28

Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287)

EXTRAKČNÍ METODY

Mgr. Romana Kostrhounová, Ph. D. RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšení teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

EXTRAKČNÍ METODY

odběr vzorku

extrakce

stanovení

Extrakční krok – hlavní zdroj chyb Časová a ekonomická náročnost Příprava vzorku pro extrakci Homogenizace Příprava alikvotu (poměrné části vzorku) pro kvantitativní extrakci zájmových sloučenin, analytů Vzorek se musí učinit extrahovatelným, forma vhodná pro extrakci, přístupným extrakčnímu činidlu

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

EXTRAKCE • • •

separační proces v kontaktu jsou dvě navzájem nemísitelní fáze analyty se dělí mezi fáze na základě rozdílné rozpustnosti (rozdílných rozdělovacích koeficientů) v použitých fázích.

• čím větší rozdíl mezi rozdělovacím koeficienty látek – tím dokonalejší je jejich oddělení. Cíl extrakce : selektivní až specifické oddělení analytu od ostatních složek vzorku nebo naopak oddělení rušících složek od analytu.

Rozdělení extrakcí a) podle zúčastněných frakcí 1. kapalina - plyn – headspace metoda extrakce těkavých látek plynem z kapaliny, použití např. v plynové chromatografii 2. kapalina – kapalina - LLE – liquid liquid extrakce 3. tuhá fáze – kapalina – selektivní rozpouštění, loužení

b) podle způsobu provedení 1. jednostupňová – dochází k ustavení jedné rovnováhy mezi fázemi, např. třepání v dělící nálevce 2. mnohostupňová – proces ustavení rovnováhy se mnohokrát opakuje v oddělených krocích. 3. kontinuální – fáze jsou při protiproudem pohybu v neustálém styku, např. extrakce v Soxhletově extraktoru c) podle charakteru extrahovaných látek 1.extrakce organických látek

2.extrakce kovových chelátů 3.extrakce iontových asociátů

• Organické látky – extrahujeme do vhodného rozpouštědla • Polarita rozpouštědla – musí přibližně odpovídat polaritě extrahované látky • Nepolární látky – extrakce nepolárními rozpouštědly • Polární látky – extrakce polárními rozpouštědly, vesměs dobře mísitelné s vodou

ELUOTROPNÍ ŘADA rozpouštědla seřazená podle rostoucí polarity 1. rozpouštědla umístěná v eluotropní řadě blízko sebe – dobře mísitelná 2. rozpouštědla z protilehlých konců nemísitelná

POLARITA MOLEKUL • rozhoduje o tom, jak se molekula bude chovat na polárních a nepolárních rozhranních • 2 hlavní média - voda (vodné roztoky) - tuky (lipidy)

látky, které je preferují hydrofilní lipofilní

POLARITA MOLEKUL • Pro praktické testování polarity látek se požívá: rozdělovací koeficient oktanol – voda (KOW) = poměr rovnovážných koncentrací látky v oktanolu a ve vodě koncentrace látky v oktanolu KOW = -----------------------------------------koncentrace látky ve vodě - vysoké KOW - nízké KOW

nízká polarita vysoká polarita

lipofilní látky hydrofilní látky

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

EXTRAKCE KAPALINA/KAPALINA • • • •

.

LLE – liquid liquid extraction Umožňuje oddělit velké množství rušivých látek Umožňuje izolovat stopové množství analytu Velmi jednoduché provedení – dělící baňky Lze dosáhnout vysoké selektivity použitím modifikátorů (pH, vysolování, iontově párující reagenty)

EXTRAKCE KAPALINA/KAPALINA Nevýhody: o používání velkého množství rozpouštědel o tvorba emulzí (odstranění přídavkem solí, zahříváním a zchlazením nálevky, filtrací, odstředěním, přídavkem malého množství jiného rozpouštědla) o obtížnější automatizace

Princip:  založena na přechodu rozpuštěné látky z jedné kapalné fáze do druhé, vzájemně nemísitelné  jedním rozpouštědlem voda (nebo vodný roztok), zatímco druhé rozpouštědlo je organické, s vodou nemísitelné (např. hexan, ether, chloroform, cyklohexan)  látka rozpuštěná v jedné fázi přechází při protřepávání obou kapalin do fáze druhé. Po ustavení rovnováhy je poměr koncentrací rozpuštěné látky v obou fázích konstantní.

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšení teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

ALKALICKÁ HYDROLÝZA • •

•

•

saponifikace, zmýdelnění (z latinského sapon – mýdlo) efektivní procedura k uvolnění neutrálních lipidů, zejména triglyceridů, z biologické matrice dochází k hydrolýze esterových vazeb a uvolnění mastných kyselin z glycerolu nebo glyceridů a fosfolipidů a z esterifikovaných sterolů a karotenoidů. přidávání silné zásady do reakční směsi – nejčastěji KOH

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

EXTRAKCE DLE SOXHLETA  Slouží k získání jedné nebo více látek ze směsi  Izolace analytů z pevné matrice

 Pohodlná a dokonalá metoda  Kontinuální proces – fáze jsou při protiproudém pohybu v neustálém kontaktu

EXTRAKCE DLE SOXHLETA • Princip  Do střední části přístroje se vloží papírová patrona se vzorkem.  Rozpouštědlo ve varné baňce se přivede do varu.  Páry rozpouštědla postranní trubičkou stoupají do chladiče.  Na chladiči kondenzují a kapají do patrony se vzorkem.  Po naplnění přepadové trubičky přeteče roztok zpět do varné baňky, z níž se těkavé rozpouštědlo znovu destiluje.

Patrony skleněné a papírové

Automatický extraktor

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

Zrychlená extrakce rozpouštědlem (PSE, ASE, PLE)  Extrakce pevných matric organickým rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a teploty  ↑ teplota - ↑ rychlost extrakce, ↑ rozpustnost analytu  ↑ tlak – udržuje rozpouštědlo kapalné (teplota je vyšší než bod varu rozpouštědla)  Získá se extrakt, který se dále přečišťuje  Výhody : rychlejší menší spotřeby rozpouštědel srovnatelná výtěžnost jako Soxhlet lepší opakovatelnost

Extrakce za zvýšené teploty a tlaku (PSE, ASE, PLE)

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

EXTRAKČNÍ METODY

1903 – M. S. CVET

Základní pojmy:  mobilní fáze  stacionární fáze, sorbent  chromatografická kolona

EXTRAKCE NA PEVNOU FÁZI – SPE • Metoda založena na rovnovážné distribuci analytu mezi vodnou a tuhou fázi, přičemž rovnováha je posunuta ve prospěch tuhé fáze. • Roztok analytu je přiveden do kontaktu s tuhým aktivovaným sorbentem, který sorbuje analyt a pouze v minimální míře ostatní složky vzorku. Zachycený analyt je následně uvolněn elucí vhodným elučním činidlem a analyticky stanoven

Extrakce na pevné fázi (SPE)

Výhody SPE • Práce s menšími objemy vzorků • Jednoduché provedení • Rychlejší a jednodušší, snížené objemy organických rozpouštědel • Snadné skladování a transport vzorků, automatizace

Stacionární fáze, sorbenty  polární: silikagel, alumina  iontoměniče, SAX, WAX, SCX, WCX  nepolární: modifikované, navázaná fáze např. C18

EXTRAKČNÍ METODY promytí

kondicionace

nanesení vzorku

eluce

odpaření, rozpuštění GC

zakoncentrování, LC

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

Další typy extrakcí:  Superkritická fluidní extrakce SFE, kapalný CO2 + modifokátory, extrakce lipofilních látek

• Semipermeabilní membrány  Matrix solid phase dispersion – MSPD  Extrakce na mikrovlákno – SPME, head space, GC  Stiirr bar, extrakce na polysiloxanovou vrstvou modifikované míchadélko, extrakce z roztoků  Extrakce na disperzní fázi QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), následovaná disperzivní SPE, d-SPE

QuEChERS  Quick

 Easy  Cheap  Effective  Rugged  Safe • účinná metoda pro kompletní analýzu potravin a přírodních

produktů • vysoká výtěžnost • přesné výsledky • nízká spotřeba rozpouštědel a laboratorního skla • jednoduchá a přesto robustní

PROVEDENÍ QuEChERS 1.Rozpuštění vzorku - acetonitril (1 g vzorku = 1 ml ACN) 2.Přídavek solí a pufrů – MgSO4 + NaCl nebo octan sodný – vysolení 3.Extrakce – centrifugace, odběr ACN vrstvy

4.Přečištění – primární a sekundární amin – odstranění organických kyselin a polárních pigmentů 5.Filtrace do vialky pro chromatografické stanovení (MS detekce)

QuEChERS vzorek do 50 ml zkumavky AcCN + ISTD, třepat 1 min + pufrovací soli, centrifuga supernatant do d-SPE clean uo zkumavky

třepání, centrifuga

GC/ MS

LC/MS/MS

EXTRAKČNÍ METODY  Úvod,  obecná charakteristika extrakce,  extrakce kapalina – kapalina, LLE,  alkalická hydrolýza,  extrakce dle Soxhleta,  extrakce za zvýšené teploty a tlaku, PLE, ASE, PSE,  extrakce na pevné fázi, SPE,  přehled dalších druhů extrakcí,  čištění extraktu.

Čištění vzorku – clean up Použití uvedených extrakčních technik :  SPE  membrány  extrakce kapalina-kapalina Gelová permeační chromatografie

 rozdělení podle velikosti molekul  odstranění rušivých koextrahovaných složek – tuky a barevné látky, stanovení stopových množství (POPs)