BAB IV IDENTIFIKASI DAN ANALISIS SNP BERDASARKAN KERAGAMAN NUKLEOTIDA GEN SAD KELAPA SAWIT

23

BAB IV IDENTIFIKASI DAN ANALISIS SNP BERDASARKAN KERAGAMAN NUKLEOTIDA GEN SAD KELAPA SAWIT Abstrak Gen Stearoyl ACP Desaturase (SAD) merupakan gen kunci yang mempengaruhi pembentukan asam oleat pada minyak kelapa sawit. Elaeis guineensis dan Elaeis oleifera adalah dua spesies kelapa sawit yang memiliki komposisi kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) yang berbeda, komposisi asam oleat E.oleifera lebih tinggi dibandingkan E.guineensis. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi dan menganalisis perbedaan susunan sekuens gen SAD kelapa sawit dan mendisain SNP marka berdasarkan lokus SNP yang teridentifikasi. Analisa nilai Tajima lima sumber keragaman gen SAD kelapa sawit adalah -1.283062, nilai negatif Tajima menandakan keragaman sequense gen SAD kelapa sawit rendah. Hasil identifikasi SNP pada fragmen genome gen SAD terdapat 13 lokus SNP yang digunakan untuk mendisain 26 pasang primer oligonukleotida untuk mengembangkan 13 lokus marka SNAP. Kata kunci : Marka, SNAP, SNP, Stearoyl ACP Desaturase (SAD), Kelapa sawit

24

SNP IDENTIFICATION AND ANALYSIS OF OIL PALM SAD (Stearoyl ACP Desaturase) GENE DIFFERSITY Abstrak The Stearoyl ACP desaturase (SAD) is a key enzyme that inffluence to oleic acid formation in palm oil. Oil palm have two spesies Elaeis guineensis and Elaeis oleifera that have different oleic acid (unsaturated fatty acids) composition. This experiments conducted to indentify the loci difference of bases constituent stearoyl acp desaturase and design of SNP markers based on SNP loci identified. The Tajima value of SAD of five sources of oil palm differcity is -1.283062, Tajima negative value indicated that the diversity of SAD sequense is narrow in oil palm. There were 13 SNP loci identify from oil palm SAD fragments genome and use to design 26 oligonucleotide primer pairs to develop the 13 loci markers SNAP. Kata kunci : oil palm, marka, SNAP, SNP, Stearoyl ACP Desaturase (SAD)

25 Pendahuluan Lipid atau lemak merupakan suatu senyawa biomolekul yang larut dalam pelarut organik seperti eter, kloroform dan benzen, tetapi tidak larut dalam air. Minyak merupakan salah satu sumber lipid/lemak alami yang terdapat pada tanaman. Tanaman sebagai sumber penghasil lemak yang signifikan karena banyak spesies tanaman menyimpan asam lemak dalam bentuk triasilgliserol pada biji (Jay et al. 2002). Kelapa sawit merupakan salah satu tanaman penyimpan dan penghasil asam lemak yang paling tinggi dibandingkan tanaman penghasil minyak lainnya. Kandungan asam oleat yang tinggi pada minyak konsumsi, baik untuk kesehatan karena dapat menurunkan kadar kolesterol LDL (Low Density Lipoprotein) dalam darah, ini dapat membantu mengurangi resiko penyakit jantung (Gambar 11). Tingginya kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) mengindikasikan tingginya nilai iodine pada minyak. Kedua faktor ini akan mempengaruhi tingkat liquiditas minyak kelapa sawit, minyak tidak akan mudah membeku walaupun berada pada suhu yang rendah. Hal ini penting apabila minyak kelapa sawit dimanfaatkan sebagai sumber energi, biofuel (Choo and Cheah 2000).

Gambar 11. Kandungan dan kualitas minyak nabati Sumber : Alberto HSHO Nutrisun Biosintesis asam lemak disamping dikontrol oleh DNA pada inti sel, juga terjadi di organel sel lain yakni pada plastid dan retikulum endosplasma (Zhang et al. 2012). Sintesis penyimpanan triasilgliserol lipid (TAG) terjadi melalui jalur gliserol 3-fosfat (Kennedy) di retikulum endoplasma. Lintasan biosintesis asam lemak pada tanaman secara umum digambarkan dalam bentuk diagram alur seperti pada Gambar 12, yang menggambarkan produk intermediat dan enzim kunci yang berperanan dalam setiap tahap lintasannya (Umi et al. 2002; Basri et al. 2002).

26

Gambar 12. Siklus biosintesis pembentukan asam lemak pada plastid tanaman

(Umi et al. 2002) Gen SAD pada Lintasan Pembentukan Asam Lemak. Stearoyl-ACP Desaturase 18:0-ACP (Strearoyl-ACP)

+ O2 + ferredoxin

18 :1-ACP (Oleoyl-ACP)

Gambar 13. Reaksi katalisasi gen SAD Sumber : Deborah et al. 1992 Gen SAD (∆9 18:0ACP desaturase) terdapat pada jaringan daun dan biji tanaman. Gen SAD berperan dalam pembentukan asam oleat dengan menambahkan satu ikatan rangkap dari 18:0 ACP menjadi 18:1-ACP. Semua enzim acyl-ACP desaturase menggunakan ferredoxin (Gambar 13) sebagai kofactor elektron donor, yang dilakukan dalam bentuk fotosintesis (David et al. 2000). Penentuan lokus genomik gen sintesis asam lemak pada kelapa sawit akan membantu memahami regulasi biosintesis asam lemak tanaman (Katayoon et al. 2001). Hal ini dapat dilakukan dengan memanfaatkan teknologi marka molekuler SNPs. SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Marka molekuler secara luas digunakan dalam penelitian tanaman dan pemuliaan tanaman secara ilmiah untuk mengetahui gen yang dapat mempengaruhi sifat agronomi tanaman yang dapat diisolasi dan diketahui posisinya pada peta genetik (Raj et.al., 2011). Marka molekuler dipakai sebagai alat bantu seleksi dan pengukur keanekaragaman genetik, yang telah diaplikasikan juga dalam mendukung pengembangan industri kelapa sawit, diantaranya Marka molekuler

27 SNPs (Single Nucleotide Polymorpism) pada warna buah kelapa sawit (Ooi et al. 2011) SNPs adalah pasangan basa tunggal pada genom yang berbeda antara satu individu dengan individu yang lainnya. SNPs adalah variasi DNA (deoxsi ribonucleic acid) yang terjadi ketika pada suatu lokasi yang bersesuaian hanya satu nukleotid yaitu A (adenin), C (sitosin), G (guanin), T (timin) dalam genom yang berbeda. Misalnya, urutan pasangan basa TAGATA dan TGGATA berbeda pada nukleotide kedua (Setiawan, 2008) Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi SNPs pada sekuens gen SAD dari 5 sumber keragaman kelapa sawit. Hasil identifikasi digunakan sebagai dasar untuk mendisain SNPs primer.

Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2013 sampai Juni 2013, di Laboratorium Teknologi Gen Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong, Tangerang, Banten. Bahan dan Alat Penelitian ini menggunakan data sekuen SAD yang dihasilkan dari percobaan sebelumnya. Data sekuen SAD yang digunakan dalam penelitian ini adalah seguense SAD dari spesies E.guineesis dan E.oleifera. Sekuens SAD spesies E. guineesis berasal dari varietas : 1. Dura, 2. Pisifera, 3. Tenera, 4. Virescens dan 5. spesies E.oleifera Bahan lain yang digunakan adalah agarose, etanol absolut, 5x phusion HF buffer, 10 mM dNTP, DMSO, Phusion Hot start II DNA Polymerase. DNA fragments Extraction kit (Genaid). Loading dye, Gelred, ladder 1 kb, pasangan primer SAD, SAD1 dan SAD2 10µM Alat yang digunakan meliputi mesin PCR, mesin DNA sekuensr, Elektroforesis tank, sentrifus, Water bath, mesin nanodrop, oven, mikrowave, pinset, bunsen, petri, mikropipet, shaker, tabung eppendorf, erlenmeyer, ice keeper, dan pipet tips. Alat gelas yang digunakan labu erlenmeyer 250 ml, tabung penyimpan bahan 200 mL. Allignment dan Identifikasi Posisi SNPs Hasil sekuens dari penelitian sebelumnya dialignment menggunakan CLUSTALW dengan program BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu.BioEdit/ bioedit.html), Mega 6 dan Geneous (http://www.geneous.com) (Drummond et al. 2011), selanjutnya dilakukan identifikasi posisi SNPs. Lokus SNPs dianalisis untuk mengetahui keberadaan SNPs pada exon atau intron, dan mengidentifikasi ada/tidaknya perubahan asam amino karena keberadaan SNPs pada exon. SNPs yang terdeteksi pada bagian intron, exon dan UTRs (Untranslated Regions) dijadikan sebagai dasar mendisain SNPs primer.

28 Disain SNPs Primer Primer spesifik yang berhubungan dengan bagian SNPs yang sudah teridentifikasi, didisain menggunakan Web SNAPER http://ausubellab.mgh. harvard.edu/ program SNAP (Single Nucleotide Amplified Polymorphisms). Amplifikasi Primer SNPs pada genom asal disain primer Primer SNPs digunakan pada genom awal yang jadi bahan untuk mendisain SNPs primer yang terdiri atas 5 sumber keragaman kelapa sawit yakni spesies E.oleifera, dan spesies E.guinenesis var dura, pisifera, tenera, dan virescence dengan PCR. Total volume mixed PCR adalah 20µL yang terdiri atas : 4 µL 5x Phusion HF buffer, 0.4 µL 10 µM dNTPs, masing-masing 1 µL Primer Forward dan Revers 10 µM, 0.2 µL Phusion Hot Start II DNA polymerase, 100 ng template DNA dan sisanya dH20. Reaksi PCR dilakukan dengan 30 siklus pada suhu 98ºC selama 30 detik, 98ºC selama 5 detik, 52ºC selama 30 detik, 72ºC selama 15 detik, dan 72ºC selama 5 menit.

Hasil dan Pembahasan Analisis Urutan Basa Gen Stearoyl ACP Desaturase (SAD) Berdasarkan hasil runutan DNA, fragmen genomik DNA yang diamplifikasi menggunakan pasangan primer SAD1 berukuran 1,100 bp. Hasil analisis juga menunjukkan keberadaan intron dengan panjang 507 bp (Gambar 14) pada fragmen DNA genomik yang diamplifikasi. Hasil amplifikasi dengan pasangan primer SAD2 menghasilkan fragmen sekuens SAD dengan ukuran 600 bp yang terdiri atas exon dan 3’UTRs (3-Untranslated Regions). Analisis runutan DNA hasil amplifikasi kedua pasang primer SAD1 dan SAD2 menunjukkan dua bagian ekson dengan total ukuran antara 969 - 1032 bp. Satu ekson pada posisi upstream dari intron, teridentifikasi mempunyai ukuran 148 bp, sedangkan satu ekson yang berada downstream dari intron, teridentifikasi mempunyai ukuran antara 821 - 884 bp. Bagian 3 UTRs yang teridentifikasi mempunyai ukuran 282 590 bp (Lampiran 2). Pensejajaran hasil sekuens fragmen genom 5 sampel sumber keragaman kelapa sawit bagian exon, intron dan 3 UTRs terdapat pada (Lampiran 3). Analisa nilai tajima menghasilkan nilai -1.283062, nilai negatif pada analisa ini menunjukkan keragaman sequense SAD kelapa sawit rendah, terbukti dengan hasil BLAST, semua sampel menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi satu sama lain (99%). Analisa urutan nukleotida fragmen intron (noncoding) gen SAD menunjukkan adanya 5 situs SNPs. Pada gen SAD kelapa sawit ditemukan lebih banyak SNPS ditemukan pada intron dari pada exon (coding) perpanjang basa. SNPs dua kali lipat lebih banyak terdapat pada urutan basa noncoding dari pada daerah coding tanaman Bunga Matahari (Judith et al. 2007). SNPs yang terdapat pada daerah noncoding, dapat mempengaruhi tingkat ekspresi gen, stabilitas RNA dan menghasilkan varian kuantitatif (Zang dan Zhang 2005).

29 ....|....| 5 GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT ....|....|

....|....| 15 CATGACAGTC CATGACAGTC CATGACAGTC CATGACAGTC CATGACAGTC ....|....|

....|....| 25 TAGTATTTGC TAGTATTTGC TAGTATTTGC TAGTATTTGC TAGTATTTGC ....|....|

....|....| 35 TCAATTTCTT TCAATTTCTT TCAATTTCTT TCAATTTCTT TCAATTTCTT ....|....|

....|....| 45 TAATTGATAT TAATTGATAT TAATTGATAT TAATTGATAT TAATTGATAT ....|....|

....|....| 55 TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG ....|....|

65 ATTATAGCAT ATTATAGCAT ATTATAGCAT ATTATAGCAT ATTATAGCAT ....|....|

75 CATCAAATTC CATCAAATTC CATCAAATTC CATCAAATTC CATCAAATTC ....|....|

85 TGATAAGAGT TGATAAGAGT TGATAAGAGT TGATAAGAGT TGATAAGAGT ....|....|

95 GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT ....|....|

105 TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC ....|....|

115 CGAACAAGCT CGAACAAGCT CGAACAAGCT CGAACAAGCT CGAACAAGCT ....|....|

Oleifera Tenera Pisifera Dura Virescens

125 TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG

135 CCAATCATGG CCAATCATGG CCAATCATGG CCAATCATGG CCAATCATGG

145 AGAAACTTCT AGAAACTTCT AGAAACTTCT AGAAACTTCT AGAAACTTCT

155 CTGAGATACA CTGAGATACA CTGAGATACG CTGAGATACA CTGAGATACA

165 GTTGTTATCT GTTGTTATCT GTTGTTATCT GTTGTTATCT GTTGTTATCT

175 CAAAATATGG CAAAATATGG CAAAATATGG CAAAATATGG CAAAATATGG


....|....| 185 GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT

....|....| 195 CTTTTATCTT CTTTTATCTT CTTTTATCTT CTGTTATCTT CTTTTATCTT

....|....| 205 TTTTTATTTT TTTTTATTTT TTTTTATTTT TTTTTATTTT TTTTTATTTT

....|....| 215 GAATAATTGG GAATAATTGG GAATAATTGG GAATAATTGG GAATAATTGG

....|....| 225 AGCAACTGCA AGCAACTGCA AGCAACTGCA AGCAACTGCA AGCAACTGCA

....|....| 235 AGTTACTTCA AGTTACTTCA AGTTACTTCA AGTTACTTCA AGTTACTTCA


....|....| 245 AAAATAGCTT AAAATAGCTT AAAATATCTT AAAATAGCTT AAAATAGCTT

....|....| 255 GCTTGATATT GCTTGATATT GCTTGATATT GCTTGATATT GCTTGATATT

....|....| 265 AAGTTATGCC AAGTTATGCC AAGTTATGCC AAGTTATGCC AAGTTATGCC

....|....| 275 TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT

....|....| 285 TATGTGTTCT TATGTGTTCT TATGTGTTCT TATGTGTTCT TATGTGTTCT

....|....| 295 TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC


....|....| 305 TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC

....|....| 315 ATTATTGGCT ATTATTGGCT ATTATTGGCT ATTATTGGCT ATTATTGGCT

....|....| 325 TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA

....|....| 335 TTATCTGGAT TTATCTGGAT TTATCTGGAT TTATCTGGAT TTATCTGGAT

....|....| 345 CAAACATCTT CAAACATCTT CAAACATCTT CAAACATCTT CAAACATCTT

....|....| 355 AGGATAGACT AGGATAGACT AGGATAGACT AGGATAGACT AGGATAGACT


....|....| 365 ATTTTGTATC ATTTTGTATC ATTTTGTATC ATTTTGTATC ATTTTGTATC

....|....| 375 TGTTAACAAA TGTTAACAAA TGTTAACAAA TGTTAACAAA TGTTAACAAA

....|....| 385 TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG

....|....| 395 CAGTGATTGC CACTGATTGC CAGTGATTGC CAGTGATTGC CACTGATTGC

....|....| 405 TTCCATAATT TTCCATAATT TTCCATAATT TTCCATAATT TTCCATAATT

....|....| 415 TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG


....|....| 425 ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA

....|....| 435 TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT

....|....| 445 TCATGGTATT TCATGGTATT TCATGGTATT TCATGGTATT TCATGGTATT

....|....| 455 TTTACTTGAT TTTACTTGAT TTTACTTGAT TTTACTTGAT TTTACTTGAT

....|....| 465 TGAATAGGTC TGAATATGTC TGAATATGTC TGAATATGTC TGAATAGGTC

....|....| 475 ACATCAATTA ACATCAATTA ACATCAATTA ACATCAATTA ACATCAATTA


....|....| 485 ATATCACTTT ATATCACTTT ATATCACTTT ATATCACTTT ATATCACTTT

....|....| 495 CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT

....|... 505 GTCTGTAG GTCTGTAG GTCTGTAG GTCTGTAG GTCTGTAG



Gambar 14. Identifikasi SNPs dari hasil pensejajaran urutan basa pada intron

30 Intron telah terbukti meningkatkan efisiensi transkripsi banyak gen pada berbagai organisme. Sebagai contoh, satu studi awal pada tikus menunjukkan bahwa transgen tanpa intron menunjukkan transkripsi 10-100 kali lebih rendah dibandingkan yang mengandung intron. Demikian pula dengan efisiensi transkripsi pengkodean gen pada Drosophila, dimana alkohol dehidrogenase berkurang setelah penghapusan intron. Salah satu cara intron dapat mempengaruhi transkripsi adalah dengan bertindak sebagai penerima elemen regulasi transkripsi (Brinster 1988; Mackenzie et al. 1996; Helve et al. 2003). Pada fragmen exon, untuk mendisain primer SNPs dilakukan penambahan 3 informasi sequense SAD dari aksesi kelapa sawit yang terdapat di NCBI (E.guineensis-Tenera aksesi U68756, E.oleifera aksesi EU057621 dan FJ940768) Lampiran 4. Hasil identifikasi memperlihatkan bahawa SNPs pada daerah exon gen SAD kelapa sawit yg dapat merubah asam amino (Non-synonymous) di 6 lokus SNPs, sedangkan 2 SNPs tidak merubah asam amino (synonymous) (Tabel 5). Mutasi titik di kodon pada posisi ke-3 jarang merubah asam amino (hanya 30% kemungkinan perubahan), sedangkan perubahan pada posisi pertama dan kedua selalu merubah asam amino sampai tingkat 96% (Vandamme 2009). Pensejajaran translasi asam amino dari sekuens sampel pada Gambar 15. Tabel 5. Identifikasi situs SNPs berdasarkan hasil pensejajaran (multiple allignment) DNA sequense fragmen genomik gen SAD dari spesies Elaeis guineensis var Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan spesies E. oleifera serta tiga aksesi NCBI (aksesi U68756 - E. guineensis var Tenera, aksesi FJ940768 dan EU057621 - E. oleifera). Lokasi SNPs Kode Lokus SNPs Posisi SNPs pada fragmen genomik Ref Alternatif alel Alt

Intron

2

1

3

4

5

307

395

541

615

A

G

G

T

G

T

C

G

6

7

Exon 8 9

3'UTR

10

11

12

13

Posisi SNPs pada fragmen 1397 762 1105 1099 812 904 1171 1283 1484 genomik Ref T G C T A A T T C Alternatif alel Alt A T T G G G C G T Ref F R F Y R D F F Residu a. amino Alt Y R F D G Y L C Posisi nukleotida varian pd Kodon triplet 2 2 3 1 1 3 1 2 Status mutasi: NS S S NS NS NS NS NS Keterangan : Kode asam amino: R = arginin, F = fenilalanin, Y = tirosin, D = asam aspartat, L = leusin, C = cistein, G = Glycine, NS = Non synomimus, S = synonimus

31

U68756-Ten Tenera-64 Dura-50 Pisifera-4 VirescensOleifera-6 FJ940768-O EU057621-O







....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 5 15 25 35 45 55 GTRDKGGAFL SFSFFHSLPP LSLSPKGEKR KEERRRKEER AMASMVAFRP EAFLCFSPPK ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------TKEGPFL SFSFFHSLPP SLSLLREKKG RKKGRRKEER AMASMVAFRP EAFLCFSPPK ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 65 75 85 95 105 115 TTRSTRSPRI SMASTVGPST KVEIPKKPFM PPREVHVQVT HSMPPQKIEI FKSLEDWAEN ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------TTRSTRSPRI SMASTVGPST KVEIPKKPFL PPREVHVQVT HSMPPQKIEI FKSLEDWAEN ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 125 135 145 155 165 175 NILVHLKPVE KCWQPQDFLP DPSSEGFHEE VKELRERSKE IPDGYYVCLV GDMITEEALP ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------NILVHLKPVE KCWQPQDFLP DPSSEGFHEE VKELRERSKE IPDDYYVCLV GDMITEEALP ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 185 195 205 215 225 235 TYQTMLNTLD GVRDETGASL TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI TYQTMLNTLD GVRDETGASL TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --MKQIEKTI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 245 255 265 275 285 295 QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP MTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQEGAT FISHGNTARH AKDMGREVGS DMWYNCLGRE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 305 315 325 335 345 355 KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL -RHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 365 375 385 395 405 415 GVDTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGLSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGLSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP

32

U68756-Ten Tenera-64 Dura-50 Pisifera-4 VirescensOleifera-6

....|....| 425 RIPCSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR

.... EVQL EVQL EVQL EVQL EVQL EVQL

Gambar 15. Pensejajaran prediksi asam amino aksesi sampel dengan asam amino yang terdeposit pada bank gen NCBI E.guineensis var Tenera aksesi U68756, E.oleifera FJ940768 dan RU57621. Disain SNPs Primer Polimorfisme pada 13 titik gen SAD yang terpilih menjadi dasar untuk membuat marka SNAP (4 lokus intron, 8 lokus exon dan 1 lokus pada 3’UTRs) gen SAD pada kelapa sawit dengan program SNAPER. Satu lokus SNPs pada intron posisi 193, (segitiga hitam pada Gambar 10) tidak digunakan karena primer yang dihasilkan berpeluang membentuk utas ganda dengan dirinya sendiri (high end self complementary). Disain primer spesifik marka SNAP berdasarkan hasil identifikasi lokus SNPs gen SAD pada kelapa sawit, dilakukan dengan bantuan perangkat lunak WebSnapper yang dapat diakses secara online di alamat website: http://ausubellab.mgh.harvard.edu/. Berdasarkan output WebSnapper, dipilih dua pasang primer yang selanjutnya diberi identitas sebagai primer Ref (sepasang primer reference [reference primer], yaitu primer Ref_forward dan Ref_reverse) dan sepasang primer Alt (sepasang primer alternate [alternate primer], yaitu Alt_forward dan Alt_reverse). Dua pasang primer dihasilkan untuk setiap lokus SNPS. Satu pasang primer rujukan (reference) dan satu pasang primer Alternatif (alternate) (Drenkard et al. 2000). Total ada 26 pasang primer yang dirancang untuk mengamplifikasi 13 lokus SNPs yang diidentifikasi, dengan kisaran ukuran 328 -374 bp. Runutan nukleotida masing-masing primer hasil disain dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. DNA sekuens dari 26 pasang spesifik primer yang digunakan untuk mengamplifikasi marka single nucleotide amplified polymorphism (SNAP) dari genomik DNA kelapa sawit. Kode SNPs Ref SNP 1 Alt Ref SNP 2 Alt Ref SNP 3 Alt

Primer Forward

Primer Reverse

Suhu Annealing (oC)

Ukuran

GGAGAAACTTCTCTGAGATGCA

GATCCTACAGACAGCAAACAAGA

51.0

374

GGAGAAACTTCTCTGAGATCCG

GATCCTACAGACAGCAAACAAGA

51.0

374

GCATAGTCCTTGGCTGGGTA

GGACAGAGAACAGCCCCTAC

48.0

354

GCATAGTCCTTGGCTGAGTC

GGACAGAGAACAGCCCCTA C

48.0

354

AAAAGAACTCAGGCATAACTTAATATCAAGCAACC

TACCTTTCTGGTAGAGTGGACATGAAGCAAATT

55.0

350

AAAAGAACTCAGGCATAACTTAATATCAAGCGAGA

TACCTTTCTGGTAGAGTGGACATGAAGCAAATT

55.0

350

33

Kode SNPS Ref SNP 4 Alt Ref SNP 5 Alt Ref SNP 6

Alt Ref

SNP 7 Alt Ref SNP 8 Alt SNP 9

Ref Alt Ref

SNP 10 Alt Ref SNP 11 Alt Ref SNP 12 Alt Ref SNP 13

Alt

Primer Forward

Primer Reverse

Annealing (oC)

CAAATTATGGAAGCAATCGC

TCAAATTCTGATAAGAGTGAGGGT

51.9

340

GAACAAATTATGGAAGCAATGAG

TCAAATTCTGATAAGAGTGAGGGT

51.9

340

CATGGTATTTTTACTTGATTGAACAT

TTGTCATCCTGACCATCATACA

48.0

374

CATGGTATTTTTACTTGATTGAACAG

TTGTCATCCTGACCATCATACA

48.0

374

ATAGGTTCTGGAATGGATCCGAG

TGGGCTACTGCCGAGAAGTG

51.9

344

TGATAGGTTCTGGAATGGATCCTCT

TGGGCTACTGCCGAGAAGTG

51.9

344

GGTAAGAGAGCCCAGGAGTTC

GCTCATAAGATGATCTGTGATAGCT

51.0

366

GTAAGAGAGCCCAGGACGTT

GCTCATAAGATGATCTGTGATAGCT

51.0

366

AATCGTTTTCAAAACCCTATAACA

GATGACAACCTCTTCGAGCA

53.6

373

ATCGTTTTCAAAACCCTATCAAT

GATGACAACCTCTTCGAGCA

53.6

373

TATGTGGTACAATTGCCGCA

GAGCAAGAGTGCAGACGAAG

52.7

330

TATGTGGTACAATTGCCCCG

GAGCAAGAGTGCAGACGAAG

52.7

330

TGGGAAATGAAAGTCGTCCT

TTATTATGTTTGCTTGGTTGGAG

48.0

330

TGGGAAATGAAAGTCGCACC

TTATTATGTTTGCTTGGTTGGAG

48.0

330

AGTGGGTGAGTTAACCGCCT

GCTCATAAAATGATCTGTGATAGCT

50.2

361

AGTGGGTGAGTTAACCGGAC

GCTCATAAAATGATCTGTGATAGCT

50.2

361

CAAGCACCACGCATACATTT

TTTTCCTACATAGGAGTACTAATACACG

51.0

341

CAAGCACCACGCATACCATG

TTTTCCTACATAGGAGTACTAATACACG

51.0

341

CATAAAATGATCTGTGATAGCTTAGAAG

AGGTAAGAGAGCCCAGGACTT

50.2

328

ATAAAATGATCTGTGATAGCTTACAAA

AGGTAAGAGAGCCCAGGACTT

50.2

328

Ukuran

Uji Primer SAD pada Aksesi Asal Keragaman Disain Primer SNPs 26 pasang primer SNPs yang telah didisain diujikan pada 5 aksesi asal keragaman gen SAD kelapa sawit yang dijadikan bahan untuk mendisain SNPs Primer yang terdiri atas E. guineensis nigrescens var. Tenera-64, Dura-50, Pisifera46, E.guineensis var. Virescens-34 dan E. oleifera-68 (open polinated). DNA genom dianalisis dengan 26 pasang primer spesifik SNAP. Hasil PCR

34 menunjukkan bahwa semua primer dapat mengamplifikasi lokus SNPs dengan baik pada semua sumber keragaman aksesi asal. Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan masing-masing pasangan primer untuk menguji efektivitas dan informativeness 26 pasangan primer spesifik marka SNAP yang dikembangkan. Efektivitas pasangan primer yang dievaluasi ditentukan berdasarkan kemampuannya untuk menghasilkan produk amplifikasi dari templat DNA genomik yang digunakan. Setiap pita DNA yang didapat dari hasil amplifikasi PCR pasangan primer SNPs dapat digunakan sebagai marka SNAP. Untuk itu, efektivitas dan informativeness pasangan primer SNAP spesifik yang telah dikembangkan perlu dievaluasi. Evaluasi pasangan primer SNAP dilakukan dengan mengoptimasi semua aspek yang mempengaruhi keberhasilan PCR, diantaranya dengan melakukan pengecekan dan optimasi suhu annealing untuk setiap primer pasangan primer yang digunakan. Perbedaan suhu annealing dengan skala sangat kecil 0.1-0.3 oC sangat mempengaruhi kualitas hasil amplifikasi PCR dengan primer SNAP. Oleh karena itu perlu dilakukan optimasi PCR lebih dahulu untuk masing-masing pasangan primer SNAP. Hasil optimasi menunjukkan suhu annealing untuk marka SNAP yang didisain berkisar dari 48 oC sampai 53.6 oC. Menurut Subandiyah, 2006 dalam Ardiana (2009), kegagalan dalam PCR sering disebabkan karena proses denaturasi yang tidak sempurna. Suhu yang diprogramkan biasanya 95 °C selama 30 detik atau 97 °C selama 15 detik. Namun untuk DNA yang mengandung G+C tinggi, suhu perlu dinaikkan atau waktu denaturasi diperpanjang tetapi tidak terlalu lama dan suhunya tidak terlalu tinggi karena akan merusak enzim Taq D-pol yang umumnya mempunyai waktu paruh 40 menit pada 95 °C. Simpulan Gen stearoyl ACP desaturase (SAD) sebagai gen kunci yang mempengaruhi pembentukan dan kandungan asam oleat dan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi. Fragmen gen SAD yang diisolasi dari berbagai sumber keragaman kelapa sawit mempunyai nilai Tajima negatif (-1.283062), yang menunjukkan keragaman sekuens SAD kelapa sawit rendah. Hasil identifikasi genome gen SAD terdapat 13 lokus SNPs, yang dikembangkan untuk mendapatkan 26 pasang primer oligonukletida marka SNAP.

BAB IV IDENTIFIKASI DAN ANALISIS SNP BERDASARKAN KERAGAMAN NUKLEOTIDA GEN SAD KELAPA SAWIT

Recommend Documents