2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen

Stage Eindwerk Studiegebied: Gezondheidszorg Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische Academiejaar Student

Laboratoriumtechnologie 2007-2008

Filip Slabbinck

Thema

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen

Stageplaats

Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG)


Woord vooraf In de eerste plaats zou ik graag Kathleen Claes bedanken. Dankzij Kathleen heb ik de mogelijkheid gekregen om mijn stage door te brengen op het DNA-labo in het Centrum voor Medische Genetica aan het Universitair Ziekenhuis te Gent. Ondanks haar drukke agenda heeft ze tijd vrijgemaakt om dit eindwerk door te nemen. Bedankt voor alle hulp. Mijn grootste dankwoord gaat uit naar Kim DeLeeneer. Tussen haar drukke agenda door heeft zij tijd vrijgemaakt om mij te begeleiden op het vlak van zowel stage als eindwerk. Dankzij jouw geduld en kritische opmerkingen is dit eindwerk geworden tot wat het nu is. Bedankt voor alle uitleg, steun en vertrouwen die je me gegeven hebt. Ik wil ook graag alle medewerkers van het DNA-labo in het CMGG bedanken, in het bijzonder Ilse en Justine voor de leuke en aangename samenwerking op praktisch vlak. Dankzij deze personen heb ik een zeer aangename en ontspannende stageperiode gekend. Ik zou ook graag Eveline en Charlotte, de mede-stagiars, bedanken voor de toffe periode die we samen beleefd hebben. Mijn

dank

gaat

ook

uit

naar

de

lectoren

van

de

opleiding

Biomedische

Laboratoriumtechnologie van de Hogeschool West-Vlaanderen departement Simon Stevin. Speciaal wil ik Mieke Demeyere, mijn promotor, bedanken voor de steun, de hulp en de nuttige tips bij het schrijven van dit eindwerk. Als laatste wil ik mijn ouders en broers bedanken voor alle steun die ze me gegeven hebben tijdens de afgelopen jaren.

1


Samenvatting Borstkanker is de op één na grootste doodsoorzaak bij vrouwen. Het is tevens één van de meest voorkomende vormen van kanker bij vrouwen. Het is een aandoening waarbij zowel genetische als niet-genetische factoren een rol spelen. Één van de belangrijkste factoren zijn de familiale voorgeschiedenis en de genetische gevoeligheid. Bij de genetische gevoeligheid wordt er een onderscheid gemaakt tussen erfelijke en familiale borstkanker. De erfelijke borstkanker wordt voornamelijk veroorzaakt door twee genen, BRCA1 en BRCA2. Defecten in deze genen geven een verhoogd risico op borstkanker. Neurofibromatose type 1 (NF1) is een autosomaal dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. De aandoening heeft een variabele expressie en wordt gekenmerkt door pigment abnormaliteiten en/of de vorming van tumoren of neurofibromen. Dit zijn complexe goedaardige tumoren en worden opgedeeld in twee grote types, de plexiforme en de discrete neurofibromen. Tot op heden worden beide aandoeningen in het CMGG gescreend op sequentievariaties. Voor borstkanker wordt BRCA1/2 mutatiedetectie uitgevoerd met behulp van High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA). Door het polymorf karakter van beide genen dient er nog een groot aantal sequentievariaties gesequeneerd te worden. NF1 wordt volledig gescreend op cDNA-niveau. Met deze methode wordt na PCR het volledige fragment gesequeneerd. Omdat voor beide methoden er nog steeds veel dient te worden gesequeneerd, wordt getracht om snellere, goedkopere en minder arbeidsintensieve alternatieven in te voeren en te optimaliseren. Beide nieuwe technieken zijn HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes (borstkanker) en mutatiescanning (NF1). Beide toepassingen worden uitgevoerd op de LightScanner. HRMCA is een post-PCR methode gebaseerd op het uiteensmelten van DNA. Bij het uiteensmelten van het DNA komt de vooraf ingebouwde fluorescerende kleurstof (LCGreen Plus) vrij. De vrijgekomen fluorescentie resulteert in een specifieke smeltcurve. Bij genotypering worden de heteroduplexen en de homoduplexen (wild types en varianten) weergegeven. Bij mutatiescanning vertonen de wild types en sequentievariaties een verschillende smeltcurve. De analyse van beide methodes gebeurt met de software (Call-IT) horend bij de LightScanner. De analyse is gebaseerd op de visuele inspectie van de data en gebeurt in drie stappen.

2


Voor BRCA1/2 wordt de genotypering van drie verschillende SNP‟s geoptimaliseerd in vier verschillende fragmenten met behulp van ongelabelde probes, namelijk SNP c.56234 C>T (BRCA1 exon 8), SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 8 en 9) en SNP c.7470 A>G (BRCA2 exon 14 fragment 2). Voor SNP c.2201 C>T in BRCA1 exon 11 fragment 8 en 9 wordt dezelfde probesequentie gebruikt. Om de optimalisatie te valideren, wordt een blinde screening uitgevoerd met 95 stalen en één blanco. Alle homo- en heterozygoten worden correct geïdentificeerd. Voor BRCA1 c.562-34 C>T was de kwaliteit van de analyse voor twee DNA stalen te laag om correct te identificeren. Bijkomende experimenten dienen te gebeuren om de oorzaak hiervan te achterhalen. De methode is geschikt voor de detectie van frequente BRCA1/2 SNP‟s, maar een sterke inspanning voor de optimalisatie is vereist. Voor mutatie onderzoek van het NF1 gen worden in het kader van deze thesis twaalf fragmenten van de 60 geoptimaliseerd. Voor alle fragmenten kon de amplificatie gebeuren met eenzelfde PCR programma. De validatie van de optimalisatie gebeurt door een test uit te voeren met positieve en negatieve controles en toont 100% sensitiviteit. Eenmaal beide technieken geoptimaliseerd zijn, zullen ze opgenomen worden in de diagnostiek. HRMCA is een eenvoudige techniek, snel in analyse, goedkoop en weinig arbeidsintensief. De optimalisatie van de techniek vergt enige inspanning maar loont gezien het groot aantal patiënten dat in het labo dient onderzocht te worden voor deze grote genen. Hierdoor zal in de toekomst het dure sequeneren sterk gereduceerd kunnen worden.

3


Lijst met afkortingen en symbolen ART

Aerosol Resistant Tips

Bp

base pair

BRCA

Breast Cancer Gene

cDNA

copy- of complement DNA

CMGG

Centrum voor Medische Genetica Gent

ddNTP

dideoxy ribonucleotide triphosphate

DGGE

Denaturerende Gradiënt Gel Elektroforese

DMSO

dimethylsulfoxide

DNA

Deoxyribonucleïnezuur

dsDNA

dubbelstrengig DNA

ssDNA

enkelstrengig DNA

HBOC

Hereditary Breast and Ovarian Cancer

HRM

High Resolution Melting

HRMCA

High Resolution Melting Curve Analysis

mRNA

messenger RNA

NF1

Neurofibromatose type 1

NIH

National Institute of Health

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleïnezuur

SNP

Single Nucleotide Polymorphism

Ta

annealing temperatuur

TBE

Tris Borate EDTA

TSG

tumorsuppressorgen

UV

ultraviolet

4


Verklarende woordenlijst Amplicon

een klein DNA-fragment dat wordt bekomen door de binding van primers aan de DNA-strengen. Na PCR verkrijgt men kleinere DNA-fragmenten of amplicons.

Genotyperen

het bepalen van het genetisch patroon van een organisme

Hybridisatie

het samenvoegen van twee enkele complementaire DNAstrengen tot een dubbele helix

Primerdimeren

bijproducten ontstaan door binding tussen de primers onderling

Pseudogen

kopie van een functioneel gen dat door bepaalde structurele veranderingen geen (functioneel) eiwit meer produceert

Sequeneren

het nagaan van de basenvolgorde in het DNA

Tumorsuppressorgen

een gen dat onbeperkte deling van de cel voorkomt, en daarmee het ontstaan van een tumor verhindert

5


Lijst van figuren en tabellen Figuren Figuur 2.1 links: vader is drager van een afwijkend gen (pijl) ...........................................19 Figuur 2.2 links: plaats van het BRCA1 gen op chromosoom 17 (gele pijl) [2]..................19 Figuur 2.3 links: de plaats van het BRCA2 gen op chromosoom 13 (gele pijl) [3].............20 Figuur 2.4 Knudson's 2 hit model voor tumorontwikkeling [33] .........................................21 Figuur 2.5 links: Plexiforme neurofibroom ........................................................................22 Figuur 2.6 voorstelling van het NF1 gen...........................................................................24 Figuur 2.7 SNP: „single nucleotide polymorphism‟ [14].....................................................25 Figuur 2.8 nonsense mutatie [44] .....................................................................................26 Figuur 2.9 missense mutatie [44] .....................................................................................26 Figuur 2.10 links: insertie .................................................................................................27 Figuur 2.11 links: wild-type...............................................................................................27 Figuur 2.12 splice-site mutaties [38].................................................................................28 Figuur 2.13 links: niet-homologe crossing-over [18] .........................................................29 Figuur 2.14 DGGE proces [5]...........................................................................................30 Figuur 2.15 DNA-sequenering volgens de methode van Sanger [39] ...............................32 Figuur 2.16 resultaat automatische DNA-sequencing [10] ...............................................32 Figuur 2.17 links: SYBR Green gebonden op het dsDNA ................................................34 Figuur 2.18 verschil tussen SYBR Green en LCGreen Plus. SYBR Green detecteerd de heteroduplex in de heterozygote mutatie niet in tegenstelling tot LCGreen Plus. F508del regio is bij cystic fibrosis een voorbeeld van een heterozygote mutatie.[45]34 Figuur 2.19 genormaliseerde smeltcurve [20] ..................................................................35 Figuur 2.20 HRM analyse: difference plot. De verschillende genotypes worden van elkaar onderscheiden [17]...................................................................................................36 Figuur 2.21 asymmetrische PCR met een ongelabelde probe [28]...................................37 Figuur 3.1 PCR reactie [42]..............................................................................................40 Figuur 3.2 principe gelelektroforese .................................................................................47 Figuur 3.3 Lightscanner (Idaho technology Inc) [45] ........................................................49 Figuur 3.4 software Call-IT – beginscherm.......................................................................50 Figuur 3.5 start run scherm ..............................................................................................51 Figuur 3.6 plate image – fluorescentiemeting van de wells ..............................................52

6


Figuur 3.7 aanmaken van een subset ..............................................................................53 Figuur 3.8 normaliseren van de smeltcurves ....................................................................54 Figuur 3.9 grouping ..........................................................................................................55 Figuur 3.10 difference curven ..........................................................................................55 Figuur 3.11 normaliseren van de curven ..........................................................................56 Figuur 3.12 grouping ........................................................................................................56 Figuur 4.1 gradiënt PCR BRCA1 fragment 11.8 en BRCA2 fragment 14.2 ......................59 Figuur 4.2 verschil in DNA-concentratie: links 50 ng/µL, rechts 100 ng/µL .......................60 Figuur 4.3 SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 8) ..............................................61 Figuur 4.4 SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 9) ..............................................61 Figuur 4.5 BRCA2 SNP c.7470 A>G ................................................................................62 Figuur 4.6 eindresultaat BRCA1 SNP c.562-34 C>T op een Ta van 53°C .......................62 Figuur 4.7 het effect van het aantal cycli in de PCR-reactie .............................................63 Figuur 4.8 het effect van DMSO op BRCA1 c.562-34 C>T...............................................63 Figuur 4.9 verschil in resultaat tussen verschillende ampliconlengtes ..............................64 Figuur 4.10 resultaat blinde test BRCA2 c.7470 A>G ......................................................65 Figuur 4.11 resultaat blinde test BRCA1 c.2201 C>T .......................................................65 Figuur 4.12 resultaat blinde test BRCA1 c.562-34 C>T ....................................................65 Figuur 4.13 controle van de specificiteit van vijf NF1 fragmenten met positieve en negatieve controles ..................................................................................................67 Figuur 4.14 resultaat LightScanner PCR55 ......................................................................69 Figuur 4.15 positief resultaat na PCR55 voor exon 2 .......................................................70 Figuur 4.16 sequentiedeel exon 2 verkregen na sequenering ..........................................71 Figuur 4.17 resultaat met een plat profiel (exon 34) .........................................................72 Figuur 4.18 profiel met een afwijkende curve (exon 28) ...................................................73 Figuur 4.19 positief resultaat waarvoor geen mooie piek verkregen is .............................73 Figuur 5.1 nagaan van de cross-complementary tussen primers onderling en tussen primers en probe ......................................................................................................75 Figuur 5.2 aanwezigheid van een aspecificiteit in SNP c.562-34 C>T ..............................76 Figuur 5.3 twee SNP‟s onder één probe ..........................................................................77

7


Tabellen Tabel 2.1 diagnostische criteria voor erfelijke borstkanker ...............................................17 Tabel 2.2 diagnostische criteria voor familiale borstkanker ..............................................18 Tabel 2.3 diagnostische criteria voor NF1 volgens NIH (National Institute of Health) .......22 Tabel 3.1 probes BRCA1/2 ..............................................................................................41 Tabel 3.2 primers BRCA1/2 .............................................................................................41 Tabel 3.3 mastermix asymmetrische PCR met een totaal volume van 15 µL ...................43 Tabel 3.4 mastermix gradiënt PCR met een totaal volume van 25 µL ..............................43 Tabel 3.5 mastermix PCR met heteroduplex stap met een totaal volume van 25 µL ........44 Tabel 3.6 basisprogramma (PROBE) asymmetrische PCR..............................................45 Tabel 3.7 PCR programma NF1_grad .............................................................................45 Tabel 3.8 PCR programma NF1_HD ...............................................................................46 Tabel 4.1 protocol genotypering van BRCA1/2 SNP‟s met behulp van ongelabelde probes ........................................................................................................................................60 Tabel 4.2 condities NF1 voor een totaal volume van 25 µL ..............................................68 Tabel 4.3 primerdimeren ..................................................................................................68 Tabel 4.4 resultaat agarosegel PCR55 ............................................................................69

Grafiek Grafiek 2.1 aantal vrouwelijke borstkankerpatiënten per leeftijdscategorie in België in 2003 (gegevens www.kankerregister.com) [17] ........................................................................16

8


Inhoudsopgave Woord vooraf .................................................................................................................. 1 Samenvatting .................................................................................................................. 2 Lijst met afkortingen en symbolen ................................................................................ 4 Verklarende woordenlijst ............................................................................................... 5 Lijst van figuren en tabellen........................................................................................... 6 Inhoudsopgave ............................................................................................................... 9 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................13

1.1

Situering .............................................................................................................13

1.2

Inleiding .............................................................................................................13

1.3

Doelstelling ........................................................................................................14

2

Literatuurstudie ................................................................................................15

2.1

Borstkanker ........................................................................................................15

2.1.1

Incidentie............................................................................................................15

2.1.2

Risicofactoren ....................................................................................................15

2.1.2.1 Geslacht .............................................................................................................15 2.1.2.2 Leeftijd ...............................................................................................................15 2.1.2.3 Gynaecologische of hormonale invloeden ..........................................................16 2.1.2.4 Geologie, leefstijl en omgeving ...........................................................................16 2.1.2.5 Familiale voorgeschiedenis ................................................................................16 2.1.3

Genetische gevoeligheid voor borstkanker .........................................................17

2.1.3.1 Erfelijk borstkankersyndroom .............................................................................17 2.1.3.2 Familiaal borstkankersyndroom..........................................................................17 2.1.4

BRCA1/BRCA2 ..................................................................................................18

2.1.4.1 Inleiding .............................................................................................................18 2.1.4.2 BRCA1 ...............................................................................................................19 2.1.4.3 BRCA2 ...............................................................................................................20 2.1.5

BRCA1/BRCA2 als tumorsuppressorgenen .......................................................20

2.2

Neurofibromatose type 1 ....................................................................................21

2.2.1

Klinische aspecten en diagnostische criteria ......................................................21

9


2.2.2

Neurofibromen ...................................................................................................23

2.2.3

De genetische aspecten van het NF1 gen ..........................................................23

2.3

Mutaties .............................................................................................................24

2.3.1

Inleiding .............................................................................................................24

2.3.2

Puntmutaties ......................................................................................................25

2.3.2.1 Nonsense mutatie ..............................................................................................25 2.3.2.2 Missense mutatie ...............................................................................................26 2.3.2.3 Inserties en deleties ...........................................................................................26 2.3.2.4 Silent mutatie/substitutie ....................................................................................27 2.3.2.5 Splice-site mutatie ..............................................................................................28 2.3.2.6 Duplicatie/grote deleties .....................................................................................28 2.3.3

Mutatiedetectietechnieken ..................................................................................29

2.3.3.1 Denaturerende gradiënt gel elektroforese (DGGE).............................................29 2.3.3.2 DNA-sequenering...............................................................................................31 2.4

High resolution melting curve analysis (HRMCA) ...............................................33

2.4.1

LCGreen Plus ....................................................................................................33

2.4.2

Mutatiedetectie met HRMCA ..............................................................................34

2.4.3

Genotypering met ongelabelde probes...............................................................36

3

Materialen en methoden ..................................................................................39

3.1

Polymerase chain reaction .................................................................................39

3.1.1

Principe ..............................................................................................................39

3.1.1.1 PCR ...................................................................................................................39 3.1.1.2 Asymmetrische PCR ..........................................................................................40 3.1.1.3 Gradiënt PCR .....................................................................................................40 3.1.2

Materiaal ............................................................................................................40

3.1.3

Methode .............................................................................................................42

3.1.3.1 PCR voorbereiding .............................................................................................42 3.1.3.2 PCR uitvoering ...................................................................................................44 3.2

Agarosegelelektroforese ....................................................................................46

3.2.1

Principe ..............................................................................................................46

3.2.2

Materiaal ............................................................................................................47

3.2.3

Methode .............................................................................................................48

10


3.2.3.1 Gieten van de gel ...............................................................................................48 3.2.3.2 Voorbereiden van de stalen en het laden van de gel ..........................................48 3.3

LightScanner ......................................................................................................48

3.3.1

Voorbereiding mutatiedetectie en genotypering met behulp van ongelabelde probes op de LightScanner ................................................................................49

3.3.2

Loopprogramma LightScanner ...........................................................................50

3.3.3

Analyse ..............................................................................................................52

3.3.3.1 Voorbereidend werk analyse ..............................................................................52 3.3.3.2 Verdere analyse mutatiedetectie ........................................................................54 3.3.3.3 Analyse genotypering met behulp van ongelabelde probes................................55 3.3.4

Materiaal ............................................................................................................57

4

Resultaten.........................................................................................................58

4.1

Genotypering van frequente BRCA1/2 SNP‟s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner ............................................................58

4.1.1

Voorbereidende gradiënt ....................................................................................58

4.1.2

Genotypering met behulp van HRMCA en ongelabelde probes..........................59

4.1.2.1 Conditiebepaling ................................................................................................59 4.1.2.2 Hoeveelheid DNA...............................................................................................60 4.1.2.3 Annealing temperatuur .......................................................................................61 4.1.2.4 Aantal cycli .........................................................................................................62 4.1.2.5 DMSO ................................................................................................................63 4.1.2.6 Primers ..............................................................................................................64 4.1.3

Blinde screening.................................................................................................64

4.2

Mutatiescreening van het NF1 gen .....................................................................66

4.2.1

Voorbereidende testen .......................................................................................66

4.2.2

Conditiebepaling ................................................................................................67

4.2.3

Primerdimeren ...................................................................................................68

4.2.4

PCR 55 ..............................................................................................................69

4.2.5

Sequeneren .......................................................................................................69

4.2.6

Opsplitsen exon en/of nieuwe primers................................................................72

4.2.7

Gradiënt PCR .....................................................................................................73

5

Discussie ..........................................................................................................74

11


5.1

Genotypering van frequente BRCA1/2 SNP‟s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner ............................................................74

5.2

Mutatiescanning van het NF1 gen ......................................................................77

6

Conclusie ..........................................................................................................79

Literatuurlijst ..................................................................................................................80 Bijlagen...........................................................................................................................85 Bijlage 1 – Resultaten PCR55 (LightScanner en agarosegel) ..........................................85 Colofon ...........................................................................................................................88 Voor akkoord verklaring ................................................................................................89

12


1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

1.1

Situering

Het Centrum Medische Genetica Gent (CMGG) maakt deel uit van het Universitair Ziekenhuis Gent. Het vertegenwoordigt één van de acht genetische centra in België waar erfelijkheidsonderzoek wordt uitgevoerd. In haar werking worden drie grote opdrachten onderscheiden. In de eerste plaats vervult het CMGG een dienstverlenende rol voor patiënten of personen met vragen rond erfelijkheid. Een tweede opdracht is het uitvoeren van wetenschappelijk onderzoek. Een derde opdracht is het geven van onderwijs. De professoren en stafleden werkzaam op het CMGG geven les aan studenten uit verschillende faculteiten. Het CMGG staat onder leiding van Professor Dr. A. De Paepe. In het CMGG zijn twee verschillende labo afdelingen aanwezig. Er is het labo Cytogenetica dat zowel het cytogenetisch als het moleculair cytogenetisch onderzoekswerk uitvoert, in diagnostisch en onderzoeksverband. En er is het labo Moleculaire Genetica, opgesplitst in het DNA- en het bindweefsel-labo. Het DNA-labo verzorgt de moleculaire diagnostiek van erfelijke aandoeningen als mucoviscidose, fragiele X-syndroom, ziekte van huntington, enzovoort en er gebeurt onderzoek

naar

oftalmogenetische

onder

andere

aandoeningen.

bindweefselaandoeningen

en

erfelijke Het

voert

en

familiale

bindweefsel-labo onderzoek

uit

kankersyndromen

verzorgt

naar

de

erfelijk

en

moleculaire bindweefsel-,

cardiovasculaire en skeletale aandoeningen.

1.2

Inleiding

Borstkanker is een aandoening veroorzaakt door genetische en niet-genetische factoren en is tevens de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen. NF1 is een autosomale dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. De aandoening heeft een variabele expressie en wordt uiterlijk gekenmerkt door pigment abnormaliteiten. De genen geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker worden gescreend door middel van High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA). HRMCA is een techniek

13


gebaseerd op analyse van het smeltprofiel dat ontstaat bij het uiteensmelten van DNA. Door middel van mutatiescanning kunnen patiënten met een verhoogd risico geïdentificeerd worden. De methode gebeurt op de LightScanner en maakt gebruik van een fluorescente verzadigde kleurstof (LCGreen Plus) die na smelten een specifieke smeltcurve weergeeft. Het NF1 gen wordt gescreend door middel van directe sequenering op cDNA niveau. Deze methode is tijdrovend en arbeidsintensief.

1.3

Doelstelling

In het kader van erfelijk en familiaal borstkankeronderzoek wordt in het CMGG mutatiedetectie van de BRCA1/2 genen uitgevoerd met behulp van High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA). Door het polymorf karakter van deze genen dient er nog steeds een groot aantal variaties gesequeneerd te worden. In het CMGG gebeurt momenteel mutatie onderzoek van het NF1 gen door sequenering op cDNA niveau. Deze methode is echter tijdrovend en arbeidsintensief. De algemene doelstelling van deze thesis is de optimalisatie van twee HRMCA toepassingen, namelijk de genotypering met behulp van ongelabelde probes voor de karakterisatie van frequente BRCA1/2 SNP‟s en de mutatiescanning van het NF1 gen.

14

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNPs en mutatiescanning van het NF1 gen literatuurstudie

2

Literatuurstudie

2.1

Borstkanker

2.1.1

Incidentie

Borstkanker is in vele Westerse landen, na hart- en vaatziekten, de grootste doodsoorzaak bij vrouwen tussen de 30 en 55 jaar [15]. Het is één van de meest voorkomende vormen van kanker bij vrouwen [47]. In België worden ongeveer ieder jaar 8000 à 9000 vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker. Het risico om borstkanker te ontwikkelen in België bedraagt voor vrouwen één op acht. Borstkanker komt in mindere mate ook voor bij mannen (ongeveer 80 patiënten per jaar). Van alle borstkankerpatiënten vertegenwoordigen mannen dan ook slechts 1% [5].

2.1.2

Risicofactoren

Borstkanker is een ziekte waarbij meerdere factoren een rol spelen, het is het resultaat van een interactie tussen omgevings- en genetische factoren. 2.1.2.1 Geslacht Een belangrijke risicofactor om borstkanker te ontwikkelen is het geslacht. De kans dat de ziekte zich manifesteert is 100 keer groter bij vrouwen dan bij mannen [34]. Vrouwen hebben meer borstweefsel en dus een hoger risico. Ook hormonale factoren spelen een rol. Oestrogenen stimuleren de ontwikkeling van borstkankercellen [5,44]. 2.1.2.2 Leeftijd Het risico op borstkanker stijgt met de leeftijd. Oudere vrouwen zijn in de loop der jaren meer blootgesteld aan risicoverhogende factoren dan jonge vrouwen. Vrouwen tussen de 50 en 59 jaar vormen de grootste risicogroep, zij vertegenwoordigen 70% van alle borstkankerpatiënten [15]. Slechts 0,3% van de borstkankerpatiënten komen voor tussen de leeftijd van 20 en 29 jaar (een overzicht wordt weergegeven in grafiek 2.1) [5,32].

15

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen literatuurstudie

Aantal

10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80+

5 160 906 2116 2327 1948 1271 320

Aantal borstkankerpatiënten per leeftijdscategorie in België in 2003 2500 2000

aantal

Leeftijd

1500 1000 500 0 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79

80+

leeftijd

Grafiek 2.1 aantal vrouwelijke borstkankerpatiënten per leeftijdscategorie in België in 2003 (gegevens www.kankerregister.com) [19]

2.1.2.3 Gynaecologische of hormonale invloeden Een verlengde blootstelling aan oestrogenen verhoogt het risico op borstkanker. Dit kan te wijten zijn aan een eerste vroege menstruatie (voor twaalf jaar), een late menopauze (na 50 jaar), een oestrogeenvervangende therapie, het kinderloos blijven of een eerste late zwangerschap (na 30 jaar) [5,32]. Borstvoeding geven kan een beschermend effect hebben tegen premenopauzale borstkanker. Bij vrouwen die vier tot twaalf maanden borstvoeding geven is er een risicovermindering van 22%. Het risico daalt naarmate vrouwen op jongere leeftijd borstvoeding geven [7]. 2.1.2.4 Geologie, leefstijl en omgeving Borstkanker komt het meest frequent voor in landen en regio‟s met een hoge graad van industrialisatie. In geïndustrialiseerde landen is er een verhoogde blootstelling aan carcinogenen en aan bestraling. Deze vergelijking is ook treffend voor Vlaanderen (184 op 100000 inwoners in 2003) en Wallonië (153 op 100000 inwoners in 2003) [19]. De leefstijl kan een groot risico vormen. Zwaarlijvigheid, verhoogde alcoholconsumptie en lage fysische arbeid kunnen het risico op borstkanker verhogen [5,32,44]. 2.1.2.5 Familiale voorgeschiedenis De familiale voorgeschiedenis voor borstkanker is één van de meest significante risicofactoren. Van alle vrouwen met borstkanker hebben er 15% een familiale voorgeschiedenis waarbij in een significant percentage een genetische afwijking kan gedetecteerd worden [16].

16


Het risico is afhankelijk van een aantal familiale factoren. Het risico wordt bepaald aan de hand van volgende factoren: graad van verwantschap tot de familieleden die getroffen zijn door borstkanker, het aantal familieleden met borstkanker, de leeftijd waarop borstkanker bij de familieleden is vastgesteld of bilaterale borstkanker bij een familielid [5].

2.1.3

Genetische gevoeligheid voor borstkanker

Ongeveer 80% van de borstkankers is sporadisch. Sporadisch betekent dat er in de familie geen verhoogd voorkomen van borstkanker is [16]. Sporadische kankers zijn het gevolg van een accumulatie van verschillende mutaties in verschillende genen. Deze mutaties komen toevallig voor in de lichaamscellen van de patiënt of onder invloed van externe factoren [26]. In 5-10% van alle borstkankerpatiënten kan een genetische oorzaak worden aangetoond [34]. De genetische gevoeligheid is één van de belangrijkste en meest bestudeerde risicofactoren. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen familiale en erfelijke borstkanker, respectievelijk geassocieerd met een minder sterk en een sterk verhoogd risico. 2.1.3.1 Erfelijk borstkankersyndroom Erfelijke borstkanker vertegenwoordigt 5-8 % van alle borstkankers [47]. Het

overervingspatroon

voor

borstkanker

is

autosomaal

dominant.

Deze

borstkankerpatiënten hebben tevens een verhoogd risico voor ovariumkanker [5]. De diagnostische criteria voor het erfelijke borstkanker en/of ovariumkanker syndroom worden beschreven in tabel 2.1. Tabel 2.1 diagnostische criteria voor erfelijke borstkanker

Erfelijke borst- en/of ovariumkanker (HBOC) Diagnose van borst- en/of ovariumkanker in: 1. ten minste drie eerste graads verwanten 2. ten minste twee opeenvolgende generaties 3. ten minste één patiënt gediagnosticeerd voor de leeftijd van 50 2.1.3.2 Familiaal borstkankersyndroom Deze groep omvat ongeveer 15% van alle borstkankers. Bij deze families komt borstkanker vaker voor en op jongere leeftijd vergeleken met de normale populatie. In de stamboom wordt geen duidelijk overervingspatroon teruggevonden. In 20-30% van de

17


families komt een BRCA-mutatie voor, vaak in kleine families of waar de overerving gebeurt via de mannelijke verwanten [5]. De diagnostische criteria voor familiale borstkanker worden vermeld in tabel 2.2. Tabel 2.2 diagnostische criteria voor familiale borstkanker

Familiale borstkanker Diagnose van borstkanker: 1. in ten minste twee eerste graads verwanten op jonge leeftijd 2. bij families die niet aan de criteria voor HBOC voldoen

2.1.4

BRCA1/BRCA2

2.1.4.1 Inleiding Tot nu toe zijn twee genen (BRCA1 en BRCA2) gekend die bij defect verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van borstkanker [34]. Ze zijn verantwoordelijk voor een klein percentage van alle borstkankers, maar voor 70-80% van alle erfelijke borstkankers. Personen die drager zijn van zo‟n mutatie hebben een sterk verhoogd risico op de ontwikkeling van borstkanker. Vrouwen met een defect gen hebben 55-85% kans om borstkanker te ontwikkelen en 15-65% om ovariumkanker te ontwikkelen voor de leeftijd van 70 jaar. Mannen die drager zijn van een aangetast gen hebben een verhoogde kans op borst- en prostaatkanker. De kans dat een man borstkanker ontwikkelt is kleiner dan 5%, maar hij kan wel de mutatie overdragen naar de volgende generatie. Bij iedere zwangerschap, waarbij één van de ouders drager is van een mutatie, is de kans 50% dat deze mutatie wordt overgeërfd. Het afwijkende gen kan zowel van de moeder als van de vader geërfd worden (figuur 2.1)[5].

18


Figuur 2.1

links: vader is drager van een afwijkend gen (pijl) rechts: moeder is drager van een afwijkend gen (pijl) onder: de kans op een afwijkend gen bij de kinderen is 50% [12]

2.1.4.2 BRCA1 BRCA1 is gelokaliseerd in het jaar 1990 en geïsoleerd in het jaar 1994. BRCA1 is gelegen op de lange arm van chromosoom zeventien op chromosoomband 21 (17q21). Chromosoom zeventien wordt weergegeven in figuur 2.2. Meer precies, het gen is gelokaliseerd van bp 38.449.840 tot bp 38.530.994 (www.ensembl.org).

Figuur 2.2

links: plaats van het BRCA1 gen op chromosoom 17 (gele pijl) [2] rechts: BRCA1 mutaties in de Belgische en Nederlandse populatie [1]

BRCA1 is opgebouwd uit 24 exonen, waarvan twee exonen niet-coderend zijn (1A en 1B). Het eerste coderende exon is exon twee. Exon vier is een ingevoegd niet-coderend repetitief Alu element. De Alu insertie leidt tot de introductie van een voortijdig stopcodon.

19


Exon elf is het grootste en vertegenwoordigt bijna 60% van de totale coderende sequentie [1,2,5]. 2.1.4.3 BRCA2 Het BRCA2 gen werd gelokaliseerd in het jaar 1994 en één jaar later volledig gekarakteriseerd. Het BRCA2 gen is gelegen op de lange arm van chromosoom dertien, op plaats 12.3 (13q12.3, figuur 2.3). Om precies te zijn, het gen is gelegen van bp 31.787.617 tot bp 31.871.809 (www.ensembl.org).

Figuur 2.3

links: de plaats van het BRCA2 gen op chromosoom 13 (gele pijl) [3] rechts: BRCA2 mutaties in de Belgische en Nederlandse populatie [1]

BRCA2 is opgebouwd uit 27 exonen. Van de 27 exonen zijn er 26 coderend. Er zijn twee grote exonen, exon tien en elf. Exon elf is het grootste exon. Het codeert voor bijna 50% van het totale eiwit. Samen met exon tien coderen beide exonen voor 60% van het gen [1,3,5].

2.1.5

BRCA1/BRCA2 als tumorsuppressorgenen

Beide genen zijn tumorsuppressorgenen (TSG). Een verhoogde expressie van de BRCA proteïnen in tumorcellijnen inhibeert de celgroei en de celdeling [26]. Knudson veronderstelde dat tumorgoei verkregen wordt als er schade voorkomt aan de functie van beide allelen. Bij erfelijke borstkankerpatiënten wordt bij één allel van het TSG een mutatie overgeërfd via paternale of maternale transmissie tijdens de conceptie (kiemlijn mutatie = “first hit”). Als resultaat dragen alle ontwikkelde cellen in de zygote een mutante

20


kopij. Om effectief kanker te ontwikkelen, moet ten minste één cel een “second hit” verkrijgen (somatische mutatie). Deze “second hit” is een beschadiging van het overblijvende wild-type allel. Het kan een tweede mutatie zijn of een intragenische deletie. Het individu heeft een hoger risico om kanker te ontwikkelen in vergelijking met individuen zonder kiembaanmutatie. In de sporadische vorm van kanker moeten immers beide hits voorkomen op het somatische niveau. De kans dat beide hits gebeuren in dezelfde cel is lager dan wanneer alle cellen al een kiembaanmutatie dragen [5]. De hypothese van Knudson wordt weergegeven in figuur 2.4.

Figuur 2.4 Knudson's 2 hit model voor tumorontwikkeling [33]

2.2

Neurofibromatose type 1

2.2.1

Klinische aspecten en diagnostische criteria

Neurofibromatose type 1 (NF1), beter gekend als Von Recklinghausen neurofibromatose, is een autosomale dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. Wereldwijd komt deze aandoening voor bij één op 3500 individuen.

21


De aandoening heeft een variabele expressie, verschillen worden gezien tussen families, binnen families en zelfs tussen verschillende lichaamsdelen van een NF1 patiënt. De meest voorkomende kenmerken zijn pigment abnormaliteiten (café-au-lait vlekken (figuur 5), sproeten en Lisch nodulen) en/of de vorming van tumoren of neurofibromen [25,35,41]. De diagnose NF1 wordt gesteld wanneer patiënten aan twee of meer van de volgende criteria voldoen (tabel 2.3): Tabel 2.3 diagnostische criteria voor NF1 volgens NIH (National Institute of Health)

NF1 is aanwezig in een patiënt met twee of meer van volgende kenmerken zes of meer café-au-lait plekken > 5 mm in grootste diameter bij prepuberale individuen en > 15 mm in grootste diameter bij postpuberale individuen twee of meer neurofibromen van eender welk type of één plexiform neurofibroom Sproeten in de oksel- of liesstreek Optisch glioom twee of meer Lisch noduli Een karakteristiek beenderletsel, zoals wiggebeen dysplasie of uitdunning van de cortex van de lange beenderen met of zonder pseudoarthrose Een eerste graad verwant met NF1

Figuur 2.5

links: Plexiforme neurofibroom rechts: café-au-lait spots [31]

22


2.2.2

Neurofibromen

Het best gekende kenmerk van NF1 zijn neurofibromen. Dit zijn complexe goedaardige tumoren bestaande uit meerdere celtypes (Schwanncellen, mastcellen, fibroblasten, ...). Deze tumoren kunnen ontstaan in de mantel van de perifere zenuwen van zowel kleine als grote zenuwen. Één enkele tumor kan ontstaan in ieder „niet-NF1‟ individu, meerdere tumoren zijn kenmerkend voor NF1. Bij de meeste patiënten zijn geen neurofibromen aanwezig bij de geboorte. Ze verschijnen voor het eerst rond de puberteit. Bij vrouwelijke patiënten stijgt het aantal en de grootte van de neurofibromen tijdens de zwangerschap. De neurofibromen kunnen onderverdeeld worden in twee grote types: de discrete neurofibromen (cutaan en subcutaan) en de plexiforme neurofibromen. De cutane neurofibromen zijn vlezige, zachte knobbeltjes met een roze-roodachtige kleur. Ze kunnen ongemakken en jeuk veroorzaken en komen meestal voor op plaatsen waar er een hogere huidtemperatuur is. De subcutane neurofibromen zijn vaster en eivormig. Ze komen voor in dieper gelegen weefsels van het lichaam. Plexiforme neurofibromen groeien langs de lengte van de zenuw. Het zijn traaggroeiende tumoren die kunnen ontstaan in verschillende delen van het lichaam. De tumor kan zeer groot worden en effect hebben op een volledig lichaamsdeel (figuur 2.5) [25,35,41].

2.2.3

De genetische aspecten van het NF1 gen

Het NF1 gen is geïdentificeerd in het jaar 1990. Het is gelokaliseerd op chromosoomplaats 17q11.2. Van de start- tot het stopcodon is de lengte van het gen 278861 bp. Het gen is opgebouwd uit 60 exonen (figuur 2.6).

23


Figuur 2.6 voorstelling van het NF1 gen De transcriptie startplaats is aangeduid door het pijltje. De asterix geeft de plaats weer van de mRNA processing [32].

Meerdere NF1-gerelateerde sequenties komen voor als pseudogenen. Er wordt verondersteld dat de pseudogenen ontstaan uit een duplicatie en transpositie van het NF1 locus. Het NF1 gen codeert voor het proteïne neurofibromine. NF1 heeft één van de hoogste mutatiesnelheden in de menselijke genen. De helft van de NF1 patiënten zijn sporadisch, ze hebben geen familiale voorgeschiedenis voor NF1. Mutatie analyse is niet eenvoudig vanwege de grootte van het gen en het voorkomen van pseudogenen. Bovendien komen alle types van mutaties voor, verspreid over het volledige NF1 gen [25,35,41].

2.3

Mutaties

2.3.1

Inleiding

Mutaties zijn veranderingen die voorkomen in het erfelijk materiaal. Zij zorgen er voor dat er variatie in fenotype bestaat, waarop de natuur kan selecteren. Polymorfismen zijn genetische varianten die niet geassocieerd zijn met een fenotype. Ze zijn neutraal of onschadelijk [40]. Variaties die betrekking hebben op één nucleotide worden „single nucleotide polymorfismen‟ of SNP‟s genoemd (figuur 2.7)[13].

24


Figuur 2.7 SNP: ‘single nucleotide polymorphism’ [14]

Veel mutaties hebben geen of weinig invloed bij overerving omdat ze enkel voorkomen in de lichaamscellen, de zogenaamde somatische mutaties. Deze mutaties zijn niet erfelijk. Kiembaanmutaties die voorkomen in de geslachtscellen kunnen wel erfelijk zijn en zijn daarom van belang in erfelijke aandoeningen en evolutionaire processen. Kanker kan ontstaan door een opeenhoping van mutaties in genen met regulerende functies. Er ontstaat een ongeremde celdeling, waarbij de kans op nieuwe mutaties groter wordt. Daardoor kunnen kankercellen meer agressieve eigenschappen krijgen [30].

2.3.2

Puntmutaties

Puntmutaties zijn kleinschalige mutaties die een verandering met zich meebrengen op genniveau. Ze veroorzaken een verandering in de basensamenstelling van het DNA. Substituties, deleties en inserties zijn puntmutaties die kunnen leiden tot een nonsense mutatie, missense mutatie, frameshift mutatie, splice-site mutatie, silent mutatie, …[30]. Men vermoedt dat puntmutaties veroorzaakt worden door de achtergrondstraling waaraan ieder organisme is blootgesteld [29]. 2.3.2.1 Nonsense mutatie Een nonsense mutatie is een basenpaarsubstitutie die optreedt in het coderend deel van het gen. Bij een nonsense mutatie is het nieuw gevormde codon, door de mutatie, een stopcodon. Dit stopcodon zorgt voor een vroegtijdig stoppen van het translatieproces en bijgevolg voor de vorming van een foutief eiwit (zie figuur 2.8) [44].

25


Figuur 2.8 nonsense mutatie [44]

2.3.2.2 Missense mutatie Een missense mutatie resulteert in de substitutie van één aminozuur in een ander aminozuur op die plaats, wat kan leiden tot het slecht functioneren van het eiwit (figuur 2.9)[44].

Figuur 2.9 missense mutatie [44]

2.3.2.3 Inserties en deleties Een insertie/deletie verandert het aantal DNA basen in een gen door een stuk DNA toe te voegen/te verwijderen (figuur 2.10). Het stuk DNA kan uit één of meerdere basen bestaan. Vanaf die plaats kan een frameshift mutatie ontstaan wanneer er geen veelvoud van drie nucleotiden geïnsereerd/gedeleteerd wordt. Een frameshift mutatie verandert het „reading frame‟ van een gen. Een „reading frame‟ bestaat uit drie gegroepeerde basen die coderen voor een aminozuur. Een frameshift mutatie verschuift de groepering van deze

26


basen waardoor de code voor de aminozuren verandert. Het proteïne gecodeerd door het gen zal niet of minder goed functioneren [44].

Figuur 2.10

links: insertie rechts: deletie [44]

2.3.2.4 Silent mutatie/substitutie Een silent mutatie veranderd de DNA-sequentie, maar heeft geen schijnbaar effect op het fenotype of de functie (figuur 2.11) [36].

Figuur 2.11

links: wild-type rechts: silent mutatie

27


Op plaats 43 worden de A en T gewijzigd in een C en G. Deze baseverandering heeft geen effect op het aminozuur dat gevormd wordt. Het gevormde aminozuur blijft threonine. Daarom wordt dit een silent mutatie genoemd, vanwege de ondetecteerbare verandering op eiwitniveau. [6]

2.3.2.5 Splice-site mutatie Voordat het mRNA de kern verlaat, worden de intronen verwijderd en komen de exonen tegen elkaar te liggen. Dit wordt splicing genoemd. Splicing wordt gecontroleerd door specifieke intronsequenties, de splice-acceptor en splice-donor sequenties. Deze sequenties komen voor aan de uiteinden van de coderende regios (exonen), in de noncoding regios (intronen) (figuur 2.12). Mutaties in deze sequenties kunnen leiden tot de retentie van grote segmenten intronisch DNA of tot de verwijdering van hele exonen uit het mRNA. Deze veranderingen kunnen intense effecten hebben op het resulterende proteïne [38].

Splice-site mutations

Figuur 2.12 splice-site mutaties [38]

2.3.2.6 Duplicatie/grote deleties Een duplicatie is een stuk DNA dat één of meerdere keren gekopieerd wordt. De verdubbeling gebeurt bij de replicatie. Het kan het resultaat zijn van ongelijke overkruising door

verkeerde

paring

en

uitwisseling

van

DNA

tussen

niet-homologe

chromosoomsequenties (figuur 2.13 links). Grote deleties overspannen verschillende exonen van een gen, een volledig gen of zelfs verschillende buurgenen [44].

28


Figuur 2.13

links: niet-homologe crossing-over [18] rechts: duplicatie [44]

2.3.3

Mutatiedetectietechnieken

2.3.3.1 Denaturerende gradiënt gel elektroforese (DGGE) Het principe van DGGE is de scheiding van een PCR amplicon volgens denaturerende elektroforese. Er wordt gebruik gemaakt van een poly-acrylamide gel die een denaturerende stof bevat (vaak ureum en formamide). De PCR wordt uitgevoerd met specifieke, universele primers op de constante regio‟s. Één van de primers bevat een lange keten van G‟s en C‟s na elkaar (GC-klem). De GC-klem zorgt ervoor dat er geen volledige denaturatie kan plaatsvinden. De GC-staart is heel stabiel in het denaturant, door de onderlinge binding van beide basen met drie waterstofbruggen. Wanneer dsDNA migreert in de denaturerende gradiënt zal op een bepaald punt het dsDNA enkelstrengig worden. De GC-klem houdt de twee strengen bij elkaar, er ontstaat een vorkstructuur die vastloopt in de matrix van de gel door de toenemende weerstand (figuur 2.14). Door toevoegen van een kleurstof (zoals ethidiumbromide) worden de fragmenten zichtbaar gemaakt in de gel na UV belichting.

29


Figuur 2.14 DGGE proces [5]

De herhaalde denaturatie en re-annealing van de DNA-strengen tijdens de PCR leidt tot de vorming van twee homoduplexe DNA-fragmenten en twee heteroduplexe DNAfragmenten. De thermostabiliteit van de heteroduplexen daalt bij de aanwezigheid van een base mismatch. De detectie van de DNA-fragmenten, de homozygoten, de varianten en de heterozygoten, is mogelijk op DGGE. De drie duplexen zijn goed van elkaar te onderscheiden.

30


DGGE is één van de meest gevoelige mutatiedetectietechnieken. De gevoeligheid gaat net niet tot 100%. DGGE werd gebruikt voor screening van onder andere BRCA1/BRCA2 [5,43]. 2.3.3.2 DNA-sequenering DNA-sequenering is het bepalen van de basenvolgorde van een DNA-fragment. Er zijn verschillende methoden, maar de meest gebruikte is de methode van Sanger. De methode is gebaseerd op enzymatische aanmaak van één van de DNA-ketens waarvan de basenvolgorde bepaald moet worden. De methode maakt gebruik van een kort gelabelde primer, DNA-polymerase, vier verschillende nucleotidebouwstenen (dATP, dTTP, dCTP en dGTP) en vier dideoxynucleotiden (ddATP, ddTTP, ddCTP en ddGTP). De primer hecht zich aan het 3‟ uiteinde en wordt verlengd. De bouwstenen worden door het DNA-polymerase in de keten ingebouwd volgens complementariteit aan de onbekende streng. Wordt er een dideoxynucleotide ingebouwd, dan wordt de aanmaak van de streng gestopt. Op deze manier ontstaan gelabelde fragmenten met een verschillende lengte. Manueel worden de reactieproducten naast elkaar in een gel op lengte gescheiden en zichtbaar gemaakt. De basenvolgorde van de complementaire streng kan afgelezen worden. De kleinste fragmenten lopen het verst op de gel en vormen het 5‟-uiteinde van de complementaire streng en het 3‟-uiteinde van het onbekende DNA-fragment (figuur 2.15).

31


Figuur 2.15 DNA-sequenering volgens de methode van Sanger [39]

De methode van Sanger leent zich goed voor automatisatie. De polymerasereacties verlopen

identiek

als

bij

de

manuele

methode,

uitgezonderd

dat

de

vier

dideoxynucleotiden elk gelabeld zijn met een andere fluorescerende molecule. Ze vertonen een verschillende kleur nadat ze met behulp van licht geëxciteerd worden. Alle reacties worden in één reactiemengsel uitgevoerd. De fragmenten worden gescheiden volgens grootte. De banden zijn gekleurd volgens de laatst toegevoegde ddNTP (figuur 2.16). Aan de hand van de emissie van de golflengte en de migratietijd wordt de DNAsequentie bepaald [8]. DNA-sequencing heeft het voordeel dat met deze techniek gemakkelijk puntmutaties kunnen nagegaan worden. De volledige basenvolgorde van een exon/gen wordt bepaald. Het enige nadeel van de methode is de hoge kostprijs.

Figuur 2.16 resultaat automatische DNA-sequencing [10]

32


2.4

High resolution melting curve analysis (HRMCA)

High resolution melting curve analysis of HRMCA is een mutatiedetectietechniek gebruikt voor de detectie van sequentievariaties gebaseerd op heteroduplexe vorming [4]. De detectie gebeurt met behulp van de kleurstof LCGreen Plus®. Screening van heterozygote SNP‟s in producten tot 1000 bp heeft een gevoeligheid van 97% en een specificiteit van 99% [20,22]. Om een sensitiviteit van 100% te verkrijgen wordt aanbevolen om korte fragmenten (± 300 bp) te gebruiken.

2.4.1

LCGreen Plus

LCGreen Plus is een dsDNA-bindende, fluorescerende kleurstof. De kleurstof maakt homogene mutatiescanning en genotypering mogelijk, gebaseerd op de unieke eigenschap om heteroduplexen te detecteren tijdens smeltanalyse [4]. De kleurstof kan in de pre-PCR of post-PCR procedure worden toegevoegd. LCGreen Plus kleurstoffen zijn stabiel en hebben geen effect op het PCR-proces. De optimale excitatie en emissie van LCGreen Plus ligt respectievelijk bij 440-470 nm en 470-520 nm. Wanneer LCGreen Plus kleurstoffen toegevoegd worden aan het PCR product verhoogt dat de annealing temperatuur met 1-3°C. Als het dsDNA gebonden met LCGreen Plus, in verzadigde vorm, denaturatie ondergaat komt de LCGreen Plus vrij. Doordat LCGreen Plus over de volledige lengte van het dsDNA geïntercaleerd is, ontstaan er geen “openingen”. Indien er “openingen” gevormd worden, zoals bij het vroeger veel gebruikte SYBR Green®, zou de kleurstof bij denaturatie verspringen naar een “opening” in plaats van vrij te komen in het milieu (figuur 2.17) [45]. Dankzij de verzadigende eigenschap kunnen heteroduplexen worden gedetecteerd (figuur 2.18)[4]. Aan de hand van de hoeveelheid vrijgekomen fluorescentie, gemeten op een HRMCA toestel, kan een smeltcurve gegenereerd worden [21].

33


Figuur 2.17

links: SYBR Green gebonden op het dsDNA rechts: LCGreen Plus verzadigd en geïntercaleerd in het dsDNA Bij denaturatie komt LCGreen Plus vrij, waardoor de fluorescentie daalt. SYBR Green verplaatst zich naar een naburig gelegen vrije plaats op het dsDNA [45]

Figuur 2.18 verschil tussen SYBR Green en LCGreen Plus. SYBR Green detecteerd de heteroduplex in de heterozygote mutatie niet in tegenstelling tot LCGreen Plus. F508del regio is bij cystic fibrosis een voorbeeld van een heterozygote mutatie.[45]

2.4.2

Mutatiedetectie met HRMCA

Het principe van HRMCA steunt op de thermostabiliteit van een PCR product. Bij de PCR reactie wordt LCGreen Plus toegevoegd dat zich intercaleert in het dsDNA. De PCR amplicons worden dan onderworpen aan een stijgende temperatuur. HRMCA wordt toegepast op de daarvoor voorziene toestellen zoals de LightScanner™ (Idaho technology Inc), Gene Rotor (Corbett Lifescience), LightCycler® (Roche). Eerst wordt de temperatuurrange bepaald waarin de fluorescentie van het amplicon zal gemeten moeten worden. Eenmaal dit gebeurd is, kan de meting gestart worden. De

34


temperatuur stijgt met 0.1-0.3°C/s [20]. Naarmate de temperatuur stijgt, zal het dsDNA denatureren en uiteindelijk resulteren in twee enkele strengen DNA. LCGreen Plus komt vrij naarmate de temperatuur stijgt en naarmate de twee strengen uit elkaar gaan. Bij 100% fluorescentie is het amplicon volledig dubbelstrengig. Bij 0% fluorescentie is het DNA enkelstrengig [24]. Wanneer een amplicon een sequentievariatie (“een mismatch”) draagt, zullen de strengen op een lagere temperatuur uit elkaar gaan dan het homozygoot perfect gepaarde DNA. Voor elk amplicon wordt op deze manier een smeltcurve gegenereerd (figuur 2.19).

Figuur 2.19 genormaliseerde smeltcurve [20]

In de smeltcurve wordt de fluorescentie uitgezet ten opzichte van de temperatuur. Na de meting worden de curves genormaliseerd. Na de normalisatie kan men de homozygote duplexen, mutanten en wild types, en heterozygote duplexen goed van elkaar onderscheiden (figuur 2.20).

35


Figuur 2.20 HRMCA analyse: difference plot. De verschillende genotypes worden van elkaar onderscheiden [17].

2.4.3

Genotypering met ongelabelde probes

Genotypering met ongelabelde probes is een andere toepassing van HRMCA. De techniek is simpel, snel en kan de meeste SNP‟s genotyperen [22]. De methode vereist twee primers, een ongelabelde probe en een verzadigende kleurstof (LCGreen Plus). De PCR reactie verloopt asymmetrisch, één primer wordt in overmaat toegevoegd. Het principe van genotyperen wordt schematisch weergegeven in figuur 2.21.

36


Figuur 2.21 asymmetrische PCR met een ongelabelde probe [28]

Men kan kiezen ten opzichte van welke streng de probe komt te liggen. Als men kiest om de probe tegenover de “sense” streng te leggen, dan moet de primer in overmaat zorgen voor een vergrote hoeveelheid kopies van de “sense” streng. De probe is complementair met deze streng en is zo ontworpen dat hij hybridiseert met de regio waar de sequentievariatie zich bevindt. Het is deze regio die gegenotypeerd moet worden. De probe kan complementair aan de wild type sequentie of aan de “variante” sequentie ontworpen worden. Indien de probe past met de sequentievariant dan zal de mutante duplex perfect passen en de hoogste smelttemperatuur (temperatuur waarbij het dsDNA voor 50% gedenatureerd is) hebben. Heterozygote stalen hebben dan één mismatch, terwijl de wild type sequentie met twee mismatches de grootste destabilisatie van de probe tot gevolg heeft [4,20]. Er kunnen twee soorten duplexen gevormd worden:

37


heterozygote en homozygote duplexen. De homozygote duplexen zijn afkomstig van de variant of van het wild type. Na de asymmetrische PCR wordt een overmaat probeamplicon duplexen gevormd en een kleinere hoeveelheid amplicon duplexen [46]. Beide duplexen geven verschillende smeltcurven die samen in één beeld kunnen bekeken en geanalyseerd worden. Na PCR is er één afgeleide grafiek te zien met twee pieken. Één piek van de probe-amplicon duplex en één piek van het amplicon duplex (figuur 2.21). De piekhoogte van het probe-target signaal is afhankelijk van de concentratie van de probe, de complementaire streng en de lengte van het PCR product [23]. Probes met een lengte rond de 30 bp produceren het beste signaal. De smelttemperatuur van de probe moet onder de 70°C blijven zodat het niet interfereert met de polymerase extensie. Het 3‟-einde van de probe wordt geblokkeerd om zijn verlenging tijdens PCR te voorkomen. De blokkage wordt gevormd met een 3‟C3-blok, 3‟-fosforylatie, ...[20].

38

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen Materialen en methoden

3

Materialen en methoden

De basistechniek in de genetica is PCR, ook het CMGG is opgesplitst in een pre- en postPCR gedeelte. Pre-PCR gebeuren de voorbereidingen voor de PCR reactie zelf. In postPCR gebeuren alle analyses na de PCR reactie. In elk gedeelte moet gewerkt worden met labojas en handschoenen. Elke vorm van contaminatie moet vermeden worden.

3.1

Polymerase chain reaction

3.1.1

Principe

3.1.1.1 PCR De polymerase chain reaction of polymerase kettingreactie (PCR) laat de vermeerdering toe van een specifieke DNA-sequentie uit een zeer kleine hoeveelheid DNA. Een PCR bestaat uit drie stappen (figuur 3.1) die elk bij een welbepaalde temperatuur en gedurende een welbepaalde tijd worden uitgevoerd. Als eerste stap (95°C) vindt men de denaturatie of het “smelten” van het DNA tot twee enkelstrengen. De tweede stap (5065°C) bestaat uit het doen “annealen” of binden van de twee primers of startsequenties aan de DNA-sequentie die men wil kopiëren. Deze primers worden in de elongatiestap verlengd door de inbouw van de DNA-bouwstenen met behulp van DNA-polymerase [9,11].

39


Figuur 3.1 PCR reactie [42]

3.1.1.2 Asymmetrische PCR Een asymmetrische PCR is een PCR waarbij één primer in overmaat wordt gebruikt (zie paragraaf 2.4.3 literatuurstudie). De primer in overmaat schrijft vele kopijen over van de streng die hybridiseert met de probesequentie. Er ontstaan veel probe-amplicon duplexen en weinig amplicon duplexen. Deze PCR wordt gebruikt voor het genotyperen van frequente BRCA1/2 SNP‟s met behulp van ongelabelde probes. 3.1.1.3 Gradiënt PCR Een gradiënt PCR is identiek aan een normale symmetrische PCR, maar in de gebruikte toestellen kan een temperatuursgradiënt aangelegd worden zodat verschillende annealing temperaturen tegelijkertijd kunnen getest worden. De gradiënt PCR wordt gebruikt voor de optimalisatie van mutatiescanning voor het NF1 gen.

3.1.2

Materiaal

 HPLC water  Producten (bewaren bij 4°C) 10x Buffer 50 mM MgCl2 1mM dNTP

Invitrogen™ Invitrogen™

40


 

Platinum® Taq DNA polymerase 10x LCGreen Plus Probes (tabel 3.1) Primers (tabel 3.2)

Invitrogen™ Idaho Technology Inc

Tabel 3.1 probes BRCA1/2 Fragment

Polymorfisme

Probe SEQUENTIE

BRCA1 8

BRCA1 IVS7-34C>T

CTGGCCAATAATTGCTTGACTG

BRCA1 c.562-34C>T BRCA1 11.8 en 11.9

BRCA1 2201C>T (S694S)

CTGGGAAAGTATCACTGTCATGTC

en BRCA1 2196G>A (D693N) BRCA1 11.18

BRCA1 3667A>G (K1183R)

CGTCCAGAGAGGAGAGCTTAG

BRCA2 14.2

BRCA2 7470A>G (S2414S)

CTGTTCAACTCTGTGAAAATGCGATTTAGTT

Tabel 3.2 primers BRCA1/2 BRCA1 Aantal bp

primer

sequentie (5' - 3')

Nucleotide positie)

TA (°C)

240

8F

M13-GTCAAGTTTCTCTTCAGGAG

(562 - 75)

50

8R

M13-CTATAAGATAAGGAATCCAGC

(667 + 59)

49

11-8F

M13-GGA AGT CTT CTA CCA GGC

1970

50

11-8R

M13-GTTAACTTCAGCTCTGGGAAA

2210

50

11-9F

M13-GGTAAAGAACCTGCAACTGGAG

2130

55

11-9R

M13-GCAAAACCCTTTCTCCACTTAAC

2394

53

11-18F

M13-CCATATCTGATTTCAGATAACTTA

3495

53

11-18R

M13-GATAAGTTCTCTTCTGAGGACTC

3768

53

Aantal bp

primer

sequentie (5' - 3')

Nucleotide positie

TA (°C)

200

14-2F

M13-GGAAAAATCTTCAAGCAATTTAGC

7333

51

14-2R

M13-GCTTTTGTCTGTTTTCCTCCAA

7532

51

241

265

274

BRCA2

 Epjes 1,7 mL epjes (Sorenson™, BioScience Inc) lot: 161920 0,7 mL epjes (Sorenson™, BioScience Inc) lot: 22195 0,2 mL epjes Thermo-tube (Thermo Scientific) lot: 9LNN2  Tips 0,5-10 µL ART® 10REACH™pipet tips (Molecular BioProducts) 10-100 µL ART® 10REACH™pipet tips (Molecular BioProducts) 100-1000 µL ART® 10REACH™pipet tips (Molecular BioProducts) ART: aerosol resistant tips  Pipetten 0,1-2 0,5-10

Labmate+ Labmate+

41


       

3.1.3

10-100 Labmate+ 100-1000 Labmate+ Rekjes (Nalgene®) Vortex VWR mini vortexer VWR Lab dancer S40 Centrifuge 5415D (Eppendorf) Folie 96-wellplaat 96-wellplaat mo-Scientific) Handschoenen Microtube 2 mL Bewaardoos producten

PCR film AB-0558 (ABgene) Lot: 108646 AB®gene PCR plates, Thermo-Fast® 96 (TherSC®value (Maxxim medical Europe) (Sarstedt) Lot: 7081701 (Sarstedt)

Methode

3.1.3.1 PCR voorbereiding Er wordt eerst een mastermix gemaakt per fragment. Het enige product dat niet aan de mastermix wordt toegevoegd is DNA. Wanneer de mastermix niet gelijk is aan het totaal volume wordt deze aangevuld met H2O. Platinum Taq polymerase wordt als laatste product toegevoegd. Bij elke nieuwe pipetteerstap wordt een nieuwe tip gebruikt om contaminatie te vermijden. Vanuit de mastermix wordt een hoeveelheid mix (totaal volume – DNA volume) gepipetteerd in de voorziene aantal epjes/welletjes. Per well/epje wordt dan de gewenste hoeveelheid DNA (concentratie 25 ng/µL) toegevoegd. De stalen worden gevortexed en gecentrifugeerd vooraleer ze in het PCR toestel geplaatst worden. Een overzicht van de verschillende mastermixen wordt weergegeven in de tabellen 3.3, 3.4 en 3.5.

42


Asymmetrische PCR voor het genotyperen van SNP’s in BRCA1/2 met ongelabelde probes Tabel 3.3 mastermix asymmetrische PCR met een totaal volume van 15 µL

Product

Concentratie

Volume (µL)

Invitrogen 10x buffer

10x

1.5

MgCl2

50 mM

0.7

dNTP

1 mM

6

LCGreen Plus

10x

1.5

Primer in overmaat

10 µM

0.15

Primer niet in overmaat

10 µM

0.03

Probe

10 µM

0.12

Taq DNA polymerase

5 U/µL

0.18

HPLC H2O DNA

2.82 25 ng/µL

2

Gradiënt PCR voor mutatiescanning van het NF1 gen Voor de gradiënt PCR worden per exon vier negatieve stalen gebruikt. Het exon wordt getest op twaalf verschillende temperaturen. Er wordt gewerkt met een totaal volume van 25 µL en 100 ng DNA per PCR reactie. Tabel 3.4 mastermix gradiënt PCR met een totaal volume van 25 µL

Product

Concentratie

HPLC H2O

Hoeveelheid (µL) 10.99

dNTP

1 mM

5

Invitrogen buffer

10x

2.5

MgCl2

50 mM

1.15

LCGreen Plus

10x

1

Platinum Taq polymerase

5 U/µL

0.16

Primer (forward en reverse) DNA

0.1 25 ng/µL

4

43


PCR met heteroduplex stap voor mutatiescanning van het NF1 gen Tabel 3.5 mastermix PCR met heteroduplex stap met een totaal volume van 25 µL

Product

Concentratie

H2O

Hoeveelheid (µL) 10.99

dNTP

1 mM

5

Invitrogen buffer

10x

2.5

MgCl2

50 mM

1.15

LCGreen Plus

10x

1

Platinum Taq polymerase

5 U/µL

0.16

Primers (forward en reverse) DNA

0.1 25 ng/µL

4

3.1.3.2 PCR uitvoering De stalen worden na de PCR voorbereiding in het PCR toestel geplaatst en het gewenste programma wordt gekozen. Voor op „run‟ gedrukt wordt, moet de „lower en higher temperature‟ aangepast worden via „edit‟. Ga daarna naar „run‟, kies of er met „tubes‟ of een „plate‟ gewerkt wordt. Het toestel zal vragen of het „heated lid‟ gebruikt moet worden of niet. Kies altijd voor „yes‟. Het programma zal daarna automatisch starten. Wacht tot het PCR toestel „program complete‟ weergeeft. Haal de stalen eruit en bewaar ze op een koele en donkere plaats. Een overzicht van de gebruikte PCR programma‟s wordt weergegeven in de tabellen 3.6, 3.7 en 3.8.

44


Asymmetrische PCR voor het genotyperen van SNP’s in BRCA1/2 met ongelabelde probes Het basisprogramma dat gebruikt wordt is PROBE en wordt stap voor stap weergegeven in tabel 3.6. Per annealing temperatuur verschilt het programma van naam. Is de Ta 55 °C, dan wordt als programma PROBE_55/PROBE55 gebruikt. Tabel 3.6 basisprogramma (PROBE) asymmetrische PCR

Stap

Temperatuur

Tijd

1

95°C

30”

2

95°C

30”

3

Annealing temperature

30”

4

72°C

30”

5

Go to stap 2 for 50 times

6

95°C

30”

7

28°C

30”

8

END

Gradiënt PCR voor mutatiescanning van het NF1 gen Tabel 3.7 PCR programma NF1_grad

Stap

Temperatuur

Tijd

1

94°C

4‟

2

94°C

20”

3

„Lower temperature‟ to „higher temperature‟

20”

4

72°C

40”

5

„Go to stap 2 for 37 times‟

6

72°C

10‟

7

15°C

10‟

8

95°C

5‟

9

20°C

10‟

10

END

45


PCR met heteroduplex stap voor mutatiescanning van het NF1 gen Tabel 3.8 PCR programma NF1_HD

Stap

Temperatuur

Tijd

1

94°C

4‟

2

94°C

20”

3

Annealing temperature

20”

4

72°C

40”

5

„Go to stap 2 for 37 times‟

6

72°C

10‟

7

15°C

10‟

8

95°C

5‟

9

20°C

10‟

10

END

3.2

Agarosegelelektroforese

3.2.1

Principe

Agarosegelelektroforese is een techniek die stukjes DNA van elkaar scheidt op basis van hun lengte, steunend op de elektrische lading van het DNA en de eigenschappen van de agarosegel. Het negatief geladen DNA migreert in de richting van de positieve pool. Grotere DNA-fragmenten zullen moeilijker door de gel bewegen dan kleinere DNAfragmenten.

Hierdoor

kunnen

de

verschillende

DNA-fragmenten

van

elkaar

onderscheiden worden. In de gel wordt een bandenpatroon zichtbaar door de toevoeging van ethidiumbromide. Er wordt ladingsbuffer bij het PCR product gevoegd. Deze kleurstof bevat sucrose, waardoor het DNA in de slotjes zakt en niet zomaar ronddwarrelt (figuur 3.2).

46


Figuur 3.2 principe gelelektroforese

3.2.2

Materiaal



Post-PCR Microplate 96 (Greiner Bio-one) Ladingsbuffer Pipet 0,5 – 10µL (Labmate+) Multichannel 0,5-10 (Finnpipette®) Agarose (Invitrogen™) Weegvlootje Balans (Navigator™)

47




Ethidiumbromidelokaal 10x TBE buffer (Invitrogen™) Microgolfoven Handschoenen Kleenguard (Kimberley-Clark professional) Ethidiumbromide Elektroforesebak (BioRad) Spanningsbron Power-Pac basic™ (BioRad) Folie Gedemineraliseerd water

3.2.3

Methode

3.2.3.1 Gieten van de gel Drie gram agarose (voor 1,5% gel) wordt afgewogen in een vlootje. Los de agarose op in 250 mL 1X TBE-buffer. Zet dit in de microgolfoven gedurende 2‟30” tot het mengsel kookt, laat niet overkoken. Koel de oplossing af en voeg vijf druppels ethidiumbromide (10 mg/30 mL) toe. Meng goed. Plaats de kammetjes op de gewenste plaats. Giet de gel en laat stollen (±30‟). Haal daarna voorzichtig de kammetjes uit de gel. 3.2.3.2 Voorbereiden van de stalen en het laden van de gel Meng 1 µL ladingbuffer met 5 µL PCR product. Laad 5 µL in de slotjes van de gel. Laat de gel lopen op 145 V gedurende 30-40 minuten. Nadat het DNA door de gel gelopen is wordt deze op een UV-plaat gelegd en wordt een foto genomen. De foto kan worden bewerkt en afgedrukt met het programma „Microsoft Photo editor‟.

3.3

LightScanner

De LightScanner (figuur 3.3) is een toestel ontworpen door de firma Idaho technology Inc. Het toestel wordt gebruikt voor High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA) voor mutatiedetectie en genotypering in 96 of 384 wellplaten.

48


Figuur 3.3 LightScanner (Idaho technology Inc) [45]

3.3.1

Voorbereiding mutatiedetectie en genotypering met behulp van ongelabelde probes op de LightScanner

De voorbereiding voor mutatiedetectie en genotypering met behulp van ongelabelde probes op de LightScanner gebeurt in het post-PCR gedeelte van het labo. De analyse van beide methoden op de LightScanner vereist specifieke platen met niet-doorzichtige welletjes (96 wellplaten). Na PCR en voor het overbrengen van de stalen in de plaat worden de stalen gecentrifugeerd. Er wordt 10 µL PCR-oplossing in de nieuwe plaat gepipetteerd. Boven de oplossing komt ongeveer 22 µL minerale olie. De plaat wordt daarna gecentrifugeerd gedurende 10‟ op 3000 rpm (programma 7). Na centrifugatie kan de plaat gelopen en geanalyseerd worden op de LightScanner.

49


3.3.2

Loopprogramma LightScanner

De analyse gebeurt met de bijhorende Software, Call-IT. Vanuit het beginscherm (figuur 3.4) wordt gekozen voor de knop „Run‟.

Figuur 3.4 software Call-IT – beginscherm

In het beginscherm worden de temperaturen waartussen de „run‟ moet gebeuren, aangepast. Voor mutatiedetectie is dit van 70°C tot en met 98°C, voor genotypering met ongelabelde probes loopt de run van 45°C tot 98°C. De hold temperature wordt steeds 5°C lager gezet dan de laagste temperatuur (figuur 3.5).

50


Figuur 3.5 start run scherm

Eens de temperaturen aangepast zijn, laat men de temperatuur van de LightScanner tot hold temperature komen (klik op „Go to Hold Temp‟). Voer de plaat in met de afgeknotte hoek gericht naar linksboven. Het luikje van de LightScanner sluit automatisch. Druk daarna op „Start run‟. Geef een naam op waaronder de data moet worden opgeslagen. De „run‟ start automatisch, nadat het toestel de fluorescentie van de wells heeft gemeten (figuur 3.6). De plaat wordt uit de LightScanner genomen na het beëindigen van de „run‟.

51


Figuur 3.6 plate image – fluorescentiemeting van de wells Op deze figuur is de controle te zien van de ingevoerde plaat. De wells die blauw blijven, zijn blanco stalen. De gekleurde wells bevatten DNA en de verzadigende kleurstof LCGreen Plus.

3.3.3

Analyse

3.3.3.1 Voorbereidend werk analyse Voor de analyse van mutatiedetectie wordt de knop „scanning‟ aangeklikt, voor de analyse van genotypering met ongelabelde probes wordt de knop „unlabeled probe‟ aangeklikt. De analyse kan starten. De eerste stap is het maken van „subsets‟. Klik op „New Subset‟ en markeer de vakjes die in de „subset‟ moeten voorkomen. Benoem de „subset‟ als volgt: gen_exon_specificiteit. Een voorbeeld: BRCA1_exon11.8_58°C. Druk daarna op „Add marked to subset‟. De „subset‟ is gemaakt en benoemd. De „subsets‟ verduidelijken op welk fragment een PCR gebeurd is. In dit voorbeeld is er een PCR gebeurd voor het fragment 11.8 van het gen BRCA1 op 58°C (figuur 3.7). Volg dit principe voor alle „subsets‟.

52


Figuur 3.7 aanmaken van een ‘subset’ Klik eerst op ‘New Subset’. Duid de vakjes aan die je in de subset wilt. Geef de subset een naam in het vakje ‘Edit Subset Name’. Klik daarna op ‘Add Marked to Subset’. Alle vakjes geven de wells weer van een 96 wellplaat. De witte vakjes zijn aangemaakte subsets. De reeks met blauwe vakjes is een gemarkeerde subset.

53


3.3.3.2 Verdere analyse mutatiedetectie Eens de „subsets‟ gemaakt zijn, kan gestart worden met de analyse. Deze is gebaseerd op visuele inspectie van de data en gebeurt in stappen. De analyse start met de normalisatie van de smeltcurves. Ga naar het tabblad „Negative Filter‟ en markeer de vakjes die als blanco moeten dienen. In het tabblad wordt bij „Standards‟ „negative‟ aangeduid, druk dan op „apply change‟. De gewenste stalen zijn aangeduid als blancostaal. In het tabblad „Normalize‟ worden de verkregen smeltcurves genormaliseerd. Voor en na de ombuigingen van de smeltcurves komen twee verschuifbare balkjes voor. Verplaats deze balkjes zodanig dat de uiteinden van de curves (rechts op figuur 3.8) in één lijn vertrekken en samenkomen. Tussen de twee balkjes moet een temperatuurverschil zitten van minimum 1°C en maximum 2°C.

Figuur 3.8 normaliseren van de smeltcurves

Nadat de curven te genormaliseerd zijn, worden deze gegroepeerd. Dit gebeurt onder het tabblad „Grouping‟. Stel bij „Standards‟ „auto Group‟ in en gebruik een hoge sensitiviteit. Klik op „Compute groups‟ (figuur 3.9).

54


Figuur 3.9 ‘grouping’

De curves worden automatisch gegroepeerd. De stalen met polymorfismen of mutaties geven een afwijking zoals weergegeven in figuur 3.10.

Figuur 3.10 ‘difference’ curven

Om de gewenste resultaten af te drukken, klikt men op „report‟. Daar kan men de gewenste subsets of resultaten afdrukken door op „print‟ te klikken. Nadien wordt het „report‟ gesloten („close report‟) en wordt alles opgeslagen. 3.3.3.3 Analyse genotypering met behulp van ongelabelde probes Nadat alle „subsets‟ gemaakt zijn, wordt gestart met de genotypering. Daarbij worden eerst alle blanco stalen aangeduid. Dit gebeurt onder het tabblad „Negative filter‟. Vink de vakjes aan die je als blanco wilt, geef op dat je deze als „negative‟ wilt en druk op „apply change‟. Daarna wordt elke „subset‟ genormaliseerd onder het tabblad „Normalize‟. Dit

55


gebeurt aan de hand van vier balkjes. Met deze balkjes worden de grenzen aangegeven van de probe-amplicon duplexen (figuur 3.11). Zorg ervoor dat alle curven samen vertrekken en samen eindigen zoals te zien is rechts op figuur 3.11.

Figuur 3.11 normaliseren van de curven Met de rode strepen worden de probe-amplicon duplexen aangeduid. De achterste piek is het amplicon fragment. Aan deze piek is te zien of de PCR goed gelukt is of niet. In de rechtse grafiek is het de bedoeling dat alle drie de groepen samen starten en samen eindigen.

Eens dit gedaan is, worden de stalen gegroepeerd. Men duidt bij „standards‟ „auto Group‟ aan. De sensitiviteit moet op „high‟ staan. Klik daarna op „compute groups‟. De stalen zijn nu gegroepeerd volgens genotype. De genotypes die onderscheiden worden, zijn de homozygoten (varianten en wild types) en heterozygoten (mutantnormaal). De homozygoten vertonen één piek, de heterozygoten hebben twee pieken (figuur 3.12).

Figuur 3.12 ‘grouping’ Op de grafiek kunnen de homozygoten onderscheiden worden van de heterozygoten (grijs). Welke curve van de homozygoten eerst verschijnt, hangt af van de selectiviteit van de probe. Wordt de probe ontworpen tegen de wild type streng dan zullen de homozygote varianten eerst verschijnen. Indien dit tegen de variant is dan zullen de homozygoot wild types eerst verschijnen. Er wordt steeds gewerkt met een hoge sensitiviteit.

56


3.3.4 

Materiaal PCR-blokken Peltier thermal cycler 200 (MJ Research) 2720 Thermal cycler (AB Applied Biosystems)



pipetten Multichannel 0,5-10 (Finnpipette®) Multichannel 10-100 (Finnpipette®)



Centrifuge Centrifuge 5415D (Eppendorf) Centrifuge 5804 (Eppendorf)



Tips Omnitip™ 10 µL (FastRack™) Omnitip™ 200 µL (FastRack™)

 

Minerale olie (Sigma®) LightScanner plaat: FrameStar 96 (4titude)



Folies Doorzichtig (Greiner Bio-one) Aluminium (Greiner Bio-one)

 

Handschoenen SC®value (Maxxim medical Europe) LightScanner™ HR|96 (Idaho Technology Inc.)

57

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen Resultaten

4

Resultaten

4.1

Genotypering van frequente BRCA1/2 SNP’s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner

In het CMGG is er reeds een beperkte ervaring in het genotyperen van SNP‟s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner voor de detectie van SNP‟s in het HFE gen, geassocieerd met de ziekte hemochromatose. Hiervoor was een protocol beschikbaar van de firma. Bijkomende optimalisaties bleken echter nog noodzakelijk. Voor de detectie van frequente SNP‟s in de BRCA1/2 genen zijn echter geen protocols beschikbaar, maar genotyperingsassay‟s voor de meest voorkomende SNP‟s in BRCA1/2 zullen toelaten sequeneren na mutatiescanning van BRCA1/2 sterk te reduceren. Vier genotyperingsprotocols worden geoptimaliseerd tijdens deze stage.

4.1.1



SNP c.562-34 C>T (BRCA1 exon 8)



SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 8)



SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 9)



SNP c.7470 A>G (BRCA2 exon 14 fragment 2)

Voorbereidende gradiënt

Voor BRCA1 c.2201 C>T en BRCA2 c.7470 A>G wordt een gradiënt PCR uitgevoerd (Ta 54°C  65°C) met als extra variërende parameter de concentratie dimethylsulfoxide (DMSO) en MgCl2. Op deze manier worden de ideale reactieomstandigheden voor de PCR reactie bepaald. Aan de mix voor de gradiënt PCR zijn de primers toegevoegd die een kort fragment amplificeren, maar is geen probe aanwezig. Hoe sterker de bandjes oplichten onder ultraviolet (UV), hoe beter de PCR reactie is doorgegaan. De verschillende DMSO concentraties hebben geen effect op de PCR specificiteit. De verschillende MgCl2 concentraties hebben wel effect. Bij hogere concentratie (2,3 mM) wordt er PCR fragment gevormd in tegenstelling tot lagere MgCl2 concentratie (1,5 mM). Uit figuur 4.1 kan men de ideale concentraties DMSO en MgCl2 afleiden voor het doorgaan van de PCR reactie, namelijk 0% DMSO en 2,3 mM MgCl2.

58


11.8 0% DMSO

11.8 3% DMSO

1,5 mM MgCl2

1,5 mM MgCl2

11.8 0% DMSO 2,3 mM MgCl2

11.8 3% DMSO

14.2 0% DMSO

2,3 mM MgCl2

1,5 mM MgCl2

14.2 3% DMSO 1,5 mM MgCl2

14.2 0% DMSO

14.2 3% DMSO

2,3 mM MgCl2

2,3 mM MgCl2

Figuur 4.1 gradiënt PCR BRCA1 fragment 11.8 en BRCA2 fragment 14.2

4.1.2

Genotypering met behulp van HRMCA en ongelabelde probes

4.1.2.1 Conditiebepaling Als startcondities wordt gebruik gemaakt van de reactieomstandigheden die volgen uit de optimalisatie van het genotyperen van hereditaire hemochromatose type één. Het protocol wordt opgesteld voor een totaal volume van 15 µL (tabel 4.1). Omwille van kostprijs redenen wordt in eerste instantie gebruik gemaakt van probes met een mismatch aan het 3‟ uiteinde. Aangezien de optimalisatie hiervan moeizaam verloopt, wordt snel overgeschakeld op probes met een C3-spacer.

59


Tabel 4.1 protocol genotypering van BRCA1/2 SNP’s met behulp van ongelabelde probes

Product

Concentratie

Hereditaire hemochromatose BRCA 1/2 type 1 Volume (µL) Volume (µL)


10x

1.5

1.5

MgCl2

50 mM

0.7

0.7

dNTP

1 mM

6

6

LCGreen Plus

10x

1

1.5

Primer in overmaat

10 µM

0.15

0.15

Primer niet in overmaat

10 µM

0.03

0.03

Probe

10 µM

0.12

0.12

Taq DNA polymerase

5 U/µL

0.18

0.18

2.12

2.82

3.2

2

15

15

HPLC H2O DNA Totaal

25 ng/µL

4.1.2.2 Hoeveelheid DNA Er wordt nagegaan bij welke hoeveelheid DNA de PCR reactie het best verloopt, met 100 ng of 50 ng. De test wordt uitgevoerd voor BRCA2 c.7470 A>G met twaalf stalen met gekende genotypes (vier wild types, vier heterozygoten en vier homozygote varianten) en op Ta 55°C. Het beste resultaat wordt verkregen met 50 ng DNA per reactie (figuur 4.2). Voor ieder verder fragment wordt dan ook verder gewerkt met 50 ng DNA per reactie.

Figuur 4.2 verschil in DNA-concentratie: links 50 ng/µL, rechts 100 ng/µL

Met 50 ng worden de groepen beter weergegeven dan bij 100 ng. Op de linkse figuur komt de eerste piek overeen met de wild types, de rode en de groene curves met de heterozygoten en de grijze curven met de homozygote varianten. De meeste curves vertonen mooie lijnen, terwijl met 100 ng de oranje en appelblauwzeegroene curve een vreemd patroon vertonen.

60


4.1.2.3 Annealing temperatuur Ieder fragment heeft zijn eigen specifieke annealing temperatuur. Voor ieder fragment worden een aantal testen op verschillende annealing temperaturen uitgevoerd. BRCA1 c.2201 C>T werkt op een annealing temperatuur van 58°C. De genotypering van beide fragmenten gebeurt met dezelfde probesequentie (figuren 4.3 tot 4.6).

Figuur 4.3 SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 8)

Beide figuren zijn het resultaat van genotypering met een geblokte probe. De linkse figuur is een beeld genomen op 58°C, rechts op 60°C. Het verschil is duidelijk te merken. Op de linkse figuur komen de blauwe curves overeen met de wild types, de rode met de homozygoot varianten en de grijze met de heterozygoten.

Figuur 4.4 SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 9)

Beide resultaten kunnen gebruikt worden. Er wordt geopteerd om het resultaat van 58°C (rechts) te nemen in plaats van 53°C (links), omdat dan dezelfde probe kan gebruikt worden als bij de voorgaande SNP. Zo kan voor beide SNP’s hetzelfde PCR programma toegepast worden. De blauwe curves komen overeen met de wild types, de rode curves met de homozygoot varianten en de grijze curves met de heterozygoten.

De genotypering van BRCA2 c.7470 A>G en BRCA1 c.562-34 C>T gebeurt op een Ta van 53°C.

61


Figuur 4.5 BRCA2 SNP c.7470 A>G

Links wordt het resultaat op 51°C weergegeven, rechts op 53°C. Op de rechtse figuur komen de rode curves overeen met de wild types, de grijze curves met de heterozygoten en de blauwe en groene curves met de homozygoot varianten.

Figuur 4.6 eindresultaat BRCA1 SNP c.562-34 C>T op een Ta van 53°C

De blauwe curves komen overeen met de wild types, de grijze curves met de homozygoot varianten en de rode curves met de heterozygoten.

4.1.2.4 Aantal cycli Het aantal cycli zorgt voor een veelvoud van kopijen van de denaturatiestap in de PCR reactie waarbij meer ssDNA ontstaat. Voor alle fragmenten wordt in de PCR reactie gewerkt met 50 cycli. Enkel voor BRCA2 c.7470 A>G worden 55 cycli gebruikt. Het vermeerderen van het aantal cycli zorgt voor een betere specificiteit van de DNA-strengen. Dit zorgt ervoor dat de strengen mooi binden met elkaar en dat de probe niet te vroeg van het amplicon komt, waardoor een beter resultaat bekomen wordt (figuur 4.7).

62


Figuur 4.7 het effect van het aantal cycli in de PCR reactie

De linkse figuren zijn het resultaat bij 50 cycli, rechts bij 55 cycli. Onderaan wordt de genormaliseerde fluorescentie weergegeven. In de linkse figuur kan met de rode curve aangetoond worden dat de probe vroeger (67°C vs 69°C) van het amplicon smelt. Daarop werd het aantal cycli verhoogd van 50 naar 55. Als resultaat worden de rechtse figuren verkregen.

4.1.2.5 DMSO DMSO is een hulpstof voor de ontbinding van het dsDNA, het zorgt voor het opheffen van secundaire structuren. DMSO zorgt ervoor dat de strengen niet te snel onderling binden, waardoor automatisch de annealing temperatuur met een paar graden Celcius verhoogd wordt. Dit zorgt voor een hogere specificiteit van de PCR. DMSO wordt in een 3% concentratie gebruikt voor BRCA1 c.562-34 C>T en in een 0% concentratie voor de drie andere SNP‟s (figuur 4.8).

Figuur 4.8 het effect van DMSO op BRCA1 c.562-34 C>T

63


Links het resultaat van een PCR reactie met een 0% concentratie, rechts met een 3% concentratie.

4.1.2.6 Primers Bij de start van de optimalisatie worden primers gebruikt die een kort fragment amplificeren (maximaal 100 bp). Deze primers worden zelf ontworpen met behulp van het programma „LightScanner Primer Design Software‟, samen met de probesequentie. Initieel wordt er gebruik gemaakt van deze primers om de nodige sensitiviteit te garanderen. Als test wordt het genotyperen overgedaan met de “standaard diagnostiek” primers, die langere fragmenten (300 bp) amplificeren. Er wordt een goed en voor sommige SNP‟s zelfs beter resultaat verkregen, waarna er enkel nog met deze primers wordt gewerkt (figuur 4.9).

Figuur 4.9 verschil in resultaat tussen verschillende ampliconlengtes

Beide figuren zijn afkomstig van BRCA2 c.7470 A>G. Het resultaat met een kort amplicon wordt links weergegeven, rechts het resultaat met een lang amplicon.

4.1.3

Blinde screening

Als validatie van de nieuw opgezette genotypering wordt voor elke geoptimaliseerde probe nog een blinde screening uitgevoerd. Voor deze screening worden 95 willekeurige stalen en één blanco staal getest. Deze blinde screening wordt uitgevoerd voor drie probes waarvan de resultaten worden weergegeven in figuren 4.10 tot 4.12. Voor BRCA1 c.562-34 C>T is de analyse voor twee stalen niet interpreteerbaar. Bijkomende experimenten zijn nodig om te bepalen of dit eventueel aan de kwaliteit van de DNA stalen gelegen is, dan wel aan een pipetteerfout of dat verdere optimalisatie van deze probe nodig is voor introductie in de diagnostiek.

64


Figuur 4.10 resultaat blinde test BRCA2 c.7470 A>G

De grijze curves zijn de wild types, de blauwe geven de homozygote varianten weer en in het rood worden de heterozygoten weergegeven. Rechts is er een voorstelling van de plaat. De ‘S’ staat voor ‘standard’. Dat zijn stalen die het toestel zelf als standaard instelt en de rest van de stalen ermee vergelijkt. Het bruine vakje is het blancostaal. Aan de hand van deze plaat kunnen de genotypes van de willekeurige stalen gecontroleerd worden.

Figuur 4.11 resultaat blinde test BRCA1 c.2201 C>T

De grijze curven komen overeen met de wild types, de blauwe met de homozygote varianten en de rode met de heterozygoten. Met behulp van de rechtse figuur kan een vergelijking gebeuren met de genotypes van de stalen. Het bruine vakje komt overeen met het blancostaal.

Figuur 4.12 resultaat blinde test BRCA1 c.562-34 C>T

65


Grijze curven: wild types, blauwe curven: homozygote varianten en rode curven: heterozygoten. De groene en oranje curve zijn twee stalen die niet interpreteerbaar zijn.

4.2

Mutatiescreening van het NF1 gen

HRMCA mutatiescanning wordt in het CMGG reeds toegepast voor BRCA1/2. Ieder exon ondergaat een aparte detectie op mutaties of polymorfismen. Het doel van dit onderdeel is de optimalisatie van HRMCA mutatiescanning voor het NF1 gen. Het NF1 gen is zoals ieder gen opgebouwd uit intronen en exonen. NF1 bestaat uit 60 exonen, daarvan zijn sommigen door hun lengte opgesplitst in meerdere fragmenten. De aanwezigheid van pseudogenen bemoeilijkt de analyse op gDNA. Voor ieder fragment wordt gezocht naar de ideale PCR condities waarbij mutaties detecteerbaar zijn met behulp van HRMCA. De resultaten zijn afhankelijk van de PCR annealing temperatuur en/of de lengte van het fragment. In eerste instantie worden de primers getest die momenteel reeds in het labo gebruikt worden voor het sequeneren van de exonen op gDNA niveau. Eens een mutatie geïdentificeerd wordt op cDNA, moet de aanwezigheid altijd bevestigd worden op gDNA.

4.2.1

Voorbereidende testen

Er wordt gestart met het controleren van de PCR fragmenten via gelelektroforese. De condities die gehanteerd worden, worden weergegeven in paragraaf 3.1.3.1 tabel 3.4. Zes fragmenten (exon 1, 2, 3; 4A, 4C en 5) worden getest met positieve en negatieve controles (figuur 4.13).

66


Exon 2

Exon 1

Exon 3

Exon 4A

Exon 4C

Exon 5

Figuur 4.13 controle van de specificiteit van vijf NF1 fragmenten met positieve en negatieve controles

Exon 1 geeft meerdere zwakke bandjes, wat dit fragment onbruikbaar maakt voor HRM. Exon 4A geeft op gel aspecificiteit (een dubbele band), exon 5 geeft op twee stalen na enkel primerdimeren.

4.2.2

Conditiebepaling

Op exon 2, 3 en 4C wordt een gradiënt uitgevoerd om de optimale PCR annealing temperatuur te vinden. Ieder exon wordt getest met 0% en 3% DMSO. De DMSO concentratie blijkt geen effect te hebben op de resultaten. Optimale condities worden verkregen met 55°C als annealing temperatuur en 0% DMSO. In tabel 4.2 worden de condities weergegeven voor een totaal volume van 25 µL.

67


Tabel 4.2 condities NF1 voor een totaal volume van 25 µL

Product

Concentratie

Volume (µL)


10x

2.5

MgCl2

50 mM

1.15

dNTP

1 mM

5

LCGreen Plus

10x

1

Primer (reverse en forward)

10 µM

0.1

Taq DNA polymerase

5 U/µL

0.16

HPLC H2O

10.99

DNA

25 ng/µL

Totaal

4.2.3

4 25

Primerdimeren

Om de grote hoeveelheid primerdimeren te vermijden, wordt een test gedaan met een kleiner volume aan primers. De primerhoeveelheid wordt gehalveerd. Bijkomend wordt ook gevarieerd met de MgCl2 concentratie. De gebruikte concentraties zijn 1,5 mM en 2,3 mM. In tabel 4.3 worden de resultaten weergegeven. De bovenste rij geeft exon 3 weer, de onderste rij exon 4B. Tabel 4.3 primerdimeren

0,2 µL Primer

0,1 µL Primer

0,2 µL Primer

0,1 µL Primer

1,5 mM MgCl2

1,5 mM MgCl2

2,3 mM MgCl2

2,3 mM MgCl2

Exon 3

Exon 4B

Uit de tabel wordt afgeleid dat de primerdimeren niet te zien zijn bij een primerhoeveelheid van 0,1 µL. Bij een hogere concentratie MgCl2 worden de bandjes iets duidelijker weergegeven dan bij een lagere concentratie. Uit de resultaten wordt besloten om verder te werken met een concentratie MgCl2 van 2,3 mM en een primerhoeveelheid van 0,1 µL.

68


4.2.4

PCR 55

Alle exonen worden getest op één annealing temperatuur (55°C). Het toegepaste programma is NF1_HD, dit is een samensmelting van het programma PCR55 met een extra heteroduplexstap (HD). Elk exon wordt getest met vier negatieve stalen en wordt gecontroleerd op agarosegel en op de LightScanner. Het beoogde resultaat is een specifieke band op agarosegel (tabel 4.4) en een vlak profiel zonder afwijkende curves op de LightScanner (figuur 4.14). Voor elf fragmenten wordt een goed resultaat bekomen op zowel agarosegel als op de LightScanner. Tabel 4.4 resultaat agarosegel PCR55

Exon 3

Exon 4B Op de foto‟s worden de vier negatieve stalen en een 100 bp ladder

weergegeven.

De

bandjes zijn duidelijk specifiek en dus bruikbaar voor HRMCA.

Figuur 4.14 resultaat LightScanner PCR55

De figuur geeft de profielen weer verkregen met de LightScanner na PCR55 voor exon 3 (links) en exon 4B (rechts). De linkse figuur is het profiel van exon 3, het rechtse profiel is het resultaat van exon 4B. Alle elf de resultaten zijn terug te vinden in bijlage 1.

4.2.5

Sequeneren

Wanneer voor bepaalde fragmenten goede smeltprofielen op de LightScanner behaald worden, maar er bij de negatieve controles afkwijkingen worden gezien, worden deze PCR fragmenten gesequeneerd. Bij het sequeneren wordt altijd een fragment met een normaal

69


profiel vergeleken met een afwijkend fragment (figuur 4.15). Een deel van de verkregen sequentie na sequenering voor exon 2 wordt weergegeven in figuur 4.16. Voor exon 2 wordt na sequeneren gezien dat de rode curves overeenkomen met een polymorfisme, namelijk c.168 C>T (p.Ser56Ser). Deze curves vertonen een vloeiend profiel, waaruit besloten wordt dat het PCR55 programma goed werkt voor dit fragment. Vervolgens worden voor exon 2 verdere testen uitgevoerd met bijkomende negatieve stalen van de patiënten met bewezen muaties in exon 2.

Figuur 4.15 positief resultaat na PCR55 voor exon 2

Na sequeneren wordt gezien dat de twee rode curves te wijten zijn aan een polymorfisme in exon 2.

70


c.168 C>T (p.Ser56Ser)

Figuur 4.16 sequentiedeel exon 2 verkregen na sequenering Figuur 4.16 geeft een sequentie weer hoe het zou moeten zijn, een sequentie met weinig achtergrondverstoring. De aanwezigheid van een polymorfisme of een mutatie wordt in de sequentie weergegeven in de rij met nucleotiden (zwarte pijl). Waar een sequentie variatie voorkomt wordt de nucleotide weergegeven in een rood vakje (omcirkeld). Het tweede rode vakje is het resultaat van een achtergrond verstoring.

71


4.2.6

Opsplitsen exon en/of nieuwe primers

Indien geen mooi profiel wordt bekomen op de LightScanner, maar wel een specifieke band op gel dan wordt nagegaan of het fragment niet te lang is voor HRMCA. Fragmenten die geen mooi profiel vertonen op de LightScanner ondergaan verdere optimalisatie. Fragmenten groter dan 450 bp worden eerst opgesplitst, daarvoor worden nieuwe primers ontworpen. Met deze nieuwe primers gebeurt er een nieuwe test op het PCR programma PCR55. De procedure gehanteerd in voorgaande puntjes (vanaf punt 4.2.4) wordt gevolgd. De verkregen profielen met afwijkende curves en een vloeiende piek worden gesequeneerd (figuur 4.18). Resultaten met een vlak profiel worden getest met positieve en negatieve controles (figuur 4.17).

Figuur 4.17 resultaat met een plat profiel (exon 34)

72


Figuur 4.18 profiel met een afwijkende curve (exon 28)

Dit profiel vertoont een afwijkende curve met een vloeiende piek. Aan de hand van dergelijke pieken wordt beslist of het fragment al dan niet gesequeneerd dient te worden.

4.2.7

Gradiënt PCR

Fragmenten kleiner dan 450 bp en waarbij geen mooi profiel bekomen wordt (figuur 4.19), ondergaan een gradiënt PCR. Dit gebeurt voor drie exonen, 16A, 33A en 35. Via de gradiënt wordt opnieuw de ideale PCR temperatuur nagegaan. Eenmaal de gradiënt doorlopen is, wordt de procedure van de voorgaande puntjes (startend bij punt 4.2.4) gehanteerd.

Figuur 4.19 positief resultaat waarvoor geen mooie piek verkregen is

Dit fragment (exon 35) wordt na de bestelling van de nieuwe primers gelopen op het PCR programma PCR55. Het resultaat is positief en vertoont geen mooie pieken. Het fragment zal opnieuw getest moeten worden, maar nu met een gradiënt PCR. Blijkbaar is voor dit fragment het programma PCR55 niet goed.

73

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen Discussie

5

Discussie

5.1

Genotypering van frequente BRCA1/2 SNP’s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner

HRMCA mutatiescanning is een techniek die gebruikt wordt om BRCA1/2 te screenen. Door het polymorfe karakter van deze twee grote genen, blijft de sequeneringskost redelijk hoog, zelfs na het uitsluiten van vals positieven. Om dit te reduceren wordt er tijdens de stageperiode een nieuwe techniek geoptimaliseerd. Met de techniek worden frequent voorkomende BRCA1/2 SNP‟s gegenotypeerd met behulp van High Resolution Melting Curve Analysis en ongelabelde probes. Het is een snelle en gevoelige methode die gebruik maakt van twee primers, een ongelabelde probe en een verzadigende kleurstof (LCGreen Plus). Deze kleurstof wordt toegevoegd voor de asymmetrische PCR en brengt de smeltcurves in beeld van het PCR product en van de probe-amplicon duplexen. Een verschil tussen mutatiescanning en genotypering is het gebruik van een ongelabelde probe. Mutatiescanning detecteert sequentievarianten tussen de twee primers terwijl genotypering sequentievarianten detecteert onder de probe. De sequentie varianten die gedetecteerd worden zijn SNP‟s (substituties, deleties, inserties) waarvoor na analyse homozygote duplexen (wild types en varianten) en heteroduplexen worden weergegeven. Voor genotypering met ongelabelde probes wordt aangeraden om primers te gebruiken die een kort fragment (maximaal 100 bp) amplificeren [27,28]. Met deze primers wordt de optimalisatie gestart. Optimale resultaten worden moeilijk verkregen. Aanpassingen met bijvoorbeeld andere concentraties MgCl2 hebben geen blijvend effect op het resultaat. Het blijkt dat deze „korte‟ primers complementair zijn met de probe waardoor deze onderling kunnen binden (figuur 5.1). Om deze hypothese te staven, wordt voor BRCA1 11.8 een test gedaan met de “standaard diagnostiek” primers, die langere fragmenten (300 bp) amplificeren. Aangezien de resultaten met de „lange‟ primers goed zijn, worden ook op de andere fragmenten met deze primers testen uitgevoerd. Ook bij de andere fragmenten worden de optimale resultaten verkregen met de „lange‟ primers. Om de methode te valideren, wordt voor elke geoptimaliseerde probe een blinde screening uitgevoerd. Voor deze screening worden alle stalen correct gegenotypeerd. Voor één probe was voor twee DNA stalen de kwaliteit van de analyse echter niet goed genoeg voor correcte

74


interpretatie. Bijkomende analyses moeten uitwijzen waaraan dit te wijten zou kunnen zijn. Bepaalde sequentie variaties weergegeven bij genotypering brengen fouten aan het licht bij mutatiescanning. Na genotypering van sommige sequentie variaties wordt opgemerkt dat deze niet juist worden weergegeven in de resultaten van mutatiescanning, waaruit besloten kan worden dat de methode gevoeliger en efficiënter is dan mutatiescanning.

Figuur 5.1 nagaan van de cross-complementary tussen primers onderling en tussen primers en probe

Met het programma ‘LightScanner Primer Design Software’ worden de primersequenties evenals de probesequentie ontworpen. Met dit programma kan ook nagegaan worden of deze primers al dan niet onderling of met de probe binden.

De eerste testen worden afgewerkt met een probe die aan het 3‟-einde een mismatch bevat. Bij bepaalde fragmenten (BRCA1 8 en BRCA2 14.2) worden deze probes na meerdere testen vervangen door probes met een C3-spacer. Met deze geblokte probes worden sneller goede resultaten bekomen. Bij BRCA1 11.8 wordt met de probe met

75


mismatch een mooi resultaat bekomen waarbij de drie genotypes duidelijk kunnen onderscheiden worden. Daarna wordt met dezelfde condities een test gedaan met de geblokte probe. Er wordt opgemerkt dat de juiste annealing temperatuur van de test met de geblokte probe 2°C lager ligt dan het resultaat bij de probe met de mismatch. Over de stabiliteit van de geblokte probes is er momenteel geen informatie beschikbaar. Dit kan nog een mogelijk nadeel vormen, wanneer men de kostprijs van de methode beschouwt. Recent werd in de literatuur een nieuwe techniek (Small amplicon genotyping) beschreven [37]. De techniek is grotendeels identiek, maar er zijn toch significante verschillen. De methode maakt gebruik van een symmetrische PCR. Er wordt geen gebruik gemaakt van probes, het fragment dat geamplificeerd wordt heeft een lengte van 40 – 60 bp en er worden interne kalibratiemoleculen gebruikt. Deze moleculen zijn een attractieve en effectieve manier om het resultaat van genotypering met behulp van HRMCA uitmuntend te verbeteren (tot 100%). Bij SNP c.562-34 C>T komt aspecificiteit voor (figuur 5.2). Het proberen weg te werken met 3% DMSO heeft geen effect. Omdat de aspecificiteit ook voorkomt in de resultaten van mutatiescanning, wordt besloten om deze aspecificiteit zo te laten. De aspecificiteit heeft uiteindelijk geen effect op de werking van de probe.

Figuur 5.2 aanwezigheid van een aspecificiteit in SNP c.562-34 C>T

Genotypering met behulp van ongelabelde probes vereist een maximum probelengte van 30 bp. Bij sommige fragmenten bestaat de mogelijkheid om met één probe meerdere SNP‟s te detecteren. Een voorbeeld wordt weergegeven in figuur 5.3.

76


Figuur 5.3 twee SNP’s onder één probe

De groene (TT), blauwe (CT) en rode curven (CC) zijn afkomstig van SNP c.2201 C>T. De oranje (GA) en grijze (GG) curven zijn afkomstig van SNP c.2196 G>A. Zowel bij BRCA1 11.8 als bij BRCA1 11.9 kan deze extra SNP gedetecteerd worden. Deze figuur is een beeld van BRCA1 11.8.

Elke SNP heeft zijn eigen specifieke condities om bepaald te worden via genotypering met behulp van ongelabelde probes. Voor elke SNP kan hetzelfde basisprotocol gehanteerd worden. De heikele punten zijn de primers en de specifieke annealing temperatuur van elke probe. De methode is eenvoudig in uitvoering, hanteert een snelle analyse, is minder arbeidsintensief en daardoor gemakkelijk op te nemen in de diagnostiek. Het voordeel van de methode is de reductie van het sequeneren als men vergelijkt met de vorige methode.

5.2

Mutatiescanning van het NF1 gen

NF1 wordt in het CMGG gescreend op cDNA niveau. Deze methode is omslachtig, arbeidsintensief en duur. Omslachtig omdat een vers bloedstaal van de patiënt nodig is om op een betrouwbare manier RNA te kunnen bereiden en duur omdat na PCR alles dient gesequeneerd te worden. Om deze sequenering te reduceren en om sneller resultaat te krijgen, wordt tijdens de stage een nieuwe methode toegepast steunend op HRMCA mutatiescanning. Het is de bedoeling deze methode te optimaliseren zodanig dat deze methode kan gebruikt worden in de diagnostiek. Het uitvoeren van een gradiënt PCR voor ieder fragment, waarmee aanvankelijk gestart is, levert niet veel extra gegevens op waardoor al vlug overgeschakeld wordt naar een methode waarbij alle fragmenten op één programma (PCR55) worden getest. Indien de fragmenten op de agarosegel een bandje vertonen en op de LightScanner een plat profiel,

77


worden ze gecontroleerd met positieve en negatieve controles voor ze in de diagnostiek kunnen opgenomen worden. Tijdens de duur van de stage worden twaalf exonen van de 60 geoptimaliseerd (exon 2, 3, 4B, 4C, 5, 6, 8, 9, 10A, 12B, 17 en 18). De test op PCR55 geeft voor veel fragmenten op de LightScanner een goed resultaat bij de eerste test, waardoor verdere optimalisatietesten dienen toegepast te worden. Daarvoor wordt gekeken naar de afwijkingen verkregen op het profiel van de LightScanner. Indien het profiel een mooie piek vertoont, dan wordt via sequenering nagegaan of deze piek overeenkomt met een polymorfisme. Een mutatie zou het nooit mogen zijn, aangezien NF1 een dominant gen is. Door deze dominantie zou de patiënt duidelijke symptomen hebben en zou de mutatie gekend zijn. Bij sommige fragmenten kunnen de resultaten verbeterd worden door minder primers toe te voegen. Voor de fragmenten waarbij de primerverdunningen niet helpen, wordt gekeken naar de fragmentlengte. Indien de fragmenten groter zijn dan 450 bp worden nieuwe primers aangemaakt en/of worden de fragmenten opgesplitst. Dit gebeurt voor negentien van de 60 fragmenten. Deze fragmenten worden opnieuw getest met het programma PCR55. Voor vijftien van de negentien fragmenten wordt een goed resultaat bekomen. Voor twee fragmenten blijven de resultaten uit. Voor drie andere fragmenten dient een gradiënt PCR uitgevoerd te worden. HRMCA mutatiescanning is een snelle en gevoelige detectiemethode en wordt vlot in de diagnostiek opgenomen. De techniek is niet tijdrovend, goedkoper dan scanning op cDNA-niveau, omvat geen post-PCR handelingen en is eenvoudig in analyse. De methode is in staat om heterozygote sequentie varianten te onderscheiden van wild types. Een nadeel van de techniek bestaat erin dat alle fragmenten met afwijkende curves dienen gesequeneerd te worden. Immers, op basis van de HRMCA curve kan niet bepaald worden welke genetische variant in het fragment aanwezig is. Bijgevolg kunnen polymorfismen en mutaties dezelfde afwijkende curve vertonen. Er kan overwogen worden om op termijn de meest frequente SNP‟s in het NF1 gen te genotyperen met behulp van ongelabelde probes. Ongeveer 2% van de mutaties in het NF1 gen liggen diep-intronisch. Deze kunnen niet gedetecteerd worden met deze technologie op gDNA. Hiervoor moet bijkomend cDNA onderzoek gebeuren. Doch, kan de HRMCA technologie geïntroduceerd worden als eerste stap. Voor patiënten die voldoen aan de NF1 diagnostische criteria (paragraaf 2.2.1) en waarin geen mutatie wordt geïdentificeerd met behulp van HRMCA, kan dan verder cDNA onderzoek aangeboden worden.

78

Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen Conclusie

6

Conclusie

De optimalisatie van de twee High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA) toepassingen gebeuren beiden op de LightScanner, een toestel speciaal ontworpen voor HRMCA. HRMCA is een methode die gebruik maakt van een verzadigende fluorescente kleurstof (LCGreen Plus). Na het uiteensmelten van het DNA zorgt de fluorescentie voor een specifieke smeltcurve. De smeltcurve van een heterozygote variant verschilt van een homozygote. Analyse van de smeltprofielen laat dus toe om stalen met een mutatie te onderscheiden van wild type stalen. De methode is eenvoudig in uitvoering, snel in analyse, goedkoop en zeer gevoelig. Voor genotypering van enkele frequente BRCA1/2 SNP‟s wordt gebruik gemaakt van ongelabelde probes. Drie probes worden geoptimaliseerd voor de detectie van drie verschillende SNP‟s in vier verschillende PCR fragmenten en deze protocols zullen toegepast worden in de diagnostiek. De validatie gebeurt aan de hand van een blinde screening op 95 stalen. De drie SNP‟s worden gedetecteerd met een gevoeligheid van 100%. Voor één probe is de kwaliteit van de analyse van voor twee DNA stalen te laag om correct geïnterpreteerd te kunnen worden. Bijkomende analyses zijn noodzakelijk om de oorzaak hiervan te achterhalen. Uit onze analyses blijkt echter dat de methode uiterst geschikt is om frequente BRCA1/2 SNP‟s correct te identificeren. De introductie van zo‟n genotyperingsprotocol met ongelabelde probes vereist echter een een doorgedreven optimalisatie, die enkel loont voor zeer frequente SNP‟s die dienen gedetecteerd te worden bij een voldoende groot aantal patiënten. Voor mutatiescanning van NF1 zal in de toekomst overgeschakeld worden van directe sequenering op cDNA niveau naar HRMCA van alle exonen en flankerende intron sequenties op de LightScanner op gDNA niveau. Tijdens deze stage wordt de analyse van twaalf exonen van de 60 geoptimaliseerd en gevalideerd aan de hand van positieve en negatieve controles. Onze experimenten tonen 100% sensitiviteit aan voor de geteste stalen. De optimalisatie van deze twee HRMCA protocols zal resulteren in een sterke reductie van het aantal te sequeneren fragmenten in vergelijking met de vroeger toegepaste methodes.

79


Literatuurlijst 1.

5 jaar DNA-onderzoek naar erfelijke borst- en ovariumkanker. (2000, September). LOD-nieuwsbrief (8).

2.

BRCA1. (2008, April 4). (US National library of medicine) Opgeroepen op Februari 21, 2008, van Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/gene=brca1

3.

BRCA2. (2008, April 4). (US National library of medicine) Opgeroepen op Februari 21, 2008, van Genetics home reference http://ghr.nlm.nih.gov/gene=brca2

4.

Carl T. Wittwer, G. H. (2003). High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen Plus. Clinical chemistry , 49 (6), pp. 853-860.

5.

Claes, K. (2003). Molecular study of the BRCA1 and BRCA2 genes in a large cohort of Belgian patients with a genetic predisposition for breast and/or ovarian cancer. Gent.

6.

Consequences of pointmutations (one basepair). (sd). Opgeroepen op April 7, 2008, van Bacterial Genetics http://web.indstate.edu/thcme/micro/bactGen/mutation.html

7.

De ziekte, de determinanten en de zorg voor de patiënt. (2007, December 13). (Nationaal kompas volksgezondheid) Opgeroepen op Maart 3, 2008, van Borstkanker http://www.rivm.nl/vtv/object_document/o1497n17276.html

8.

Demeyere, M. Biotechnologie I (Vol. Hoofdstuk V, pp 45-46). Brugge, WestVlaanderen, België: Hogeschool West-Vlaanderen.

9.

Demeyere, M. (2007). De PCR-techniek. DNA- en RNA-technieken (Vol. VII, pp. 5561). Brugge, West-Vlaanderen, België: Hogeschool West-Vlaanderen.

10. DNA sequencing. (2008, April 6). (Wikimedia Foundation, Inc) Opgeroepen op Maart 11, 2008, van Wikipedia the free encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing 11. Donders, S. (sd). Zo werkt PCR. Opgeroepen op April 18, 2008, van Genomics: http://www.watisgenomics.nl/genomics/genomics/i000835.html

80


12. Erfelijke borst- en/of eierstokkanker. (2007, November). (Katholieke universiteit Leuven) Opgeroepen op Februari 15, 2008, van Eenheid psychosociale genetica: http://www.kuleuven.be/psychogen/teksthboc.htm 13. GEVAERT, L. (2008, Maart 3). Afkomst van genen. (Gentaur Molecular products BVBA) Opgeroepen op Maart 3, 2008, van Gentaur: http://www.gentaur.com/spijsverterings_snp_test.htm 14. Hall, D. (2007, Augustus 13). Genoom-brede associatiestudies: ALS als eerste spierziekte onderzocht. (Phoundry) Opgeroepen op Maart 3, 2008, van VSN: http://www.vsn.nl/onderzoek/nieuws.php?diagnose_id=0&nieuws_id=1025 15. Heneweer, D. M. (2004, November 11). Borstkanker in een bakje: over borstkanker en onderzoek in het lab. Opgeroepen op Februari 15, 2008, van kennislink.nl: http://www.kennislink.nl/web/show?id=122691&vensterid=811&cat=60360 16. Het zit in de familie... (2008, Maart 18). Opgeroepen op Februari 29, 2008, van Natarelle http://www.natarelle.be/familie.php

17. High resolution melt. (2006, Juni). Opgeroepen op Februari 21, 2008, van Corbett lifescience: http://www.corbettlifescience.com/control.cfm?page=Introduction%5F4&bhcp=1&relo c=16621&CFID=5746339&CFTOKEN=64547944 18. Inherited sterility . (sd). Opgeroepen op Maart 14, 2008, van http://instruct1.cit.cornell.edu/courses/ipm444/07GenManPest/mp4.htm 19. Jaarlijkse statistieken. (2004). Opgeroepen op Februari 29, 2008, van Belgian cancer registry www.kankerregister.com 20. Jose Montgomery, C. T. (2007). Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature Protocols (1), pp. 59-66. 21. LCGreen Plus. (sd). Information sheet . Idaho Technology Inc. 22. Luming Zhou, A. N. (2004, Mei 27). Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye. Clinical chemistry , 50 (8), pp. 1-8. 23. Luming Zhou, L. W. (2005). High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clinical Chemistry , 51 (10), pp. 17701777.

81


24. Marina L. Kennerson, T. W. (2007). Mutation scanning the GJB1 gene with highresolution melting analysis: implications for mutation scanning of genes for CharcotMarie-Tooth disease. Clinical chemistry , 53 (2), pp. 349-352. 25. Martens, O. (2006). New insights in the molecular pathogenesis of neurofibromatosis type 1. Doctoraatthesis, Universiteit Gent, Faculty of Medicine and Health Sciences , Gent. 26. Matthijs, P. G. (2008, April 8). Borstkanker: de erfelijke risico’s. (Europadonna belgium) Opgeroepen op Maart 3, 2008, van Europese borstkanker coalitie: http://www.europadonna.be/nl/art_2006-10-01_genetic.html 27. Michael Liew, e. a. (2007). Closed-Tube SNP Genotyping without labeled probes. Anatomic Pathology , 341-348. 28. Mikeal Wall, J. B. Algorithm for conversion of TaqMan Genotyping assays to unlabeled probe assays. Idaho Technology Inc. Lyon: International agency for research on cancer. 29. Mutatie. (sd). Opgeroepen op Maart 3, 2008, van Museumkennis: http://www.museumkennis.nl/nnm.dossiers/museumkennis/i001372.html 30. Mutatie (biologie). (2008, Maart 17). (Wikimedia Foundation, Inc) Opgeroepen op maart 2008, van Wikipedia De vrije encyclopedie: http://nl.wikipedia.org/wiki/Mutatie_(biologie) 31. Neurofibromatosis Type 1. (2001, September 13). (University of Oulo) Opgeroepen op Maart 12, 2008, van the NF1 research team: http://cc.oulu.fi/~anatwww/NF/Neurofibromatosis/ 32. NF1 gene. (2002). (University of Oulo) Opgeroepen op Maart 14, 2008, van Oulun Yliopisto http://herkules.oulu.fi/isbn9514266463/html/x208.html 33. Richards, F. M. (2001, Maart 19). Knudson’s two-hit hypothesis for tumourigenesis involving a tumour suppressor gene (TSG). Opgeroepen op Maart 3, 2008, van Expert reviews in molecular medicine http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/01002678h.htm

34. Risicofactoren. (2008, Februari 12). Opgeroepen op Februari 15, 2008, van Borstkanker informatiepagina's: http://www.borstkanker.net/hoofdframe.html?risicofac.html&2

82


35. Schepper, S. D. Café-au-lait spots in neurofibromatosis type 1: a step towards unraveling the etiopathogenic mechanisms. Doctoraatthesis, Universiteit Gent, Gent. 36. Silent mutation. (2008, Mei 16). Opgeroepen op april 7, 2008, van Genetics Home Reference http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=silentmutation

37. Small Amplicon Genotyping using internal temperature calibration and High Resolution-Melting. (2008). BioTechniques , 44 (4), 577-578. 38. Splice-site mutations. (2005, januari 28). Opgeroepen op April 7, 2008, van National Cander Institute: http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/cancergenomics/Slide19 39. Steensma, Q. v. (1993, Maart 1). Het ontrafelen van een genoom. Natuur & techniek , 61 (3). 40. Twyman, R. (2003, Maart 20). Mutation or polymorphism? (Gibbs Building) Opgeroepen op Maart 3, 2008, van The Human Genome: http://genome.wellcome.ac.uk/doc_WTD020780.html 41. Vandenbroucke, I. (2004). Identification and characterization of neurofibromatosis type 1 splice variants. Doctoraatsthesis, Universiteit Gent, Faculty of Medicine and Health Sciences, Gent. 42. Vierstraete, A. (1999, November 8). Principle of the PCR. Opgeroepen op april 18, 2008, van Homepage of Andy Vierstraete: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 43. Welke technieken? (2004, Mei 28). Opgeroepen op Maart 3, 2008, van http://www.ftns.wau.nl/micr/milieumicrobiologie/technieken/Technieken.htm 44. What kinds of gene mutations are possible? (2008, April 4). (US National library of medicine) Opgeroepen op Maart 3, 2008, van Genetics home reference: http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/mutationsanddisorders/possiblemutations 45. Why LCGreen Plus® Works: Competing Dyes are Not Sensitive Enough for Hi-Res Melting™. (sd). (Bioké) Opgeroepen op Februari 21, 2008, van Bioké: http://www.bioke.com/lightscanner/LCGreen Plus+melting+dyes/why+LCGreen Plus+works

83


46. Wittwer, G. H. (2004). Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical chemistry , 50 (10), pp. 17481754. 47. www.borstkanker.net www.tegenkanker.be. (2006, Oktober 13). Borstkanker. Opgeroepen op Februari 21, 2008, van Gezondheid.be: http://www.gezondheid.be/index.cfm?fuseaction=art&art_id=3562

84


Bijlagen Bijlage 1 – Resultaten PCR55 (LightScanner en agarosegel)

 Agarosegel Exon 3

Exon 4B

Exon 4C

Exon 5

Exon 6

Exon 8

Exon 9

Exon 10A

Exon 12B

85


Exon 17

Exon 18

 LightScanner

Exon 3 (links) en exon 4B (rechts)

Exon 4C (links) en exon 5 (rechts)

86


Exon 6 (links) en exon 8 (rechts)

Exon 9 (links) en exon 10A (rechts)

Exon 12B (links) en exon 17 (rechts)

Exon 18

87


Colofon 

Dell inspiron I6400 Intel® core™2 CPU



Windows Vista™ Premium



Tekstverwerkingsprogamma Microsoft Office Word 2007 o Kop 1: Arial 14 vet, zwarte achtergrond met wit lettertype o Kop 2: Arial 14 vet o Kop 3: Arial 12 vet o Kop 4: Arial 11 o Standaard tekst: Arial 11 o Bijschriften: Arial 9 vet

Brugge 30/05/08

88


Voor akkoord verklaring

Kim DeLeeneer

Kathleen Claes

Stagementor

Stagegever

Mieke Demeyere Promotor

89

2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen

Recommend Documents