8
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April sampai Juni 2012 dan bertempat di unit pengolahan tradisional Teluk Petai, Kampar, Riau, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Pengetahuan Bahan Baku Hasil Perairan serta Laboratorium Pengolahan Pangan Ilmu dan Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan selais asap (Ompok hypophthalmus) yang berasal dari Teluk Petai, Kampar, Riau. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis TVB antara lain larutan asam borat 2%, larutan asam klorida (HCl) 0,02 N, larutan asam trikloroasetat (TCA) 7%, larutan kalium karbonat (K2CO3) jenuh (1:1). Bahan-bahan untuk uji mikrobiologi antara lain Lactose Broth, plate count agar (PCA), garam fisiologis, dan aquades. Bahan-bahan untuk analisis proksimat antara lain aquades, HCl, NaOH, katalis selenium, H2SO4, H3BO3, dan pelarut heksana. Alat-alat yang digunakan yaitu plastik, aluminium foil, tissue,
kantung
plastik, pisau, talenan, cawan porselen, tabung Kjeldahl, kapas bebas lemak, tabung soxhlet, timbangan analitik, homogenizer, Aw-meter, erlenmeyer 250 ml, corong, kertas saring, gelas ukur, pipet volumetrik, mikro pipet, tip,
cawan
Conway beserta tutupnya, inkubator, desikator, oven, tabung durham, cawan petri, tabung reaksi, kulkas, vortex, rak tabung reaksi, sudip, alu dan mortar.
3.3 Prosedur Kerja Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji dan mempelajari keadaan sanitasi pengolahan ikan selais asap (O. hypophthalmus) serta mutunya yang dilakukan dengan wawancara, pengamatan terhadap pengaruh penyimpanan ikan asap pada suhu dingin dan analisis mutu ikan asap selais. Analisis mutu terdiri dari uji organoleptik, uji fisik, uji kimia, dan uji mikrobiologi. Uji fisik meliputi uji aktivitas air (aw), uji kimia meliputi uji Total Volatile Base (TVB) dan proksimat.
9
Uji mikrobiologi meliputi uji TPC (total plate count) dan, Escherechia coli. Ikan selais asap kemudian dikemas menggunakan plastik HDPE non vakum dan disimpan pada suhu dingin selama 20 hari. Uji TPC, aw dan TVB dilakukan setiap 5 hari selama penyimpanan, sedangkan uji proksimat dilakukan pada awal. Prosedur penelitian disajikan pada Gambar 2.
Ikan selais asap
Wawancara dan observasi
Analisis mutu dan penyimpanan (suhu ruang dan kulkas) produk ikan selaisasap
-
Uji organoleptik Analisis proksimat Kadar TVB Uji TPC Uji bakteri E. Coli* Uji aw**
Gambar 2 Diagram alir proses uji dalam penelitian ikan asap. *analisis mutu ikan selais asap; **analisis penyimpanan ikan selais asap
3.4 Pengambilan Sampel Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel ikan selais kering yang berasal dari tiga pasar tradisional yang berbeda di Pekan baru, Riau. Sampel yang digunakan dipisahkan dalam beberapa kemasan untuk dianalisis mutunya, terdiri dari uji organoleptik, uji fisik, uji kimia, dan uji mikrobiologi.
10
3.4.1 Analisis proksimat a) Analisis kadar air (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 30 menit) dan ditimbang hingga beratnya konstan. Cawan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 105 oC selama 6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air: % kadar air = Keterangan:
x 100%
A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat cawan dengan sampel (gram) C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
b) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu dilakukan untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dan bahan yang dianalisis. Cawan porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu sekitar 105 oC selama 30 menit. Cawan abu porselen tersebut dimasukkan ke dalam desikator (30 menit) dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam cawan abu porselen, kemudian dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 6 jam.
Cawan dimasukkan ke dalam desikator
kemudian ditimbang. Perhitungan kadar abu ikan selais:
Keterangan:
A=
Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B=
Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
C=
Berat
cawan abu porselen dengan sampel
dikeringkan (gram)
setelah
11
c) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap.
Pada saat destilasi
pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu
105 oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya
konstan (W3). Kadar lemak ditentukan dengan rumus :
Keterangan : W1 = Berat sampel (gram) W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) d) Analisis kadar protein (AOAC 1980) Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahapan yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1. Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 1 gram. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Setengah butir selenium dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 mL H2SO4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 oC. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi hijau jernih. 2. Tahap destilasi Larutan yang telah jernih didinginkan dan kemudian ditambahkan 10 ml akuades dan 10 mL NaOH 40%, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 mL yang berisi 25 mL asam borat (H3BO3) 4% . Hasil destilat berwarna hijau kebiruan.
12
3. Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1013 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Perhitungan kadar protein pada ubur-ubur adalah sebagai berikut:
% Kadar Protein = % nitrogen x faktor konversi (6,25) 3.4.2 Uji organoleptik (SNI 2346) Metode yang digunakan untuk uji organoleptik ikan asap berdasarkan SNI 2346 tentang petunjuk pengujian organoleptik atau sensori pada produk perikanan. Metode ini menggunakan angka yang berkisar antara 1 sampai 9 dengan penilaian dalam bentuk produk ikan asap. Pengukuran organoleptik merupakan cara penilaian mutu ikan selais asap yang bersifat subyektif dengan mengunakan indera manusia.
3.4.3 Uji kimia Pengujian kimia dilakukan untuk mengetahui karakteristik kimia ikan asap yang meliputi uji TVB. Pengujian TVB dilakukan dengan cara penimbangan sampel sebanyak 15 gram, kemudian ditambahkan 45 mL TCA 7%
dan
dihomogenkan, lalu disaring dengan kertas saring dan ditampung dalam erlenmeyer. Selanjutnya diambil 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam cekungan luar pinggir kiri dari cawan Conway, dipipet sebanyak 1 mL K2CO3 dan dimasukkan ke dalam cekungan luar pinggir kanan. Asam borat sebanyak 1 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam cekungan tengah cawan Conway, kemudian cawan ditutup, sedikit digoyangkan untuk mencampur ketiga larutan tersebut. Setelah selesai diinkubasi lebih kurang selama 1 jam, kemudian dilakukan titrasi larutan borat pada bagian dalam (inner chamber) cawan Conway blanko dengan larutan HCl 0,01 N sehingga warna larutan asam borat berubah menjadi merah muda, selanjutnya berturut-turut titrasi larutan asam borat pada cawan Conway contoh sampai diperoleh warna merah yang sama dengan blanko. Perhitungan nilai TVB dapat dihitung dengan rumus:
13
Keterangan : i
= Volume titrasi sampel (mL)
j
= mL titrasi HCl blanko
Fp
= faktor pengenceran
3.4.4 Uji mirobiologi Uji mikrobiologi dilakukan untuk mengetahui cemaran biologis pada ikan asap selais. Uji mikrobiologi terdiri dari pengujian TPC dan bakteri E. coli. (1) Pengujian total plate count (TPC) atau penentuan angka lempeng total (ALT) pada produk perikanan (SNI 01-2332.3-2006) a) Preparasi Contoh Sampel diambil secara acak dan dipotong kecil-kecil hingga beratnya 10 gram, kemudian dimasukkan ke dalam wadah atau aluminium foil. Selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan garam fisiologis 90 mL dan dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1, kemudian dengan pipet steril diambil 1 mL homogenat di atas dan dimasukkan ke dalam 9 mL larutan garam fisiologis untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Pengenceran selanjutanya (10-3), dilakukan dengan mengambil sampel dari pengenceran 10-2 dimasukkan ke dalam 9 mL larutan garam fisiologis. Pada setiap pemindahan 1 mL bahan kemudian di vortex. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-4, 10-5 dan seterusnya sesuai kondisi sampel. b) Metode agar tuang (pour plate method) Sampel yang telah diencerkan 10-1, 10-2 dan seterusnya, dipipet masingmasing 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Prosedur tersebut dilakukan secara duplo untuk setiap pengenceran. Media plate count agar (PCA) yang telah didinginkan dalam waterbath hingga mencapai suhu 45 oC, dituangkan sebanyak 12-15 mL ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel. Cawan yang telah berisi sampel dan media PCA digerakkan ke depan ke belakang ke kiri dan ke kanan supaya tercampur sempurna. Setelah agar menjadi padat,
14
untuk menentukan mikroorganisme aerob cawan-cawan tersebut diinkubasi dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 31 oC. Pengenceran yang digunakan dicatat dan dilakukan penghitungan jumlah total koloni. Jumlah koloni bakteri yang dihitung adalah cawan petri yang mengandung koloni bakteri antara 30 koloni-300 koloni.
(2) Pengujian bakteri E. coli (SNI 01-2331.1-2006) Pengujian bakteri E. coli dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap uji tersebut adalah uji pendugaan, uji penegasan, uji morfologi, dan uji biokimia. a) Tahap analisis Pengenceran 10-2 disiapkan dengan cara melarutkan 1 mL larutan 10-1 ke dalam 9 mL larutan pengencer garam fisiologis. Pengenceran selanjutnya dilakukan sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh.
Pada setiap
pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Sebanayak 1 mL larutan dipindahkan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung Durham.
Tabung-tabung tersebut
diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 oC. Selanjutnya diperhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi selama 24 jam dan diinkubasi kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. b) Uji pendugaan E. coli Setiap tabung LTB yang positif diinokulasi dengan jarum ose ke tabungtabung yang berisi larutan EC Broth dan tabung durham. Selanjutnya tabungtabung tersebut diinkubasi dalam waterbath sirculation selama 48 jam pada suhu 45 oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang diinkubasi. Tabung-tabung tersebut diperiksa setelah 24 jam diinkubasi, untuk menguji timbulnya gas. Apabila tidak menghasilkan gas atau negatif, diinkubasi kembali selama 48 jam. Tabung yang positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Selanjutnya ditentukan nilai Angka Paling Memungkinkan (APM) berdasarkan tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nilainya dinyatakan sebagai (APM/g faecal coliform).
15
c) Uji penegasan E. coli (confirmed E. coli) Tabung-tabung EC Broth positif diambil dan digoreskan ke LEMB agar dengan menggunakan jarum ose, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Koloni E. coli akan memberikan ciri yang khas, yaitu terdapat warna hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. Beberapa koloni (typical) Escherichia colidiambil dari masing-masing cawan LEMB dan digoreskan ke media PCA miring dengan jarum tanam, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Jika tidak ada koloni yang khas (typical), pindahkan satu atau lebih koloni yang tidak khas (typical) E. coli ke media PCA miring. d) Uji morfologi Prosedur uji morfologi dilakukan dengan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri E. coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus. e) Uji biokimia 1. Produk indol (I) Sebanyak satu ose E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan dilakukan inokulasi ke dalam tryptone Broth serta diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 mL- 0,3 mL pereaksi kovacs. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif jika terbentuk cincin warna kuning. 2. Uji voges proskauer (VP) Sebanyak satu ose koloni E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan dilakukan inokulasi ke dalam MRVP Broth serta diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 oC, dipindahkan 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm
100 mm steril dan ditambahkan 0,6 mL larutan
alpha naphtol dan 0,2 mL 40% KOH, dan dikocok. Untuk mempercepat reaksi ditambahkan sedikit Kristal keratin. Selanjutnya dikocok kembali dan didiamkan selama 2 jam. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby)
16
3. Uji methyl red (MR) Media MRVP Broth di atas diinkubasi kembali selama 48 jam pada suhu o
35 C. Selanjutnya ditambahkan 5 tetes indikator methyl red pada setiap MRVP Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning. 4. Uji sitrat (C) Sebanyak satu ose dari PCA miring digoreskan ke permukaan simmon citrate agar, kemudian diinkubasi selama 96 jam pada suhu 35 oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah menjadi warna biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. 5. Produksi gas dari laktosa Sebanyak satu ose dari PCA miring diinokulasikan ke dalam LTB, dan diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 35 oC. Reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham. Interpetasi hasil pengujian E. coli disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Interpetasi hasil pengujian bakteri E. coli (SNI 01-2332.1-2006) Kriteia
Biotipe 1
Biotipe 2
Gas pada tabung LTB
+
+
Indol
+
-
MR
+
+
VP
-
-
Citrate
-
-
Uji morfologi
Gram negatif, bentuk batang
Gram negatif, bentuk batang
pendek berspora
pendek tidak berspora
3.5 Penentuan Aktivitas Air (aw) Sampel sebanyak 2-5 gram ditumbuk sampai halus, dimasukkan ke dalam plastik kemudian dimasukkan ke dalam a w meter untuk pengukuran nilai aw. Sebelum dilakukan pengukuran aw meter distandarisasi dengan NaCl, Mg(NO3)2 dan BaCl2 masing-masing selama 30 menit, kemudian dilakukan pengukuran aw masing-masing sampel selama 15 menit.
17
3.6 Analisis Data Data dianalisis menggunakan analisis statistik menggunakan rancangan acak lengkap. Data disajikan dalam bentuk histogram, tabel atau gambar kemudian diiterpretasikan.
