14
3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Agustus 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan; Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Histopatologi, Ruang Diskusi Histopatologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi (KRP), Fakultas kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama berupa ikan bandeng (Chanos chanos) dengan ukuran 200-250 g/ekor. Ikan bandeng yang diamati adalah ikan bandeng yang disimpan pada suhu chilling. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis proksimat meliputi H2SO4 (MERCK p.a.), kjeltab Selenium (MERCK p.a.), NaOH (MERCK p.a.), H3BO3 (MERCK p.a.), n-heksana (MERCK p.a.), dan HCl (MERCK p.a.). Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat histologi terdiri dari larutan Buffer Normal Formalin 10% (MERCK p.a.), alkohol 50-100% (MERCK p.a.), xylol (MERCK p.a.), parafin (MERCK p.a.), hematoksilin (MERCK), eosin (MERCK), dan mounting agent (MERCK). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sokhlet (SIBATA SB 6), tabung kjehdahl (PYREX), tanur pengabuan (Yamato FM 38), timbangan analitik (AND HF 400), oven (Yamato DV 40), cetakan yang terbuat dari kertas kalender, rotary mikrotom (Yamato Kohki LR-85), Mikroskop Cahaya Olympus BX51, Microcular MD 130 Electron Eyepiece serta peralatan uji organoleptik. 3.3 Metode Pengambilan Sampel Ikan bandeng yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari daerah tambak Kampung Melayu, Teluk Naga, Tanjung Pasir, Kabupaten TangerangBanten. Bobot ikan bandeng yang diamati berkisar antara 200-250 gram/ekor. Ikan bandeng ini diambil dengan menggunakan pancing. Setelah ditangkap, ikan langsung dimatikan. Ikan dimatikan dengan cara menusuk kepala bagian medula oblongata yang menyebabkan ikan langsung mati.
15
3.4 Prosedur Analisis Pengujian organoleptik dilakukan terhadap sampel ikan bandeng untuk menentukan tahapan post mortem ikan bandeng tersebut. Sampel kulit ikan bandeng pada fase prerigor, rigormortis, post rigor, dan fase busuk diambil serta dilakukan analisis
pembuatan
dan pengamatan
preparat
jaringan
kulit
menggunakan mikroskop. Pada sampel kulit ikan bandeng juga dilakukan uji proksimat untuk mengetahui komposisi kimia kulit ikan bandeng tersebut. 3.4.1 Uji organoleptik (BSN 2006) Penentuan fase
kemunduran mutu pada
ikan
bandeng dilakukan
menggunakan metode sensori, yaitu secara organoleptik. Pengujian organoleptik merupakan cara pengujian menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk menilai mutu produk. Pengujian organoleptik ini mempunyai peranan yang penting sebagai pendeteksian awal dalam menilai mutu untuk mengetahui penyimpangan dan perubahan dalam produk. Pada uji organoleptik ini, ada beberapa syarat yang harus disepakati oleh panelis, antara lain tertarik dan mau, terampil dan konsisten dalam mengambil keputusan, siap sedia pada saat dibutuhkan dalam pengujian, tidak menolak contoh yang akan diuji, berbadan sehat, bebas dari penyakit THT dan tidak buta warna, serta jumlah panelis minimum untuk satu kali pengujian adalah 15 orang (semi-terlatih). Penetapan fase kemunduran mutu pada ikan dilakukan menggunakan alat bantu berupa lembar nilai (score sheet) yang telah ditetapkan oleh Badan Standardisasi nasional (BSN) dengan SNI 01-2346-2006 (Lampiran 1). 3.4.2 Analisis proksimat Analisis
proksimat
adalah
suatu
metode
analisis
kimia
untuk
mengidentifikasi kandungan nutrisi pada suatu bahan. Analisis proksimat terhadap kulit ikan bandeng meliputi analisis kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat. (1) Analisis kadar air (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 oC selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit) hingga dingin kemudian ditimbang sampai beratnya konstan. Sampel sebesar 5 gram kemudian
16
ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 150 oC selama 8 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus : kadar air % =
B−C x 100% B−A
Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat cawan yang diisi sampel (gram) C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram) (2) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 oC selama 30 menit. Cawan abu tersebut kemudian dimasukkan ke dalam desikator (30 menit) dan ditimbang. Sampel sebesar 5 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Selanjutnya dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan (600 oC) selama 7 jam. Cawan dimasukkan ke dalam desikator dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar abu kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus : Kadar abu % =
C−A x 100% B−A
Keterangan : A = Berat cawan abu porselen kosong (gram) B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram) C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram) (3) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Sampel sebesar 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berta tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung sokhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung sokhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi sokhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 oC menggunakan pemanas listrik selama
17
16 jam. Pelarut lemak yang ada di dalam labu lemak didestilasi hingga semuanya menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak. Selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC dan didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3). Perhitungan kadar lemak kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus : kadar lemak % =
W3 − W2 x 100% W1
Keterangan : W1 = Berat sampel (gram) W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) (4) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari destruksi, destilasi dan titrasi. (a) Tahap destruksi Kulit ikan bandeng ditimbang sebesar 1 gram kemudian sampel tersebut dimasukkan ke dalam tabung kjehdahl. Sebanyak 0,25 gram selenium dan 25 ml H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening . (b) Tahap destilasi Sampel yang telah didestruksi dituangkan ke dalam labu destilasi lalu ditambahkan akuades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 10 ml berisi larutan H3BO3 dan 2 tetes indikator (cairan methyl red dan brom creosol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 10 ml destilat dan berwarna hijau kebiruan. (c) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat.
18
Perhitungan kadar protein kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus : N % =
ml HCl − ml HCl blanko x 0,1 N HCl x 14,007 x 100% mg sampel
Kadar protein = % N x 6,25 (5) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005) Kadar karbohidrat ditentukan dengan cara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar protein. Perhitungan kadar karbohidrat kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus : Karbohidrat (%) = 100% - (% kadar air - % kadar abu - % kadar protein - % kadar lemak) 3.4.3 Pembuatan preparat dengan metode parafin (Angka et al. 1984) Pengamatan jaringan kulit ikan diawali dengan pembuatan preparat kulit ikan bandeng (Chanos chanos) kemudian pengambilan gambar objek pada mikroskop. Pembuatan preparat dilakukan dengan metode parafin. Tahapannya terdiri atas fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi, embedding, blocking, trimming,
pemotongan
jaringan,
pewarnaan,
serta
perekatan
jaringan
menggunakan mounting agent (Lampiran 2). Fiksasi dilakukan dalam larutan BNF (Buffer Normal Formalin) selama lebih dari 24 jam (3 hari), setelah itu larutan fiksasi dibuang, kemudian dilakukan dehidrasi melalui perendaman jaringan dalam alkohol pada suhu ruang dengan perincian: 1) Alkohol 70% selama 24 jam 2) Alkohol 80% selama 2 jam 3) Alkohol 90% selama 2 jam 4) Alkohol 95% selama 2 jam 5) Alkohol 95% selama 2 jam 6) Alkohol 95% selama 2 jam 7) Alkohol 100% selama 12 jam Proses clearing dimulai dari perendaman sampel dalam clearing agent. Jaringan direndam dalam alkohol:xilol (1:1) selama 30 menit yang dilanjutkan dengan tahap impregnasi dan embedding. Impregnasi adalah perendaman jaringan
19
ke dalam xilol:parafin (1:1) dalam gelas piala selama 45 menit. Embedding adalah perendaman jaringan di dalam parafin cair, yakni parafin I, parafin II, parafin III masing-masing selama 45 menit. Kedua proses ini berlangsung di dalam oven pada suhu 60 oC. Jaringan yang telah diembedding dalam parafin cair lalu di blok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair yang kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku, seperti kertas kalender, dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Setelah itu jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan membeku dalam suhu ruang selama 24 jam. Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari cetakan lalu ditrimming menggunakan silet. Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan mikrotom putar setebal 4 μm. Pita-pita parafin yang terbentuk diambil dengan jarum kemudian diletakkan di permukaan air hangat (45 oC-50 oC). Pita-pita parafin kemudian direkatkan pada gelas obyek dan dibiarkan hingga mengering. Proses pewarnaan dilakukan menggunakan hematoksilin dan eosin. Pewarnaan diawali dengan perendamaan gelas obyek ke dalam xilol I dan xilol II masing-masing selama 2 menit, dilanjutkan perendaman dalam alkohol absolut (100%), 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50% masing-masing selama 2 menit. Setelah itu, obyek dibilas dengan akuades selama 2 menit. Kemudian obyek dimasukkan ke dalam pewarna hematoksilin selama 7 menit dan dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap. Obyek direndam kembali dalam pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci kembali dengan akuades. Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 50%, 70%, 85%, 90%, 100%, 100%, xilol I, xilol II masing-masing selama 2 menit. Proses selanjutnya adalah penutupan gelas obyek dengan pemberian mounting agent atau Canada Balsam pada gelas obyek dan ditutupi dengan gelas penutup kemudian dikeringkan selama 24 jam. Pengamatan preparat awetan dilakukan dengan mikroskop cahaya Olympus BX51 dengan perbesaran 200x. Proses pengambilan gambar dilakukan dengan Microcular MD 130 Elektron
20
Eyepiece. Diagram alir pembuatan preparat kulit ikan bandeng (Chanos chanos) dapat dilihat pada Gambar 3.
Ikan bandeng
Pemotongan bagian kulit Fiksasi dengan larutan BNF 10% Dehidrasi dengan alkohol berseri Penjernihan (clearing) dengan alkohol-xilol (1:1) Impregnasi dengan menggunakan xilol-parafin (1:1) Penanaman (embedding) dalam parafin Trimming Pemotongan dengan mikrotom Pelekatan pita parafin pada gelas obyek Pewarnaan Hematoksilin-Eosin Perekatan jaringan dengan mounting agent Preparat awetan
Pengamatan dengan mikroskop Pengambilan gambar Gambar 3 Diagram alir pembuatan preparat kulit ikan bandeng (Chanos chanos).
21
3.5 Analisis Data Hasil yang diperoleh dari pengamatan dan pengukuran terhadap nilai organoleptik kulit ikan bandeng (Chanos chanos) dicari nilai rata-ratanya. Nilai rata-rata tersebut dihitung menggunakan rumus berikut (BSN 2006): 𝑛
𝑋=
𝑋𝑖 𝑖=1
n Keterangan: X
: nilai rata-rata
Xi
: nilai X ke-i
N
: jumlah data Sampel kulit ikan bandeng pada setiap tahapan kemunduran mutu
(prerigor, rigormortis, postrigor, dan busuk) diamati. Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis secara deskriptif kualitatif dengan melihat preparat histologi menggunakan mikroskop.
