3. BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat Penelitian Penelitian
dilaksanakan
di
Laboratorium
Terpadu
Immunologi,
Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner dan Kandang Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung dari bulan Januari hingga Juli 2010.
3.2 Metode Penelitian 3.3.1 Persiapan dan Pemeliharaan Kelinci sebagai Hewan Coba Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini merupakan kelinci lokal jantan sebanyak dua ekor, berumur 6 bulan dengan bobot badan masing-masing 1 kg, yang berasal dari Balai Penelitian Peternakan (Balitnak) Ciawi, Bogor. Lima hari sebelum imunisasi aktif, kelinci dipastikan bebas dari koksidiosis dan scabies. Preparat sulfa dengan dosis 30-60 mg/kgBB diberikan secara peroral yang dilarutkan kedalam air minum disertai dengan pemeriksaan tinja selama maksimal tiga hari untuk pencegahan koksidiosis. Ivomex® dengan dosis 0.2 µg/kgBB diberikan melalui injeksi subkutan untuk mencegah infeksi agen parasit lain terutama sarcoptes scabieii. Kelinci dipelihara secara individual dalam kandang dan diberi pakan berupa pelet serta sayuran (wortel dan kangkung).
3.3.2 Persiapan Antigen E/S Fasciola gigantica Antigen yang digunakan untuk imunisasi dalam penelitian ini merupakan antigen E/S Fasciola gigantica asal domba dan kerbau dari hasil penelitian Satrija (2009). Fasciola gigantica dewasa dikoleksi dari hati kerbau di Rumah Potong Hewan (RPH) Kota Bekasi serta hati domba dari Tempat Pemotongan Hewan (TPH) di Empang-Kota Bogor. Antigen berupa protein E/S F. gigantica diproduksi dan diisolasi dari cacing dewasa menurut metode Satrija et al. (2007) yang dimodifikasi. Cacing hati (F. gigantica) dewasa yang telah dikoleksi dicuci tiga kali dengan larutan NaCl fisiologis sebelum dicuci dengan larutan PBS steril. Untuk menyiapkan antigen dari ES F. gigantica yang telah dicuci NaCl fisiologis, dalam tabung sentrifus 50 ml berisi larutan RPMI 1640 yang mengandung antibiotik
penisilin 1000 IU dan streptomisin 100 µg permililiter dalam larutan RPMI 1640 pada suhu 37oC selama 4-6 jam. Setiap tabung diisi dengan 10 ml RPMI 1640 dan 10 ekor cacing dewasa. Setelah inkubasi, protein ES dipanen dengan melakukan sentrifugasi terhadap larutan RPMI dengan kecepatan 1500g pada suhu 4oC selama 10 menit. Selanjutnya supernatant yang mengandung protein ES dipisahkan dari endapanProtein E/S F. gigantica yang didapat selanjutnya disimpan dalam tabung-tabung mikro volume 1,5 ml pada suhu -20oC sampai saat digunakan sebagai antigen untuk imunisasi kelinci.
3.3.3 Pengukuran Konsentrasi Protein Antigen dengan Metode Bradford Konsentrasi protein sampel antigen E/S Fasciola gigantica diukur menggunakan metode Bradford (1976) sebelum digunakan untuk imunisasi. Metode Bradford digunakan secara luas untuk penentuan protein secara kuantitatif dengan menggunakan pereaksi Commasie Briliant Blue. Konsentrat Bradford terdiri dari 100 mg Commasie Briliant Blue yang dilarutkan dalam 50 ml etanol 95% dan ditambahkan sebanyak 100 ml asam fosfat 85% (w/v) serta diencerkan dengan aquabides hingga volume larutan mencapai 1 liter kemudian disaring menggunakan kertas saring. Konsentrat Bradford tersebut diencerkan dengan dua kali pengenceran menggunakan aquades dengan perbandingan 1:4 dan 1:9. Larutan protein Bovine Serum Albumin (BSA) standar dibuat dengan perbandingan 1:1 antara Bovine Serum Albumin (BSA) dengan aquabides (1 mg dalam 1 ml) kemudian dihomogenkan. Kemudian sebanyak 11 tabung reaksi yang telah disterilisasai disiapkan. Masing-masing tabung diisi dengan larutan BSA dan aquabides (Tabel 1). Masing-masing larutan dihomogenkan dan diambil sebanyak 100 µl dari setiap tabung kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tabung baru yang sebelumnya telah dimasukkan 5 ml larutan Bradford sesuai urutan tabung.
Tabel 1 Tata cara pengisian larutan BSA dan Aquabides Tabung
Larutan BSA
Aquabides
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0 µl 100 µl 200 µl 300 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl 1000 µl
1000 µl 900 µl 800 µl 700 µl 600 µl 500 µl 400 µl 300 µl 200 µl 100 µl 0 µl
Larutan protein Bovine Serum Albumin (BSA) digunakan untuk membuat grafik konsentrasi protein standar pada spektrofotometer yang diukur dengan panjang gelombang (λ) 595 nm sebelum mengukur protein sampel antigen. Setelah itu sampel berupa ES cacing yang akan diperiksa dibuat duplo. Masingmasing sampel diambil sebanyak 100 µl yang dimasukkan ke dalam masingmasing tabung yang kemudian ditambahkan dengan larutan Bradford sebanyak 5 ml. Larutan Bradford dan sampel dilarutkan hingga homogen kemudian dilakukan pembacaan
konsentrasi
menggunakan
spektrofotometer
dengan
panjang
gelombang (λ) 595 nm.
3.3.4 Teknik Imunisasi Dua ekor kelinci diimunisasi dengan antigen E/S Fasciola gigantica. Dosis antigen yang diberikan adalah 150 µg/ekor. Antigen pada imunisasi pertama diberikan tanpa adjuvant. Rute penyuntikkan dilakukan secara intravena (i.v). Imunisasi kedua diberikan seminggu kemudian dengan rute subkutan (s.c). Antigen pada imunisasi kedua ditambah adjuvant Freund lengkap (Freund’s complete adjuvant) dengan perbandingan 1:1. Imunisasi ketiga hingga imunisasi kelima masing-masing diberikan dengan selang dua minggu. Antigen pada imunisasi ketiga hingga kelima ditambah adjuvant Freund tak lengkap (Freund’s incomplete adjuvant) dengan perbandingan 1:1. Imunisasi diberikan dengan rute subkutan (s.c). Tata cara penyuntikkan antigen dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 2 Tata cara penyuntikkan antigen Kelinci 1 (KP) 2 (KH) Keterangan:
Antigen E/S F. gigantica asal Domba E/S F. gigantica asal Kerbau
Penyuntikkan (Minggu ke-) 1 3 5
7
Tanpa Adjuvant
FAC
FAI
FAI
FAI
Tanpa Adjuvant
FAC
FAI
FAI
FAI
0
Tanpa Adjuvant (Rute i.v) FAC = Freund’s Adjuvant Complete (Rute s.c) FAI = Freund’s Adjuvant Incomplete (Rute s.c) KP = Kelinci yang diimunisasi E/S F. gigantica asal domba KH = Kelinci yang diimunisasi E/S F. gigantica asal kerbau
3.3.5 Teknik Pengambilan Darah Darah kelinci diambil sebanyak 1,5-2 ml melalui vena auricularis dengan menggunakan disposable syringe 3 ml (IACUC 2010). Pengambilan darah pertama dilakukan sebelum kelinci diimunisasi. Pengambilan darah kedua dilakukan seminggu setelah pengambilan darah pertama dan pengambilan darah ketiga dilakukan empat minggu setelah pengambilan darah kedua. Pengambilan darah berikutnya dilakukan setiap seminggu sekali hingga minggu ke-14. Sampel darah dimasukkan dalam tabung reaksi untuk diambil serumnya.
3.3.6 Teknik Pengumpulan Serum Darah yang diambil dari kedua kelinci, dikumpulkan dalam tabung terpisah yang dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan posisi miring selama 30 menit. Kemudian disimpan dalam refrigerator semalam pada suhu 4oC. Serum yang didapat dikumpulkan menggunakan pipet mikro. Bila perlu, darah disentrifus dengan kecepatan 2000g selama 15 menit. Serum yang didapat dipisahkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro dan diberi tanggal pengambilan darah serta kode kelinci.
3.3.7 Pembuatan Antigen Terlarut Antigen dan antibodi harus dapat berdifusi dengan baik dalam uji presipitasi menggunakan media agar. Antibodi dalam serum memiliki ukuran molekul protein yang kecil sehingga mudah berdifusi sedangkan antigen E/S
memiliki molekul protein yang besar sehingga harus dipecah salah satunya dengan menggunakan teknik sonikasi. Teknik sonikasi digunakan dalam penelitian ini untuk membuat antigen E/S Fasciola gigantica menjadi terlarut (solubel) dalam agar (Parimala dan Ishaq 2005). Antigen E/S Fasciola gigantica dimasukkan dalam tabung sonikasi. Tabung sonikasi dimasukkan dalam sonikator yang berisi air bersuhu 4oC. Hal ini bertujuan untuk mendinginkan tabung dan mencegah kerusakan antigen karena panas yang ditimbulkan selama proses berlangsung. Proses sonikasi dilakukan kurang lebih selama tiga menit dengan frekuensi 50.000 Hz.
3.3.8 Teknik Agar Gel Precipitation Test (AGPT) Agar Gel Precipitation Test (AGPT) merupakan uji presipitasi antigen yang terlarut. Teknik uji presipitasi dalam penelitian ini menggunakan metode Ouchterlony (1953). Bahan untuk AGPT terdiri atas Phosphate Buffer Saline (PBS) dengan pH 7,4, aquabides, agarose 1%, dan Na acide 0,001%. Campuran tersebut dipanaskan dalam microwave atau dengan penangas air sampai agar larut dan mendidih. Sebanyak 4 ml larutan agar dituang diatas gelas objek hingga seluruh permukaan gelas objek tertutup dengan agar dan dibiarkan hingga mengeras. Agar yang telah mengeras, dilubangi menggunakan puncher agar. Lubang pada bagian tengah diisi dengan antigen yang telah disonikasi dan enam lubang disekelilingnya diisi dengan serum antibodi yang akan diuji (Boulanger 1967). Agar disimpan di dalam wadah tertutup yang telah dialasi dengan kertas atau tissue basah untuk menjaga kelembaban dan didiamkan selama 24 hingga 48 jam pada suhu ruang. Pengamatan dapat dilakukan dengan melihat garis presipitasi yang terbentuk.
`
3.3.9 Pemurnian Immunoglobulin G (Ig G) Serum kelinci positif mengandung antibodi dimurnikan menggunakan
metode pemurnian dari Montage® Antibody Purification Kit and Spin Columns with PROSEP®-A Media. Media PROSEP®-A yang digunakan dipre-ekuilibrasi menggunakan 10 ml Binding Buffer A dengan mensentrifus spin column dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4oC. Sampel berupa serum kelinci anti
Fasciola gigantica kerbau dan domba disaring menggunakan 0,2 µm Steriflip-GP filter. Serum yang telah difiltrasi ditambahkan dengan Binding Buffer A dengan volume yang sama banyak (perbandingan 1:1 v/v) kemudian disentrifus dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4oC. Supernatan didasar tabung dibuang kemudian spin column dibilas menggunakan 20 ml Binding Buffer A dan disentrifus dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4oC untuk menghilangkan kontaminan yang tidak terikat. Sepuluh ml Elution Buffer B2 ditambahkan langsung kedalam spin column dalam tabung steril baru yang telah diisi 1,3 ml Neutralization Buffer C kemudian disentrifus dengan kecepatan 4500g selama 40 menit pada suhu 4oC. Supernatan didasar tabung yang mengandung Ig G diambil, kemudian difiltrasi menggunakan Amicon 30.000 dan disentrifus dengan kecepatan 4500g selama 25 menit pada suhu 4oC. Konsentrasi Ig G dihitung menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan metode Bradford (1976). Supernatan berupa Ig G yang tertinggal didalam filter disimpan dalam tabung-tabung mikro volume 1,5 ml, disimpan dalam suhu -20oC. Ig G yang telah dipurifikasi diuji kembali dengan AGPT menggunakan antigen E/S Fasciola gigantica.
