3 BAC Biochemie , 2 semester. E. De Herdt

A-PDF Labo MERGER MCB:DEMO inleiding

LABORATORIUM MOLECULAIRE CELBIOLOGIE 3° BAC Biochemie 2007 – 2008, 2° semester

E. De Herdt

Inleiding: Planning, doelstelling, evaluatie Informatie betreffende chemicaliën Colorimetrie en spectrofotometrie Buffers Automatische pipetten (handleiding + oefening) Eiwitzuivering: computersimulatie Subcellulaire celfractionatie, SDH activiteit Zure fosfatase bestudering SDS-PAGE van viseiwitten – evolutionaire verwantschap (eiwitfingerprinting) Detectie van DNA polymorfisme TPA-25 (Alu) via PCR

GROEP T Leuven Engineering School

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 1

Labo MCB: inleiding

Planning van de experimenten in het kader van het labo MCB (3°BAC Bi) Zitting 1 2 3 4 5

Experiment eiwitzuivering, computersimulatie introductie automatische pipetten + oefening Subcelluaire celfractionatie, SDH bepaling (Verse varkensnier meebrengen !!!) Zure fosfatase bestudering DNA polymorfisme (DNA isolatie + PCR) SDS-PAGE van viseiwitten, PCR detectie

Wie iedereen iedereen iedereen iedereen iedereen

Verslagen zo vlug mogelijk af te geven, doch uiterlijk W14, vrijdag 18u! Gebruik de electronische versie van de labonota’s (zie Toledo) om uw verslag te maken (uw eigen tekst in een andere kleur of Italic aub). E. De Herdt L. Borremans F. Mahieu

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 2

Labo MCB: inleiding

Labo MCB: doelstelling en evaluatie Lees aandachtig deze inleiding en de eerste delen van het labonota’s betreffende colorimetrie, spectrofotometrie, buffers en de bediening van de automatische pipet vooraleer je naar de eerste labozitting komt. De laboteksten zijn zo opgevat dat de experimenten en de uit te voeren handelingen stap voor stap uitgelegd en aangegeven worden. Dit wil niet zeggen dat je niet meer moet nadenken over wat je aan het doen bent op een gegeven moment. Om u hiertoe wat meer te stimuleren moet je VOOR DAT JE NAAR EEN LABOZITTING KOMT het uit te voeren experiment thuis grondig voorbereiden. Dit behelst op zijn minst het lezen van de tekst en het invullen van het eerste deel van het verslag. Eventueel kunnen verdunningsschema's, bufferoplossingen, enz. reeds uitgerekend worden. Lees tijdens de voorbereiding ook even de vragen door die je in het verslaggedeelte zult moeten invullen zodanig dat je hiermee rekening kan houden tijdens de uitvoering van uw experimenten. Bij het begin van elke labozitting zal de verantwoordelijke uw voorbereiding controleren of een korte toets afnemen ! Gebruik voor het maken van uw verslag UITSLUITEND de bijgevoegde invulbladen; eventueel aangevuld met de nodige grafieken en gevraagde bijlagen. De evaluatie is voor - 50 % gebaseerd op uw prestatie tijdens het labo zelf: voorbereiding, inzet, enthousiasme, leergierigheid, handigheid, (tijdens het labo op elk ogenblik weten wat je aan het doen bent of het u tenminste afvragen; bv. weten waarom je een bepaald product op een gegeven ogenblik toevoegt, waarom je incubeert, ...). Het afwerken van een experiment binnen de voorziene tijd is hieraan ondergeschikt. - 50 % op het ingediende verslag: beantwoording van de vragen, berekeningen (aantal beduidende cijfers!, grafieken, enz. Ieder lid van de groep is mede verantwoordelijk voor het verslag en krijgt hierop dus dezelfde punten (maak daarom het verslag samen).

Stel u steeds op de hoogte van de gevaren geassocieerd met chemische producten. Vergewis u daarom van de R/S zinnen en de MSDS (material safety data sheet) van de door u gehanteerde producten; deze zijn trouwens aanwezig in de desbetreffende fardes in het labo!!! Bron: Posters, Catalogi (R/S zinnen), Chemische kaarten (hard copy, software programma), en MSDS (hard copy van sommige en volledig op CDrom), Internet E. De Herdt, L. Borremans, F. Mahieu Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 3

Labo MCB: inleiding

INFORMATIE BETREFFENDE CHEMICALIEN In elk labo is er een farde aanwezig met alle MSDS voor de chemicaliën die gebruikt worden in het kader van een bepaald experiment. Consulteer deze aandachtig!!! Bijkomende informatie kan je opzoeken op internet, eventueel via de computers in het labo. Denk hierbij vooral aan de MSDS (Material Safety Data Sheet) waarin je alle veiligheidsinformatie kan terugvinden. Op het net ben je zeker dat je over de meest actuele informatie beschikt. Kijk hiervoor ook naar de datum van de laatste wijziging! Indien je de MSDS raadpleegt, moet je ook letten op de datum van de laatste wijziging. Welke site geeft de meest actuele veiligheidsinformatie? http://www.chemdat.de/ eenvoudig te doorzoeken chemicaliëndatabank van Merck; geen paswoorden nodig; bekijk de MSDS’s liefst in Engelstalige versie (meestal is deze de recentste!) http://www.acros.be/index_microsoft.html vlug MSDS opzoeken, geen registratie noodzakelijk! http://www.sigmaaldrich.com/suite7/Area_of_Interest/Europe_Home/Belgium/Nederla nds.html Een gratis registratie is noodzakelijk om MSDS te bekijken!

Ga op de drie verschillende sites na wat de betekenis is van de verschillende R-zinnen (RISK) en S-zinnen (SAFETY). Je kan ook de veiligheidsbrochure raadplegen die opgesteld werd door de vakgroep leven en die consulteerbaar is via Toledo. Ook op de site van de KUL, departement chemie, veiligheid en milieu kan je heel wat veiligheidsinformatie vinden: http://www.chem.kuleuven.ac.be/safety/Veiligheid/index.html Een directe link naar de betekenis van R en S zinnen: http://www.chem.kuleuven.ac.be/safety/Veiligheid/rens.html Een andere mogelijke bron van informatie zijn de chemiekaarten: boekvorm en/of CD-rom te raadplegen op PC of als hard copy in het labo aanwezig!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 4

Labo MCB: inleiding

Chemicaliën gebruikt tijdens de laboproef: Zure fosfatase Naam 4-aminoantipyrine

MG R/S zinnen 203.243 R:22,36/37/3 8 S: 26,36 Phenyl phosphate, C6H5Na2O4P.2H2O 3279-54-7 254.08 S: 22-24/25 F: diNa 10-21 fenol C6H5OH 108-95-2 94.11 R24/25/34 S28A, S45 citroenzuur C6H8O7 77-92-9 192.12 R36/37/38 S26/37/39 citraat, triNa C6H5Na3O7.2H2O 6132-04-3 294.10 S24/25 natriumhydroxide HNaO 1310-73-2 39.99 R35 S26/37/39/45 EDTA C10H14N2Na2O8 60-00-4 336.20 R36/37/38 S26/37/39 Natrium waterstof CHNaO3 144-55-8 84.01 S24/25 carbonaat Kalium K3Fe(CN)6 13746-66- 329.24 R32 ferricyanide 2 Natrium diwaterstoffosfaat

Formule C11H13N3O

NaH2PO4

CAS N° 83-07-8

10049-21- 137.99 5

S24/25

Synoniemen 4-amino-2,3-dimethyl-1phenyl-2-pyrazolin-5-on, Ampyrone

2-Hydroxy-1,2,3propanetricarboxylic acid

Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt Sodium bicarbonate Potassium hexacyanoferrate (III) Potassium ferricyanide Sodium phosphate, monobasic monohydrate

Chemicaliën gebruikt tijdens de laboproef: Succinaat dehydrogenase Naam Formule Triphenyl formazan C19H16N4

CAS N° 531-52-2

MG R/S zinnen 300.36 S24/25

2,3,5-triphenyl C19H15N4Cl tetrazolium chloride succinic acid, C4H4Na2O4 disodium salt fumarate C4H2Na2O4.H2O

298-96-4

334.8

150-90-3

162.05 S24/25

371-47-1

178.05 S24/25

Trichloor azijnzuur

C2HCl3O2

76-03-9

163.4

sucrose aceton natrium dithioniet

C12H22O11 C3H6O Na2S2O4

Groep T / 30-01-2008

Synoniemen Alpha-Phenylazo-Alphaphenylhydrazonotoluene

S24/25

Disodium succinate Maleic acid, disodium salt, hydrate S: TCA

R: 35, 24/25,26,45 57-50-1 342.30 S24/25 saccharose 67-64-1 58.08 R11/36, S9/16/26 2-Propanone 7775-14-6 174.09 R7/22/31, Sodium hydrosulfite S7/8/26/28A/43E

E. De Herdt

p. 5

Labo MCB: inleiding

COLORIMETRIE & SPECTROFOTOMETRIE Veel gekleurde oplossingen absorberen licht in verhouding tot de hoeveelheid gekleurd materiaal dat aanwezig is. De concentratie ervan kan dus afgeleid worden uit de hoeveelheid geabsorbeerd licht. Vele biochemische producten absorberen licht, soms zelfs in het ultraviolette gedeelte van het spectrum waardoor ze kleurloos tonen. Eigenlijk kan men dus een standaardoplossing maken van een gekende concentratie en de kleur visueel vergelijken met een oplossing van onbekende concentratie. Het is echter nauwkeuriger om een colorimeter of spectrofotometer te gebruiken waarin een fotoëlectrische cel de hoeveelheid licht meet welke door de oplossing gaat.

Figuur 1: Situering van zichtbaar - en U.V.- licht in het elektromagnetisch spektrum.

Bij een colorimeter wordt het licht van een wolframfilamentlamp door een gepaste filter gestuurd welke licht selecteert met een vrij grote spreiding in golflengte. Bij de spectrofotometer (Figuur 3) wordt een monochromator gebruikt welke een kleine bandbreedte aan golflengtes aflevert (enkele nm). Een prisma of diffractierooster geeft een spectrum waaruit met behulp van een spleet een bepaalde golflengte wordt geselecteerd. Dit toestel heeft de volgende voordelen: Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 6

Labo MCB: inleiding - Een spectrofotometer kan gebruikt worden om het absorptie spectrum te meten. Dit is een grafiek van absorptie ten overstaan van de golflengte; - De eenvoudige theorie van lichtabsorptie (zie hieronder) is enkel geldig voor monochromatisch licht. Een brede golflengteband vereist dus meer uitgebreide standaardisatie; - Indien de absorbtiepieken scherp zijn, is een spectrofotometer gevoeliger en selectiever dan een colorimeter. De eenvoudige colorimeter welke filters in plaats van een monochromator gebruikt is veel goedkoper en volstaat voor verschillende toepassingen.

Figuur 2: Een algemeen optisch systeem van een spectrofotometer

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 7

Labo MCB: inleiding Indien wit licht door een gekleurde oplossing gaat worden bepaalde golflengten van het licht selectief geabsorbeerd, de kleur van de oplossing is het resultaat van het transmissielicht! De maximum absorptie van gekleurde oplossingen gebeurt bij de tegenovergestelde kleur (rode oplossingen absorberen groen licht, enz.; zie figuur 4).

Figuur 4: Relatie tussen de kleur van een oplossing en de kleur van het geabsorbeerde licht. Tabel met het golflengtegebied van de verschillende kleuren

Colorimeters en spectrofotometers worden veel gebruikt in biochemisch onderzoek voor de concentratiebepaling in oplossing. Meestal zijn enkele µg materiaal voldoende. Het U.V.gebied van het licht is belangrijk voor de studie van eiwitten en nucleïnezuren! Veel producten zonder specifieke absorptieband kunnen chemisch of enzymatisch omgevormd worden tot gekleurde derivaten en dus colorimetrisch bepaald worden. De relatie tussen absorptie en concentratie moet bestudeerd worden aan de hand van standaardoplossingen van de component in kwestie. Het is meestal ook nodig de absorptie van een "blanco" te bepalen. Dit is een oplossing van alle componenten behalve deze welke moet bepaald worden, aangezien sommige zouden kunnen bijdragen of interfereren met de gemeten absorptie! Lampen:

- gasontladingslamp - thermische stralingslamp»»

»» 'spectral - line' fotometer; 'filter' fotometer.

Figuur 5:

Figuur 6:

Emissiespectrum van lichtbronnen

Welke cuvetten gebruiken

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 8

Labo MCB: inleiding WET VAN LAMBERT Dezelfde hoeveelheid van het invallende licht wordt geabsorbeerd per dikte eenheid, onafhankelijk van de intensiteit. Elke opeenvolgende laag absorbeert in dezelfde verhouding het invallende licht (bv. invallende licht = 100% en 50% wordt geabsorbeerd per laag dan zal de intensiteit van het licht verminderen als volgt: 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, enz.). De intensiteit van het licht doorheen de cel daalt dus exponentiëel: I = Ioe-kl

l = weglengte k = constante

I/Io = e-kl

I/Io = transmissie, T

of

log10(Io/I)

= k.l.log10 e = K.l

(K = 0,4343 x k = andere constante)

= A = absorptie (evenredig met weglengte l) = O.D.= optische densiteit = extinctie dus: A˜l

WET VAN BEER De absorptie van het licht is evenredig met het aantal absorberende molekulen (de transmissie daalt exponentiëel met het aantal absorberende moleculen): log10 Io/I ˜ c

c = concentratie in mol/l

dus: A˜c WET VAN LAMBERT-BEER Combineren we de twee wetten: log10 Io/I ˜ c.l = ε.c.l ε = molaire extinctiecoëfficiënt (l.mol-1.cm-1) Het is numeriek gelijk aan de absorptie van een één molair oplossing over een lengte van 1 cm. A=e.c.l

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 9

Labo MCB: inleiding Indien de weglengte constant wordt gehouden, is de absorptie van een oplossing recht evenredig met de molaire concentratie (indien de wet van Beer geldt!). De Wet van Lambert is steeds geldig; deze van Beer geldt meestal enkel voor verdunde oplossingen. Vanaf bepaald concentraties vermoedt men dat er associatie optreedt tussen de absorberende moleculen waardoor er een afzwakking van de absorptie gebeurt.

Het is gebruikelijk om een standaardcurve (A versus c) op te stellen om het concentratiegebied te kennen waarin de wet van Beer geldt (dit is immers afhankelijk van het substraat!). Binnen dit gebied, en indien de weglengte constant wordt gehouden, kan de concentratie van een oplossing bepaald worden uit de vergelijking van zijn lichtabsorptie met deze van een oplossing met gekende concentratie: c = A/Ast . cst Aangezien de absorptie een log10 schaal is, betekent een verhoging van de absorptie met één eenheid een tienvoudige daling van de transmissie: A=0

100 % van het licht getransmitteerd (doorgelaten)

A=1


A=2


Voor absorptiewaarden groter dan 1 (minder dan 10 % van het invallende licht wordt doorgelaten) betekent een kleine fout in de meting van het getransmitteerde licht een grote fout in absorptiewaarde! FOUTENBRONNEN - Bandbreedt van de geselecteerde golflengte; - Calibratie van het toestel; - Strooilicht; - Temperatuur; - Vuile of verkeerde cuvetten.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 10

Labo MCB: inleiding PRACTISCH In het labo zijn drie spectrofotometers aanwezig: Bausch & Lomb UVD21 Dit toestel is uitgerust met een doorstroomcuvet uit kwartsglas, dit wil zeggen de te meten oplossing wordt via een pompsysteen door een cuvet gezogen met een weglengte van 1 cm die bruikbaar is voor metingen in het UV of zichtbare gebied. Beide lampen, deuterium (UV) en tungsten (zichtbaar) kunnen niet tegelijkertijd branden. Metingen in UV en zichtbaar gebied moeten daarom gegroepeerd worden om niet telkens rekening te moeten houden met een kwartier opwarmtijd van elke lamp.. - zorg dat de oplossing vooraf goed gemengd werd; - de meting is destructief, dit wil zeggen het sample is verloren en wordt opgevangen in een afvalvat. Je moet dus voldoende oplossing hebben. (liefst 4 à 6 ml) - telkenmale een luchtbel in de meetcel terechtkomt zal de uitlezing variabel worden. - zuig de oplossing op en lees de display af zodra de meting stabiel is. Checklist: - zet de aflezing vooraf op A = 0 met water. Zuig af en toe een luchtbel op en kijk of de display steeds terug op nul komt. Zoniet moet de cuvet gereinigd worden (laboverantwoordelijke !!!) - Zuig nu uw sample op. Indien geen stabiele aflezing wordt bekomen, controleer dan de oplossing voor heterogeniteit of aanwezigheid van stof of neerslag.

Pye Unicam PU 8600 UV/VIS, Philips Dit toestel bevat een schuif voor vier cuvetten die één voor één voor de lichtbundel kunnen geschoven worden. Je kan het toestel dus gebruiken met standaardcuvetten uit glas, kwartsglas of plastic wegwerpcuvetten. Beide lampen, deuterium (UV) en tungsten (zichtbaar) kunnen tegelijkertijd branden. Metingen in UV en zichtbaar gebied kunnen dus zonder problemen afgewisseld worden.

GENESYS 10 UV spectrofotometer Dit toestel is ook uitgerust met een doorstroomcuvet en kan zowel gebruikt worden voor zichtbaar licht of voor UV licht! Voor een beknopte handleiding: zie volgend blad! Voor een uitgebreide handleiding: zie uitgeprinte handleiding bij het toestel!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 11

Labo MCB: inleiding

GENESYS 10 UV spectrofotometer Aanzetten toestel De aan/uit toets bevindt zich aan de achterzijde van de GENESYS. Het toestel zal een zelfcontrole en een interne calibratie uitvoeren.: - calibratie van filter wiel - zoeken van het nulpunt - zoeken van de energiepiek - calibratie van de grating De Xenon lamp van de GENESYS UV dient niet opgewarmd te worden. BASIC ABSORBANCE / %T Metingen Op het basisscherm verschijnt de Absorptie en de golflengte.

met de funktietoets “Set nm” kan de golflengte veranderd worden; met de funktietoets “change mode” kan de aflezing van het resultaat aangepast worden van Absorptie (ABS) naar Transmissie (%T) of concentratie (met 1 standaard of met een factor); met de funktietoets “Measure blank” kan een blankostaal gemeten worden (met lege cuvet of met gedestilleerd water of met reagensblanko) Gebruik van de doorstroomcuvet Checklist: - zet de aflezing vooraf op A = 0 met water. Zuig af en toe een luchtbel op en kijk of de display steeds terug op nul komt. Zoniet moet de cuvet gereinigd worden (laboverantwoordelijke !!!) - Zuig nu uw sample op. Indien geen stabiele aflezing wordt bekomen, controleer dan de oplossing voor heterogeniteit of aanwezigheid van stof of neerslag.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 12

Labo MCB: inleiding

Buffers Een buffer zorgt ervoor dat de pH weinig verandert bij toevoeging van alkali of zuur. Ze worden veel gebruikt in biochemische experimenten waarbij de pH nauwgezet gecontroleerd en gestabiliseerd moet worden. De pH van een bufferoplossing wordt via de Henderson-Hasselbalch vergelijking bepaalt door twee factoren: de pKa en de verhouding zout/zuur. Deze laatste verhouding wordt aanzien als zijnde constant binnen het gebied 4 - 10 waar de concentratie aan waterstof en hydroxylionen laag is en kan verwaarloosd worden. pH = pKa +log10 (zout)/(zuur) De meest gebruikte buffers staan in onderstaande tabel. Ze worden gebruikt binnen 1 eenheid onder of boven de pKa waarde.

Zuur of Base

pKa pKa pKa

Fosforzuur Citroenzuur Koolzuur Glycyl glycine Azijnzuur Barbituurzuur Tris* Hepes**

2.1 3.1 6.4 3.1 4.8 3.4 8.3 7.6

7.2 4.8 10.3 8.1

12.3 5.4

*Tris = N-tris(hydroxymethyl)aminomethane **Hepes = N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-2ethanesulphonic acid

Koolzuur (bicarbonaat buffersysteem) Deze buffer stelt spontaan CO2 vrij en moet daarom gehouden worden in een gecontroleerde atmosfeer van CO2. Bicarbonaat heeft een pKa van 6.1 waardoor de bufferende capaciteit rond de fysiologische pH van bv. bloed 7.4 slecht is.

Fosfaat De meest populaire buffer. Fosfaationen complexeren echter met zware metaalionen. Daarenboven spelen fosfaationen dikwijls een cruciale rol in tal van biochemische reacties (activator, inhibitor, metaboliet) waardoor de buffer niet kan gebruikt worden).

Tris Dit is ook een populaire buffer aangezien het kan gebruikt worden met zware metalen. Hij werkt echter soms ook als inhibitor in sommige biochemische reacties. Tris heeft een sterk lipofiel karakter waardoor het vlot doorheen membranen kan diffunderen. Dit kan in sommige experimenten nadelig zijn.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 13

Labo MCB: inleiding Het grootste probleem is echter het temperatuureffect!!! Een tris buffer van pH7.8 bij kamertemperatuur heeft een pH van 8.4 bij 4°C en van 7.4 bij 37°C. Hierdoor stijgt de protonenconcentratie dus een factor 10 tussen de bereiding van weefselfracties bv (4°C) en de enzyme incubaties (37°C).

Hepes Dit is een voorbeeld van een zwitterionische buffer. Ze bevatten dus zowel + als - ladingen zodat ze niet doorheen membranen kunnen diffunderen.

Gebruik van de pH meter De electrode wordt steeds bewaard in een KCl oplossing. Spoel de electrode af met water wanneer deze gaat gebruikt worden. De eerste maal dat de pH meter gebruikt wordt tijdens de labozitting moet deze daarenboven geijkt worden volgens de beschreven procedure (zie zuigkast!!!) Zorg ervoor dat de oplossing waarvan je de pH wenst te meten op kamertemperatuur is en dat deze constant gemengd wordt. Gebruik een roersteen en de magnetische roerder. Roer niet te hevig omdat anders luchtbellen de meting kunnen verstoren. De electrode dient minstens een drietal centimeter in de oplossing te steken, liefst een beetje uit het centrum weg. Voeg eventueel druppelsgewijs een gepast zuur of base toe om de pH te brengen op de door u gewenste waarde. Hiervoor zijn een aantal stockoplossingen aanwezig in de zuigkast. Na gebruik de electrode afspoelen met water en terugplaatsen in de KCl oplossing.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 14

Labo MCB: inleiding

Finnpipette Digital van Labsystems

Eenvoudige regeling via draaiknop: Draaien tot op het gewenste volume; Pipetteren zoals gebruikelijk bij alle pipetten, d.w.z.: - piston indrukken tot bij de eerste stop; - tip in de vloeistof verticaal onderdompelen tot 2-3 mm onder het vloeistofoppervak; - traag de piston in de oorspronkelijke stand laten terugkeren; - volg het opnemen van de vloeistof in de pipetpunt met uw ogen zodat je de pipet niet uit de vloeistof neemt zolang het niveau in de punt nog niet gestabiliseerd is; - neem de pipet uit de vloeistof terwijl je met de punt tegen de zijwand glijd; - plaats de tip tegen de wand van de ontvangende container en druk de piston in tot de eerste stop; nadien tot de tweede stop: het uitblazen van de extra lucht zorgt ervoor dat eventuele restanten vloeistof alsnog verwijderd worden; - vervang de tip indien je een andere vloeistof gaat pipetteren!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 15

Labo MCB: inleiding

SOCOREX DIGITAL PIPET CALIBRA

Regeling: Zet de pipet op het gewenste volume in 2 stappen (hoofdvolume, fijnvolume); Pipetteren gebeurt zoals gebruikelijk bij alle pipetten, d.w.z.: - piston indrukken tot bij de eerste stop; - tip in de vloeistof verticaal onderdompelen tot 2-3 mm onder het vloeistofoppervlak; - traag de piston in de oorspronkelijke stand laten terugkeren; - volg het opnemen van de vloeistof in de pipetpunt met uw ogen zodat je de pipet niet uit de vloeistof neemt zolang het niveau in de punt nog niet gestabiliseerd is; - neem de pipet uit de vloeistof terwijl je met de punt tegen de zijwand glijd; - plaats de tip tegen de wand van de ontvangende container en druk de piston in tot de eerste stop; nadien tot de tweede stop: het uitblazen van de extra lucht zorgt ervoor dat eventuele restanten vloeistof alsnog verwijderd worden; - vervang de tip indien je een andere vloeistof gaat pipetteren!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 16

Labo MCB: inleiding

EPPENDORF COMFORPETTE

REGELING: Vastvolume: niets te regelen. Drie verschillende vaste volumes: piston half indrukken en draaien. Pipetteren gebeurt zoals gebruikelijk bij alle pipetten, d.w.z.: - piston indrukken tot bij de eerste stop; - tip in de vloeistof verticaal onderdompelen tot 2-3 mm onder het vloeistofoppervlak; - traag de piston in de oorspronkelijke stand laten terugkeren; - volg het opnemen van de vloeistof in de pipetpunt met uw ogen zodat je de pipet niet uit de vloeistof neemt zolang het niveau in de punt nog niet gestabiliseerd is; - neem de pipet uit de vloeistof terwijl je met de punt tegen de zijwand glijd; - plaats de tip tegen de wand van de ontvangende container en druk de piston in tot de eerste stop; nadien tot de tweede stop: het uitblazen van de extra lucht zorgt ervoor dat eventuele restanten vloeistof alsnog verwijderd worden; - vervang de tip indien je een andere vloeistof gaat pipetteren!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 17

Labo MCB: inleiding

OPDRACHT Naam: ………………………………… Groep: …………… In het kader van het labo wordt er heel veel gewerkt met de automatische pipet. Het correct gebruik ervan is essentieel om nauwkeurig experimenten te kunnen uitvoeren. Lees de handleiding van de door u gebruikte pipet aandachtig door en oefen een aantal keren het instellen van het juiste volume en het overbrengen van vloeistof van het ene naar het andere recipiënt. Neem vervolgens een potje gedeïoniseerd water en een grote weegschuit mee naar de analytische balans. Pipetteer 10 x 1 ml in de weegschuit en noteer telkens het gewicht in onderstaande tabel: aantal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 gram 0.0000g verschil Bereken het gemiddelde van het verschil tussen twee opeenvolgende metingen en de standaardafwijking hierop: Zet vervolgens het “aantal” uit t.o.v. het ”aantal gram” !

Geef commentaar: Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 18

Labo MCB: Eiwitzuivering, computersimulatie

EIWITZUIVERING, COMPUTERSIMULATIE Volgende technieken kunnen aangewend worden om een eiwitmengsel bestaande uit 20 verschillende eiwitten op te zuiveren: techniek - ammoniumsulfaatprecipitatie (= zoutprecipitatie) - gelfiltratie - ionenuitwisseling - chromatofocusing - hydrofobe interaktie chromatografie

capaciteit

resolutie

hoog +/- hoog +/- hoog laag +/- hoog

laag +/- hoog +/- hoog zeer hoog +/- hoog

Probeer het voor u bestemde eiwit op te zuiveren in maximaal 6 stappen anders zul je merken dat je door de computer "ontslagen" wordt. In dat geval moet je van vooraan opnieuw beginnen. Gebruik een logische volgorde voor uw opzuiveringschema; d.w.z. eerst technieken met een hoge kapaciteit en naar het einde toe technieken met een hoge resolutie, net zoals je dit in de praktijk ook zou doen. Het is de bedoeling dat je alle technieken tijdens de labozitting gebruikt hebt. Bij het samenvoegen van de door u gewenste frakties moet je erop letten dat je zoveel mogelijk van de aktiviteit behoudt, dit ten koste van de zuiverheid. Hierdoor zal uw rendement steeds maximaal zijn. Onzuiverheden kunnen altijd nog in de volgende stap verwijderd worden. Via twee-dimensionele elektroforese kan je nagaan in hoeverre uw preparaat zuiver is. Tracht steeds te streven naar één polypeptide dat je kan karakteriseren aan de hand van zijn molecuulgewicht en isoëlectrisch punt. Indien je alle technieken gebruikt hebt en nog steeds twee polypeptiden waarneemt bij 2-dim. elektroforese, moet je besluiten dat uw eiwit opgebouwd is uit deze twee peptiden. Vul als verslag onderstaande tabellen in. Het molekuulgewicht en pI van het opgezuiverde eiwit kan je afleiden uit de 2-dim. elektroforese. Bedenk wel dat dit niet noodzakelijk ook het natieve molekuulgewicht van het gezochte eiwit is; de elektroforese vindt immers plaats onder denaturerende omstandigheden (SDS). Het natieve molecuulgewicht (di-, tri-; tetrameer, enz.) kan je afleiden uit volgend experiment: Als je het eiwit volledig hebt opgezuiverd, ga je nogmaals een gelfiltratie uitvoeren. Indien uw eiwit elueert met het "void"-volume (Vo) heeft het een molekuulgewicht groter dan de exclusielimiet (bv. G50; groter dan 50 000). Het "void"-volume van een bepaalde kolom kan je afleiden uit bijgeleverde elutiegrafieken; hierbij werd telkens het komplete eiwitmengsel gescheiden op één van de kolommen.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 1


GELFILTRATIE VAN ALLE EIWITTEN Vo is hier dus telkens te vinden op fractienummer 25!!!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 2


2-DIMENSIONALE ELECTROFORESE VAN ALLE EIWITTEN Isoëlectrisch - SDS-PAGE Gebruik deze techniek om na een bepaalde opzuiveringstap de zuiverheid van uw preparaat na te gaan. Werk verder tot je nog maar één vlek bemerkt of meerdere die door geen van de aangeboden technieken meer van elkaar te scheiden zijn. Uit de positie van de vlek kan je een schatting maken van het molecuulgewicht van de individuele polypeptideketen en het isoëlectrisch punt.

- geladen

+

geladen

bv. als dit de equilibratie pH bij ionenuitwisselingschromatografie is: kation(+)uitwisselaar (S-Sepharose) zoutgradiënt bv: 0.05M - 0.5M (1M)

doorloop = niet gebonden eiwitten (+ geladen)

Groep T / 30-01-2008

elutie met zoutgradiënt = scheiding van eiwitten volgens sterkte van - lading

E. De Herdt

p. 3


Ioniseerbare groepen op een eiwit: o.a.

Prot - COO-

Prot- COOH H Prot- NH3+

Prot – NH2 H Prot - O-

Prot- OH H Prot = + geladen!

pI

Prot = - geladen!

Samenvatting

pI

+

pH

-

pH

-

+

pI

Ionuitwisselaar:

Q = anion (-) uitwisselaar / S = kation (+) uitwisselaar

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 4


Gelfiltration Gel filtration is a simple and reliable chromatographic method for separating molecules according to size. Its versatility makes it generally applicable to the purification of all classes of biological substances, including giant macromolecules not readily fractionated by other techniques. Good separations and high activity yields are easily obtained.

Principle In gel filtration, molecules are separated according to size in a bed packed with a porous gel medium. Molecules larger than the largest pores in the swollen gel beads, i.e. above the exclusion limit, cannot enter the gel and are eluted first (void volume: Vo). Smaller molecules which enter the gel beads to varying extents, depending on their size and shape, are retarded on their passage through the bed. Molecules are eluted (Ve) in a predictable way in order of decreasing molecular size, making gel filtration a useful non-destructive method for estimating molecular size.

Fractionation range A suitable gel is one whose fractionation range covers the molecular sizes in the sample to be fractionated. Biological molecules can range in size from a few hundred to many million in molecular weight. To provide good separations over each part of the range, Pharmacia supplies media that collectively cover all molecular sizes up to several hundred million (MW). The media include Sephadex G-types, Sepharose and Sepharose Cl. Sephacryl, Sephadex LH-types, and Sephasorb. These media are described below. Sephadex is a bead-formed, cross-linked dextran gel which swells in water and aqueous salt solutions. By varying the degree of cross-linking, gels of different porosities, and with different fractionation ranges, are obtained (see Table). Due to different degrees of cross-linking, we recommend a working pH of 2 -13 for Sephadex G-10-G-25, and 2 -10 for Sephadex G-50-G-200. Sephadex can be used with buffers containing dissociating agents such as urea and detergents, and may be autoclave sterilized. Sephadex is the standard choice for fractionating mixtures of proteins, peptides and the smaller nucleic acids and polysaccharides. Typical applications include fractionation of multi-component samples, estimation of molecular weights, estimation of equilibrium constants, and desalting and buffer exchange. Sephadex is available with different bead sizes for different applications. Superfine for very high resolution work. Fine for most laboratory applications. Medium for preparative and large-scale applications where high flow rates are desirable, and for rapid desalting and buffer exchange. Coarse for preparative and large-scale applications where exceptionally high flow rates are required. Gel filtration is a rapid and efficient alternative to dialysis for desalting and buffer exchange. It is used, for example, in the preparation of protein samples prior to freeze-drying or fractionation by ion exchange chromatography.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 5


For regular laboratory use, Sephadex G-25 Medium is available in prepacked PD-10 columns. These handy columns enable samples of up to 25 ml to be desalted in less than 5 minutes. Excellent recoveries are obtained without risk of losing valuable material through leaky dialysis tubing. Sepharose is a bead-formed agarose gel which is supplied in three fractionation ranges (Table). The fractionation range is governed by the agarose concentration. In the gel beads Sepharose is stable in aqueous suspension in the range pH 4-9. It can be used with eluents containing high concentrations of salt, guanidine hydrochloride and urea, although for prolonged use under dissociating conditions cross-linked Sepharose CL is recommended. Sepharose melts on heating and should not be used above 40°C or autoclaved.

Table: Technical data on gel filtration products:

Ion exchange chromatography Ion exchange chromatography is one of the best documented, most reproducible, and simplest separation techniques to perform at laboratory or production scale. Excellent resolution and yields are obtained with all types of biological molecules.

Principle Due to the presence of charged moieties, biological macromolecules will bind to oppositely charged groups on an ion exchange matrix. Separation of bound substances occurs when Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 6


elution of the matrix causes the strength of the binding to decrease under the influence of changing salt concentrations or changes in pH. Molecules with very small differences in charge can be separated, making ion exchange a high resolution technique. In addition to a high sample capacity, the ability to process large volumes and the elution of dilute sample components in concentrated form make ion exchange extremely useful, especially in the early stages of a purification scheme.

Choice of ion exchange gel Several factors have to be taken into account when choosing a gel for a particular application; the stability of the sample components, the pH of the starting buffer, the molecular size of the sample components etc. Consequently, no single ion exchange gel is best for all applications. Pharmacia has a complete range of gels for all applications. Briefly, these are Sephadex and Sepharose ion exchangers, DEAE-Sephacel and Sepharose Fast Flow gels. These media are described in detail below. The availability of ion exchange media with different characteristics means that the technique can be applied in a wide variety of situations as a batch step in the initial stages of a purification scheme, as a selective step in the latter stages, and as part of a process chromatography system for the large scale production of biological macromolecules.

Sephadex ion exchangers The eight ion exchange gels listed in the table are derivatives of Sephadex G-25 and G-50. Anion and cation exchangers are denoted by A and C respectively. Ion exchangers are termed "weak" or "strong" depending on the range of pH over which they carry a charge. The strong ion exchangers, QAE- and SP-Sephadex, are characterized by their constant capacities over a wide pH range of 2-10. The weak ion exchangers start to lose their charge at pH values below 6 (CM-Sephadex) or above 9 (DEAE-Sephadex). Therefore choose a strong ion exchanger to separate substances requiring extremes of pH for ionisation. Where extremes are not required, we recommend a weak ion exchanger, as these have higher capacities around neutral pH. This flexibility allows selection of a pH range and buffer to best suit the properties of the sample. A-25 and C-25 types are intended for small molecules (amino acids, peptides, nucleotides etc) and very large molecules (MW>200 000). A-50 and C-50 types are particularly suitable for molecules in the range MW 30000-200000. Their high capacity per unit cost makes them ideal for batch separations. All Sephadex Ion exchangers are stable in the pH range 2-10 and can be sterilised by autoclaving at 120°C, pH 7.

Sepharose Fast Flow ion exchangers DEAE-Sepharose Fast Flow and CM-Sepharose Fast Flow are new media derived from Sepharose CL-6B. They have improved mechanical characteristics, allowing higher flow rates to be used. The media were especially designed for large scale use, but their flow properties are naturally welcomed in many laboratories. Pharmacia has recently developed Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 7


two outstanding Fast Flow ion exchange media, ideally suited to both research and largescale applications. Both gels are highly substituted with strong ion-exchange groups; Q Sepharose being a strong anion exchanger, and S Sepharose strong cation exchanger. This means they have high capacity over a very wide pH range, and offer superior resolution for proteins of all pI values. The cross-linking has been optimised to confer really superb flow rates. Figure: illustrates the superb Quality of separation obtainable

Chromatofocusing Chromatofocusing is a simple, inexpensive chromatographic method for separating proteins through differences in their pI. This high-resolution method retains the high capacity and economy of ion exchange, perfectly complementing other techniques, such as gel filtration in complex biochemical purification protocols.

Principle Chromatofocusing takes advantage of the buffering action of charged groups on a special exchanger gel - PBE exchanger. If this PBE exchanger is adjusted to one pH and then eluted with a special eluent -Polybuffer- at a second pH, a pH gradient is formed just as if two buffers at different pH were gradually mixed in the mixing chamber of a gradient maker. When such a pH gradient is used to elute proteins bound to the PBE exchanger gel, the proteins elute in the order of their isoelectric points. Focusing effects result in band sharpening, sample concentration and very high resolution. Peak widths can be in the range 0,04-0,05 pH unit, and samples containing several hundred milligrams of protein can be processed in one step. Linear gradients are required for optimal resolution and it is

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 8


therefore necessary that the eluent buffer and the exchanger gel should have an even buffering capacity over a wide pH range.

Self generated pH gradients As noted previously chromatofocusing takes advantage of the buffering action of the charged groups on PBE exchangers. Figure 1 shows how the pH gradient is formed. As the elution proceeds (stages a, b. c and d), the pH in the column is gradually lowered as more Polybuffer 96 is added to the column.

Fig. 1. The formation of a pH gradient (pH 9-6) in a column of PBE 94 eluted with Polybutfer 96. (a) (b) (c) and (d) represent different stages in the elution.

Focusing effects When a protein is applied to a column of PBE below its pI, it migrates downwards in the column until pH = pI. Beyond this point it binds to the gel. However, as more Polybuffer is added to the column, the pH decreases and the protein moves down the column, eluting according to its pI. Zones are focused since proteins below their pI are repelled from the PBE gel and are continually moving with the leading edge of the eluting zone. Focusing effects are shown diagrammatically in figure 2.

Fig. 2. Focusing effect in chromatofocusing. The rate of protein migration in the pH gradient developing in the column is much lower than the rate of flow of Polybuffer. Protein molecules at the rear end of the zone are repelled from the gel and migrate more rapidly than proteins at the front.

The high resolution obtainable with chromatofocusing is shown in figure 3. The eluted zones are extremely narrow (0,02 pH units). Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 9


Figure 3: Separation of standard proteins. Column SR10/50 containing PBE 94. Bed height: 18cm. Sample 5 ml elution buffer containing sperm whale myoglobin (2mg), horse myoglobin (2mg) and carboxyhemoglobin (2mg). Elution conditions start buffer 0°?025 M ethonolamine, pH 9,5, elution buffer: 0,0075 mmol pH unit ml Polybuffer 96, pH7. Flow rate: 15 cm/h

Chromatofocusing like ion exchange chromatography is a high capacity technique Relatively small columns (20-30 ml) are capable of handling samples containing 200-300 mg protein depending on the nature of the sample. Figure 4 shows the separation of proteins extracted from elk muscle

Fig.4. Fractionation of soluble proteins from elk muscle. Column C 10/40 Bed height 34,5 cm, Sample: 5 ml of supernatant from elk meat homogenate. Elution conditions start buffer 0;025 M ethanolamine.HCl, pH 9,4; elution buffer O,0075 mmol/pH unit.ml Polybuffer 96, pH6. Flow rate: 20cm/h.

Other information: http://ntri.tamuk.edu/chromatofocusing/joe3.html

Hydrophobic interaction chromatography Hydrophobic interaction chromatography has proved an important step in the purification scheme of many proteins and forms an excellent complement to other methods based on size and charge differences. Although hydrophobic interaction chromatography is less selective than affinity chromatography, it has very widespread applicability, and is not limited to bio Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 10


molecules that are considered very hydrophobic. This is supported by a rapidly increasing number of published reports.

Principle In hydrophobic interaction chromatography, substances are separated on the basis of differing strengths of their hydrophobic interactions with an uncharged bed material containing hydrophobic groups. Most proteins contain hydrophobic areas exposed on their surfaces. These interact with hydrophobic groups on the matrix. Adsorbed substances can be fractionated by altering the elution conditions to decrease the strength of the hydrophobic interaction. This is usually achieved by lowering the ionic strength of the eluent, or by lowering its polarity (e.g. by including ethylene glycol), or both. Many biochemical separations begin with a precipitation in the presence of a high concentration of salt such as ammonium sulphate. This step can be combined with hydrophobic interaction chromatography. A concentration of ammonium sulphate just below that used for salting out is most likely to promote binding of proteins to the gel. It is important to have a charge-free support. If the matrix has ionic as well as hydrophobic groups, elution can be difficult, since a decrease in ionic strength decreases hydrophobic interactions but promotes ionic interactions. Phenyl-Sepharose CL -4B and Octyl-Sepharose CL -4B are gels specifically designed for hydrophobic interaction chromatography of biological macromolecules. Phenyl-Sepharose CL-4B Phenyl-Sepharose CL-4B IS prepared by coupling cross-linked Sepharose CL -4B with the glycidyl ether of the phenyl moiety. The resulting product is an electrically neutral derivative which is attached through a stable, uncharged ether linkage. Phenyl-Sepharose CL -4B should be used when the hydrophobic nature of the sample is unknown, since strongly hydrophobic substances will not easily be eluted from Octyl-Sepharose CL -4B. Proteins with many aromatic amino acids often bind well to Phenyl-Sepharose CL -48 through ̟-̟ bond interaction.

Fig. 1. Chromatography of human fibroblast interferon on Phenyl Sepharose CL –48. Interferon was applied to the column, which was then equilibrated with sodium phosphate. A linear concentration gradient of ethylene glycol (EG) was developed by mixing the equilibration buffer with 75% ethylene glycol. Finally, the columns were developed with 75% EG.

Octyl-Sepharose CL-4B Octyl-Sepharose CL -4B is prepared by coupling cross-linked Sepharose CL -4B with the glycidyl ether of the octyl moiety. The resulting product is an electrically neutral derivative which is attached through a stable, uncharged ether linkage. Octyl-Sepharose CL -4B is Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 11


more hydrophobic than Phenyl-Sepharose CL -48 and is suitable for separating proteins of low hydrophobic nature and proteins that are labile at high ionic strength. Table lists a variety of commercially available proteins and compares their binding with and elution from Octyl-Sepharose CL -4B and Phenyl Sepharose CL -4B.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 12


VERSLAG : EIWITZUIVERING COMPUTER SIMULATIE Namen:

Datum: .............

Eiwitnummer

Procedure

Zoutprecip. Gelfiltratie Ionenchrom HIC Chromatofoc.

pH stabiliteitsgebied

Omstandigheden

% verzadiging pH (equilibratie pH) zoutgradiënt (welke?) pHgradiënt (welke?)

Gepoelde fracties

Temperatuurstabiliteit

Eiwit (mg)

Opbrengst AanKost enzym. rijking m.u/1 (%) 00U

Begin- en eindfractie vermelden

CONCLUSIE: EIWIT N°

POLYPEPTIDEN M. G.

pI

SCHATTING VAN NATIEF MOLEKUULGEWICHT Via vergelijking van topfracties bij gelfiltratie. De top van Vo is steeds fractie 25! Dus antwoord in termen van < of > dan bv. 50 000 uit een G50 exp.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 13


VERSLAG : EIWITZUIVERING COMPUTER SIMULATIE Namen:

Datum: .............

Eiwitnummer

Procedure

Zoutprecip. Gelfiltratie Ionenchrom HIC Chromatofoc.

pH stabiliteitsgebied

Omstandigheden

% verzadiging pH (equilibratie pH) zoutgradiënt (welke?) pHgradiënt (welke?)

Gepoelde fracties

Temperatuurstabiliteit

Eiwit (mg)

Opbrengst AanKost enzym. rijking m.u/1 (%) 00U

Begin- en eindfractie vermelden

CONCLUSIE: EIWIT N°

POLYPEPTIDEN M. G.

pI

SCHATTING VAN NATIEF MOLECUULGEWICHT Via vergelijking van topfracties bij gelfiltratie. De top van Vo is steeds fractie 25! Dus antwoord in termen van < of > dan bv. 50 000 uit een G50 exp.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 14

Labo MCB: Subcellulaire fractionatie, SDH

SUBCELLULAIRE CELFRACTIONATIE SDH-ACTIVITEIT 1.

Inleiding

De succinaat dehydrogenase activiteit in weefselfracties kan bepaald worden door de kwantitatieve reductie, met natrium succinaat als substraat, van een kleurloos tetrazolium zout tot een rood, water onoplosbaar formazan. De bekomen kleur is evenredig met de succinaat dehydrogenase activiteit en kan colorimetrisch gemeten worden. enzymatische oxidatie / reductie

Succinaat

Fumaraat

SuccinaatDH

SuccinaatDH

FAD

FADH2

chemische oxidatie / reductie

Triphenylformazan (rood!!!)

Triphenyltetrazolium chloride (kleurloos)!!!)

Verschillende enzyme systemen zijn karakteristiek gelokaliseerd in welbepaalde subcellulaire fracties. Zo is het succinaat dehydrogenase (SDH) bijvoorbeeld typisch gelokaliseerd in de mitochondria. Het experiment bestaat uit twee delen: 1. De opstelling van een ijkcurve voor de kwantitatieve bepaling van het triphenylformazan dat gevormd wordt tijdens de latere bepaling van de succinaat dehydrogenase (SDH) activiteit; 2. De bepaling van de SDH - activiteit in de verschillende subcellulaire fracties. Nadien kan dan het distributiepatroon van SDH opgesteld worden.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 1


2.

IJkcurve voor SDH - activiteit

2.1.

Oplossingen en materialen

Maak volgende oplossingen. Kijk na of er reeds sommige aanwezig zijn in het labo. Indien dit het geval is, kijk dan na of er voldoende is en of de oplossingen nog bruikbaar zijn (check voor troebeling, wat wijst op microbiële groei!). Vergewis u over de gevaren van de verschillende producten door R en S zinnen op te zoeken en MSDS te raadplegen (zie labo inleiding!!!) Gebruik hiervoor catalogi, posters, internet.

- warmwaterbad op 37°C; - kleine tafelcentrifuge Hettich en grote centrifuge; - 12 % (g/v) trichloorazijnzuur; - 0,1 M Na-fosfaatbuffer, pH 7; - 0,2 M Na-succinaat (50 à 100 ml); - 0,1 % (g/v) Triphenyltetrazolium chloride (TTC) (20 ml); Stel een verdunningsreeks op welke telkens 3 ml bevat van volgende concentraties: 50, 100, 150, 200, 250, 300 µg TTC/ml. - 0,25 M sucrose (500 ml) (ijskoud maken/eventueel kort in de diepvries zetten!!); - Aceton (technische kwaliteit); - Een vers bereide, verzadigde oplossing (1 ml in eppendorf buisje) van Na2S2O4 (= natrium dithioniet of natrium hydrosulphite).

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 2


2.2.

Opstellen van de ijklijn

- Meng in kleine proefbuizen (= centrifugeerbuisjes voor de kleine tafelcentrifuge “HETTICH” IN DUPLO: - 0,5 ml 0,1 M Na-fosfaat buffer pH 7; - 0,5 ml 0,2 M Na-succinaat; - 1 ml 0,25 M sucrose; - 1 ml TTC van de bovenstaande verdunningsreeks (0 - 300 µg/ml); N.B.: Vergeet de BLANCO niet (= 0 µg TTC/ml)! - Reduceer het aanwezige TTC vervolgens door toevoeging van 20 µl verzadigd natrium dithioniet, schud krachtig; - Incubeer bij 37°C gedurende 5 minuten (dit om de chemische reactie volledig te laten opgaan); - Voeg 7 ml aceton toe (met pipet en pipetteerpomp; niet met de mond!!!), schud krachtig (plaats uw duim op de buis; aceton lost immers parafilm op!); - Centrifugeer in de tafelcentrifuge gedurende 5 minuten op 60 % van het maximaal vermogen; N.B.: Als er organisch materiaal aanwezig is, verkrijgt men een neerslag (dit is dus bij de activiteitsbepaling van de weefselfracties: zie 3.2.1) (aceton wordt gebruikt om de kleurstof te extraheren uit het waterige milieu); bij het opstellen van de ijklijn is er geen organisch materiaal aanwezig maar is de oplossing troebel door de beperkte oplosbaarheid van het water in de aceton; door centrifugatie treedt er een fasescheiding op (bemerk onderaan één druppeltje water!). - Bij het meten van de A480 (hier in het kader van de ijklijn) dient men er zorg voor te dragen dat het zuigdarmpje van de doorstroomcuvet niet tot op de bodem komt om opmenging van de waterdruppel met de aceton te voorkomen. Bij het meten van de A480 in het kader van de weefselfractie: 3.2.1 moet men er sterk op letten het zuigdarmpje zodanig te positioneren dat geen neerslag noch de waterdruppel mee opgezogen wordt. Plaats de opening dus langs de tegenovergestelde kant van de neerslag tegen de zijwand van de buis op ongeveer 2 cm van de bodem. Beweeg zo weinig mogelijk met het darmpje want hierdoor kan er neerslag loskomen. Opgezogen neerslag kan de doorstroomcuvet verstoppen. Eventueel kan men met een pasteurpipet de organische fase (= het supernatans) zonder neerslag overbrengen in een propere proefbuis waarna zo vlug mogelijk (aceton verdampt snel!) de A480 wordt gemeten t.o.v. water. - Zet de A480 uit ten overstaan van µg TTC/ml.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 3


3. Bepaling van de succinaat dehydrogenase activiteit in de verschillende subcellulaire fracties 3.1.

Celfractionatie

Deze gebeurt zo koel mogelijk; dit wil zeggen dat alle handelingen zoveel mogelijk op ijs worden gedaan! Als biologisch materiaal worden varkensnieren gebruikt. Door de homogenisatie wordt het weefsel verbroken in individuele cellen welke door de hier gebruikte homogenisatiemethode ook zullen opengebroken worden. De verschillende subcellulaire fracties worden nadien door differentiële centrifugatie gescheiden. De 0,25 M sucrose oplossing zorgt ervoor dat de celorganellen intact blijven (iso-osmotisch!!!). 3.1.1.

Bereiding van het homogenaat

Potter - Elvejhem homogenisator

50 ml van een ±20 % homogenaat (=±10 g nierweefsel/±50 ml homogenaat) in 0,25 M sucrose wordt bereid door homogenisatie in een POTTER - ELVEJHEM homogenisator bij 4°C (demonstratie!). Alle handelingen dienen zo koel mogelijk uitgevoerd te worden. weefselfracties dienen steeds op ijs bewaard te worden!!!

Sucrose en

Vooreerst wordt de vereiste hoeveelheid nierweefsel afgewogen (hoeveel?) en onder een weinig 0,25 M sucrose in zeer kleine stukjes geknipt. De sucrose wordt zoveel mogelijk verwijderd (bevat bloed en oppervlakkige onzuiverheden van het weefsel). Het geheel wordt aangelengd met koude 0,25 M sucrose tot ±40 ml en overgebracht in de homogenisatiebuis. Er wordt traag gehomogeniseerd door op en neer te gaan met de draaiende stamper tot deze de bodem raakt. Nadien noteert men het aantal keer dat men op en neer gaat! Vervolgens brengt men het homogenaat over in een maatcylinder van 100 ml. Noteer het exacte volume van het totale homogenaat. Neem hiervan een staal van ongeveer 5 ml en bewaar dit op ijs in een Falcon buisje voor de latere bepaling van de SDH aktiviteit. Noteer tevens het exacte volume van het homogenaat dat je gaat centrifugeren. Een centrifuge moet steeds in evenwicht zijn!!! Zorg er daarom voor dat je een centrifugebuis met exact hetzelfde gewicht hebt om als tegengewicht te fungeren (bv. zelfde type centrifugebuis gevuld met dezelfde hoeveelheid sucrose oplossing OF een lege buis vullen met zoveel water dat het totale gewicht hetzelfde is als deze van de buis met uw homogenaat (controleer op de bovenweegbalans tot op 0.02 g!!!) Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 4


3.1.2.

Subcellulaire fractionatie door differentiële centrifugatie

H

Pm

2000 rpm, 10 min

Pk

SN1

8000 rpm, 10 min

SN2

- Centrifugatie van het homogenaat (H) bij 2 000 rpm gedurende 10 minuten in de grote centrifuge; - Het supernatans (SN1) wordt van het neerslag afgegoten en overgebracht in een nieuwe centrifugeerbuis voor verdere centrifugatie. De neerslag (Pk) bevat vooral celdebris en kernen. Pk wordt gesuspendeerd in 10 ml 0,25 M sucrose en bewaard op ijs voor SDH bepaling. Noteer het exact volume van de gesuspendeerde pellet. Bewaar minstens 8 ml in een Falcon buisje op ijs. - Centrifugeer SN1 bij 8 000 rpm gedurende 10 minuten. Het supernatans (SN2) bevat de celinhoud (membranen, ribosomen, oplosbare enzymefractie, enz.). SN2, ook postmitochondriaal supernatans genoemd, wordt zorgvuldig verwijderd van de neerslag (zoals hierboven) en bewaard op ijs voor SDH-bepaling. Noteer het exact volume van het totale SN2. Bewaar minstens 8 ml in een Falcon buisje op ijs.

De neerslag (Pm) bevat voornamelijk mitochondria. Pm wordt gesuspendeerd in 10 ml 0,25 M sucrose en bewaard in ijs voor SDH-bepaling. Noteer het exact volume van de gesuspendeerde pellet. Bewaar minstens 8 ml in een Falcon buisje op ijs. Op deze manier wordt het homogenaat dus verdeeld over drie subcellulaire fracties: Pk: celdebri en kernen; Pm: mitochondria; SN2: post-mitochondriaal supernatans. Merk op dat de totale hoeveelheid weefsel en de totale SDH activiteit van het homogenaat verdeeld worden over Pk, Pm en SN2. Dus theoretisch kunnen we stellen dat: g weefsel H = g weefsel Pk + g weefsel Pm + g weefsel SN2 SDH-act. H = SDH-act. Pk + SDH-act. Pm + SDH-act. SN2

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 5


3.2. Bepaling van de SDH-aktiviteit op de verschillende subcellulaire frakties 3.2.1.

SDH activiteit

De SDH activiteit en weefselblanco worden bepaald (in duplo) op 1 ml van elk der subcellulaire fracties zoals beschreven in 2.2. Van elk der vier weefselfracties moet zowel een weefselblanco als de SDH activiteit bepaald worden. TTC kan immers door alle reeds aanwezige reduktieëquivalenten gereduceerd worden! In de cel zijn zowiezo reductieëquivalenten aanwezig. Daarnaast zijn er tal van substraten en enzymen aanwezig die tijdens de incubatie reductieëquivalenten kunnen produceren. Door een overmaat succinaat toe te voegen zorgen we ervoor dat het succinaatdehydrogenase, dat een grote substraatspecificiteit vertoont, kan blijven werken aan maximale snelheid tijdens de incubatie. De toename aan reductieëquivalenten is dus evenredig met de aanwezige hoeveelheid actief succinaatdehydrogenase. De weefselfractie wordt gedoseerd via een automatische pipet voorzien van een blauwe tip waarvan de punt afgeknipt werd zodat een opening van enkele mm ontstaat. Meng de weefselfractie grondig vlak voor de staalname!

SDH activiteit

Weefselblanco

0,5 ml 0,1 M Na fosfaat pH 7 0,5 ml 0,2 M Na succinaat 1 ml van de betrokken weefselfractie 1 ml 0,1 % TTC

idem 0,5 ml water idem idem

Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 37°C. Voeg hierna onmiddellijk 7 ml aceton toe en schud krachtig! De verdere bewerkingen gebeuren zoals beschreven in 2.2. 3.2.2. Bepaling van het droog gewicht De SDH activiteit dient uitgedrukt te worden op basis van het droog gewicht. Dit wordt bepaald door: - 4 droge kleine centrifugebuizen vooraf wegen op de analytische balans (tot op 0.0001g); - 1 ml weefselfractie neer te slaan (30 minuten, 0°C) met 5 ml 12 % (g/v) trichloorazijnzuur (eindconcentratie = 10%g/v); - Het neerslag wordt afgecentrifugeerd bij 60% van het vermogen in de kleine tafelcentrifuge gedurende 5 minuten; - Het supernatans wordt afgedecanteerd en het neerslag wordt gedroogd in de oven bij 110°C gedurende 2 uur of overnacht; - Na afkoelen wordt het netto droog gewicht bepaald op de analytische* balans (tot op 0.001g). * De analytische balans eerst op nul afstellen!!!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 6


3.2.3. Bepaling van de specifieke SDH activiteit De specifieke SDH activiteit wordt uitgedrukt als µg TTC gereduceerd per g weefsel per 15 minuten. Met behulp van de opgestelde ijklijn wordt de extinctie bij 480 nm omgezet in µg TTC gereduceerd door 1 ml weefselfraktie in 15 minuten. Via het droog gewicht per ml weefselfractie (3.2.2.) kan de SDH activiteit nu uitgedrukt worden als µg TTC gereduceerd door 1 g weefsel in 15 minuten. Samengevat:

specifieke SDH activiteit =

µg TTC / ml.15min. _____________________

=

g weefsel / ml

µg TTC _________________

g weefsel . 15 min

De totale enzyme activiteit in een fractie:

Totale activiteit

µg TTC ____________

=

x V (ml)

ml . 15 min met V (ml): het totale volume van de fractie. Construeer het distributiepatroon van succinaatdehydrogenase. Zie hieronder een typevoorbeeld van de distributie van ß-glycerofosfatase in de subcellulaire fracties van rattenlever. Data from "Untitled Data #1"

L

Relatieve specifieke aktiviteit

5

4

K = kernen M = mitochondria L = lysosomen P = microsomen S = supernatans

3

M

2

P

K

1

S

0 0

20

40

60

80

100

120

% eiwit

Verzamel alle afval in een beker. Controleer de pH (met universeelindicatorpapier) en deponeer in de gepaste afvalcontainer ("zuren" of "basen", afhankelijk van de pH) op het einde van de labozitting!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 7


Verslag: SUBCELLULAIRE CELFRAKTIONATIE, SDH ACTIVITEIT NAMEN:

Groep:

DATUM UITVOERING: ............... DATUM AFGIFTE VERSLAG: ................

VRAGEN VOORAF TE BEANTWOORDEN: 1. Succinaat dehydrogenase is een "marker"-enzyme voor mitochondriën: a. Wat is het belang van "marker"-enzymen bij biochemische studies? woorden, waarvoor kan je ze gebruiken?

Met andere

b. Ken je nog andere voorbeelden?

2. De SDH activiteit kan gestopt worden met aceton. Leg uit: wat is het principe en wat is het uiteindelijke resultaat van de acetonbehandeling?

3. Waarom wordt er gehomogeniseerd in een 0,25 M sucrose oplossing?

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 8


4. Wat is homogenisatie? Welke factoren bepalen de graad van homogenisatie, weefseldestructie met het gebruikte type van homogenisator?

5. Zoek enkele andere homogenisatiemethoden op.

6. Wat is de betekenis van de weefselblanco bij de bepaling van de enzyme activiteit? Hoe kan het dat sommige weefselblanco's toch een duidelijke kleurontwikkeling zullen opleveren?

RESULTATEN, BEREKENINGEN, INTERPRETATIES 1. Type gehomogeniseerd weefsel Lever of Nier?: ...................... Vers of diepvries:........................ Hoeveelheid: ..........g Homogenisatiewijze (hoeveel maal ging de stamper op en neer?): ........ 2. IJkcurve voor de SDH activiteit:

µg TTC / ml 0 (= blanco) 50 100 150 200 250 300

A480 t.o.v. water

A480 - Ablanco 0

Voeg in bijlage de grafiek: A480 t.o.v. µg TTC / ml 1 A480 komt aldus overeen met .................... µg TTC / ml. Correlatiecoëfficiënt: ............................

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 9


3. Distributie van succinaatdehydrogenase over de subcellulaire fracties: Meet de A480, stel de spectrofotometer op nul met water! Fraktie

V (ml)

Abs. weefsel blanco duplo’s

Abs. weefsel fractie duplo’s

Netto A µg TTC/ (dit is dus ml.15 min A480/ml15’

Totale activiteit fractie

% recup. in de fractie

H Pk Pm SN2

100 %

Totaal % van Pk + Pm + SN2 = .....................% Becommentarieer deze totale recuperatie:

4. Droog gewicht: Fractie

g lege buis

g na drogen

∆g = g weefsel/ml

V (ml)

H Pk Pm SN2

g weefsel in de totale fractie

% recuperatie in de fractie

100 %

Totaal % van Pk + Pm + SN2 = .....................% Becommentarieer deze totale recuperatie:

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 10


5. Specifieke activiteit - Relatieve specifieke activiteit: specifieke activiteit v.d. fractie Relatieve specifieke activiteit

=

_______________________________________

specifieke activiteit v.h. homogenaat

Fraktie

µg TTC/ml.15'

g weefsel/ml

specifieke activiteit

relatieve specifieke activiteit

H Pk Pm SN2

1

6. Construeer het distributiepatroon van succinaatdehydrogenase Kleef dit hieronder! abscis = % eiwit (uitgezet op cumulatieve wijze) gebruik hiervoor % recuperatie van de enzymatische activiteit. ordinaat = relatieve specifieke activiteit;

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 11


7. Bewijs: "De totale oppervlakte van een blok in het distributiepatroon is evenredig met het % recuperatie van de enzyme activiteit in de betreffende fractie".

8. Is Pm een goede "mitochondriale" fraktie? (of is SDH een goede mitochondriale marker?). Beschouw en bespreek hiervoor de relatieve specifieke activiteit en het % recuperatie van de enzyme activiteit. Wat is de oorsprong van een eventuele hoge relatieve specifieke activiteit van Pk en/of SN2?

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 12

Labo MCB: zure fosfatase

ZURE FOSFATASE BEPALING 1.

Principe

Fosfatasen hydrolyseren monoësters van fosforzuur. Zure fosfatasen hebben een zuur pHoptimum (rond pH 5). Deze enzymen zijn voornamelijk gelokaliseerd in de lysosomen van vele type cellen waar ze onder andere de volgende reactie katalyseren: 2-phosphoglycerol + water

glycerol + fosfaat

Zure fosfatasen worden dikwijls als indicatorenzyme gebruikt tijdens de isolatie van lysosomen. In deze proef wordt tijdens de enzymatische reactie gebruik gemaakt van dinatrium fenylfosfaat als substraat. H2O

Zure fosfatase dinatriumfenylfosfaat

fenol

Het gevormde fenol kan aangetoond worden met een chemische kleurreactie.

oxidans

+

Chinon, rood alkalisch milieu

4-amino-antipyrine

fenol

Als oxidans gebruikt men K3Fe(CN)6. De enzymatische activiteit wordt gestopt door toevoegen van NaOH. Daarna wordt NaHCO3 toegevoegd om de pH terug te brengen tot 10,2 voor de kleurreactie. Het gevormde chinon absorbeert bij 500 nm. De productvorming kan kwantitatief gevolgd worden door het opstellen van een ijklijn: absorptie bij 500 nm als functie van µg fenol. We stellen eerst een ijklijn op om later het tijdens de enzymatische reactie gevormde fenol te kunnen kwantificeren. Hierna bepalen we de activiteit van het ter beschikking gestelde enzymepreparaat. Dit is nodig om tijdens de bestudering van de enzymatische parameters, die geschikte hoeveelheid enzyme te bepalen die in ons proefopzet (buffer, temp., substraat, incubatietijd) een hoeveelheid fenol produceert, die we nauwkeurig kunnen bepalen (dus binnen onze ijklijn valt!).

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 1


2.

Experimentele uitvoering

2.1.

Stockoplossingen

Maak volgende oplossingen. Kijk na of er reeds sommige aanwezig zijn in het labo. Indien dit het geval is, kijk dan na of er voldoende is en of de oplossingen nog bruikbaar zijn (check voor troebeling, wat wijst op microbiële groei!). Vergewis u over de gevaren van de verschillende producten door R en S zinnen op te zoeken en MSDS te raadplegen (zie labo inleiding!!!) Gebruik hiervoor catalogi, posters, internet. - 100 ml substraatoplossing: dinatriumfenylfosfaat, 0,02M. (VERS AANMAKEN!) - 500 ml citroenzuurbuffer, pH 4,9: 0,4M citroenzuur. Los de vereiste hoeveelheid citroenzuur op in ongeveer 300 ml water. Breng vervolgens op pH met een NaOH-oplossing (pH-meter!) en leng tenslotte aan tot 500 ml met gedeïoniseerd water. - 200 ml NaOH 0,5 M + 0,1%(g/v) EDTA. - 200 ml NaHCO3 0,5 M. - 100 ml 4-amino-antipyrine 0,6%(g/v). (= 4-amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on) (VERS AANMAKEN!) - 100 ml K3Fe(CN)6 2,4%(g/v) (VERS AANMAKEN!). - 100 ml citroenzuurbuffer, pH 4,9 (zie hierboven) gesupplementeerd met 5 mM NaH2PO4 (enkel voor puntje 2.5). - 100 ml citroenzuur 0,05 M (enkel voor puntje 2.6). - 100 ml natriumcitraat 0,05 M (enkel voor puntje 2.6). - Zure fosfatase: 0,02 g/100ml (wordt ter beschikking gesteld!). - Fenol (veroorzaakt brandwonden!) : 0,02 g/100ml (wordt ter beschikking gesteld!).

- Waterbad op 37°C instellen bij het begin van de labozitting!!!!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 2


2.2.

Opstellen van een ijklijn: A500 i.f.v. µg fenol

Men maakt een verdunningsreeks (een 10-tal punten tussen 5 en 60 µg fenol) uitgaande van een gegeven stockoplossing (0,02 g/100ml) met behulp van automatische pipetten. bv.: voor 5 µg/0,5ml fenolverdunning: 25 µl stock + 475 µl H2O 60 µg/0,5ml 300 µl 200 µl GRONDIG MENGEN! De hoeveelheid fenol wordt gekwantifiëerd via de volgende kleurreactie (zorg ervoor dat je de volgorde van de reagentia respecteert!!!): 0,5 ml fenolverdunning + 0,5 ml citroenzuurbuffer (VORTEX!). + 1 ml water (VORTEX!). + 1 ml NaOH/EDTA (VORTEX!). + 1 ml NaHCO3 (VORTEX!). + 1 ml 4-amino-antipyrine (VORTEX!). + 1 ml K3Fe(CN)6 (VORTEX!). Meet de absorptie ten overstaan van water (de spectrofotometer op A=0 zetten met water) bij 500 nm. Zet de resultaten grafisch uit (A500 - A500 blanco t.o.v. µg fenol).

2.3.

Bepaling van de enzymatische activiteit

In dit experiment zullen we de enzyme-verdunning achterhalen die een absorptie geeft van 0,5 à 0,8. Met die geselecteerde enzyme-verdunning zullen alle hiernavolgende experimenten (2.4, 2.5 en 2.6) uitgevoerd worden. Maak vooreerst een verdunningsreeks van de enzyme-stockoplossing (0,02g/100ml) in H2O: 5, 10, 20, 40, 80 x verdunnen. Laat vooraf je uitgewerkt verdunningsschema controleren door de laboverantwoordelijke. Reactiemengsel voor de bestudering van het enzyme: 0,5 ml substraatoplossing + 0,5 ml citroenzuurbuffer (VORTEX!). + 1 ml enzyme-verdunning (resp. 5, 10, 20, 40, 80 x) (VORTEX!). Vergeet geen blanco mee te nemen: 1ml water in plaats van 1 ml enzyme-oplossing!!! Incubatie: 37°C, 20 min. Noteer het exacte tijdstip waarop je de enzyme-verdunningen in het reactiemengsel brengt. De enzymatische reactie moet immers precies 20 minuten later gestopt worden. Stoppen van de enzymatische reactie: + 1 ml NaOH/EDTA-oplossing (VORTEX!) (enzyme wordt door sterke pH wijziging gedenatureerd!); Kleurreactie (nadat alle reactiebuisjes gestopt zijn!): + 1 ml NaHCO3 (VORTEX!) (neutralisatie van pH ter voorbereiding van kleurreactie!); + 1 ml 4-amino-antipyrine (VORTEX!); + 1 ml K3Fe(CN)6 (VORTEX!). Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 3

Labo MCB: zure fosfatase Absorptiemeting: Meet de absorptie ten overstaan van water (de spectrofotometer op A=0 zetten met water) bij 500 nm. Zet de resultaten grafisch uit (A500 - A500 blanco t.o.v. enzym verdunning). Berekeningen: Zet de resultaten grafisch uit (A500 t.o.v. µg enzyme) en bepaal de enzymatische activiteit van de enzym stockoplossing in Units/ml. Bereken ook de specifieke activiteit van de enzym stockoplossing in Units/mg. 1 Unit = de enzym hoeveelheid die verantwoordelijk is voor de vorming van 1 µmol fenol per minuut in 0.4 M citroenzuurbuffer, pH 4.9 bij 37°C met dinatriumfenylfosfaat als substraat.

2.4.

De enzymatische activiteit i.f.v. de substraatconcentratie

Maak eerst de volgende substraat verdunningsreeks; goed mengen! Deze verdunningen zullen zowel in 2.4 als in 2.5 gebruikt worden. 0,02 M dinatriumfenylfosfaat (ml) 0,5 H2O (ml) 4,5

1,0 4,0

1,5 3,5

2,0 3,0

2,5 3,0 2,5 2,0

3,5 1,5

4,0 4,5 1,0 0,5

5,0 0,0

Volg hetzelfde reactieschema voor de enzymatische reactie als in 2.3, maar gebruik: 0,5 ml van deze substraat verdunningsreeks i.p.v. 0,5 ml substraat; +0,5 ml citroenzuurbuffer; +1 ml van de in 2.3 geselecteerde enzym verdunning. Incubatie bij 37°C , 20 minuten + 1 ml NaOH/EDTA - oplossing (VORTEX!) = stoppen van de enzym werking; + 1 ml NaHCO3 (VORTEX!) = neutralisatie + 1 ml 4-amino-antipyrine (VORTEX!) = kleurreactie + 1 ml K3Fe(CN)6 (VORTEX!). Vergeet geen blanco mee te nemen: 1ml water in plaats van 1 ml enzym oplossing!!! In principe zou je voor elke substraatverdunning een afzonderlijke blanco moeten maken; voor de eenvoud maken we enkel een blanco mengsel waarbij er een maximale substraatconcentratie aanwezig is! (d.w.z.: 0.5 ml substraat oplossing + 0.5 ml buffer + 1 ml water). Alle buisjes uitmeten bij 500 nm t.o.v. water. Zet de resultaten uit volgens LINEWEAVER-BURK en bepaal de MICHAELIS-MENTEN constante.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 4


2.5.

De invloed van fosfaationen op de enzymatische reactie

Maak eerst een oplossing van 5 mM NaH2PO4 in citroenzuurbuffer. Volg hetzelfde reactieschema als in 2.3, maar maak gebruik van: 0,5 ml van de substraat verdunningsreeks van 2.4; +0,5 ml citroenzuurbuffer met 5 mM NaH2PO4; +1 ml van de in 2.3 geselecteerde enzyme-verdunning. Incubatie bij 37°C , 20 minuten + detectie van fenol via de gebruikelijke kleurreactie! + 1 ml NaOH/EDTA - oplossing (VORTEX!). + 1 ml NaHCO3 (VORTEX!). + 1 ml 4-amino-antipyrine (VORTEX!). + 1 ml K3Fe(CN)6 (VORTEX!). Vergeet geen blanco mee te nemen (zie hierboven: 2.4). Alle buisjes worden uitgemeten bij 500 nm ten overstaan van water. Zet de resultaten uit volgens LINEWEAVER-BURK, op dezelfde grafiek als de resultaten van 2.4. Interpreteer! Bepaal de schijnbare Michaëlis-Menten constante Km' en de inhibitorconstante Ki.

2.6.

De enzymatische activiteit i.f.v. de pH: pH-optimum

Maak een reeks citroenzuurbuffers met variërende pH door het mengen van 0.05 M citroenzuur (zonder pH-stellen!) en 0,05 M natriumcitraat. Neem x ml citroenzuur en leng aan tot 10 ml met natriumcitraat volgens onderstaand schema. x 9,1 8,6 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,4 3,9 3,4 2,9 2,4 1,9 1,4 ml pH 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 Volg hetzelfde reactieschema als in 2.3, maar maak gebruik van: 0,5 ml van de citroenzuurbuffers met variërende pH. +0,5 ml van de substraatoplossing +1 ml van de in 2.3 geselecteerde enzym verdunning. Incubatie bij 37°C , 20 minuten of korter als je niet veel tijd meer hebt! + detectie van fenol via de gebruikelijke kleurreactie! + 1 ml NaOH/EDTA - oplossing (VORTEX!). + 1 ml NaHCO3 (VORTEX!). + 1 ml 4-amino-antipyrine (VORTEX!). + 1 ml K3Fe(CN)6 (VORTEX!). Vergeet geen blanco mee te nemen (zie hierboven: 2.4). Alle buisjes worden uitgemeten bij 500 nm ten overstaan van water. Meet van enkele buisjes met citroenzuurbuffer de werkelijke pH met een pH meter. Vul de tabel in op uw verslag en zet de resultaten grafisch uit (A500 t.o.v. pH). Bepaal het pH-optimum en bespreek.

Verzamel alle afval in een beker. Controleer de pH (met universeelindicatorpapier) en deponeer in de gepaste afvalcontainer ("zuren" of "basen", afhankelijk van de pH) op het einde van de labozitting! Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 5


VERSLAG: ZURE FOSFATASE NAMEN:

Groep:

DATUM UITVOERING:...........

DATUM AFGIFTE VERSLAG:..............

Kijk hier voor een volledige cursus over enzym kinetiek: http://www-biol.paisley.ac.uk/kinetics/contents.html o.a. over voor- en nadelen van Lineweaver-Burk plot en alternatieven zoals Hanes plot!

VRAGEN VOORAF TE BEANTWOORDEN: 1. Welke reactie katalyseren fosfatasen?

2. Waarom wordt er een ijklijn met fenol opgesteld?

3. Wat is de rol van het 4-amino-antipyrine; is het belangrijk voor de enzymatische reactie?

4. Welk product stopt de enzymatische reactie en waarom?

RESULTATEN Hou rekening met het aantal beduidende cijfers bij je rapportering!!!!!!! 1. IJKLIJN: µl fenol (stock) µg fenol µmol fenol A500staal A500staal - A500blanco 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 300

0 (=blanco) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 60

Groep T / 30-01-2008

0

E. De Herdt

p. 6

Labo MCB: zure fosfatase Voeg in bijlage een grafiek A500staal - A500blanco in functie van µmol fenol. Geef de regressie vergelijking: ................................................ Correlatiecoëfficiënt: .................... Een absorptie van 1 bij 500 nm komt aldus overeen met ................µmol fenol.

2. ENZYMATISCHE ACTIVITEIT De concentratie van de gebruikte zure fosfatase stockoplossing was ...............g/100 ml.

Verdunning µg enzym A500staal blanco

0

A500staal A500blanco 0

Units/ml Units/mg v.d. enzym verdunning!

0

0

1/80 1/40 1/20 1/10 1/5 Voeg in bijlage een grafiek A500staal - A500blanco i.f.v. µg enzym. Geef de juiste definitie van een Unit zure fosfatase in dit experiment:

Principieel levert elke verdunning u een waarde op voor de enzymatische activiteit van de enzym stockoplossing. Welke waarde is volgens u het meest betrouwbaar en waarom?

Activiteit van de enzym stockoplossing: ............................Units/ml. Specifieke activiteit van de enzym stockoplossing: .............................Units/mg. Met welke enzym verdunning heb je verder gewerkt: ....................

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 7

Labo MCB: zure fosfatase 3. ENZYMATISCHE ACTIVITEIT ALS FUNCTIE VAN DE SUBSTRAATCONC. ml A500st - Substr.conc. in substr. ml H2O A500 A500bl reaktiemengsel 1/∆ ∆A 1/S (M-1)

Blanco 0,5

4,5

1,0

4,0

1,5

3,5

2,0

3,0

2,5

2,5

3,0

2,0

3,5

1,5

4,0

1,0

4,5

0,5

5,0

0,0

(M)

0

Zet uit in grafiek: 1/A500staal - A500blanco ( =1/v) i.f.v. 1/S (Lineweaver-Burk) Vergelijk eventueel met een Hanes plot, zie hiervoor: (http://www-biol.paisley.ac.uk/kinetics/contents.html) Michaëlis-Menten constante = ......................................... (eenheden!) De maximale enzymatische snelheid, VMax = ............................. (eenheden!) 4. INVLOED VAN FOSFAATIONEN ml A500staal substr. ml H2O A500 A500blanco

Blanco 0,5

4,5

1,0

4,0

1,5

3,5

2,0

3,0

2,5

2,5

3,0

2,0

3,5

1,5

4,0

1,0

4,5

0,5

5,0

0,0

Groep T / 30-01-2008

Substr.conc. in reactiemengsel

1/∆ ∆A 1/S (M-1)

(M)

0

E. De Herdt

p. 8

Labo MCB: zure fosfatase Geef de resultaten weer op dezelfde grafiek 1/v versus 1/S van punt 3. Bepaal de schijnbare Michaëlis-Menten constante K'm = ............................. Over welk type inhibitie gaat het hier en waarom? .......................................

Hoe bereken ja Ki? Wat is het verband tussen Km en K'm?

Bepaal de inhibitor constante Ki = ........................................... (conc. inhibitor in het reactiemengsel = 5 mM x 1/4 = 1,25 . 10-3 M).

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 9

Labo MCB: zure fosfatase 5. pH - OPTIMUM

ml citroenzuur 9,1 8,6 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,4 3,9 3,4 2,9 2,4 1,9 1,4

ml Nacitraat 0,9 1,4 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,6 6,1 6,6 7,1 7,6 8,1 8,6

pH theoretisch 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0

pH gemeten

A500

Zet hieronder de absorptie bij 500 nm uit in functie van de pH. Wat is het optimum: ................... Waarom oefent de pH een invloed uit op de reactiesnelheid? ..........

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 10

Detectie van DNA polymorfisme TPA-25 (Alu) via PCR (MCB)

Detectie van een DNA polymorfisme via polymerase kettingreactie (PCR) In deze proef gaan we DNA isoleren uit de wang via een zoutspoeling waarna we twee verschillende DNA polymorfismen zullen trachten te detecteren via PCR. Owel gaat je groep een Alu insertie polymorfisme detecteren gelegen op chromosoom 8, in de buurt van het TPA gen ofwel ga je een VNTR polymorfisme detecteren gelegen op een niet coderend deel van chromosoom 8, nml. locus D1S80. Lees bijgevoegde bijlage ook goed door. Ze bevat veel informatie over de DNA polymorfismen en het verloop van de proef. Verderop zul je vragen moeten beantwoorden waarvan de antwoorden o.a. in bijlage terug te vinden zijn. Internet links: http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/DNA/detection.html http://www.biology.usu.edu/courses/biol4100/2005%20labs/human%20DNA%20lab%20a nalysis.htm

1Materiaal: Bakje met ijs, waterbad van 100°C, permanente merkerstift (fijn); 10 % Chelex (= iminodiacetic acid, sodium form, Sigma C7901) 1 g + 10 ml 50 mM Tris pH 10.5 (met NaOH) 0,9 % (g/v) NaCl; Steriele epjes (1.5 ml), steriele PCR epjes (250 µl), steriele pipetpunten (10 - 200 - 1000 µl); Steriel water; PCR Core System II, Promega M7665, (-20°C) OF PCR Master Mix, Promega M7502, (-20°C) Primers:

U-TPA: GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT D-TPA: CCCCACCCTAGGAGAACTTCTCTTT

5 x TBE buffer, pH 8,0 (met NaOH); (is reeds klaargemaakt!) 5xTBE Tris Boorzuur EDTA, diNa

g/l 54,0 27,5 3,7

Referentiemerkers: 100 bp ladder van Pharmacia Biotech (27-4001) 100 bp ladder van Promega (G2101), 250 µl (1.13 µg/l), 5 µl te laden! 1 Kb ladder van Promega (G5711), 500µl (0.1µg/µl), 5 µl te laden! Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 1


Blue/orange Loading Dye, 6x (Promega G1881, 3x1ml) bevat Orange G (50bp), Bromophenol blauw (300 bp) en Xylene cyanol FF (4kb) De migratiesnelheid in TBE (0.5-1.4 % agarose) staat tussen haakjes vermeld.

Raadgevingen: Epjes voor de DNA bereiding en de PCR dienen genummerd te worden op het deksel. De zijkanten slijten immers snel af omdat je deze dikwijls vastneemt. Bij het pipetteren uitgaande van stockoplossingen moet je steeds plastic handschoenen dragen en een nieuwe steriele pipetpunt gebruiken dit om contaminatie ervan te vermijden.

2DNA isolatie - Spoel je mond even met water om etensresten te verwijderen; - Geef elke persoon een Falconbuis (50 ml) gevuld met 10 ml 0,9 % (g/v) NaCl; - Giet de zoutoplossing in je mond en was je wangen hevig hiermee (eventueel schrapen met je tanden) gedurende 15 sec; - Vul de Falconbuis met de wasoplossing en centrifugeer de cellen af in de grote kamercentrifuge gedurende 10 min bij 3000 rpm. Zorg voor correcte tegengewichten!!!! - Haal de centrifugeerbuis uit de rotor en hou hem in dezelfde houding (hoek) zonder te draaien of teveel te bewegen. Pipetteer zoveel mogelijk van het supernatans weg zonder de witte celpellet te verstoren en bewaar de buis op ijs; - Neem een automatische pipet (1000 µl) met blauwe tip, waarvan je de punt afknipt. Controleer of de opening groot genoeg is en het hars de punt niet verstopt. Schud de chelex stockoplossing goed op en breng 500 µl over bij de celpellet (opzuigen langs de zijkant aangezien er daar een grotere hoeveelheid chelex aanwezig is. Controleer of je wel degelijk hars hebt overgebracht, want dit bezinkt snel zodat er een reële kans bestaat dat je verkeerdelijk enkel vloeistof opzuigt. - Resuspendeer de celpellet door op en neer te zuigen. Controleer visueel dat er geen klompen meer aanwezig zijn; - Breng 500 µl terug over in een proper, gemerkt epje van 1.5 ml en incubeer 10 minuten in een kokend waterbad, waarna je het epje 1 minuut op ijs laat afkoelen; - Plaats de epjes in de eppendorfcentrifuge en centrifugeer gedurende 30 sec om het hars te pelletteren. Breng 200 µl van het supernatans over in een proper, gemerkt (volgens een volgnummersysteem dat opgegeven wordt door de laboverantwoordelijke) epje (geen hars mee overbrengen !!!), bewaar op ijs tot de monstername voor PCR en vries later in bij -20°C.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 2


3Bereiding van het PCR mengsel 3.1.1Methode via de PCR Core II kit (Promega) De volgorde van de bereiding van het mengsel is belangrijk aangezien het DNA zelf en het DNA polymerase gevoelig zijn voor veranderingen in de omgeving: temperatuur, pH, zoutconcentratie, enz. Daarom beginnen we met de buffer, waarna we water, de nucleotide mix en de 2 primers toevoegen. Hierna volgt het DNA polymerase. Dit mengsel kunnen we in grote hoeveelheden aanmaken (dit noemen we een mastermix!!) Het uiteindelijke aangemaakte volume is het aantal stalen plus één. Dit mengsel wordt eerst gevortexd, gecentrifugeerd, gevortexd en verdeeld over het aantal stalen. Om de reactie te starten voegen we uiteindelijk het template DNA toe, waarna we kort afcentrifugeren, de stalen in het PCR toestel plaatsen en de run starten.

Werkwijze: - de epjes voor de PCR worden gemerkt, in de speciale houders (Perkin Elmer) geplaatst en op ijs gezet. - uit de PCR Core II kit worden de buisjes met Taq DNA polymerase, Taq DNA polymerase 10x buffer / 15 mM MgCl2, PCR nucleotide Mix genomen, in de hand ontdooid en vervolgens op ijs bewaard. De geschikte upstream en downstream primers worden u ter beschikking gesteld; - Alle uit de diepvries gekomen epjes worden nadat ze ontdooid zijn kort gemengd en kort gecentrifugeerd teneinde homogene oplossingen te bekomen; - Maak de gepaste hoeveelheid mastermix oplossing en voeg vlak voor je de PCR run start het template DNA toe: - Vergeet geen negatieve blanco mee te nemen: deze bevat alles behalve DNA, dus extra 5 µl water toevoegen i.p.v. een DNA staal!!! Component Buffer, 10x / 15 mM MgCl2 Water (steriel) PCR Nucleotide Mix, elk 10 mM Upstream primer, 50 µM Downstream primer, 50 µM Taq DNA Polymerase, 5U/µl) Totaal

Volume (µl) 5 36.75 1 1 1 0.25 45

Aantal stalen + 1= x Eindconcentratie 1 x / 1.5 mM MgCl2

200 µM elk 1 µM 1 µM 1.25 U

deze volumes vermenigvuldigen met x en samenvoegen, mengen, afcentrifugeren en per 45 µl uitverdelen

DNA staal of water (neg. blanco) Totaal

Groep T / 30-01-2008

5 50

E. De Herdt

p. 3


3.1.2Methode via PCR Master Mix kit (Promega): - uit de PCR Master Mix kit wordt het epje met de Master Mix oplossing en het epje met nuclease vrij water genomen en in de hand ontdooid. Ze worden gemengd en kort gecentrifugeerd teneinde een homogene oplossing te bekomen waarna ze op ijs worden bewaard. De geschikte upstream en downstream primers, alsook het positieve controle plasmide en de bijhorende positieve controle primers worden u ter beschikking gesteld; - Neem uw DNA stalen uit de diepvries, ontdooi ze, meng ze en centrifugeer ze kort; - Vergeet geen negatieve blanco mee te nemen: deze bevat alles behalve DNA, dus extra 5 µl water toevoegen i.p.v. een DNA staal!!! - Vul elk epje volgens onderstaand schema: Component PCR, Master Mix, 2x Nuclease vrij water Upstream primer, 50 µM Downstream primer, 50 µM

Volume (µl) 25 18 1 1

Aantal stalen = x Eindconcentratie 1 x / 1.5 mM MgCl2

1 µM 1 µM

deze volumes vermenigvuldigen met x en samenvoegen, mengen, afcentrifugeren en per 45 µl uitverdelen (de laatste portie dient voor de negetieve blanco!)

DNA staal of water (neg. blanco) Totaal

5 50

- vergeet ook geen positieve controle mee te nemen: assembleer hiervoor in een PCR epje (200 µl): Component PCR, Master Mix, 2x Nuclease vrij water Upstream controle primer, 15 µM Downstream controle primer, 15 µM Positieve controle plasmide DNA, 1 ng/ µl Totaal

Volume (µl) 25 17.4 3.3 3.3 1 50

Mengen, kort afcentrifugeren en in het PCR toestel plaatsen! Het TPA programma opstarten! Het logboek van het PCR toestel nauwkeurig invullen met betrekking tot aard en plaats van de verschillende stalen!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 4


4PCR run 4.1Programma voor TPA: aantal cycli tijd (min) 1 3 30 1 1 1 1 5 1 ∞

temp (°C) 94 94 58 72 72 4

Na de PCR run worden de stalen door het toestel op 4°C bewaard. De volgende dag dienen de stalen bewaard te worden bij -20°C tot het tijdstip van electroforetische analyse.

5Electroforese 5.1Electroforese De PCR stalen worden uit de diepvries gehaald en aan 50 µl PCR staal wordt ofwel: 10 µl 6 x loading dye toegevoegd; of 12.5 µl 5 x loading dye toegevoegd. Mengen en kort afcentrifugeren vooraleer 10 µl te laden. Ontdooi ook enkele referentiemerkers (100 bp ladder)

5.2Alu detectie Deze gebeurt via een 2 % agarose gelelectroforese (zie restrictieafbraak experiment). 4 g agarose in 200 ml 1xTBE buffer laten oplossen via microgolfoven, gel gieten, laten stollen en 10 µl staal laden (5 µl van de referentiemerkers). 120 V, 1 u 15 min. Kleuren met ethidiumbromide en fotograferen (laboverantwoordelijke).

6Analyse Ken op basis van het bekomen bandenpatroon de allelische vormen toe aan elke persoon van de groep: d.w.z. genotype voor TPA (homozygoot +/+ of -/- of heterozygoot +/-) + : aanwezigheid van Alu insertie: fragmentgrootte 400 bp - : afwezigheid van Alu insertie: fragmentgrootte 100 bp. Als je geïnteresseerd bent in een eerste kennismaking met bioinformatica technieken kan je alvast deze oefening even doornemen: http://www.biology.usu.edu/courses/biol4100/2005%20labs/bioinformatics.htm Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 5


Verslag: DNA polymorfismen Namen: ………………………………………………………………………………. Datum afgifte: ………….. 1.

Vanwaar komt de benaming “Alu” insertie?

2.

Wat is de functie van de Chelex?

3.

Evalueer de kwaliteit van uw gel, zijn er primer dimeren aanwezig?

4.

Geef voor uw totale labogroep de genotypische distributie van de TPA locus en bereken hieruit de allelische frequentie van (+) en (-).

Persoon

Volgnummer

TPA Genotype

type aantal +/+ +/-/totaal

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 6

Detectie van DNA polymorfisme TPA-25 (Alu) via PCR (MCB) 5.

Vergelijk dit met de verwachte genotype frequentie:

50% heterozygoot (2pq), 30% homozygoot zonder instertie (-/-) (q2), 20% homozygoot met insertie (+/+) (p2)

frequentie p2 q2 2pq

verwacht

6.

Hoe verklaar je mogelijke afwijkingen?

7.

Bereken de χ2 waarde voor de totale groep en trek uw conclusie?

uw groep

8. Ken je nog andere polymorfismen (catalogi) die in aanmerking komen voor persoonsidentificatie of verwantschapstudies?

9.

Kleef hieronder een foto of scan van uw gel en schrijf een legende + benoem iedere ‘lane’ met het volgnummer van het geladen DNA staal.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 7

Eiwitfingerprinting via SDS-PAGE, slabs, Bio-Rad

Eiwit ‘fingerprinting’ via SDS-PAGE Mini-PROTEAN 3 /BIO-RAD 1.

Inleiding

Veranderingen in DNA (mutaties), hebben gedurende de tijd voor een enorme diversiteit aan levende organismen op aarde gezorgd. Daar het DNA codeert voor eiwitten met een welbepaalde functie, zal een verandering in het DNA ook soms een productie van een ander eiwit (of andere structuur) met zich meebrengen. De theorie van de genetische evolutie is gebaseerd op de veronderstelling dat elk levend organisme afstamt van een eenvoudige ééncellige voorvader en dat het door voortdurende modificatie en diversificatie in die vorm voorkomt waarin het zich nu bevindt. Deze theorie wordt ondersteund door het feit dat een groot deel van de DNA sequenties van de verschillende organismen op aarde sterk op elkaar lijken. Hoe verder de organismen van elkaar verwant zijn, hoe groter de verschillen. Verwante organismen vertonen echter veel meer gelijkenissen in hun genetische code.

2.

Doel van de proef

In deze proef zullen we een eiwit “fingerprinting” gaan toepassen op enkele stalen van het spierweefsel van verschillende vissen. Op deze wijze kunnen we de voorafgaande theorie toetsen aan de werkelijkheid. We gaan kijken of het aantal verschillende eiwitten in de weefsels van verwante vissoorten kleiner is dan bij soorten die verder van elkaar verwant zijn. Ook zullen we bij deze proef kunnen zien dat er eiwitten zijn die in elke soort voorkomen. Het spierweefsel van vissen is uitermate geschikt om deze proef te ondergaan omdat de vissen een diverse en oude groep van vertebraten zijn en omdat veel van deze soorten gemakkelijk te verkrijgen zijn. Daarenboven bevat het spierweefsel van vissen een laag vetgehalte en een laag gehalte aan sterk weefsel waardoor we op een vrij eenvoudige manier de eiwitten kunnen oplossen. De twee belangrijkste eiwitten die voorkomen in de spieren zijn actine en myosine, welke instaan voor de spiercontractie. Zij zijn uiteraard ook aanwezig in alle vissoorten, maar er zijn nog vele andere eiwitten die nodig zijn bij spiercontractie. Deze vertonen meer variabiliteit: sommige komen voor bij bepaalde soorten en bij andere weer niet. Aan de hand van de verschillen die er nu optreden bij de “fingerprints” van de verschillende soorten gaan we dus een idee kunnen krijgen van de verwantschap. Deze resultaten kunnen we dan nadien vergelijken met een stamboom die gebaseerd is op morfologische kenmerken. Kijk voor bijkomende documentatie: Project ‘Tree of life’: http://tolweb.org/tree/phylogeny.html Ichthyology Web Resources: http://www2.biology.ualberta.ca/jackson.hp/IWR/index.php Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 1


3.

SDS-polyacrylamide gelelectroforese

Tijdens SDS polyacrylamide gelelectroforese vindt er een interactie plaats tussen eiwitstaal, gelmatrix, bufferbestanddelen en electrische stroom. Dit zijn dan ook de variabelen die we in acht moeten nemen. Bijkomende informatie over geleleftroforese: http://wine1.sb.fsu.edu/BCH4053/bch4053.htm

3.1.

Poriëngrootte

Polyacrylamide (PAA) is een uiterst geschikt dragermateriaal voor electroforese. Het geeft scheidingen met een hoge resolutie. De gewenste poriëngrootte van de gel is op een eenvoudige wijze te realiseren. De gel wordt immers gevormd door de polymerisatie van twee monomeren, acrylamide en een 'cross-linking' reagens N,N'-methyleen(bis)acrylamide. Het percentage monomeer geelft een indicatie van de poriëngroote: g acrylamide + g crosslinker ______________________________ %T = x 100 totaal volume (ml) De verhouding van de monomeren (en niet zozeer de totale concentratie) is echter zeer belangrijk voor de poriëngrootte, alhoewel een minimale totale concentratie nodig is voor gelvorming. g crosslinker ______________________________ %C= x 100 g acrylamide + g crosslinker Voor de meeste analytische gels geldt: 2,67 %C Gels kunnen een continu percentage bevatten of een gradiënt %T. Typische samenstellingen zijn van 7,5 % tot 20 % voor continue gels en 4-15 % of 10-20 % voor gradiënt gels. De totale monomeer concentratie voor optimale scheiding is de ‘optimale %T’. Deze is afhankelijk van het molecuulgewicht. Empirisch is het deze concentratie die leidt tot een relatieve mobiliteit (Rf) tussen 0,55 – 0,60. migratieafstand van het eiwit Rf =

________________________________

Migratieafstand ionenfront

P =

__

L

De polymerisatie van de gel vereist (NH4)2S2O8 (ammoniumperoxidisulfaat) als catalysator en TEMED (tetramethylethyleendiamine) als initiator van de reactie. De polymerisatie en 'cross-linking' verloopt zoals voorgesteld in onderstaande figuur: Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 2


3.2.

Gelbuffersystemen

Het buffersysteem bepaalt het benodigde voltage en de scheiding. Het bestaat uit de gebruikte buffer voor de gel (gelbuffer) en deze die gebruikt wordt tussen gel en electroden (electrodebuffer). Er bestaan continue en discontinue systemen. 3.2.1. Continue buffersystemen Hier zijn dezelfde bufferionen aanwezig bij constante pH, zowel in de gel als in de electrodereservoirs. De gel bestaat uit een continu % T en het staal wordt rechtstreeks geladen op de gel waarin de scheiding zal plaatsvinden. De te verwachtten banddikte wordt bepaald door het staalvolume. Daarom wordt best met geconcentreerde eiwitstalen gewerkt. Dit systeem wordt in dit practicum toegepast. 3.2.2. Discontinue buffersystemen Verschillende ionen zijn aanwezig in de gel en de electrodereservoirs. Door tevens een ‘stacking’ gel bovenop het scheidingsgel aan te brengen, worden de stalen gecomprimeerd in een smalle startband. De resolutie ligt hier dus hoger.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 3


3.3.

SDS-PAGE

PAA-gelelectroforese (PAGE) wordt uitgevoerd in cylindrische glazen buisjes ('rod gels') of op 'slab gels' (vertikale slab gelelectroforese). SDS-polyacrylamide-gelelectroforese (SDS-PAGE) wordt gebruikt voor het scheiden van eiwitten. Voor electroforese worden de eiwitten gedissociëerd tot de samenstellende polypeptideketens door reductie van de disulfidebruggen met β-mercapto-ethanol en gedenatureerd met SDS (natrium-dodecylsulfaat) ter vorming van staafvormige eiwitSDS-komplexen. SDS, een anionisch detergent, bindt in nagenoeg dezelfde verhouding aan alle eiwitten (ongeveer 1,2 g SDS/g eiwit). Alzo wordt de natieve lading van het eiwit gemaskeerd en hebben ze, bij neutrale pH, allen een constante ladingsdichtheid. Ten gevolge hiervan is de electroforetische mobiliteit van alle eiwit-SDS-komplexen nagenoeg gelijk. Het moleculair zeefeffect van de PAA-gel tijdens de elctroforese zorgt echter voor een relatieve mobiliteit die omgekeerd evenredig is met de grootte van de complexen. SDS-PAGE wordt uitgevoerd in aanwezigheid van SDS. Een 'tracking dye' of 'front marker' (dit is een snelmigrerend negatief geladen molecule) laat toe het einde van de elctroforese te bepalen. Na electroforese worden de gels uit hun houders gehaald, gekleurd en ontkleurd. SDS-PAGE is momenteel de meest gebruikte electroforesetechniek voor eiwitten. Deze techniek is uitermate geschikt om op elk stadium van een eiwit-zuiveringsprocedure de complexiteit en de relatieve samenstelling van een eiwitpreparaat te bepalen. Met deze techniek kan op een eenvoudige wijze de moleculaire massa van de gescheiden polypeptiden bepaald worden. Er bestaat immers een lineair verband tussen log MG en de relatieve mobiliteit Rf. Met behulp van een reeks eiwitten met gekend MG (ijkeiwitten) kan een ijkkurve opgesteld worden. Uit de Rf van een eiwit met ongekend MG kan dan het MG bepaald worden.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 4


4.

Experimenteel gedeelte 4.1.

Benodigdheden 4.1.1. Stockoplossingen

- 30 % (g/v) acrylamide (TOXISCH ! zuurkast en handschoenen); - 1 % (g/v) bis-acrylamide (TOXISCH ! zuurkast en handschoenen); - 10 % (g/v) (NH4)2S2O8: juist voor gebruik aanmaken! - TEMED: commerciële vloeistof, (GIFTIG + VLUCHTIG!) (frigo). - Kleuroplossing:

0,2 % (g/v) Coömassie Brilliant Blue G-250; 30 % (v/v) methanol technische kwaliteit! 10 % (v/v) azijnzuur technische kwaliteit! De kleuroplossing steeds RECUPEREREN!

- Ontkleuroplossing 30 % (v/v) methanol of ethanol (=norvanol); 10 % (v/v) azijnzuur. Ontkleuroplossing steeds RECUPEREREN! - IJkproteinen, LMW (Pharmacia) Een mengsel van: Fosforylase b (konijnespier) Serumalbumine (rund) Ovalbumine (eiwit) Koolzuuranhydrase (rundererythrocyten) Trypsine inhibitor (sojaboon) α-lactalbumine (rundermelk)

94 000 67 000 43 000 30 000 20 100 14 400

- Kaleidoscoop Polypeptide standards (Biorad CatN° 161-0324) De eiwitten worden covalent gebonden met een kleurstof waardoor ze altijd zichtbaar zijn. De covalent gebonden kleurstoffen wijzigen het molecuulgewicht van de eiwitten en zorgen voor relatief brede banden!!! Door deze procedure is het werkelijke molecuulgewicht afhankelijk van lot tot lot: Eiwit Kleur Benaderend Lotgebonden MG (92691) MG Myosine Blauw 216 000 199 000 Beta-galactosidase Magenta 132 000 133 000 BSA Groen 78 000 87 000 Carbonic anhydrase Violet 45 700 40 100 Soybean trypsin inhibitor Oranje 32 500 31 600 Lysozyme Rood 18 400 18 510 Aprotinin Blauw 7 600 7 100 -

cellulose acetaat velletjes

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 5


Voor een zelfgemaakte continue gel: - gelbuffer:

0,59 M Tris; 0,46 M Glycine; 0,5 % (g/v) SDS.

- electrodebuffer: Tot. vol. electrodebuffer 0,01 M Tris 0,33 M Glycine 0,1 % (g/v) SDS

35,74 g 17,27 g 2,5 g

totaal 500 ml

g/1 liter g/5 liter 1,21 6,07 24,77 123,86 1,00 5,00

- Laadbuffer (om stalen in op te lossen!) (2x): 2x 0.05 M Tris 2.5 % SDS 10 % glycerol 5 % β mercaptoethanol dit zijn eindconcentraties van 1x

1.21 g 5g 20 ml 10 ml

aanlengen tot 100 ml

Voor een discontinu systeem: - 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 - 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 - 10 % (g/v) SDS - 1 % bromophenol blauw - electrodebuffer: electrodebuffer 0,025 M Tris 0,192 M Glycine 0,1 % (g/v) SDS

g/1 liter g/1000 ml (5x geconc)! 3.0 15.0 14.4 72.0 1 5.0 pH ongeveer 8.3 (niet aanpassen!!!)

- Laadbuffer (1,5x) (om stalen in op te lossen!): 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.0 ml 10 % SDS 1.6 ml glycerol 2.0 ml β mercaptoethanol 0.4 ml 1.0 % bromophenol blauw 0.1 ml gedeïoniseerd water 2.9 ml tot = 8 ml

eindconcentratie van 1,5x 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8 2 % SDS 25 % glycerol 5 % β mercaptoethanol 0.0125 % bromophenol

1 deel staal verdunnen met 2 delen laadbuffer (1,5x) brengt de eindconcentratie op 1x!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 6


4.1.2. Apparatuur - Stroombron (instelbaar op konstante spanning of konstante stroomsterkte); - Electroforeseapparaat: Mini-PROTEAN 3 unit van de firma BIO-RAD - Casting apparatuur voor het maken van slabgels; - Afzuigfles met stop.

4.2. -

Bereiden van de slabgels

4.2.1. Assemblage van de gel cassette plaats de kleine plaat voorzichtig bovenop de grotere plaat (=spacer plaat)

-

glij vervolgens de opeengestapelde platen in het casting frame (groen) ervoor zorgend dat de kleine plaat vooraan staat.

-

sluit de poorten van de casting frame zodat de platen goed vastzitten;

-

plaats daarna alles op de daartoe voorziene staanders, we zorgen ervoor dat deze goed vastzitten (maak de poorten nog eens open en druk de platen nog eens extra op het rubber om later lekken te voorkomen)

4.2.2. Acrylamide mengsel maken Zelfgemaakte continue gels: Continue PAA- gels worden bereid volgens onderstaand schema:

gelbuffer 30 % acrylamide 1 % bis acrylamide R.O. water ONTGASSEN ! (10 min) TEMED 10 % (g/v) (NH4)2S2O8 TOTAAL

2 slab gels (10%) 3,60 ml 6,00 ml 2,34 ml 6,00 ml

2 slab gels (15%) 3,60 ml 9,00 ml 3,51 ml 1,77 ml

30 µl 90 µl

30 µl 90 µl

18 ml

18 ml

OPGEPAST! DE POLYMERISATIE START ONMIDDELLIJK! Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 7


4.2.3. Vullen van de platen In principe heb je met 10 ml voldoende om de 2 gels (dikte 0,75 mm) te vullen. Voor gels van dikte 1,5 mm heb je zeker 22 ml nodig dus verdubbel de hoeveelheden in bovenstaande tabel! - Vul onmiddellijk de gelplaten met een glazen pasteurpipet tot de plaatjes helemaal vol zijn; - plaats vervolgens de kam met 10 kanteeltjes (= aantal te laden stalen) tussen de platen, hierbij moeten we luchtbellen onderaan de kantelen proberen te vermijden door de staander schuin te houden wanneer we de kam tussen de platen plaatsen; - laat 1 uur polymeriseren.

Zelfgemaakte discontinue gels: Eerst wordt de cassette gevuld met de scheidingsgel tot ongeveer één centimeter lager dan de onderkant van de slotjes. Hierop wordt dan een verzadigde oplossing van water met iso-butanol gebracht, dit om the voorkomen dat de lucht de polymerisatie zou inhiberen. Men laat dit geheel ongeveer een uur polymeriseren. Ondertussen wordt de ‘stacking’ gel aangemaakt. Men giet de iso-butanol af en vult de cassette tot bovenaan met het ‘stackinggel’ mengsel. Als laatste plaatst men de kammetjes om slotjes te vormen. Discontinue PAA- gels worden bereid volgens onderstaand schema:

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 10 % SDS 30 % acrylamide 1 % bis acrylamide R.O. water ONTGASSEN ! (10 min) TEMED 10 % (g/v) (NH4)2S2O8 TOTAAL

2 scheidingsgels (10%) 4,50 ml 0,18 ml 6,00 ml 2,34 ml 4,86 ml

2 scheidingsgels Stackinggel (15%) 4,50 ml 5,0 ml 0,18 ml 0,2 ml 9,00 ml 2,43 ml 3,51 ml 2,0 ml 0,69 ml 10,4 ml

90 µl 270 µl

90 µl 270 µl

90 µl 270 µl

18 ml

18 ml

20,24 ml

OPGEPAST! DE POLYMERISATIE START ONMIDDELLIJK! 18 ml is ruimschoots voldoende voor 2 gels met een dikte van 0,75 mm; voor gels met een dikte van 1,5 ml dienen de bovenstaande volumes best verdubbeld te worden!

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 8


4.3.

Gebruik van kant en klare ‘Ready Gels’ (BioRad)

Deze commerciëel verkrijgbare gels worden uit de verpakking genomen en rechtstreeks in het electroforesetoestel geplaatst. Er zijn verschillende acrylamide concentraties verkrijgbaar en ook gradiënt gels. Gebruik deze die aangewezen is voor jouw toepassing. De in het labo verkrijgbare gels zijn gemaakt in Tris-HCl, pH 8.8 buffer. Ze worden gelopen met de electrodebuffer van het discontinue systeem, zoals hierboven beschreven. De eiwitstalen worden opgenomen in de laadbuffer van het discontinue systeem (pH 6.8) zoals hierboven beschreven.

4.4.

Voorbehandeling van de eiwitmonsters

Selecteer een aantal visstalen die volgens u informatief kunnen zijn om de evolutionaire stamboom te confirmeren. Prepareer de monsters zoals opgegeven door de laboverantwoordelijke (uiteindelijk moeten de eiwitten zitten in 1 x laadbuffer. In elk epje is een blokje vis aanwezig. Laat ontdooien en voeg 250 µl laadbuffer (1x) toe. Meng en schud regelmatig gedurende een tiental minuten. Centrifugeer gedurende 1 minuut om het onopgelost materiaal (meerderheid!) in pellet te verkrijgen. Breng zoveel mogelijk supernatans over in een proper eppendorfbuisje. Concentratiebepaling: Spot van elk staal 4 µl op een cellulose acetaat strip. Spot ook een BSA (albumine) verdunningsreeks als referentie (50 – 25 – 12.5 – 6 .25 – 3.12 – 1.6 µg/µl). Kleur 5 minuten en ontkleur. Maak een ruwe schatting van de concentratie en verdun uw stalen zodanig dat elk staal een concentratie bezit van +/- 20 µg/µl. De ijkeiwitten (gelyophiliseerd flesje) worden rechtstreeks opgenomen in 200 µl 1 x laadbuffer en werden vooraf door de laboverantwoordelijke klaargemaakt, zodat je ze enkel nog maar te laden hebt; Alle stalen ondergaan een hittebehandeling ( 10 minuten, 100°C) waarna enkele seconden gecentrifugeerd wordt om de fijne druppeltjes onderaan te verzamelen of om het schuim te verwijderen! Laad 10 µl per slotje! Volgende stalen zijn ter beschikking: 1 Zeeduivel 2 Mossel 4 Zalm 5 Sprot 7 Rog 8 Pladijs 10 Barbeel 11 Noordzeegarnaal 13 Tonijn 14 Botervis 16 reuzegarnaal 17 Inktvis

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

3 6 9 12 15

Zeewolf Kabeljauw Forel Sardine Zeepaling (doornhaai)

p. 9


4.5. -

-

-

Elektroforese

4.5.1. Assemblage van het toestel Verwijder de slabgels uit het frame (groen) en plaats deze in de electrode unit zodat de kleine plaatjes naar de binnenkant gericht zijn; Schuif de casette met de electrode in het klemraam; Druk goed naar beneden terwijl de klemmen worden gesloten; Plaats het geheel in de Mini Tank. De binnenkamer van het apparaat (= bovenste bufferreservoir) wordt gevuld met ongeveer 125 ml electrodebuffer totdat de buffer ongeveer in het midden van de toppen van de twee platen komt (boven het kleine plaatje maar niet over de grote plaat!) Vul vervolgens de Mini-Tank met 200 ml electrodebuffer (= onderste bufferreservoir).

4.5.2. Laden van de eiwitstalen Reken op een maximaal laadvolume van ongeveer 10 ul. Om eenvoudig te laden, kan er een geel hulpstuk geplaatst worden tussen de kathode en anode. Plaats het uiteinde van de tip schuin tegen de dikke plaat! Laad het staal zeer traag met behulp van een pipet met gele tip zodat het de kans krijgt om tot op de bodem van het kanteeltje te zakken (niet prikken in de bodem van het kanteeltje)

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 10


-

-

4.5.3. Electroforese Plaats het deksel op het toestel zodat de kleuren van de electrode overeenkomen (rood = anode, zwart = kathode) Verzeker nadien de korrekte aansluiting met de stroombron De looptijd zal ongeveer 35 min bedragen bij 200 volt. Controleer of er stroom door het systeem loopt door deze te meten via de stroombron. Spanning staat er immers altijd op! Open het apparaat NOOIT tijdens de elektroforese! Als de 'tracking dye' ongeveer 1 cm van de onderkant gekomen is, wordt de elektroforese stopgezet. Stroombron afzetten en kabels verwijderen.

4.6. -

Kleuren en ontkleuren van de gels

Verwijder het deksel en neem het casette/electrode-klemraam uit het toestel. Giet de electrode buffer weg. Open de klemmen en verwijder de gelcasettes. Verwijder voorzichtig het bovenste plaatje met behulp van het daarvoor voorziene groene rechthoekje. Verwijder voorzichtig de gel met behulp van het daarvoor voorziene groene rechthoekje. Eventueel afspoelen in bakje en overbrengen in de kleurvloeistof.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 11

Eiwitfingerprinting via SDS-PAGE, slabs, Bio-Rad - De kleuring van de gels gebeurt in de kleuroplossing gedurende 15 min. Hierna wordt ontkleurd met de ontkleuroplossing tot de achtergrond weer helder is. Meermaals (2x) verversen is noodzakelijk. Continu schudden is aan te raden! - Laat de gel nooit droog staan anders rolt deze op! - Reinig alle onderdelen van het Mini-Protean systeem met gedeïnoniseerd water. Meet van de voornaamste eiwitbanden op de gels de migratieafstand, evenals de totale lengte van de gel. Vraag om de gel te scannen en af te drukken. Op onderstaande internetsite tref je prachtige voorbeelden van mislukte gels of waar tenminste enkele opmerkingen zijn over te geven. Surf er zeker eens naar toe, hij is zeer leerrijk: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html

5.

Verslag

Stel voor de ijkeiwitten een grafiek op (log molecuulgewicht in functie van relatieve mobiliteit = migratieafstand van de band/migratieafstand van ‘loading dye’). Bepaal hiermee het molecuulgewicht van de polypeptideketens in de onbekende preparaten.

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 12


VERSLAG:

Eiwitfingerprinting SDS-PAGE

NAMEN: DATUM UITVOERING:.............. DATUM AFGIFTE VERSLAG:.............. VRAGEN VOORAF TE BEANTWOORDEN: 1. Geef de struktuurformule van SDS (Na-zout):

2. Welke lading hebben de eiwit-SDS-compexen?

3. Welk eiwit migreert het vlugst bij SDS-PAGE: serumalbumine (MM 67 000) of αlactalbumine (MM 14 400)?

4. Vergelijk SDS-PAGE met gelfiltratie.

5. Zou het mogelijk zijn om de gescheiden eiwitten na SDS-PAGE te testen op hun enzymatische activiteit? Bespreek

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 13

Eiwitfingerprinting via SDS-PAGE, slabs, Bio-Rad 7. Wat zou er gebeuren als je kathode en anode verkeerd aansluit (omwisseling)?

8. Zoek de R- en S- zinnen van acrylamide op.

9. Wat is het effect van β-mercapto-ethanol op eiwitten? Geef eveneens de structuurformule van β-mercapto-ethanol en de reactie die optreedt.

10. Wat is de functie van actine en myosine tijdens de spiercontractie?

RESULTATEN, BEREKENINGEN, INTERPRETATIES: 1. Opstellen van de ijkkurve (logMG i.f.v. RM): Totale lengte van de gel =........................... IJkeiwit MM gemigreerde afstand(cm) Fosforylase b

log MG

Rf

Serumalbumine Ovalbumine Koolzuuranhydrase Trypsine inhibitor α-lactalbumine

Voeg de grafiek bij: log MM versus Rf Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 14

Eiwitfingerprinting via SDS-PAGE, slabs, Bio-Rad 2. Analyse van de onbekende monsters: Werk op basis van de ingescande of gefotografeerde gel. 1. Meest verwante soorten: Als je de stamboom bekijkt: welke visstalen zouden de grootste overeenkomst moeten vertonen? a. Bekijk de eiwitbanden in deze twee stalen; hoeveel ervan zijn aanwezig in beide stalen?

b. Wat is het totaal aantal verschillende eiwitbanden dat je via uw gel hebt kunnen detecteren bij deze twee soorten?

c. Welk percentage is gemeenschappelijk? (a/b).100 %

2. Meest verschillende soorten: Als je de stamboom bekijkt: welke visstalen zouden de slechtste overeenkomst moeten vertonen? a. Bekijk de eiwitbanden in deze twee stalen; hoeveel ervan zijn aanwezig in beide stalen?

b. Wat is het totaal aantal verschillende eiwitbanden dat je via uw gel hebt kunnen detecteren bij deze twee soorten?

c. Welk percentage is gemeenschappelijk? (a/b).100 %

3. Komen uw bevindingen overeen met de relaties van de phylogenetische stamboom?

4.Welke banden op uw gel komen volgens u overeen met actine en myosine?

Groep T / 30-01-2008

E. De Herdt

p. 15

3 BAC Biochemie , 2 semester. E. De Herdt

Recommend Documents