11
3. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada Februari sampai Mei 2011. Sampel Padina australis diambil dari perairan Pulau Pramuka, Taman Nasional Kepulauan Seribu, Jakarta. Proses ekstraksi dan analisis dilakukan di beberapa laboratorium IPB, yaitu: Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Pangan, Laboratorium Kimia Analitik, dan Laboratorium Uji Biofarmaka-Pusat Studi Biofarmaka 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah Padina australis. Bahan lain yang digunakan untuk analisis proksimat adalah dietil eter, K 2 SO 4 , HgO, H 2 SO 4 , H 2 O 2 , H 3 BO 3 , bromcherosol green, methyl red, NaOH-Na 2 S 2 O 3 , AgNO 3 , dan HCl. Bahan yang digunakan untuk uji serat pangan adalah etanol, akuades, aseton, buffer phospat, NaH 2 PO 4 anhidrat, enzim thermamyl, HCl, pepsin, NaOH, dan pankreatin. Bahan yang digunakan untuk ekstraksi adalah metanol, etil asetat dan n-heksana. Bahan-bahan untuk uji total fenol adalah etanol, akuades, Na 2 CO 3 5%, reagen Folin-Ciocalteau 50%, dan asam tanat. Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan adalah ekstrak Padina australis, etanol, dan butylated hydroxytoluene (BHT) sebagai standar. Bahan yang digunakan untuk uji fitokimia adalah asam sulfat, pereaksi dragendorff, meyer, wagner, molisch, benedict, biuret, ninhidrin, kloroform, anhidra asetat, asam sulfat, magnesium, amil alkohol, dan FeCl 3 . Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi timbangan analitik, mortar, blender, erlenmeyer, sonikator, magnetic stirrer, vacuum rotary evaporator, botol vial, kertas saring, inkubator, spektrofotometer UV-Visible, plate microwell, sudip, alumunium foil, tabung reaksi, gelas ukur, pipet volumetrik, pipet mikro, gegep, tissue, kapas bebas lemak, kompor listrik, kantung plastik, tanur, cawan porselen, dan vorteks.
12
3.3 Tahapan Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu tahap pengambilan dan preparasi sampel, serta tahap ekstraksi. Tahapan penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 3. 3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel Padina australis yang terdapat di perairan Pulau Pramuka selain tumbuh pada substrat berpasir, ditemukan berasosiasi dengan berbagai jenis rumput laut dan lamun. Spesies tersebut dipanen pada sore hari yaitu saat perairan surut untuk mempermudah proses pengambilan. Sampel P. australis yang telah dipanen dicuci dengan air tawar. Sampel tersebut kemudian dimasukkan dalam kantong plastik dan ditambahkan sedikit air laut. Kantong plastik tersebut kemudian dimasukkan dalam cool-box dan ditambahkan es batu secukupnya. Preparasi sampel P. australis dilakukan untuk menyiapkan sampel dalam bentuk segar dan kering sesuai dengan jumlah yang dibutuhkan dalam proses analisis. Pembuatan sampel kering dilakukan dengan mengeringkan sampel selama dua hari dengan sinar matahari pada pukul 10.00-13.00 WIB. Sampel tersebut kemudian diblender hingga halus. 3.3.2 Ekstraksi sampel Ekstraksi P. australis didasarkan pada metode Andayani et al. (2008) yang telah dimodifikasi. Proses tersebut menggunakan tiga jenis pelarut yaitu metanol (polar), etil asetat (semi polar) dan n-heksana (non-polar). Sampel kering P. australis dihaluskan menggunakan blender dan ditimbang sebanyak 10 gram. Sampel tersebut kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan dengan pelarut sebanyak 160 ml (1:16). Erlenmeyer berisi sampel dan larutan kemudian dimaserasi selama 48 jam dengan menggunakan orbit shaker. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman 42 sehingga diperoleh filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh kemudian dievaporasi menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 40 oC. 3.4 Prosedur Analisis Analisis dilakukan terhadap sampel segar dan ekstrak kasar P. australis. Analisis sampel segar meliputi analisis proksimat dan kadar abu tidak larut asam, serta analisis serat pangan. Analisis pada ekstrak kasar P. australis meliputi
13
analisis rendemen, kandungan total fenol, senyawa fitokimia, dan aktivitas antioksidan. Rumput laut Padina australis
Segar
Pengeringan dengan sinar matahari
Analisis: a. Proksimat b. Abu tak larut asam c. Serat pangan
Penambahan pelarut
metanol
Etil asetat
n-heksana
Maserasi
Filtrat
Penyaringan
Evaporasi
Ekstrak kasar etil asetat
Ekstrak kasar metanol
a. b. c. d.
Ekstrak kasar n heksana
Analisis: Rendemen Total fenol Fitokimia Aktivitas antioksidan
Gambar 3. Diagram alir penelitian 3.4.1 Analisis proksimat dan abu tidak larut asam Analisis proksimat yang dilakukan meliputi analisis kadar air, kadar abu, karbohidrat, kadar protein, dan kadar lemak. Analisis yang digunakan mengacu pada metode AOAC (2005) dan BSN (2000).
14
1) Kadar air (AOAC 2005) Proses analisis diawali dengan mengeringkan cawan porselen kosong dalam oven selama 15 menit. Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator selama 20 menit, selanjutnya ditimbang. Sampel segar P. australis sebanyak lima gram dimasukkan dalam cawan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 100 oC. Tekanan yang digunakan tidak lebih dari 100 mmHg. Proses pengovenan dilakukan selama lima jam atau sampai beratnya konstan. Cawan berisi sampel yang telah dioven didinginkan dalam desikator, selanjutnya ditimbang. Perhitungan kadar air menggunakan rumus berikut.
Keterangan : A = berat cawan kosong (g) B = berat cawan + sampel awal (g) C = berat cawan + sampel kering (g) 2) Kadar abu (AOAC 2005) Cawan pengabuan dikeringkan dalam oven selama satu jam pada suhu 105 oC. Cawan tersebut kemudian didinginkan selama 15 menit dalam desikator, selanjutnya ditimbang. Sampel sebanyak lima gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas kompor listrik hingga proses tersebut tidak menghasilkan asap. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tanur pengabuan selama enam jam pada suhu 400 oC. Cawan tersebut selanjutnya didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Penentuan kadar abu dihitung dengan menggunakan rumus berikut. Berat abu (g) = berat sampel dan cawan akhir (g) – berat cawan kosong (g)
3) Kadar lemak (AOAC 2005) Analisis kadar lemak dilakukan dengan menggunakan metode soxhlet. Labu lemak dikeringkan dalam oven, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Satu gram sampel dalam bentuk tepung ditimbang menggunakan saringan timbel yang sesuai ukurannya kemudian ditutup dengan kapas wool yang bebas lemak. Timbel yang berisi sampel diletakkan dalam alat ekstraksi soxhlet kemudian alat kondensor dipasang di atasnya dan labu lemak dibawahnya. Pelarut
15
dietil eter atau n-heksana dituangkan secukupnya ke dalam labu lemak. Labu tersebut kemudian direfluks selama enam jam sampai pelarut yang turun ke labu lemak tidak berwarna. Pelarut hasil destilasi ditampung, kemudian labu lemak berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 oC. Labu tersebut kemudian didinginkan dalam desikator, selanjutnya ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan rumus berikut.
Keterangan : W 0 = Berat sampel (g) W 1 = Berat labu lemak kosong (g) W 2 = Berat labu lemak dengan lemak (g) 4) Kadar protein (AOAC 2005) Analisis kadar protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml. Sebanyak 0,25 gram Selenium dan 3 ml H 2 SO 4 pekat serta sampel didekstruksi (pemanasan dalam keadaan mendidih) pada suhu 410 oC selama 1 jam sampai larutan jernih. Setelah dingin ditambahkan 50 ml aquades dan 20 ml NaOH 40%, lalu didestilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer yang berisi campuran 10 ml H 3 BO 3 2% dan 2 tetes indikator bromcherol green-methyl red berwarna merah muda (1:2). Setelah volume hasil tampungan (destilat) menjadi 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, destilasi dihentikan dan destilat dititrasi dengan HCl 0,10 N sampai berwarna merah muda. Perlakuan yang sama dilakukan juga terhadap blanko. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Protein (%) = N (%) x 6,25 5) Kadar abu tidak larut asam (BSN 2000) Analisis
kadar
abu
tidak
larut
asam
dilakukan
berdasarkan
SNI 01-3836-2000. Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu, dididihkan dengan 25 ml HCl encer selama lima menit. Abu tidak larut asam disaring
16
melalui krus kaca masir atau kertas saring bebas abu. Proses tersebut dilanjutkan dengan menambahkan air panas hingga bebas klorida. Kertas saring kemudian dimasukkan dalam oven hingga kering. Kertas saring tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam cawan yang telah ditimbang kemudian dipijarkan di ruang asam sampai tidak berasap. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tanur selama enam jam. Cawan selanjutnya didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Perhitungan kadar abu tidak larut asam dilakukan menggunakan rumus berikut.
3.4.2 Analisis serat pangan (Asp et al. 1983) Analisis serat pangan dilakukan
mengacu
pada metode multi enzim
(Asp et al. 1983). Serat pangan terdiri atas serat pangan larut dan serat pangan tak larut. Analisis serat pangan diawali dengan menghaluskan sampel kemudian dihomogenkan dan diliofilisasi. Sampel yang akan digunakan adalah sampel dalam keadaan tanpa lemak dan air. Oleh karena itu, dilakukan ekstraksi lemak dan pengeringan. Sampel tanpa lemak dan air ditimbang sebanyak 1 gram kemudian ditambahkan dengan 25 ml buffer phospat dan 0,1 ml enzim thermamil. Campuran tersebut dipanaskan pada suhu 80 0C selama 15 menit, kemudian didinginkan dan ditambahkan dengan HCl 4N hingga pH menjadi 1,5. Proses tersebut dilanjutkan dengan menambahkan suspensi pepsin sebanyak satu ml, kemudian diinkubasi dalam suhu 37 0C selama 2 jam. Hasil yang diperoleh ditambahkan dengan NaOH 4N hingga pH menjadi 6,8. Sampel kemudian ditambahkan dengan suspensi pankreatin dan diinkubasi dalam suhu 37 0C selama dua jam. Selanjutnya dilakukan pengaturan pH kembali dengan menggunakan HCl 4N hingga diperoleh larutan sampel dengan pH 4,5. 1. Analisis serat pangan tidak larut air (IDF) Analisis serat pangan tak larut air dilakukan dengan menyaring larutan sampel pH 4,5 dengan kertas saring Whatman 40 hingga menghasilkan filtrat dan residu. Residu yang terdapat pada kertas saring dibilas dengan akuades dan dicuci dengan 50 ml etanol 78%. Kertas saring tersebut kemudian dicuci dengan aseton dan dipanaskan dalam oven dengan suhu 105 0C selama 3 jam. Kertas saring
17
didinginkan, kemudian ditimbang. Kertas saring tersebut selanjutnya dilipat dan dimasukkan dalam cawan yang telah ditimbang. Cawan tersebut kemudian diarangkan dan ditanur dalam suhu 550 0C. Cawan didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Perhitungan serat pangan tidak larut air dilakukan dengan menggunakan rumus berikut.
Keterangan : A = Berat sampel B = Berat kertas saring kosong C = Berat kertas saring + residu setelah dioven D = Berat cawan porselen kosong E = Cawan porselen + abu setelah ditanur 2. Analisis serat pangan larut air (SDF) Analisis serat pangan larut air dilakukan dengan menambahkan 500 ml etanol 95% pada filtrat yang diperoleh dari analisis serat pangan tak larut. Larutan tersebut dipanaskan hingga suhu 60 0C dalam waterbath, kemudian didiamkan selama 1 jam. Larutan disaring dengan kertas saring Whatman 40 hingga menghasilkan residu dan filtrat. Residu yang terdapat pada kertas saring kemudian dibilas dengan akuades dan dicuci dengan 50 ml etanol 78%, selanjutnya dicuci kembali dengan aseton. Kertas saring tersebut dipanaskan dalam oven selama tiga jam pada suhu 105 0C. Kertas saring kemudian didinginkan dan ditimbang, selanjutnya dilipat dan dimasukkan ke dalam cawan yang telah ditimbang. Cawan tersebut kemudian diarangkan dan ditanur pada suhu 550 0C. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator, selanjutnya ditimbang. Perhitungan serat pangan larut air dilakukan dengan menggunakan rumus berikut.
Keterangan : A = Berat sampel F = Berat kertas saring kosong G = Berat kertas saring + residu setelah dioven H = Berat cawan porselen kosong I = Cawan porselen + abu setelah ditanur
18
3.4.3 Analisis rendemen (Andayani et al. 2008) Ekstrak P. australis yang dihasilkan berdasarkan metode penelitian Andayani et al. (2008) yang dimodifikasi. Perhitungan rendemen ekstrak kasar menggunakan rumus sebagai berikut.
Keterangan : A = bobot awal sampel (gram) B = bobot botol kosong (gram) C = bobot sampel+botol setelah ekstraksi (gram) 3.4.4 Uji kandungan total fenol (Yangthong et al. 2009) Uji kandungan total fenol yang dilakukan mengacu pada metode penelitian Yangthong et al. (2009). Ekstrak kasar dengan berat sekitar 5 - 10 mg ditimbang lalu diilarutkan dengan 2 ml etanol 95%. Kemudian larutan ditambahkan 5 ml akuades dan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Campuran didiamkan selama lima menit dan ditambahkan 1 ml Na 2 CO 3 5% (b/v). Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi dalam kondisi gelap selama satu jam. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 725 nm. Asam galat digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, dan 70 mg/l. Nilai total fenol sampel P. australis dinyatakan dalam mg GAE/1000 g sampel. 3.4.5 Uji aktivitas antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2009) Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Metode tersebut didasarkan pada kemampuan sampel yang digunakan dalam mereduksi radikal bebas stabil DPPH. Satu mg ekstrak kasar dan BHT sebagai kontrol positif ditimbang, kemudian ditambahkan etanol dengan perbandingan 1:1000. Sebanyak 1,3 g DPPH diencerkan dengan 25 ml etanol. Satu µl etanol dimasukkan ke dalam microwell plate yang telah disiapkan. Setelah itu, dilakukan pengisian ekstrak dengan beberapa konsentrasi dan penambahan larutan DPPH. Campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 517 nm.
19
Persentase penghambatan aktivitas radikal bebas diperoleh dari nilai absorbansi sampel. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi sampel dan presentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai konsentrasi penghambatan aktivitas radikal bebas sebanyak 50% (IC 50 ) dihitung dengan menggunakan persamaan regresi. Nilai IC 50 diperoleh dengan memasukkan y = 50 serta nilai A dan B yang telah diketahui. Nilai x sebagai IC 50 dapat dihitung dengan persamaan : y = A + B Ln (x) Keterangan : y = persen inhibisi x = konsentrasi sampel (ppm) A = slope B = intercept 3.4.6 Uji fitokimia (Harborne 1987) Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya komponen
bioaktif
yang terdapat pada sampel P. australis. Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, dan tannin. 1) Alkaloid Uji alkaloid dilakukan dengan melarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi dragendorff, pereaksi meyer, dan pereaksi wagner. Hasil uji positif diperoleh bila terbentuk endapan putih kekuningan dengan pereaksi meyer, endapan coklat dengan pereaksi wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi dragendorff. Pereaksi meyer dibuat dengan menambahkan 1,36 HgCl 2 dengan 0,5 g KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi wagner berwarna coklat dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 gram iodin dan 2 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi dragendorff berwarna jingga dibuat dengan cara 0,8 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air.
20
2) Triterpenoid/steroid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering lalu ditambahkan 10 tetes anhidrat asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. 3) Saponin (uji busa) Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. 4) Fenol Hidrokuinon Satu gram sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5%. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru. 5) Flavonoid Sejumlah sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. 6) Tanin Sejumlah sampel ditambahkan FeCl 3 kemudian campuran dihomogenkan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah pada campuran. 3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data (Steel dan Torrie 1981) Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor. Data hasil pengujian yang diolah menggunakan RAL adalah total fenol dan aktivitas antioksidan. Semua perlakuan dilakukan sebanyak dua kali ulangan. 1. Total fenol Hipotesis rancangan acak lengkap (RAL) terhadap total fenol adalah sebagai berikut (α i = 0) : HO
: jenis pelarut tidak berpengaruh nyata terhadap kandungan total fenol
H1
: jenis pelarut berpengaruh nyata terhadap kandungan total fenol
21
2. Aktivitas antioksidan Hipotesis rancangan acak lengkap (RAL) terhadap aktivitas antioksidan adalah sebagai berikut (α i = 0): HO
: jenis pelarut tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas antioksidan
H1
: jenis pelarut berpengaruh nyata terhadap aktivitas antioksidan Faktor yang digunakan sebagai perlakuan adalah jenis pelarut yang
digunakan yang terdiri dari 3 taraf, yaitu metanol, etil asetat dan n-heksana. Model rancangan yang digunakan adalah : y = µ + α i + є ij Keterangan ; y µ αi є ij
= hasil pengamatan faktor A taraf ke-i (i=1,2,3) pada ulangan ke-j (j=1,2) = rataan umum = pengaruh faktor jenis pelarut taraf ke-i = sisaan akibat jenis pelarut taraf ke-i pada ulangan ke-j Analisis ragam digunakan untuk menganalisis data. Data yang diperoleh
kemudian dianalisis menggunakan rancangan acak lengkap dengan uji lanjut Duncan p<0,05.
Keterangan : Sy KTS r qa’ Rp
= Significant range = kuadran tengah sisa = ulangan = significant studentized range = wilayah nyata terkecil dari nilai rata-rata
