3. NUKLEINSAVAK 3.0. Bevezetés Az élı szervezet jellemzı sajátossága az önreprodukció képessége, amivel faji és egyedi sajátosságait utódaira átörökíti. Ehhez minden élılényben van egy nagy részben állandó, az elızı generációtól kapott információkészlet, amit a dezoxiribonukleinsav (DNS) molekula (retrovírusoknál a ribonukleinsav: RNS) tartalmaz. A nagyon egyszerő szervezeteknél (egyes baktériumok, kékmoszatok) a sejtben egyetlen kettıs-szálú DNS molekula található. A fejlettebb élılényeknél több kettıs szálból álló DNS molekula (kromoszóma) található fıleg a setjmagban (pl. az Escherichia coli baktérium sejtmagjának DNS-e 4,7 millió nukleotidpárt tartalmaz). A Human Genom Program, mely az ember teljes genetikai információjának feltárására irányul, és a DNS láncunk (kinyújtva 2 m hosszú molekula) mintegy hárommilliárd nukleotidjának sorrendjét határozza meg, várhatóan a közeljövıben fejezıdik be.
3.1. Nukleinsavak szerkezete A nukleinsavak három komponensbıl tevıdnek össze: cukor, nitrogén tartalmú heterociklusos bázis és foszforsav. A cukorkomponens alapján a nukleinsavakat két részre oszthatjuk: 1. Ribonukleinsavak (RNS), D-(-)-ribózt tartalmaznak. 2. Dezoxiribonukleinsavak (DNS), 2-dezoxi- D-ribózt tartalmaznak.
CHO
CHO
OH
HO CH2 O
OH
OH OH
D-(-)-ribóz (2R, 3R, 4R)
OH
OH
OH CH2
HO CH2 O
H OH
OH
OH
CH2
OH
OH
H
β-D-ribofuranóz 2-dezoxi-D-ribóz β-D-2-dezoxi-ribofuranóz
57
A nukleotidokban leggyakoribb hat bázis pirimidin és purin bázisokra osztható. Pirimidin győrőt tartalmaz az uracil, a citozin és a timin. Purin váz található az adeninben, a guaninban és a hipoxantinban. OH N
O
N
N
N
NH OH
H uracil: 2,4-dihidroxipirimidin
pirimidin NH2
NH2
O CH3
N
N OH
N
O
N
N
NH
O
O
N
H
H
citozin: 4-amino-2-hidroxipirimidin
timin: 5-metiluracil NH2
6 1
N
5
7
N 9
2
N 3
4
N 8
N
6 2
H2N
N
N H
H
adenin: 6-aminopurin
O N
N 9
N
purin: imidazo [4,5-d] pirimidin H
6
O N N H
guanin: 2-amino-6-hidroxipurin
H
N
6
N
N N
H hipoxantin: 6-hidroxipurin
A ribonukleinsavakban a pirimidin bázisok közül uracil és citozin fordul elı. A dezoxiribonukleinsavak timint és citozint tartalmaznak. A purin bázisok (adenin és guanin) mindkét nukleinsavban azonosak.
58
A felsorolt bázisokon kívül még elıfordul az 5-metilcitozin (pl. növényi sejtekben) és N-6-metiladenin (prokariota sejtekben). A nukleinsavakban ismétlıdı monomer részeket nukleozidoknak hívjuk. A nukleozidokat 3',5'-helyzetben foszforsav kapcsolja össze észter kötéssel (nukleotid egységek, 3.1. és 3.2. ábra). A nukleotid monofoszfátok pKa értéke 1 és 6 körüli, azaz vizes közegben a foszforsav monoészter dianionként van jelen. O NH
OH O
P
NH2
O CH2 O
N
N
OH
O
O
P
OH
O CH2 O
N
O
OH OH
OH
uridilsav (UMP) [uridin: U]
OH
pKa1= 1,0
OH
citidilsav (CMP) [citidin: C]
pKa2= 6,4
pKa1= 0,8 pKa2= 6,3 O
NH2 N
OH O
P
O CH2 O
N
N N
N
OH O
P
O CH2 O
N
N
H NH2
OH
OH
pKa1= 0,9 OH
N
OH
pKa2= 6,1
pKa1= 0,7 OH
OH
pKa2= 6,1
guanilsav (GMP)
adenilsav (AMP) [adenozin: A]
[guanozin: G]
3.1. Ábra. Ribonukleotidok Az 3.1. és 3.2. ábrákban felsoroltakon kívül néhány nukleotid jelentıs szerepet játszik metabolitikus folyamatokban (szabályozók), vagy energiaátvivı anyagok.
59
O
NH2
CH3
NH
P O CH2 O
N
N P O CH2 O
O
OH
N
O
OH
timidilsav (dTMP)
2-dezoxi-citidilsav (dCMP) O
NH2 N N
P O CH2 O
N
N P O CH2 O
N
NH
N
N
NH2
OH
OH 2-dezoxi-adenilsav (dAMP)
2-dezoxi-guanilsav (dGMP)
3.2. Ábra. Dezoxiribonukleotidok
Adenozin-5'-trifoszfát (ATP): Élı szervezetek fı energiatároló és energiaátvivı anyaga. Különösen sokat tartalmaznak az izmok. Vizes közegben 75%-ban teljesen disszociált formában van (pKa1 = 2,5; pKa2 = 6,5) és a négy negatív töltést viselı képzıdmény Mg-sóként stabilizálódik. NH2 N O O
P O
O O
P O
N
O O
P
N N
O CH2 O
O ATP OH
60
OH
Az ATP enzimkatalizált hidrolízisénél egy foszforsav egység lehasadásával adenozin-5'-difoszfát (ADP) keletkezik és 30 kJ/mol energia szabadul fel. A pirofoszfát egység lehasadása is exoterm (35 kJ/mol).
Guanozin-5'-trifoszfát (GTP): Az ATP-hez hasonló energiaátvivı szerepet tölt be a peptidszintézisekben. O N O O
P
O
O
O
O
P O
P
O
O
NH
N
NH2
N
O CH2 O GTP OH
OH
Adenozin-3',5'-ciklofoszfát (cAMP): A sejtmembránhoz érkezı információk és utasítások továbbítását (másodlagos hírvivı) és a sejten belüli információk továbbítását végzi. A hormonális úton (elsıdleges hírvivı) érkezı információ a sejtfal G-fehérjéiben konformációs változást okoz, ami kiváltja az ATP átalakulását cAMP-vé. Az utóbbi protein kinázt aktiválva egy sor enzimet aktiválhat (pl. glikogén lebontása glükóz-1-foszfáttá).
Guanozin-3',5'-ciklofoszfát (cGMP): A cAMP-hez hasonló másodlagos hírvivı szerepet tölt be. Elsısorban sejten belüli szabályozó szerepe van. O
NH2 N N
P
N
N
O
O O
N
N
O
O
P
N
NH2
O
O
OH
NH
O
OH
O
O cAMP
cGMP
61
Inozin-5'-monofoszfát (IMP): A purin nukleotidok bioszintézisének intermedierje. Általában nem halmozódik fel a sejtekben, gyorsan kétlépéses folyamatban AMP-vé vagy xantozin-5'monofoszfáton (XMP) keresztül GMP-vé alakul.
O N N
O O
P
O
O
N
O
N O
O CH2 O
N
NH
P
O CH2 O
NH N
O
H
O OH
OH
OH
IMP
OH
XMP
3.2. Nukleinsavak bioszintézise Az élılények a pirimidin nukleotidokat aszparaginsavból és glutamátból képezett karbamoil-foszfátból építik fel enzimkatalizált reakciókkal (3.3. ábra). A purinvázas nukleotidok biosztinézise foszforibozil-aminból és glicinbıl kiindulva összetett reakciósorral történik. A 3.4. ábrán a purin egyes atomjainak eredetét tüntettük fel. A polinukleotidokban a nukleozid egységek 3',5'-foszforsav-diészter kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. A kötés kialakítása erısen endoterm folyamat (a szabadenergia változás +25 kJ/mol), így energia közlését igényli. A szükséges energiát nukleozid-trifoszfát (általában ATP) biztosítja. A folyamat alapreakciója: (2 ADP → AMP + ATP) Nukleozid-trifoszfát → nukleozid-monofoszfát + pirofoszfát
(-30 kJ/mol)
(Polinukleotidlánc)n+nukleozid-monofoszfát→(Polinukleotidlánc)n+1+H2O (+25 kJ/mol) A polinukleinsavak instabilis molekulák de hidrolízisük katalizátor nélkül lassú. A gyomorban található enzimek nem bontják, de a hasnyálmirigy ribonukleáz és dezoxiribonukleáz enzimjei oligonukleotiddá bontják a vékonybélben, majd tovább hidrolizálódnak a foszfodiészteráz enzim (foszfatáz) hatására. Végülis 5'- és 3'-
62
mononukleotidokat kapunk, amelyek tovább hidrolizálódnak, és a képzıdött nukleozidok szívódnak fel a béltraktusból. 2 ADP + P i + glutamát NH2 2 ATP + HCO 3 + glutamin
aszpartát
C O
2
OPO3
H
H
O
N
CO2
N
O
N
H dihidroorotát O H
2
O 3P
O
H orotát
CO2
O 2
- CO2
O
OH
O H
N
O 3P
O
OH
N N
O
OH
orotidin-5'-monofoszfát
CO2
CO 2
N
O
CH
N
H karbamoil-aszpartát foszforibozil-pirofoszfát
O
N
C
O
O - H2 O
HO C O NH2 CH2
OH
uridin-5'-monofoszfát
3.3. Ábra.
Pirimidin nukleotidok bioszintézise CO 2 Gly Asp
C N
C
C
N 10
N - formil-THF
C C 10
N - formil-THF
C N
N
C
C C
N
N
C N
N
Glu Glu
3.4. Ábra.
A purin atomjainak eredete 3.3. Nukleinsavak szintézise 63
A polinukleinsavak felépítése két nukleozid egység közötti 3',5'-foszforsav-diészter kötés kialakítását jelenti.
DMTr
O
B'
O
HO
O O
C C H2
O
2
C l2 CHC OOH
NH C H2
DMTr
O
C
P
O
C C H2 O
Si...
Si...
B''
O
HO
O
O
P O
O
O
C H3
O
O
O
Si...
Si...
B''
O B'
OH
3.5. Ábra.
Polinukleinsavak szintézise
64
P
O
O
CH(C H3)2
1.C l2C HCOOH
O
O O
NH
CH 3
B''
O
B'
O
O
B''
3
I2
C H3
O
(C H 3 )2CH
2
DMTr
O P
O
NH
3
O
O
O
O
O
DMTr
O
C H2
H
C
B'
O
2. NH 4 OH B'
Ehhez a monomerek bázisainak funkciós csoportjait (pl. NH2) védeni kell, amit általában benzoil- vagy izobutiril-csoportok segítségével végzünk. Ugyanígy védeni kell az egyik nukleozid 5'-helyzetében a hidroxilcsoportot. amire a p,p'-dimetoxitritil-csoportot (DMTr) alkalmazhatjuk. A másik nukleozid 3'-helyzetében a hidroxilcsoportot aktiválnunk kell, amit a nagyon reakcióképes foszforamidit csoport kialakításával végezhetünk. Az eljárást a leggyakrabban használt szilárd fázisú technikával mutatjuk be (3.5. ábra). A szintézisben az 5'-helyzető hidroxilcsoporton védett nukleozidot észter kötéssel szilikát mátrixhoz kötjük, majd enyhén savas kezeléssel a DMTr csoportot eltávolítjuk. Az így kialakított 5'-helyzetben szabad nukleozid származékot reagáltatjuk a 3'-helyzetben aktivált nukleoziddal. A képzıdött dinukleozid származékot jóddal oxidáljuk, majd a DMTr védıcsoport eltávolítása után (savas kezelés) újabb aktivált nukleozidot kapcsolunk hozzá. Az oxidációt minden kapcsolás után el kell végezni. A szintézis végén a védıcsoportokat lúgos kezeléssel eltávolítjuk és a polinukleotidot ammónium-hidroxiddal a szilikátról lehasítjuk.
3.4. A DNS szerkezete A DNS molekula lineáris szerkezető két polinukleotid láncból álló kettıs hélix (Phelix). Elsıdleges szerkezetük alatt a nukleotidok sorrendjét értjük. Ábrázolásukat mindíg az 5'-végnél kezdjük és az alábbi egyszerősített írásmódokat használhatjuk.
T
P
3' 5'
A
P
3' 5'
C
P
3' 5'
pdTdAdCdG
G
P
3'
OH
5'
vagy
pdT-dA-dC-dG
Annak ellenére, hogy a különbözı DNS-ek bázisösszetétele széles határok között változhat, az adenin és timin, illetıleg a citozin és guanin aránya 1:1. Ugyanis a kettıs hélixben az egyik lánc adeninje a másik lánc timin bázisával, míg a citidin a másik lánc guaninjával képez erıs hidrogén kötéseket. A DNS két fonalát (antiparallel láncok) ezek az A-T ill. G-C bázispárok közötti hidrogénkötések tartják össze.
65
A bázispárok tárgyalt aránya miatt a DNS összetételére elég a GC arányt megadni. Például, GC 40%-nál a bázisok mennyisége: 20%, G, 20%, C, 30%, A, és 30% T. A két komplementer DNS szálnál a hidrogénkötéseken kívül további stabilitást jelent a hélix belsejében a bázisok egymásra helyezése (csomagolási hatás). Ugyanakkor destabilizációs hatást jelent a negatív töltéső foszforészter részek kölcsönös taszítása és a hımozgás. Ezek a kettıs spirál gyors elválását és újraképzıdését váltják ki. Magasabb hımérsékleten a molekulák hımozgását a gyenge kölcsönhatások nem tudják ellensúlyozni és a két szál elválik egymástól (denaturálódás). A DNS denaturálódásának hımérséklete annál magasabb (65-75oC), mennél nagyobb a GC tartalma (a G és C bázisok közötti erısebb hidrogénkötések miatt). 5'
G C A
T
3'
3'
C G T
A
5'
0,282 nm
H N H
N
A N
N
cukorváz
H N 0,291 nm
N
1,085 nm A
G N cukorváz
N cukorváz
T H N 0,292 nm
O
T
O
0,284 nm N
CH3
O
N H
H
C
N
N
N H
N H
O
cukorváz
0,284 nm 1,085 nm G C 3.6. Ábra.
A bázispárok között kialakuló hidrogénhidak
66
A DNS denaturálódásának hımérséklete az oldat ionerısségétıl is függ. Alacsonyabb sókoncentrációnál a negatív töltések kölcsönös taszítása erısebb. A kettıs spirál modelljét Watson és Crick tárta fel. A kettıs spirálban a bázisok belül vannak és a poláros hidrofil részek (dezoxiribóz és foszfordiészter) kívül helyezkednek el. A spirál egy fordulata 3,4 nm-enként következik be, ami 10,5 bázist érint. A molekula átmérıje 2 nm és a bázisok közötti távolság 0,34 nm. A bázispárok ugyanabban a síkban helyezkednek el és közel merılegesek a spirál tengelyére. Az eredeti hélixmodell késıbb módosult. A DNS leggyakoribb úgynevezett Bformájában a bázisok nem pontosan merılegesek a hélix tengelyére. Az eltérés mintegy 6o (3.7. ábra).
3.7. Ábra.
A DNS B-formája (A második ábrán az egyik láncot zöld színnel jelöltük. A harmadik és negyedik ábrák a különálló láncokat mutatják)
67
A bázisok a hélix tengelyéhez közel helyezkednek el, és a tengely átmegy a hidrogénkötések között. A hélix külsı részén két különbözı mélységő vájat van. Híg oldatokban a víz a kisebb vájatba beépül. A nagyobb vájat teszi lehetıvé, hogy a bázisok más molekulák részére hozzáférhetık legyenek. A DNS A-formáját alacsony víztartalomnál úgynevezett mikrokristályos állapotra észlelték. Az A-formában a bázisok a hélix tengelyétıl távolabb helyezkednek el és erısen hajlanak a tengely felé (3.8. ábra). Ebben a formában a két vájat közel azonos mérető.
3.8. Ábra.
A DNS A-formája (A második ábrán az egyik láncot zöld színnel jelöltük. A harmadik és negyedik ábrák a különálló láncokat mutatják) A DNS Z-formájában a C1'-N kötésre a konformáció — az eddigiektıl eltérıen —
szin (3.9.ábra), és a spirál balmenető (M-hélix). Egyes DNS molekulák győrős szerkezetőek, ami akkor alakulhat ki ha egy szál (vagy mindkettı) a végénél foszforsav diészter kötésekkel van összekötve.
68
3.9. Ábra.
A DNS Z-formája (A második ábrán az egyik láncot zöld színnel jelöltük. A harmadik és negyedik ábrák a különálló láncokat mutatják)
3.5. RNS Szerkezete Az RNS molekula szerkezete — hasonlóan a DNS-éhez — három szinten tárgyalható. Elsıdleges (primer) szerkezeten itt is a molekula 3',5'-foszfodiészter kötésekkel összekapcsolt bázisainak sorrendjét értjük.
G
P
A
U
C
OH
OH
OH
OH
P
P
P
OH
pGpApUpC pG-A-U-C
69
Másodlagos (szekunder) szerkezet alatt az RNS lánc hidrogénkötésekkel összekapcsolt részleteit és ezekkel kialakuló térbeli elrendezıdéseket értjük. Hidrogénhidak uracil és adenin, valamint citozin és guanin bázisok között alakulhatnak ki.
O
O O
5 4 6 N 1 2 3N
OH
O H
H N H N1 6 2
O U
3
N
5 7 4 9
N
N A
8
OH
O
2'
3' 4'
1'
O
5'
O
Gyakori az U-A párhoz harmadikként uracil kapcsolódása hidrogénkötésekkel és a C-G párhoz citozin bázis kötıdése (3.10.ábra). Az RNS molekulában nem találunk olyan mérvő rendezettséget, mint a DNS-ben láttunk. Egy szálon belül vagy két szál között a hidrogénkötések csak molekularészeket kapcsolnak össze. Az
RNS
tercier
kölcsönhatását értjük.
70
strukturája
alatt
különálló
másodlagos
szerkezetelemek
O O O
O
HO N
O O
O O
N
N
OH
N
H N H N
N
H
O
N OH
N
O
H
U-A-U
O
O
O O O O
O
H H N
O O
H
H N
N
H
OH O
N N H
O
O
N
N
H N
HO N
N
N OH
O
H C-G-C
O
O
3.10. Ábra.
Hármas bázispárok RNS-ban
71
A leggyakoribb harmadlagos szerkezetrészletek:
Hajtő hurok
Kettıs szál
Hajtő nyél
Egyszálú rész
kidudorodó
belsı hurok
elágazó
3.6. Genetikai információ A fajra és egyedre jellemzı genetikai kód a DNS-ben tárolódik. A DNS egy darabja (gén) valamilyen szerepő polipeptid szintézisét irányítja RNS molekulák közremőködésével. A DNS-ben három nukleotid (kodon) kódol egy aminosavat, vagy stop és start jelet. A négy nukleotidnak megfelelıen 43, azaz 64 triplett lehetséges. Közülük 61 kódol aminosavat és három megálljt jelzı triplett (stopjelek). Mivel az aminosavakkal közvetlen kapcsolatba az RNS hozható, a kódokat a DNS komplementerjére, az RNS-re szokás megadni (3.1. táblázat). Látható, hogy egy-egy aminosavat több triplett is meghatároz.
72
Általában az elsı két nukleotid jellemzı az adott aminosavra, a haramadik változhat. Például, a fenilalanin szintézisét kódoló két triplett az UUU és UUC. Az aminosav szintézisét leállító három triplett (stopjelek) UAA, UAG és UGA. A szintézis indító kódja AUG, ami egyúttal a metionin szintézisét is kódolja. A genetikai kód univerzálisnak mondható. Eltérést csak a mitokondriális géneknél és kloroplasztoknál találunk. Például az emlısök mitokondriumaiban az egyébként arginint kódoló AGA és AGG triplettek stopjelek. 3.1. Táblázat. A három betős genetikai kód 5'-bázis
U U
C
A
G
Középsı bázis
C
A
3' bázis
G
UUU Phe
UCU Ser
UAU Tyr
UGU Cys
U
UUC Phe
UCC Ser
UAC Tye
UGC Cys
C
UUA Leu
UCA Ser
UAA Stop*
UGA Stop*
A
UUG Leu
UCG Ser
UAG Stop*
UGG Trp
G
CUU Leu
CCU Pro
CAU His
CGU Arg
U
CUC Leu
CCC Pro
CAC His
CGC Arg
C
CUA Leu
CCA Pro
CAA Gin
CGA Arg
A
CUG Leu
CCG Pro
CAG Gin
CGG Arg
G
AUU lle
ACU Thr
AAU Asn
AGU Ser
U
AUC lle
ACC Thr
AAC Asn
AGC Ser
C
AUA lle
ACA Thr
AAA Lzs
AGA Arg
A
AUG Met#
ACG Thr
AAG Lys
AGG Arg
G
GUU Val
GCU Ala
GAU Asp
GGU Gly
U
GUC Val
GCC Ala
GAC Asp
GGC Gly
C
GUA Val
GCA Ala
GAA Glu
GGA Gly
A
GUG Val
GCG Ala
GAG Glu
GGG Gly
G
*
Stopjelek
#
Az AUG kodon indítójel és metionint is kódol
73
3.7. DNS replikáció A DNS két ellentétes irányultságú polinukleotid láncból felépülı kettıs hélixe, amelyeket komplementer bázispárok (A-T és G-C) közötti hidrogénhidak kötnek össze, DNS-polimeráz enzimek és kofaktorok jelenlétében képes szétválni és megkettızıdni. Korábban a szétváló két DNS fonalon szimultán DNS szintézist, azaz két új kettıs hélix kialakulását tételezték fel (3.11. ábra).
Eredeti szál
Új szál
Új szál
Eredeti szál
3.11. Ábra.
DNS kettıs hélix replikációja Késıbb kiderült, hogy az új polinukleotid lánc szintézise csak 5' → 3' irányban folyhat. Ebbıl következıen csak az egyik szálon folyamatos a szintézis. A másik szálon a szintézis a szétválástól kifelé szakaszosan halad és az így képzıdött kettıs hélix darabokat a DNS-ligáz enzim kapcsolja össze. Az eukariota DNS replikációja még bonyolultabb, a kettıs hélix több szakaszán is egyszerre kezdıdik (úgynevezett replikációs buborékok keletkeznek).
74
(A DNS-ben tárolt információ nem folyamatos. Az értelmes szakaszokat olyanok választják el, amelyek nem íródnak át. A nem értelmezhetı DNS szakaszok szerepét még nem ismerjük, vagy nem is értelmezhetıek.) 5'
3'
szülıi DNS
DNS-DNS komplex
késlekedı szál vezetı szál
3' 3'
5'
C
G
T
A
C
G
T
A
5'
5'
O O
P
O CH 2 O
P
3'
O G
nıvekvı DNS lánc
P O
P O
P
3' OH
A P G P
P
P
P
P
O
O CH2 O
A
T OH
OH
5'
templát lánc
új (növekvı lánc)
O O
O
P O O
CH2 O
O O
O T
O O belépı dTTP
OH
3.12. Ábra.
DNS replikáció egyszerősített ábrája.
75
Az új DNS szál kezdı szakaszának szintézisét RNS-polimeráz enzimrendszer indítja, és a képzıdött úgynevezett indító RNS-fonal folytatódik tovább dezoxiribonukleotidok hozzákapcsolásával. A lánc eleji RNSt késıbb egy nukleáz enzim kivágja.
A két szál szintézisét nem ugyanaz az enzim vezérli. A vezetı szál replikációját a
δ-DNS-polimeráz végzi. Az úgynevezett késlekedı szál szintézisét az α-DNS-polimeráz irányítja (3.12. ábra). Az új nukleotid egység kapcsolása nukleozid-5'-trifoszfáton keresztül történik a lánc szabad 3'-poziciójához kötött hidroxilcsoporton.
3.8. Transzkripció és transzláció A sejtek anyagcseréjét irányító fehérjék szintézise a citoplazma riboszómáin történik. Az ehhez szükséges információt az eukarióta sejtekben a sejtmag kromoszómáiban található DNS adja. Az információt szállító szerepet a hírvivı ribonukleinsav (messenger RNS,
mRNS) tölti be. A mRNS néhány ezer bázist tartalmaz és minden proteinre más és más szerkezető. Rövid élettartalmú, felezési ideje néhány perc. RNS polimeráz 5' 3'
DNS szétválik
átirási buborék
3' 5'
polimeráz iránya
m RNS
RNS-DNS hélix (kb. 12 bázispár hosszú)
5'
3.13. Ábra.
Genetikus információ átírása Az információ átírását (transzkripció) az RNS-polimeráz enzimek végzik (3.13. ábra). Ezek felismerik a DNS átírható szakaszait (exonok) és indítják a komplementer bázisokat tartalmazó RNS bioszintézisét. Az RNS szintézise is csak 5' → 3' irányban
76
történhet és a mintaszállal antiparallel kell lennie, azaz az információ leolvasása 3' → 5' irányban folyik.
Riboszómális ribonukleinsav (rRNS) a riboszómákban található. A riboszóma szárazanyagra számítva mintegy 60% RNS-t és 40% fehérjét tartalmaz. Viszonylag stabilis, mintegy 1500-3000 nukleotid egységet tartalmaz. A riboszomális RNS a sejtek RNS tartalmának mintegy 90%-át adja. A mRNS a riboszóma speciális receptoraihoz kötıdve elindítja a proteinszintézist, ami nagyrészt az rRNS-en történik. Transzláció alatt a mRNS molekulában hozott genetikus információ alapján történı aminosavak sorba rendezıdését értjük a fehérjeszintézis során. A transzfer ribonukleinsavak (tRNS) az aminosavakat szállítják a proteinszintézishez a riboszómákban. Az RNS-ek közül a legkisebb molekulatömegőek, általában 73-94 nukleotid egységet tartalmaznak. Minden aminosavnak legalább egy tRNS-e van.
D-hurok D
G
A
D
A C C A C G C U U A
pG C G G A U U C U C G AU
Aminosav kötıhely
TΨC-hurok C
A
U mA
G A C A C
G G
G A G C m22G G
G
2 UC7m 2C U G U G mG G A G G U m5C Ψ
A C C A G
A C
A
U
Y G
A
C T
Ψ
Antikodon-hurok
A
3.14 Ábra.
tRNS szerkezete.
77
O tRNS
O
O
β
O
O O
OH
C O
H C R
NH3
3.15. Ábra. tRNS-hez kötött aminosav
H N CH2 CH C Adenozin
N
N
CH3 CH3
O CH3
N
N
N
N
N
N
ribóz
ribóz
N6-izopenteniladenozin (i 6A) 1-metiladenozin (m1 A) O H
O CH3
N
N
Guanozin
N
N
N
N N
ribóz
N ribóz
1-metilguanozin (m 1G)
inozin (I) O H CH3 CH3
N
N
N
N2,N2-dimetilguanozin (m 22G) N
N ribóz 3.16. Ábra.
Bázismódosulások a tRNS-ben.
78
O H Uridin
CH3
N
O
O H
N
N
O
N
ribóz
ribóz dihidrouridin (D)
ribotimidin S H
O H
N
O
N
N
ribóz
4-tiouridin (S4U)
pszeudouridin (Ψ) NH2
NH2 N S
H
O
ribóz
Citidin
N
CH3
N N
O
ribóz
N ribóz
2-tiocitidin (S2C)
5-metilcitidin (m5C)
3.16. Ábra. (folytatás) A tRNS egyszálú, de egyes szakaszai a molekulán belüli hidrogénkötésekkel hélixé rendezıdnek (3.14. ábra). A lóhere alakú molekulában a szállítandó aminosav a 3'-láncvég egyik szabad hidroxilcsoportjához kapcsolódik észterként (3.15 ábra). A tRNS-ben az információ átírás után érdekes bázis módosulások jöhetnek létre. Közülük a leggyakrabbakat a 3.16. ábra tartalmazza.
3.9. Mitokondriális DNS
Mitrokondriumok a soksejtő élılények minden sejtjének citoplazmájában elıforduló kettıs membránnal határolt szervecskék, amelyek fontos szerepet töltenek be a sejtlégzésben és energiatermelésben. A mitokondriumok is tartalmaznak DNS-t és annak szerepe ugyanaz mint a sejtmagban található DNS-é: információ tároló és átörökítı anyag. 79
A mitokondriális DNS mind méretében mind szerkezetében jellegzetesen eltér a sejtmag DNS-étıl. Például, az ember sejtjeinek magjában tárolt DNS kettıs hélix több milliárd bázispárt tartalmazó lineáris óriásmolekula, ami néhány százezer gént tartalmaz. Ezzel szemben az ember mitokondriális DNS-e (mtDNS) 16569 nukleotidpárt tartalmazó cirkuláris molekula (supercoiled), ami 37 gént tartalmaz, és közülük csak 13 kódol fehérjét. A többi gén 22 tRNS-t és két rRNS-t kódol, amelyek a mitokondrium saját fehérjeszintéziséhez szükségesek. A mitokondriumok információ átadásában (öröklés) jellegzetes eltérések találhatók a sejtmagi örökléstıl. A kromoszómális DNS (genom) az ivarsejtekben egy, a szomatikus sejtekben két példányban található. Ettıl eltérıen egy sejtben több száz mitokondrium lehet, és mindegyik 5-10 DNS molekulát tartalmaz, ami sejtenként mintegy ezer DNS molekulát jelent. A petesejtben több százezer mtDNS található, a spermiumban viszont csak néhány száz. Ez utóbbiak a megtermékenyítés után elpusztulnak. Így az utódban a mitokondriális gének csak az anyától származnak (bizonyos tulajdonságok csak anyai ágon öröklıdnek).
3.10. Mutációk
A faji és egyedi jellegzetességek átöröklıdése a genetikai anyag állandóságán és pontos másolásán alapul. A DNS-lánc azonban nem teljesen stabilis és megkettızıdése során is elıfordulnak hibák. Ezeket a hibákat a sejtek javító (repair) mechanizmusai folyamatosan javítják. Ha a hiba csak az egyik láncon fordul elı, az a megkettızıdésig még javítható, mert a komplementer lánc még tartalmazza a helyes információt. Amennyiben a hibajavítás a megkettızıdésig nem következik be, úgy a hiba rögzítıdik és mutáció jön létre. A DNS-lánc sérülése hıhatásra, ionizáló sugárzásra, UV-fényre és kemikáliák hatására is bekövetkezhet. Hıhatásra a purinbázisok (A, G) glikozidos kötése (C1'-N) hasadhat és úgynevezett depurináció játszódik le. A hiba gyakorisága sejtenként naponta több ezerre tehetı. Ritkább a bázisok dezaminálódása (oxidatív dezaminálódás), ami hıhatáson kívül ionizáló sugárzás vagy alkilezıszerek hatására bekövetkezhet. A dezaminálódás során az adeninbıl hipoxantin, a guaninból xantin és a citozinbıl uracil jön létre. A tárgyalt hibákat nagyrészt a korrigáló rendszerek specifikus glikozidázai javítják, amelyek az idegen bázisokat felismerik, és glikozidos kötésük hasításával eltávolítják.
80
Gyakran megtörténik egy DNS-láncon egymás mellett elıforduló timin bázisok [2πs+ 2 πs] cikloaddíciója ultraibolya fény hatására. H
O N
O
CH3 dR
H
H
O H
O
hν
N O
CH3 dR
A C
CH3 CH3 N
O
H
T
T G C
O N
N
H
dR
A C
hν
T G A A C G
H
N
H
O
dR
T
T G C
T G A A C G
A dimerizáció kisebb gyakorisággal a láncon szomszédos helyzetben elıforduló citozin bázisok és timin-citozin bázispárok között is lejátszódhat. A hiba javításakor egy specifikus endonunkleáz felismeri a dimereket és az elsı sérült nukleotid 5'-foszfátját és a másik sérült nukleotid 3'-foszfátját hasítva eltávolítja a láncból, majd a hiányt a β-DNSpolimeráz a komplementer láncnak megfelelı bázisokkal pótolja. A prokarióta sejtekben egy úgynevezett fotoaktivált enzim segítségével elkerülhetı a sérült bázisok kivágása. Az enzim fény hatására (λ < 400 nm) aktiválódik és hasítja a két bázis közötti kovalens kötéseket. Számos vegyület okoz károsodást a genetikai anyagban. A kémiai mutagének közül a salétromossav dezamináló hatású. Az alkilezıszerek (dimetil-szulfát, diazometán, mustárgáz, nitrogénmustár) a DNS egy vagy több bázisát alkilezik. Például, a guaninból metilezı
szerekkel
N7-metilguanidin
és/vagy
O-6-metilguanidin
képzıdik.
Metilezıszerekkel szemben a DNS bázisai közül legaktívabb (nukleofilabb) a guanin N7poziciója, ezt követi az adenin N3-as helyzete, majd az N3-pozició következik a citozinban. Az N-alkilezés fokozza a guanin savasságát, és a keto-enol tautomériát az enol-alak irányába tolja el. A DNS-ben a guanin keto-alakja képez hidrogénkötéseket a komplementer 81
szál citozinjával. Az N7-alkilezett fıleg enol-alakban jelenlévı molekula viszont a másik lánc timinjével alakít ki hidrogénkötéseket, ami a replikációnál hibás információt jelent. O H H2N
OH N
N
metilezıszer
N
N
H2N
dR
O
CH3 N
N
N
N
H2N
dR
N
N
+
CH3
N
N dR
N7-metil-guanilsav
O-6-metil-guanilsav
A metilezett guaninhoz hasonló úgynevezett bázisanalógok, amelyek a természetes bázisokhoz hasonlóak, a DNS szintézis során beépülhetnek a láncba. Például, ilyen a timinnel analóg 5-bróm és 5-fluoruracil, vagy az adeniné a 2-aminopurin.
O X
H N O
N
N N
H2N
H
N
N
H
X = Br 5-brómuracil
2-aminopurin
X = F 5-fluoruracil Rendkívül erıs mutagénitást (és karcinogén hatást) fejt ki a benzo[a]piréndiolepoxid, ami a guanin bázis aminocsoportjával reagálva megbontja a komplementer szálak bázispárjai közötti hidrogén-kötéseket. O N N
O enzim O2 benzo[a]pirén
dR HO OH benzo[a]pirén diol-epoxid
82
N N
H NH
HO HO OH
3.11. RNS örökítıanyagú vírusok
A vírusok önálló életre alkalmatlan, csak fehérje burokba csomagolt genetikai információt hordozó részecskék. Energiatermelı és fehérje szintetizáló rendszerük nincs, így csak
élılények
sejtjeiben
képesek
genetikai
anyagjaik
megsokszorozására,
azaz
szaporodásra. A gazdasejt reprodukciós rendszerét és enzimjeit felhasználva replikálódnak és genetikai anyagjukat fehérjeburokba csomagolva juttatják ki a sejtbıl. A vírusok genetikai anyaga (genomja) eltér a magasabbrendő szervezetekétıl. Jelentıs részüknél ugyan DNS-t találunk, azonban az lehet egyszálú vagy kettısszálú, lineáris vagy cirkuláris szerkezető, és csak néhány száz gént tartalmaznak. Például, a polyomavírus kétszálú DNS-t tartalmaz és mindössze hat génnel rendelkezik. A vírusok kisebb részének genetikai anyaga RNS. Leggyakoribbak az egyszálú RNSgenomú vírusok. Közéjük tartozik az influenzavírus, a járványos gyermekbénulás vírusa (poliovírus) és a száj- és körömfájás vírusa. Ezek replikációjához az RNS-függı RNS polimeráz enzim szükséges, amit a vírus genomja kódol. A replikációkor az egyszálú RNS szálról kettısszálú RNS képzıdik, majd az új szálról az eredeti szálak másolódnak és kerülnek fehérjeburokba. Az eredeti RNS szál egyúttal a m-RNS szerepét is betölti, ami a replikáz enzim szintézisét és a szükséges fehérjék felépítését is végzi. Mivel az RNSpolimeráznak nincs hibajavító enzimje, a tisztán RNS-genomú vírusoknál gyakoriak a mutációk. A retrovírusok (RNS-tumorvírusok) olyan egyszálú RNS-vírusok, amelyek az RNS átírását DNS-re irányító RNS-függı DNS-polimeráz enzimet (reverz transzkriptáz) is kódolják, és azt a fehérjeburkon belül tartalmazzák. Közéjük tartozik a human immundeficiencia vírus (AIDS vírus) is. A retrovírusok szaporodásánál a vírus a felületén található glikoprotein tüskéivel a sejt receptorához kötıdik, majd a vírus és a sejt membránja egyesül. A sejt belsejébe került vírus RNS-rıl a reverz transzkriptáz DNS másolatot készít. A keletkezett DNS-RNS hibrid RNS része lebontódik, és a DNS megkettızıdik. A kétszálú DNS bejut a sejt genetikai anyagába és a sejt forrásait használva a vírus RNS-ét termeli.
83
