1
ÚVOD
Za uplynulých třicet let došlo v celosvětovém měřítku k nebývalému nárůstu spotřeby léčiv. Tisíce tun farmakologicky aktivních látek jsou každoročně produkovány a používány v humánní, ale i veterinární medicíně, a proto je poslední dobou věnována zvýšená pozornost jejich likvidaci, přítomnosti a potenciálním nepříznivým účinkům v životním prostředí. Značné množství léčiv se totiž dostává do povrchové vody a odtud do celého životního prostředí různými cestami, např. likvidací odpadních vod v průběhu výrobního procesu (farmaceutický průmysl) anebo vypouštěním přečištěné vody z čistíren odpadních vod (domácnosti). V současnosti používané technologie bohužel neumožňují z odpadních vod efektivně odstranit veškeré zbytky léčiv. Některé medikamenty a metabolity navíc vykazují specifickou biologickou aktivitu, která způsobuje problémy při biologickém čištění. Mimoto i lipofilní charakter a obtížná biologická rozložitelnost některých druhů léčiv způsobují, že se zbytky medikamentů vyskytují v tělech vodních živočichů. V poslední době se ale čím dál častěji objevují i informace o přítomnosti některých léčiv v pitné vodě, čímž se tato problematika stává novým ekologickým problémem světa. V podzemních, povrchových a odpadních vodách byl prozatím prokázán obsah více než sta druhů léčivých přípravků. Toto číslo však není konečné, protože představuje jen nepatrný zlomek z přibližně 10.000 různých léčiv, která jsou v současnosti k dispozici jako terapeutické látky, a proto je potřeba se důkladně zabývat jejich analýzou [1-5]. Pro analýzu reziduí léčiv se běžně používají separační techniky ve spojení s citlivou detekcí, zejména se jedná o hmotnostní detekci, která umožňuje stanovení až do úrovně desetin ng/l. Velmi rozšířené je tak stanovení metodou plynové (GC) resp. kapalinové chromatografie (LC) ve spojení s hmotnostním spektrometrem (MS), příp. spektrometry (MS/MS). Dnes jsou léčiva analyzována vesměs metodou LC-MS/MS. Ačkoliv tato metoda poskytuje celkem přesné výsledky a umožňuje analýzu širšího spektra léčiv s větší citlivostí než GC-MS, vysoké náklady na přístrojové vybavení znemožňují její dostupnost. Plynová chromatografie se využívá mnohem častěji, i když je popsáno poměrně málo metod pro rutinní analýzu. V GC na rozdíl od LC dosahujeme daleko lepší citlivosti, avšak často je nutná derivatizace analytů. Kromě samotného analytického dělení je bez ohledu na analytickou koncovku potřeba vzorek prekoncentrovat tak, abychom se zbavili matricových komponent, k čemuž se nejčastěji využívá extrakce kapalinou nebo tuhou fází.
-1-
Tyto techniky jsou však časově náročné a vyžadují složité postupy [1-2, 6]. V České republice se stálé oblíbenosti těší skupina léčiv proti bolesti – analgetika. Analgetika se podle údajů Státního ústavu pro kontrolu léčiv drží za poslední léta na prvním místě v žebříčku nejprodávanějších skupin léčiv. Nejznámější analgetikum ibuprofen se dokonce v letech 2007, 2008 a 2009 stalo třetím nejprodávanějším léčivem v České republice. Velkému objemu distribuce analgetik nahrává i fakt, že jde o léčiva, která jsou k dispozici i bez lékařského předpisu [7]. Diplomová práce se zabývá kvalitativní a kvantitativní analýzou čtyř účinných látek z řady analgetik. Výsledkem práce je pak zavedení nové techniky, která umožňuje detekci ibuprofenu, naproxenu, ketoprofenu a diklofenaku ve vzorcích povrchové vody ve velmi nízkých koncentracích.
-2-
2
TEORETICKÁ ČÁST
2.1
LÉČIVA
Analgetika Analgetika představují rozmanitou skupinu léčiv, která se používají k úlevě od bolesti a dosažení analgesie (=bezbolestnosti). Analgetika účinkují rozdílnými způsoby na periferní a centrální nervový systém. Řadíme mezi ně např. paracetamol a nesteroidní antiflogistika (ibuprofen, naproxen, ketoprofen, diklofenak ad.) [8].
2.1.1
IBUPROFEN Ibuprofen zastaralým anglickým názvem iso-butyl-propanoic-phenolic acid je
nesteroidní antirevmatikum s dobrým analgetickým, protizánětlivým a antipyretickým účinkem. Vyznačuje se velmi dobrou snášenlivostí [9]. Jedná se o volně prodejné léčivo, které je k dispozici ve formě tablet (200, 400, 600 příp. 800 mg), čípků (600 mg) a mastí. Prodává se pod komerčními názvy Brufen, Ibuprofenal, Ibalgin, Dolgit apod. (příloha 4).
2.1.1.1 Chemické a fyzikální vlastnosti Ibuprofen se vyskytuje jako bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je špatně rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v etheru, v methanolu a v dichlormethanu. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a uhličitanů [10].
strukturní vzorec
systematický název
2-[4-(2-methylpropyl)fenyl]propanová kyselina
sumární vzorec
C13 H18 O2
molekulová hmotnost
206,280 g/mol
teplota tání
76 ºC
pKa
4,91 Tab. 1 – Vlastnosti ibuprofenu [10]
-3-
2.1.1.2 Historie Historie ibuprofenu je spjata s doktorem Stewartem Adamsem, který byl v padesátých letech dvacátého století vedoucím vědeckého výzkumu u společnosti Boots Pure Drug Company. Původním úkolem pracovní skupiny Stewarta Adamse bylo nalezení protizánětlivého léku pro pacienty s revmatickou artritidou, nicméně výsledkem byla látka tišící bolesti mnohem silněji než aspirin a s menším množstvím vedlejších účinků. Zajímavostí je, že lék byl testován i na kocovinu. Ibuprofen byl patentován v roce 1961, v roce 1969 byl schválen k léčbě ve Velké Británii a v roce 1974 v USA [9]. Doktoru Adamsovi byla za objev ibuprofenu v roce 1987 udělena dvě významná ocenění, mezi nimiž byl i Řád britského impéria [9].
2.1.1.3 Farmakologické vlastnosti 2.1.1.3.1 Farmakodynamické údaje Ibuprofen působí v nižších dávkách analgeticky a ve vyšších dávkách protizánětlivě, např. dávka okolo 2400 mg denně má protizánětlivý účinek odpovídající účinku 4 g kyseliny acetylsalicylové. Protizánětlivý účinek je dán inhibicí enzymu cyklooxygenázy s následnou inhibicí biosyntézy prostaglandinů. Zánět je zmírňován snížením uvolňování mediátorů zánětu z granulocytů, bazofilů a žírných buněk. Ibuprofen snižuje citlivost cév vůči bradykininu a histaminu, ovlivňuje produkci lymfokinů v T lymfocytech a potlačuje rozšiřování cév. Tlumí též agregaci krevních destiček [11-12].
2.1.1.3.2 Farmakokinetické údaje Po perorálním podání se ibuprofen rychle a dobře vstřebává a vrcholu plazmatické koncentrace při podání nalačno dosahuje již za 45 minut, zatímco při podání s jídlem cca za 1-3 hodiny. Po rektální aplikaci se ibuprofen vstřebává pomaleji, maximální koncentrace v séru je dosaženo až za 2 hodiny po aplikaci. Sérové koncentrace po podání 600 mg ibuprofenu rektálně po 4-6 hodinách po aplikaci odpovídají sérovým koncentracím 400 mg ibuprofenu podaného perorálně [13]. Ibuprofen se z více než 99 % váže na plazmatické proteiny, ale vazba je reverzibilní. Léčivo je intenzivně metabolizováno cytochromy CYP2C8 a CYP2C9 v játrech. Část (R)(-) izomeru je ireverzibilně přeměněna na (S)(+) formu (Obr. 1). Poměrně rychle je vylučován močí, hlavně ve formě metabolitů (Obr. 2) a jejich konjugátů a jen malá část je vylučována
-4-
žlučí do stolice. Biologický poločas má asi 2 hodiny. Při snížení vylučování může dojít ke kumulaci léku v organismu. Exkrece ibuprofenu je ukončena za 24 hodin po podání poslední dávky. Biologická dostupnost je minimálně alterována přítomností stravy. Ibuprofen u žen prochází placentární bariérou a je vylučován do mateřského mléka [10-13].
Obr. 1 – Metabolická inverze ibuprofenu [14]
Obr. 2 – Metabolizace ibuprofenu [15]
-5-
2.1.1.4 Použití v léčebné praxi Ibuprofen se používá k léčbě zánětlivých a degenerativních kloubních chorob, mimokloubního revmatismu a chorob páteře. Jako analgetikum-antipyretikum ho lze využít při horečnatých stavech, nemocech z nachlazení, bolestech hlavy různého původu, bolestech zubů a bolestivé menstruaci [13].
2.1.1.5 Kontraindikace Absolutní
kontraindikace:
Léčiva
na
bázi
ibuprofenu
se
nesmí
užívat
při přecitlivělosti na ibuprofen, při vředech žaludku a dvanáctníku a dále pak při poruchách krvetvorby a krevní srážlivosti [13]. Relativní kontraindikace: O léčbě ibuprofenem by se měli se svým lékařem nebo lékárníkem poradit i pacienti trpící výrůstky v nosní sliznici, zúžením průdušek po kyselině acetylsalicylové a jiných nesteroidních antirevmatikách, otokem hrtanu, patologickým hubnutím a dále těhotné a kojící ženy. Zvýšené opatrnosti je třeba dbát i při těžší poruše ledvin, jater, srdeční funkce a u astmatiků [13].
2.1.1.6 Nežádoucí účinky Nejčastějšími nežádoucími účinky bývají gastrointestinální potíže: nauzea, zvracení, bolesti v nadbřišku, pálení žáhy, průjem, zácpa, nadýmání apod. Vzácně se pak vyskytuje žaludeční nebo dvanáctníkový vřed, krvácení do gastrointestinálního traktu, zánět žaludečních sliznic, změny v jaterních funkcích a zánět slinivky břišní [13]. Vlivem na centrální nervovou soustavu se mohou objevit závratě, bolesti hlavy, neostré vidění a zcela vzácně nespavost, deprese a emoční labilita. Ojediněle se objevují poruchy krvetvorby (neutropenie, agranulocytóza, aplastická nebo hemolytická anémie, trombocytopenie), z kardiovaskulárních poruch edémy, retence tekutin a nepravidelná činnost srdce. U některých jedinců se projevily alergické kožní reakce a ve výjimečných případech i poruchy ledvinových funkcí (intersticiální nefritida nebo nefrotický syndrom) [13].
2.1.1.7 Interakce s jinými léčivy Při současném podávání ibuprofenu s antikoagulancii kumarinového typu dochází k prodloužení protrombinového času. Při současné aplikaci s kyselinou acetylsalicylovou se výrazně snižuje agregace krevních destiček a hladiny protrombinu a fibrinogenu. Fenobarbital
-6-
zrychluje metabolizaci ibuprofenu. Samotný ibuprofen zvyšuje plazmatické hladiny lithia, digoxinu a fenytoinu a je zodpovědný i za zvýšení toxicity metotrexátu a baklofenu. Současným podáním s glukokortikoidy se zvyšuje riziko krvácení do gastrointestinálního traktu. Ibuprofen snižuje urikosurický účinek probenecidu a sulfinpyrazonu a diuretický účinek spironolaktonu. Celkově je možné snížení účinku diuretik (léky na odvodnění) a antihypertonik (léky proti vysokému tlaku) [13].
2.1.1.8 Dávkování Dávkování je v rozsahu 1,2-2,4 g denně podle závažnosti onemocnění a reakce pacienta na léčbu, přičemž by neměla být překročena denní dávka 2,4 g. U zánětlivých forem se pak podávají dávky vyšší. U menstruálních bolestí v podbřišku se podává 400 mg perorálně po 4-6 hodinách. Jako analgetikum se podává 3-4krát denně v dávkách 200-400 mg perorálně. Čípková forma je zvláště vhodná pro pacienty po operaci, pacienty užívající více léků současně a pro podání na noc. Podává se 2-5 čípků denně (účinnost 1 čípku s obsahem 600 mg ibuprofenu přibližně odpovídá účinnosti 1 tablety s obsahem 400 mg) [13]. Pro děti se používají potahované tablety s obsahem 200 mg ibuprofenu. Denně se aplikuje dávka 20 mg/kg tělesné hmotnosti, a to rozděleně v několika dílčích dávkách. U dětí s tělesnou hmotností nižší než 30 kg se nepřekračuje dávka 400 mg denně [13].
2.1.1.9 Výroba Existují dvě základní cesty pro přípravu ibuprofenu a u obou se jako výchozí látka využívá izobutylbenzen [9]. První metoda je starší a k syntéze ibuprofenu ji využil i Stewart Adams v roce 1960. Skládá se ze šesti kroků (Obr. 3).
Obr. 3 – Výroba ibuprofenu (postup I) [9]
-7-
V roce 1997 byla pro přípravu ibuprofenu vyvinuta nová metoda, která je rychlejší a skládá se pouze ze tří kroků (Obr. 4).
Obr. 4 – Výroba ibuprofenu (postup II) [9]
2.1.2
NAPROXEN Naproxen je derivát naftylpropionové kyseliny a svými farmakologickými
vlastnostmi je velmi podobný ibuprofenu. Naproxen je nesteroidní antirevmatikum a antiflogistikum s výraznými antipyretickými, analgetickými a protizánětlivými účinky [13]. Je k dispozici ve volném prodeji především ve formě tablet (220, 250, 275 mg) a čípků (250, 500 mg), ale také jako gel nebo mast. Prodává se pod komerčními názvy Nalgesin, Napsyn, Emoxen gel apod. (příloha 5).
2.1.2.1 Chemické a fyzikální vlastnosti Naproxen se vyskytuje jako bílý nebo téměř bílý krystalický prášek, který je špatně rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v ethanolu a methanolu a mírně rozpustný v etheru. Naproxen je v současnosti jediné nesteroidní protizánětlivé léčivo, které se prodává pouze jako jeden izomer [10-11].
strukturní vzorec systematický název
2-(6-methoxynaftalen-2-yl)propanová kyselina
sumární vzorec
C14 H14 O3
molekulová hmotnost
230,259 g/mol
teplota tání
153 ºC
pKa
4,15 Tab. 2 – Vlastnosti naproxenu [10]
-8-
2.1.2.2 Farmakologické vlastnosti Protizánětlivé
účinky
naproxenu
jsou
způsobeny
inhibicí
cyklooxygenázy
a následným tlumením syntézy prostaglandinů a dalších mediátorů zánětu [11,13]. Maximální plazmatické koncentrace nastupují za 2-4 hodiny po podání. Naproxen se výrazně váže na plazmatické bílkoviny (99 %). Přibližně 95 % podané dávky se vylučuje, z toho asi 70 % v nezměněné podobě a zbývající část jako inaktivní 6-desmethylnaproxen a jeho konjugáty (Obr. 5). Zajímavostí je, že volná frakce naproxenu je o 41 % vyšší u žen než u mužů, ačkoliv vazba na albumin je velmi vysoká u obou pohlaví. Léčivo je intenzivně metabolizováno cytochromy CYP2C9, ale také CYP1A2 a CYP2C8. Poločas termální eliminační fáze je přibližně 12-15 hodin [11,13].
Obr. 5 – Metabolizace naproxenu [16] 2.1.2.3 Použití v léčebné praxi Přípravek se používá u zánětlivých a degenerativních revmatických onemocnění: revmatoidní artritida, ankylozující spondylitida (Bechtěrevova nemoc), osteoartróza, spondylóza (vyhřezlé plotýnky), mimokloubní revmatismus, posttraumatické a pooperační otoky a záněty a zánětlivá onemocnění v gynekologii [13].
2.1.2.4 Kontraindikace Naproxen se nesmí užívat při aktivních žaludečních vředech, přecitlivělosti na účinnou látku a při nesnášenlivosti kyseliny acetylsalicylové a jiných nesteroidních antirevmatik. Naproxen je kontraindikován v těhotenství a v období laktace.
-9-
Zvýšené opatrnosti by se mělo dbát u nemocných s postižením trávicího ústrojí v anamnéze, při závažnějším poškození jater, ledvin, srdce a při poruchách krvetvorby a hemokoagulace [13].
2.1.2.5 Nežádoucí účinky Relativně častými nežádoucími účinky bývají gastrointestinální potíže (nauzea, pálení žáhy, bolesti v nadbřišku aj.). Méně často se vyskytují bolesti hlavy, poruchy soustředění,
nespavost,
trombocytopenie
(nedostatek
krevních
destiček),
erythema
exsudativum multiforme (kožní onemocnění) a jiné kožní reakce, fotosenzibilace a gastrointestinální tvoření vředů [13].
2.1.2.6 Interakce s jinými léčivy Naproxen je zodpovědný za možnost vzniku interakcí v oblasti vazby na krevní bílkoviny. Současné podání s probenecidem zvyšuje celkovou koncentraci naproxenu. Naproxen snižuje natriuretické působení furosemidu, antihypertenzivní působení propranololu a jiných β-blokátorů. Snižuje se též vylučování lithia a metotrexátu [13]. Podávání
léčiva
může
interferovat
s určováním
17-ketosteroidů
a 5-hydroxyindoloctové kyseliny [13].
2.1.2.7 Dávkování Počáteční dávkování u akutních stavů je 1 g/den a později se dávka upravuje na hodnotu 500 mg/den, a to rozděleně do dávek. Vyšší dávkování se používá zejména u akutního záchvatu dny a u poúrazových stavů. U dětí nad jeden rok věku se u revmatoidní artritidy podává dávka 10 mg/kg/den, a to odděleně ve dvou dávkách. Při poklesu glomerulární filtrace pod 20 ml/min je možné pouze krátkodobé podávání [13].
2.1.2.8 Výroba Průmyslová výroba naproxenu se skládá z pěti kroků a jako výchozí látka se používá 2-naftol (Obr. 6) [17].
- 10 -
Obr. 6 – Výroba naproxenu [17] 2.1.3
KETOPROFEN Ketoprofen je stejně jako ibuprofen a naproxen derivát propionové kyseliny a má
i podobné vlastnosti. Ketoprofen je nesteroidní antirevmatikum a antiflogistikum s protizánětlivým, analgetickým a antipyretickým účinkem [13]. V podobě mastí a gelů je k dispozici ve volném prodeji, ale ve formě tablet (50, 100 mg), kapslí (50, 100 mg), čípků (100 mg) a injekcí (100 mg) je vázán na lékařský předpis. Prodává se pod komerčními názvy Ketonal, Profenid, Diractin, Fastum gel aj. (příloha 6). 2.1.3.1 Chemické a fyzikální vlastnosti Ketoprofen se vyskytuje jako bílý nebo téměř bílý krystalický prášek, který je špatně rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v ethanolu a v dichlormethanu [10].
strukturní vzorec
systematický název
2-(3-benzoylfenyl)propanová kyselina
sumární vzorec molekulová hmotnost
C16 H14 O3 254,281 g/mol
teplota tání
94 ºC
pKa
4,45 Tab. 3 – Vlastnosti ketoprofenu [10]
- 11 -
2.1.3.2 Farmakologické vlastnosti Ketoprofen ovlivňuje vasomotorické (průtok krve cévami) a exsudativní (únik tekutin a bílkovin) projevy zánětu. Jeho protizánětlivý účinek je dán inhibicí enzymů cyklooxygenázy a lipoxygenázy s následnou inhibicí syntézy prostaglandinů a jiných mediátorů zánětu. Ketoprofen se úplně metabolizuje v játrech, především na glukuronid, který podléhá reaktivaci a opětovně prochází játry [11,13]. Po perorální aplikaci jsou maximální plazmatické koncentrace dosaženy za 60-120 minut. Ketoprofen se z velké části váže na krevní bílkoviny (99 %). Při distribuci vstupuje též do synoviální tekutiny (tekutina obklopující klouby), kde hladiny léčiva přetrvávají déle než 4 hodiny po podání. Střední plazmatický poločas je 1,5-2 hodiny. Méně než 1 % podané látky se vylučuje v nezměněné podobě močí, 65-75 % jako glukuronáty [13]. Metabolizace ketoprofenu zjednodušeně probíhá podle obr. 7.
Obr. 7 – Metabolizace ketoprofenu [18] 2.1.3.3 Použití v léčebné praxi Přípravek je indikován u chronických a degenerativních onemocnění pohybového ústrojí, zejména u revmatoidní artritidy, ankylozující spondylitidy (Bechtěrevova nemoc) a u dekompenzované osteoartrózy. Indikací jsou též projevy mimokloubního revmatismu, drobné poúrazové a pooperační stavy, dnavý záchvat, bolest v nadbřišku při menstruaci (primární dysmenorea) a bolesti nádorového původu [13].
- 12 -
2.1.3.4 Kontraindikace Absolutní kontraindikace: Ketoprofen se nesmí užívat při gastroduodenálních vředech i v anamnéze a přecitlivělosti na ketoprofen. Nesmí být podáván rovněž pacientům do 16 let, těhotným ženám a při laktaci [13]. Relativní kontraindikace: Léčbu ketoprofenem by měli nejprve se svým lékařem nebo lékárníkem konzultovat pacienti trpící bronchiálním astmatem, alergickými reakcemi na kyselinu acetylsalicylovou a jiná nesteroidní antirevmatika, srdeční, ledvinovou a jaterní slabostí. Užívání léčiva není doporučováno ani lidem, kteří prochází antikoagulační terapií nebo trpí těžšími formami hypertenze [13].
2.1.3.5 Nežádoucí účinky Nejčastějšími nežádoucími účinky bývají gastrointestinální potíže, např. chronické bolesti břicha (dyspepsie), nauzea, zvracení, bolesti v nadbřišku, anorexie, pálení žáhy, průjem nebo zácpa. Vzácněji se objevují: zhoršení nemoci, vředové choroby, krvácení do gastrointestinálního traktu, perforace, bolesti hlavy, ospalost, závratě a kožní vyrážky [13].
2.1.3.6 Interakce s jinými léčivy Ketoprofen může snižovat účinek některých diuretik a antihypersenzitivních látek. Možné jsou též interakce v oblasti vazby na perorální antikoagulancia, antidiabetika a fenytoin. Přípravek snižuje plazmatickou koncentraci lithia. Probenecid snižuje ledvinovou eliminaci ketoprofenu [13]. Přípravek může vyvolat ospalost či závratě a tím nepříznivě ovlivnit činnosti vyžadující zvýšenou pozornost [13].
2.1.3.7 Dávkování Dospělým se podává obvykle 200 mg ketoprofenu denně, a to po 100 mg ve dvou denních dávkách ráno a večer. U velmi bolestivých stavů se denní dávky zvyšují na 300 mg a podávají se rozděleně ve třech dílčích dávkách. U osob ve vyšším věku je však potřeba denní dávky redukovat [13].
- 13 -
2.1.4
DIKLOFENAK Diklofenak je derivát fenyloctové kyseliny a svým účinkem a strukturou je podobný
flurbiprofenu
a
meklofenamátu.
Diklofenak
je
nesteroidní
antirevmatikum,
které
má protizánětlivé, antipyretické, antiflogistické a analgetické účinky [11, 13]. Je k dispozici ve volném prodeji především ve formě tablet (25 mg) a různých gelů nebo mastí. Tablety s vyšším množstvím účinné látky (50, 75, 100, 150 mg), čípky a injekce jsou však vázány na lékařský předpis. Prodává se pod komerčními názvy Diclofen, Diclofenacal, Dicloreum, Dolmina, Monoflam, Veral, Voltaren emulgel apod. (příloha 7).
2.1.4.1 Chemické a fyzikální vlastnosti Diklofenak se nejčastěji vyskytuje jako sodná sůl, a pak se jedná o bílý nebo slabě nažloutlý krystalický prášek, který je slabě hygroskopický. Diklofenak je mírně rozpustný ve vodě, snadno v methanolu, dobře rozpustný v ethanolu, ale těžce se rozpouští v acetonu a v etheru je prakticky nerozpustný [10].
strukturní vzorec
systematický název
2-[2-(2,6-dichlorofenylamino)fenyl]octová kyselina
sumární vzorec
C14 H11 Cl2 N O2
molekulová hmotnost
296,148 g/mol
teplota tání
284 ºC Tab. 4 – Vlastnosti diklofenaku [10]
2.1.4.2 Farmakologické vlastnosti Diklofenak je silným neselektivním inhibitorem cyklooxygenázy, čímž se snižuje biosyntéza prostaglandinů a dalších mediátorů zánětu [11,13]. Po perorálním podání se diklofenak rychle absorbuje, ale jeho systémová biologická dostupnost je jen 30-70 % díky metabolismu po prvém průchodu játry. Diklofenak se výrazně váže
na
plazmatické
bílkoviny
(99,7
%).
- 14 -
Maximální
plazmatické
koncentrace
nastupují za 2 hodiny po podání a po dalších 2-4 hodinách je dosaženo maximální koncentrace v synoviální tekutině. Léčivo je intenzivně metabolizováno cytochromy CYP3A4 a CYP2C9. Okolo 60 % podané dávky se vylučuje ledvinami ve formě metabolitů (Obr. 8). Plazmatický eliminační poločas je přibližně 1-2 hodiny [11,13,19].
Obr. 8 – Metabolizace diklofenaku [19]
2.1.4.3 Použití v léčebné praxi Přípravek se používá u zánětlivých a degenerativních revmatických onemocnění: revmatoidní artritida, ankylozující spondylitida, osteoartróza, spondylóza, mimokloubní revmatismus, akutní dna, posttraumatické a pooperační otoky a záněty, bolestivá a zánětlivá onemocnění v gynekologii, např. dysmenorea a adnexitis (zánět vejcovodů a vaječníků) [13].
- 15 -
2.1.4.4 Kontraindikace Diklofenak je zakázáno užívat při aktivních vředech žaludku a dvanáctníku, přecitlivělosti na účinnou látku a při nesnášenlivosti kyseliny acetylsalicylové a jiných nesteroidních antirevmatik. Diklofenak je kontraindikován v těhotenství a v období laktace. Zvýšené opatrnosti by měli dbát pacienti s postižením trávicího ústrojí v anamnéze, se závažnějším postižením jater, ledvin, srdce a při poruchách krvetvorby a hemokoagulace [13].
2.1.4.5 Nežádoucí účinky Relativně častými nežádoucími účinky bývají gastrointestinální potíže (nauzea, pálení žáhy, bolesti v nadbřišku aj.). Vzácně se vyskytují bolesti hlavy, poruchy soustředění, nespavost, trombocytopenie, kožní reakce a gastrointestinální vředovatění [13].
2.1.4.6 Interakce s jinými léčivy U diklofenaku je vysoká pravděpodobnost vzniku interakcí v oblasti vazby na krevní bílkoviny. Současné podání diklofenaku s lithiem nebo digoxinem zvyšuje jejich sérovou koncentraci. Diklofenak může snížit účinnost současně podávaných diuretik [13].
2.1.4.7 Dávkování Počáteční dávkování u dospělých je 100-150 mg denně, ale u méně závažných stavů obvykle postačuje 75-100 mg/den, přičemž denní dávka se vždy dělí do 2-3 dílčích dávek. V léčbě primární dysmenorey je počáteční dávka 50-100 mg a podle terapeutické účinnosti se zvyšuje až na 200 mg za den. U dětí nad jeden rok věku se podává 0,2-2 mg/kg/den. Při léčení chronické artritidy je maximální možná denní dávka 3 mg/kg rozdělená do 2-3 dílčích dávek [13].
2.2 2.2.1
ZNEČIŠTĚNÍ POVRCHOVÝCH VOD LÉČIVY Příčiny Existuje několik cest, jejichž prostřednictvím do povrchových vod vstupují
farmakologicky aktivní látky. Jenom dvě z těchto cest jsou ale natolik významné, že vyvolávají problémy v životním prostředí.
- 16 -
Jednou z příčin kontaminace povrchových vod je nadměrné užívání léčiv. Za posledních 20-30 let došlo nejen v České republice, ale i v celém světě k prudkému nárůstu spotřeby léčiv (Graf 1).
Graf 1 – Výdaje na léčiva v ČR v letech 1991-2002 [20]
Lidé se stávají na léčivech de facto psychicky i fyzicky závislí, čímž umocňují dávno známou skutečnost, že lidský organismus není schopen plně využít veškeré množství podaného léčiva. Dochází k tomu, že určitá část medikamentu je z těla vyloučena přirozenou cestou v nezměněné podobě. Zbytky léčiv včetně metabolitů se tak dostávají na čistírny odpadních vod, skrze ně prostupují do vod povrchových a odtud do celého životního prostředí. V současnosti používaná technologie pro čištění odpadních vod totiž není na takový druh znečištění uzpůsobena, i když je schopna snížit relativně vysoké koncentrace léčiv a některé dokonce úplně eliminovat [21]. Dalším neméně důležitým zdrojem znečištění je farmaceutický průmysl, jehož činnost bezprostředně souvisí se spotřebou léčiv. Ve výrobě léčiv vznikají odpadní vody, které jsou daleko bohatěji zamořeny než běžné splaškové vody. Odpadní voda farmaceutického průmyslu podstupuje speciální očistu na průmyslových čistírnách odpadních vod. I když je tento typ čistíren vybaven špičkovou technologií, nelze zabránit tomu, že část účinných látek proniká do povrchových vod.
- 17 -
2.2.2
Důsledky Léčiva jsou v povrchových vodách přítomna ve velmi nízkých koncentracích,
řádově se jedná o ng/l – µg/l. Vzhledem k nízkým koncentracím účinných látek je prakticky vyloučena jakákoliv akutní toxicita. Problémy ale způsobuje jejich chronická toxicita, které je nepřetržitě vystavena zejména vodní fauna a flora. Chronickému působení stopových množství léčiv mohou načas unikat migrující živočišné druhy (např. úhoř, parma…), kterých je však minimum. Nemožnost jakékoliv migrace a pravidelný přísun reziduí léčiv způsobují, že se v tělech živočichů a rostlin hromadí účinné látky medikamentů [22]. Celá řada vědeckých studií prokázala neblahý vliv léčiv na přírodní prostředí. Vědci bylo prokázáno, že stopová množství psycholeptik a antiepileptik vyvolávají změny v chování ryb a některých bezobratlých. Analgetika a antibiotika zase ovlivňují růst vodních řas a rostlin [22-23].
Analgetika Vědecké studie potvrzují, že v tělech ryb je přítomna cyklooxygenáza, jež se vyskytuje i v lidském těle. Její inhibicí nesteroidními antiflogistiky dochází k inhibici biosyntézy prostaglandinů z kyseliny arachidonové, což vede k protizánětlivým účinkům. Prostaglandiny hrají také důležitou roli při syntéze vaječných skořápek u ptáků a inhibice jejich syntézy má za následek ztenčení skořápek [24]. Z nesteroidních antiflogistik vykazuje nejvyšší ekotoxikologické riziko v tomto ohledu diklofenak, který vyvolává chronickou intoxikaci u pstruhů, jež jsou potravou větších ptáků. Diklofenak u pstruha obecného (Obr. 9a) snižuje hodnoty hematokritu (množství červených krvinek) už při velmi nízkých koncentracích okolo 0,5 µg/l. Při koncentracích přibližně 5 µg/l dochází k vážnému poškození jater a ledvin pstruha duhového (Obr. 9b). Diklofenak se vyznačuje i významnou fytotoxicitou, protože inhibuje rozmnožování sladkovodních a mořských řas [24].
a) pstruh obecný (Salmo trutta fario)
b) pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss)
Obr. 9 – Živočichové citliví na diklofenak
- 18 -
Chronická toxicita byla prokázána i u nejpopulárnějšího analgetika ibuprofenu. Ibuprofen způsobuje u ryby halančíka japonského (Obr. 10a) zvětšení jater a zvýšenou produkci jiker. Ibuprofen ovlivňuje i chování a reprodukci vodních korýšů hrotnatky velké (Obr. 10b) a blešivce obecného (Obr. 10c), kteří jsou na jeho přítomnost citliví již při koncentracích mezi 1-10 ng/l.
a) halančík japonský (oryzias latipes)
b) hrotnatka velká (daphnia magna)
c) blešivec obecný (gammarus pulex)
Obr. 10 – Živočichové citliví na ibuprofen Z fytologického hlediska ibuprofen stimuluje růst cyanobakterií ve vodním prostředí a zároveň brání rostlinnému růstu okřehku menšího (Obr. 11) [24].
okřehek menší (lemna minor) Obr. 11 – Rostlina citlivá na ibuprofen Ekotoxicita naproxenu byla testována na nižších organismech. Laboratorní testy na vířnících (Brachionus calyciflorus, Ceriodaphnia dubia) a sladkovodních korýších (Thamnocephalus platyurus) prokázaly akutní toxicitu v rozsahu koncentrací 1-100 mg/l. Při nižších koncentracích 62 µg/l byla zjištěna inhibice růstu vířníků Ceriodaphnia dubia [24]. Kontaminace pitné vody Stopy léčiv se vlivem koloběhu vody v přírodě vyskytly už i v pitné vodě. Prozatím byla přítomnost medikamentů prokázána ve vodovodních sítích jen v USA, Evropě se tento jev podle současných vědeckých studií zatím vyhýbá. Zbytky léčiv ve vodovodním řadu byly
- 19 -
zaznamenány nejen ve velkých městech, jako je Los Angeles nebo New York, ale úplně ve všech 50 státech unie. Ve vodovodních sítích se vyskytla léčiva na snížení hladiny cholesterolu, léky proti bolesti, astmatu, epilepsii, infekci včetně antibiotik, léky na srdce a duševní nemoci [25-26]. Pro množství léků v pitné vodě neexistují žádné normy. Jen 28 z 62 největších vodárenských společností testuje jejich přítomnost, většinou však jen na jedno nebo dvě léčiva [26]. Odborná veřejnost se obává dlouhodobých následků užívání stopových koncentrací léčiv, protože hrozí, že například antibiotika ztratí svou účinnost. Už nyní se objevují kmeny tuberkulózy odolné vůči antibiotikům [26].
2.2.3
Opatření Voda se stává jakýmsi mediem přenosu zbytků léčiv od pacienta k jednotlivým
složkám životního prostředí. Rezidua léčiv ve složkách životního prostředí svoji pouť nekončí, ale vrací se zpět k lidem prostřednictvím potravy a pitné vody. Koloběhu léčiv v přírodě (Schéma 1) je potřeba účinně bránit, protože stopové koncentrace medikamentů představují potenciální riziko pro člověka.
Schéma 1 – Koloběh léčiv v životním prostředí [27]
- 20 -
Abychom ochránili svoje zdraví a zároveň zamezili vstupu léčiv do životního prostředí je potřeba věnovat zvláštní péči úpravě pitné vody, ale i důkladnému čištění odpadní vody. Pro eliminaci léčiv z povrchových vod se nejčastěji využívá:
1) Biologické odbourání Nejlepším způsobem pro odstranění léčiv z odpadních vod je kvalitní biodegradační proces. Biologické odbourání léčiv v bioreaktoru pomocí aktivovaného kalu je oproti ostatním používaným technologiím daleko účinnější, ačkoliv i zde existují léčiva, která jsou vůči biodegradaci rezistentní, např. diklofenak [28-29].
2) Adsorpce Tato metoda čištění vody je založena zejména na schopnosti léčiv adsorbovat se na aktivním uhlí. Voda kontaminovaná léčivy je za pomoci elektrického čerpadla proháněna přes filtry obsahující aktivní uhlí. Na uhlíkových filtrech dochází k adsorpci organických látek (léčiv), čímž je voda čištěna. Metoda využívá fyzikálně-chemických procesů [30-31]. K adsorpci může docházet i v souvislosti s aktivovaným kalem, na který se zachytávají hydrofobní látky. Problém vzniká v případě hydrofilních léčiv, jejichž eliminace touto metodou je prakticky vyloučena [28].
3) Fotodegradace Fotodegradace je metodou samovolného čištění vody v přírodě, ale lze ji realizovat i uměle. Účinkem ultrafialového a viditelného záření za přítomnosti TiO2 jako katalyzátoru dochází k rozkladu molekuly léčiva a tím i ke ztrátě jeho specifických vlastností. Odstraňování léčiv účinkem slunečního záření je velmi účinné v případě ketoprofenu a diklofenaku [21, 27, 32].
4) Ozonizace a oxidační procesy Ozonizace a oxidační procesy (např. Cl2 nebo H2O2) se používají většinou k úpravě pitné vody za účelem odstranění choroboplodných zárodků, ale lze je využít i k odstranění léčiv. Aktivní molekula ozonu je schopná okamžitě rozložit molekulu léčiva. Nevýhodou této metody čistění je, že dochází k vedlejšímu vlivu – okysličování vody [31].
- 21 -
5) Srážení Odstranění medikamentů z vody metodou srážení bývá u některých druhů léčiv značně problematické a málo účinné [31, 33]. Nicméně lze využít této metody k separaci léčiva tvořícího sraženinu se srážecím činidlem (např. léčiva obsahující Ca, Mg nebo fosfáty se dobře sráží roztokem NaHCO3) [34]. 6) Laboratorní metody Velmi dobrých výsledků odstranění léčiv bylo dosaženo metodami reverzní osmózy a nanofiltrace [33]. Bohužel jsou tyto metody v průmyslovém měřítku jen velmi těžko realizovatelné.
2.3 2.3.1
STOPOVÁ ANALÝZA LÉČIV ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKU K ANALÝZE Koncentrace léčiv v povrchových vodách jsou velmi nízké (ng/l – µg/l), a proto je
nutné odebírat relativně velké objemy vzorku, které se následně zkoncentrují. Před samotným zkoncentrováním vzorku se ale provádí další dílčí kroky, jejichž úkolem je zejména odebraný vzorek zbavit hrubých nečistot a rozpuštěných plynů. Před konečnou analýzou vzorku je potřeba provést několik nezbytných operací: 1) Odběr vzorku 2) Filtrace vzorku 3) Extrakce vzorku 4) Derivatizace vzorku
2.3.1.1 Odběr vzorku Vzorky povrchové vody se odebírají do vzorkovnic z nereaktivního materiálu (např. sklo, PE, PTFE…). Vzorkovnice musí být čisté a je-li to nutné, měly by obsahovat i malé množství kyseliny kvůli konzervaci vzorku. Vzorkování se provádí v přiměřené vzdálenosti od břehu a ideálně v hloubce asi 25 cm pod vodní hladinou. Objem vzorku pro stopovou analýzu bývá 500 ml nebo 1 l. Po odebrání vzorku se vzorkovnice uzavře takovým způsobem, aby se v ní neobjevila vzduchová bublina. Vzorkovnice se pak uloží do chladící přepravky s teplotou okolo 4ºC a je transportována do laboratoře, kde by se měl vzorek do 24 hodin zpracovat.
- 22 -
2.3.1.2 Filtrace vzorku Odebraný vzorek povrchové vody zpravidla obsahuje drobné nerozpustné částice, které je potřeba odstranit, zejména bude-li následně využita extrakce tuhou fází. Pro separaci pevných nečistot se používá klasická filtrace. Filtruje se buď přes běžné celulosové nebo speciální filtry ze skelných vláken s průměrem pórů 0,45 nebo 0,75 µm. Pokud to vyžadují okolnosti,
lze
filtry
před
samotnou
filtrací
proprat
v organickém
rozpouštědle
(hexan, diethylether, methanol…), které bude použito k extrakci [35-36].
2.3.1.3 Extrakce vzorku Po odstranění hrubých nečistot ze vzorku obvykle následuje izolace sledovaných analytů. Jednou z nejběžnějších metod izolace je extrakce, která poskytuje celou řadu možností. Při extrakci přechází složka ze směsi látek v kapalné nebo tuhé fázi do jiné kapalné nebo tuhé fáze, přičemž je splněna podmínka vzájemné nemísitelnosti obou fází. Vhodnou volbou extrakčních podmínek a znalostí vedlejších rovnovah lze docílit dobré selektivity separace. Podle charakteru analyzované látky se například volí vhodné pH anebo typ rozpouštědla. Extrakce hraje významnou roli také v souvislosti se separací léčiv ze vzorků povrchových vod, kde se nejčastěji využívá extrakce kapalinou nebo tuhou fází.
Extrakce kapalinou Extrakce z kapaliny do kapaliny je nejstarší formou izolace organických látek z vody. Jedná se o velmi jednoduchou izolační techniku, která nevyžaduje složité postupy ani nákladnou instrumentaci. Sledovaná složka spolu s ostatními látkami přechází z vody do organického rozpouštědla, ve kterém je více rozpustná. Podmínkou však zůstává ustavení fázové rovnováhy mezi dvěma nemísitelnými kapalinami [37].
Extrakce tuhou fází (SPE) Extrakce tuhou fází je moderní technika pro přípravu vzorků, jejíž podstatou je zachycení molekul sledované látky na tuhém sorbentu. Sorbent bývá zpravidla umístěn v umělohmotné kolonce, přes kterou se nechává protékat roztok vzorku. Vhodnou volbou sorbentu a rozpouštědel lze docílit i toho, že na sorbentu se zachytí pouze sledované analyty, které se posléze jenom vymyjí elučním činidlem (Obr. 12).
- 23 -
Obr. 12 – Extrakce tuhou fází [38]
Sorbentem zpravidla bývá chemicky modifikovaný silikagel ve formě drobných částeček (Ø = 50 µm), na které se navazují skupiny různých vlastností, které pak rozhodují o vlastnostech sorbentu [37]. Pro izolaci léčiv se nejvíce používají nepolární vázané fáze a iontově-výměnné fáze. Použití fází na bázi imunoafinitních sorbentů a „molekulárních otisků“ (molecular imprinting) bývá zcela výjimečné.
Nepolární vázané fáze Mají hydrofobní vlastnosti a používají se pro extrakci nepolárních a středně polárních sloučenin. Jedná se v podstatě o první teoretické patro kapalinové chromatografie na reverzní fázi, kdy jako funkční skupinu zakotvenou na stacionární fázi používáme např. oktadecyl (kolonky C18) či oktyl (kolonky C8) a mobilní fází je voda [37-39]. Iontově-výměnné vázané fáze Příkladem
je
trimethylamoniumpropyl-chloridová
fáze,
která
je
silným
iontoměničem pro výměnu aniontů (anex) z vodných i nevodných roztoků náhradou za svůj chloridový anion. Dalšími iontově-výměnnými fázemi mohou být zmíněná aminopropylová, benzensulfonová nebo propansulfonová [37].
- 24 -
I když extrakce tuhou fází má oproti klasické extrakci kapalinou řadu pozitiv, je v některých
situacích
výhodnější
využít
extrakce
kapalinou.
Extrakce
v systému
kapalina – kapalina totiž poskytuje lepší návratnost, která je v případě stopové analýzy nepostradatelná. Na úkor času tak lze dosáhnout lepších detekčních limitů a přitom ještě ušetřit za SPE kolonky.
2.3.1.4 Derivatizace vzorku Derivatizace je proces, při kterém se převádí analyty ve vzorku na vhodné deriváty pomocí derivatizačního činidla. Proces derivatizace slouží zejména k: •
zvýšení citlivosti a zlepšení detekce [40]
•
zvýšení rozlišení a zlepšení separace (zvýšení těkavosti, snížení polarity) [39-40]
•
zamezení nežádoucí sorpce v koloně [40]
Samotná derivatizace však není nezbytnou součástí postupu chemické analýzy a lze ji v některých případech vypustit. Za těchto podmínek je ale nutné počítat se zhoršením limitů detekce příslušné metody koncového stanovení. Derivatizace se nevyužívá například při stanovení léčiv metodou kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovými hmotnostními spektrometry (HPLC-MS/MS), kde se právě díky tandemovému uspořádání MS/MS dosahuje i tak dobrých detekčních limitů. Naproti tomu při analýze metodou plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (GC-MS) je derivatizace obvykle nezbytným krokem, bez něhož by stanovení extrémně nízkých koncentrací léčiv bylo nemyslitelné. K derivatizaci léčiv, která jsou následně stanovována metodou GC-MS, se využívají zejména tato derivatizační činidla:
N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (BSTFA) [2]
N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) [2]
N-terc-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid (MTBSTFA) [2]
pentafluorbenzylbromid [41-42]
diazomethan [43]
methanol / BF3 [35]
hydrogensíran tetrabutylamonia [39]
- 25 -
Negativní stránkou derivatizace je její pracnost, časová náročnost a možný vznik vedlejších derivatizačních produktů. Mezi nevýhody patří i nebezpečné vlastnosti většiny derivatizačních činidel, protože mnohá z nich jsou explozivní, jedovatá či karcinogenní [39, 44].
2.3.2
ANALÝZA VZORKU Při stopové analýze medikamentů se v drtivé většině případů využívá jako analytická
koncovka separační metoda ve spojení s hmotnostní detekcí. V analýze reálných vzorků je tak nejčastěji využíváno metody GC-MS nebo HPLC-MS, případně tandemového uspořádání GC-MS/MS resp. HPLC-MS/MS. Pro léčiva iontové povahy je zvlášť výhodná separace pomocí kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí (CE-MS). Bohužel její aplikace na reálné vzorky bývá většinou limitována matricovými efekty vzorku. Mimo dosud uvedených metod analýz byla v souvislosti se stanovením léčiv v životním prostředí realizována i online spojení kapalinové
chromatografie
se
spektrometrickým
(HPLC-DAD)
a
fluorescenčním
(HPLC-FLD) detektorem nebo offline spojení s nukleární magnetickou rezonancí (HPLC-NMR) [17, 45-46].
2.3.2.1 Plynová chromatografie – hmotnostní spektrometrie (GC-MS) GC-MS je metoda, která kombinuje vlastnosti plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Spojení GC-MS se používá k analýze léčiv, drog, výbušnin, životního prostředí, vyšetřování příčin požárů a k identifikaci neznámých vzorků. GC-MS je součástí bezpečnostních kontrol na letištích, soudech apod. Hlavní výhodou tohoto zapojení je však možnost stopové analýzy [47]. GC-MS je standardní metodou ve forenzní analýze, kde slouží k provádění specifických testů, které jednoznačně identifikují přítomnost určitých látek v daném vzorku. Nespecifické testy totiž pouze naznačují, že daná látka může být ve vzorku přítomna, protože spadá do určité kategorie, což může vést k její falešné pozitivní identifikaci [47].
- 26 -
2.3.2.1.1 Historie Použití hmotnostního spektrometru jako detektoru v plynové chromatografii bylo vyvinuto v průběhu roku 1950 Rolandem Gohlkem a Fredem McLaffertym. První realizované GC-MS představovalo objemné zařízení, které bylo nesmírně citlivé na laboratorní podmínky. Vývoj cenově dostupných, miniaturizovaných a výkonných počítačů umožnil zjednodušení této techniky a zkrácení celkové doby analýzy. V roce 1996 se na trhu objevila generace vysokorychlostních GC-MS, která umožnila zkrácení doby analýzy hořlavin z 16 minut na pouhých 90 sekund. Zkrácení doby analýzy vedlo k širokému uplatnění GC-MS nejen v laboratoři, ale i v terénu [47].
2.3.2.1.2 Instrumentace GC-MS se skládá z plynového chromatografu (GC) a hmotnostního spektrometru (MS). Tyto dva přístroje se používají dohromady, protože poskytují daleko lepší výsledky, než kdyby se využívaly samostatně. Kromě toho přesná identifikace určité molekuly pouze GC nebo pouze MS by nebyla dostatečná. Plynový chromatograf využívá k separaci látek kapilární kolonu, která bývá charakterizována svými rozměry (délka, průměr, tloušťka filmu) a typem stacionární fáze (např. nepolární HP 5). V chromatografické koloně dochází k separaci složek vzorku na základě jejich různé schopnosti poutat se ke stacionární fázi. Složky vzorku potom opouští kolonu v různém čase (retenční čas) a přechází z plynového chromatografu do hmotnostního spektrometru, který umožňuje jejich detekci. V hmotnostním spektrometru dochází k ionizaci molekul, jejich fragmentaci a akceleraci. Jednotlivé fragmenty jsou potom hmotnostním analyzátorem (např. kvadrupól) separovány a samostatně detekovány. Fragmenty molekuly jsou od sebe oddělovány podle poměru m/z (hmotnost/náboj), odtud název hmotnostní spektrometrie [47]. Velkou předností hmotnostního detektoru je jeho výborná citlivost a možnost rozeznat případnou koeluci dvou či více složek. Pomocí výsledného chromatogramu a hmotnostních spekter lze tak jednoduše zjistit, zda ke koeluci dochází či nikoliv. V případě GC-MS je totiž velmi nepravděpodobné, že by koeluvaly dvě látky, které by navíc i stejně fragmentovaly. Kvalitativními charakteristikami v GC-MS tak jsou retenční čas a hmotnostní spektrum. Ke kvantifikaci se pak využívá plocha píku resp. jeho výška, pokud pík nevykazuje asymetrii [47].
- 27 -
Nástřik v GC-MS Vzorek je zaváděn do kolony pomocí mikrostříkačky, kterou se propíchne septum a provede se nástřik. Po nástřiku je vzorek okamžitě převeden do plynné fáze a může být nadávkován na kolonu. V plynové chromatografii se využívá několik technik pro převedení vzorku na kolonu, nejpoužívanějšími technikami však jsou [47]: 1) Nástřik do kolony (on column) je základní metodou náplňových a mikronáplňových kolon. V závislosti na podmínkách měření se dávkuje 1-10 µl vzorku. Bývá preferován i pro kapilární kolony větší světlosti (od průměru 0,25 mm) s použitím jemné nástřikové jehly pro 0,2-2 µl vzorku. Horní část kolony je zahřívána na teplotu o 10-30 °C nižší, než je teplota varu rozpouštědla. Vzorek musí být rychle nastříknut a vytvořit kapalný film na stěně kolony. Po 30-60 s se teplota kolony prudce zvýší, aby nastalo odpaření [37].
2) Nástřik pomocí děliče toku (split injection). Tenčí kapilární kolony mají malou kapacitu, a proto se zejména u koncentrovaných vzorků musí pomocí děliče toku (splitter) jeho část s nosným plynem oddělit. Do kolony se pak dostává jen definovaný zlomek nastříknutého množství (zpravidla 0,1-10 %), které bývá v intervalu 0,1-2 µl. Skleněná vata v odpařovací trubici (liner) zajišťuje homogenní odpařování a účinné promíchávání vzorku před vstupem do kolony [37].
3) Nástřik bez děliče toku (splitless injection) je využíván hlavně při stopové analýze, protože umožňuje stanovení velmi nízkých koncentrací (ppm a méně). Používá se téhož zařízení jako s dělením toku, ale odvod děliče je uzavřen. Po nástřiku dochází v lineru k odpaření vzorku a jeho vstupu na kolonu. Při této metodě nástřiku je většina vzorku převáděna přímo na kolonu, a proto je možné dosahovat nižších limitů detekce (vyšší citlivosti) než ve splitovacím režimu. Vylepšenou variantou bezděličového nástřiku je pulzní nástřik bez děliče toku (pulsed splitless injection), který umožňuje efektivnější vstup vzorku na kolonu. Princip nástřiku je téměř stejný s tím rozdílem, že po odpaření vzorku je prudce zvýšen tlak, což umožňuje rychlejší převod vzorku na kolonu. Kromě toho dochází po 30-60 sekundách k otevření děliče toku a oplachu lineru od zbytků rozpouštědla a analytů, čímž je zamezeno chvostování píků. Hlavní výhody oproti klasickému splitless spočívají v možnosti nástřiku většího objemu (až 5 µl) a v rychlejším transferu vzorku na kolonu [48-49].
- 28 -
Typy hmotnostních analyzátorů Nejběžnějším hmotnostním analyzátorem v GC-MS je kvadrupól, který je cenově nejdostupnější. Kvadrupólový hmotnostní analyzátor je obvykle tvořen čtyřmi rovnoběžnými tyčovými elektrodami s kruhovým nebo hyperbolickým průřezem. Tyčové elektrody jsou paralelně umístěny v rozích pomyslného pravidelného čtyřbokého hranolu a na každou dvojici protilehlých tyčí je aplikováno jiné vysokofrekvenční napětí. Nastavení hodnot veličin (stejnosměrné napětí, amplitudy a frekvence radiofrekvenčního pole) předurčuje trajektorie drah, po kterých se mezi tyčemi budou pohybovat ionty s určitou hodnotou m/z. Při daném nastavení mají stabilní trajektorii vedoucí k detektoru jen ionty určité hodnoty m/z. Ostatní ionty k detektoru neprojdou, protože jejich trajektorie jsou nestabilní a kolidují s tyčovými elektrodami. Nastavení veličin kvadrupólu se postupně mění a detektor zachycuje ionty o různých hodnotách m/z. Dalším relativně běžným analyzátorem je iontová past, která pracuje podobně jako kvadrupól. Jinou variantou je pak sektorový hmotnostní analyzátor, který je ale finančně nákladný, rozměrný a může si jej dovolit jen málokterá laboratoř. Analyzátor doby letu se používá zejména v tandemovém uspořádání, kde bývá řazen za kvadrupól [47].
2.3.2.1.3 Analýza Hmotnostní spektrometr obvykle může pracovat ve dvou režimech, buď měří celá spektra tzv. celkový iontový proud (TIC), anebo selektivně monitoruje určitou hmotu tzv. selektivní monitorování iontů (SIM). Typický GC-MS je schopen vykonávat obě tyto funkce, a to buď jednotlivě anebo současně v závislosti na možnostech a nastavení přístroje [47]. TIC („Total Ion Current“) Pokud má přístroj registrovat celá spektra, je nutné mu zadat určitý interval m/z, ve kterém bude pracovat (např. 50-400 m/z). Šířka intervalu bývá ovlivněna očekávanými analyty, použitými rozpouštědly a případnými interferencemi. Ve sledovaném intervalu by neměly být obsaženy příliš nízké hmoty, protože jejich přítomnost vede ke zvýšení šumu. Lze tak potom v naměřeném spektru najít například dusík (28 m/z), oxid uhličitý (44 m/z), vodu (18 m/z), popřípadě další možné interference. Kromě toho nastavení příliš širokého intervalu skenování má za následek snížení citlivosti a reprodukovatelnosti metody, protože při každém skenu je sledováno velké množství různých fragmentů, což vede ke snížení frekvence snímání spekter a zhoršení tvaru píků [47].
- 29 -
Úplný sken se provádí při určování neznámé látky ve vzorku. Pokud jde o určení nebo potvrzení obsahu určité sloučeniny ve vzorku, tak režim TIC poskytuje daleko více informací než režim SIM. Mód TIC bývá nástrojem pro vývoj nové metody stanovení, kdy se při první analýze provádí nejprve celkový sken. Z naměřených retenčních časů a hmotnostního spektra sledovaných látek se pak volí podmínky pro režim SIM [47].
SIM („Selective Ion Monitoring“) Hmotnostní spektrometr v režimu SIM registruje pouze takové fragmenty, které mu byly dopředu zadány. Mód SIM umožňuje dosažení extrémně nízkých detekčních limitů, protože je sledováno jenom několik vybraných fragmentů (např. 4), a proto se nesnižuje citlivost přístroje. Vzhledem k tomu, že jsou sledovány pouze vybrané hmoty, tak se částečně eliminuje i vliv matricových efektů ve vzorku. Aby byl výsledek dostatečně relevantní, je důležité ověřit, zda daný pík skutečně odpovídá hledanému analytu. K tomu se může využít referenčního standardu, který se přidá ke vzorku a analýza se provede znovu. Další možností je tzv. „qualifier ions“, což je skupina iontů vybraná z hmotnostního spektra sledované sloučeniny. Přítomnost těchto iontů v určitém množství k charakteristickému iontu analytu pak poskytuje důkaz o správné identifikaci cílové sloučeniny [47].
Typy ionizace Potomco složky vzorku opustí kolonu, procházejí přes interface a vstupují do hmotnostního spektrometru, kde nejprve probíhá jejich ionizace. Po nezbytné ionizaci, fragmentaci, akceleraci a separaci iontů následuje jejich detekce pomocí elektronového násobiče (detektor s konverzní dynodou). Ionizované fragmenty jsou tak převedeny na elektrický signál, který je pak detekován. V GC-MS se používají tyto způsoby ionizace [47]: 1) Ionizace elektronem (EI) Ionizace elektronem je zdaleka nejčastějším způsobem ionizace, který se stal určitým standardem. Molekuly vstupují do hmotnostního analyzátoru (kvadrupól nebo iontová past), kde jsou bombardovány elektrony uvolněnými z rozžhaveného vlákna. Elektrony dopadají na molekuly a vyvolávají jejich fragmentaci, která probíhá charakteristickým a reprodukovatelným způsobem. Tato „tvrdá“ ionizační technika vede k tvorbě mnoha fragmentů o nízkém poměru m/z a jen několik málo z nich se svou hmotou blíží
- 30 -
molekulové hmotnosti původní molekuly. Z toho vyplývá, že molekulární ion může být ve spektru málo intenzivní a v některých případech může dokonce chybět. Molekulární fragmentace je závislá na ionizační energii elektronů (typicky 70 eV). Použití ionizační energie 70 eV usnadňuje porovnání naměřených spekter se spektry uloženými v knihovně spekter počítače [47]. 2) Chemická ionizace (CI) Chemická ionizace využívá k ionizaci reakčního plynu (methan, amoniak), který je zaváděn do ionizační komůrky hmotnostního spektrometru. V závislosti na módu chemické ionizace (pozitivní nebo negativní CI) je zvolen reakční plyn, který interaguje s elektrony a analytem a způsobuje jeho „měkkou“ ionizaci. Při „měkké“ ionizaci dochází k menší fragmentaci molekuly než při „tvrdé“ ionizaci elektronem. Jednou z hlavních výhod chemické ionizace je, že molekulární ion bývá ve spektru daleko intenzivnější, než je tomu u ionizace elektronem [47]. •
pozitivní chemická ionizace (PCI) – Reakční plyn (např. methan, izobutan…) reaguje s molekulami látek, které mají protonovou afinitu [47].
•
negativní chemická ionizace (NCI) – Reakční plyn (např. amoniak, dichlormethan…) reaguje s molekulami látek, které mají elektronovou afinitu [47].
V GC-MS je prioritou identifikace látky, která se provádí pomocí retenčních charakteristik a hmotnostního spektra. Určitému retenčnímu času v chromatogramu odpovídá určité hmotnostní spektrum, jehož vyhodnocením lze zjistit, o jakou látku se jedná. Toto vyhodnocení provádí počítač, který pomocí příslušného softwaru porovnává naměřené hmotnostní spektrum se spektry uloženými v databázi, tzv. knihovně spekter. Ve výsledku jsou pak navrženy látky, jejichž hmotnostní spektra přicházejí v úvahu. V případě, že software nenalezne vhodnou látku, která by odpovídala naměřenému spektru, je na místě manuální interpretace spektra. Počítač současně porovnává více údajů (např. retenční časy z GC), které se přesně týkají naměřených dat [47, 50]. Jinou metodou identifikace je matematická analýza píků v MS spektru. MS spektrum má totiž původně charakter píků, teprve matematickým zpracováním získáváme čárové spektrum. V této metodě je nejvyššímu píku přiřazena 100 % hodnota a dalším píkům v MS spektru jsou přičteny poměrné hodnoty, přičemž se berou v úvahu všechny hodnoty nad 3 %. Molekulová hmotnost neznámé sloučeniny obvykle odpovídá molekulárnímu píku, jehož
- 31 -
přesná hmota se použije ke zjištění chemického vzorce, který obsahuje různé prvky, jež mohou být přítomny ve sloučenině. Izotopové linie ve spektru, které jsou charakteristické pro jednotlivé prvky, se použijí k identifikaci těchto prvků. Jakmile je pomocí spektra nalezen chemický vzorec, může být identifikována molekulární struktura, která však musí být v souladu s charakteristikami zaznamenanými GC-MS. Tato identifikace je automaticky prováděna programem, který je dodáván společně s přístrojem. Software automaticky navrhuje možné struktury, které by mohly být ve vzorku přítomny [47, 50]. V módu TIC se berou v úvahu všechny fragmenty ve spektru, kdežto v módu SIM se sledují pouze vybrané hmoty odpovídající konkrétní látce. Využívá se předpokladu, že v daném retenčním čase je určitá skupina iontů charakteristická pro danou látku. To umožňuje rychlou a efektivní analýzu, zejména pokud má analytik předběžné informace o vzorku nebo hledá jen několik specifických látek. Díky SIM módu dochází k výraznému zjednodušení výsledného chromatogramu, čímž roste citlivost analýzy, takže lze detekovat menší množství sloučeniny [47]. Ke kvantifikaci látky se pak využívá geometrických charakteristik píku, kdy se měří jeho plocha nebo výška.
GC-MS/MS Tandemové uspořádání MS/MS umožňuje stanovení velmi nízkých koncentrací ve vzorcích s výrazným vlivem matricových efektů. V praxi existuje několik typů tandemových hmotnostních spektrometrů, které se od sebe liší druhem použitých hmotnostních analyzátorů. V GC-MS/MS se v této souvislosti nejběžněji využívá trojitého kvadrupólu. Hmotnostní spektrometr tak ve skutečnosti obsahuje tři kvadrupóly (QqQ) – 1. analyzátor (Q1), kolizní celu (q2) a 2. analyzátor (Q3). V prvním kvadrupólu (Q1) dochází ke generaci iontů, z nichž se separuje požadovaný ion, který se v kolizní cele (q2) podrobí další reakci, a z něj vzniklé ionty jsou analyzovány následujícím kvadrupólem (Q3) [47]. Kromě trojitého kvadrupólu se využívá také iontové pasti, která poskytuje několik výhod. Je možné ji zkonstruovat i s malými rozměry při zachování velmi dobrého rozlišení. Iontová past má také menší nároky na vakuum a napájení než kvadrupóly (a tím je možné použít menší a jednodušší vakuové pumpy). Hlavní výhodou však je možnost provádět GC-MSn, kde jediná iontová past slouží zároveň jako hmotnostní analyzátor i kolizní cela.
- 32 -
Obecně lze v první fázi tandemové hmotnostní spektrometrie separovat buď pouze jeden ion (SRM) nebo více iontů (MRM), a ty potom podrobit dalším reakcím. Tandemové uspořádání MS/MS je vysoce specifická metoda, která prakticky eliminuje vlivy matrice. Využití jiných typů uspořádání hmotnostních analyzátorů (např. QqTOF, QqTrap apod.) je v souvislosti s plynovou chromatografií méně běžné [47]. 2.3.2.2 Kapalinová chromatografie – hmotnostní spektrometrie (HPLC-MS) HPLC-MS je analytická technika,
která kombinuje vlastnosti kapalinové
chromatografie a hmotnostní spektrometrie. HPLC-MS je výborná technika, která se používá zejména tam, kde je požadována vysoká citlivost a specifičnost analýzy. Obecně se metoda HPLC-MS využívá k detekci a potenciální identifikaci chemických látek v přítomnosti jiných chemických látek (ve složité směsi) [51]. Kapalinová chromatografie HPLC-MS se od kapalinové chromatografie s běžnou detekcí (např. spektrometrický detektor) odlišuje hlavně použitým měřítkem. V HPLC-MS se obvykle používají kolony s menšími vnitřními průměry a tedy i s nižšími průtoky mobilních fází. Nedávno se v HPLC-MS ještě využívaly kolony o průměru 1 mm (klasická HPLC 4,6 mm), nyní převládají kolony s vnitřním průměrem okolo 300 µm nebo i 75 µm, a tak v těchto případech nebývají výjimkou i průtoky v řádech stovek nanolitrů za minutu [51]. V případě separace na klasických kolonách s průměry 4,6 mm lze eluát z kolony rozdělit
v určitém
spektrofotometrickou
splitovacím
poměru
(HPLC-UV/VIS)
(např. a
10:1),
hmotnostní
a
tak
detekci
realizovat
současně
(HPLC-MS
příp.
HPLC-MS/MS). Na jednu stranu dochází rozdělením toku ke snížení citlivosti spektrometrického detektoru, ale na druhou stranu nám hmotnostní spektrometr poskytuje výbornou citlivost při průtocích 200 µl/min nebo méně [51]. Hmotnostní spektrometrie Obvyklým hmotnostním analyzátorem v HPLC-MS bývá kvadrupól, iontová past nebo analyzátor doby letu. V případě tandemového uspořádaní HPLC-MS/MS je podobně jako v GC-MS/MS využíváno trojitého kvadrupólu (QqQ) nebo kombinace kvadrupólu s průletovým analyzátorem (QqTOF) [51]. Donedávna byl největším problémem HPLC-MS interface mezi kapalinovým chromatografem a hmotnostním spektrometrem, rozvoj ionizačních technik však tento
- 33 -
problém vyřešil. Především ionizace elektrosprejem (ESI) se zasloužila o rozvoj HPLC-MS a jeho uplatnění ve farmakologické praxi. Je ale využíváno i jiných ionizačních technik např. bombardování rychlými atomy, termospreje, nanospreje nebo chemické či fotometrické ionizace za atmosférického tlaku. Pro biologické vzorky našla uplatnění technika MALDI [51]. GC-MS a HPLC-MS umožňují separaci a citlivou detekci širokého spektra léčiv (Obr. 13) [46].
Obr. 13 – Stanovení léčiv separačními metodami [46]
- 34 -
2.3.3
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Stopová analýza bývá často doprovázena komplikovaným pozadím a matricovými
efekty. Z tohoto důvodu se musí volit vhodná kvantifikační metoda, která tyto nepříznivé vlivy do jisté míry eliminuje. Ke kvantifikaci léčiv v životním prostředí se zejména používá:
1) Metoda kalibrační křivky Tato metoda spočívá v přípravě tzv. kalibračních standardů, což jsou roztoky, které obsahují postupně rostoucí koncentraci stanovované složky. Kalibrační standardy se proměří a sestrojí se grafická závislost sledované veličiny na obsahu složky. Pak se proměří vzorek a z velikosti naměřené veličiny se určí obsah složky ve vzorku. Musí se přitom dbát na to, aby bod na kalibrační křivce, který patří vzorku, ležel mezi standardy. Metoda kalibrační křivky je sice hojně využívaná v praxi, ale v případě stopové analýzy v povrchových vodách ji nelze uplatnit, protože ve vzorku dochází k výraznějším matricovým efektům, které ruší stanovení. Analyt se totiž jinak chová ve vzorku a jinak zase v připravených standardech. Z tohoto důvodu pak detektor může dávat různé odezvy, čímž dochází k chybám při stanovení. Řešením může být přídavek balastních látek do tzv. matricových standardů nebo využití jiné kalibrační metody – nejlépe metody standardního přídavku [3, 30, 36-37, 52-53].
2) Metoda vnitřního standardu Ke vzorku se přidává známé množství standardu. Standardem je látka, která nesmí být ve vzorku obsažena a musí tvořit samostatný pík v blízkosti píku stanovované složky. Je nezbytné zabránit chybám způsobeným jinou odezvou standardu a analytu. V takovém případě plochy píků pro stejná látková množství standardu a analytu nejsou stejné; jejich poměr tedy není roven jedné a označujeme jej jako korekční faktor, kterým je nutno korigovat změřené plochy píků. Samotná kvantifikace se pak provádí, buď metodou přímého srovnání anebo metodou kalibrační křivky [37]. Nalezení vhodného vnitřního standardu bývá problematické. Vhodným vnitřním standardem např. pro analýzu ibuprofenu je látka známá pod obchodním názvem „fenoprop“,
systematickým
názvem
2-(2,4,5-trichlorfenoxy)propanová
(Obr. 14) [54]:
- 35 -
kyselina
Obr. 14 – Strukturní vzorec 2-(2,4,5-trichlorfenoxy)propanové kyseliny („fenoprop“)
3) Metoda standardního přídavku Při využití metody standardního přídavku se provádí dávkování samotného vzorku a vzorku, do kterého bylo přidáno známé množství standardu stejného jako stanovovaná látka. Zvětšení plochy píku je pak přímo úměrné přidanému množství standardu [37, 54].
- 36 -
3
3.1
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Chemikálie Dichlormethan, p.a. (Penta, Praha, Česká republika) Methanol, p.a. (Penta, Praha, Česká republika) Kyselina chlorovodíková 35 %, p.a. (Penta, Praha, Česká republika) Síran sodný, p.a. (Lachema, Neratovice, Česká republika) Léčiva: •
Ibuprofen /Ibalgin 400/ (Zentiva, Praha, Česká republika)
•
Naproxen /Nalgesin S/ (Krka, Praha, Česká republika)
•
Ketoprofen /Ketonal/ (Pharmaceutical and Chemical Company, Ljubljana, Slovinsko)
•
Diklofenak /Diclofenac AL/ (Aliud Pharma, Laichingen, Německo)
Účinné látky byly izolovány z komerčních přípravků, jejichž názvy jsou uvedeny kurzívou. Diazomethan
v diethyletheru
–
byl
připraven
alkalickou
N-nitroso-N-methylmočoviny (Sigma Aldrich, St. Luis, USA)
3.2
Přístroje a zařízení Plynový chromatograf HP 6890 Hmotnostní spektrometr Agilent 5973N Automatický dávkovač HP 7683 Křemenná kapilární kolona HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Nosný plyn – He (99,998 %, SIAD, Bergamo, Itálie) Tlaková láhev s N2 (99,998 %, SIAD, Bergamo, Itálie) Ultrazvuková lázeň Elmasonic S 40H Centrifuga Eppendorf 5702 Topná deska Evaterm Analytické váhy Kern Automatické pipety Laboratorní sklo Plastové špičky a mikrozkumavky
- 37 -
hydrolýzou
3.3
Odběr vzorků K analýze léčiv byla odebírána povrchová voda z řeky Dřevnice, která pramení
na jihu Hostýnských vrchů, zhruba 3 km severně od obce Držková, v nadmořské výšce 551 m. Nedaleko pramene cca 7 km jižněji se na řece nachází přehrada, která slouží k zadržování povrchové vody, jež se posléze upravuje na vodu pitnou, kterou je zásobováno město Zlín a blízké okolí. Řeka protéká Slušovicemi, Zlínem a Otrokovicemi, u kterých se vlévá zleva do řeky Moravy ve výšce 182 m n.m. Dřevnice se svou délkou toku 42,3 km patří k významným řekám Zlínského kraje [55]. Vzorkování probíhalo jak na samotném toku řeky Dřevnice, tak i na jejích významných přítocích a řece Moravě. Mapoval se asi 35 km dlouhý úsek řeky, který sahá od přehrady ve Slušovicích až po ústí Dřevnice do řeky Moravy. Analyzováno bylo celkem 33 vzorků, které byly odebírány ve třech sériích z 11 odběrových míst, jejichž poloha je znázorněna na mapce (Obr. 15).
Obr. 15 – Mapa odběru vzorků
K vzorkování byla použita nádoba pro odběr vody a čisté plastové (PE-HD, PET) láhve o objemech 500, 1500 a 2000 ml. Vzorky vody byly ihned po odběru transportovány do laboratoře, kde byly v průběhu následujících 48 hodin zpracovány. Data a podmínky odběrů jsou uvedeny v tabulce č. 5.
- 38 -
číslo
umístění
měřící
stanice
stanice
/řeka/
1
2
3
4
5
Spytihněv /Morava/ Kroměříž /Morava/ Zlín /Dřevnice/ Vizovice /Lutoninka/ Slušovice /Dřevnice/
dlouhodobý
2.3.2009
3.5.2009
2.3.2010
průměr
Tvzd. = 2,9°C
Tvzd. = 13,4°C
Tvzd. = 3,0°C
Q
H
Q
H
Q
H
Q
H
[m3/s]
[cm]
[m3/s]
[cm]
[m3/s]
[cm]
[m3/s]
[cm]
55,40
155
87,46
188
34,70
130
314,00
51,30
179
77,82
206
26,52
142
295,50
2,21
36
5,74
40
0,46
24
7,13
57
0,59
24
1,07
23
0,13
13
1,60
32
–
–
0,30
15
0,04
7
0,80
25
420 (1.SPA) 415 (1.SPA)
Tab. 5 – Podmínky vzorkování /zdroje: Povodí Moravy s.p. a ČHMÚ/
3.4
Pracovní postup Odměrným válcem bylo odměřeno 500 ml vzorku, který se nechal asi 5 minut
odplynit v ultrazvuku. Odplyněný vzorek byl převeden do dělící nálevky o objemu 1 litr a okyselen přídavkem 1,5 ml 5 M HCl, čímž se upravilo pH na 2. Pro extrakci léčiv bylo do děličky přidáno 20 ml dichlormethanu a poté se obsah děličky asi 5 minut intenzivně protřepával. Po ustálení obou vrstev byla spodní organická vrstva odpuštěna do plastové centrifugační zkumavky. Extrakce pak byla ještě jednou opakována s přídavkem 10 ml dichlormethanu. Extrakty ve zkumavkách byly následně centrifugovány po dobu 5 minut při maximálních otáčkách (4400 min-1), aby se od sebe dokonale oddělily vrstvy dichlormethanu, vody a přítomných nečistot. Vodná fáze byla odstraněna do odpadu a vrstva dichlormethanu byla opatrně pomocí automatické pipety převedena do skleněné baňky. Pro vysušení bylo k extraktu přidáno menší množství bezvodého Na2SO4. Vysušený extrakt byl na topné desce odpařen mírným proudem dusíku na objem 3-4 ml. Tento objem byl postupně pipetou převeden do skleněné vialky a odpařen dosucha.
- 39 -
Pro derivatizaci vzorku bylo do vialky přidáno 500 µl roztoku diazomethanu v diethyletheru. Vzorek se nechal methylovat přibližně 15 minut, a pak bylo přebytečné rozpouštědlo pomocí jemného proudu dusíku opět odpařeno. Methylace diazomethanem byla poté ještě jednou zopakována. Následně bylo do vialky přidáno 1000 µl methanolu a vzorek ve vialce byl asi na 2 minuty vložen do ultrazvuku. Vzorek se v této fázi kvůli odstranění velmi jemných nečistot nechal ještě jednou centrifugovat a posléze se opatrně převedl do čisté vialky. Takto připravený vzorek pak byl podroben analýze na GC-MS. Paralelně byly zpracovávány i vzorky se standardními přídavky léčiva 10 a 100 ng/l.
3.5
Analýza GC-MS Analýza byla prováděna na plynovém chromatografu HP-6890, který byl vybaven
hmotnostním spektrometrem Agilent 5973N a automatickým dávkovačem HP-7683. Vzorky ve vialkách byly umístěny do automatického dávkovače a následně byla spuštěna analýza. Mikrostříkačka Hamilton byla nejprve propláchnuta acetonem, posléze vzorkem a až poté byl nadávkován 1 µl vzorku. K nadávkování vzorku do kolony byla zvolena metoda pulzního dávkování bez děliče toku – (138 kPa; 0,4 min.). Jako nosný plyn bylo použito helium s průtokem 0,9 ml/min. Teploty nástřiku a spojky mezi GC a MS byly nastaveny na 280ºC. K separaci byla použita křemenná kapilární kolona o délce 30 m, vnitřním
průměru
0,25
mm,
tloušťce
filmu
0,25
µm
a
teplotní
program:
50ºC – 2 min – 10ºC/min – 300ºC – 5 min. Celková doba analýzy byla 42 minut. Hmotnostní spektrometr využíval ionizace elektronem (EI) a byl na počátku analýzy po dobu 5 minut vypnut kvůli odstranění rozpouštědla. Sběr dat byl realizován v modech „TIC“ a „SIM“ (161, 185, 209 a 214 m/z).
- 40 -
4
VÝSLEDKY A DISKUZE
Při extrakci do dichlormethanu byly zjištěny technikou vícenásobné extrakce poměrně vysoké hodnoty návratnosti, které se pohybovaly okolo 99 % (Tab. 6, příloha 1). Bohužel návratnost extrakce bývá závislá na složení vzorku. Vzhledem k případným matricovým efektům byla pro kvantifikaci léčiv zvolena metoda standardního přídavku, která matricové efekty do jisté míry eliminuje a poskytuje správné a přesné výsledky i v případě nekvantitativní extrakce analytů. Takto zpracovaný vzorek s příslušnými standardními přídavky byl poté využit pro analýzu dalších vzorků jako standard (matricový standard). Z důvodu značného vlivu matrice na výsledné tvary a plochy píků je bez matricových standardů problematické i stanovení příslušných detekčních limitů. Pro orientační odhad byl použit vzorek pitné vody zpracovaný jako slepý pokus a tentýž vzorek s přídavkem léčiv na koncentrační úrovni 0,5 ng/l. V příloze č. 2 je doložen dostatečně průkazný vliv standardních přídavků na plochy detekovaných píků. Hodnota 0,5 ng/l byla proto přijata jako spolehlivě prokazatelná koncentrace ve vzorcích nepříliš znečištěných vod. V tabulce č. 6 jsou rovněž uvedeny hodnoty koncentrací léčiv, které odpovídají plochám píků detekovaných ve slepém pokusu (cBLANK).
léčivo
tR [min]
charakteristický ion [m/z]
návratnost extrakce [%]
ibuprofen
15,14
161
99,12
naproxen
20,41
185
98,69
ketoprofen
21,53
209
98,67
diklofenak
22,23 214 99,28 Tab. 6 – Retenční charakteristiky léčiv
LOD [ng/l]
cBLANK [ng/l] 0,22
0,5
0,11 0,04 0,08
Analýzou methylovaných standardů (výchozí koncentrace 1 µg/l) byly zjištěny retenční časy jednotlivých léčiv (Tab. 6) a jejich příslušná hmotnostní spektra, která byla porovnána s databází knihovny spekter (příloha 3). Z naměřených hmotnostních spekter byly zjištěny charakteristické ionty (Tab. 6), které byly následně použity pro citlivou kvantifikaci léčiv v reálných vzorcích pomocí režimu Selective Ion Monitoring (SIM).
- 41 -
Monitoring řeky Dřevnice Rozborem odebraných vzorků vody se podařilo prokázat přítomnost všech čtyř sledovaných
léčiv
jak
v
řece
Dřevnici,
tak
v
jejích
významných
přítocích
(Obr. 16-17, příloha 8). Zjištěné koncentrace se pohybovaly v rozmezí několika desítek až stovek ng/l, avšak vyskytla se i taková místa, kde byla přítomnost medikamentů prakticky vyloučena (Tab. 8). Bylo zjištěno, že koncentraci léčiv v řece ovlivňuje několik faktorů. Množství léčiv totiž závisí mj. na místě odběru, průtoku vody a ročním období. Z tabulky naměřených hodnot a grafů (Tab. 8, Grafy 2-5) jasně vyplývá, že koncentrace léčiv závisí především na místě odběru. Nejvyšší koncentrace léčiv byly nalezeny na samotné výusti přečištěné odpadní vody z areálu ČOV Zlín-Malenovice a bezprostředně za ní. To jednoznačně dokazuje, že se léčiva do životního prostředí dostávají právě skrze ČOV. Naopak nejnižší množství léčiv bylo nalezeno pod slušovickou přehradou, která spadá do I. stupně vodárenské ochrany, a proto by zde neměla připadat v úvahu jakákoliv vnější kontaminace. V letním období zde dokonce nebyla přítomnost léčiv téměř vůbec prokázána. Koncentrace léčiv na ostatních místech řeky nepatrně kolísaly, což je zřejmě způsobeno tím, že do Dřevnice ústí i odpadní stoky z obcí, které nejsou napojeny na ČOV. Kromě toho se na horním toku řeky nachází také ČOV Slušovice nebo ČOV Vizovice, která vypouští přečištěnou vodu do řeky Lutoninky, jež je levostranným přítokem Dřevnice. Z uvedených tabulek (Tab. 5 a 8) je parné, že koncentrace léčiv v povrchových vodách jsou silně ovlivněny i průtokem vody. V řece Moravě byly nalezeny maximální koncentrace v řádu desítek ng/l i přes to, že se nad nedalekým místem odběru vzorku č.1 (cca 2 km) nachází ČOV Otrokovice. Ve srovnání s řekou Dřevnicí v téže vzdálenosti od ČOV Zlín-Malenovice (vzorek č. 3) se jedná o koncentraci cca třetinovou, což sice může být ovlivněno počtem obyvatel obou měst, ale na druhou stranu i rychlostí toku a mírou průtoku, protože dochází ke zředění kontaminované vody, postupnému odbourávání, případně k ukládání do sedimentů. Výsledky rovněž ukazují, že v zimním období dosahují koncentrace léčiv vyšších hodnot, než je tomu počátkem léta. To je nepochybně zapříčiněno vyšší spotřebou léčiv během zimy, kdy se u lidí objevují chřipková onemocnění. V důsledku jarního oteplení se snižuje výskyt akutních respiračních onemocnění, s čímž souvisí i pokles spotřeby léků. Koncentrace medikamentů zaregistrované dne 2.3.2010 vykazují vesměs mírný pokles oproti množstvím nalezeným přesně před rokem (2.3.2009) na stejných místech.
- 42 -
V průběhu vzorkování v roce 2009 totiž vrcholila chřipková epidemie, a proto se dal přepokládat nárůst koncentrací. Tehdejší data také neovlivňovala jarní obleva, kterou jsou zatíženy hodnoty z roku 2010, kdy byly na řece Moravě vyhlášeny 1. stupně povodňové aktivity. Množství jednotlivých medikamentů ve vodních tocích se odlišuje. Nejvyšší koncentrace jsou zaznamenány u diklofenaku a nejnižší v případě ketoprofenu. Jejich různé zastoupení ve vodním toku je ovlivněno několika faktory, mezi něž patří např. množství účinné látky v medikamentu, spotřeba nebo obtížnost biologické přeměny. Ačkoliv údaje Státního ústavu pro kontrolu léčiv (Tab. 7) ukazují, že spotřeba ibuprofenu je ze všech čtyř zkoumaných subjektů nejvyšší, nalezené hodnoty říkají, že nejvyšší koncentrace byla zaznamenána u diklofenaku. Právě molekula diklofenaku je totiž obtížně rozložitelná látka, která nepříznivě působí na vodní organismy. Naopak koncentrace ketoprofenu jsou bez ohledu na roční období nejnižší ze všech zkoumaných léčiv. Ketoprofen dokonce nebyl na většině odběrových míst v létě vůbec zaregistrován, což je způsobeno i tím, že většina léků s jeho obsahem je vázána na lékařský předpis. Kromě již zmíněných faktorů mají na koncentraci léčiv vliv i přírodní podmínky, zejména počasí a charakter vodního toku. Zvýšená sluneční aktivita totiž příznivě snižuje koncentrace farmak ve vodním toku, kdy dochází k přirozené fotodegradaci léčiva. Množství jsou ovlivňována i typem vodního toku a počtem jezů. Právě u jezů proniká do vody kyslík nezbytný pro život vodních organismů, ale současně působí i na rezidua léčiv, která jsou oxidována na jednodušší molekuly. Problémem tohoto samočisticího procesu je jeho pomalý průběh.
Farmakologické údaje
Statistické údaje
účinná látka
DDD [mg]
ibuprofen
1200
průměrný počet spotřebovaných DDD na 1000 obyvatel za den [-] 26,10
naproxen
500
0,53
1,01
ketoprofen
150
0,77
0,44
diklofenak
100
10,48
4,00
roční spotřeba [t] 119,64
Tab. 7 – Spotřeba analyzovaných léčiv v ČR za rok 2009 /zdroj: SÚKL/ (data jsou vztažena na počet obyvatel k 1.1.2009 – 10 467 542 obyv.)
- 43 -
Abundance TIC: Y07.D 1100000 1000000 900000
diklofenak
800000
ketoprofen
700000
naproxen 600000 500000 400000
ibuprofen
300000 200000 100000 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 Time-->
Obr. 16 – Chromatogram odebraného vzorku vody na výusti z areálu ČOV do řeky Dřevnice (vzorek č.5) z 2.3.2009, měřeno v módu TIC
Abundance TIC: Z07.D 18000 17000
ketoprofen
16000 15000 14000
naproxen
13000 12000
diklofenak
11000
ibuprofen
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 14.00
15.00
16.00
17.00
18.00
19.00
20.00
21.00
22.00
Time-->
Obr. 17 – Chromatogram odebraného vzorku vody na výusti z areálu ČOV do řeky Dřevnice (vzorek č.5) z 2.3.2009, měřeno v módu SIM
- 44 -
IBUPROFEN
číslo vzorku
místo odběru
NAPROXEN
KETOPROFEN
DIKLOFENAK
řeka 2.3.09 3.5.09 2.3.10
2.3.09
3.5.09
2.3.10
2.3.09
3.5.09
2.3.10
2.3.09
3.5.09
2.3.10
1
Napajedla – přístaviště
Morava
23,52
8,83
20,01
14,81
1,32
9,77
7,35
2,96
9,44
108,48
28,70
27,75
2
Otrokovice – lávka
Morava
53,10
13,70
19,79
9,11
0,73
9,23
10,47
<0,50
8,98
113,02
29,47
41,82
3
Otrokovice – Organik
Dřevnice
90,81
15,00
37,46
24,29
17,18
58,28
24,45
<0,50
15,2
124,60
38,82
104,84
Dřevnice
82,11
40,21
78,70
115,90
52,12
152,21 102,08
26,08
79,52
406,30
82,74
172,51
–
91,21
91,94
89,99
260,53
58,72
190,53 191,42
57,62
147,06 687,12 105,24 403,12
Dřevnice
77,49
17,45
78,74
30,20
2,84
21,75
73,88
<0,50
11,25
70,59
33,94
28,49
4
5
6
Zlín-Malenovice (za ČOV) Zlín-Malenovice (výusť z ČOV) Zlín-Malenovice (před ČOV)
7
Zlín-Příluky (U Přístavu)
Dřevnice
39,83
29,18
33,17
8,55
4,23
9,87
10,49
<0,50
7,72
61,84
24,01
30,37
8
Lípa - Pražanka
Dřevnice
36,22
63,94
23,29
10,51
5,10
7,28
27,30
<0,50
5,47
67,96
12,92
30,82
9
Lípa - odbočka
Lutoninka
31,78
39,45
16,98
26,18
7,64
13,38
17,52
<0,50
7,91
62,62
14,17
30,83
10
Lípa - obalovna
Dřevnice
22,01
58,50
23,81
11,14
4,07
15,12
11,34
<0,50
10,06
51,99
33,94
31,17
Dřevnice
1,33
<0,50
1,70
6,58
<0,50
6,90
1,56
<0,50
1,69
17,00
5,94
8,62
11
Slušovice – pod přehradou
Tab. 8 – Tabulka naměřených hodnot
IBUPROFEN
100 90 80
c [ng/l]
70 60
2.3.2009
50
3.5.2009
40
2.3.2010
30 20 10 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
číslo vzorkovacího místa
Graf 2 – Množství ibuprofenu na jednotlivých místech toku
NAPROXEN
300
250
c [ng/l]
200
2.3.2009 3.5.2009
150
2.3.2010 100
50
0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
číslo vzorkovacího místa
Graf 3 – Množství naproxenu na jednotlivých místech toku
- 46 -
KETOPROFEN
250
200
150 c [ng/l]
2.3.2009 3.5.2009 2.3.2010
100
50
0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
číslo vzorkovacího místa
Graf 4 – Množství ketoprofenu na jednotlivých místech toku
DIKLOFENAK
800
700
600
500 c [ng /l]
2.3.2009 3.5.2009
400
2.3.2010 300
200
100
0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
číslo vzorkovacího místa
Graf 5 – Množství diklofenaku na jednotlivých místech toku
- 47 -
5
ZÁVĚR
Cílem mé diplomové práce bylo provést kvalitativní a kvantitativní analýzu čtyř protizánětlivých léčiv v povrchové vodě. K tomuto účelu bylo vybráno povodí řeky Dřevnice. Na jednotlivých místech řeky byla pomocí metody GC-MS prokázána přítomnost ibuprofenu, naproxenu, ketoprofenu a diklofenaku. Koncentrace medikamentů se pohybovaly v řádech několika desítek až stovek ng v jednom litru. Bylo rovněž zjištěno, že množství účinných látek v povrchové vodě ovlivňují tři základní faktory, mezi něž patří hlavně místo odběru, průtok vody v řece a roční období. Znečištění povrchové vody léčivy bylo v drtivé většině způsobené domácnostmi, protože v blízkosti řeky Dřevnice se nenachází žádná farmaceutická továrna, která by se zabývala jakýmkoliv zpracováním zkoumaných léčiv. Určitý podíl na znečištění nesou také nemocniční zařízení, kterých je v okolí hned několik. Hladina analgetik v řece je i přesto relativně nízká (ng/l), a proto zde nevzniká riziko, které by mohlo negativně ovlivňovat lidské zdraví [56]. Otázkou ale zůstává, do jaké míry jsou kontaminovány podzemní vody a studny v blízkém okolí řeky. Není také dostatečně jasné, jak moc je ovlivněn život vodních organismů v řece. Z výsledků provedeného monitoringu vyplývá, že ke znečištění povrchových vod nedochází pouze v blízkosti velkých měst, nýbrž i v menších městech a větších obcích.
- 48 -
6
[1]
LITERATURA
Ven K., Dongen W., Maes B.U.W., Esmans E.L., Blust R., Coen W.M.: Chemosphere 57, 967–973 (2004).
[2]
Bisceglia K.J., Yu J.T., Coelhan M., Bouwer E.J., Roberts A.L.: J. Chromatogr. A 1217, 558–564 (2010).
[3]
Gros M., Petrović M., Barceló D.: Talanta 70, 678–690 (2006).
[4]
Joss A., Keller E., Alder A.C., Göbel A., McArdell C.S., Ternes T., Siegrist H.: Water. Res. 39, 3139–3152 (2005).
[5]
Vieno N.M., Tuhkanen T., Kronberg L.: J. Chromatogr. A 1134, 101–111 (2006).
[6]
Moldovan Z.: Chemosphere 64, 1808–1817 (2006).
[7]
http://www.sukl.cz/4-ctvrtleti-a-za-cely-rok-2008 (staženo 8.2.2010)
[8]
http://cs.wikipedia.org/wiki/Analgetika (staženo 8.2.2010)
[9]
http://en.wikipedia.org/wiki/Ibuprofen (staženo 8.2.2010)
[10]
http://www.piskac.cz/ETD/ (staženo 9.2.2010)
[11]
Katzung B.G.: Základní a klinická farmakologie. H&H, Jinočany 2006.
[12]
http://www.ibalgin.cz/Pages/pro-odborniky.aspx (staženo 8.2.2010)
[13]
Švihovec J.: Pharmindex – kompendium. MediMedia Informations, Praha 1995.
[14]
Carvalho P.O., Cass Q.B., Calafatti S.A., Contesini F.J., Bizaco R.: Braz. J. Chem. Eng. 23, 291–300 (2006).
[15]
Oliveira A.R.M., Santana F.J.M., Bonato P.S.: Anal. Chim. Acta 538, 25–34 (2005).
[16]
Sidelmann U.G., Bjørnsdottir I., Shockcor J.P., Hansen S.H., Lindon J.C., Nicholson J.K.: J. Pharm. Biomed. Anal. 24, 569–579 (2001).
[17]
http://en.wikipedia.org/wiki/Naproxen (staženo 10.2.2010)
[18]
Heitmeier S., Blaschke G.: J. Chromatogr. B 721, 109–125 (1999).
[19]
Bort R., Macé K., Boobis A., Lechón M.J.G., Pfeifer A., Castell J.: Biochem. Pharmacol. 58, 787–796 (1999).
[20]
http://www.pace.cz/go/archiv_p0303_2 (staženo 17.2.2010)
[21]
Lin A.Y-C., Yu T-H., Lateef S. K.: J. Hazard. Mater. 167, 1163–1169 (2009).
[22]
Lange H.J., Noordoven W., Murk A.J., Lürling M., Peeters E.T.H.M.: Aquat. Toxicol. 78, 209–216 (2006).
- 49 -
[23]
Pomati F., Netting A.G., Calamari D., Neilan B.A.: Aquat. Toxicol. 67, 387–396 (2004).
[24]
Santos L.H.M.L.M., Araújo A.N., Fachini A., Pena A., Delerue-Matos C., Montenegro M.C.B.S.M.: J. Hazard. Mater. 175, 45–95 (2010).
[25]
Webb S., Ternes T., Gibert M., Olejniczak K.: Toxicol. Lett. 142, 157–167 (2003).
[26]
http://www.novinky.cz/zahranicni/amerika/134979-milionum-americanu-tece-zkohoutku-voda-se-zbytky-leku.html (staženo 17.2.2010)
[27]
Heberer T.: Toxicol. Lett. 131, 5–17 (2002).
[28]
Sipma J., Osuna B., Collado N., Monclús H., Ferrero G., Comas J., Rodriguez-Roda I.: Desalination 250, 653–659 (2010).
[29]
Zhang Y., Geißen S.U., Gal C.: Chemosphere 73, 1151–1161 (2008).
[30]
Santos J.L., Aparicio I., Alonso E., Callejón M.: Anal. Chim. Acta 550, 116–122 (2005).
[31]
Betts K.S.: Environ. Sci. Technol., 377–378 (2002).
[32]
Fono L.J., Kolodziej E.P., Sedlak D.L.: Environ. Sci. Technol. 40, 7257–7262 (2006).
[33]
Kim S.D., Cho J., Kim I.S., Vanderford B.J., Snyder S.A.: Water Res. 41, 1013–1021 (2007).
[34]
http://www.bbraunweb.cz/doc/doc_download.cfm?5781&uuid=51CD374B2A5AE626 6DFCD2A42DD2C6F4&&IRACER_AUTOLINK&& (staženo 18.2.2010)
[35]
Verenitch S.S., Lowe C.J., Mazumder A.: J. Chromatogr. A 1116, 193–203 (2006).
[36]
Tauxe-Wuersch A., Alencastro L.F., Grandjean D., Tarradellas J.: Water Res. 39, 1761–1772 (2005).
[37]
Klouda P.: Moderní analytické metody. Pavel Klouda, Ostrava 2003.
[38]
http://services.leatherheadfood.com/mycotoxins/item.asp?sectionid=3&mytype=traini ng&number=2&fsid=61 (staženo 20.2.2010)
[39]
Lin W.C., Chen H-C., Ding W-H.: J. Chromatogr. A 1065, 279–285 (2005).
[40]
http://www.hplc.cz/ (staženo 20.2.2010)
[41]
Farré M., Petrovic M., Gros M., Kosjek T., Martinez E., Heath E., Osvald P., Loos R., Menach K.L., Budzinski H., Alencastro F., Müller J., Knepper T., Fink G., Ternes T.A., Zuccato E., Kormali P., Gans O., Rodil R., Quintana J.B., Pastori F., Gentili A., Barceló D.: Talanta 76, 580–590 (2008).
[42]
Sacher F., Lange F.T., Brauch H-J., Blankenhorn I.: J. Chromatogr. A 938,
- 50 -
199–210 (2001). [43]
Öllers S., Singer H.P., Fässler P., Müller S.R.: J. Chromatogr. A 911, 225–234 (2001).
[44]
Gómez M.J., Agüera A., Mezcua M., Hurtado J., Mocholí F., Fernández-Alba A.R.: Talanta 73, 314–320 (2007).
[45]
Deng A., Himmelsbach M., Zhu Q-Z., Frey S., Sengl M., Buchberger W., Niessner R., Knopp D.: Environ. Sci. Technol. 37, 3422–3429 (2003).
[46]
Fatta D., Nikolaou A., Achilleos A., Meriç S.: Trends Anal. Chem. 26, 515–533 (2007).
[47]
http://en.wikipedia.org/wiki/GC-MS (staženo 27.2.2010)
[48]
http://www.kinesis-solutions.co.uk/kinesis_techtips.asp?id=12 (staženo 31.3.2010)
[49]
http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5988-9944EN.pdf (staženo 31.3.2010)
[50]
http://en.wikipedia.org/wiki/Mass_spectrometry (staženo 27.2.2010)
[51]
http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid_chromatography-mass_spectrometry (staženo 27.2.2010)
[52]
Balakrishnan V.K., Terry K.A., Toito J.: J. Chromatogr. A 1131, 1–10 (2006).
[53]
Nebot C., Gibb S.W., Boyd K.G.: Anal. Chim. Acta 598, 87–94 (2007).
[54]
Quintana J.B., Rodil R., Reemtsma T.: J. Chromatogr. A 1061, 19–26 (2004).
[55]
http://cs.wikipedia.org/wiki/D%C5%99evnice (staženo 5.3.2010)
[56]
Schwab B.W., Hayes E.P., Fiori J.M., Mastrocco F.J., Roden N.M., Cragin D., Meyerhoff R.D., D'Aco V.J., Anderson P.D.: Regul. Toxicol. Pharm. 42, 296–312 (2005).
[57]
Galmier M-J., Bouchon B., Madelmont J-C., Mercier F., Pilotaz F., Lartigue C.: J. Pharm. Biomed. Anal. 38, 790–796 (2005).
- 51 -
7
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ
Apíku
plocha píku
BSTFA
N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid
cBLANK
koncentrace léčiva ve slepém pokusu v ng/l
CE
kapilární elektroforéza
CI
chemická ionizace
CYP1A2
druh cytochromu
CYP2C8
druh cytochromu
CYP2C9
druh cytochromu
CYP3A4
druh cytochromu
ČHMÚ
Český hydrometeorologický ústav
ČOV
čistírna odpadních vod
DAD
detektor s diodovým polem
DDD
doporučená denní dávka
EI
ionizace elektronem
ESI
ionizace elektrosprejem
FLD
fluorescenční detektor
GC
plynová chromatografie
H
výška vodní hladiny v cm
HP
Hewlett-Packard
HP 5
typ
stacionární
fáze
v GC
–
jedná
se
o poly(5%-difenyl-95%-dimethylsiloxan) HPLC
vysoce účinná kapalinová chromatografie
HPLC-UV/VIS
vysoce účinná kapalinová chromatografie se spektrofotometrickou detekcí
LC
kapalinová chromatografie
LOD
limit detekce
MALDI
desorpce/ionizace laserem za účasti matrice
MRM
monitorování reakce více iontů (z angl. „Multiple Reaction Monitoring“)
MS
hmotnostní spektrometrie
- 52 -
MSTFA
N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid
MTBSTFA
N-terc-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid
NCI
negativní chemická ionizace
NMR
nukleární magnetická rezonance
PCI
pozitivní chemická ionizace
PE
polyethylen
PE-HD
vysokohustotní polyethylen
PET
polyethylentereftalát
PTFE
polytetrafluorethylen (teflon)
Q
průtok vody v m3 za sekundu
Q1
kvadrupól č. 1 (1. hmotnostní analyzátor)
q2
kvadrupól č. 2 (kolizní cela)
Q3
kvadrupól č. 3 (2. hmotnostní analyzátor)
QqQ
tandemový
hmotnostní
spektrometr
tvořený
třemi
kvadrupóly
(=trojitý kvadrupól) QqTOF
tandemový hmotnostní spektrometr, kde koncovým analyzátorem je analyzátor doby letu
QqTrap
tandemový hmotnostní spektrometr, kde koncovým analyzátorem je iontová past
SIM
selektivní monitorování iontu (z angl. „Selective Ion Monitoring“)
SPE
extrakce pevnou fází
SRM
monitorování reakce jednoho iontu (z angl. „Single Reaction Monitoring“)
SÚKL
Státní ústav pro kontrolu léčiv
TIC
celkový iontový proud (z angl. „Total Ion Current“)
TOF
průletový analyzátor
tR
retenční čas v min.
Tvzd.
teplota vzduchu v °C
USA
Spojené státy americké
- 53 -
8
PŘÍLOHY
Příloha č. 1 – Kalibrační závislosti
ibuprofen c [ng/l] 50 125 250 500 1250 2500 5000 12500
log c [-]
Apíku [-]
1,6990 2908 2,0969 7117 2,3979 12999 2,6990 38585 3,0969 137231 3,3979 307782 3,6990 693603 4,0969 1401819
naproxen
ketoprofen
log log Apíku Apíku Apíku Apíku [-] [-] [-] [-] 3,4636 11702 4,0683 4564 3,8523 27183 4,4343 10875 4,1139 50543 4,7037 22182 4,5864 107757 5,0324 49646 5,1375 279867 5,4470 139114 5,4882 566191 5,7530 306354 5,8411 1144482 6,0586 671105 6,1467 2456220 6,3903 1513095
diklofenak
log log Apíku Apíku Apíku [-] [-] [-] 3,6593 954 2,9795 4,0364 1980 3,2967 4,3460 3885 3,5894 4,6959 10171 4,0074 5,1434 23182 4,3652 5,4862 46934 4,6715 5,8268 112525 5,0512 6,1799 350309 5,5445 y = 115,24x + 5813,8 R2 = 0,9906
Kalibrační závislost
y = 198,46x + 30383 R2 = 0,9956
3000000
y = 122,8x - 780,89 R2 = 0,9978 2500000 y = 27,905x - 8606,4 R2 = 0,9918 Ibuprofen
2000000
Naproxen
Apíku [-]
Ketoprofen Diklofenak 1500000
1000000
500000
0 0
2000
4000
6000
8000 c [ng/l]
- 54 -
10000
12000
14000
y = 1,1835x + 1,399 R2 = 0,9935
Logaritmická kalibrační závislost
y = 0,9904x + 2,3657 R2 = 0,999
7
y = 1,0797x + 1,7927 R2 = 0,9988
6,5
y = 1,075x + 1,0728 R2 = 0,9962
6 5,5
Ibuprofen Naproxen
log Apíku [-]
5
Ketoprofen Diklofenak
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5
2
2,5
3
3,5
log c [-]
- 55 -
4
4,5
Příloha č. 2 – Detaily chromatogramů vzorku pitné vody a standardu s přídavkem 0,5 ng/l IBUPROFEN Abundance TIC: Z19.D TIC: Z21.D
STD – 0,5 ng/l
66 64 62
BLANK 60 58 56 54 52 50 48 46 44 14.40
14.60
14.80
15.00
15.20
15.40
15.60
15.80
Time-->
NAPROXEN Abundance TIC: Z19.D TIC: Z21.D
1050 1000 950
STD – 0,5 ng/l
900 850 800 750 700 650
BLANK
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 19.90
20.00
20.10
20.20
20.30
Time-->
- 56 -
20.40
20.50
20.60
20.70
20.80
KETOPROFEN Abundance TIC: Z19.D TIC: Z21.D 210
STD – 0,5 ng/l
200 190 180
BLANK
170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20.00
20.50
21.00
21.50
22.00
22.50
23.00
Time-->
DIKLOFENAK Abundance TIC: Z19.D TIC: Z21.D
STD – 0,5 ng/l
160 150 140 130
BLANK
120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 21.70 21.80 21.90 22.00 22.10 22.20 22.30 22.40 22.50 22.60 22.70 Time-->
- 57 -
Příloha č. 3 – Porovnání naměřených hmotnostních spekter s databází knihovny spekter naměřené spektrum (výše), originální spektrum (níže) IBUPROFEN A bundanc e S c an 1967 (15.136 mi n): Z 01.D 161 9000 8000
[M] + - COOCH3 44
7000 6000 5000
[M]+.
4000 3000
117
2000
+
220
91
1000
65 50
100
150
419 446 476 502
256281 310 341 370
191
138
0
200
250
300
350
400
450
500
m/z --> A bundanc e #69397: B enz eneac eti c ac i d, .al pha.-methy l -4-(2-methy l prop... 161 9000 8000 7000 6000 5000 4000 220
3000
117 91
2000 1000
59
191
0 50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
m/z -->
NAPROXEN Abundanc e Sc an 2906 (20.412 min): Z01.D 185 9000
[M] + - COOCH3
8000 7000 6000 5000 4000
[M]+.
244
3000 2000 1000
44
74
141 115 163
0 50
100
150
284
207 200
250
300
342 350
413 446 400
450
483
518
500
m/z --> Abundanc e #84812: 2-Naphthaleneac etic ac id, 6-methox y -.alpha.-methy l... 185 9000 8000 7000 6000 5000 4000
244
3000 2000
141 115
1000 0
59 50
93 100
213 150
200
250
m/z -->
- 58 -
300
350
400
450
500
KETOPROFEN A b u n d a n ce S c a n 3 1 0 5 ( 2 1 .5 3 1 m i n ) : Z 0 1 .D 209
[M] + - COOCH3
9000 8000 7000 6000
105
5000
268
4000
77
[M]+.
3000
191
44 2000 1000
131
165
236
2 9 9 3 3 03 5 5
0
414
446
2 0 4 0 6 0 8 01 0 0 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 m /z - -> A b u n d a n ce # 9 9 2 5 7 : K e to p r o fe n m e th y l e s te r 209 9000 8000 7000 105
6000 5000
77
268
4000 3000
191
2000 51
1000
131
165
236
0 2 0 4 0 6 0 8 01 0 0 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 m /z - ->
DIKLOFENAK [57] Ab u n d a n ce S c a n 3 2 2 9 ( 2 2 .2 2 7 m i n ): Z0 1 .D 214
[M] + - CH3 - H 2O - CO
9000
[M] + - CH3 - H 2O - CO - Cl
8000 7000 6000 5000
242
4000 3000
[M] + - CH3 - H 2O
309
44
[M]+.
2000 1000
151 179 63
90
0 50
277
125
100
150
356 334 200
250
300
350
401
446
400
450
400
450
m /z --> Ab u n d a n ce # 1 2 2 1 5 1 : D i c l o fe n a c , m e th y l e s te r 214 9000 8000 7000 6000 5000 242
4000 3000
309
2000 1000 0
77 51 50
151
179 277
107 126 100
150
200
m /z -->
- 59 -
250
300
350
Příloha č. 4 – Prostorový model ibuprofenu a léčivo Ibalgin 400
- 60 -
Příloha č. 5 – Prostorový model naproxenu a léčivo Nalgesin S
- 61 -
Příloha č. 6 – Prostorový model ketoprofenu a léčivo Ketonal
- 62 -
Příloha č. 7 – Prostorový model diklofenaku a léčivo Diclofenac AL
- 63 -
Příloha č. 8 – Vzorkovací místa řeka Dřevnice (nahoře), výusť z ČOV (dole)
- 64 -
Příloha č. 9 – Publikovaný článek
- 65 -
- 66 -
- 67 -
- 68 -
- 69 -
- 70 -
- 71 -
