A humán tripszinogén jellemzése és mutációinak szerepe a krónikus herediter pancreatitis pathogenezisében PhD doktori értekezés
Kukor Zoltán Témavezető : Dr. Tóth Miklós Programvezető : Dr. Mandl József
Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia Doktori Program 2005 Szigorlati bizottság elnöke : Tagok :
Dr. Machovich Raymund Dr. Hrabák András Dr. Müllner Nándor Dr. Szilágyi László
Bíráló bizottság elnöke : Tagok :
Dr. Zelles Tivadar Dr. Falus András Dr. Geiszt Miklós Dr. Hegyi Péter
Hivatalos bírálók :
Dr. Varga Gábor Dr. Venekei István
Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke………………………………………. 3. 2. Bevezetés…………………………………………………… 5. 3. Célkitűzések……………………………………………….. 33. 4. Módszerek…………………………………………………. 35. 5. Eredmények……………………………………………….. 38. 6. Megbeszélés……………………………………………….. 75. 7. Következtetések…………………………………………… 88. 8. Összefoglaló……………………………………………….. 93. 9. Summary………………………………………………….. 95. 10. Köszönetnyílvánítás……………………………………... 97. 11. Irodalomjegyzék…………………………………………. 99.
2
1. Rövidítések jegyzéke BSA Bovine Serum Albumin CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator EDTA Etilén-Diamin-TetraAcetát GPR-pNA glicil-prolil-arginil-p-nitro-anilid IP izoelektromos pont TAP
Tripszinogén Aktivációs Peptid
TAT 1 Tumor Associated Trypsin 1 (tripszin 1) TAT 2 Tumor Associated Trypsin 2 (tripszin 2) TCA triklórecetsav Tg1 humán tripszinogén 1 (kationos tripszinogén) Tg1* Arg122-Val123 helyen hasított (két szálú) humán tripszinogén 1 Tg2 humán tripszinogén 2 (anionos tripszinogén) Tg3 humán tripszinogén 3 (mezotripszinogén) Tr1 humán tripszin 1 (kationos tripszin) Tr2 humán tripszin 2 (anionos tripszin)
3
Tr3 humán tripszin 3 (mezotripszin) PAR
Proteáz Aktivált Receptor
PRSS1
kationos tripszinogén gén
PRSS2
anionos tripszinogén gén
PRSS3
mezotripszinogén gén
PSTI
Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor
SAAP Surfactant-Associated Anionic Peptides SBTI SoyBean Trypsin Inhibitor SPINK1 Serine Protease INhibitor Kazal type 1 (PSTI)
4
2. Bevezetés 2.1. Nomenklatúra 2.1.1. A tripszin aminosavainak jelölése A kimotripszinszerű szerin proteázok, így a tripszin aminosav számozása hagyományosan a kimotripszinogén számozásán alapul. Mivel a pretripszinogén egyes aminosavai emiatt nem kapnak számozást, az esetleges mutációk egyértelmű jelölése is nehézségekbe ütközik, a kimotripszinogénen alapuló számozást egyre kevésbé használják. A kimotripszinen alapuló számozás előnye, mely szerint a kitüntetett aminosavak (pl. a katalitikus triád) egyforma számot kapnak és egyszerűen összehasonlíthatók így elvész, de egyéb jelölési módokkal (pl. a katalitikus triádot csillaggal jelölve) a hátrány kiküszöbölhető. Disszertációmban a tripszinogénen alapuló számozást használom a kétféle számozás közül. Mivel az értekezés alapjául szolgáló cikkekben mindkét számozás előfordul, az eltéréseket az alábbiakban írom le. A 2002 Feb 22;277(8):6111-7 JBC cikkben szereplő Arg117 Arg122-nek, Val118 Val 123-nak, Glu75 Glu80-nak, Glu85 Glu90-nek felel meg. Az értekezésben az aminosavak elfogadott egy- és három betűs rövidítéseit használom. 2.1.2. Tripszinogén mutációk jelölése Az aminosavak számozásának problémája magával hozta a mutációk jelölésének problematikáját
is.
A
biokémikusok
által
a
szerin
proteázokra
elfogadott
kimotripszinogén szekvenciáján alapuló számozás több problémát is felvetett a tripszin mutációk jelölésében: A startkodon (Met) nem kodon 1. 11 aminosav az aktív tripszinben nem kapott számozást. A tripszinogén aktivációs peptidje szintén nem kapott számot (1). 5
Az első tripszinogén mutációt 1996-ban írták le, az eltelt időszakban számuk 20 körülire nőtt, és ez sürgőssé tette a mutációk egyértelmű jelölését is. Antonarakis 1998ban az 1996-os heidelbergi (Locus-Specific Mutation Databases) és san franciscoi (Mutation Databases) International Nomenclature Working Group Nomenklatúra Bizottság vezetőjeként írta le javaslatukat a mutációk egységes jelölésére (2). Az egyértelmű, logikus jelölések ellenére az új számozás elterjedése még nem általános (3, 1
) és bizonyára még fog félreértéseket okozni.
2.2. Pancreatitis (hasnyálmirigy gyulladás) A pancreatitis a pancreas gyulladásos betegsége. A pancreatitis incidenciája iparilag fejlett országokban 3,5-35 /100000, az arány -elsősorban az alkoholisták számának emelkedése miatt- folyamatosan növekvő tendenciát mutat (4, 5). A pancreatitis több szempont szerint is osztályozható. A legegyszerűbb felosztás szerint akut és krónikus pancreatitis létezik. Az akut és krónikus pancreatitis definíciója sem egységes, a klasszifikáció is problematikus (6,7), egyes országok ajánlásai is eltérhetnek egymástól. Több alkalommal (Marseilles, 1963 (8), Cambridge, 1983 (9), Marseilles, 1984 (10) MarseillesRóma 1988, Atlanta 1992 (11) ) próbáltak nemzetközi szinten egységes álláspontot kialakítani. A legelfogadottabbak a cambrigde-i és a marseilles-i kritériumok. A marseilles-i hátránya az, hogy hisztológiai bizonyítékra is szükség van, míg a cambrigde-i nem elég specifikus (10).
2.2.1. Akut pancreatitis (heveny hasnyálmirigy gyulladás) Az
akut
pancreatitis
általában
hirtelen
kezdődik
súlyos
epigastriális
fájdalommal, ami állandóvá és gyötrelmessé válik. A fájdalom a hátba, ritkán balra vagy jobbra sugárzik. A beteg a fájdalom helyét a hasán övszerűen széthúzva szokta 6
jelölni. A fájdalom járáskor vagy hanyattfekvéskor fokozódik, felüléskor és előrehajláskor csökken. Az ágyában ülő, előrehajló, a kezeit a térdén összekulcsoló beteg látványa a pancreas megbetegedésének a gyanúját kelti (12). Az akut pancreatitisre jellemző még a hányinger, hányás, a beteg gyengének érzi magát, izzadt, gyakori a magas, 38,4-39 oC-os láz. A has nyomásérzékeny, főként a felső részben. A legtöbb esetben az izomvédekezés, feszülés nem észlelhető. A has puffadt lehet, a bélhangok hiányozhatnak (néma has). Akut pancreatitisben az emésztőenzimek szekréciója csökken, míg szérumban koncentrációjuk nő. A fekális elasztáz-, lipáz-, tripszinszintek csökkennek, ami az elégtelen emésztési funkciókra utalnak. A laboratóriumi leletekre jellemző, hogy az esetek 90 %-ában 24 órán belül a szérum amiláz és lipáz szintek megemelkednek, rendszerint a normál érték háromszorosára (13). A változások korrelálnak a pancreatitis súlyosságával. O'keefe és mtsai közelmúltban megjelent cikke szerint akut pancreatitises betegek szérum átlagos lipázkoncentrációja kevesebb, mint 300 U/l –ről mérsékelt pancreatitisben 4200-ra, míg nekrotizáló pancreatitisben 33000-re nőtt. Az amiláz szérumkoncentráció 150 U/l-ről több mint háromszorosára, illetve 15-szörösére emelkedett. A duodenális szekréciós ráta (U/óra) a tripszin esetében 500-ról 200-ra illetve 30-ra, az amiláz 9200-ról 9000-re, illetve 420-ra, míg a lipáz szekréció 570*103ról 235*103-re illetve 6*103-ra csökkent (14). Az akut pancreatitis oka leggyakrabban epekő megakadása és a pancreas szekrétum következményes pangása vagy nagy mennyiségű alkohol rendszeres fogyasztása. A recidiváló akut pancreatitis a kationos tripszinogén R122H (15), a kationos tripszinogén N29T (16), a PSTI N34S (17) mutációhoz, valamint CFTR mutációkhoz (18) is kapcsolható. Az alkoholos eredetű pancreatitis súlyosságának megítéléséhez a Ranson-féle kritériumokat használják. A 11 kritériumból 3 vagy több megléte esetén súlyos lefolyású esetre számíthatnak. 7-8 kritérium teljesülésénél a mortalitás 100 %-os. Az „Acute Phisiology and Chronic Health II” (APACHE II) kritériumrendszer, valamint a
7
módosított Glasgow kritériumok szintén használatosak a betegség súlyosságának megítélésében (19). Az akut pancreatitist az okozza, hogy az aktivált pancreas emésztőenzimek kiszabadulnak az acinus sejtekből a környező szövetekbe. Az aktiváció mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Az akut pancreatitis az esetek többségében enyhe betegség, amely kezelés nélkül, napok alatt magától gyógyul. A hasnyálmirigy nyugalomba helyezése érdekében az orális táplálkozást felfüggesztik, amíg a fájdalom nagyrészt nem szűnik meg sem folyadékot, sem szilárd táplálékot nem adnak szájon keresztül. Fontos a fájdalom csökkentése. Súlyos pancreatitis esetén a kezelés a laboratóriumi eredményektől is függ (folyadék-, kalcium-, plazma-, albumin-, stb. pótlás). Szükség lehet műtétes megoldásra is (pl. epeköves eredet esetén; részben vagy teljesen elhalt pancreas eltávolítása céljából) (20).
2.2.2. Krónikus pancreatitis (idült hasnyálmirigy gyulladás) A krónikus pancreatitist felnőttekben úgy definiálják, mint a pancreas kiújuló vagy folyamatos gyulladásos betegségét, irreverzibilis morfológiai változásokkal kísérve. Utóbbiak fájdalmat okozhatnak. Némelyik betegben az exokrin vagy endokrin funkciók vagy mindkettő zavart szenvedhet. A krónikus pancreatitisre jellemző a tartósan fennálló vagy visszatérő, rohamokban jelentkező epigastrialis és bal felső kvadráns fájdalom. Gyakori az étvágytalanság, a hányinger, a hányás, a székrekedés, a flatuentia és a fogyás. Roham alatt a has nyomásérzékeny, az izomvédekezés gyenge. A rohamok időtartama változó, néhány órától két hétig is eltarthatnak, a fájdalom állandósulhat vagy idővel csökkenhet. Steatorrhea alakulhat ki a betegség kései szakaszában. A felnőttek 80 %-ában a klinikai tünetek első megjelenése után 25 éven belül diabetes alakul ki (21).
8
Az akut rohamok során jellemző az emelkedett szérum amiláz és lipáz szint, de a normális vagy csökkent érték nem zárja ki a krónikus pancreatitist. A közös epevezeték kompressziója miatt a szérum alkalikus foszfatáz és bilirubin szint emelkedhet. Glukózuria is előfordulhat. A széklet vizsgálatával fokozott (7 gramm/napnál magasabb érték) zsírürítés mutatható ki. A pancreas elégtelen működését a széklet kimotripszin vagy elasztáz tartalmának csökkenésével mutathatják ki. Csökkenhet a beteg bikarbonát elválasztása, ami szintén a pancreas elégtelen működését jelzi. A krónikus pancreatitis leggyakoribb oka a hosszan tartó, nagy mennyiségű (férfiaknál legalább 80g/nap, nőknél 60 g/nap) alkoholabúzus. Az alkoholfogyasztás időtartamával és mennyiségével a krónikus pancreatitis kockázata megnő (22,23), de a súlyos alkoholisták 5-10 %-ánál fordul csak elő. Az alkohol valószínűleg nem befolyásolja közvetlenül a tripszin aktiválódását. Publikálatlan eredményeink szerint az alkohol 2 %-os koncentrációban nem okozott fokozott autoaktivációt egyik izoenzimnél sem, nem növelte a tripszinek stabilitását, valamint a PSTI kötődését, illetve degradációját sem befolyásolta. Valószínű, hogy az etanol a zimogének ürítésére hat, kolecisztokininnel indukált patkány acinus sejtek tripszin és kimotripszin aktivitása nőtt 35 mM etanol jelenlétében (24). A második legyakoribb krónikus pancreatitis típus az elsősorban Ázsiában, trópusi területeken előforduló trópusi krónikus pancreatitis. Incidenciája Dél-Indiában magas, 126/100 000 (25). A trópusi krónikus pancreatitis fiatalkori, nem alkoholos eredetű, kalcifikáló pancreatitis. A trópusi pancreatitisre jellemző a fiatalkori, (2-3. dekád) manifesztáció, az esetek több mint 90 %-ában megjelenő nagy méretű intraduktális kő, a krónikus pancreatitises betegeknél is fokozottabb pancreatikus carcinóma. A tipikus klinikai kép az abdominális fájdalom, hasmenéshez vezető emésztési zavarok és súlyos, 90 % feletti gyakoriságú fibrocalculus pancreaticus diabetes. A trópusi krónikus pancreatitises betegeknél gyakori az alultápláltság, ami egyik oka lehet a betegségnek (26).
9
Pancreas szekretorikus tripszin inhibitor (PSTI) N34S mutációt találtak a trópusi krónikus pancreatitises betegek 44 %-ában (27), az egészséges kontrollokban az előfordulása ennek a mutációnak kb. 2 % volt. Egy másik munkacsoport is talált összefüggést a trópusi krónikus pancreatis és a PSTI N34S mutánsa között, különös tekintettel a fibrocalculus pancreaticus diabetes krónikus pancreatitisesekre (28). A krónikus pancreatitisisek körében a pancreas tumor valószínűsége kb. az ötvenszeresére emelkedik. Trópusi pancreatitis esetében a kockázat még nagyobb. A krónikus pancreatitis két csoportra osztható. Az első a késői típus, amelynek első klinikai manifesztációja az 5-7. dekádra jellemző. A második a korai típus, mely 35 év alatt fejlődik ki. Függetlenül az etiológiától a krónikus pancreatitis klinikai menete két szakaszra bontható. A korai fázisra jellemző a visszatérő akut pancreatitises epizódok, majd ezt követi a késői fázis a pancreas exokrin funkcióinak zavaraival, diabetes mellitussal és kalcifikációval. A krónikus pancreatitis pathogeneziséről az ismereteink még nagyon szegényesek. Nem világos, hogy milyen genetikai faktorok és környezeti tényezők vezetnek el egyértelműen a krónikus pancreatitis kialakulásához. A leggyakoribb PRSS1 gén (kationos tripszinogén) mutáció (R122H) penetranciája 80 %. A PSTI N34S mutáció növeli a krónikus pancreatitis kockázatát, de az emberek kb. 1%-a hordozza a mutációt klinikai manifesztáció nélkül, a tünetmentes hordozók aránya egy finn tanulmány szerint 2,6 % volt (29). Az iparilag fejlett országokban a krónikus pancreatitis esetek kb. 70 %-ában a betegség oka a hosszú távú (legalább öt éve tartó) alkohol abúzus. Az alkoholisták viszonylag kis hányada betegszik meg krónikus pancratitisben abban az esetben is, ha már ismert mutációkat hordoznak (30). Több elméletet is felállítottak a krónikus pancreatitis kialakulásának magyarázatára. Ezek alátámasztására felhozott kísérletes bizonyítékok általában állatkísérletekből származnak, ezért fenntartással kell őket fogadni.
10
Az az elgondolás, hogy a pancreatitis kialakulásának egyik első lépése a tripszin aktiválódása a pancreasban már több mint 100 éves múltra vezethető vissza. Klebs számolt be 1879-ben először arról, hogy a pancreasnak önemésztő potenciálja van. A képződő tripszin aktiválhatja a pancreatikus emésztőenzimeket, az elasztázt, karboxipeptidáz A-t, kimotripszint. A képet árnyalja, hogy a tripszin képes autolízisre, tehát a tripszin és tripszinogén lebontásával a pancreasban aktiválható potenciális tripszin mennyiségét csökkenti. A tripszinnek így védőszerepet is tulajdonítanak. Mint pancreatitis ellen védő izoenzim különösen a mezotripszin volt népszerű, mert gyengén kötődik a tripszin antagonista PSTI-hez, így aktivitása nem gátolt, szabadon bonthatná a tripszinogéneket (31). Ezt a védőfunkciót saját kísérleteink alapján kizártuk, mert a mezotripszin nem képes jelentős mértékben hidrolizálni egyik tripszin izoenzimet sem. Mivel a mezotripszin specifikusan tripszin inhibitorokat bont, így a PSTI-t is, a tripszinaktiváció gátlásának megszüntetésével a mezotripszin pathológiás folyamatok egyik elindítója lehet (32). Chen és munkatársai 2003-ban írták le, hogy a PRSS1 gén (kationos tripszinogén) funkcióvesztő mutációját (loss of function mutation) egészséges kontrollokban és krónikus pancreatitisben nem szenvedő alkoholistákban is megtalálták, míg pancreatitis betegekben nem (33). Ezen eredemények alapján kijelenthető, hogy a tripszinnek nincs védőhatása a pancreatitis ellen, ellenkezőleg, egyre több adat arra mutat, hogy szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában. Kérdés, hogy mi lehet az oka a tripszinaktivitás megjelenésének a pancreasban? Az enteropeptidáz, mint a tripszin specifikus aktivátora valószínűleg nem iniciátor, mert expressziója a vékonybélre lokalizálódik. A tripszinaktiválás két lehetséges útja a pancreasban az autoaktiváció és a lizoszómális emésztőenzimek okozta aktiválás. Az autoaktiváció lehetséges helye a szekretórikus vakuolum vagy a lizoszóma. A citoszólra jellemző enyhén lúgos közegben a kationos tripszinogén autoaktiváció sebessége csak Ca2+ jelenlétében jelentős (34,
35
). A lehetséges tripszin
mennyiség 20 %-ának megfelelő PSTI mellett, (0,1 M Tris/HCl, pH=8,0 , 5 mM Ca2+ 37 oC) 14 nap múlva sem tapasztalható tripszinaktivitás (Sahin-Tóth M, Kukor Z nem közölt megfigyelés). Az anionos tripszinogén autoaktivációját az eredmények részben ismertetem. A mezotripszinogén nem autoaktiválódik (32). 11
A tripszinnek lehet kitüntetett szerepe mégis a pancreatitis kialakulásában, mert pathológiás körülmények között nem csak lizoszómális enzim, katepszin B aktiválhatja, hanem képes PSTI hiányában autoaktivációra mind a citoszólra jellemző enyhén lúgos, mind a lizoszómákra jellemző enyhén savas kémhatású körülmények között is. A képződő tripszin pedig beindíthatja a pancreasban termelődő emésztőenzimek aktiválási kaszkádját. Tíz vizsgálat alapján a tripszin inhibitorokkal történt kezelés nem befolyásolja szignifikánsan az enyhe akut pancreatitisben szenvedők mortalitását, és közepesen vagy nagyon súlyos pancreatitisnél sem változtatja azt meg számottevően (36). A krónikus pancreatitis kezelésének fő szempontja a kiesett pancreasfunkciók pótlása és a szövődmények kialakulásának megelőzése, illetve késleltetése. Alkoholos pancreatitis esetében fontos a teljes alkoholelvonás. Általában csökkenthető a fájdalom, az emésztési funkciók javulnak, a pancreas károsodása csökkenthető, esetleg visszafordítható.
Ha
szükséges,
a
kiesett
exokrin
és
endokrin
funkciókat
emésztőenzimek adásával és a diabetes kezelésével lehet helyettesíteni. A diétában általában csökkentik a zsír- és fehérjebevitelt. Fontos a néha szinte elviselhetetlen fájdalom csillapítása is. Műtéti megoldás is szóba jöhet a pancreas kivezető csövében lévő kövek eltávolításától kezdve a pancreasectómiáig.
2.2.3. Örökletes pancreatitis Az első családfát Comfort és Steinberg (37) írták le 1952-ben, mellyel igazolták, hogy a pancreatitis öröklődő is lehet. Ezután közel ötven év telt el, míg a betegséget okozó génhibák azonosítására is sor került. 1996-ban három munkacsoport egymástól függetlenül (38,
39 40
,
) bejelentette, hogy az öröklődő pancreatitis a VII. kromoszóma
hosszú karjához köthető, ahol több pancreatikus emésztőenzim ( pl. karboxipeptidáz A1, kationos tripszinogén, anionos tripszinogén) génje is megtalálható. Szintén a VII. kromoszóma hordja a CFTR gént is.
12
Az első olyan mutációt, ami krónikus pancreatitist okoz 1996-ban azonosították a kationos tripszinogén génjében (PRSS1 R122H). Krónikus pancreatitishez elsősorban a kationos tripszinogén, a PSTI és a CFTR gén mutációi vezethetnek. Az előbbieken kívül vizsgálták még az α1-antitripszin mutációinak szerepét, de egyértelmű eredmény nem született. Az örökletes pancreatitis kezelésének célja a fájdalom csökkentése, a beteg életminőségének javítása, a szövődmények kialakulásának késleltetése. A betegséget kiváltó okot nem lehet megszűntetni. A pathogenezis feltárásának ezért rendkívüli szerepe van a potenciális gyógymódok és a lehetséges preventív stratégia kidolgozásában.
2.2.3.1.
Tripszinogén mutációk
1996-ban Whitcomb és munkatársai azonosították az első örökletes krónikus pancreatitissel kapcsolható pontmutációt (41), ami a tripszinogén1 R122H mutációja volt. Ez egy egyszerű nukleotid csere (tranzíció), CGC(Arg122)-ről CAC(His122)-re, ami a vizsgálatba bevont családok közül ötöt érintett. Mivel ez a mutáció egy új restrikciós helyet eredményez az Afl III endonukleáz számára, a könnyű detektálási megközelítés miatt világszerte ez a leggyakrabban használt módszer az érintettség kimutatására (42, 43). A leggyakrabban előforduló R122H mutáció mellett leírtak számos egyéb mutációt és polimorfizmust is (1. táblázat) (44). A promoter régióban egy deléciót azonosítottak, a tripszinogén aktivációs peptidjében találták az A16V, D19A, D22G, K23R mutációkat, a N29I, N29T, P36R, Y37X mutációk a tripszinogén 2. exonjában, az E79K, G83E, K92N, D100H, L104P, R116C, R122H, V123M és C139F mutációk pedig a 3. exonjában találhatóak.
13
PRSS1 gén mutáció
Aminosav változás
esetszám 1
-28delTCC 47C>T
A16V
>10
56A>C
D19A
1
65A>G
D22G
1
68A>G
K23R
1
86A>T
N29I
>50
86A>T
N29I/N54S
1
86A>C
N29T
1
107C>G
P36R
1
111C>A
Y37X
1
235G>A
E79K
4
248G>A
G83E
1
276G>T
K92N
1
298G>C
D100H
1
311T>C
L104P
1
346C>T
R116C
3
364C>T
R122C
2
365G>A
R122H
>100
365G>A, 366C>T
R122H
2
367G>A
V123M
1
416G>T
C139F
1
161A>G PRSS1/PRSS2 génkonverzió
1. táblázat A PRSS1 (kationos tripszinogén) gén örökletes pancreatitissel összefüggő ismert mutációi (polimorfizmusok nélkül) Vastag betűvel tüntettem fel az egynél nagyobb esetszámú mutációkat
14
A single-strand conformation polymorphism technikával felfedezett mutáció a kationos tripszinogén gén teljes szekvencia analízisével azonosítható. Ha az azonosított mutáció ritka (pl. kationos tripszinogén D19A), megfigyelésük mindössze egy esetre korlátozódik, ha családi öröklésmenet nem követhető nyomon (haláleset, mintaadás megtagadása) akkor könnyen lehet téves következtetés levonásához jutni. Kérdésessé válhat az is, hogy mutációról vagy variációról van-e szó. A mutáns fehérje biokémiai karakterizálása ebben az esetben segíthet (kationos tripszinogén D19A). Tapasztalataink alapján, ha egy feltételezett mutáns fehérje (pl. anionos tripszinogén V118I) tulajdonságai (autoaktiválás-, degradáció sebessége, mértéke, Vmax, KM, PSTI kötés, PSTI lebontás) megegyeznek a vad típuséval, érdemes további statisztikai analízisnek alávetni a mutációt. Esetünkben az anionos tripszinogén V118I-ről kiderült, hogy polimorfizmusról van szó, a változatot csak véletlenül mutatták ki először egy érintett családban (Whitcomb DC, Sahin-Tóth M, Kukor Z nem közölt megfigyelés). Az örökletes krónikus pancreatitis mutációk gyakoriságát nehéz megbecsülni megfelelő esetszám és metodikájú vizsgálat nélkül (45), az esetszám növelésével általában az R122H mutációt sikerül azonosítani (46). Gyakran csak a leggyakoribb mutációk vizsgálatára (PRSS1 R122H, N29I, A16V; PSTI N34S) kerül sor, ami a mutációk előfordulási arányának eltolódásához vezethet (47). Európában (48) Howes és munkatársainak az EUROPAC (European Registry of Hereditary Pancreatitis and Pancreatic Cancer) keretében végzett, több országot, 112 örökletes krónikus pancreatitisben érintett családot (418 beteget) magában foglaló felmérésében kationos tripszinogén mutációs profilt készítettek, a felmérés adatainak felhasználásával készült a 1. ábra.
15
Nincs Tg1 mutáció Ritka mutációk A16V
R122H N29I
1. ábra Örökletes krónikus pancreatitis betegek kationos tripszinogén génmutációinak megoszlása Európában (Howles (47) alapján)
(PRSS1)
A leggyakoribb mutáció az R122H (52%), ezt követte az N29I (21%), A16V (4%), ritka mutációk (2%). A betegek 19 %-ában nem találtak PRSS1 mutációt.
Örökletes pancreatitist okozó mutációt még nem találtak az anionos tripszinogén (PRSS2) génben (49). Még nem publikált eredményeink szerint viszont létezik olyan anionos tripszinogén mutáció (G191R), ami német populációban a pancreatitisben szenvedők kb. 1 %-ában, míg az egészséges kontroll csoportban kb. 3 %-os arányban fordul elő. Ez arra utal, hogy a G191R mutáció esetleg védő hatású lenne a pancreatitis ellen. Ez alátámasztja azt az elméletünket, mely szerint az anionos tripszinogénnek szerepe lehet a pancreatitis kialakulásának megakadályozásában (lsd. később). Jelenleg
még
pancreatitishez
kapcsolható
PRSS3
génmutációt
(mezotripszinogén) nem azonosítottak. Ismert az E32del variánsa, amit biokémiai jellemzése során identifikusnak találtak a vad típussal (50). Tekintettel arra, hogy a mezotripszin specifikusan tripszin inhibitorokat, így a pancreast a nemkívánatos tripszinaktivitástól védő PSTI-t bontja, stabilabb vagy aktívabb mezotripszint 16
eredményező esetleges mutációk a pancreatitis kialakulásának kedveznének (32). A PRSS3 emiatt vizsgálatok tárgya.
2.2.3.2.
PSTI mutációk
A pancreas acinus sejtjeiben termelődő PSTI elsődleges feladata a pancreas védelme az esetlegesen képződő tripszin ellen. A PSTI a potenciálisan képződő tripszin mennyiség kb. 20 %-át képes gátolni (51). Mennyiségének csökkenése vagy az inhibitor csökkent kötődése a tripszin esetleges felszaporodásához vezethet a pancreasban. A PSTI tripszin antagonista szerepéből adódóan logikus volt, hogy a tripszinmutációk felfedezése után az esetleges PSTI mutációk azonosítása a kutatók érdeklődését felkeltse. 2000-ben több munkacsoportnak is sikerült örökletes pancreatitissel kapcsolt PSTI mutációt azonosítani (52, 53). Érdekes, hogy több mutáció is intronokban található (8). A két nagyobb esetszámú, aminosavcserét jelentő N34S és P55S közül az N34S mutáció kiemelkedő számban fordul elő pancreatitisben, így jelentősége is nagyobbnak tűnik. Jelen ismereteink szerint (54) a PSTI N34S mutáció rizikófaktor az alkoholos pancreatitis kialakulásában. A krónikus alkoholos pancreatitises betegek közel 6%-a hordozza az N34S allélt. A pancreatitis nélküli alkoholisták és egészséges kontroll személyek kb. 1 %-a bizonyult heterozigóta hordozónak az N34S mutációra nézve. Egészségesek közt homozigóta N34S allélt nem találtak. Meglepetésre a heterozigóta és homozigóta betegek között nem lehetett klinikai különbségeket megfigyelni. Ezeknek az adatoknak az analízise három N34S asszociált pancreatitis hipotézishez vezetett, mely szerint pancreatitis abban az esetben fejlődhet ki, ha valamely személy - vagy N34S homozigóta hordozó - vagy N34S heterozigóta és alkoholos abúzus áll fenn - vagy N34S hordozó és legkevesebb egy másik genetikai rizikófaktor is fennáll.
17
PSTI mutáció
aminosav változás
esetszám
-215G>A
promoter
1
-215G>T
promoter
1
-53C>T
5' UTR
1
2T>C
M1T
1
c.27delC
2
41T>C
L14P
1
c.87+1G>A
2 intron
1
101A>G
N34S
> 200
150T>G
D50E
1
160T>C
Y54H
1
163C>T
P55S
<10
194G>A
R65Q
1
IVS3+2T>C
3 intron
<10
IVS3+125C>A
3 intron
1
IVS3+184T>A
3 intron
<10
199C>T
R67C
1
2. táblázat A PSTI (SPINK1) gén örökletes pancreatitissel összefüggő ismert mutációi Vastag betűvel az egynél nagyobb esetszámú mutációkat (polimorfizmusok nélkül) jelöltem
2.2.3.3.
Egyéb mutációk szerepe
A vizsgálati adatok azt mutatják, hogy az örökletes pancreatitis poligénes betegség. A tripszinogén és PSTI géneken kívül más géneket is vizsgáltak. A CFTR gén mutációi okozta cisztikus fibrózis betegek 85 %-ának van pancreatitis érintettsége is (1). A leggyakoribb CFTR mutáns hordozó újszülöttek immunreaktív vér tripszinogén szintjét vizsgálva emelkedett tripszinogén szintet mutattak ki (55). Az α1-antitripszin egyike a szérumban található legfontosabb proteáz inhibitoroknak(56). Az α1antitripszin deficienciát összefüggésbe hozták májelégtelenséggel (57) és pulmonáris 18
emphysemával (58). Krónikus pancreatitisben is fontos szerepe lehet, mert védheti a pancreast az önemésztődés ellen a proteáz gátlásával. Az eddigi vizsgálatok eredménye nem egyértelmű. Az α1-antitripszin fenotípusának és szérumszintjének vizsgálata egyes esetekben korrelációt mutatott a krónikus pancreatitissel (59,60,61,62,63), míg mások nem találtak asszociációt (64,65,66,67 ).
2.3. Tripszin A tripszin egyike a legrégebben tanulmányozott és legismertebb fehérjéknek. A tripszinek neutrális szerinproteázok, közös jellemzőjük a szubsztrátspecificitás. Bázikus aminosavak, tehát arginin és lizin mellett hidrolizálják a peptidkötést. A humán tripszinogénnek négy izoenzime ismert, jelen dolgozatban kationos tripszinogén, anionos tripszinogén, mezotripszinogén és agyi tripszinogén névvel különböztetem meg őket.
2.3.1. Tripszinogén szerkezete A tripszinogének aminosav szekvenciája ismert, meghatározták a kationos tripszin, mezotripszin és agyi tripszin háromdimenziós szerkezetét is. Az agyi tripszin kristályos szerkezetét magyar kutatócsoport írta le (68). A pancreasban expresszálódó három izoforma (kationos tripszin, anionos tripszin, mezotripszin) felépítésére jellemző, hogy a pretripszinogén egy 15 aminosavból álló szignál peptidből, 8 aminosavból álló aktivációs peptidből és 224 aminosavból álló tripszinből áll (2. ábra).
19
szignál peptid Tg1
TAP
--MNPLL-ILTFVAA---------- ALAAPFDDDDKIVGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQ 56
Tg2
--MNLLL-ILTFVAA---------- AVAAPFDDDDKIVGGYICEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLISEQ 56
Tg3
--MNPFL-ILAFVGA---------- AVAVPFDDDDKIVGGYTCEENSLPYQVSLNSGSHFCGGSLISEQ 56
Tg1
WVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINARVST 125
H
D
Tg2
WVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPKYNSRTLDNDILLIKLSSPAVINSRVSA 125
Tg3
WVVSAAHCYKTRIQVRLGEHNIKVLEGNEQFINAAKIIRHPKYNRDTLDNDIMLIKLSSPAVINARVST 125
Tg1
ISLPTAPPATGTKCLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPGKITSNMFCVGFLEGGKD 194
Tg2
ISLPTAPPAAGTESLISGWGNTLSSGADYPDELQCLDAPVLSQAECEASYPGKITNNMFCVGFLEGGKD 194
Tg3
ISLPTAPPAAGTECLISGWGNTLSFGADYPDELKCLDAPVLTQAECKASYPGKITNSMFCVGFLEGGKD 194
Tg1
SCQGDSGGPVVCNGQLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANS 247
Tg2
SCQGDSGGPVVSNGELQGIVSWGYGCAQKNRPGVYTKVYNYVDWIKDTIAANS 247
Tg3
SCQRDSGGPVVCNGQLQGVVSWGHGCAWKNRPGVYTKVYNYVDWIKDTIAANS 247
/
S
*
*
2. ábra A pancreatikus tripszinogén izoenzimek aminosavsorrendje A tripszin működésében kitüntetett aminosavak a következők: vastag : szignálpeptid narancs : tripszinogén aktivációs peptid vastag piros : katalitikus triád (H, D, S-sel is jelölve) aláhúzott : kötőzsebben lévő glicinek (csillaggal is jelölve) vastag dőlt : mezotripszin és agyi tripszin inhibitor rezisztenciájáért felelős arginin 198 vastag dőlt aláhúzott : a szubsztrátspecificitásért felelős aszparaginsav (/-gal is jelölve)
A tripszinek a peptidkötés hidrolízisét a szerin200-hisztidin63-aszparaginsav107 katalitikus triád segítségével végzik. A szerin proteázok által katalizált hidrolízis részletesen ismert folyamat, mechanizmusát biokémiai tankönyvek részletesen ismertetik (69, 29. és 222. o.), ezért leírásától eltekintek. A szubsztátspecificitás a kötőzsebben található konzervatív aszpartát194 és két glicin (Gly221, Gly231) segítségével biztosított. Az aszpartát negatív töltése révén erős ionos kötést képes létesíteni a szubsztrát argininjével vagy lizinjével. A két glicin szerepe az, hogy a kötőzsebbe bekötődhessenek a nagy oldallánccal rendelkező aminosavak is. A tripszin inaktív formában, tripszinogénként szintetizálódik. A tripszin aktivációja limitált proteolízissel történik, ennek során a nyolc aminosavból álló 20
tripszinogén aktivációs peptid lehasad a tripszinről. A vékonybélben ezt a hasítást specifikusan az enteropeptidáz végzi. A tripszinogén aktivációs peptid konzervatív felépítésű, összetétele a halaktól az emlősökig hasonló. A hasítóhely általában lizin, ami előtt savas karakterű aszparaginsavak (2-4) találhatóak. A lizin és az aszparginsavak egyaránt késleltetik az idő előtti aktivációt. A tripszin arginin mellett 2-10-szer nagyobb sebességgel hasít, mint lizin mellett (70). Az arginin guanidinocsoportja közvetlenül alakít ki ionos kötést a kötőzsebben található aszpartáttal, míg a lizin kisebb mérete révén nem képes elérni az aszpartátot, a két aminosav között egy vízmolekula közvetíti a kötést. Az aktivációs peptidben lizin jelenléte arginin helyett tehát csökkent autoaktivációs sebességet jelent. Az aktivációs peptid aszpartátjai negatív töltésük miatt gátolják a kötőzseb aszpartátjának bekötődését, ezért jelentenek csökkent autoaktivációs sebességet (71). Az Asp4 szekvencia emlősökben erősen konzervált struktúra, a lizinnel együtt az enteropeptidáz specifikus hasítóhelyét adják. Az Asp-Asp-Asp-Asp-Lys szekvencia így a tripszinogén csökkent autoaktiválásán kívül lehetővé teszi, hogy az enteropeptidáz specifikusan aktiválja a tripszint. A tripszinogén aktivációs peptidben lévő negatív töltések árnyékolásával az autoaktiválás sebessége nő.
A Ca2+
hozzákötődik az aktivációs peptidhez, így csökkentve annak negatív töltését. Alacsony pH értéknél (pH<5) az aszparaginsav protonálódik, ami szintén a negatív töltések semlegesítését jelenti. Savas közegben emiatt nincs szükség autoaktivációhoz Ca2+-ra, a Ca2+ nem növeli az autoaktiváció sebességét. Érdekes, hogy a tripszinhez hasonlóan az enteropeptidáz is nagyobb sebességgel hasít arginin mint lizin mellett. A természetben mégis lizin található argininnel szemben az aktivációs peptidben. Az ebből fakadó hátrány úgy tűnik kisebb, mint az előny, ami a csökkent autoaktivációból (idő előtti aktiválásból) származik. Az aktivációs peptidben található K23R mutációt egy német munkacsoport rövid, az aktivációs peptid szekvenciáját is tartalmazó peptiddel modellezte. A peptid emésztését vizsgálva azt tapasztalták, hogy az arginint tartalmazó változatot 12,5-szer nagyobb sebességgel hasította a tripszin a lizint tartalmazó változathoz képest pH=8,0-nál. Az arány csökkent a pH csökkentésével (72). Érdekes megfigyelés, hogy a tripszinogén aktivációs peptidhez hasonló szerkezetű, kis méretű (1 kDa alatti), néhány aminosavból álló, legalább négy, egymást követő aszparaginsavat tartalmazó peptideknek antibakteriális hatása van. Ide tartoznak 21
a tüdőben található SAAP-ok (Surfactant-Associated Anionic Peptides), valamint egyes prohormonok, proenzimek aktivációs peptidjei, beleértve a tripszinogén aktivációs peptideket is. Marha tripszinogén aktivációs peptidet összehasonlítva SAAP–pal azt tapasztalták, hogy közel azonos koncentrációban akadályozták meg a baktériumok szaporodását. Pasteurella haemolytica esetén tized mM, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginose, Staphyloccus aureus esetén közel 1 mM volt az a peptidkoncentráció, ami megakadályozta a baktériumok növekedését (73). A vékonybél lumenjének tripszin (tripszinogén aktivációs peptid) koncentrációja kb. 40 μM, ami a teljes gátláshoz nem elég. A vékonybél epiteliális sejtjeinek mikrokörnyezetében, a mucózus rétegben a defenzinekkel együtt feltehetően hatásos lehet. Kationos tripszinogén Arg122 szerepe A kationos tripszinogén 122-es pozícióban lévő arginin a fehérje felszínén található, a tripszin számára könnyen elérhető. Emiatt azt hitték, hogy az Arg122 melletti peptidkötés hasítása a tripszin(ogén) degradáció első lépése. Az R122H mutáció ezt az autolitikus helyet megszűntetve egy stabil, az autolízisnek ellenálló tripszint, „szupertripszint” hozna létre. Ez a mutáció tehát elősegítené pathológiás körülmények között a magas tripszinszint létrejöttét (41). A humán tripszinogénnek hat néma és három expreszálódó génje van. Ezek négy tripszinogén izoformát eredményeznek, mert a tripszinogén 3 génnek alternatív splicing miatt két formája létezik (74). A tripszin izoformáknak több elnevezésük is ismert (3. táblázat) (75). Jelen munkában a kationos tripszinogén, anionos tripszinogén és mezotripszinogén
elnevezést
használom.
Eredetileg
a
tripszin
izoformáit
elektroforetikus mozgékonyságuk alapján különböztették meg, innen ered a kationos tripszinogén, anionos tripszinogén és mezotripszinogén elnevezés (3. ábra).
22
3. ábra Humán tripszinogén izoenzimek gélelektroforetikus képe
100 ul 2 μM Tg liofilizálás után 12 %-os natív gélen futtatva (0,1 M Tris/HCl pH=8,5), Coomassie blueval festve
23
Gén
cDNS
Protein elnevezése
Molekulatömeg IP Da
T1 (pszeudogén) T2 (reliktum gén) T3 (pszeudogén) T4 (PRSS1)
TRY I
Kationos tripszinogén 23438
6,2
(jelen munkában) Tripszinogén 1 TAT 1 Tripszinogén 3 T5 (pszeudogén) T6 (nincs produktum) T7 (pszeudogén) T8 (PRSS2)
TRY II Anionos tripszinogén
25006
4,9
24348
5,7
24218
7,6
(jelen munkában) Tripszinogén 2 TAT 2 Tripszinogén 1 T9 (PRSS3)
TRY III Mezotripszinogén (jelen munkában) Tripszinogén 3 TRY IV Agyi tripszinogén Tripszinogén 4
3. táblázat Tripszinogén gének és izoformák jellemzői
A kilenc tripszinogén gén közül nyolc a VII kromoszómában, a 7q35 kromoszóma régióban lokalizálódik, míg egy, a PRSS3 gén (mezotripszinogén) a IX 24
kromoszómán,
a
9p13
kromoszóma
régióban
található.
Az
expresszálódó
tripszinogéneknek 5 exonja van. A humán tripszinogénekben jellemzően kevesebb diszulfid híd található, mint az analóg emlős tripszinogénekben. A kationos tripszinogénben és mezotripszinogénben öt, az anionos tripszinogénben négy diszulfid híd található (76 , 77).
2.3.2. Pancreatikus tripszinogén A tripszinogének legnagyobb mennyiségben a pancreasban termelődnek pretripszinogén formában. A pancreatikus tripszinogéneket a pancreas acinus sejtjei termelik a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon. A szignálpeptid lehasítása után a tripszinogén a Golgi komplexbe transzportálódik, koncentrálódik, a szekretorikus vezikulumokban tárolódik, és a pancreatikus vezetéken keresztül ürül hormonális és neurális stimulusokra. A doudenumban az enteropeptidáz aktiválja a tripszinogént, majd az aktív tripszin itt aktiválja a többi emésztőenzimet (4. ábra). A tripszinogén a hasnyál fehérjemennyiségének kb. 20 %-a (78). Elsősorban két izoforma expresszálódik, a kationos tripszinogén és az anionos tripszinogén. Fiziológiás esetben a tripszinogén 60-65 %-a kationos tripszinogén, 30-35 % anionos tripszinogén a maradék 3-10 % pedig mezotripszinogén. Pathológiás esetekben (alkoholizmus, pancreatitis) a kationos tripszinogén és az anionos tripszinogén aránya megfordulhat (kationos tripszinogén:anionos tripszinogén=1:2). A tripszinogén összmennyisége nőhet (alkoholistáknál), vagy akár csökkenhet is (pancreatitises betegeknél) (79).
25
enteropeptidáz
Tg prokarboxipeptidáz
PAR2
Tr aktív PAR2
kimotripszinogén
kimotripszin
karboxipeptidáz
prokolipáz
proelasztáz
elasztáz
kolipáz
profoszfolipáz
foszfolipáz
4. ábra Az emésztési kaszkád aktiválása a vékonybélben
1978-ben Rinderknecht és munkatársai fedezték fel, és különítették el hasnyálból és pancreas szövetből a mezotripszinogént (80). Nevét elektroforetikus mobilitása alapján kapta, tudniillik a mezotripszin gélelektroforézis során a már két ismert izoforma közé vándorolt (3. ábra). Felfigyeltek arra a szokatlan tulajdonságára is, hogy a mezotripszin proteáz inhibitorokkal szemben rezisztenciát mutat. A humán mezotripszinhez hasonló inhibitor rezisztens proteáz szerepét az inhibitor emésztésben Broadway 1997-ben rovarokon mutatta ki. 1% szója tripszin inhibitor tartalmú táplálékot etetve rovar lárvákkal az inhibitor rezisztens proteáz mennyiségének és aktivitásának növekedését tapasztalta (81). Az inhibitor rezisztencia az állatvilágban már az evolúció korai szakaszában megjelent. A már említett rovarokon kívül kimutatták a tüskésbőrűekhez tartozó tengeri csillagban is (82), míg kutyában, szarvasmarhában, sertésben, patkányban, egérben, hörcsögben nem sikerült azonosítani (72). Amíg munkacsoportunk nem tisztázta, a mezotripszin szerepe titokzatos volt. Több szerepet is tulajdonítottak neki. Feltételezték, hogy védő funkciója van a pancreasban. Mivel a mezotripszin rezisztens a PSTI-vel szemben, ha a pancreasban megjelenik a tripszinogéneket lebontja és így csökkenti a lehetséges tripszin mennyiséget, redukálva a gyulladásos folyamatokat is (72). Ezt a szerepet a mezotripszin 26
nem tudja betölteni, mert képtelen a fehérjék gyors degradációjára (48). Mások az inhibitor rezisztencia miatt a mezotripszint mint a pancreatitis okát vélték megnevezni, mert rezisztenciája miatt inhibitor mellett is képes az aktivációs kaszkádot elindítani (83). Ez az elmélet is hibás, mert a mezotripszin a degradáció mellett az aktivációra is képtelen (48). Egyesek a mezotripszinre úgy tekintettek, mint funkcióját vesztett evolúciós melléktermékre (84). Munkacsoportunk mutatta be, hogy a mezotripszin képes gyorsan tripszin inibitorokat (PSTI, SBTI) bontani akkor is, ha az inhibitor nagy feleslegben van. A mezotripszin fziológiás szerepe tehát a tápcsatornában lévő tripszin inhibitorok lebontása lehet (48). Ehhez kis mennyiségű mezotripszin is elegendő, és ez magyarázatul szolgál arra is, hogy a mezotripszinogén a pancreatikus tripszinogén mindössze 3-10 %a. Hasnyál ürítés szabályozása Emberben a hasnyálürítés idegi és hormonális szabályozás alatt áll. A pancreasnedv szekréció szempontjából a kolecisztokinin a legfontosabb hormon. A kolecisztokinin a pancreas acinussejtek enzimszekrécióját fokozza, valamint szekretin jelenlétében a pancreas kivezetősejtek elektrolitszekrécióját is növeli. Ezen kívül a kolecisztokinin hatásai közé tartozik, hogy az epehólyagot összehúzza, a gyomor ürülését lassítja, a bélperisztaltikát fokozza, ellazítja az Oddi sphinctert, gátolja a táplálékfelvételt. A patkánynak két PSTI analóg fehérjéje van. Az egyik, a „monitor peptid” kolecisztokinin releasing peptidként hat. A monitor peptid a pancreas nedv szekrécióját fokozta, míg a bélbe juttatott hasnyál csökkentette azt. A PSTI szekvenciák hasonlósága miatt felmerült az ötlet, hogy emberben a PSTI hasonló szereppel is bírhat, mint a patkány monitor peptidje. Betegeknél ha a képződő hasnyálat a testen kívülre vezették, a hasnyálszekréció nőtt. A bélbe juttatott tripszin vagy hasnyál a szekréciót viszont csökkentette. A vékonybélbe juttatott PSTI viszont nem befolyásolta a szekréciót (30).
27
2.3.3. Extrapancreatikus tripszin A tripszinogén legnagyobb mennyiségben a pancreasban termelődik, ahol három izoformája (kationos tripszinogén, anionos tripszinogén és mezotripszinogén) található meg. A pancreason kívül a kationos tripszinogént Paneth sejtekben, vékonybélben, gyomorfalban mutatták ki. Tripszinogén mRNS-t azonosítottak bőrben, nyelőcsőben, gyomorban, vékonybélben, tüdőben, vesében, májban, epevezetékben, idegszövetben, makrofágokban, monocytákban, lymfocytákban is. A szérum tripszinkoncentrációja egészséges emberekben 15-26 μg/l. Az anionos tripszinogén jellemzően előfordul egyes carcinómákban is. Ezért tumor associated trypsinogen-nek (TAT) is nevezik. Ovárium-, gyomor-, colorectalis-, pancreas-, vastagbél- és tüdőcarcinomában mutatták ki (85, 86, 87) A hím genitáliákban (testis, ondóhólyag, ondóvezeték, húgycső) is kimutatták mind a kationos tripszinogént mind az anionos tripszinogént, a humán ondóban a koncentrációjuk meglehetősen magas, 0,4 (kationos tripszinogén) és 0,5 (anionos tripszinogén) mM volt (88), ami összemérhető a pancreasban található mM koncentrációval. Szerepük még tisztázásra vár. Az extrapancreatikus tripszinogének közül a legkarakterisztikusabb az agyban, idegszövetben termelődő tripszinogén, amit jellegzetes előfordulási helyéről agyi tripszinogénnek is neveznek. Az agyi izoforma az agyi idegszövetre jellemző. Az agyi tripszin kristályos szerkezetét magyar kutatócsoport közölte (67). Az agyi tripszinogén a mezotripszinogén alternatív splicingjának terméke. Proteáz aktivált receptorok A sejthártyában található, a szignált G fehérjék által közvetített receptorok csoportjába tartoznak a proteáz aktivált receptorok (PAR). A PAR családot négy típusra lehet osztani (PAR1, PAR2, PAR3 és PAR4). Ezek közül tripszinnel a PAR2 és PAR4 aktiválható. A PAR-ok főbb jellemzőit a 4. táblázat foglalja össze. 28
PAR1 Lokalizáció
PAR2
PAR3
Agy, tüdő, szív, Prosztata, vastagbél,
vese, Szív,
vese, vékonybél,
testis
vastagbél,
PAR4 vese, Tüdő, pancreas,
pancreas,
pajzsmirigy,
máj, thymus,
vékonybél,
pancreas, trachea vékonybél,
placenta,
nyirokrendszer,
vázizom,
gyomor, trachea
mellékvese,
testis,
prosztata, vastagbél Potenciális
Trombin,
Tripszin, triptáz, Trombin
endogén
tripszin, granzim faktor
aktivátor
Trombin,
Xa,
tripszin,
prokonvertin,
katepszin G
MT-SP1 Potenciális
Katepszin
G, elasztáz,
endogén
elasztáz,
plazmin,
inaktivátor
plazmin,
proteináz3
Katepszin
G,
elasztáz
proteináz3 szerepe
Sejtosztódás,
Bél
kontrakció, Lassú
vérlemezke
motilitás
hatású Vérlemezke
trombin receptor aggregáció
aggregáció, Ca2+ csökentése, Ca2+ szint emelkedés Gyomor,
szint emelkedés,
bél pancreas
kontrakció,
szekréció,
relaxáció
szekréció,
nedv Cl-
leukocita migráció 4. táblázat PAR-ok jellemzése (89,90, 91,92) A PAR2 kimutatható a pancreasban is. Marha pancreassal végzett kísérlet azt mutatta, hogy 3 μM tripszinnel végzett aktiváció 2,8 μmol/óra/cm2-ről 0,4 29
méh,
μmol/óra/cm2-re csökkentette a pancreas ductus bikarbonát szekrécióját. A pancreasban megjelenő szabad tripszin emiatt szerepet játszhat a pancreatitisben megfigyelhető csökkent bikarbonát ürítésben is (93). A PAR2 gátlása így potenciális lehetőséget nyújt a pancreatitises betegek bikarbonát szekréciójának normalizálására. A képet árnyalja az a tény, hogy PAR2 knock out egerekben súlyosabb cörulein indukált akut pancreatitist lehetett generálni, mint vad típusú egerekben. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a PAR2-nek védő szerepe lehet a pancreatitis ellen (94). A PAR2 aktiválása serkenti a pancreas tumorsejtek osztódását, valamint a ciklooxigenáz 2 expresszióját is. A PAR2 szignál transzdukció gátlásával új stratégiai út nyílt meg a pancreas tumorok növekedésének visszaszorítására és a gyulladás enyhítésére (95).
2.4. PSTI A PSTI (SPINK1, serine protease inhibitor Kazal type1) tripszininhibitor, legismertebb szerepe az, hogy a pancreast védje a nemkívánatos tripszinaktivitástól. A PSTI génje az V. kromoszómán található, 7,5 kbp nagyságú, 4 exont tartalmaz. A PSTI 79 aminosavból álló fehérje, ami 23 aminosavból álló szignálpeptidet tartalmaz. Az érett fehérje 56 aminosavból áll, mérete 6500 Da. A méretéhez képest sok, 3 diszulfidkötést hordoz. Ez rideg fehérjeszerkezetet eredményez. A PSTI reaktív helye, ami interakcióba lép a szerinproteázokkal a Lys18. A
PSTI
cDNS-t
már
1985-ben
izolálták
és
meghatározták
a
nukleotidszekvenciáját (96). A PSTI a vékonybélben degradálódik, inhibitor hatását már nem fejti ki. Emiatt időleges tripszininhibitornak nevezte el a jelenséget leíró Laskowski (97). A PSTI lebontása két úton történik:
a, kationos tripszin és anionos tripszin akkor képes bontani, ha feleslegben van a PSTIhez képest. Az aktív tripszin ekkor a komplexben található PSTI-t hasítja: Tr + PSTI = TrPSTI TrPSTI + Tr = 2 Tr + degradált PSTI 30
Ha a PSTI feleslegben van a tripszinhez képest, a degradáció nagyon lassú, hetekig nem történik változás. A pancreasban spontán keletkező tripszinaktivitást tehát a PSTI eliminálja. A vékonybélben a tripszinogént elsősorban az enteropeptidáz aktiválja, és az enteropeptidázra nem hat a PSTI. A keletkező tripszin, mivel a PSTI a tripszinogén kb. 20 %-a, feleslegben lesz az inhibitorhoz képest, a lebontása tehát akadálymentesen végbemehet.
b, A mezotripszin nem kötődik a PSTI-hez, degradációját az inhibitor feleslegében is elvégzi. mezotripszin + PSTI = mezotripszin + degradált PSTI A vékonybélben is végbemehet a reakció, de mivel a mezotripszin az összes tripszinnek csak 3-10 %-a, a vékonybélben történő mezotripszin általi PSTI emésztés nem lehet jelentős. Pathológiás körülmények között, pl. pancreasban a katepszin B általi mezotripszin aktiváció azt eredményezi, hogy a tripszin izoenzimek közül csak a mezotripszin aktív, a másik kettőt a PSTI inaktív állapotban tartja. A mezotripszin ebben az esetben elbonthatja a PSTI-t és így elősegítheti a tripszin autoaktivációját. A PSTI koncentrációja szérumban 3-16 μg/liter. Ez a koncentráció nem változik pancreas eltávolítása után sem, tehát a PSTI nem kizárólagosan pancreas eredetű. Megtalálták a PSTI-t ováriumban, gyomorban, vastagbélben, epehólyagban, vesében, tüdőben, emlőben is. A második trimeszterben az amnionfolyadékban a koncentrációját 160 μg/liternek mérték. Ez az anyai szérumban található koncentráció 20-szorosa volt. A terhesség előrehaladtával az arány kb. 5-szörösre csökkent (98). Feltételezik, hogy emésztőtraktusban a PSTI a mucosat védi a tripszintől.
31
PSTI-t kimutatták tumorokban is, ezért TATI-nak (Tumor Associated Trypsin Inhibitor) is nevezik. Ovárium-, cervikális-, endometrium-, pancreas-, tüdő-, máj- és emlőtumorokban figyelték meg a jelenlétét. Ovárium tumoroknál ciszta folyadékban benignus esetekben átlagosan 2700 μg/liter, míg malignus esetekben 6600 μg/liter koncentrációt mértek. Mivel a PSTI az epidermális növekedési faktorhoz (EGF) hasonló (méret, aminosavszekvencia, 3 diszulfid híd), feltételezik, hogy esetleg az EGF receptorokhoz kötődve a sejtek osztódását segíti elő (29, 99).
32
3. Célkitűzések 1. Rekombináns tripszinogének jellemzése Munkánk egyik célja a natív humán tripszinogén izoformák (anionos-, kationos tripszinogén, mezotripszinogén), valamint a herediter krónikus pancreatitisszel kapcsolatban leírt tripszinogén mutánsok biokémiai jellemzése az acinus sejtekre, a duodenumra és a lizoszómákra jellemző pH értékek és Ca2+ koncentrációk mellett. Vizsgálni kívántuk ezen körülmények között a tripszinogének autoaktivációjának, katepszin B-vel történő aktiválásának és autodegradációjának kinetikáját. Az eredményekből választ vártunk arra a kérdésre, hogy milyen biokémiai folyamatok lehetnek felelősek a krónikus pancreatitis kialakulásáért.
2. Az anionos tripszinogén szerepe a krónikus pancreatitisben Megfigyelték, hogy krónikus pancreatitisben megváltozik a kationos tripszinogén és az anionos tripszinogén mennyiségének aránya. Normálisan ez az arány 2/1, krónikus pancreatitisben ez megfordul és 1/2 arányt is elérhet. Feltételezve, hogy ennek a pathomechanizmusban vagy a betegséghez történő alkalmazkodásban lehet szerepe, vizsgálatainkban fiziológiás (kationos tripszinogén: anionos tripszinogén=2:1) és pathológiás (kationos tripszinogén: anionos tripszinogén=1:2) összetételű tripszinogén keverékek biokémiai viselkedéseit is jellemezni kívántuk.
3. Herediter pancreatitissel összefüggő tripszinogén aktivációs peptid mutációinak vizsgálata A kationos tripszinogén eddig ismert tripszinogén aktivációs peptid mutációi (A16V, D22G, K23R) mellett munkatársaink egy új mutációt, a kationos tripszinogén D19A mutációját azonosították. Mivel ezen mutációkat krónikus pancreatitisszel kapcsolatban írták le, vizsgálatainkat kiterjeszteni kívántuk ezek biokémiai jellemzésére is. E célra 3 mutációt választottunk ki (D19A, D22G, K23R). E három mutáció azért 33
volt számunkra különösen érdekes, mert a tripszin aminosav szekvenciáját nem érintik, ezért a tripszin eredeti tulajdonságait nem befolyásolják, várhatóan e mutációk a tripszinogén → tripszin átalakulás és az autokatalizáció herediter pancreatitisszel kapcsolatos jelentőségének vizsgálatára különösen alkalmasak.
4.
Az
Arg122
helyen
hasított
kationos
tripszinogén
inhibitor
tulajdonságának biokémiai jellemzése A kationos tripszinogén Arg122 helye feltételezett autolitikus hasítási pont, ennek R122H mutációjával a kationos tripszin autodegradációjának sebessége csökken. Eredeti célunk annak tanulmányozása volt, hogy az Arg122-Val123 kötés hidrolízisének milyen hatása van az autolízisre. Az Arg122-Val123 kötés hidrolízisével a peptidláncot diszulfidkötés tartja egyben, ennek alapján a hasított, kétszálú forma (Tg1*) elkülöníthető az intakt formától és vizsgálható. A Tg1* formáról vizsgálataink során kiderült, hogy a többi vizsgált tripszinogénnel szemben inhibitor tulajdonsággal rendelkezik. Ezért célul tűztük ki ezen forma tripszin inhibitor tulajdonságának biokémiai jellemzését.
34
4. Módszerek Mutagenezis A tripszinogén mutánsokat pTrap T7 expressziós plazmidban készítettük el. Egy szintetikus oligonukleotid linker kódolta a mutációt, amit NcoI és EcoRI helyeken ligáltunk. A K15Q/R117H mutációt EcoRI-SacI klónozásával készítettük pTrap-T7/R117H plazmidból pTrap-T7/K15Q plazmidba. Munkám során a transzfektált Escherichia coli törzseket készen kaptam (SahinTóth M), a munkafolyamatokat az expressziótól végeztem. Tripszinogén expressziója és tisztítása A tripszinogén expresszióját Rosetta (DE3) sejtek 800 ml-es tenyészetében végeztük Luria-Bertani médiumban 50 μg/ml carbenicillin és 34 μg/ml klóramfenikol mellett. A sejteket OD600 0,5-ig növesztettük, ekkor az indukciót 1 mM izopropil-1-tioβ-D-galaktopiranoziddal végeztük, és további 5 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, majd 60 cm3 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0), 5 mM EDTA oldatban reszuszpendáltuk és French press-szen nyomtuk át 25000 psi-n. Kis térfogatú (25 ml) sejttenyészetből származó lecentrifugált sejtekből ultrahangos feltárással (jégen 30 másodperc 2/3-os teljesítménnyel) is nyertünk zárványtesteket. A tripszinogént tartalmazó zárványtesteket centrifugálással gyűjtöttük és kétszer mostuk 25 cm3 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) 5 mM EDTA oldattal. A zárványtestek oldatba vitelét és a tripszinogén refoldingját 0,9 M guanidin, 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0), 1 mM cisztein, 1 mM cisztin oldattal végeztük argon atmoszférában 15 percig szobahőn, majd 4 oC-on egy éjszakán keresztül. Az oldatot kétszeres térfogatra hígítottuk 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0)-dal, majd a tripszinogént ecotin affinitás kromatográfiával tisztítottuk meg 50 mM HCl eluáló oldattal. A zimogén koncentrációját 280 nm-es abszorbancia alapján határoztuk meg kationos tripszinogén 36160 M-1cm-1 anionos tripszinogén 37320 M1
cm-1 moláris extinkciós koefficienssel számolva. 35
A kationos tripszinogén és Tg1* izolálása A vad típusú kationos tripszinogént 1 mM EDTA jelenlétében 37 oC-on autoaktiváltuk 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0)-ben 2 órán keresztül. A K15Q kationos tripszinogén mutánst K15Q:wt=250:1 arányban vad típusú tripszinnel hasítottuk 37 oCon 20 percig 1 mM EDTA, 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0)-ben. Inkubálás után azonnal Mono Q 5/5 oszlopra vittük a mintát, ekvilibráltuk 20 mM Tris/HCl (pH=8,8)–dal. A kationos tripszinogént és Tg1*-t 0-0,5 M NaCl líneáris grádiens oldattal eluáltuk és szeparáltuk. Adott körülmények között a tripszin nem kötődik az oszlophoz, így az átesőben jelent meg. A tripszinogén autoaktivációja A tripszinogének autoaktivációját, katepszin B-vel történő aktivációját, autolízisét a pancreasra jellemző modellkörnyezetekben végeztük el. Ezek a következők voltak: a, acinus sejtek
pH=8,0 (Tris/HCl puffer) és alacsony Ca2+ szint vagy Ca2+ hiány
b, duodenum
pH=8,0 és milimólos Ca2+ koncentráció
c, lizoszómák
pH=5,0 (Na-acetát puffer)
A tripszinogént 2 μM koncentrációban, 37 oC-on inkubáltuk 0,1 M Tris/HCl-ban (pH=8,0) vagy 0,1 M Na-acetátban (pH=5,0) a jelzett CaCl2 vagy EDTA koncentrációknál. Meghatározott időnként 2,5 μl mintát vettünk tripszin aktivitás méréshez. A tripszin aktivitást 200 μM mesterséges kromogén szubsztrát (glicil-prolilarginil-p-nitro-anilid, GPR-pNA) jelenlétében végeztük 22 oC-on 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0), 1 mM CaCl2-ban. A kromofór (p-nitroanilid) felszabadulás kinetikáját 405 nm-en követtük.
36
Gélelektroforézis és denzitometrikus analízis A mintákat Eppendorf csövekben 10 %-os végkoncentrációjú triklórecetsavval precipitáltuk, jégen tartottuk 10 percig, centrifugáltuk (14000 rpm, 10 perc), majd a csapadékot 20 μl Laemmli mintapufferben 1 μl 2 M NaOH-ban, 2 ul 1 M ditiotreitolban oldottuk, 90 oC-on 5 percig denaturáltuk. Az elektroforézist 12 %-os SDS PAGE gélen végeztük. A géleket Coomassie Brilliant Blue R-rel festettük 30 percig, majd éjszakán át 30 % metanol, 10 % ecetsavban mostuk. A géleket két réteg celofán között szárítottuk (Gel-Dry kittel). A száraz géleket 600 dpi felbontással szürkeskálában szkenneltük. A csíkok kvantifikációját ImageQuaNT 5.2 szoftverrel végeztük el. A natív gélelektroforézishez 100 μl 2 μM tripszinogént tartalmazó elegyet liofolizáltunk, SDS-t és ditiotreitolt nem tartalmazó 20 μl Laemmli mintapufferben oldottuk, forralás nélkül felvittük a gélre és elektroforetizáltuk. Számozás Jelen dolgozatban a tripszinogén számozását követem.
37
5. Eredmények 5.1.
A
kationos-,
anionos-
és
mezotripszinogén
vizsgálata 5.1.1. Az anionos tripszinogén jellemzése Az anionos tripszinogén expresziója Az anionos humán tripszinogént nekünk sikerült először rekombináns módszerrel előállítani. Az expressziót és tisztítást a Módszerekben leírtaknak megfelelően végeztük el. Az ecotin oszlopról egy egyszerű csúcsot eluáltunk, ami azt mutatta, hogy homogén tripszinogént kaptunk. A homogenitást ellenőriztük anioncserélő oszlopon (MonoQ), illetve molekulaszűrőn (Superose 6) is, amiken szintén egynemű csúcsot kaptunk. A tisztított anionos tripszinogént ellenőriztük SDS/PAGE gélen is, ahol az anionos tripszinogén molekulatömegének megfelelő homogén csíkot kaptunk. Az anionos tripszin (KM=11±1 μM, Kcat=41±1 1sec-1) és kationos tripszin (KM=15±1 μM, Kcat=50±1 1sec-1) katalitikus jellemzői hasonlóak a szintetikus kromogén GPR-pNA szubtráttal mérve. A rekombináns tripszinekkel összehasonlítható sebességgel hasítják a kis tömegű szubsztrátokat a natív tripszinek is (100,101). Végezetül, a moláris extinkciós koefficiens alapján számolt anionos tripszinogén mennyiség 1:1 sztöchiometrikus arányban gátolható PSTI-vel. Az anionos tripszinogén autoaktivációja Az anionos tripszinogén autoaktivációját pH=8,0-on mind fiziológiás (0-1 mM) mind farmakológiás (20 mM-ig) Ca2+ mellett mértük 2 μM tripszinogén koncentrációnál. 0-0,1 mM Ca2+ koncentrációknál nincs mérhető anionos tripszin aktivitás (14. ábra). 0,1 mM Ca2+ koncentráció felett a tripszinaktivitás már mérhető. Maximális tripszinaktivitást 20 mM Ca2+ mellett mértünk. Az autoaktiválás sebessége 5 mM Ca 2+ koncentrációig nő, felette csökken, de magasabb tripszinszint érhető el. Az 38
autoaktiválást SDS/PAGE gélelektroforézissel is követtük (5. C ábra). 50 μM Ca2+ koncentrációnál egy halvány tripszincsík látható, a tripszinogén pedig 30 perc alatt gyakorlatilag teljesen degradálódott, halványan kis molekulatömegű degradációs termékek jelennek meg. Tehát a tripszinaktivitás hiánya nem a lassú autoaktivációval, hanem a gyors degradációval magyarázható. 5 mM Ca2+ mellett a tripszinogén jelentős része tripszinné alakul át 15 percen belül, a tripszin autolízise lassú. Degradációs termékek itt is megjelennek, de nem azonosak az 50 μM Ca2+ koncentrációnál megfigyelhetőnél. Megjelenik egy 28 kDa-os csík, és minden termék kifejezettebb, mint alacsony Ca2+ koncentráció mellett. Ez arra utal, hogy a degradáció sebessége magasabb Ca2+ koncentrációnál csökken, és alacsony Ca2+ koncentráció mellett a gélen már nem látható kis molekulatömegű degradációs termékek keletkezése dominál.
39
5. ábra Az anionos tripszinogén autoaktivációja
2 μM anionos tripszinogén 100 μl végtérfogatban 37 oC-on inkubálva A és B panel aktivitásmérés 2,5 μl minta 140 μM GPR-pNA 100 %-os aktivitást enterokinázzal aktivált tripszinogén, 22 oC, pH=8,0, Ca2+=10 mM C panel 100 ml mintát 10 %-os TCA-val precipitáltunk, 12 %-os SDS/PAGE gélen futtatunk redukáló körülmények között, a gélt Coomassie Blue-val festettük
Az
anionos
tripszinogén
autoaktivációját
kationos
tripszinogén
autoaktivációjával összehasonlítva több különbséget is észrevehetünk. Kationos tripszinogén vizsgálatánál már 10 μM Ca2+ mellett is szignifikánsan megemelkedik a tripszin keletkezés sebessége (6. A ábra). Az autoaktiváció sebessége 1 mM Ca2+ koncentrációig folyamatosan emelkedik, majd e felett a sebesség csökken. A Ca2+ dependens autoaktiválás sebességének analízisét végezve (6. C ábra) megállapíthatjuk, 40
hogy az autoaktiválás Ca2+ koncentrációtól való függése bifázisos. A görbe első része tipikus telítési görbe, melynek féltelítési értéke 15 μM Ca2+ koncentrációnál található. A görbe második része líneáris emelkedést mutat. Eszerint a tripszin két Ca2+ kötő hellyel rendelkezik, egy nagy és egy kis affinitásúval. A nagy affinitású kötőhely félmaximális aktivitást eredményező Ca2+ koncentrációja (15 μM) gyakorlatilag megegyezik azzal a 20 μM Ca2+ koncentrációval, ami félmaximálisan stabilizálja a kationos tripszint autolízis ellen. A Ca2+ a kationos tripszint a Glu80 és Glu90 között található nagy affinitású kötőhelyre való bekötődéssel stabilizálja. A kis affinitású kötőhely Ca2+ kötése 0,1-1 mM között a kationos tripszin autoaktiválás sebességének emelkedését okozza. A félmaximális sebességnövekedéshez tartozó Ca2+ koncentrációt a CaCl2 inhibitor sajátsága miatt nem lehetett megmérni. A gátló hatásért valószínűleg a magas ionerősség a felelős.
41
6. ábra Kationos tripszinogén autoaktivációja Az A és B panelben a kísérleti körülmények megegyeznek az 1. ábrában leírtakéval A C panel 1 egységnyi aktivitása a 0 mM Ca2+ koncentrációnál mért autoaktiváció sebessége
A kationos tripszinogén autoaktivációjának nyomonkövetése gélelektroforézissel már az értekezésen kívül eső munkában is megtörtént (102). A kationos tripszinogén autoaktivációja során a kationos tripszinogén 0,5-5 mM Ca2+ koncentrációnál teljesen átalakul tripszinné. Itt emlékeztetni kell arra a tényre, hogy a kationos tripszin egy és két láncú formája egyensúlyban van egymással, így az aktív kationos tripszin megjelenik kis molekulatömegű, 15 kDa-os csíkokban is.
42
A maximális tripszinszint elérése után nem csökken azonnal a tripszinaktivitás, ami arra utal, hogy a kationos tripszin az anionos tripszinnel összehasonlítva rezisztensebb az autolízisre (lsd. lejjebb). 100 mM NaCl gátolja a kationos tripszinogén autoaktivációját és autolízisét, és úgy tűnik, hogy a magas CaCl2 koncentráció is a magas ionerőség miatt gátolja az enzimaktivitást. Humán tripszinogének degradációja pH=8,0-nál Már az autoaktivációs kísérleteknél is feltűnő, hogy az anionos tripszinogén autoaktivációjánál
markáns
degradációt
lehet
megfigyelni.
A
tripszinogének
degradációjának pontos megfigyelése érdekében mindkét tripszinogénnek (kationos tripszinogén, anionos tripszinogén) előállítottuk az aktív tripszinné át nem alakítható inaktív K23Q formáját, majd a degradációs kísérleteket az autoaktivációra rezisztens tripszinogénekkel végeztük. Az K23Q anionos tripszinogén 5 μM koncentrációban használtuk mint szubsztrátot, emellett 0,5 μM kationos tripszin volt mint enzim. Azért kationos tripszint használtunk enzimként, mert a kísérleti körülmények között és ideje alatt nem változott meg lényegesen az autolízis miatt a koncentrációja. A 7. A ábrán látható, hogy Ca2+ mentes közegben (1 mM EDTA) a kationos tripszin gyorsan degradálja a K23Q anionos tripszinogént. A denzitometriás kiértékelés (7. C ábra) azt mutatta, hogy a féléletidő (t½) 2,25 perc volt. 50 μM Ca2+ négyszeres stabilizációt eredményezett, a féléletidő 10 percre tolódott ki (7. B és C ábra). Hasonló stratégiát alkalmazva a kationos tripszinogén lebontását vizsgálva (5 μM K23Q kationos tripszinogén, 0,5 μM kationos tripszin) a t½ 45 perc volt pH=8,0-nál, Ca2+ mentes közegben. Ez azt jelenti, hogy a kationos tripszinogén hússzor rezisztensebb az anionos tripszinogénhez képest a tripszinolitikus degradációval szemben.
43
7. ábra K23Q anionos tripszinogén degradációja kationos tripszinnel
Kb. 5 μM anionos tripszinogént 0,5 μM kationos tripszinnel 100 μl térfogatban 37 oC-on emésztettünk 0,1 M Tris/HCl-ben (pH=8,0) 1 mM EDTA-ban (A) vagy 50 μM Ca2+ (B) mellett. A reakciót a jelölt időpontokban 10 % TCA-val állítottuk le és redukáló SDS/PAGE gélen analizáltuk, Coomassie Blue festés mellett. C panel a kísérlet denzitometriás kiértékelése (n=3, SD<15 %)
Humán tripszinogének autoaktivációja pH=5,0-nél Összehasonlítva a pH=8,0-nál bekövetkező gyors autoaktivációval, az anionos tripszinogén pH=5,0-nél jóval lassabban autoaktiválódik. Az autoaktiváció sebessége Ca2+ dependens, 5 mM Ca2+ koncentrációig nő. A maximálisan elérhető tripszinaktivitás az enteropeptidázzal elérhetőének kb. 30 %-a, ami erőteljes tripszinogén degradációra utal. 10 mM Ca2+ a sebességet már nem növelte szignifikánsan. 20 mM Ca2+ az 44
autoaktiválás
sebességét
csökkenti,
de
magasabb
tripszinszintet
eredményez.
SDS/PAGE analízissel megvizsgáltuk, hogy miért nincs tripszin aktivitás Ca2+ hiányában pH=5,0-nél. A jelenség hátterében nem a gyors anionos tripszinogén degradáció áll, mint az pH=8,0-nál megfigyelhető, hanem az, hogy savas közegben nincs zimogén aktiváció. 5 mM Ca2+ jelenlétében idődependens módon jelenik meg az anionos tripszin csík a gélen, 120 percnél már masszív tripszincsík látszik, a tripszinné át nem alakult anionos tripszinogén pedig lebomlik (8. ábra).
8. ábra Az anionos tripszinogén autoaktivációja pH=5,0-nél
Kb. 2 μM anionos tripszinogétn inkubáltunk 0,1 M Na-acetát pufferben (pH=5,0) (37 oC, 100 μl) a jelölt Ca2+ koncentrációknál (A). Az enzimaktivitás mérése hasonló körülmények között történt, mint az 1. ábránál (A). B panel 100 μl (2 μM anionos tripszinogén) mintát 10 % TCA-val precipitáltuk, redukáló SDS/PAGE gélen elektroforezitáltuk és Coomassie Blue-val festettük.
Ca2+ mentes közegben a kationos tripszinogén pH=5,0-nél gyorsabban aktiválódik (9. A ábra) mint pH=8,0-nál. pH=5,0-nél 1 mM Ca2+ koncentrációig enyhe 45
aktiváció sebességemelkedést figyelhetünk meg. 1 mM Ca2+ felett 20 mM Ca2+-ig koncentrációdependens autoaktiválás sebességcsökkenést figyelhetünk meg. Az SDS/PAGE analízist megnézve látható, hogy Ca2+ hiányában az anionos tripszinogén inaktív a vizsgálat 120 perce alatt, míg a kationos tripszinogén teljesen átalakul tripszinné ez idő alatt. Az átalakulás gyakorlatilag kvantitatív, zimogén degradáció nem figyelhető meg, 5 mM Ca2+ csak enyhe autoaktiváció sebesség növelő hatással rendelkezik (9. C ábra).
46
9. ábra A kationos tripszinogén autoaktivációja pH=5,0-nél
2 μM anionos tripszinogént inkubáltunk 0,1 M Na-acetát pufferben (pH=5,0) (37 oC, 100 μl) a jelölt Ca2+ koncentrációknál (A, B). Az enzimaktivitás mérése hasonló körülmények között történt, mint az 14. ábránál (A). C panel 100 μl (2 μM anionos tripszinogén) mintát 10 % TCA-val precipitáltuk, redukáló SDS/PAGE gélen elektroforezitáltuk és Coomassie Blue-val festettük. Az A és B csík magyarázatát lsd. az 5. ábránál.
47
Humán tripszinek degradációja pH=8,0-nál Korábbi kísérletek azt mutatták, hogy a natív humán tisztított anionos tripszin kevésbé stabil és autolízise gyorsabban történik, mint a kationos tripsziné (103,104). A tripszin degradáció vizsgálatához enteropeptidázzal aktiváltunk tripszinogént tripszinné, majd tisztítottuk. Ca2+ hiányában az anionos tripszin gyorsan degradálódott (t½=8 perc). A Ca2+ már alacsony koncentrációban is stabilizálja a tripszint IC50= 5 μM (10. A és C ábra). 100 mM NaCl harmadára csökkenti az autolízis sebességét (t½=24 perc), és növeli a Ca2+ IC50 értékét a hatszorosára (IC50=30 μM) (10. C ábra). A kationos tripszin autolízise szignifikánsan lassúbb, Ca2+ hiányában a t½=90 perc (11. A ábra). A két tripszin izoforma stabilitása között így több mint 11-szeres a különbség. A Ca2+ IC50=20 μM értékkel stabilizálja a kationos tripszint az autolízis ellen (11. A és B ábra). 100 mM NaCl az autolízis sebességét 14-ed részére csökkentette, 50 %-os aktivitáscsökkenés Ca2+ hiányában majdnem 21 óra alatt figyelhető meg. A sóérzékenységben tehát a két tripszin között nagyon jelentős a különbség. Az anionos tripszin aktivitását kevésbé csökkenti a NaCl, nagy sókoncentrációnál az anionos tripszin aktivitása magasabb a kationos tripszin aktivitásánál.
48
10. ábra Az anionos tripszinogén autolízise
A tripszinogént enteropeptidázzal aktiváltuk és ecotin oszlopon tisztítottuk. Kb. 2 μM anionos tripszint 37oC-on inkubáltunk 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) oldatban a jelölt Ca2+ koncentrációknál. A panel anionos tripszin autolízise NaCl nélkül B panel anionos tripszin autolízise 100 mM NaCl jelenlétében C panel Ca2+ hatása az autolízis relatív sebességére 100 mM NaCl jelenlétében (○) és NaCl nélkül (●) Egységnyi az autolízis sebessége Ca2+ nélkül (1 mM EDTA)
49
11. ábra A kationos tripszinogén autolízise
A tripszinogént enteropeptidázzal aktiváltuk és ecotin oszlopon tisztítottuk. Kb. 2 μM anionos tripszint 37oC-on inkubáltunk 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) oldatban a jelölt Ca2+ koncentrációknál. A panel anionos tripszin autolízise NaCl nélkül B panel anionos tripszin autolízise 100 mM NaCl jelenlétében C panel Ca2+ hatása az autolízis relatív sebességére Egységnyi az autolízis sebessége Ca2+ nélkül (1 mM EDTA)
5.1.2. A mezotripszinogén A mezotripszinogén a pancreatikus tripszinogének minor izoformája, a hasnyál tripszinogéntartalmának 3-10 %-a. Laboratóriumunkban sikerült először rekombináns mezotripszinogént előállítani és jellemezni. Dolgozatomban az öröklődő krónikus pancreatitissel szorosan kapcsolódó eredményeinket foglalom össze, ezért most a mezotripszinnel kapcsolatos fontosabb megállapításainkat csak röviden írom le az alábbiakban. A mezotripszinogén szekvenciaanalíziséből (105) és a benzamiddal kristályosított agyi tripszin struktúrájából arra következtettek, hogy az Arg198 okozza a tripszin inhibitor rezisztenciáját (66). Az R198G mezotripszinogén mutáns felhasználásával 50
megállapítottuk, hogy az R198G mezotripszin elveszíti inhibitor rezisztenciáját, gátolható PSTI-vel és BPSTI-vel egyaránt az inhibitor érzékeny tripszinekre jellemző 1:1=inhibitor:tripszin
arányban
és
affinitással.
Az
R198G
mezotripszin
a
mezotripszinnel ellentétben aktiválja a kationos - és anionos tripszinogént, a kimotripszinogént és elasztáz 2-t is. A fehérjékhez való affinitás csökkenése miatt a mezotripszin inhibitor rezisztenciáját tehát ténylegesen az Arg198 okozza. A mezotripszin fiziológiás funkciója ismeretlen volt, ezért munkánk során a mezotripszin lehetséges szerepének tisztázását is célul tűztük ki. Mivel a mezotripszin KM értéke PSTI-hez hasonló, mint a kationos tripszin KM értéke kimotripszinhez, felmerült, hogy a PSTI nem mint inhibitor, hanem mint szubsztrát viszonyul a mezotripszinhez. A mezotripszin a PSTI-t degradálta, a kationos és anionos tripszinnel ellentétben nagy PSTI felesleg esetén is. A mezotripszin hidrolizálja az SBTI aktív helyét is a doudenumra jellemző enyhén lúgos környezetben, 1 mM Ca2+ mellett, tízszeres SBTI feleslegben is. Ez alapján jelentettük ki, hogy a mezotripszin fiziológiás funkciója valószínűleg a táplálékban található tripszin inhibitorok bontása lehet. Nagy inhibitor tartalmú élelmiszerek esetén (pl. szója, tök), a kationos - és anionos tripszint az inhibitor inaktív állapotban tarthatja, így a mezotripszinre gyakorolt degradatív hatásukkal az inhibitor bontásáig nem kell számolni. A mezotripszinogént aktiválja az enteropeptidáz, a kationos tripszin, az anionos tripszin és a katepszin B is. Enteropeptidázzal lehet elérni a legmagasabb mezotripszin szintet, degradáció ebben az esetben nincs. Meglepő, hogy a katepszin B a mezotripszinogént a másik két izoformánál nagyobb sebességgel aktiválja. Ez felveti a lehetőségét annak, hogy a mezotripszin pathogén tényező lehet a pancreatitis kialakulásában (lsd. Megbeszélés) (32).
5.1.3. Kölcsönhatások a kationos tripszinogén és anionos tripszinogén között: fiziológiás és pathológiás összetételű tripszinogének vizsgálata Az 5-11. ábrák a kationos tripszinogén és anionos tripszinogén autoaktiválását és degradációját mutatják be. A két izoenzim közötti különbségek azt sugallják, hogy a különböző tripszinogén összetételű hasnyálak stabilitása, aktivitása, aktivációja a tripszinogének arányától függően változhat. A változások in vitro modellezéséhez 51
különböző összetételű tripszinogének tulajdonságait vizsgáltuk. A kísérletekben két különböző keveréket használtunk. A fiziológiás keverék 2:1 arányban (67%:33%) tartalmazta a kationos tripszinogént és anionos tripszinogént. A pathológiás keverékben pedig a kationos tripszinogén:anionos tripszinogén arány 1:2 (33%:67%) volt. Az autoaktivációs kísérleteket pH=8,0-nál és pH=5,0-nél végeztük. pH=8,0-nál két Ca2+ koncentrációt használtunk. 1 mM Ca2+ koncentrációval a duodenum környezetét modelleztük, míg 50 μM Ca2+ koncentrációval az intracelluláris környezetet imitáltuk. Az acinus sejtek Ca2+ tartalma ennél kisebb, de 50 μM Ca2+ mellett a reakciók sebessége elég nagy ahhoz, hogy az autoaktivációt teljes időtartama alatt nyomon követhessük. A kísérleteket megismételtük Ca2+ hozzáadása nélkül is. pH=5,0 mellett az intracelluláris
vezikulumok
savas
környezetét
modelleztük,
ahol
körülmények között megtörténhet a tripszinogének aktivációja (106,
107
pathológiás ). Az intra-
acináris környezet és a pankreatikus szekrétum magas só és fehérje tartalmát a biokémiai kísérletek általában nem veszik figyelembe. Mivel ezek jelentősen befolyásolják a tripszinogének tulajdonságát, a kísérleteket elvégeztük 100 mM NaClban, illetve 100 mM NaCl, 2 mg/cm3 BSA-ban is. Amint a 12. A ábra mutatja, pH=8,0-on (0,1 M Tris/HCl) 1 mM Ca2+ koncentrációnál a tripszinogének hasonló autoaktivációs sebességgel aktiválódtak, de a végső tripszinszintben kétszeres különbség volt (12. A ábra fehér szimbólumok). Ez a különbség az anionos tripszinogén gyors degradációjának köszönhető. A fiziológiás és pathológiás tripszinogénkeverékek autoaktivációs rátájában szignifikáns különbség nincs, és érdekes, hogy a végső tripszintszintben is csak 20 %-os különbség tapasztalható (12. A ábra, fekete szimbólumok). Ha az aktiválást enteropeptidázzal végezzük el, gyakorlatilag azonos tripszinszintet kapunk eredményül (ábra nem mutatja). 100 mM NaCl a kationos tripszinogén autoaktiválási sebességét jelentősen csökkenti, míg az anionos tripszinogént ez a hatás kevésbé érinti (12. B ábra fehér szimbólumok). A tripszinogén keverékek aktiválási sebessége és a maximális tripszinszintjei 100 mM NaCl mellett azonosak (12. B fekete szimbólumok). 100 mM NaCl és 2 mg/cm3 BSA az autoaktiválás sebességében és a végső tripszinszintben kb. 20 %-os különbséget eredményezett.
52
12. ábra Tripszinogének autoaktivációja pH 8,0-ál 1 mM Ca2+ jelenlétében fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén és anionos tripszinogén arányoknál Tripszinogén összkoncentrációja 2 μM; (□) 2 μM kationos tripszinogén, (○) 2 μM anionos tripszinogén, (■ ) 1,33 μM kationos tripszinogén és 0,66 μM anionos tripszinogén, (● ) kationos tripszinogén 0,66 μM kationos tripszinogén és 1,33 μM anionos tripszinogén Kísérleti körülmények: A panel csak puffer, B panel 100 mM NaCl C panel 100 mM NaCl 2 mg/cm3 BSA
53
Alacsony, 50 μM Ca2+ koncentrációnál (pH=8,0, 0,1 M Tris/HCl) az előző kép gyökeresen megváltozik. Mindhárom vizsgálati körülmény között a tripszinszintek kizárólag a kationos tripszinogén koncentrációtól függnek, az anionos tripszinogén teljesen degradálódik. Ennek megfelelően a fiziológiás és pathológiás keverékekben legalább kétszeres különbség figyelhető meg mind az aktivációs ráták, mind a maximális tripszinszintek között (13. A, B, C ábra).
54
13. ábra Tripszinogének autoaktivációja pH 8,0-ál 50 μM Ca2+ jelenlétében fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén és anionos tripszinogén arányoknál
Kísérleti körülmények a Ca2+ koncentráció kivételével a 12. ábráéval azonosak
Az intralizoszómális környezetet modellező pH=5,0-ös (0,1 M Na-acetát) pufferoldatban hasonló különbségeket lehet megfigyelni mint pH=8,0-nál Ca2+ mentes közegben vagy μM nagyságrendű Ca2+ koncentrációnál. Az autoaktiválás sebessége a kationos tripszinogén koncentrációtól függ. A maximálisan elérhető tripszinszinteket nem lehet pontosan meghatározni jelen körülmények között, de úgy látszik, hogy a fiziológiás keveréknek legkevesebb kétszer akkora az aktivitása mint a pathológiásnak (14. ábra A, B, C).
55
14. ábra Tripszinogének autoaktivációja pH 5,0-nél fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén és anionos tripszinogén arányoknál Kísérleti körülmények a Ca2+ koncentráció kivételével a 12. ábráéval azonosak
Az izoformák különböző migrációs sebessége SDS/PAGE gélen lehetővé teszi a különböző formák vizuális elkülönítését (15. ábra). pH=8,0-nál (0,1 M Tris/HCl) 50 μM Ca2+ mellett 60 perc alatt a tripszinogének közül csak a kationos tripszinogén alakul át tripszinné fiziológiás és pathológiás arányoknál egyaránt (15. ábra A). A kationos tripszinnek mind az egy-, mind a kétszálú formája megfigyelhető. Az aktivitásméréssel egybevetve a magasabb aktivitáshoz intenzívebb festődésű kationos tripszin csík társul. Az anionos tripszinogén gyors eltűnése detektálható tripszinképződés nélkül történik mindkét keverékben. Megállapítható tehát, hogy a pathológiás összetételű tripszinogén keverék pH=8,0-nál és 50 μM Ca2+ mellett (intracelluláris kondíció)
az anionos
tripszinogén szelektív degradációjával alacsonyabb tripszinszintet, a fiziológiás kb. 56
50%-át eredményezi. Magasabb, 1 mM Ca2+ koncentrációnál (doudenális kondíció) a tripszinaktivitás csökkenés nem jelentős. Enyhén savas körülmények között (pH=5,0-nél) a kationos tripszinogén teljesen tripszinné aktiválódik, míg az anionos tripszinogén inaktív, tripszinogén formában marad.
15. ábra Fiziológiás és pathológiás kationos tripszinogén: anionos tripszinogén keverékek autoaktivációja pH=8,0-nál és pH=5,0-nél A kísérleti körülmények megegyeznek a 12. ábra (A panel) és a 14. ábra (B, C panel) körülményeivel A mintákat (100 μl, 2 μM Tg) 10 % TCA-val precipitáltuk és 12 %-os SDS/PAGE gélen analizáltuk, Coomassie Blue-val vizualizáltuk. A C panel a B panel 120 perces mintáinak kinagyított képe, a tripszinogén négy formájának elhelyezkedését demonstrálja (kationos tripszinogén, anionos tripszinogén, kationos tripszin, anionos tripszin) Kationos tripszin Arg122-Val123 peptidkötés vizsgálata
57
5.2. A tripszinogén 1 aktivációs peptidjének mutációi A tripszin aktivációja során egy oktapeptid hasad le a tripszinogénről. A hasítást a vékonybélben a tripszin specifikus aktivátora, az enteropeptidáz végzi, illetve a már aktiválódott tripszin. A tripszin fiziológiás körülmények között inaktív állapotban található a pancreasban, de aktiválódhat ott is. Az idő előtti aktiválódást autoaktiváció vagy a lizoszómális katepszin B okozza. A
kationos
tripszinogén
azonosítottak. Ezek a
aktivációs
peptidjében
idáig
négy
mutációt
A16V, D22G, K23R, a negyedik, D19A mutációt a jelen
értékezés alapjául szolgáló egyik cikkben írtuk le először (108). A négy ismert tripszinogén aktivációs peptid mutáció közül három (D19A, D22G, K23R) biokémiai tulajdonságait vizsgáltuk rekombináns kationos tripszinogén segítségével. Az A16V mutáció a tripszinogén aktivációs peptid első aminosava, közvetlenül a szignál peptidet követi. A mutáció szerepe valószínűleg a pretripszinogén tripszinogénné való átalakulásában vagy a pretripszinogén lokalizációjában keresendő, ennek vizsgálatát a lehetőségeink nem tették lehetővé. A D19A, D23G és K23R mutációknak az autolízisét nem vizsgáltuk, mivel az aktív tripszint ezek a mutációk nem érintették. A kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsainak autoaktiválását, enteropeptidázzal és katepszin B-vel való aktiválását vizsgáltuk. Kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsok autoaktiválása Mind a három kationos tripszinogén mutáns fokozott autoaktiválást mutatott pH=8,0-nál mind Ca2+ hiányában, mind 1 mM Ca2+ mellett, valamint pH=5,0-nél is (16. ábra).
58
16. ábra Tripszinogén aktivációs peptid mutánsok autoaktivációja
kationos tripszinogén = 2 μM , BSA=2 mg/ml, T= 37 oC A panel Tris=0,1M (pH=8,0), Ca2+ nélkül B panel Tris=0,1M (pH=8,0), Ca2+=1 mM C panel Na-acetát=0,1 M (pH=5,0) 100 % tripszinaktivitás pH=8,0 1 mM Ca2+, 100 ng/ml enteropeptidázzal való aktiválás után □ vad típus, ● D19A, ○ D22G, ■ K23R
Az autoaktiválás sebességét jellemző időt, ami a félmaximális aktivitás eléréséhez szükséges, az 5. táblázat mutatja.
59
pH=8,0
t½ (perc)
t½ (perc)
t½ (perc)
t½ (perc)
vad
D19A
D22G
K23R
60
12,5
2,5
3
24
7
3,5
3
70
55
28
7
1 mM EDTA pH=8,0 1 mM Ca
2+
pH=5,0 5. táblázat
Kationos tripszinogén tripszinogén aktivációs peptid mutánsok autoaktivációjának t½ ideje
A kapott eredmények jól magyarázhatók az (Asp)4 és a Lys23 szerepével. A K23R kationos tripszinogén erősen fokozott autoaktivációt okoz. A tripszin arginin mellett legalább 8-szoros sebességgel hasított lizinnel (vad típusú kationos tripszinogén) összehasonlítva (5. táblázat). Ezt az arginin és a szubsztrátkötő helyben lévő Asp194 közötti erős ionkötés biztosítja. A P1 helyen lévő arginin guanidincsoportja tökéletesen illeszkedik az Asp194-hez. Az a megfigyelés (16. ábra A, B panel), hogy a Ca2+ az (Asp)4 töltéseinak árnyékolásával nem módosította lényegesen az autoaktivációt, azt mutatja, hogy az (Asp)4 gátló hatását arginin mellett nem képes kifejteni. Ezt támasztja alá az is, hogy az (Asp)4-Lys motívum halaktól emlősökig konzervatív, (Asp)4-Arg nem fordul elő. Egyes esetekben, (rovarok, hideg adaptált halak tripszinogénje, illetve baktériumok és gombák tripszinogénszerű enzimjei) ahol a tripszinogén aktivációs peptid P1 pozíciójában arginin van, a P2 helyen aszpartát helyett más aminosav, általában glicin található. Az (Asp)4-ben lévő két mutáció (D19A, D22G) szintén az autoaktiválás sebességének növekedését okozta. A D22G kisebb t½-t eredményezett mint a D19A, tehát az autoaktiválást az Asp22 eredményesebben gátolja mint az ASp19.
60
Kationos
tripszinogén
tripszinogén
aktivációs
peptid
mutánsok
aktiválása
enteropeptidázzal Az enteropeptidáz lizin vagy arginin mellett hasít, és fontos, hogy a P2 és P3 helyen két savas tulajdonságú aminosav legyen. A P4 helyen lévő savas karakterű aminosav is növeli az enteropeptidáz affinitását, de megléte nem esszenciális (109). Az enteropeptidáz Lys99 ionkötést alakít ki a tripszinogén P2 és P4 helyén lévő aszpartáttal, míg az enteropeptidáz Tyr174 hidrogénkötést létesít az Asp-P3-mal (110). Az (Asp)4 formátumban így 3 aszpartát látszik fontosnak az enteropeptidáz általi aktiválásban. A 17. ábra a tripszinogén aktivációs peptid mutációk hatását mutatja az enteropeptidáz általi kationos tripszinogén aktivációjára.
17. ábra Tripszinogén aktivációs peptid mutánsok aktivációja enteropeptidázzal
kationos tripszinogén =100 nM, 0,1 M Tris (pH=8,0), 1 mM Ca2+, 2 mg/ml BSA T=25 oC Aktiválási reakciót p-nitroanilid felszabadulás folyamatos mérésével (405 nm) követtük □ vad típus, ● D19A, ○ D22G, ■ K23R
A kationos tripszinogén koncentráció a kísérletekben rutinszerűen használt 2 μM helyett 100 nM volt, amiatt, hogy az autoaktiválásból származó tripszingenerációt a minimálisra csökkentsük. A D22G mutáció az enteropeptidáz általi tripszin aktivációt 61
gyakorlatilag meggátolta. A K23R mutáció fokozott aktivációt eredményezett, ami egyrészt annak köszönhető, hogy az enteropeptidáznak nagyobb az affinitása az argininhez mint a lizinhez, másrészt szerepe van a K23R megnövekedett autoaktivációs sebességének is. A D19A az enteropeptidáz aktiválás sebességét szignifikánsan nem befolyásolta. Ezek az eredmények összhangban vannak azokkal az adatokkal, amelyek az enteropeptidáz specificitását írták le. Eredményeink azt mutatják, hogy a tripszinogén aktivációs peptid (Asp)4-Lys szerkezet mutációi fokozott autoaktiváláshoz vezetnek. A katepszin B a vad típusú kationos tripszinogént aktiválja a leggyorsabban, ezért a katepszin B-nek nem lehet szerepe a tripszinogén aktivációs peptid mutációk pathológiás kifejeződéséhez. A K23R mutáció az (Asp)4 gátló hatását gyakorlatilag megszűnteti, valamint a D19A és D22G mutációk is az autoaktiválás sebességét növelik. Eredményeink azt valószínűsítik, hogy a tripszinogén aktivációs peptid mutációk pathogenezisében a megnövekedett autoaktivizációnak lehet szerepe.
5.3. A humán kationos tripszinogén Arg122 vizsgálata Az Arg122-Val123 peptidkötés hasítása A tripszin autoaktivációja során az aktivációs oktapeptid lehasad a tripszinogénről. A keletkező tripszin mind a kationos tripszinogén, mind a kationos tripszin Arg122-Val123 peptidkötés hasítására képes. Így gélen négy csík figyelhető meg. A tripszinogén (Tg), tripszin (Tr), az A és a B csík (18. ábra). A kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötésének hasításánál két egyforma mobilitású peptid keletkezik, ezek egy csíkot adnak, az A csíkot. A kationos tripszin Arg122-Val123 kötésének hasításakor az aktivációs peptiddel rövidebb N-terminális gyorsabban vándorol, ez eredményezi a B csíkot, így a kationos tripszin hasításánál két csík figyelhető meg, az A és a B csík. A hidrolizált Arg122-Val123 kötést hordozó tripszinogén és tripszin Tg1* és Tr1* jelölést kapott.
62
A Tg1* a tripszin által Tr1*-né alakulhat át. A keletkező Tr1* az N-terminális B csíkkal követhető nyomon. A gélen megfigyelhető két peptidláncot a valóságban egy diszulfidkötés tartja össze.
A kD 42
0
5
10
20
40
80
160
320 perc Tg1 Tr1
30 22 17
A B
B Tg1 Tr1 A B
A
Tg1*
A
Tr1*
18. ábra Kationos tripszinogén aktiválása kationos tripszinnel
[kationos tripszinogén]=3 μM, [kationos tripszin]=0,3 μM , T= 37 oC , Tris/HCl=0,1M (pH=8,0) 100 μl elegyet 10 % TCA-val precipitáltunk a jelzett időpontokban, 12 %-os redukáló gélen futtattuk, Coomassie Blue-val festettük. A 0 perces minta nem tartalmazott tripszint. A és B proteolitikus fragmentek A B ábra a Lys23 és Arg122 hasítási helyeket és termékeket mutatja a tripszinogénben
63
A Tg1* izolációja Megfigyeltük, hogy a tripszin általi Tg1* aktiváció lassúbb folyamat, mint az intakt kationos tripszinogén aktivációja. Így a B csík mindig később jelent meg, és jóval halványabb volt, mint a Tr csík (19. ábra). Ez a megfigyelés vezetett ahhoz a hipotézishez, mely szerint a tripszinogén hasítása az Arg122 helyen gátolja a tripszinogén aktivációt. Feltételeztük, hogy ez a kationos tripszinogén szerkezet változásán keresztül következik be. A feltételezés igazolásához Tg1*-t izoláltunk. Az izolációhoz anioncserélő oszlopot használtunk. A Tg1* generáláshoz először kationos tripszinogént autoaktiváltunk Ca2+ mentes környezetben. Ebben az esetben elsősorban az Arg122-Val123 kötés hidrolizálódik, mert az aktivációs peptid Lys23 Ca2+ hiányában a tripszin számára nehezen hozzáférhető. Így elsősorban Tg1* képződik és kis mennyiségű tripszin. MonoQ oszlopon a Tg1* jól elkülöníthető az intakt tripszinogéntől (19. ábra). Amint a kis ábra a gélen mutatja, a tripszinogén kb. 95 %-a hasított, és csak kis része marad intakt.
64
E280 kD 42 30 22 17
0.3
[NaCl] (M) 0.5
Gyűjtött frakció
0.4
1 234 5
1
2
3
4
5 0.4
0.3 0.2 0.2 0.1
0.1
0.1
0.0 6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Elúciós térfogat (cm3)
19. ábra Az intakt és Arg122 helyen hasított kationos tripszinogén szeparációja
Kb. 5 μM kationos tripszinogén autoaktivációjából (0,1 M Tris/HCl (pH=8,0), 1 mM EDTA, T=37 oC, t=2 óra) származó 5 ml mintát MonoQ 5/5 oszlopra vittük fel, 20 mM Tris/HCl-dal (pH=8,0) ekvilibráltuk, líneáris 0-0,5 M NaCl grádienssel eluáltuk. A jelölt helyeken 0,5 cm3 frakciókat gyűjtöttünk, 20 μl-t közvetlenül redukáló gélre vittünk.
Az Arg122-Val123 peptidkötés meglepő reszintézise Adat nem mutatja, de amikor tripszinaktivitást mértünk, nem tapasztaltunk semmilyen különbséget az intakt kationos tripszinogén és a hasított Tg1* aktivációja között. A két tripszinogén forma enteropeptidázzal vagy tripszinnel történt aktivációjában sem észleltünk különbséget, valamint az autoaktiváció Ca2+ függése is megkülönböztethetetlen volt. Továbbá a két forma teljesen azonosnak bizonyult az enzimkinetikai vizsgálatok alapján is. Ezek a megfigyelések nem támasztották alá az eredeti hipotézisünket. A korábbi megfigyelések, mely szerint marha tripszinogén degradálódik a humán kationos tripszinogén Arg122-Val123 peptidkötéssel identikus Arg-Val hidrolízise után (111) sem bizonyult igaznak humán kationos tripszinogén esetén. Amikor az időfüggését vizsgáltuk az autoaktivációnak SDS-PAGE gélen, 65
váratlan megfigyelést tettünk. Amint azt a 20. A ábra mutatja, pH=8,0-nál 5 mM Ca2+ mellett a Tg1* nagy része átalakult intakt tripszinné tripszin hatására. Jelen kísérleti körülmények között a reakciót nehéz kvantifikálni. Mivel a tripszinogén átalakul tripszinné, a reakcióban folyamatosan változik az enzim és a szubsztrát koncentrációja is. Az elegyben tehát a következő tripszin által katalizált reakciók mehetnek végbe: Tg1* ↔ kationos tripszinogén kationos tripszinogén → kationos tripszin Tg1* → Tr1* Tr1* ↔ kationos tripszin A reakciók reverzibilitását kísérletekkel igazoltuk. Annak érdekében, hogy a reakciót jobban lehessen követni, egy olyan tripszinogén mutánst hoztunk létre, melyben az aktivációs peptid Lys23-t glutaminra cseréltük (K23Q kationos tripszinogén). Ebben az esetben a tripszin képtelen az aktivációs peptidet lehasítani a tripszinogénről, tehát a tripszinogént nem lehet aktiválni. Így egy olyan mutánshoz jutottunk hozzá, mellyel a tripszinogén szubsztrát tulajdonságait lehet vizsgálni. A zimogén Arg122-Val123 peptidkötés elérhető a tripszin számára, de aktiválni nem lehet.
A lehetséges reakciók száma így egyre
csökken: K23Q Tg1* ↔ K23Q kationos tripszinogén A fent említett módon K23Q Tg1*-t hoztunk létre és izoláltuk az intakt formától. A K23Q Tg1*-t vad tripszinnel inkubáltuk és az Arg122-Val123 időfüggő reszintézisét figyeltük meg (20. ábra B). Degradációs terméket a kísérlet ideje alatt nem figyeltünk meg. Reszintézist tripszin hiányában, illetve a katalitikusan inaktív S200A kationos tripszin jelenlétében nem figyeltünk meg (ábra nem mutatja). Amint a 20. C ábrán látható, a reszintézis során nem értük el az egyensúlyi állapotot, de egy látszólagos 66
egyensúlyi állapot kiszámítható. A tripszinogén kb. 40 %-a Tg1*, 60 %-a kationos tripszinogén. Ebből a hidrolízisállandó értéke: Khid=[Tg1*] / [kationos tripszinogén]= 0,73.
20. ábra Az Arg122-Val123 peptidkötés reszintézise vad típusú és K23Q kationos tripszinogénben
A reakciók [Tris/HCl]=0,1 M (pH=8,0), [CaCl2]=5 mM, 37 oC-on történtek [kationos tripszin]=0,3 μM. 100 μl elegyet 10 % TCA-val precipitáltunk a jelzett időpontokban, 12 %-os redukáló gélen futtattuk, Coomassie Blue-val vizualizáltuk. A panel, 2,8 μM kationos tripszinogén B panel 4 μM K23Q kationos tripszinogén C panel B denzitometriás kiértékelése. A Tg csík denzitását a Tg és Tg* összdenzitásának a %-ában adtuk meg
Amikor az intakt K23Q kationos tripszinogént kis mennyiségű tripszinnel emésztettük (kationos tripszin:K23Q kationos tripszinogén = 1:160), Ca2+ hiányában pH=8,0-nál, nagyon gyors Arg122-Val123 hasítás volt megfigyelhető. Egyensúlyban a K23Q kationos tripszinogén* 85 %, míg a K23Q kationos tripszinogén 15 % volt (Khid=5,4). Ca2+ jelenlétében a K23Q Tg* aránya szignifikánsan csökkent (21. ábra). 0,1 mM Ca2+ koncentrációnál 0,96 ; 0,5 mM Ca2+-nál 0,7 a Khid értéke. 5 mM Ca2+ mellett a vizsgált időben nem állt be az egyensúlyi állapot. A tripszin koncentrációt megemelve (22. ábra) az egyensúlyi állapot szintén Khid=0,7 értéknél állt be. Az adatok azt 67
mutatják, hogy a Ca2+ koncentráció növelésével az Arg122-Val123 kötés lassabban hidrolizálódik, de az egyensúlyi állapot 0,1-5 mM Ca2+ koncentráció intervallumban gyakorlatilag állandó.
21. ábra Ca2+ hatása a K23Q kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötés kationos tripszin általi hasítására
K23Q kationos tripszinogén=5 mM, kationos tripszin=30 nM , Tris/HCl=0,1 M (pH=8,0), T= 37 oC A-D jelzett időpontokban 10 % TCA-val precipitáltuk a mintákat, redukáló SDS/PAGE gélen futtattuk, Coomassie Blue-val vizualizáltuk. E Az A-D ábrák denzitometriás kiértékelése. A Tg1* %-os értékét a kationos tripszinogén és Tg1* összdenzitásából számoltuk.
68
22. ábra 5 mM Ca 2+ hatása a K23Q kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötés kationos tripszin általi hasítására A kísérleti körülmények megegyeznek a 21. ábráéval, kivéve, hogy [kationos tripszin]=0,5 mM
5.3.1. Az Arg122 egy gyenge inhibitor loop reaktív helye A leírt megfigyelések azt mutatják, hogy az Arg122-Val123 kötés a kationos tripszinogénben több analógiát mutat a reverzibilis kanonikus inhibitorokkal (112). Ezek a következők: a, az Arg122 egy hiperszenzitív Arg a tripszinogén felszínén b, a kötés hasítása egyensúlyra vezet az intakt (szűz) és hasított (módosult) forma között c, hasonló egyensúly figyelhető meg a hasított formák tripszin katalizálta reszintézisénél. Ezek a tulajdonságok azt sugallják, hogy az Arg122 egy reaktív hely lehet a tripszinogén inhibitor doménjében. Egy lényeges különbség van a kanonikus proteáz inhibitorok és a tripszinogén között, mégpedig az, hogy a kationos tripszinogén hidrolízise nagyon gyors, ami arra utal, hogy a Tg1* relatív gyenge inhibitor lehet (113). A hipotézist ellenőrizve megvizsgáltuk a hatását viszonylag magas koncentrációjú, 80 μM inaktív K23Q kationos tripszinogénnek és K23Q Tg1*-nek vad típusú kationos tripszinogén auotoaktivációjára. A kontroll mintába K23Q tripszinogén helyett K23Q/R122H kationos tripszinogént tettünk. A K23Q kationos tripszinogén szignifikánsan csökkentette a kationos tripszinogén autoaktivációját (23. ábra). A K23Q 69
Tg1* gátlás különösen pH=8,0-nál Ca2+ nélkül és pH=5,0-nél volt feltűnő. A K23Q kationos tripszinogén és K23Q Tg1* egyformán gátolt pH=8,0-nál Ca2+ nélkül. Ez annak köszönhető, hogy a K23Q kationos tripszinogén hasítása nagyon gyors folyamat, a két reakció elegyben a K23Q Tg1* koncentráció identikusnak tekinthető. A K23Q kationos tripszinogén kevésbé gátolt pH=5,0-nél és pH=8,0-nál 5 mM Ca2+ jelenlétében. Ábra nem mutatja, de 100 μM bovine kimotripszinogén kationos tripszin általi aktivációját 80 μM K23Q Tg1* kb. felére csökkenti. A kísérletet végrehajtottuk pH=5,0nél is, ahol a kimotripszinogén aktiváció KM értéke nagyobb mint 0,5 mM (Sahin-Tóth M. nem közölt eredmény). Mivel a kimotripszinogén koncentráció jóval a KM érték alatt volt, a Ki=EC50/(1+[S]/KM) egyenletet használva (114) a hasított kationos tripszinogén Ki értékét kb. 80 μM értéknek számoltuk.
70
23. ábra K23Q kationos tripszinogén és K23Q kationos tripszinogén* hatása a vad típusú kationos tripszinogén autoaktivációjára
Kb. 2 μM vad típusú kationos tripszinogént inkubáltunk 80 μM K23Q Tg1(■) vagy K23Q Tg1* (□) jelenlétében. A kontroll minták 80 μM K23Q/R122H kationos tripszinogént (●) tartalmaztak. A panel 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) 5 mM CaCl2 B panel 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) Ca2+ nélkül C panel 0,1 M Na-acetát (pH=5,0) 5 mM CaCl2 100 μl végtérfogatokból a jelzett időben 2,5 μl-t kivettünk és 140 μM kromofór szubsztráttal (GPR-pNA) mértük az enzimaktivitást. Az enzimaktivitást a potenciálisan elérhető tripszinaktivitás százalékában fejeztük ki, ami pH=8,0 és 10 mM CaCl2 mellett enteropeptidáz aktiválással elérhető.
71
Zimogén degradáció Kísérleti eredményeink azt mutatják, hogy az Arg122-Val123 peptidkötés hidrolízise kis kationos tripszin:kationos tripszinogén (1:160) aránynál nem vezet a kationos tripszinogén gyors degradációjához. A kötés reszintézise dinamikus egyensúlyt eredményez a kationos tripszinogén és Tg1* között. Ez akkor igaz, ha a kationos tripszin:kationos tripszinogén arány alacsony (21. ábra). Ha K23Q kationos tripszinogént emésztünk Ca2+ mentes környezetben magasabb (kationos tripszin: kationos tripszinogén=1:10) tripszinkoncentráció mellett, nem csak az Arg122-Val123 peptidkötés hidrolízisét figyelhetjük meg (24. ábra). Idővel mind a K23Q kationos tripszinogén mind a K23Q Tg1* csík intenzitása csökken. Ez azt jelenti, hogy a tripszinogén degradálódik. A degradációs termékek a gélen nem adtak detektálható degradációs terméket. A kísérletet megismételtük K23Q/R122H kettős mutáns tripszinogénnel is. Ebben az esetben már sikerült azonosítanunk a 24. B ábrán C-vel jelölt terméket. Szekvenciaanalízissel megállapítottuk, hogy a C fragment a peptid N terminális vége. A fragment látszólagos tömege alapján a hasítási hely Lys193-Asp194 –nek bizonyult. Ugyanezt az autokatalitikus hasítási helyet már leírták patkány tripszinogén (115) és marha tripszin (116) vizsgálatánál, ahol a hasítás a tripszin(ogén) inaktiválódását eredményezte. A Lys193 hely természetesen hidrolizálódik a K23Q kationos tripszinogénben is, de az Arg122 szintén hidrolizálódik, és az így kapott fragmentumok már túl kicsik ahhoz, hogy a rutinszerűen használt 12 %-os gélen detektálhatóak legyenek. 5 mM Ca2+ teljesen stabilizálta mind a K23Q kationos tripszinogént (22. ábra), mind a K23Q/R122H kationos tripszinogént (24. C ábra). A kationos tripszinogén és Tg1* csík denzitása a jelzett időben nem változott. Kísérleteinkben az R122H mutáció hatását a tripszinogén degradációra K23Q kationos tripszinogén és K23Q/R122H kationos tripszinogén segítségével modelleztük. A kationos tripszinogén degradációt a kationos tripszinogén -Tg1* csíkok intenzitásának csökkenése mutatta. A K23Q kationos tripszinogén → K23Q Tg1* átalakulás nem tekinthető degradációnak, mert a vad típusú Tg1* teljesen aktív Tr1*-né alakul át. Ezzel szemben a Lys193 (24. C ábra) kötés hidrolízise valódi degradációs lépésnek tekinthető. Ha a kationos tripszinogén Lys193 elhasad, aktív tripszint már nem nyerünk vissza. A K23Q kationos tripszinogén és Tg1* összdenzitás csökkenéséből és a K23Q/R122H 72
kationos tripszinogén denzitásának csökkenéséből kiszámoltuk a degradáció sebességét. K23Q kationos tripszinogén esetében 39 nM/perc, K23Q/R122H kationos tripszinogén esetében 22 nM/perc adódott. Ez azt mutatja, hogy adott kísérleti körülmények között az R122H mutáció kb. kétszeres stabilitást eredményez a humán kationos tripszinogénben. A Tg1* csík szekvenciaanalízise azt mutatta, hogy a Tg1* csíkban az N és C terminális proteinek mennyisége azonos sebességgel csökkent, a vizsgálat időtartama alatt a C peptid:N peptid = 1:1 arány maradt. Ez azt jelenti, hogy a degradációjuk azonos sebességgel történt. Összehasonlítottuk az Arg122 hely hasítási sebességét egyéb tripszinolitikus helyek hasítási sebességével. Ca2+ hiányában 1:160=kationos tripszin:kationos tripszinogén arányban a K23Q kationos tripszinogén → K23Q Tg1* átalakítás félideje kb. 0,5 percnek bizonyult (21. ábra). Ugyanilyen Ca2+ mellett, de 16-szor nagyobb kationos
tripszin
koncentrációnál
(0,5
μM)
(kationos
tripszin:
kationos
tripszinogén=1:10) a t½=60 perc volt K23Q/R122H esetén (24. B ábra). Tehát Ca2+ mentes környezetben az Arg122 majdnem 2000-szer (16*60/0,5=1920) gyorsabban hasad mint az egyéb tripszinolitikus helyek a tripszinogénben.
73
24. ábra A K23Q kationos tripszinogén és a K23Q/R122H kationos tripszinogén tripszinolitikus degradációja
5 μM végső koncentrációjú K23Q kationos tripszinogént (A panel) vagy K23Q/R122H kationos tripszinogént (B és C panel) inkubáltunk 0,5 μM vad típusú kationos tripszinnel 37 oC-on 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) és 1 mM EDTA mellett (A és B panel) vagy 0,1 M Tris/HCl (pH=8,0) és 5 mM CaCl2 mellett (C panel). ( Összehasonlításul lsd. a K23Q Tg1 5 mM CaCl2 melletti emésztése a 22. ábrán.) 100 μl elegyet 10 % TCA-val precipitáltunk a jelzett időpontokban, 12 %-os redukáló gélen futtattuk, Coomassie Blueval vizualizáltuk. A C fragment egy egyedi proteolitikus termék, ami csak a K23Q/R122H kationos tripszinogénnél figyelhető meg.
74
6. Megbeszélés 6.1. Krónikus pancreatitis pathogenezise A pancreatitis a pancreas gyulladásával járó betegség, gyakori a pancreas necrózisa, ami a pancreas exokrin és endokrin funkciók zavarával jár együtt. A tripszin szerepét a pancreatitis pathogenezisében már több mint egy évszázada felvetették. A tripszin 1876-os felfedezése után három évvel Klebs leírta, hogy a pancreas nedv pancreas vérzést okoz, majd 1896-ban Chiari állapította meg, hogy a pancreasnak önemésztő potenciálja van (117). A tripszin aktiválja a karboxipeptidáz A-t, elasztázt, foszfolipázt, kimotripszint. Az emésztőenzimek kaszkádszerű aktiválódását szöveti destrukció követheti. A tripszinnek tehát központi szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában mint kórokozó tényező. A pancreatitis oka tehát a nemkívánatos tripszinaktivitás megjelenése a pancreasban, ezen alapszik a „gain of function” teória, mely szerint a tripszinaktivitás növekedése a pancreatitis kialakulását vonhatja maga után. A pancreatitishez vezető mutációk tehát valamilyen módon a tripszinaktivitás növekedését idézik elő. A tripszin másrészt - a zimogének aktiválásán túl - a degradációban is szerepet játszhat. A tripszin eszerint védő funkciót láthat el, a veszélyessé váló enzimek mennyiségének csökkentésével a pancreatitis kialakulásának lehetőségét is csökkenti. A mutációk hatását teoretikusan magyarázók szerint az örökletes pancreatitis oka a mutációk hatására bekövetkező védőhatás elvesztése lehet. Ez a „loss of function” elmélet alapja. A kérdés mindkét esetben az, hogy milyen tényezők válthatják ki az aktív tripszin megjelenését a pancreasban?
75
6.1.1. A tripszin idő előtti aktivációjának megakadályozása A tripszinaktiváció a pancreasban erősen korlátozott, a folyamatot több mechanizmus is gátolja. A tripszin inaktív formában képződik a pancreasban, az aktív tripszin létrejöttéhez le kell hasadni a tripszinogén aktivációs peptidnek a tripszinogénről. A tripszinogén specifikus aktiválószere, az enteropeptidáz a duodenumban képződik, így nem aktiválhatja a pancreasban a tripszinogént. A tripszin aktiválódhat autoaktiváció révén is. Az autoaktivációnak akkor megfelelő a sebessége, ha a tripszinogén aktivációs peptidet Ca2+ árnyékolja le. A pancreas acinus sejtekben a Ca2+ koncentráció alacsony, nem kötődik az (Asp)4-hez, az autoaktiváció sebessége lassú, és a lehetséges maximális tripszinaktivitás is alacsonyabb, mint Ca2+ jelenlétében. Ca2+ hiányában a tripszin stabilitása kisebb, mint Ca2+ jelenlétében, autolízisre hajlamosabb, degradációja gyorsabb. Alacsony Ca2+ koncentráció mellett jelentős lehet a Tg1* gátló hatása is. Csekély mennyiségű tripszin is képes a kationos tripszinogén 80 %-át átalakítani Tg1*-né, ami gátolhatja a további tripszinképződést. A legjelentősebb tényező a tripszin aktiválás megakadályozásában a PSTI. A tripszinogén → tripszin átalakulás nagyon lassan, de spontán is megtörténik. A keletkező tripszin már képes a tripszinogént átalakítani tripszinné (autoaktiválás). A keletkező tripszint a PSTI inaktiválja, így gátolva meg az autoaktivációt (25. ábra). A PSTI a kationos tripszin és anionos tripszin izoformákat gátolja (Kd = 10-9 M). A PSTI a potenciális kationos tripszin és anionos tripszin mennyiség 20 %-át képes gátolni, és ez elég ahhoz, hogy megakadályozza a tripszin megjelenését a pancreasban. A PSTI a mezotripszinnel gyengén asszociál (Kd = 8*10-5 M). A szabad mezotripszin specifikusan tripszin inhibitorokat bont, így a PSTI-t is degradálja. Fiziológiás körülmények között viszont a mezotripszin képtelen autoaktivációra, és ez megakadályozza a mezotripszin megjelenését a pancreasban.
76
A N-Ala-Pro-Phe-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- Ile- --
B
Tg enteropeptidáz Tg1*
degradáció
PST Ca2+
Tr
25. ábra A tripszin idő előtti aktivációjának megelőzése pancreas acinus sejtekben A panel a tripszinogén aktivációs peptid (Asp)4-Lys motívuma az autoaktivációt csökkenti B panel Az enteropeptidáz extrapancreatikus aktivátor, kizárólag a vékonybélben termelődik. Az alacsony Ca2+ szint az autoaktiváció sebességét csökkenti, a tripszinogén degradációját növeli. A PSTI a tripszint inaktív komplexben tartja.
Eredményeink szerint szerepe lehet a pancreas károsodás megakadályozásában a tripszinogén arány megváltozásának is. Az anionos tripszinogén mennyiségének növekedése a pancreasban megjelenő maximális tripszinaktivitást csökkenti. Alacsony Ca2+ koncentrációnál és pH=8,0 mellett a tripszin aktív anionos tripszin megjelenése nélkül degradálja az anionos tripszinogént. A kationos tripszinogén: anionos tripszinogén =2:1 arány megfordulásával a tripszinaktivitás a fiziológiás érték felére csökken. A lizoszómákban sem jelenik meg jelentős anionos tripszin aktivitás, az itt jellemző pH=5,0 értéken az anionos tripszinogén inaktív formában marad akkor is, ha a kationos tripszin aktív. Eszerint a lizoszómában is a fiziológiás aktivitás 50 %-a érhető el a tripszinogén arány megfordulásával (26. ábra).
77
fiziológiás
pathológiás
Tg1:Tg2=2:1 Tg1
Tg1:Tg2=1:2
Tr1
Tg1
Tg2 degradáció
Tr1
Tg2 degradáció
szekretórikus vezikulum
szekretórikus vezikulum
lizoszóma
lizoszóma
26. ábra Pancreas acinus sejtekben elérhető tripszinaktivitás fiziológiás és pathológiás tripszinogén keverékek esetén A kationos tripszinogén: anionos tripszinogén arány megváltozásával a pancreas acinus sejtekben az elérhető maximális tripszinaktivitás kb. a felére csökken. Az esetleges tripszinaktivációkor a szekretorikus vezikulumokban az anionos tripszinogén degradálódik, a lizoszómákban pedig inaktív marad.
6.1.2. A PRSS1 (kationos tripszinogén) gén mutációk szerepe a pancreatitis kialakulásában A tripszin felszaporodása a pancreasban elméletileg vagy a megnövekedett autoaktivációnak vagy a csökkent degradációnak a következménye. A pancreas által termelt tripszinogén mennyiség állandónak tekinthető, így kórosan megnőtt tripszinogénszinttel akkor kell számolni, ha a hasnyál működése akadályozott (epekövek, Oddi sphincter görcse, anatómiai anomáliák stb.). A pancreatitis kialakulása emberben nem követhető nyomon, a betegek az első tünetek megjelenésével fordulnak orvoshoz, amikor már csak a végállapot vizsgálható. In
vitro
elsősorban
az
autoaktivációt,
autolízist,
PSTI
lebontást,
tripszinaktivációt lehet nyomon követni. Humán acinus sejttenyészet híján az esetleges transzport defektusok (A16V kationos tripszinogén mutáció), expressziós zavarok (intron mutációk) nehezen vizsgálhatók. 78
R122H mutáció, a szupertripszin Az elsőként felfedezett és egyben leggyakoribb kationos tripszinogén mutáció az R122H. Marha és patkány tripszin degradációjának vizsgálata során feltételezhető volt, a tripszin degradáció első lépése az Arg122-Val123 helyen lévő peptidkötés hidrolízise. Logikusnak tűnt, ha a mutációval megszűnik a tripszinhasítási hely, egy autolízis rezisztens, stabil „szupetripszin” jön létre. E modell szerint az esetlegesen képződő tripszin nem degradálódik, mennyisége folyamatosan nő, hasnyálmirigy károsodást okozva (40,
50
). Rekombináns kationos tripszinogén R122H
vizsgálatával Sahin-Tóth M. megnövekedett autoaktivációt és csökkent autolízis sebességet mutatott ki (118, 119). N29I mutáció
Az N29I mutáció a második a gyakoriságot tekintve, eddig több mint 50
esetben azonosították. Az N29I kationos tripszinogénnel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a kationos tripszinogén N29I autoaktivációs sebessége megnövekszik, a növekedés a vad típushoz képest 2-3-szoros volt (85,120). R122C A kationos tripszinogén R122C mutációt 2002-ben írták le először. A kationos tripszinogén R122C mutáns fehérje megemelkedett autoaktivációs sebességet mutatott pH=8,0 és pH=5,0 mellett is. Ca2+ mentes közegben a maximális tripszinaktivitás is magasabb volt a vad típushoz képest. A magasabb tripszinaktivitást a kationos tripszin R122C csökkent autolízise okozhatja (121). Azok a mutációk, amelyek új cisztein megjelenéséhez vezetnek (R116C, R122C) a tripszinogén foldingjában is zavart okozhatnak. Még nem publikált eredményeink szerint azonos kitermelés mellett, a módszerekben ismertetett módon a natív állapotban feltekeredett tripszinogén mennyisége kb. harmada a kationos tripszinogén R116C mutáns esetén a vad típushoz képest. A hibás folding a fehérje lizoszómális transzportjához és lebontásához vezet. A lizoszómákban a megnövekedett zimogén mennyiség megnövekedett katepszin B általi tripszin aktiválódást okozhat. Ez a tényező is elősegítheti a pancreatitis kialakulását. E79K
A kationos tripszinogén E79K mutációt európai és amerikai együttműködés
keretében mi azonosítottuk először három európai családban, és mi végeztük el a biokémiai karakterizálását. A mutáció érdekessége, hogy nem okoz szignifikáns 79
változást sem az autoaktivációban, sem a degradációban, nem változtatja meg a PSTI kötődést. Az aktív kationos tripszin E79K viszont az anionos tripszinogént kétszeres sebességgel aktiválja a vad típusú kationos tripszinhez képest. Más eltérést nem találtunk vizsgálataink során. Mivel idáig az irodalomban nem ismert olyan anionos tripszinogén mutáció, ami pancreatitist eredményez, úgy gondolták, hogy az anionos tripszinogénnek a szerepe perifériás lehet a pancreatitis kóroktanában. Eredményünk viszont azt támasztja alá, hogy az anionos tripszinogénnek is fontos szerepe lehet a pancreatitis
kialakulásában,
és
a
pathológiai
folyamatok
vizsgálata
további
erőfeszítéseket kíván (122). Génkonverzió (kationos tripszinogén N29I/N54S) Az ismertetett esetben a génkonverzió során a PRSS2 gén (anionos tripszinogén) 2 exonjából és 2 intronjából legalább 289 bázishosszúságú szakasz került át a PRSS1 génbe (kationos tripszinogénbe), mégpedig csere nélkül, a PRSS2 nukleotidsorrendje tehát nem változott. A konverzió során 16 intron- és 6 exon nukleotid szubsztitúció történt, utóbbiak közül kettő okozott aminosav sorrendváltozást, kationos tripszinogén N29I/N54S kettős mutáns keletkezett. A mutáció fokozott autoaktivációt eredményezett pH=8,0-nál és pH=5,0-nél is, enteropeptidázzal és katepszin B-vel való aktiválás nem okozott változást (123). Nonszensz és splicing „védő” mutációk Chen és mtsai 2003-ban olyan nonszensz és splicing PRSS1 mutációkat írtak le (nonszensz mutáció: c.111C>A; Y37X splicing mutáció: IVS2+1G>A), amelyek csökkent kationos tripszinogén szintézishez vezetnek, és krónikus pancreatitises betegekben nem, csak egészséges emberekben volt kimutatható. Ez azt jelenti, hogy a kationos tripszinogén szint csökkenése véd a pancreatitis ellen (32). In vitro kísérletek tehát azt bizonyítják, hogy a megnövekedett tripszinszintért az autoaktiváció sebességének emelkedése lehet a felelős. A munkák során világossá vált, hogy az ismert mutációk a tripszinszint növekedését teszik lehetővé. Ez a „gain of function” elmélet mellett szól. Pancreatitist előidéző mutációt, ami a tripszin károsodását, és így a tripszin védő hatásának csökkenését okozza, nem találtak. A „loss of function” elméletet tehát nem sikerült kísérletes bizonyítékkal alátámasztani, sőt, 80
Chen és mtsai adatai szerint (lsd. nonszensz és splicing mutációk) a kationos tripszinogén funkcióvesztése védelmet biztosít a pancreatitis ellen.
6.1.3. Katepszin B szerepe a krónikus pancreatitis pathológiájában A krónikus pancreatitis pathogenezisében nem világos, hogy a tripszinaktiválás milyen mechanizmussal történik. Az autoaktiválás PSTI jelenlétében nagyon lassú. Az autoaktiválás kezdő lépése a tripszinogén által katalizált Tg →Tr átalakulás. A keletkező tripszin öt nagyságrenddel aktívabb a tripszinogénnél. A tripszin inaktív komplexbe kerül a PSTI-vel, így az autoaktiválás akkor lehet jelentős, ha a PSTI mennyisége jelentősen lecsökken, vagy a tripszinogén tripszinszerű aktivitása nagyságendekkel emelkedik, pl. mutáció következtében. Ez utóbbira nem ismerünk példát. A PSTI mennyiségének csökkentésében szerepe lehet a katepszin B-nek. A katepszin B lizoszómális cisztein peptidáz, a tripszinhez hasonlóan lizin és arginin mellett hasít. A pH optimuma 4 körül van (124,
125
). Német munkacsoporttal
kollaborációban kimutattuk, hogy a katepszin B és a tripszinogén kolokalizálódhat, valamint a lizoszómákban uralkodó savas környezetben a katepszin B képes a tripszinogén aktivációs peptidet hasítani, így a tripszin aktívvá válik. Szilágyi és mtsai. kimutatták, hogy a katepszin B PSTI jelenlétében is aktiválja a tripszint (126). Munkacsoportunk érdeme az az érdekes megfigyelés, hogy a katepszin B legnagyobb sebességgel a mezotripszint aktiválja, bár a degradáció is gyors. A pancreatitisre is jellemző oxidatív stressz a lizoszómák membránjának sérüléséhez vezet. A sérült lizoszómákból a fehérjetartalom a citoszólba ürül (127), az aktiválódott mezotripszin a PSTI lebontásával lehetővé teszi a kationos tripszin és anionos tripszin autoaktivációját, amik elindíthatják az emésztési kaszkádot és az önemésztődést. A lizoszómák szétesése hidrogénperoxid produkcióhoz vezethet, így egy apoptózist okozó öngerjesztő folyamat indulhat be. Kolecisztokininnel kiváltott intracelluláris Ca2+ szintemelkedés a tripszin megjelenését okozta a pancreasban (128). Ca2+ kelátorral egerekben és patkányokban kísérletes pancreatitis kialakulását késleltetni lehetett a tripszin idő előtti aktivációjának megakadályozásával (129). A Ca2+ szint emelkedésének tehát szerepe lehet a pancreatitis kialakulásában.
81
6.1.4. Enteropeptidáz szerepe Az enteropeptidázt a vékonybél enterocytái termelik. A tripszinogént specifikusan aktiválja, peptidáz inhibitorok a működését nem gátolják, ellenálló a peptidázokkal szemben (130). 1968-ban McCutcheon felvetette, hogy a pancreatitis oka lehet az, hogy az enteropeptidáz megjelenik a pancreasban (131). Normál körülmények között a sphincter megakadályozza, hogy a vékonybélből enteropeptidáz, epe és aktív proteázok kerüljenek a pancreasba. A hepatocyták az esetlegesen vérbe kerülő enteropeptidáz 98-99 %-át lizoszómális hidrolázokkal lebontják. Az aktív enzim 0,2-2 %-a 1 órán belül az epébe kerül kiválasztásra. A hepatocyta funkciók sérülése esetén, pl. etanol indukált tengerimalac zsírmájban az epe enteropeptidáz koncentrációja 2-3szorosra növekedett. Pancreas ductusba juttatott 50-200 ng enteropeptidáz fatális hemorrhágiás pancreatitist eredményezett (132).
Grant és munkatársai humán
enteropeptidáz aktivitást mérve epében azt tapasztalták, hogy duodenális reflux nem kimutatható, de epében 0,1-4,8 ng/ml aktív enteropeptidáz koncentráció mérhető. A legnagyobb enzimaktivitást postoperatív nekrotizáló pancreatitisben mérték (133). In vitro körülmények között 3 ng/ml enteropeptidáz a hasnyál zimogénjeit aktiválni képes, az epében található enteropeptidáz tehát (ha nem hígul az epe) elvileg képes a tripszinogén aktiválására.
6.2. A pancreatitis lehetséges pathogenezise Saluja és mtsai 1989-ben mutatták ki, hogy nyulakban a pancreas ductus műtéti elzárásával a lizoszómális katepszin B és az amiláz kolokalizálódik (134). A katepszin B aktiválja a tripszinogént (135,
136 137
,
), ami az emésztőenzimek aktiválásával a környező
szövetek autofágiáját okozhatja. Munkacsoportunknak jelentős szerepe volt a katepszin B humán pancreatitisben betöltött esetleges kóroktani szerepének felderítésében. Kimutattuk, hogy humán pancreasban a tripszinogén és a katepszin B kolokalizálódik (27. ábra), valamint a humán katepszin B képes mindhárom pancreatikus tripszinogén izoenzim aktivációjára. Az aktiváció éles pH depenciát mutat, a pH optimum 4,0-4,3 között van, pH 5,0-nél az 82
aktiváció a töredékére, a maximum kb. 10 %-ára csökken. Érdekes és fontos megfigyelés, hogy a proteáz rezisztens mezotripszint aktiválja a katepszin B a leggyorsabban. Ha a lizoszómában aktiválódott mezotripszin kiszabadul a citoszólba, a PSTI degradáció révén a tripszin aktiváció drámaian felgyorsulhat.
27. ábra A katepszin B és tripszinogén kolokalizációja egészséges humán pancreasban Az A, B és C panel egy, míg a D és E panel egy másik egyénből származik, akiknél nem volt az anamnézisben korábbi pancreas betegség. A szöveteket fixálták, műgyantába ágyazták, immuno-arannyal jelölt antitesttel kezelték (katepszin B esetében 5 nm arany, anionos tripszin esetén 15 nm arany jelöléssel). A vonal 1 μm vastagságot jelöl. A panel kontroll 2 órás előinkubálás a megfelelő feleslegben vett antitesttel, jelölés gyakorlatilag nem tapasztalható B panel acinus sejtek endoplazmatikus retikulumában és lizoszómájában (beillesztett ábra) megfigyelhető a katepszin B A kolokalizáció következetesen a szekretorikus granulumokban figyelhető meg (C és D panel) A B és D panelekben a fehér nyilak a katepszin B; míg a fekete nyilak a tripszin arany jelölését mutatják. E panel acinus sejtek lumenje
83
A katepszin B szerepének fontosságát támasztja alá az a cikk is, amelyben katepszin B-t gátoltak egerekben és patkányokban a secretagouge és retrográd ductus infúzió indukált panceatitis kiváltása előtt. A pancreasban a katepszin B gátlószer hatására a tripszinszint csökkent, valamint a kialakuló pancreatitis kevésbé volt súlyos. Redukálódott a gyulladás, az ödéma és az acinus sejtek nekrózisa is (138). A katepszin B-nek szerepe lehet az alkoholos pancreatitisben is. Patkányokat etanolos diétán tartva azt tapasztalták, hogy a katepszin B expressziója növekedett. Ezzel párhuzamosan nőtt a tripszinogén, kimotripszinogén és lipáz mennyisége is (139). Irodalmi adatok és saját kísérleteink alapján a krónikus pancreatitis feltételezett pathogenezisét az alábbiakban foglalom össze: Az első lépés valószínűleg a lizoszómákban bekövetkező tripszinaktiváció. Ha a lizoszómák membránja sérül (pl. etanol, oxidatív stressz hatására), az emésztőenzimek a citoszólba, majd a szekretórikus vezikulumokba kerülhetnek. Az aktív mezotripszin a PSTI-t elbonthatja, és ezután autoaktiválódhat a kationos tripszin. Az autoaktivációt az esetlegesen megemelkedő Ca2+ szint, illetve a kationos tripszinogén mutációi (aktivációs peptid mutációk, R122H, N29I stb.) gyorsíthatják. A tripszin aktiválhatja az emésztési kaszkádot, ami a pancreas önemésztéséhez vezethet (28. ábra).
84
28. ábra A krónikus pancreatitis kialakulásának lehetséges modellje A folyamat bonyolult, többlépcsős mechanizmus. Ez magyarázatot adhat arra, hogy az egyes mutációk penetranciája miért nem 100%-os, és miért hosszú évek, évtizedek alatt alkulnak ki az első tünetek. A lizoszómákban a tripszinaktiváció valószínűleg folyamatos, de ezt lebontás követi. Az enzimek lizoszómából való kiszabadulásához is stresszhatásnak kell érnie a sejtet. A pancreatitisszel kapcsolatos mutációk a folyamat végén, a tripszin keletkezéséhez köthetők. Az általunk vizsgált mutációk fokozott autoaktiválással járnak, ami azt mutatja, ha a tripszinautoaktiváció nem is kezdő lépése a pancreas károsodásának, fontos szerepe lehet benne.
6.2.1 A Tg1* inhibitor tulajdonsága Az Arg122 autokatalitikus degradációs szerepét kationos marhatripszinben már 1969-ben leírták (140) és megfigyelték más fajokban is. Patkány tripszin vizsgálata azt mutatta, hogy az R122N mutáció a patkány tripszint megvédte az autokatalitikus degradáció ellen (141). Ez ahhoz a következtetéshez vezetett, hogy az Arg122 központi 85
szerepet játszik a tripszin autolízisében. Ezeken a megfigyeléseken alapult az, hogy a humán kationos tripszinogén Arg122-Val123 kötés hasítása lehet a kationos tripszinogén degradációs útvonalának első lépése, és ez megvédheti a pancreast a tripszin idő előtti aktivációjától. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy az Arg122, eltérően a szarvasmarha, patkány, egér tripszinogéntől, a humán kationos tripszinogénben nem a gyors degradációt elősegítő hely, hanem inhibitor aktív helyeként viselkedik. A tripszin az Arg122-Val123 pepidkötést gyorsan hidrolizálja, de meglepően gyors a kötés reszintézise is. A Tg1* tehát kanonikus inhibitor. A Tg1* gyenge inhibitor, a Ki=80 μM, ami megegyezik a kationos tripszin fehérjetermészetű szubsztrátjainak (pl. kimotripszinogén) KM értékével. A humán Tg1* inhibitorként szokatlan tulajdonságokat hordoz: 1. Maga a peptidáz viselkedik inhibitorként 2. A peptidkötés hidrolízise és reszintézise gyorsan egyensúlyba kerül A kationos tripszinogén hidrolízise Ca2+ dependens folyamat. Ca2+ mentes közeg a Tg1* kialakulásának kedvez (1 mM EDTA, Khid=5,4), míg mM Ca2+ koncentráció a reszintézist segíti elő (1 mM Ca2+, Khid=0,7). A KM és a hidrolízis Ca2+-dependenciája segíthet a Tg1* fiziológiás szerepének tisztázásában. Feltételezésünk szerint a Tg1* védelmet jelenthet a tripszin aktivációtól a pancreas acinus sejtekben. Az acinus sejteket elsősorban a PSTI védi a tripszin aktivációtól. Ha a PSTI menyisége csökken, a tripszinogén autoaktiválódhat. Alacsony Ca2+ koncentráció mellett a kationos tripszinogén jelentős része Tg1*-né alakul át, így csökkentheti a tripszin aktivitását. A kationos tripszinogén R122H mutáció az inhibitor aktív helyének elveszítésével jár, tehát a mutáns kationos tripszinogénnél a keletkező kationos tripszin aktivitása nem gátlódik, szabadon aktiválhatja a zimogéneket (29. ábra). 86
vad típus
R122H mutáció Tg1
Tg1* Tr1 29. ábra A kationos tripszinogén Arg122 lehetséges szerepe a pancreas védelmében
A kationos tripszinogén pH=8,0 és alacsony Ca2+ mellett átalakul Tg1*-é. A Tg1* mint inhibitor gátolja a kationos tripszint, így csökkenti az autoaktivációs sebessséget. A kationos tripszinogén R122H mutáció az inhibitor tulajdonság elveszítésével jár. Rövidítések: Tg1 kationos tripszinogén; Tr1 kationos tripszin
Az anionos tripszinogén és mezotripszinogén az Arg122 helyen hidrolizálva degradálódik, az anionos tripszinogénnek és mezotripszinogénnek tehát nincs inhibitor hatása, ezeknél az Arg122 litikus hely.
87
7. Következtetések Mind vad típusú, mind mutációt hordozó rekombináns kationos és anionos tripszinogén, valamint mezotripszinogén expressziójának és tisztításának megoldásával lehetővé vált ezen proenzimek biokémiai viselkedésének vizsgálata, biokémiai tulajdonságaik jellemzése. E munka elméleti orvostudományi jelentőségét Sahin-Tóth Miklós és Tóth Miklós közleményei (33, 34, 102, 115, 120) adják meg, miszerint a humán herediter pancreatitis oka elsősorban a mutáns tripszinogén gyorsult autoaktiválásával függhet össze.
1. Rekombináns tripszinogének jellemzése A rekombináns kationos és anionos tripszin kinetikai tulajdonságait (Vmax, KM) szintetikus
glicil-prolil-arginil-p-nitro-anilid
szubsztráttal
mérve
gyakorlatilag
azonosnak találtuk. Ugyanakkor a két izoenzim biokémiai viselkedésében több lényeges különbséget mutattunk ki: Tripszin stabilitás Az anionos tripszin pH 8,0, 10 μM Ca2+ közegben kb. egy nagyságrenddel gyorsabban degradálódik mint a kationos tripszin. Az anionos tripszinre jellemző kis stabilitás az anionos tripszinogénre is igaz. Az autoaktiválás pH érzékenysége A kationos tripszinogénhez képest az anionos tripszinogén Ca2+ mentes közegben történő inkubáláskor pH=8,0-on igen kismértékű, pH=5,0-ön mérhetetlenül alacsony tripszin aktivitást mutat. Gélelektroforézissel kimutatható, hogy ennek oka pH=8,0-nál az anionos tripszinogén gyors degradációja (vagyis eltűnik az anionos tripszin előanyaga), pH=5,0-nél viszont a stabilizáció, mivel a vizsgálat időtartama alatt az anionos tripszinogén inaktív tripszinogén formában marad (vagyis nincs autoaktiváció). Ca2+ érzékenység 1. Ca2+ hatása az autoaktiválásra:
88
Enyhén lúgos körülmények között, pH=8,0-on, Ca2+ mentes vagy 1-10 μM nagyságrendű Ca2+ koncentrációnál az anionos tripszinogén autoaktivációja nem figyelhető meg. A Ca2+ koncentráció emelésével 100 μM Ca2+ koncentrációig még nem lehet tripszint kimutatni. Ezután az autoaktiválás sebessége 5 mM Ca2+ koncentrációig nő, a maximális tripszinszint eléréséhez 20 mM Ca2+ szükséges. Ezzel szemben a kationos tripszin képződése kationos tripszinogénből már 10 µM Ca2+ mellett is jelentős, a maximális enzimaktivitás 1 mM Ca2+ koncentrációnál érhető el. A kationos tripszinogén Ca2+ koncentrációtól függő autoaktiválása bifázisos görbét mutat, ami egy nagyobb és egy kisebb affinitású Ca2+ kötőhelyre utal. 2. Ca2+ hatása a tripszin stabilitására: Ca2+ mindkét izoformát stabilizálta autolízissel szemben. Tris/HCl (pH = 8,0) pufferben az IC50 érték 5 μM az anionos tripszin és 20 μM a kationos tripszin esetében. Sóérzékenység Az anionos tripszin kevésbé érzékeny 100 mM NaCl inaktiváló hatásával szemben mint a kationos tripszin.
2. Az anionos tripszinogén szerepe a krónikus pancreatitisben Munkánk során megvizsgáltuk fiziológiás (kationos tripszinogén: anionos tripszinogén arány = 2:1), illetve pathológiás (kationos tripszinogén: anionos tripszinogén arány = 1:2) körülményekre jellemző tripszinogén keverékek inkubáció során tapasztalható viselkedését. A duodenumra jellemző környezetben inkubálva (pH=8,0; 1 mM Ca2+) a két keverék nem tér el sem aktiválhatóságban, sem a maximális tripszinaktivitásban. A lizoszómára (pH=5,0), illetve a citoszólra jellemző (pH=8,0; 10 µM Ca2+) körülmények között inkubálva viszont jelentős különbségek tapasztalhatóak. Ilyenkor a pathológiás összetételű tripszinogén keverék tripszin aktivitása jelentősen csökken a fiziológiás összetételűhöz képest. A pancreas lizoszómájára jellemző savas, illetve a citoszólra jellemző Ca2+ szegény, enyhén lúgos közegben az anionos tripszin nem jelenik meg, a tripszin összaktivitásában ilyenkor az anionos tripszin nem játszik szerepet. Ennek oka, hogy a keverékben lévő anionos tripszinogén vagy nem aktiválódik (pH 5.0) vagy gyorsan 89
lebomlik (pH=8,0; 10 µM Ca2+).
Az exocrin pancreas sejtekben képződő tripszin
gyulladásos, szövetelhalást eredményező folyamatokat indíthat el. Eredményeink arra mutatnak, hogy az anionos tripszinogén arányának növekedésével az exocrin pancreas sejtek tripszinszintje csökken, így az anionos tripszinogén szint emelkedésének a pathológiás folyamatok ellen inkább védő hatása lehet, és nem valószínű, hogy ezek kiváltásában van szerepe (26. ábra).
3. Herediter pancreatitissel összefüggő tripszinogén aktivációs peptid mutációinak vizsgálata Az enteropeptidázzal végzett aktivációs kísérletekben a kapott eredmények megfeleltek az enteropeptidáz szubsztrátspecificitásából következtethetőeknek és a tripszinogén aktivációs peptidet hordozó modellfehérjén végzett vizsgálatokénak. A vad típushoz viszonyítva az enteropeptidáz argininhez való nagyobb affinitása miatt a K23R kationos tripszinogén gyorsabban aktiválható. A D22G kationos tripszinogént az enteropeptidáz nem képes aktiválni, mert számára az aszparaginsav jelenléte esszenciális a P2 pozícióban. Ebben az esetben az aktiválás kizárólag autoaktiváció révén történhet. A D19A mutáns a vad típussal megegyező sebességgel aktiválódik, ami arra mutat, hogy a P5 pozícióban lévő aszparaginsavnak az enteropeptidáz szubsztrátspecificitásában nincs szerepe, az Asp19-nek a jelentősége az autoaktiváció gátlásában van. Az általunk vizsgált tripszinogén aktivációs peptid mutációk a pancreasban a jelentősen gyorsult autoaktiválódás miatt okozhatnak tripszinfelszaporodást. Az autoaktiváció sebessége vad típusú kationos tripszinogén esetében 60 (pH=8,0 ), illetve 70 perc (pH=5,0) t½-vel jellemezhető, a K23R mutánsnál t½ =3 illetve 7 perc, a D22G mutánsnál t½ =2,5 illetve 28 perc, a D19A mutánsnál t½ =12,5 illetve 55 perc. Összehasonlítva a szintén autoaktivációs sebességet növelő N29I (t½ =24 illetve 34 perc) és R122H (t½ = 40 illetve 45 perc) kationos tripszinogén mutánsokkal, a K23R és D22G mutánsok autoaktiválási sebességet növelő hatása különösen szembetűnő.
90
4. A kationos tripszinogén Arg122 vizsgálata, a hasított tripszinogén (Tg1*) tripszin inhibitor tulajdonsága A tripszin az Arg122-Val123 peptidkötést hidrolizálja és reszintetizálja. Ebből következik, hogy a tripszinogént felfoghatjuk egy olyan tipikus tripszin inhibitornak, aminek aktív helye az Arg122. Az általunk felismert Tg1* mint tripszin inhibitor az irodalomban egyedülálló. Ez a Tg1* két lényeges tulajdonságának köszönhető: 1. A tripszin zimogénjének hasított formája (Tg1*) gátolja a tripszin aktivitását 2. A tripszinogén mint tripszin inhibitor rendkívül gyorsan hasad. Ezzel szemben az irodalomból ismert tipikus tripszin inhibitorok aktív helyén a hasadás mérhetetlenül lassú. A kationos tripszinogén ↔ Tg1* folyamat egyensúlyi állandója Ca2+ függő. Ca2+ mentes közeg a Tg1* kialakulásának (Khid=5,4); míg a Ca2+ az intakt forma kialakulásának kedvez (Khid=0,7). A Tg1* gyenge inhibitor, Ki=80 μM. Fentiek értelmében az inhibitor hatás acinus sejtekben, magas, mM nagyságrendű tripszinogén koncentrációnál és alacsony, μM nagyságrendű Ca2+ koncentráció mellett lehet számottevő. Elképzelhető, hogy pathológiás folyamatok esetében a Tg1* tripszin inhibitor hatása kiegészíti a PSTI tripszinnel szembeni védő hatását. A vékonybélben az emésztési folyamatokat a Tg1* inhibitor hatása nem befolyásolja. Ez egyrészt a magas Ca2+ szintnek köszönhető, ami az intakt tripszinogén, illetve tripszinképződésnek kedvez, másrészt a doudenum tripszinkoncentrációja (4-40 μM) a Ki érték (80 μM) alatt van. Megállapítottuk, hogy a humán kationos tripszinogén Arg122 helye a legérzékenyebb autolitikus hely, azonban -szemben az állati tripszinogének Arg122 helyével – az Arg122-Val123 peptidkötés hasadása nem vezet gyors és teljeskörű autolízishez, ugyanis az Arg122-Val123 peptidkötés hidrolízisétől függetlenül a következő, másodlagos hidrolitikus lépés(ek) sebessége kb. 2000-szer lassúbb(ak). Továbbá az Arg122-Val123 peptidkötés hasadása után a tripszin hatására Ca2+ - függő módon visszaszintetizálódik peptidkötéssé. Eredményeink nem támasztják alá azt a nézetet, hogy a humán kationos tripszin gyors autolízisének beindító lépése az Arg122Val123 peptidkötés hidrolízise lenne. Ugyanakkor az Arg122-Val123 peptidkötés 91
kicserélése a tripszin-rezisztens His122-Val123 kötésre (R122H mutáció) hosszabb távon (több óra inkubálás) a tripszin stabilitását növeli, ami az intracelluláris tripszin szint növelésével hozzájárulhat pancreatitis kialakulásához. Mivel az R122H mutáció a hasított tripszinogén forma, vagyis a tripszin inhibitor kialakulását megakadályozza, felvetődik, hogy a Tg1* okozta tripszin aktivitás gátlás kiesése is szerepet játszhat a pancreatitis kialakulásában.
92
8. Összefoglaló Bevezetés A krónikus pancreatitis incidenciája 3,5-35/100000, ennek 10-20 %-a örökletes pancreatitis. A pancreatitis kezdő lépése az idő előtti tripszinképződés a pancreasban,
ami
a
pancreatikus
emésztőenzimek
aktiválásával
gyulladásos
folyamatokat indíthat el. A pancreasban háromféle tripszinogén izoforma termelődik. Ezek közül a kationos tripszinogén (CatTg) és az anionos tripszinogén (AnTg) expresszálódik nagyobb mennyiségben, a harmadik, a mezotripszinogén az összes tripszinogénnek kb. 5 %-a. Fiziológiás körülmények között a CatTg: AnTg arány 2/1, ami pancreatitisben gyakran 1/2-re változik. Az első pancreatitisszel összefüggő mutációt, a CatTg R122H-t 1996-ban írták le, amit eddig kb. húsz egyéb mutáció leírása követett. Célkitűzések 1. Rekombináns humán pancreatikus tripszinogének biokémiai jellemzése 2. Fiziológiás (2/1) és pathológiás (1/2) összetételű CatTg: AnTg keverékek biokémiai sajátságainak in vitro tanulmányozása 3. A CatTg tripszinogén aktivációs peptidjében (TAP) előforduló mutációk biokémiai következményének jellemzése 4. Az Arg122
helyen
hasított
kationos
tripszinogén
(CatTg*)
tripszin
inhibitor
tulajdonságának bizonyítása és a CatTg* inhibitor tulajdonságainak jellemzése. Módszerek Tripszinaktivitás mérés: kromogén szubsztráttal. Tripszinogének aktiválása, degradációja: gélelektroforézis segítségével. Autoaktiváció és autolízis vizsgálata: a pancreas acinus sejtekre (pH = 8,0; μM Ca2+ illetve Ca2+ depléció); pancreas lizoszómára (pH = 5,0); valamint duodenumra (pH = 8,0; 1 mM Ca2+) jellemző közegben. Eredmények Az AnTg (ellentétben a CatTg-vel) pH = 8,0-on, Ca2+ szegény médiumban gyorsan autolizál, pH = 5,0-nél pedig gyakorlatilag nem autoaktiválódik, ezért ilyen körülmények között csak alig mérhető tripszin képződik. Pathológiás összetételű tripszinogén keverékeknél a pancreas acinus sejtekre jellemző körülmények között a tripszinaktivitás a fiziológiásnak kb. fele. „Duodenális” környezetben nincs szignifikáns különbség. A TAP mutációk (D19A, D22G, K23R) valamennyi vizsgálati körülmény mellett fokozott autoaktivációt okoztak. A tripszin a CatTg Arg122-Val123 peptidkötését hidrolizálja, majd reszintetizálja. Az Arg122 tehát nem az autolízis iniciációjának helye. A CatTg* kanonikus proteáz inhibitorként viselkedik, de egyben proteáz is, ezért egyedülálló a tripszin inhibitorok között. A CatTg ↔ CatTg* átalakulás Ca2+ függő, a CatTg* keletkezésnek a Ca2+ hiány kedvez. A CatTg* gyenge inhibitor, 93
Ki = 80 μM. Következtetések 1. A pancreasra jellemző körülmények között az AnTg gyors autolízist szenved, illetve inaktiválódik, a CatTg kevésbé érintett. 2. A CatTg : AnTg arány pathológiás körülmények között bekövetkező megváltozásának pancreast védő hatása lehet, mert csökkenti a pancreas tripszinszintjét. 3. A CatTg TAP mutációi az autoaktiválás sebességének növekedését okozzák, ez eredményezheti a pancreatitis megnövekedett kockázatát. 4. A humán CatTg* tripszin inhibitor viselkedése egyedülálló, eddig nem ismert megfigyelés. A CatTg R122H mutációja az inhibitor tulajdonság kiesését okozza, így elősegítheti a pancreatitis kialakulását.
94
9. Summary Characterisation of the trypsinogen and mutations of trypsinogen activation peptide and their role in the pathogenesis of herediter chronic pancreatitis Introduction: Incidence of chronic pancreatitis is 3,5-35/100000 in advanced countries, 10-20 % of the cases are hereditary pancreatitis. The initial step of pancreatitis is premature trypsin generation in the pancreas, that can activate pancreatic digestive enzymes and initiate inflammation processes. Three trypsinogen isoforms are expressed in the pancreas. Two forms – the cationic trypsinogen (CatTg) and the anionic trypsinogen (AnTg) – express in bulk, the third one, mesotrypsinogen is approximately 5 % of the total trypsinogen quantity. The ratio of CatTg vs. AnTg is 2/1 under physiological conditions, that can change to 1/2 in pancreatitis. The first pancreatitis associated mutation, CatTg R122H was described in 1996, followed by about 20 others later. Aims: 1. Biochemical characterization of recombinant human pancreatic trypsinogens. 2. In vitro investigation of CatTg-AnTg mixtures of physiological (2/1) and pathological (1/2) composition. 3. Characterization of mutations of trypsinogen activation peptide (TAP) of CatTg. 4. Validation and characterization of the inhibitory property of CatTg cleaved at Arg122 (CatTg*) on trypsin activity Methods: Determination of trypsin activity was based on the cleavage of chromogenic substrate. Activation and degradation of trypsinogen was studied by gel electrophoresis. For analysis of activation and autolysis pancreatic acinar (pH 8.0, absence of Ca2+), pancreatic lysosomal (pH 5.0) and duodenic (pH 8.0, 1 mM Ca2+) conditions were used. Results:
In contrast with the CatTg, AnTg suffer rapid autodegradation in Ca2+
deficient, pH = 8.0 medium whereas at pH = 5.0 its autoactivation is extremely slow, therefore under these conditions only trace amounts of trypsin is formed. In acinar conditions the trypsin activity of pathological composition of trypsinogens is roughly half of that of the physiological composition. Significant change in the duodenal milieu was not found. The mutations of TAP (D19A, D22G, K23R) cause increased autoactivation under all of the conditions studied. Hydrolysis by trypsin of the Arg122Val123 peptide bond of CatTg is followed by resynthesis of the bond. Accordingly, Arg122 is not an initiation site for autolysis, rather the CatTg* behaves as a unique canonical inhibitor of trypsin. The CatTg ↔ Tg1* conversion is Ca2+ dependent, 95
absence of Ca2+ favors CatTg* formation. CatTg* is a weak inhibitor, Ki = 80 μM. Conclusions: 1. AnTg is rapidly degraded or inactivated under acinar conditions of pancreas whereas CatTg is less affected. 2. Change of the 2/1 ratio of CatTg vs. AnTg to 1/2 could be protective for the pancreas, because it decreases the pancreatic trypsin level. 3. The TAP mutations of CatTg lead to increased rate of autoactivation resulting in an augmented risk of pancreatitis. 4. The behavior of human CatTg* as a protease inhibitor is a genuine and unique observation. The CatTg R122H mutation causes loss of this inhibitor property and may therefore be a risk factor of the chronic pancreatitis.
96
10. Köszönetnyílvánítás Köszönöm mesteremnek, prof. dr. Tóth Miklós egyetemi tanárnak, hogy megtanított a kísérletek megtervezésére és technikai kivitelezésére, egyengette utamat az egyetemen és kongresszusi részvételeken egyaránt. Köszönöm a tanácsokat és azt, hogy figyelmemet a tudomány egy igen fontos és érdekes területe, a pathobiokémia felé fordította, valamint a lehetőséget, hogy hosszú amerikai tanulmányútra mehessek. Köszönetet mondok dr. Sahin-Tóth Miklósnak, aki lehetővé tette, hogy laboratóriumaiban 2,5 évet eltöltsek, elvégezhessem azt a munkát, amin ez a disszertáció alapul. Neki köszönhetem a tripszinekről és a krónikus pancreatitisről szóló tudásomat. Laboratóriumában sajátítottam el a tripszinogén és egyéb fehérjék (ecotin, PSTI) expresszió technikáját, az aktivitás méréseket. Reggeli és napközbeni kávézásaink alkalmával az elméleti háttérről lehetett sokat tanulni. Még budapesti együttműködésünk alkalmával a western-blot technikámat tökéletesítette. Köszönöm a bizalmat és a barátságot, hogy befogadott otthonába az amerikai tanulmányút elején, és egy év múlva segített a kontinensen átkelni, új otthont teremteni Bostonban. Köszönöm prof. dr. Mandl József akadémikusnak, a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet igazgatójának, hogy helyet biztosított számomra intézetében, a bizalmat és türelmet, melyet irányomban tanúsított. Köszönöm kedves barátaimnak, dr. Valent Sándornak és Szmola Richárdnak az együtt töltött órákat a laboratóriumban. Köszönöm dr. Ronald Kabacknek, hogy Los Angelesben helyet biztosított laboratóriumában kísérleteink elvégzéséhez. Köszönettel tartozom külföldi partnereinknek; J.M. Chennek, C. Ferecnek, M. Lerchnek, W. Halangk-nak, N. Teichnek, hogy az új mutációk felfedezésekor a mutációk biokémiai analízisét ránk bízták. Köszönet illeti Bérczi Esztert, aki Budapesten segítette munkámat. Köszönöm Szabó Csillának a könyvtári segítséget és a helyet a könyvtárban, mellyel sokat lendített azon, hogy az értekezést megírhassam. Köszönöm Bajkó Ágnesnek a sok segítségét. 97
Köszönet illeti meg a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémia Intézet; a Department of Physiology, University of California Los Angeles és a Department of Molecular and Cell Biology, Boston University dolgozóit, akik segítették munkámat. Köszönöm családomnak, hogy lehetővé tették továbbtanulásomat, munkámat, és segítettek, hogy a hosszú külföldi utat rövidebbnek érezhessem.
98
11. Irodalomjegyzék 11.1. Saját közlemények jegyzéke 11.1.1. Az értekezés támájával összefüggő közlemények, előadások, poszterek 11.1.1.1. Cikkek 1. Kukor Z, Tóth M, Pál G, Sahin-Tóth M. Human cationic trypsinogen. Arg(117) is the reactive site of an inhibitory surface loop that controls spontaneous zymogen activation. J Biol Chem. 2002 Feb 22;277(8):6111-7. Epub 2001 Dec 17 2. Kukor Z, Mayerle J, Kruger B, Tóth M, Steed PM, Halangk W, Lerch MM, SahinTóth M. Presence of cathepsin B in the human pancreatic secretory pathway and its role in trypsinogen activation during hereditary pancreatitis. J Biol Chem. 2002 Jun 14;277(24):21389-96. Epub 2002 Apr 03 3 . Kukor Z, Tóth M, Sahin-Tóth M. Human anionic trypsinogen: properties of autocatalytic activation and degradation and implications in pancreatic diseases. Eur J Biochem. 2003 May;270(9):2047-58 4. Chen JM, Kukor Z, Le Marechal C, Tóth M, Tsakiris L, Raguenes O, Ferec C, Sahin-Tóth M. Evolution of trypsinogen activation peptides. Mol Biol Evol. 2003 Nov;20(11):1767-77. Epub 2003 Jun 27 5. Szmola R, Kukor Z, Sahin-Tóth M. Human mesotrypsin is a unique digestive protease specialized for the degradation of trypsin inhibitors. J Biol Chem. 2003 Dec 5;278(49):48580-9. Epub 2003 Sep 24 6. Teich N, Le Marechal C, Kukor Z, Caca K, Witzigmann H, Chen JM, Tóth M, Mossner J, Keim V, Ferec C, Sahin-Tóth M. Interaction between trypsinogen isoforms in genetically determined pancreatitis: mutation E79K in cationic trypsin (PRSS1) causes increased transactivation of anionic trypsinogen (PRSS2). Hum Mutat. 2004 Jan;23(1):22-31 11.1.1.2. Előadások, poszterek, idézhető absztraktok 1. Z. Kukor, R. Szmola, M. Sahin-Tóth Human Mesotrypsin Rapidly Degrades Trypsin Inhibitors 99
Pancreatology 2003;3:429–441 2. R. Szmola, Z. Kukor, M. Sahin-Tóth Cathepsin B Preferentially Activates Mesotrypsinogen of the Three Human Trypsinogen Soforms Pancreatology 2003;3:429–441 3. R. Szmola, Z. Kukor, M. Sahin-Tóth The Evolutionary G198R Mutation is Responsible for the Inhibitor Resistance and Substrate Restriction of Human Mesotrypsin Pancreatology 2003;3:429–441 4. J. Mayerle, Z. Kukor, B. Krüger, M. Tóth, P.M. Steed, W. Halangk, M.M. Lerch, M. Sahin-Tóth Presence of Cathepsin B in the Human Pancreatic Secretory Pathway and Its Role in Trypsinogen Activation During Hereditary Pancreatitis Pancreatology 2002;2:217–361 5. Szmola R, Kukor Z, Sahin-Tóth Az evolúciós G198R mutáció szerepe a humán mezotripszin biológiai funkciójában Magyar gasztroenterológiai társaság 46. Nagygyűlés, 2004.
11.1.2. A disszertáció témájával nem összefüggő közlemények 1. Kukor Z, Tóth M. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent NO-synthesizing activities of human primordial placenta Acta Physiol Hung. 1994 82(4):313-9 2. Tóth M, Kukor Z, Romero R, Hertelendy F Nitric-oxide synthase in first-trimester human placenta- characterization and subcellular-distribution Hypertension in pregnancy 1995 14 (3): 287-300 3. Kukor Z, Mészáros G, Hertelendy F, Tóth M. Calcium-dependent nitric oxide synthesis is potently stimulated by tetrahydrobiopterin in human primordial placenta. Placenta. 1996 Jan;17(1):69-73 4. Tóth M, Kukor Z, Sahin-Tóth M. Activation and dimerization of type III nitric oxide synthase by submicromolar concentrations of tetrahydrobiopterin in microsomal preparations from human primordial placenta. Placenta. 1997 Mar-Apr;18(2-3):189-96 5. Sahin-Tóth M, Kukor Z, Tóth M.
100
Tetrahydrobiopterin preferentially stimulates activity and promotes subunit aggregation of membrane-bound calcium-dependent nitric oxide synthase in human placenta. Mol Hum Reprod. 1997 Apr;3(4):293-8 6. Tóth M, Kukor Z, Sahin-Tóth M. Differential response of basal and tetrahydrobiopterin-stimulated activities of placental type III nitric oxide synthase to sodium dodecyl sulphate: relation to dimeric structure. Mol Hum Reprod. 1998 Dec;4(12):1165-72 7. Kukor Z, Valent S, Tóth M. Regulation of nitric oxide synthase activity by tetrahydrobiopterin in human placentae from normal and pre-eclamptic pregnancies. Placenta. 2000 Nov;21(8):763-72 8. Tóth M, Kukor Z, Valent S. Chemical stabilization of tetrahydrobiopterin by L-ascorbic acid: contribution to placental endothelial nitric oxide synthase activity. Mol Hum Reprod. 2002 Mar;8(3):271-80
101
11.2. Felhasznált irodalom 1
Keim V, Teich N, Mossner J Trypsinogen mutations in hereditary pancreatitis: which nomenclature is convenient? Gut. 2000 Jun;46(6):873 2
Antonarakis SE Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group Hum Mutat. 1998;11(1):1-3 3
Chen JM, Ferec C Wanted: a consensus nomenclature for cationic trypsinogen mutations Gastroenterology. 2000 Jul;119(1):277 4
Teich N, Ockenga J, Keim V, Mössner J Genetic risk factors in chronic pancreatitis J Gastroenterol 2002 (37) 1-9 5
Witt H, Becker M Genetics of chronic pancreatitis J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2002 Feb;34(2):125-36 6
Chari ST, Singer MV The problem of classification and staging of chronic pancreatitis. Proposals based on current knowledge of its natural history Scand J Gastroenterol. 1994 Oct;29(10):949-60 7
Homma T Criteria for pancreatic disease diagnosis in Japan: diagnostic criteria for chronic pancreatitis Pancreas. 1998 Apr;16(3):250-4 8
Sarles H Proposal adopted unanimously by the participants of the symposium on pancreatitis at Marseilles Bibl Gastroenterol 1963 Vol7: VII-VIII 9
Sarner M, Cotton PB Classification of pancreatitis Gut. 1984 Jul;25(7):756-9 10
Singer MV, Gyr K, Sarles H. Revised classification of pancreatitis. Report of the Second International Symposium on the Classification of Pancreatitis in Marseille, France, March 28-30, 1984 Gastroenterology. 1985 Sep;89(3):683-5 102
11
Bradley EL 3rd A clinically based classification system for acute pancreatitis. Summary of the International Symposium on Acute Pancreatitis, Atlanta, Ga, September 11 through 13, 1992 Arch Surg. 1993 May;128(5):586-90 12
Magyar Imre Rövid belgyógyászat Egyetemi Tankönyv,1984 13
Tierney LM, McPhee SJ, Papadakis MA Korszerű orvosi diagnosztika és terápia Kézikönyv, 2003 14
O'keefe SJ, Lee RB, Li J, Stevens S, Abou-Assi S, Zhou W Trypsin Secretion and Turnover in Patients with Acute Pancreatitis Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005 Feb 10 15
Gorry MC, Gabbaizedeh D, Furey W, Gates LK Jr, Preston RA, Aston CE, Zhang Y, Ulrich C, Ehrlich GD, Whitcomb DC Mutations in the cationic trypsinogen gene are associated with recurrent acute and chronic pancreatitis Gastroenterology. 1997 Oct;113(4):1063-8 16
Ochi F, Fujii M, Sakai T, Sugano M, Oshiro K, Okabayashi Y, Mita M, Kido Y A case of acute pancreatitis associated with cationic trypsinogen N29T mutation Pancreas. 2003 Aug;27(2):199-201 17
Gomez-Lira M, Bonamini D, Castellani C, Unis L, Cavallini G, Assael BM, Pignatti PF Mutations in the SPINK1 gene in idiopathic pancreatitis Italian patients Eur J Hum Genet. 2003 Jul;11(7):543-6
18
Maire F, Bienvenu T, Ngukam A, Hammel P, Ruszniewski P, Levy P Frequency of CFTR gene mutations in idiopathic pancreatitis Gastroenterol Clin Biol. 2003 Apr;27(4):398-402 19
Taylor SL, Morgan DL, Denson KD, Lane MM, Pennington LR A comparison of the Ranson, Glasgow, and APACHE II scoring systems to a multiple organ system score in predicting patient outcome in pancreatitis Am J Surg. 2005 Feb;189(2):219-22 20
Gaál Csaba szerk. Sebészet Egyetemi tankönyv 1992
103
21
Malka D, Hammel P, Sauvanet A, Rufat P, O'Toole D, Bardet P, Belghiti J, Bernades P, Ruszniewski P, Levy P Risk factors for diabetes mellitus in chronic pancreatitis Gastroenterology. 2002 119:1324 22
Lin Y, Tamakoshi A, Hayakawa T, Ogawa M, Ohno Y Associations of alcohol drinking and nutrient intake with chronic pancreatitis: findings from a case-control study in Japan Am J Gastroenterol. 2001 Sep;96(9):2622-7 23
Otsuki M Chronic pancreatitis in Japan: epidemiology, prognosis, diagnostic criteria, and future problems J Gastroenterol. 2003;38(4):315-26 24
Gorelick FS. Alcohol and zymogen activation in the pancreatic acinar cell Pancreas. 2003 Nov;27(4):305-10 25
Tandon RK, Garg PK Tropical pancreatitis 26
K K Barman, G Premalatha, V Mohan Tropical chronic pancreatitis Postgrad Med J 2003;79:606–615 27
Bhatia E, Choudhuri G, Sikora SS, Landt O, Kage A, Becker M, Witt H Tropical calcific pancreatitis: strong association with SPINK1 trypsin inhibitor mutations Gastroenterology. 2002 Oct;123(4):1020-5 28
Rossi L, Pfutzer RH, Parvin S, Ali L, Sattar S, Kahn AK, Gyr N, Whitcomb DC SPINK1/PSTI mutations are associated with tropical pancreatitis in Bangladesh. A preliminary report. Pancreatology. 2001;1(3):242-5 29
Lempinen M, Paju A, Kemppainen E, Smura T, Kylanpaa ML, Nevanlinna H, Stenman J, Stenman UH Mutations N34S and P55S of the SPINK1 gene in patients with chronic pancreatitis or pancreatic cancer and in healthy subjects: a report from Finland Scand J Gastroenterol. 2005 Feb;40(2):225-30 30
Whitcomb DC Genetic predisposition to alcoholic chronic pancreatitis Pancreas. 2003 Nov;27(4):321-6
104
31
Truninger K, Ammann RW, Blum HE, Witt H Genetic aspects of chronic pancreatitis: insights into aetiopathogenesis and clinical implications Swiss Med Wkly. 2001 Oct 6;131(39-40):565-74 32
Szmola R, Kukor Z, Sahin-Toth M. Human mesotrypsin is a unique digestive protease specialized for the degradation of trypsin inhibitors. J Biol Chem. 2003 Dec 5;278(49):48580-9. Epub 2003 Sep 24 33
Chen JM, Le Marechal C, Lucas D, Raguenes O, Ferec C "Loss of function" mutations in the cationic trypsinogen gene (PRSS1) may act as a protective factor against pancreatitis Mol Genet Metab. 2003 May;79(1):67-70 34
Sahin-Tóth M, Tóth M Gain-of-Function Mutations Associated with Hereditary Pancreatitis Enhance Autoactivation of Human Cationic Trypsinogen Biochem Biophys Res Commun. 2000 Nov 19;278(2):286-9 35
Sahin-Tóth M, Tóth M A tripszinogén gén mutációinak jelentősége az örökletes hasnyálmirigy-gyulladás kóroktanában Orvosi hetilap 2001 142(12): 603-606 36
Seta T, Noguchi Y, Shimada T, Shikata S, Fukui T. Treatment of acute pancreatitis with protease inhibitors: a meta-analysis Eur J Gastroenterol Hepatol. 2004 Nov;16(12):1287-93 37
Comfort MW, Steinberg AG. Pedigree of a family with hereditary chronic relapsing pancreatitis Gastroenterology. 1952 May;21(1):54-63 38
Le Bodic L, Bignon JD, Raguenes O, Mercier B, Georgelin T, Scnee M , Soulard M, Gagne K, Bonneville F, Muller JY, Bachner L, Ferec C The hereditary pancreatitis gene maps to long arm of chromosome 7. Hum Mol Genet. 1996 Apr;5(4):549-54
39
Pandya A, Blanton SH, Landa B, Javaheri R, Melvin E, Nance WE, Markello T Linkage studies in a large kindred with hereditary pancreatitis confirms mapping of the gene to a 16-cM region on 7q Genomics. 1996 Dec 1;38(2):227-30 40
Whitcomb DC, Preston RA, Aston CE, Sossenheimer MJ, Barua PS, Zhang Y, Wong-Chong A, White GJ, Wood PG, Gates LK Jr, Ulrich C, Martin SP, Post JC, Ehrlich GD A gene for hereditary pancreatitis maps to chromosome 7q35 105
Gastroenterology. 1996 Jun;110(6):1975-80 41
Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA, Furey W, Sossenheimer MJ, Ulrich CD, Martin SP, Gates LK Jr, Amann ST, Toskes PP, Liddle R, McGrath K, Uomo G, Post JC, Ehrlich GD Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsinogen gene Nat Genet. 1996 Oct;14(2):141-5 42
Gress TM, Micha AE, Lacher U, Adler G Diagnosis of a "hereditary pancreatitis" by the detection of a mutation in the cationic trypsinogen gene Dtsch Med Wochenschr. 1998 Apr 9;123(15):453-6 43
Teich N, Mossner J, Keim V Screening for mutations of the cationic trypsinogen gene: are they of relevance in chronic alcoholic pancreatitis? Gut. 1999 Mar;44(3):413-6. 44
www.uni-leipzig.de/pancreasmutation
45
Lee WJ, Kim KA, Lee JS, Jeon YB, Jeong JB, Ryu JK, Kim YT, Yoon YB, Kim CY Cationic trypsinogen gene mutation in patients with chronic idiopathic pancreatitis Korean J Gastroenterol. 2004 Jan;43(1):41-6
46
Kim JY, Choi SH, Ihm JS, Kim SJ, Kim IJ, Kim CM. A Case of R122H Mutation of Cationic Trypsinogen Gene in a Pediatric Patient with Hereditary Pancreatitis Complicated by Pseudocyst and Hemosuccus Pancreaticus Korean J Gastroenterol. 2005 Feb;45(2):130-6 47
Truninger K, Kock J, Wirth HP, Muellhaupt B, Arnold C, von Weizsacker F, Seifert B, Ammann RW, Blum HE Trypsinogen gene mutations in patients with chronic or recurrent acute pancreatitis Pancreas. 2001 Jan;22(1):18-23 48
Howes N, Lerch MM, Greenhalf W, Stocken DD, Ellis I, Simon P, Truninger K, Ammann R, Cavallini G, Charnley RM, Uomo G, Delhaye M, Spicak J, Drumm B, Jansen J, Mountford R, Whitcomb DC, Neoptolemos JP Clinical and genetic characteristics of hereditary pancreatitis in Europe Clin Gastroenterol Hepatol. 2004 Mar;2(3):252-61 Howes N, Greenhalf W, Stocken DD, Neoptolemos JP Cationic trypsinogen mutations and pancreatitis Gastroenterol Clin North Am. 2004 Dec;33(4):767-87
49
Idris MM, Bhaskar S, Reddy DN, Mani KR, Rao GV, Singh L, Chandak GR Mutations in anionic trypsinogen gene are not associated with tropical calcific pancreatitis 106
Gut. 2005 May;54(5):728-9 50
Nemoda Z, Teich N, Hugenberg C, Sahin-Toth M Genetic and Biochemical Characterization of the E32del Polymorphism in Human Mesotrypsinogen Pancreatology. 2005 Apr 22;5(2-3):273-278 51
Rinderknecht H, Adham NF, Renner IG, Carmack C A possible zymogen self-destruct mechanism preventing pancreatic autodigestion Int J Pancreatol. 1988 Jan-Feb;3(1):33-44 52
Chen JM, Mercier B, Audrezet MP, Ferec C Mutational analysis of the human pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) gene in hereditary and sporadic chronic pancreatitis J Med Genet. 2000 Jan;37(1):67-9 53
Witt H, Luck W, Hennies HC, Classen M, Kage A, Lass U, Landt O, Becker M. Mutations in the gene encoding the serine protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis Nat Genet. 2000 Jun;25(2):213-6 54
Witt H, Luck W, Becker M, Bohmig M, Kage A, Truninger K, Ammann RW, O'Reilly D, Kingsnorth A, Schulz HU, Halangk W, Kielstein V, Knoefel WT, Teich N, Keim V. Mutation in the SPINK1 trypsin inhibitor gene, alcohol use, and chronic pancreatitis JAMA. 2001 Jun 6;285(21):2716-7 55
Castellani C, Picci L, Scarpa M, Dechecchi MC, Zanolla L, Assael BM, Zacchello F Cystic fibrosis carriers have higher neonatal immunoreactive trypsinogen values than non-carriers Am J Med Genet A. 2005 Apr 14;:9999 [Epub ahead of print] 56
Perlmutter DH. Alpha-1-antitrypsin deficiency. Semin Liver Dis 1998; 18:217–25 57
Sharp HL, Bridges RA, Krivit W. Cirrhosis associated with alpha-1-antitrypsin deficiency: a previously unrecognized inherited disorder. J Lab Clin Med 1969; 73:934–9. 58
Eriksson S. Pulmonary emphysema and [alpha]1-antitrypsin deficiency. Acta Med Scand 1964; 175:197–205. 59
Hutchison DCS. Alpha1-antitrypsin deficiency in Europe: geographical distribution of Pi types S and Z. 107
Respir Med 1998; 92:367–77 60
Novis BH, Young GO, Bank S, Marks IN. Chronic pancreatitis and alpha-1-antitrypsin. Lancet 1975; 2:748-9. 61
Mihas AA, Hirschowitz BI. Alpha1-antitrypsin and chronic pancreatitis. Lancet 1976; 2:1032–3. 62
Edmunds SEJ, Wilkinson ML. Alpha 1-antitrypsin deficiency and pancreatitis in a juvenile. Aust N Z J Med 1991; 21:345–7. 63
Rabassa AA, Schwartz MR, Ertan A. [alpha]1-antitrypsin deficiency and chronic pancreatitis. Dig Dis Sci 1995; 40:1997–2001. 64
Braxel C, Versieck J, Lemey G, Vanballenberghe L, Barbier F Alpha1-antitrypsin in pancreatitis. Digestion 1982; 23:93–6.
65
Lankisch PG, Koop H, Winckler K, Kaboth U Alpha1-antitrypsin in pancreatic diseases. Digestion 1978; 18:138–40. 66
Haber PS, Wilson JS, McGarity BH, Hall W, Thomas MC, Pirola RC Alpha1 antitrypsin phenotypes and alcoholic pancreatitis. Gut 1991; 32:945–8. 67
Witt H, Becker M Genetics of chronic pancreatitis J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2002 Feb;34(2):125-36 68
Katona G, Berglund GI, Hajdu J, Graf L, Szilagyi L. Crystal structure reveals basis for the inhibitor resistance of human brain trypsin J Mol Biol. 2002 Feb 1;315(5):1209-18 69
Ádám V, Dux L, Faragó A, Fésüs L, Machovich R, Mandl J, Sümegi B Orvosi biokémia Egyetemi tankönyv 2001. (2. kiadás) 70
Craik CS, Largman C, Fletcher T, Roczniak S, Barr PJ, Fletterick R, Rutter WJ Redesigning trypsin: alteration of substrate specificity Science. 1985 Apr 19;228(4697):291-7
108
71
Abita JP, Delaage M, Lazdunski M The mechanism of activation of trypsinogen. The role of the four N-terminal aspartyl residues Eur J Biochem. 1969 Apr;8(3):314-24 72
Teich N, Ockenga J, Hoffmeister A, Manns M, Mossner J, Keim V Chronic pancreatitis associated with an activation peptide mutation that facilitates trypsin activation Gastroenterology. 2000 Aug;119(2):461-5 73
Brogden KA, Ackermann M, Huttner KM Small, anionic, and charge-neutralizing propeptide fragments of zymogens are antimicrobial Antimicrob Agents Chemother. 1997 Jul;41(7):1615-7 74
Rinderknecht H, Renner IG, Abramson SB, Carmack C Mesotrypsin: a new inhibitor-resistant protease from a zymogen in human pancreatic tissue and fluid Gastroenterology. 1984 Apr;86(4):681-92 75
Annukka Paju Trypsinogens and trypsin inhibitor (PSTI/TATI) expression in urogenital organs and tumors Academic dissertation 2001 Helsinki 76
Nyaruhucha CN, Kito M, Fukuoka SI. Identification and expression of the cDNA-encoding human mesotrypsin(ogen), an isoform of trypsin with inhibitor resistance J Biol Chem. 1997 Apr 18;272(16):10573-8 77
Kenesi E, Katona G, Szilagyi L Structural and evolutionary consequences of unpaired cysteines in trypsinogen Biochem Biophys Res Commun. 2003 Oct 3;309(4):749-54 78
Figarella C, Clemente F, Guy O On zymogens of human pancreatic juice FEBS Lett. 1969 Jun;3(5):351-353 79
Rinderknecht H, Renner IG Carmak Trypsinogen variants in pancreatic juice of healthy volunteers, chronic alcoholics, and patients with pancreatitis and cancer of the pancreas. Gut 1979 20, 886–891 80
Rinderknecht H, Renner IG, Abramson SB, Carmack C Mesotrypsin: a new inhibitor-resistant protease from a zymogen in human pancreatic tissue and fluid Gastroenterology. 1984 Apr;86(4):681-92 109
81
Broadway RM Dietary regulation of serine proteinases that are resistant to serine proteinase inhibitors J Insect Physiol. 1997 Sep;43(9):855-874 82
Estell, D. A., Wilson, K. A., and Laskowski, M., Jr. Thermodynamics and kinetics of the hydrolysis of the reactive-site peptide bond in pancreatic trypsin inhibitor (Kunitz) by Dermasterias imbricata trypsin 1 Biochemistry, 1980 19, 131–137 83
Nyaruhucha, C. N. M., Kito, M., and Fukuoka, S. I. Identification and expression of the cDNA-encoding human mesotrypsin(ogen), an isoform of trypsin with inhibitor resistance J. Biol. Chem. 1997 272, 10573–10578 84
Chen, J.-M., and Ferec, C. in Nature Encyclopedia of the Human Genome (Cooper, D. N., ed) 2003 Vol. 5, pp. 645–650, Nature Publishing Group,London 85
Darmoul D, Marie JC, Devaud H, Gratio V, Laburthe M Initiation of human colon cancer cell proliferation by trypsin acting at proteaseactivated receptor-2 Br J Cancer. 2001 Sep 1;85(5):772-9 86
Koivunen E, Saksela O, Itkonen O, Osman S, Huhtala ML, Stenman UH Human colon carcinoma, fibrosarcoma and leukemia cell lines produce tumorassociated trypsinogen Int J Cancer. 1991 Feb 20;47(4):592-6 87
Koivunen E, Huhtala ML, Stenman UH Human ovarian tumor-associated trypsin. Its purification and characterization from mucinous cyst fluid and identification as an activator of pro-urokinase J Biol Chem. 1989 Aug 25;264(24):14095-9 88
Paju A, Bjartell A, Zhang WM, Nordling S, Borgström A, Hansson J, Stenman UH Expression and characterization of trypsinogen produced in the human male genitaltruct Am J Pathol 2000 , 157:2011-2021 89
Hollenberg MD Proteinase-mediated signaling: proteinase-activated receptors (PARs) and much more Life Sci. 2003 Dec 5;74(2-3):237-46 90
Hollenberg MD, Compton SJ International Union of Pharmacology. XXVIII. Proteinase-activated receptors. Pharmacol Rev. 2002 Jun;54(2):203-17
110
91
Lan RS, Stewart GA, Henry PJ Role of protease-activated receptors in airway function: a target for therapeutic intervention? Pharmacol Ther. 2002 Sep;95(3):239-57 92
S. R. Macfarlane, M. J. Seatter, T. Kanke, G. D. Hunter, and R. Plevine Proteinase-Activated Receptors Pharmacol Rev 2001 53:245–282 93
Alvarez C, Regan JP, Merianos D, Bass BL Protease-activated receptor-2 regulates bicarbonate secretion by pancreatic duct cells in vitro Surgery. 2004 Sep;136(3):669-76 94
Sharma A, Tao X, Gopal A, Ligon B, Andrade-Gordon P, Steer ML, Perides G Protection against acute pancreatitis by activation of protease-activated receptor-2 Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005 Feb;288(2):G388-95 95
Yada K, Shibata K, Matsumoto T, Ohta M, Yokoyama S, Kitano S Protease-activated receptor-2 regulates cell proliferation and enhances cyclooxygenase2 mRNA expression in human pancreatic cancer cells. J Surg Oncol. 2005 Feb 1;89(2):79-85 96
Yamamoto T, Nakamura Y, Nishide J, Emi M, Ogawa M, Mori T, Matsubara K Molecular cloning and nucleotide sequence of human pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) cDNA Biochem Biophys Res Commun. 1985 Oct 30;132(2):605-12 97
Laskowski M, Wu FC Temporary inhibition of trypsin J Biol Chem. 1953 Oct;204(2):797-805 98
Kolho KL, Huhtala ML, Jalanko H, Rauramo I, Stenman UH Pancreatic secretory trypsin inhibitor from human amniotic fluid and fetal and neonatal urine: concentrations and physicochemical characterization Clin Chim Acta. 1986 Apr 30;156(2):123-9
99
Marchbank T, Freeman TC, Playford RJ Human pancreatic secretory trypsin inhibitor. Distribution, actions and possible role in mucosal integrity and repair Digestion. 1998;59(3):167-74 100
Szilagyi L, Kenesi E, Katona G, Kaslik G, Juhasz G, Graf L Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis J Biol Chem. 2001 Jul 6;276(27):24574-80. Epub 2001 Apr 18
111
101
Colomb E, Guy O, Deprez P, Michel R, Figarella C. The two human trypsinogens: catalytic properties of the corresponding trypsins Biochim Biophys Acta. 1978 Jul 7;525(1):186-93
102
Sahin-Toth M Human cationic trypsinogen. Role of Asn-21 in zymogen activation and implications in hereditary pancreatitis J Biol Chem. 2000 Jul 28;275(30):22750-5 103
Mallory PA, Travis J Human pancreatic enzymes. Characterization of anionic huyman trypsin Biochemistry. 1973 Jul 17;12(15):2847-51 104
Colomb E, Guy O, Deprez P, Michel R, Figarella C. The two human trypsinogens: catalytic properties of the corresponding trypsins Biochim Biophys Acta. 1978 Jul 7;525(1):186-93
105
Nyaruhucha CN, Kito M, Fukuoka SI Identification and expression of the cDNA-encoding human mesotrypsin(ogen), an isoform of trypsin with inhibitor resistance J Biol Chem. 1997 Apr 18;272(16):10573-8 106
Niederau C, Grendell JH Intracellular vacuoles in experimental acute pancreatitis in rats and mice are an acidified compartment J Clin Invest. 1988 Jan;81(1):229-36 107
Lerch MM, Gorelick FS. Early trypsinogen activation in acute pancreatitis Med Clin North Am. 2000 May;84(3):549-63 108
Chen JM, Kukor Z, Le Marechal C, Toth M, Tsakiris L, Raguenes O, Ferec C, Sahin-Toth M. Evolution of trypsinogen activation peptides. Mol Biol Evol. 2003 Nov;20(11):1767-77. Epub 2003 Jun 27 109
Maroux S, Baratti J, Desnuelle P Purification and specificity of porcine enterokinase J Biol Chem. 1971 Aug 25;246(16):5031-9 110
Lu D, Futterer K, Korolev S, Zheng X, Tan K, Waksman G, Sadler JE Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide J Mol Biol. 1999 Sep 17;292(2):361-73 111
Ru BG, Du JZ, Zeng YH, Chen LS, Ni YS, Tan GH, Zhang LX Active products of porcine trypsin after autolysis 112
Sci Sin. 1980 Nov;23(11):1453-60 112
Laskowski M, Qasim MA What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? Biochim Biophys Acta. 2000 Mar 7;1477(1-2):324-37 113
Estell DA, Laskowski M Jr Dermasterias imbricata trypsin 1: an enzyme which rapidly hydrolyzes the reactive-site peptide bonds of protein trypsin inhibitors Biochemistry. 1980 Jan 8;19(1):124-31 114
Cheng Y, Prusoff WH Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction Biochem Pharmacol. 1973 Dec 1;22(23):3099-108 115
Sahin-Toth M. Hereditary pancreatitis-associated mutation asn(21) --> ile stabilizes rat trypsinogen in vitro J Biol Chem. 1999 Oct 15;274(42):29699-704 116
Smith RL, Shaw E Pseudotrypsin. A modified bovine trypsin produced by limited autodigestion J Biol Chem. 1969 Sep 10;244(17):4704-12 117
Teich N, Ockenga J, Keim V, Mossner J Genetic risk factors in chronic pancreatitis J Gastroenterol. 2002 Jan;37(1):1-9 118
Sahin-Toth M, Toth M Gain-of-function mutations associated with hereditary pancreatitis enhance autoactivation of human cationic trypsinogen. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Nov 19;278(2):286-9 119
Sahin-Toth M The pathobiochemistry of hereditary pancreatitis: studies on recombinant human cationic trypsinogen Pancreatology. 2001;1(5):461-5 120
Sahin-Toth M, Toth M Significance of trypsinogen gene mutations in the etiology of hereditary pancreatitis Orv Hetil. 2001 Mar 25;142(12):603-6 121
Simon P, Weiss FU, Sahin-Toth M, Parry M, Nayler O, Lenfers B, Schnekenburger J, Mayerle J, Domschke W, Lerch MM. Hereditary pancreatitis caused by a novel PRSS1 mutation (Arg-122 --> Cys) that alters autoactivation and autodegradation of cationic trypsinogen 113
J Biol Chem. 2002 Feb 15;277(7):5404-10. Epub 2001 Nov 21 122
Teich N, Le Marechal C, Kukor Z, Caca K, Witzigmann H, Chen JM, Toth M, Mossner J, Keim V, Ferec C, Sahin-Toth M. Interaction between trypsinogen isoforms in genetically determined pancreatitis: mutation E79K in cationic trypsin (PRSS1) causes increased transactivation of anionic trypsinogen (PRSS2). Hum Mutat. 2004 Jan;23(1):22-31 123
Teich N, Nemoda Zs, Köhlen H, Heinritz W, Mössner J, Keim V, Sahin-Tóth M Gene conversion between functional trypsinogen genes PRSS1 and PRSS2 associated with chronic pancreatitis in asix-year-old girl Human mutation 2005;25:343-347
124
Figarella C, Miszczuk-Jamska B, Barrett AJ Possible lysosomal activation of pancreatic zymogens. Activation of both human trypsinogens by cathepsin B and spontaneous acid. Activation of human trypsinogen 1 Biol Chem Hoppe Seyler. 1988 May;369 Suppl:293-8 125
Kukor Z, Mayerle J, Kruger B, Tóth M, Steed PM, Halangk W, Lerch MM, SahinTóth M. Presence of cathepsin B in the human pancreatic secretory pathway and its role in trypsinogen activation during hereditary pancreatitis. J Biol Chem. 2002 Jun 14;277(24):21389-96. Epub 2002 Apr 03
126
Szilagyi L, Kenesi E, Katona G, Kaslik G, Juhasz G, Graf L Comparative in vitro studies on native and recombinant human cationic trypsins. Cathepsin B is a possible pathological activator of trypsinogen in pancreatitis J Biol Chem. 2001 Jul 6;276(27):24574-80. Epub 2001 Apr 18 127
Zhao M, Antunes F, Eaton JW, Brunk UT Lysosomal enzymes promote mitochondrial oxidant production, cytochrome c release and apoptosis Eur J Biochem. 2003 Sep;270(18):3778-86 128
Raraty M, Ward J, Erdemli G, Vaillant C, Neoptolemos JP, Sutton R, Petersen OH Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 21;97(24):13126-31 129
Mooren FCh, Hlouschek V, Finkes T, Turi S, Weber IA, Singh J, Domschke W, Schnekenburger J, Kruger B, Lerch MM Early changes in pancreatic acinar cell calcium signaling after pancreatic duct obstruction J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):9361-9. Epub 2003 Jan 8
114
130
Rinderknecht H Activation of pancreatic zymogens. Normal activation, premature intrapancreatic activation, protective mechanisms against inappropriate activation Dig Dis Sci. 1986 Mar;31(3):314-21 131
McCutcheon AD A fresh approach to the pathogenesis of pancreatitis Gut. 1968 Jun;9(3):296-310 132
Talbot RW, Grant DA, Hermon-Taylor J Displacement of endogenous enterokinase into portal venous blood and bile following luminal perfusion of proximal small intestine in guinea pigs Dig Dis Sci. 1984 Nov;29(11):1009-14 133
Grant DA, Talbot RW, Hermon-Taylor J Catalytically active enterokinase in human bile Clin Chim Acta. 1984 Sep 15;142(1):39-45 134
Saluja A, Saluja M, Villa A, Leli U, Rutledge P, Meldolesi J, Steer M. Pancreatic duct obstruction in rabbits causes digestive zymogen and lysosomal enzyme colocalization J Clin Invest. 1989 Oct;84(4):1260-6 135
Greenbraum LM, Hirshkowitz A, Shoichet I The activation of trypsinogen by cathepsin B J Biol Chem. 1959 Nov;234:2885-90 136
Greenbraum LM, Hirshkowitz A Endogenous cathepsin activation of trypsinogen in extracts of dog pancreas Proc Soc Exp Biol Med. 1961 May;107:74-6 137
Steer ML, Meldolesi J, Figarella C Pancreatitis. The role of lysosomes Dig Dis Sci. 1984 Oct;29(10):934-8 138
Gijs J. D. van Acker, AK. Saluja, L Bhagat, V P. Singh, A M. Song, and M L. Steer Cathepsin B inhibition prevents trypsinogen activation and reduces pancreatitis severity Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2002 283: G794–G800 139
Apte M, Norton I, Haber P, Applegate T, Korsten M, McCaughan G, Pirola R, Wilson J The effect of ethanol on pancreatic enzymes--a dietary artefact? Biochim Biophys Acta. 1998 Mar 2;1379(3):314-24
115
140
Maroux S, Desnuelle P On some autolyzed derivatives of bovine trypsin Biochim Biophys Acta. 1969 May;181(1):59-72 141
Várallyay É, Pál G, Patthy A, Szilágyi L, Gráf L Two mutations in rat trypsin confer resistance against autolysis Biochem Biophys Res Commun. 1998 Feb 4;243(1):56-60
116
