaOH-dal • 0,5 mM cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB, az EOF megfordítására)
32.
Enzimek CZE elválasztása borított falú kapillárisban bare (uncoated) fused silica = borítatlan falú szilika kapillárisban:
borított falú kapillárisban: dinamikus: ikerionos puffer OH-alkil-cellulóz ... statikus:
teflon
atenolol
Nemvizes kapilláris elektroforézis (NACE): β-blokkolók elválasztása metanolban metabolitja
33.
• 0,5 ml szűrt humán vizeletminta, SPE (Oasis HLB) dúsítás, MeOH lemosás, bepárlás • BGE: 40 mM AcOH/NaOAc (pK 9,7); pH 8,9 • 58,5 (Ld=50) cm FS kapilláris (50 µm)
• std.minta: 10 µg/ml β-blokkolók MeOH-ban
• minta: 0,5 ml metanolban
• elfo: +30 kV (10 µA), UV detektálás 200 nm
• spike: 20 µg/ml atenolol standard
H Sirén, R Kuldvee, T Karla, T Ekström, ML Riekkola, J Chromat A 2005, 1068, 89-97.
34.
Izoproterenol enantiomerek elválasztása (CZE ciklodextrin királis szelektorral)
* OH
HO O
„natív CD” HO
O
OH HO
O
RS
O
OH
O
O HO O HO
OH O
hidroxipropil-
OH
HO
OH
O
HO
OH OH HO
O
HO OH O O
O OH
OH
O HO
béta-ciklodextrin
dimetil-
trimetilkét CD keveréke („duál CD rendszer”)
• 50 mM foszfát/TEA puffer, pH = 3,0; 30 kV H Godel, R Weinberger, HP Application Note, 1995, 12-5963-5502E.
35.
A CZE összefoglalása: a pufferoldat (BGE) szerepe
• Megfelelő pufferkapacitás (>10 mM / pH) biztosítása:
pKa – 1,5 < pH < pKa + 1,5 megfelelő koncentráció • Koncentráció (tipikusan 5-50 mM): megfelelő vezetőképesség, de még nem túl nagy Joule-hő ionerősség: 10-50 mM
forrás: Gerd Vanhoenacker, www.richrom.com
• Direkt UV detektálás esetén a puffer lehetőleg ne abszorbeáljon (akár 190-210 nm !) • Indirekt UV detektálás esetén abszorbeáló komponens is kell • CE-MS esetén illékony puffer kell (ecetsav, hangyasav, ammóniumsók...) • Szelektivitás növelése:
• EOF elnyomás:
szerves módosító (oldószer: MeOH, ACN, iPrOH...) szelektív komplexképző királis szelektor ...
hidrofil polimer (pl. hidroxietil-cellulóz) vagy kationos tenzid (konc.
36.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás Capillary Isoelectric focusing (CIEF) Makromolekulák (fehérjék, huminsavak...) elválasztása izoelektromos pontjuk (pI) szerint (S. Hjertén, 1985)
Q
1 0,5
pI
0 -0,5 -1 -1,5 -2 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
pH
37.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve I.
Amfolit: több, különböző pKa-jú csoportot tartalmazó molekula (⇔ ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) pH
A
B
C
C A
C
A B
borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) NaOH kapilláris az EOF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kV): pH-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás
anód(+) H3PO4
3
4
5
6
7
8
9 pH
38.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve II.
Amfolit: több, különböző pK-jú csoportot tartalmazó molekula (⇔ ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) pH
borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) NaOH kapilláris az EOF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kV): pH-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás
anód(+) H3PO4
A
3
4
B
5
C
6
7
8
9 pH
kialakul a pH-gradiens („steady state” ), az áram minimális értékre csökken, a mintakomponensek izoelektromos pontjuk (pI) szerint fókuszálódnak
39.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve III.
3. A pH-gradiens mobilizálása: a fókuszált mintazónák áthajtása a detektoron
A
anód(+) H3PO4
4
3
A
B
B
5
C pH 6 katód(-) H3PO4+NaCl
C
4 5 6 7 8 9 pH 3 elektroforetikus mobilizálás: pl. katód-elektrolitot ellentétes pH-jú pufferre cseréljük [H + ] + ∑ cNH3+ = [OH − ] + ∑ cCOO −
[H + ] + ∑ cNH3+ = [OH − ] + ∑ cCOO − + cCl-
40.
Hemoglobin-rendellenességek klinikai szűrése 25 µm id borított kapilláris 2% amfolitkev. pH 3-10 fókuszálás 10 kV, 5 min mobilizálás 10 kV
A0: normál humán Hb
C, G, G2: mutáns hemoglobinok
41.
Kapilláris gélelektroforézis Capillary Gel Electrophoresis (CGE) Nagymolekulák (biopolimerek) méret szerinti elválasztása
Fehérjék analízise: pl. SDS-PA-CGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél gélelektroforézis)
Oligonukleotidok, DNS: pl. agaróz gélen és lineáris poliakrilamidon 1990-2003. teljes Human Genome szekvenálása Capillary Array Electrophoresis
42.
Kapilláris gélelektroforézis (CGE)
• Gél töltet a kapillárisban ⇒ kusza, térhálós szerkezet, pórusokkal - kis méretű ionok (pl. pufferalkotók) zavartalanul átmennek a pórusokon - nagyobb ionok hidrodinamikai sugara összemérhető a pórusok méretével: a pórusok molekulaszűrőként viselkednek (Ogston-modell) ⇒ méret szerinti elválasztás (oligonukleotidok) - nagyobb biopolimerek (denaturált DNS vagy fehérje) „kígyózó, hüllőszerű” mozgással (reptation) préselik át magukat a pórusokon ⇒ méret (molekulatömeg) szerinti elválasztás - gél: antikonvektív közeg (diffúzió lecsökken) - kapillárisfal borítása (coating) ⇒ EOF is minimális • kémiai gélek (térhálós polimerek, kémiai keresztkötésekkel, cross-links) - bele vannak polimerizálva a kapillárisba, jól definiált méretű pórusok - hőérzékeny, buborékképződés veszélye! pl. térhálósított poliakrilamid • fizikai gélek (lineáris polimerek hálózata, polymer networks) - kisebb viszkozitás, bepumpálható a kapillárisba, majd eltávolítható, megújítható - pórusméret változtatható pl. a hőmérséklettel, nem hőérzékeny pl. lineáris poliakrilamid, alkilezett cellulóz, agarózgél, dextrán, polietilén-oxid, PEG…
43.
Kémiai gél: poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) H2C
CH
H2C
CO NH2
AA (akrilamid)
CH
CO NH
H2C
CH
CO
BIS
• Gél összetételének jellemzése (AA = akrilamid) T% = (AA + bis) / 100 teljes gélképző anyag tömeg%-a, 3-10 % C% = bis / (AA + bis) · 100% bifunkciós akrilamid %-a, 0-5 % • C% határozza meg a térhálósodás fokát, a gél keménységét C% = 0 ⇒ fizikai, lineáris gél (kapillárisba pumpálható, megújítható) • gyakori az elektrokinetikus injektálás • kereskedelemben kapható kész, géllel töltött kapillárisok: Beckman, ABI, Bio-Rad, J&W, Supelco, ... • • • •
Oligonukleotidok, DNS szakaszok szekvenálása: PAGE kétszálú DNS (dsDNA) denaturálása: 7 M karbamid vagy formamid, hő, Hg-vegy. töltés/méret arány azonos, elválasztás méret szerint! nagyobb DNS-re jobb a lineáris poliakrilamid-gél vagy agarózgél (nagyobb pórusok)
• Fehérjék, glikoproteinek elválasztása: SDS-PAGE • a (globuláris) fehérjéket denaturálni kell pl. a következő anyagokkal: nátrium-dodecil-szulfát (SDS): be is burkolja a fehérjét, mozgékonys. arányos log Mt béta-merkaptoetanol, DTT = ditiotreitol (diszulfidhidak hasítása)
44.
Humán fehérjék méret szerinti elválasztása: SDS-PAGE • (A) cerebrospinális folyadék minta (B) szérumminta • minta + puffer, hevítés (feh. denatur.) 120 mM Tris, pH 6.6, 1% SDS, merkaptoetanol • lineáris PAG kapilláris, inj. 3.4 kPa 60 sec • elfo 14 kV, UV detektálás 254 nm • marker fehérjék (ismert Mt): Ferguson plot
OG: Orange G (front marker, elsőként jut át) a: transthyretin c: β-trace protein Alb: albumin f: α2-makroglobulin
b: IgG könnyű lánc d: IgG nehéz lánc e: transzferrin A. Hiraoka et al. J. Chromatogr. A 895 (2000) 339-344
45.
Micelláris elektrokinetikus kromatográfia Micellar Elektrokinetic Chromatography (MEKC) Micellar Elektrokinetic Capillary Chromatography (MECC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő micella / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján Ionok esetén vegyes mechanizmus, mert egyidejűleg mozgékonyság szerinti elválasztás is történik
(Terabe, 1984)
Micelláris elektrokinetikai kromatográfia (MEKC, MECC)
µ tot = µ eo +
1 k' ⋅ µ ep + ⋅ µ mc 1+ k' 1+ k'
ez a tag csak ionokra! elválasztás:
injektálás:
k’: kapacitás faktor (micella – oldatfázis megoszlás) detektor
46.
EOF
teo detektorjel
MEKC elúciós ablak
tmc MEKC retenciós idő
47.
A MEKC-ben leggyakrabban alkalmazott anionos tenzidek tenzid
CMC [mM] aggr. szám
anionos: Na dodecil-szulfát, SDS: CH3(CH2)11OSO3
8,2
62
nátrium tetradecil-szulfát
2,1
62
N-lauroil-N-metil-β-alaninát (ALE)
9,8
lítium-perfluorooktánszulfonát (LIPFOS)
6,7
epesavsók:
R1 nátrium-kolát (SC)
R2
R
OH OH OH CH2CH2COO−
-dezoxikolát (SDC) OH H -taurokolát (TC) -taurodezoxikolát
R3
OH CH2CH2COO−
OH OH OH OH H OH
CH2CH2CONHCH2CH2SO3− CH2CH2CONHCH2CH2SO3−
13
2-4
10
4-10
10 6
4
48.
A MEKC-ben gyakran használt további pszeudofázisok tenzid
CMC [mM] aggr. szám
kationos: dodecil-trimetil-ammónium-bromid (DTAB)
nemionos:
15
50
tetradecil-trimetil-ammónium-bromid (TTAB)
3,6
hexadecil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB)
1
78
0,1
40
polioxoetilén(23)-dodecil éter (Brij 35)
polioxoetilén(20)-szorbinát monooleát (Tween 80)
0,01
polioxoetilén(20)-szorbinát monolaurát (Tween 20)
0,059
oktilglükozid dodecil-β-D-maltozid
0,16
TRITON X-100
0,24
140
49.
A legfontosabb micella-markerek • teljesen szolubilizált festékmolekula – a micellákkal együtt vándorol tmc meghatározására
50.
A felbontás optimálásának lehetőségei a MEKC-ban
1 − teo / t mc N α −1 k ' Rs = ⋅ ⋅ ⋅ 4 α 1 + k ' 1 − (teo / t mc )k ' • ha tmc → ∞,
szelektivitás:
k '1 α= ≥1 k '2
visszakapjuk a HPLC-re érvényes felbontás képletet
Optimálási lehetőségek: • Micellák típusa és koncentrációja (MEKC elúciós ablak) • Puffer típusa, koncentrációja és pH-ja • Szerves módosító használata (MeOH, ACN, iPrOH) • Vegyes micellák használata • Micellák + királis szelektorok (pl. ciklodextrinek) használata • Kapillárisfal borítása, más hőmérséklet vagy feszültség használata
51.
Anabolikus szteroidok MEKC elválasztása H3C CH3
1
H
OH
5
H H
OH CH3
3
CH3 H
6
CH3
O
H H3C
7
O
CH3 H
O O CH3
H H
CH3
H
H
H
O
O O CH3
H
H
H
O CH3
2
H
H
CH3OH CH3
CH3
H
O
O
CH3
H H
O
• 50 µm ID kapilláris, 65 (50) cm • BGE: 60 mM borát, 30 mM foszforsav, 20 mM SDS, 10% 1-propanol • referencia minta: 50 µg ml-1 (0,2 mM) szteroid BGE-ben feloldva • EK injektálás 11 kV, 4 s • elfo: +27 kV, 25 °C, UV detektálás 245 nm WC Lin, CC Sue, CH Kuei, Chromatographia 1999, 49, 454-456.
52.
Doxorubicin & metabolitjai egyetlen sejtből: MEKC + LIF
A: egyetlen sejtből, B: sejtszuszpenzió extraktumból • NS-1 sejtek inkubációja: 25 µM DOX, 8 h, majd mosás HEPES/mannitol pufferrel • 20 µm ID 39,5 cm kapillárisba mikroszkóp alatt az 5 ml sejtszuszpenzióból egyetlen sejtet felszippantunk (gravitációs injektálás, 114 cm, 1 sec, <0,1 nl), pufferben sejt lízis 30” • BGE: 10 mM borát, 10 mM SDS (pH 9,3) • elfo: 400 V cm-1, detektálás: LIF Ar-ion lézer 488 nm gerj, 635 ± 28 nm bandpass detektálás • DOX kalibráció: 0,1 – 10 nM lineáris, LOD: 61 ± 13 zmol (36600 molekula) • átlagosan 9,5 fmol DOX / sejt, metabolit: 0,03-1 amol/sejt AB Anderson, J Gergen, EA Arriaga, J Chromatogr. B 2002, 769, 97-106.
53.
Kapilláris elektrokromatográfia Capillary Elektrochromatography (CEC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő állófázis / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján (mint az RP-HPLC-ben) Ionok esetén vegyes mechanizmus, mert mozgékonyság szerinti elválasztás is történik („HPLC + CZE”) 1981. Jorgenson, Lukacs: 10 µm ODS fázis 170 µm kapillárisban 1987. Tsuda: coated open tubular cap. 1987-91. Knox, Grant: CEC gyakorlati megvalósítása 1994. Smith, Evans: gyógyszermolekulák CEC elválasztása (ODS tölteten)
54.
Kapilláris elektrokromatográfia (CEC)
• HPLC hatékonyságának növelése: részecskeméret csökkentése µm alá ⇒ egyre nagyobb oszlopellenállás, egyre nagyobb nyomás kell! • hidraulikus áramlási profil: parabolikus, csúcsdiszperzióhoz vezet • nyomás helyett EOF hajtsa a folyadékot: - elérhető a HPLC-ben megszokott sebesség (0.5-3 mm/s) - dugószerű áramlási profil: nagyobb hatékonyság - részecskeméret elvileg µm alá is csökkenthető • Elválasztás elve: semleges molekulák álló/mozgófázis közti megoszlása
Az EOF szerepe • a töltet részecskéinek felületén is kialakul elektromos kettősréteg elég közeli részecskék kettősrétegei átfednek, EOF megszűnhet! • Stern-Gouy-Chapman modell: egyre kisebb részecskék esetén egyre nagyobb pufferkoncentráció kell (10 mM-ig), hogy vékonyabb kettősréteg legyen, az elmélet szerint 0,4 um-ig le lehet menni a részecskeátmérővel pressurized CEC (pCEC) = PEC (pszeudo-elektrokromatográfia): • EOF mellett nyomáskülönbség (pumpa) is hajtja az eluenst (inletben túlnyomást alkalmazunk; Verheij, Hugener; Tsuda, 1987)
55.
CEC oszlop készítése
• a részecskék felületén is kialakul elektromos kettősréteg ⇒ töltöttek ⇒ frit kell a kapilláris végére a töltet kiáramlásának megakadályozására: - szilikakapilláris végének szinterelésével (huzalon áramot átvezetve, 450 °C) - kálium-szilikát és formamid in situ polimerizálása - a töltet anyagának szinterelésével • oszlop töltése állófázissal: - „zagy (slurry)”: állófázis szuszpendálva a mozgófázisban, kapillárisba töltés, majd a mozgófázis kimosása vízzel - 1-2 mm vastag kapillárist száraz állófázissal töltenek, majd géppel kihúzzák - szilikagél töltött, elektrokinetikusan be lehet vinni - újabban: monolith column (continuous bed column) kémiailag belepolimerizálják az állófázist, nem kell frit (kb. 2000-től) • buborékképződés megakadályozása: kis túlnyomás a pufferedényekben
grafika: HP CE Partner
56.
Használt állófázisok
• „C18” oktadecilszilán (ODS), 3 µm - erősen bázisos anyagok esetén „szilika hatás” (csúcsalak-torzulás) - mixed-mode: pl. C6/SCX (kationcserélő szulfonátcsoport ugyanazon a szemcsén) • szilikafalhoz kémiailag kötött „C8” • szilikafalhoz kémiailag kötött alfa-savas glikoprotein (AGP) királis elválasztásra
Mozgófázis választása • adott pH-jú puffer víz/acetonitril (vagy víz/metanol) oldószerelegyben %ACN-el nő (!) az EOF • ikerionos (Good-típusú) puffer előnyös 1-5 mM (hő- és buborékfejlődés kivédésére) • pl. 5 mM SDS: ionpárképző és hatékony buborék-gátló (felületi feszültséget csökkenti a szilárd/folyadék fázishatáron)
57.
Gyógyszeralapanyag (API) gyártás példa: Ibuprofen szennyezésprofilja pCEC-val • fused silica kapilláris (33 cm, 24.5 cm, i.d. 100 um), töltet: Lichrosphre 100 RP-18 (5 um) • mobil fázis: 10 : 40 : 50 arányban: - 100 mM hangyasav/ammónia, pH 2,5 - víz - acetonitril • 0,5 mg/ml metanolos minta, injektálás 12 bar 24 sec • elektrokromatográfia: 25 kV és 12 bar túlnyomás • lineáris tartomány: 0,05-0,15 mg/ml, 1% szennyezők kvantitatív mérése
Quaglia, et al. Il Farmaco 55 (2003) 699-705
58.
Mikrochip elfo, „lab-on-a-chip”, micro-TAS, mikrofluidika • fotolitográfiásan gyártott lapkák - üveg, fused silica - poli(dimetil)sziloxán, PMMA • EK injektálás, detektálás: LIF, MS, amperometria • néhány cm migrációs úthossz ⇒ sec-időskálára rövidült analízis • előkoncentrálás, reakció is lehetséges „lab-on-a-chip”
1-puffer, 2-minta, 3-minta waste, 5-elválasztás, 4-waste
• biokémiai, orvosdiagnosztikai alkalmazások!
