MARKA SNAP BERBASIS FRAGMEN GENOMIK GEN SAD SEBAGAI INDIKATOR KANDUNGAN ASAM LEMAK TIDAK JENUH KELAPA SAWIT RISMAYANTI

MARKA SNAP BERBASIS FRAGMEN GENOMIK GEN SAD SEBAGAI INDIKATOR KANDUNGAN ASAM LEMAK TIDAK JENUH KELAPA SAWIT

RISMAYANTI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Marka SNAP berbasis Fragmen Gen SAD sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh Kelapa Sawit”, adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor,

Nofember 2014 Rismayanti NRP A253110051

SUMMARY RISMAYANTI. Marka SNAP Base on SAD Gene Fragment for Unsaturated Fatty Acid Indicator of Oil Palm. Supervised by SUDARSONO as chairman, NURUL KHUMAIDA and WAHYU PURBOWASITO as member of advisory committee. The oil palm is a major vegetable oil producing plant which has the highest yields per hectare of all oil crops. It is necessary to improved, high-yield genetic material with better oil quality to meet the increase global demand for healthy and cheap vegetable oil. The SNPs marka is one of technology, instead of convensional breeding technique that can be used to strenghten breeding program to get oil palm genetic material with high quality oil. The quality of oil affected by unsaturated fatty acids content in the oil. Oleic acid is main component of monounsaturated fatty acids that well known it is good for health, stabil and able to reduce heart disease risk. Stearoyl Acyl-carrier-protein Desaturase (SAD) is a key enzyme for oleic acid biosynthesis. This enzyme play an important role in determining composition of unsaturated fatty acids in oil palm (Elaeis sp.). In this experiment, the genomic fragment of SAD isolated using SAD spesific primer (SAD1 and SAD2) from 5 sources of oil palm variety and used to identified SNPs (single nucleotide polymorphisms) loci. There were 13 loci of SNPs identified from SAD genomic fragments and they used to disain 26 pairs of oligonucleotide primers to generate 13 SNAP markas loci. The 13 SNAP marker were used to evaluate 50 oil palm accessions consisted of E. guineensis and E. oleifera. Out of the 13 SNAP marka loci analyzed, six (6) loci (2 in the intron, 3 in the exon and 1 in 3’UTRs part of SAD genomic fragment) were polymorphic for E. guineensis and E. oleifera acessions. Since E. oleifera is known to have different (high) unsaturated fatty acids compotition in its fruit than those of E. guineensis, these SNAP marka loci might be used to predict genetic variations and oleic acid biosynthetic activities which lead to different composition of unsaturated fatty acid content among segregated progenies derived from hybridization of E. oleifera and E. guineensis. This is the first experiment results that shows SNPs locus combination of exons, introns and 3'UTRs can indicate the content of unsaturated fatty acids in oil crops. The results of this study can be utilized by the oil palm seed industry for selecting the superior parent, getting a superior plant with high unsaturated fatty acid content through crossbreeding. Using SNAP marka in backcross breeding (E.guineensis and E.oleifera) will be able to improve the efficiency of selection, and reduce the number of backcross generation into a half compared to conventional selection. It can indicate the mutated plants in SNPs loci that affecting the content of oleic acid (unsaturated fatty acids), thus help the oil palm breeding programs to obtain plants with high oleic acid content with better oil quality for health and meet international requirements as source material of bioedisel. The results of this study has been registered at Directorate General of Intellectual Property Rights, Ministry of Law and Human Rights Republic of Indonesia for patented since 11 April 2014, number P00201402143, with title “ Penanda SNAP (Single Nucleotide Amplified Polimorphism) Berbasis DNA Sekuens dari Fragmen Genomik Gen Stearoyl Acyl carrier protein Desaturase

(SAD) sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh pada Kelapa Sawit”. Key words : Elaeis guineensis, E. oleifera, Asam oleat, SAD (Stearoyl ACP Desaturase), SNPs, SNAP

RINGKASAN RISMAYANTI. Marka SNAP berbasis Fragmen Gen SAD sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh Kelapa Sawit. Dibimbing oleh SUDARSONO sebagai ketua, NURUL KHUMAIDA dan WAHYU PURBOWASITO sebagai anggota komisi pembimbing. Kelapa sawit merupakan salah satu tanaman penghasil minyak nabati utama dengan produktifitas per hektar tertinggi dibandingkan semua tanaman penghasil minyak lainnya. Kebutuhan terhadap kualitas minyak nabati yang sehat dengan harga yang murah menjadi tren pada perkembangan industri minyak dan asam lemak secara global, diharapkan kelapa sawit dapat memenuhi kebutuhan tersebut. Oleh karena itu perlu dikembangkan materi genetik dengan produktifitas yang tinggi dan kualitas minyak yang baik, sebagai sumber bahan pangan maupun non pangan. Salah satu cara mempercepat mendapatkan tanaman unggul yang memenuhi kriteria yang diinginkan adalah dengan mengembangkan marka molekuler yang dapat mengindikasikan kualitas minyak yang dihasilkan tanaman kelapa sawit sejak dini. SNPs (Single Nucleotide Polimorphisms) merupakan salah satu teknologi marka molekuler, selain pemuliaan konvensional yang dapat dimanfaatkan untuk memperkuat dan mempercepat program pemuliaan kelapa sawit. Kualitas minyak dipengaruhi oleh kandungan asam lemak tidak jenuh pada minyak. Asam oleat merupakan salah satu komponen utama asam lemak tidak jenuh tunggal yang baik untuk kesehatan, bersifat stabil dan mampu mengurangi resiko serangan penyakit jantung. Pembentukan dan kandungan asam oleat serta asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit dipengaruhi oleh gen kunci stearoyl ACP desaturase (SAD). Gen ini memainkan peran penting dalam menentukan komposisi asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit (Elaeis sp.). Dalam penelitian ini, fragmen gen SAD diisolasi dari genom sumber keragaman kelapa sawit untuk mengidentifikasi dan meanganalisis lokus SNP yang digunakan sebagai dasar pengembangan marka SNAP (Single Nucleotide Amplified Polimorphisme). Dua pasang primer gen SAD spesifik berhasil didisain untuk mengisolasi fragmen gen SAD dari genom sumber keragaman kelapa sawit, yakni primer SAD1 dan SAD2. Fragmen gen SAD telah berhasil diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom 5 aksesi kelapa sawit yang terdiri atas satu aksesi spesies E.oleifera (open polinated) dan 4 aksesi dari spesies E.guineensis var tenera, Dura, Pisifera, dan Virescens. Fragmen gen SAD yang diisolasi dari berbagai sumber keragaman kelapa sawit mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen SAD yang terdeposit di NCBI (National Center for Biotechnology Information). Primer SAD1 berhasil mengamplifikasi semua sampel dengan ukuran 1100 bp dengan satu intron ukuran 507 bp. Primer SAD2 menghasilkan urutan basa dengan ukuran 600 bp. Total ukuran exon yang teramplifikasi berkisar antara 969-1032 bp. Hasil identifikasi dan analisis sekuens SAD menghasilkan 13 lokus SNPs gen SAD, yang kemudian dikembangkan untuk mendapatkan 26 pasang marka SNAP. Diantara 13 lokus SNP yang dievaluasi, terdapat enam (6) lokus marka SNAP (2 lokus di bagian intron, 3 lokus di bagian exon, dan 1 lokus di bagian

3’UTRs), yang dapat digunakan untuk menduga variasi aktivitas biosintesis dan komposisi asam lemak tidak jenuh dalam buah kelapa sawit umumnya dan kandungan asam oleat pada khususnya. Ini adalah hasil penelitian pertama yang menunjukkan gabungan lokus SNPs pada exon, intron dan 3’UTRs dapat mengindikasikan kandungan asam lemak tidak jenuh pada tanaman penghasil minyak nabati. Hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh industri benih kelapa sawit untuk mendapatkan induk superior dengan kandungan asam oleat yang tinggi, meningkatkan efisiensi seleksi dan mengurangi jumlah generasi silang balik pada backcross E.oleifera dan E.guineesis, mengindentifikasi tanaman tenera yang mengalami mutasi alami pada gen SAD dengan komposisi kandungan asam lemak spesifik yang dapat diperbanyak dengan teknik kultur jaringan sehingga didapatkan tanaman klon tenera unggul alami tanpa melalui transformasi atau bukan GMO (Genetically Modified Organism). Dengan demikian dapat mempercepat program pemuliaan kelapa sawit untuk mendapatkan tanaman dengan kandungan asam oleat tinggi, yang baik untuk kesehatan dan memenuhi persyaratan internasional sebagai sumber bahan bioedisel. Hasil penelitian ini telah terdaftar di Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Kementerian Hukum dan Hak Azazi Manusia Republik Indonesia untuk dipatenkan sejak 11 April 2014, nomor P00201402143 dengan judul Penanda SNAP (Single Nucleotide Amplified Polimorphism) Berbasis DNA Sekuens dari Fragmen Genomik Gen Stearoyl Acyl carrier protein Desaturase (SAD) sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh pada Kelapa Sawit. Kata kunci: Elaeis guineensis, E. oleifera, Asam oleat, SAD (Stearoyl ACP Desaturase) , SNPs, SNAP

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

MARKA SNAP BERBASIS FRAGMEN GENOMIK GEN SAD SEBAGAI INDIKATOR KANDUNGAN ASAM LEMAK TIDAK JENUH KELAPA SAWIT

RISMAYANTI

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

Penguji pada ujian tesis : Dr. Sintho Wahyuning Ardie, SP, MSi

Judul Tesis : Marka SNAP Berbasis Fragmen Gen SAD sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh Kelapa Sawit Nama NRP

: Rismayanti : A 253110051

Disetujui oleh Komisi Pembimbing

Prof Dr Ir Sudarsono MSc Ketua

Dr Ir Nurul Khumaida, MS Anggota

Dr Wahyu Purbowasito, MSc Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Yudiwanti Wahyu EK, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 19 Agustus 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt atas segala karuniaNya tesis ini berhasil diselesaikan. Tesis ini disusun berdasarkan penelitian dengan judul “Marka SNAP Berbasis Fragmen Gen SAD sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh Kelapa Sawit”. Terima kasih penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Sudarsono MSc selaku ketua komisi pembimbing, Dr Ir Nurul Khumaida MS dan Dr Wahyu Purbowasito MSc sebagai anggota komisi pembimbing, yang telah banyak memberi saran dan bimbingan dalam penelitian dan penyusunan tesis ini. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Kepala Balai Pengkajian Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi dan seluruh staff serta Bapak Satyoso dan staf PT. Astra Agro Lestari, serta seluruh tim PMB Lab, IPB. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, papa (almarhum), mama, kakak dan adikadik serta seluruh keluarga, atas segala doa, dukungan dan kasih sayangnya. Penulis berharap semoga tesis ini dapat memberikan manfaat bagi kemajuan ilmu pemuliaan dan biologi molekuler tanaman penghasil minyak, khususnya perkembangan tanaman kelapa sawit. Penulis menyadari masih banyak kekurangan, besar harapan penulis atas saran dan kritik yang membangun untuk kesempurnaan tesis ini.

Bogor,

Nofember 2014

Rismayanti

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xiii

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian 2

TINJAUAN PUSTIDAKA Kelapa Sawit Metabolisme Asam Lemak dan Gen SAD Pemuliaan Kelapa Sawit Marka SNAP Berdasarkan SNP

3 ISOLASI FRAGMEN GEN STEAROYL ACP DESATURASE (SAD) ASAL 5 SUMBER KERAGAMAN KELAPA SAWIT Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Simpulan 4

5

1 3 3 4 5 8 10 10

14 15 17 22

IDENTIFIKASI DAN ANALISIS SNP BERDASARKAN KERAGAMAN NUKLEOTIDA GEN SAD KELAPA SAWIT Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Simpulan

25 27 28 34

APLIKASI MARKA SNAP UNTUK MEMPREDIKSI KANDUNGAN ASAM OLEAT (ASAM LEMAK TIDAK JENUH) PADA KELAPA SAWIT Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil dan Pembahasan Simpulan

37 39 41 48

6 PEMBAHASAN UMUM

49

7 SIMPULAN DAN SARAN

51

DAFTAR PUSTAKA

52

LAMPIRAN

56

xii

DAFTAR TABEL 1

Komposisi asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh pada minyak sawit dari buah kelapa sawit spesies Elaeis guineensis dan sejumlah aksesi E. oleifera.

14

Dua pasang primer SAD spesifik untuk mengamplifikasi genomik fragmen gen SAD.

18

3

Hasil isolasi 5 sumber keragaman kelapa sawit

19

4

Contoh tingkat kemiripan sequense sampel (Tenera) dengan informasi sequense SAD yang terdeposit di Bank gen, NCBI

21

Identifikasi situs SNPs berdasarkan hasil pensejajaran (multiple allignment) DNA sequense fragmen genomik gen SAD dari spesies Elaeis guineensis var Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan spesies E. oleifera serta dari tiga aksesi NCBI (aksesi U68756 - E. guineensis var Tenera, aksesi FJ940768 E. oleifera, EU057621 - E. oleifera) yang dijadikan sebagai lokus untuk disain primer SNPs.

30

DNA sekuens dari 26 pasang spesifik primer yang digunakan untuk mengamplifikasi marka single nucleotide amplified polymorphism (SNAP) dari genomik DNA kelapa sawit.

32

Variasi asam lemak dan gen pada pathway biosintesis TAG yang berasosiasi dengan tingginya kandungan minyak pada spesies tanaman yang berbeda.

38

Interpretasi hasil analisis dua aksesi kelapa sawit spesies Elaeis guineensis Tenera 06 dan Tenera 08 dengan pasangan primer yang merepresentasikan sejumlah lokus SNPs sebagaimana yang dihasilkan dalam elektroferogram pada Gambar 13.

42

Lokus marka SNAP yang dapat memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh

45

Lokus SNPs diferential yang mampu membedakan SAD asal E. oleifera dan asal E. guineensis dan berpotensi untuk memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh kelapa sawit.

46

2

5

6

7

8

9 10

DAFTAR GAMBAR 1

Bagan alir penelitian

2

Ragam tanaman kelapa sawit. (A) Elaeis guineensis Nigrescens, (B) E. guineensis Virescens, (C) E. oleifera. (D) Buah E.guineensis var. Tenera (Nigrescens), (E) Buah E. guineensis var. Virescens, (F) Buah E. guineensis var. Dura (Nigrescens), dan (G) Buah E. guineensis var. Pisifera (Nigrescens).

4

6

xiii

3

Produk minyak kelapa sawit

7

4

Biosintesis asam lemak pada tanaman

8

5

Dua skema pathway sistesis membran glycerolipid pada daun Arabidopsis.

9

6

Disain Primer SAD spesifik, SAD 1 terdiri atas pasangan primer Forward (F1) dan Revers 1 (R1), SAD 2 terdiri atas pasangan primer Forward (F2) dan Revers 1 (R2)

17

7

Bahan Isolasi DNA (a) Daun Pisifera dari kultur jaringan embrio, (b) Daun tomabak Tenera berasal dari lapangan

19

8

Hasil elektroforesis isolasi DNA

20

9

Elektoforegram hasil SAD primer pada E.guineensis Var. Tenera, Virescens, Dura, Pisifera dan E. oleifera

20

Panjang sekuens yang dihasilkan oleh primer SAD1 dan SAD2. (a) Ukuran Gen SAD aksesi U68756, (b) Hasil amplifikasi Primer SAD 1 dan SAD 2 pada dua daerah yang berbeda.

21

11

Kandungan dan kualitas minyak nabati

25

12

Siklus biosintesis pembentukan asam lemak pada plastid tanaman

26

13

Reaksi katalisasi gen SAD

26

14

Identifikasi SNPs dari hasil pensejajaran urutan basa pada intron

29

15

Pensejajaran prediksi asam amino aksesi sampel dengan asam amino yang terdeposit dalam bank gen NCBI E.guineensis var Tenera aksesi U68756, E.oleifera FJ940768 dan RU57621.

32

16

Bahan isolasi genom aksesi kelapa sawit

41

17

Elektroferogram aksesi 8 dan aksesi 06

41

18

Dendogram hasil amplifikasi 26 pasang SNAP primer pada 50 aksesi kelapa sawit.

43

Dua lokus SNPs gen SAD yang tergolong sebagai SNPs nonsynonimous spesifik untuk spesies Elaeis oleifera.

44

Dendogram 50 aksesi kelapa sawit dengan pada 6 locus SNPs yang mengindikasikan biosintesis kandungan asam oleat

47

10

19 20

DAFTAR LAMPIRAN 1

Lokasi disain primer gen SAD spesifik (SAD1 dan SAD2)

56

2

Sekuens gen SAD dari 5 sumber keragaman kelapa sawit

58

xii

3

Pensejajaran sekuens sampel (exon, intron dan 3’UTRs)

61

4

Pensejajaran 5 sampel dengan aksesi rujukan NCBI

67

5

Asal bahan tanaman 50 aksesi kelapa sawit

75

6

Pendaftaran paten dan nomor paten

76

BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) merupakan tanaman penghasil minyak nabati dengan kemampuan produksi paling tinggi dibandingkan dengan sumber minyak nabati lainnya. Minyak kelapa sawit dapat dimanfaat sebagai sumber bahan pangan, bahan baku industri maupun sebagai alternatif bioenergi (Tan 2009). Produktifitas kelapa sawit per hektar per tahun sepuluh kali lebih tinggi daripada tanaman bunga matahari dan tiga kali lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kelapa, dengan potensi hasil bisa mencapai 18-20 ton (Cocchi et al. 2009). Indonesia sejak tahun 2007 merupakan produsen utama minyak sawit dunia, yang memproduksi lebih dari 44% dan menjadi negara konsumen kelapa sawit terbesar juga sejak tahun 2013 (Hariyadi 2010; USDA 2014). Dua spesies tanaman kelapa sawit yang dikenal luas adalah Elaeis guineensis, yang berasal dari Afrika Barat dan Elaeis oleifera yang berasal dari Amerika Selatan (Corley dan Tinker 2003). E. guineensis telah dibudidayakan secara luas dan komersial sebagai tanaman penghasil minyak nabati, sedangkan pengembangan E. oleifera masih relatif terbatas. Biosintesis minyak pada buah kelapa sawit tidak terlepas dari proses biosintesis asam lemak pada mesokarpa dan inti biji (kernel). Minyak yang berasal dari mesokarpa dan kernel mempunyai komposisi yang berbeda-beda dan tergantung pada proses pembentukan dan akumulasi minyak selama perkembangan buah kelapa sawit (Basri et al. 2004). Asam oleat merupakan salah satu komponen utama asam lemak tidak jenuh tunggal pada minyak sawit yang baik untuk kesehatan. Asam oleat bersifat stabil dan diketahui mampu mengurangi resiko serangan penyakit jantung. Selain itu, kandungan asam lemak tidak jenuh juga penting dalam menunjang industri oleochemical dan nutraceutical (Sundram et al. 2003; Georgios et al. 2005; Masani dan Parveez 2008). Terdapat korelasi positif antara tingginya Kandungan asam lemak tidak jenuh dengan tingginya nilai iodine pada minyak sawit, nilai iodine E. oleifera 80 sedangkan Elaeis guineensis 50 (Rajanaidu et al. 2000). Nilai Iodine adalah banyaknya Iodine (gram) yang dibutuhkan untuk menetralkan ikatan rangkap yang terdapat pada 100 gram minyak (Zulkarnain et al. 2011). Kandungan asam oleat dan nilai iodine yang tinggi akan mempengaruhi tingkat liquiditas minyak kelapa sawit, sehingga minyak sawit tidak akan mudah membeku walaupun berada pada suhu yang rendah. Karakteristik ini penting apabila minyak sawit akan dimanfaatkan sebagai sumber energi atau biofuel (Choo dan Cheah 2000). Minyak yang dihasilkan buah kelapa sawit mengandung asam lemak jenuh yang terdiri atas asam palmitat (16:0) dan asam stearat (18:0) serta asam lemak tidak jenuh yang terdiri atas asam oleat (18:1) dan asam linoleat (18:2). Kandungan asam lemak tidak jenuh dan asam lemak jenuh berbeda antara minyak sawit yang dihasilkan dari buah E. guineensis dan E. oleifera. Minyak sawit dari E. guineensis

2 mempunyai kandungan asam lemak tidak jenuh yang berkisar antara 40-60%. Sebaliknya, minyak sawit dari E. oleifera dilaporkan mempunyai kandungan asam lemah tidak jenuh yang lebih tinggi, yaitu berkisar antara 70-80% (Rajanaidu et al. 2000). E. oleifera memiliki karakter unggul yang dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetik spesies E. guineensis yang telah dibudidayakan secara komersial, melalui pemuliaan tanaman guna menghasilkan varietas E. guineensis baru dengan karakter unggul kandungan asam lemak tidak jenuh yang tinggi (Subhash dan Farida 2012). Proses pembentukan asam lemak tidak jenuh berhubungan dengan aktifitas enzim stearoyl ACP (acyl carier protein) desaturase (SAD) yang merupakan gen kunci pada pembentukan asam oleat. Mesokarpa buah kelapa sawit mengandung enzim SAD yang aktif dan sebagian besar enzim SAD efektif membentuk asam oleat (Parveez 2004). Sejumlah gen kunci yang berperanan dalam pembentukan asam lemak pada tanaman secara umum, juga mempunyai fungsi yang sama dalam biosintesis asam lemak pada buah kelapa sawit (Basri et al. 2004). Gen SAD merupakan gen penyandi enzim stearoyl ACP desaturase, yang merupakan lintasan gen awal untuk pembentukan asam lemak tidak jenuh pada tanaman. Gen SAD menyandi protein yang berfungsi dalam biosintesis asam lemak tidak jenuh (asam oleat dan asam linoleat). Karakterisasi dan purifikasi gen penting tersebut pada kelapa sawit telah dilakukan (Ravigadevi et al. 2000), namun studi yang mempelajari keragaman DNA sekuens dari gen SAD antar varietas dan spesies kelapa sawit yang mempunyai perbedaan kandungan dan komposisi asam lemak tidak jenuh belum terdokumentasi dengan baik. Mesokarpa kelapa sawit sangat aktif dan efektif merubah hampir semua stearoyl ACP menjadi oleoyl-ACP dalam pembentukan asam oleat pada lintasan bisosintesis asam lemak pada kelapa sawit, sehingga untuk meningkatkan kandungan asam oleat pada kelapa sawit dibutuhkan peningkatan aktifitas gen SAD. Mesokarpa E.oleifera mengandung komposisi asam lemak tidak jenuh (asam oleat) lebih tinggi dibandingkan E.guineensis, mempelajari dan membandingkan aktifitas gen SAD pada kedua spesies ini akan membantu mengetahui kunci utama yang menyebabkan perbedaan komposisi asam lemak tidak jenuh pada kedua tanaman ini (Siti et al. 2001). Marka molekuler berbasis keragaman sekuens DNA semakin luas digunakan dalam pemuliaan tanaman karena dapat berfungsi sebagai indikator tidak langsung untuk menseleksi berbagai gen-gen atau karakteristik penting yang mempengaruhi sifat-sifat agronomis unggul pada tanaman (Raj et al. 2011). Salah satu marka molekuler yang bersifat polimorfik dan mampu berfungsi sebagai pembeda adalah marka SNAP (single nucleotide amplified polymorphism) (Ruangchai et al. 2011) yang dikembangkan berdasarkan keberadaan lokus SNPs (single nucleotide polymorphism) akibat keragaman DNA sekuens pada genom tanaman. Satu fragmen DNA yang identik, tetapi berasal dari individu yang berbeda, seringkali mempunyai keragaman dalam DNA sekuensnya. Perbedaan basa tunggal diantara fragmen DNA yang sama disebut sebagai SNPs. Marka molekuler SNAP, yang dikembangkan berbasis keberadaan SNPs, setelah dievaluasi akan dapat membantu pemulia tanaman untuk secara tidak langsung menseleksi galur-galur hasil pemuliaan tanaman dengan daya hasil tinggi atau yang mempunyai keunggulan tertentu seperti resisten terhadap penyakit dan tahan cekaman abiotik. Marka SNPs berbasis pada keragaman DNA sekuens dari

3 fragmen gen tertentu paling banyak digunakan karena langsung berhubungan dengan fungsi gen target yang diinginkan, bersifat stabil, dapat diulang dan mampu menghasilkan marka dengan resolusi yang bagus (Syvanen 2001). Marka molekuler SNPs pada kelapa sawit telah dikembangkan untuk mendeteksi perbedaan sifat terkait dengan warna buah dan ketebalan cangkang. Marka SNPs yang telah dikembangkan tersebut mampu memprediksi warna buah dan ketebalan cangkang dengan tingkat akurasi yang tinggi (Ooi et al. 2011). Pada tanaman Brassica yang juga penghasil minyak nabati, perubahan gen FAD2 dan FAD3 yang berbasis SNPs dapat digunakan sebagai marka molekuler (US Pat.No.2006/0248611 A1) (Xueyi et al. 2006). Tujuan Penelitian Tujuan umum : Mendapatkan marka molekuler SNAP berbasis SNP yang dapat digunakan untuk memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh kelapa sawit. Tujuan khusus : (1) Mengisolasi dan mengetahui runutan nukleotida fragmen gen SAD dari sumber keragaman kelapa sawit. (2) Mempelajari dan mengidentifikasi keragaman nukleotida gen SAD dalam rangka pengembangan Marka molekuler berbasis SNPs. (3) Mengembangkan marka SNAP berbasis SNPs berdasarkan keragaman nukleotida gen SAD yang dapat mengindikasikan kandungan asam lemak tidak jenuh dan asam oleat khususnya pada kelapa sawit. Hipotesis (1) Terdapat keragaman runutan nukleotida fragmen gen SAD dari spesies kelapa sawit E. guinensis dan E. Oleifera. (2) Marka SNAP berbasis single nucleotide polymorphisms (SNPs) dapat diperoleh berdasarkan keragaman gen SAD pada spesies kelapa sawit yang dapat mengindikasikan keragaman dan kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) pada kelapa sawit Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini dapat diterapkan untuk mengembangkan komoditas kelapa sawit dengan kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) yang tinggi. Kelapa sawit dengan kandungan asam lemak tidak jenuh yang tinggi juga mengindikasikan kualitas minyak yang baik bila dimanfaatkan sebagai sumber biodiesel, karena menyebabkan tingkat liquiditas minyak yang tinggi bila digunakan pada suhu rendah. Hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh industri benih kelapa sawit untuk menseleksi induk superior, meningkatkan efisiensi seleksi dan mengurangi jumlah generasi silang balik pada backcross E.oleifera dan E.guineesis. Pada perbanyakan kelapa sawit dengan sistem kultur jaringan dapat digunakan untuk memilih tanaman induk yang berpotensi mengandung asam oleat dan asam lemak tidak jenuh yang tinggi. Marka ini juga dapat digunakan sebagai alat deteksi dini hasil transformasi untuk mendapatkan tanaman unggul dengan kandungan asam lemak tidak jenuh yang tinggi.

4 Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini mempunyai ruang lingkup yang saling berkaitan menjadi satu kesatuan untuk mencapai tujuan penelitian yang melingkupi: (1) Penelusuran data aksesi DNA sekuens gen SAD asal kelapa sawit dan menggunakannya untuk mendisain SAD spesifik primer. (2) Isolasi DNA genom dari daun kelapa sawit dan amplifikasi fragmen genomik gen SAD asal kelapa sawit dari spesies E. guineensis dan E. oleifera dengan primer SAD spesifik menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). (3) DNA sequencing fragmen genomik gen SAD asal kelapa sawit dan analisis keragaman DNA sekuens untuk mengidentifikasi keberadaan situs SNPs pada fragmen genomik gen SAD. (4) Disain pasangan primer SNAP spesifik berbasis keragaman DNA sekuens (SNPs) pada fragmen genomik gen SAD. (5) Uji efektivitas pasangan primer SNAP spesifik. (6) Pengembangan marka SNAP berbasis keragaman gen SAD untuk mengindikasikan kandungan asam lemak tidak jenuh kelapa sawit. Bagan alir penelitian secara rinci disajikan pada Gambar 1.

Database gen SAD (NCBI)

Isolasi DNA Genome E.guineensis & E.oleifera

Disain Primer Spesifik

Amplifikasi DNA genom dengan Primer Spesifik

Elektroforesis Purifikasi DNA Amplifikasi Perunutan Nukleotida Allignment, identifikasi SNPs

Disain SNPs Primer

Isolasi DNA genom 50 aksesi kelapa sawit

Amplifikasi dg SNPs primer Elektroforesis dan Analisis

Gambar 1. Bagan alir penelitian

5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Kelapa Sawit Kelapa sawit sebagai tanaman penghasil minyak nabati mempunyai peran strategis dalam perekonomian nasional. Komoditas kelapa sawit berperan dalam menyerap tenaga kerja, sumber pendapatan dan devisa bagi negara, stimulator pertumbuhan pusat-pusat ekonomi baru di pedesaan, serta sebagai sumber pangan dan energi yang penting bagi Indonesia (Warta 2008). Genus Elaeis terdiri atas tiga spesies yakni Elaeis guineeensis, Elaeis oleifera dan Elaeis odora yang dikenal juga dengan nama Barcella odora (Corley dan Tinker 2003). Namun, yang banyak dikenal dan dimanfaatkan adalah E.guineensis dan E.oleifera. Kelapa sawit adalah tanaman bergenom diploid yang memiliki 32 kromosom dengan 16 pasang kromosom homolog. Elaeis berasal dari kata bahasa Yunani elaion dengan arti minyak, sedangkan guineensis didasarkan kepada asalnya yakni Guinea (pantai Barat Afrika), penamaan ini diberikan oleh Jacquin (1973) ( Corley dan Tinker 2003; Lubis 1992). Elaeis oleifera atau Elaeis melanococca berasal dari Amerika Selatan, merupakan spesies penting sebagai sumber plasma nutfah yang dapat dimanfaatkan untuk perbaikan karakter kelapa sawit komersial (E.guineensis). Kanopi E.oleifera relatif kecil dengan pertumbuhan tinggi tanaman hanya 20 cm/tahun, sedangkan E.guineensis mencapai 45 cm/tahun, sehingga dapat ditanam lebih banyak perhektarnya dan lebih mudah untuk melakukan pemanenan. Perbandingan bunga jantan dan buang betina cukup tinggi, dengan tandan bunga jantan yang sedikit sekali. Disamping itu E.oleifera memiliki kandungan asam lemak tidak jenuh yang lebih tinggi (70-83%) dari pada E.guineensis (40-60%) (Lubis 1992; Pamin 1998). Introduksi kelapa sawit ke Indonesia dimulai pada tahun 1848 dengan penanaman 4 bibit tanaman kelapa sawit di Kebun raya Bogor. Dari keempat bibit tersebut dua bibit diintroduksi dari Bourbon atau Mauritius pada bulan Februari 1848, dan dua bibit lain diintroduksi dari Amsterdam pada bulan Maret 1948. Kemudian dari 4 bibit ini kelapa sawit menyebar menjadi tanaman komersial seperti saat ini. Awalnya kelapa sawit ditanam sebagai komoditi perkebunan dilakukan pada tahun 1911 yang dibangun oleh M.Adrien Hallet berkebangsaan Belgia dengan menanam tanaman kelapa sawit di Perkebunan Sungai Liput (Aceh) dan Pulu Raja (Asahan) (Pamin 1998). Taksonomi tanaman kelapa sawit adalah : Divisi : Tracheophy Subdivisi : Pteropsida Kelas : Angiospermae Subkelas : Monocotyledoneae Ordo : Cocoideae Familia : Palmae Sub Famili : Cocoidae Genus : Elaeis Spesies : Elaeis guineensis Jacq. dan Elaeis oleifera

6

A

D

B

E

C

F

G

Gambar 2. Ragam tanaman kelapa sawit.(A) Elaeis guineensis Nigrescens, (B) E. guineensis Virescens, (C) E. oleifera. (D) Buah E.guineensis var. Tenera (Nigrescens), (E) Buah E. guineensis var. Virescens, (F) Buah E. guineensis var. Dura (Nigrescens), dan (G) Buah E. guineensis var. Pisifera (Nigrescens).

Kelapa sawit diklasifikasikan berdasarkan berbagai hal yang dapat dibedakan atas tipe buah, bentuk buah, tebal cangkang dan warna buah. Berdasarkan ketebalan cangkang buah ada tiga tipe tanaman kelapa sawit, yakni: tipe Dura, tipe Pisifera, dan tipe Tenera (Basri et al. 2004). Salah satu ciri E. guineensis tipe Dura adalah mempunyai cangkang biji yang tebal dan sabut atau mesokarpa yang tebal. Kelapa Sawit tipe Dura pada umumnya digunakan sebagai induk betina dalam pemuliaan kelapa sawit. Tipe Pisifera mempunyai cangkang biji tipis yang digunakan sebagai induk jantan dalam pemuliaan kelapa sawit (Latiff 2000). Kelapa sawit tipe Tenera merupakan kelapa sawit yang dibudidayakan secara komersial untuk menghasilkan minyak. Karakteristik buah Tenera mempunyai ketebalan cangkang biji sedang dan sabut yang tebal sehingga

7 banyak mengandung minyak (Latiff 2000; Basri et al. 2004). Kelapa sawit Tenera pada umumnya merupakan hibrida dari persilangan antara tetua betina Dura dan tetua jantan Pisifera (Hafiz dan Rashid 2011), keragaman kelapa sawit seperti terlihat pada Gambar 2. Berdasarkan warna buah, kelapa sawit dapat dibedakan atas varietas nigrescens, virescens dan Albescens. Varietas nigrescens, buahnya berwarna violet sampai hitam waktu muda dan menjadi merah-kuning (orange) sesudah matang, dengan warna buah yang hampir sama baik yang masih muda ataupun yang sudah masak fisiologis sehingga sulit untuk membedakan perkembangan buahnya. Kelapa sawit dengan warna buah kehijauan saat muda dan buah tua berwarna kekuningan dikenal sebagai Virescens (Latiff 2000). Akibat perubahan warna tersebut memudahkan proses pemanenan tandan buah karena tandan buah yang siap panen akan mempunyai warna buah yang berbeda dengan tandan buah yang masih muda (Hafiz dan Rashid 2011). Buah albescens berwarna kuning pucat, tembus cahaya karena mengandung sedikit protein (Lubis 1992). Komposisi minyak nabati secara umum terdiri atas trigliserida asam lemak yang bisa mencapai 95%, asam lemak bebas (Free Fatty Acid), monogliserida dan digliserida, serta beberapa komponen lain seperti phosphoglyserida, vitamin, mineral dan sulfur. Minyak kelapa sawit terdiri atas dua jenis yang berasal dari bagian buah yang berbeda yakni CPO (crude palm oil) yang berasal dari daging buah, dan Palm Kernel Oil (PKO) yang berasal dari inti biji kelapa sawit. Minyak sawit digunakan sebagai bahan pangan dan industri setelah melalui proses penyulingan, penjernihan, dan penghilangan bau (Refined, Bleached and Deodorized Palm Oil, RBDPO). CPO dapat diuraikan untuk memproduksi minyak sawit cair (RBD Olein) dan minyak sawit padat (RBD Stearin). RBD olein digunakan untuk minyak goreng, sedangkan RBD stearin digunakan untuk margarine dan shortening, serta sebagai bahan baku industri sabun dan deterjen. Produk minyak kelapa sawit disajikan pada Gambar 3. CPO - PKO Edible products

Non edible Products

 Cooking oil/Fats

Oleochemicals

Soap

 Margarine and Shortening

 Fatty acids

Detergent powder

 Table Margarine

Fatty Alcohol

Liquid detergent

 Speciality Fats

 Fatty Acid mathyl

Loundry soap

Cocoa Butter Replacers

 Fatty Amines

Toilet soap

Coffea Whitener, etc

Glycerine

(Fats for Bakery Products



Gambar 3. Produk minyak kelapa sawit

8 Produk turunan kelapa sawit (CPO dan PKO) dapat dibagi atas produk pangan dan non pangan. Produk pangan umumnya digunakan untuk minyak goreng, mentega dan cocoa butter, sedangkan non pangan dimanfaatkan sebagai bahan baku sabun, oleochemical dan sumber energi alternatif yang dikenal dengan biodiesel. Komitmen negara-negara di dunia untuk menggunakan biodiesel dan bioethanol sebagai sumber energi, menjadi peluang untuk perkembangan industri kelapa sawit, disamping itu diversifikasi produk dan pengembangan produk baru dengan nilai tambah diharapkan berlanjut sehingga memperkuat industri kelapa sawit (Pamin 1998; Tan 2009; Bangun 1998). Minyak kelapa sawit relatif cepat diterima oleh pasar domestik dan dunia, dari awal sampai sekarang fokus perhatian perkembangan industri sejak tahun 1968 salah satunya adalah Indonesia dapat menjadi pemasok utama minyak nabati utama dunia. Hal ini tidak terlepas dari beragam manfaat dan kegunaaan minyak kelapa sawit, produksi yang semakin meningkat, aspek nutrisi dan harga yang kompetitif (Pamin 1998). Di pasar pangan dunia, minyak sawit bisa ditemukan sebagai komponen pada satu dari setiap 10 produk pangan yang diperdagangkan (Hariyadi 2010). Metabolisme Asam Lemak dan Gen SAD (Stearoyl ACP Desaturase) Pembentukan minyak pada kelapa sawit tidak terlepas dari metabolisme pembentukan asam lemak pada mesokarpa dan inti biji kelapa sawit. Gen-gen kunci dalam pembentukan asam lemak secara umum pada tanaman juga terdapat pada metabolisme pembentukan kelapa sawit seperti pada Gambar 4. Gen ßketoacyl ACP Syntetase II (KAS II) dan Stearoyl ACP Desaturase merupakan bagian dari gen-gen kunci yang penting pada biosinthesis pembentukan asam lemak pada tanaman. Gen SAD berperan dalam merubah C18:0-ACP menjadi C18:1-ACP untuk pembentukan asam oleat. Karakterisasi dan purifikasi gen tersebut pada kelapa sawit telah dilakukan (Ravigadevi et al. 2000), namun keragaman gen-gen tersebut pada varietas dan spesies kelapa sawit belum tereksplorasi dengan baik. Biosintesis Asam Lemak Stearoyl ACP Desaturase

KAS II

C18:0-ACP Stearoyl ACP Thiosterase

C16:0-ACP (palmitoyl-ACP) Palmitoyl-ACP thloesterase C16:0 (palmitic acid)

C18:1-ACP (oleoyl-ACP)

C18:1 (oleic acid)

C18:0 (stearic acid) Oleoyl-CoA desaturase C18:2-CoA (linoleoyl)

Gambar 4. Biosintesis asam lemak pada tanaman

C18:1-CoA (oleoyl-CoA)

9 Kandungan dan komposisi asam lemak yang berbeda pada E.guineensis (40-60%) dan E.oleifera (70-80%) mengindikasikan adanya keragaman gen pada pembentukan asam lemak kelapa sawit diantara keragaman gen SAD (Rajanaidu et al. 2000). Keragaman ini dapat diidentifikasi dengan memanfaatkan teknologi molekular untuk mendapatkan tanaman kelapa sawit unggul. Kandungan asam oleat tinggi baik untuk kesehatan terutama dalam mengurangi resiko penyakit jantung. Tingginya kandungan asam oleat bersamaan diindikasikan dengan tingginya nilai iodine. Kedua faktor ini akan mempengaruhi tingkat liquiditas minyak kelapa sawit, dimana minyak tidak akan mudah membeku walaupun berada pada suhu yang rendah. Hal ini penting apabila minyak kelapa sawit dimanfaatkan sebagai sumber energi, biofuel.

Gambar 5. Dua alur biosintesis asam lemak pada daun Arabidopsis Sumber : http://lipidlibrary.aocs.org/plantbio/fa_biosynth/ index.htm Biosintesis asam lemak disamping dikontrol oleh DNA pada inti sel, juga terjadi di organel sel yakni pada plastid dan retikum endosplasma (Gambar 5). Dua jenis asam lemak desaturases bertanggung jawab atas asam lemak tidak jenuh yakni asam lemak desaturase-2 (FAD2) dari retikulum endoplasma (ER) dan lemak Asam desaturase-6 (FAD6) dari plastida mengkodekan dua v-6 desaturases yang mengkonversi asam oleat (18:1) menjadi asam linoleat (18:2) dengan memasukkan ikatan ganda pada posisi-6. Sedangkan asam lemak desaturase-3 (FAD3) pada Retikum Endoplasma dan asam lemak desaturase-7 (FAD7) atau asam lemak desaturase-8 (FAD8) dari plastida yang menyandikan tiga desaturases yang mengkonversi asam linoleat (18:2) menjadi asam linolenat (18:3) dengan menyisipkan ikatan ganda pada posisi-3 (Zhang et al. 2012).

10

Pemuliaan Kelapa Sawit Pemuliaan tanaman kelapa sawit merupakan salah satu contoh program pemuliaan yang berhasil, dimana dari 4 bibit yang di tanam di Kebun Raya Bogor tahun 1848 berkembang menjadi tanaman penghasil minyak nabati terbesar di dunia pada saat ini. Pemuliaan tanaman merupakan suatu cabang dari ilmu pertanian yang fokus pada manipulasi keturunan tanaman untuk mengembangkan jenis tanaman baru yang dapat dimanfaatkan oleh manusia (Pamin 1998) Keberhasilan pelaksanaan pemuliaan kelapa sawit sangat bergantung pada ketersediaan variasi sumber genetik. Indonesia memiliki keragaman genetik kelapa sawit yang tidak luas dan hanya berada dalam kisaran segregasi dari bahan genetik yang sempit seperti Deli Dura dan turunan Tenera/Pisifera yang berkerabat dekat (Warta 2008). Oleh karena itu ekploitasi sumber genetik yang berbeda melalui kegiatan introduksi dan eksplorasi ke pusat-pusat keragaman genetik kelapa sawit di Afrika dan Amerika Selatan penting bagi perkembangan industri kelapa sawit. Persilangan dan seleksi pada pemuliaan kelapa sawit memakan waktu yang cukup lama, demikian pula untuk melakukan crossing guna pemanfaatan karakter yang baik dari famili liar. Dengan adanya perkembangan teknologi Marka Asisted Selection (MAS), dapat mempersingkat waktu yang dibutuhkan, perkembangan marka molekuler sangat membantu pemuliaan kelapa sawit. Marka molekuler sebagai salah satu hasil dari perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang bioteknologi memberikan dampak positif untuk perkembangan pemuliaan tanaman. Teknologi marka molekuler pada tanaman berkembang sejalan dengan makin banyaknya pilihan marka DNA yaitu: 1) marka yang berdasarkan pada hibridisasi DNA seperti restriction fragment length polymorphism (RFLP), 2) marka yang berdasarkan pada reaksi rantai polimerase yaitu polymerase chain reaction (PCR) dengan menggunakan sekuenssekuens nukleotida sebagai primer, seperti randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) dan amplified fragment lengthpolymorphism (AFLP), 3) marka yang berdasarkan pada PCR dengan menggunakan primer yang menggabungkan sekuens komplementer spesifik dalam DNA target, seperti sekuens tagged sites (STS), sekuens characterized amplified regions (SCARs), simple sekuens repeats (SSRs) atau mikrosatelit, dan single nucleotide polymorphisms (SNPs) (Azrai 2006). Pemanfaatan marka molekuler juga telah diterapkan pada tanaman kelapa sawit, akan tetapi untuk deteksi dini kualitas minyak kelapa sawit belum tereksplorasi dengan baik. Marka molekuler dapat dikembangkan berbasis keragaman DNA sekuens yang ada dan dapat dimanfaatkan untuk membantu percepatan pengembangan varietas tanaman kelapa sawit unggul di masa yang akan datang, guna menghemat waktu, tenaga dan biaya dalam pemuliaan kelapa sawit. Pengembangan marka molekuler berbasis SNPs diharapkan dapat dilakukan untuk meningkatkan kualitas minyak kelapa sawit, guna memenuhi beragam kebutuhan terhadap beragam komposisi kandungan asam lemak dalam industri yang menggunakan minyak kelapa sawit. Marka SNAP berbasis SNP Marka SNAP (Single Nucleotide Amplified Polymorpism) merupakan salah satu marka molekuler yang dipakai sebagai alat bantu seleksi dan pengukur keanekaragaman genetik tanaman. Marka SNAP bersifat polimorfik dan mampu

11 berfungsi sebagai pembeda pada populasi (Ruangchai et al. 2011). Marka SNAP dikembangkan berdasarkan keberadaan lokus SNP (single nucleotide polymorphism). SNP merupakan perbedaan basa tunggal diantara fragmen DNA yang sama yang disebabkan oleh perbedaan basa pada lokus yang sama maupun karena terjadinya indel (insertion and deletion) sebagai akibat dari keragaman DNA sekuens pada genom tanaman. Satu fragmen DNA yang identik, tetapi berasal dari individu yang berbeda, seringkali juga mempunyai keragaman dalam DNA sekuensnya. Evaluasi marka SNAP secara tidak langsung dapat membantu pemulia tanaman guna menseleksi galur-galur hasil pemuliaan tanaman dengan daya hasil tinggi atau yang mempunyai keunggulan tertentu. Gen SAD mempunyai peranan penting dalam proses biosintesis asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit. Pengembangan marka molekuler SNAP berbasis keragaman DNA sekuens (SNPs) fragmen gen SAD diduga dapat digunakan sebagai prediktor kandungan asam lemak tidak jenuh pada biji kelapa sawit. Pengembangan marka molekuler SNAP untuk memprediksi kandungan asam lemak pada kelapa sawit sampai saat tesis ini ditulis belum ada yang mempublikasikan atau mempatenkan.

12 BAB III

ISOLASI FRAGMEN GEN STEAROYL ACP DESATURASE (SAD) ASAL 5 SUMBER KERAGAMAN KELAPA SAWIT Abstrak Kelapa sawit merupakan tanaman penghasil minyak nabati dengan produktifitas per hektar tertinggi dibandingkan tanaman penghasil minyak lainnya. Asam oleat merupakan salah satu komponen asam lemak tidak jenuh yang baik untuk kesehatan dan terdapat pada tanaman penghasil minyak nabati dan mempengaruhi kualitas minyak. Kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) pada kelapa sawit komersil (Elaeis guineensis) lebih rendah dibandingkan minyak yangdihasilkan Elaeis Oleifera, yang merupakan spesies kelapa sawit yang belum termanfaatkan secara optimal. Pembentukan asam oleat dipengaruhi oleh gen kunci stearoyl acp desaturase, diduga perbedaan komposisi asam oleat pada E. guineensis dan E.oleifera disebabkan oleh perpedaan basa penyusun gen stearoyl acp desaturase. Pada penelitian ini dilakukan isolasi fragmen gen SAD menggunakan dua primer spesisfik SAD (SAD1 dan SAD2) dari 5 sumber keragaman kelapa sawit yang berasal dari dua spesies kelapa sawit, E.guineensis var Dura, Pisifera, Tenera, Virescens dan spesies E.oleifera (open pollinated), untuk melihat perbedaan basa penyusun gen stearoyl acp desaturase. Hasil sequense pada fragmen gen SAD menunjukkan kemiripan yang tinggi (99%) antar kelima sampel dan dengan sequense SAD aksesi E.guineensis U68756, AF 507965 dan aksesi E.oleifera FJ940768, EU057621 yang terdeposit pada NCBI. Primer SAD1 yang menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp dan primer SAD2 yang menghasilkan fragmen gen SAD dengan ukuran 600 bp pada kelima sampel yang diisolasi. Kata kunci : asam oleat, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera, kelapa sawit, stearoyl acp desaturase (SAD)

13

STEAROYL ACP DESATURASE (SAD) GENE FRAGMENT ISOLATION FROM 5 DIFFERSITY SOURCE OF OIL PALM Abstract Oil palm is a vegetable oil crops with the highest productivity per hectare than other oil crops. Oleic acid is a component of the unsaturated fatty acids which have good for human health (lowering blood LDL, Low Density Lipoprotein) and influense to the quality of the vegetable oil. The composition of oleic acid content (unsaturated fatty acids) in commercial oil palm (Elaeis guineensis) is lower that other oil palm spesies (Elaeis oleifera), which is not utilize optimally yet. Oleic acid formation on vegetable oil influence by the key enzym stearoyl acp desaturase (SAD). The oleic acid composition different between E. guineensis and E.oleifera may caused by the difference bases constituent stearoyl acp desaturase of both spesies. This research conduvted to isolate of SAD gene fragments was isolate using two spesifik SAD primers (SAD1 and SAD2) from 5 sources of oil palm diversity derived from two species of oil palm, E.guineensis var Dura, Pisifera, Tenera, virescens and species E.oleifera (open-pollinated). The SAD fragment sequense showed high similarity (99%) to each others sample source and oil palm SAD sequense acsesion E.guineensis U68756, AF 507965 and E.oleifera acsesion FJ940768, EU057621 of NCBI. The SAD 1 produce SAD sequense fragments 1100 bp and the SAD2 primer 600 bp in all five isolated samples. Keywords : differsity, oleic acid, oil quality, oil palm, Stearoyl ACP Desaturase

14 Pendahuluan Kualitas Minyak Kelapa Sawit Kebutuhan terhadap kualitas minyak nabati yang sehat dengan harga yang murah menjadi tren pada perkembangan industri minyak dan asam lemak secara global. Kelapa sawit sebagai salah satu tanaman penghasil minyak utama dengan produktifitas per hektar tertinggi dibandingkan semua tanaman penghasil minyak lainnya, diharapkan dapat memenuhi kebutuhan tersebut. Oleh karena itu perlu dikembangkan materi genetik kelapa sawit dengan hasil tinggi dan kualitas minyak yang baik guna memenuhi kriteria sebagai bahan pangan maupun non pangan. Salah satu cara mempercepat mendapatkan tanaman unggul kelapa sawit, yang memenuhi kriteria diinginkan adalah dengan mengembangkan marka molekuler yang dapat mengidentifikasi kualitas minyak yang dihasilkan. Mesokarpa buah kelapa sawit merupakan sumber penghasil minyak terbesar pada tanaman kelapa sawit. Perbaikan kualitas minyak yang dihasilkan mesokarpa penting dilakukan untuk perkembangan industri kelapa sawit pada masa sekarang dan yang akan datang. Kualitas minyak berkaitan erat dengan biosintesis pembentukan asam lemak dan perbandingan komposisi asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh yang dihasilkan tanaman, kualitas minyak berkorelasi dengan kandungan asam lemak tidak jenuh, semakin tinggi kandungan asam lemak tidak jenuh (asam oleat) kualitas minyak juga semakin tinggi. Lintasan pembentukan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit diawali oleh aktifitas gen SAD (Gambar 4). Ini merupakan gen kunci yang mempengaruhi pembentukan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit, baik asam oleat yang merupakan monounsaturated fatty acid (MUFA) maupun asam linoleat dan linolenat (PUFA). Tabel 1. Komposisi asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh pada minyak sawit spesies Elaeis guineensis dan sejumlah aksesi plasma nutfah E. oleifera. Asam lemak jenuh (%) Spesies

Asal

Honduras

Total

C18.1 a.oleat

C18.2 a.linoleat

Total

18.6

0.2

18.8

56.5

23.3

79.8

17

0.5

17.5

56.7

23.5

80.2

Panama

17.8

0.3

18.1

59.6

21

80.6

Colombia

15.8

0.6

16.4

61.5

20

81.5

Brazil

26.1

0.9

27

51.6

20.6

72.2

Suriname

25

0.4

25.4

70.5

3.6

74.1

4.5

48.5

39

10.1

49.1

Costa Rica E.oleifera

C16.0 C18.0 a.palmitat a.stearat

Asam lemak tidak jenuh (%)

E.guineensis

Sumber: Latiff (2000)

44

15 Kandungan dan komposisi asam lemak yang berbeda pada E.guineensis dan E.oleifera (Tabel 1) mengindikasikan adanya perbedaan gen penyandi enzim yang berperanan dalam lintasan biosintesis pada pembentukan asam lemak pada genom kedua tanaman tersebut. Perbedaan ini dapat diidentifikasi dengan mengevaluasi keragaman DNA sekuens dari masing-masing gen terkait menggunakan teknologi molekuler. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan primer gen SAD spesifik dan fragmen gen SAD yang berasal dari 5 sumber keragaman genom kelapa sawit spesies E.guineensis dan E.oleifera.

Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2012 sampai Mei 2013, di Laboratorium Teknologi Gen dan Kultur Jaringan Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong, Tangerang, Banten. Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah daun kelapa sawit Elaeis guinensis, Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan Elaeis oleifera. Bahan lain yang digunakan meliputi liquid nitrogen, buffer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) yang terdiri atas CTAB 2 %, 100 mM Tris (pH8), 20mM EDTA (pH8), 1.4 M NaCl, dan dH2O, kloroform - isoamil alkohol (24 : 1), agarose, etanol absolut, 5x phusion HF buffer, 10 mM dNTP, DMSO, Phusion Hot start II DNA Polymerase. DNA fragments Extraction kit (Genaid). Loading dye, Gelred, ladder 1 kb, pasangan Primer SAD, SAD1 dan SAD2 forward dan revers 10µL. Alat yang digunakan meliputi mesin PCR, Elektroforesis tank, Laminar Air Flow Cabinet, sentrifus, Water bath, mesin nanodrop, timbangan analitik, oven, mikrowave, pinset, bunsen, petri, mikropipet, shaker, tabung eppendorf, erlenmeyer, ice keeper, mortar, spatula, Tabung Liquid Nitrogen dan pipet tips. Alat gelas yang digunakan labu erlenmeyer 250 ml, tabung penyimpan bahan 200 mL, dan cawan petri. Pelaksanaan Penelitian Persiapan Sampel berupa daun diperoleh dari material kelapa sawit koleksi Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT, Kebun PT PN.8 yang ada di Cimulang dan Cikumpai, Bogor serta asal PT. Astra Agro Lestari. Daun tanaman tenera yang berasal dari lapangan yang digunakan merupakan daun tombak yang masih berwarna putih. Daun tanaman Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera merupakan material hasil kultur jaringan yang berasal dari kultur embrio. Material E.oleifera mrupakan material introduksi dari Camerun yang merupakan open pollinated, yang

16 diintroduksikan oleh PT. AAL. Bahan kimia untuk isolasi DNA, PCR, dan elekstroforesis disiapkan di laboratorium Teknologi Gen. Isolasi DNA Genom Isolasi DNA daun dilakukan berdasarkan metode CTAB Doyle and Doyle (1990) yang dimodifikasi. Sampel daun (0.5 – 1 gr) digerus dengan bantuan nitrogen cair, kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 700 µl bufer ekstraksi. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam water bath selama 30 menit pada suhu 65oC. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 700 µL kloroform - isoamil alkohol (CIA) (24:1). Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4oC, supernatan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf baru. Prosedur penambahan CIA diulangi sampai dua kali dengan tujuan untuk mendapatkan hasil isolasi yang murni. Pelet DNA dicuci dengan menambahkan etanol absolut dua kali volume sampel, kemudian disentrifugasi 10 menit dengan 12.000 rpm pada suhu 40C, kedalam pelet ditambahkan etanol 70% dan disentrifus 12.000 rpm pada suhu 40C selama 5 menit, supernatan dibuang kemudian pellet dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 50 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0). Pengecekan kualitas dan kuantitas DNA genom dilakukan dengan elektroforesis (1% gel agarose) dan nanodrop. Disain Primer Spesifik Disain primer spesifik dilakukan dengan mengakses data sekuenss gen Stearoyl ACP Desaturase dari aksesi tanaman, Elaeis oleifera, Elaeis guineensis, yang terdeposit di NCBI yang terdiri atas U68756 (E.guineensis var Tenera) yang merupakan fragmen gen SAD kelapa sawit terpanjang yang terdapat di NCBI, FJ940768 (E.oleifera), EU057621 (E.oleifera, klon). Daerah yang sama diidentifikasi menggunakan Clustalw Bioedit, sedangkan primer dirancang menggunakan software primer3plus. Amplifikasi DNA Genom dengan Primer Spesifik Sampel DNA yang akan digunakan sebagai template PCR dicek konsentrasi dan kemurniannya terlebih dahulu dengan nanodrop, kemurnian DNA yang digunakan pada panjang gelompang 260/280 berkisar antara 1,8-2,0. Total volume mixed PCR adalah 20µL yang terdiri atas : 4 µL 5x Phusion HF buffer , 0.4 µL 10 µM dNTPs, masing-masing 1 µL Primer Forward dan Revers 10 µM, 0.2 µL Phusion Hot Start II DNA polymerase, 100 ng template DNA dan sisanya dH20. Reaksi PCR dilakukan dengan 30 siklus pada suhu 98ºC selama 30 detik, 98ºC selama 5 detik, 52ºC selama 30 detik, 72ºC selama 15 detik, dan 72ºC selama 5 menit. Elektroforesis Elektroforesis hasil amplifikasi PCR menggunakan 1% gel agarose. 0.3 gram agarose ditambahkan ke dalam 30 mL 1x TAE, kemudian dihomogenkan menggunakan microwave dan ditambahkan sybr safe 1 µL. Sampel DNA dicampur loading dye dengan perbandingan 5:2 kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel dalam tank elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 120 volt selama 30 menit, kemudian dilihat hasilnya menggunakan UV lumination. Hasil

17 PCR dinyatidakan positif apabila terlihat adanya produk yang spesifik sesuai ukuran primer. Perunutan nukleotida dan analisis sekuen produk PCR Produk PCR (single band) dipurifikasi menggunakan PCR DNA fragments Extraction kit (Genaid kit). Hasil purifikasi digunakan sebagai bahan untuk perunutan nukleotida menggunakan mesin DNA sequenser otomatis AB 3130 Genetic Analyzer DNA. Hasil runutan DNA dianalisis menggunakan perangkat lunak BLAST 2.0, yang tersedia secara online di situs NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) untuk mengetahui identitas fragmen genomic DNA yang didapatkan serta tingkat kemiripannya dengan gen SAD tanaman lain. Hasil dan Pembahasan Disain Primer SAD Spesifik Disain primer dilakukan untuk membuat untaian basa nukleotida yang akan menempel dan mengapit daerah untaian DNA tertentu dari total genom yang ada pada kromosom. Pengapitan daerah untaian DNA diperlukan untuk melakukan perbanyakan (amplifikasi) hanya pada daerah untaian DNA tertentu sehingga lebih mudah dalam melakukan analisis. Keberhasilan melakukan amplifikasi daerah untai DNA sangat dipengaruhi oleh kecocokan primer terhadap kondisi DNA target. Disain primer gen SAD spesifik dilakukan dengan mengakses data sekuens gen SAD kedua spesies kelapa sawit dari NCBI aksesi U68756 (E.guineensis var Tenera), FJ940768 (E.oleifera), EU057621 (E.oleifera). Daerah yang sama diidentifikasi dengan Clustalw Bioedit, sedangkan primer dirancang dengan software primer3plus untuk dua daerah dengan urutan basa yang berbeda (Gambar 6) sehingga dihasilkan dua pasang primer, SAD 1 dan SAD 2 seperti pada Tabel 2, lokasi primer berdasarkan aksesi U68756 terdapat pada Lampiran 1. Gen SAD : Ukuran 1715 bp pada aksesi U68756

F1

F2

R1

R2

Gambar 6. Disain Primer SAD spesifik, SAD 1 terdiri atas pasangan primer Forward (F1) dan Revers 1 (R1), SAD 2 terdiri atas pasangan primer Forward (F2) dan Revers 1 (R2) Optimasi suhu annealing dilakukan untuk mendapatkan suhu optimal guna mengamplifikasi gen SAD dari genom kelapa sawit. Dari hasil optimasi diperoleh, suhu optimal untuk primer SAD1 guna mengamplifikasi genom kelapa sawit adalah 52oC, sedangkan suhu optimal untuk primer SAD2 adalah 50oC. Asmini et al. (2010) menambahkan selain suhu annealing (penempelan) dan konsentrasi ion Mg, spesifisitas primer merupakan salah satu faktor penting dalam amplifikasi suatu fragmen DNA.

18

Tabel 2. Dua pasang primer SAD spesifik untuk mengamplifikasi genomik fragmen gen SAD. Primer

Forward

Reverse

Suhu Annealing (oC)

SAD1

ATGCTCAACACCCTTGATGG

GGCATAGTCCTTGGCTGTGT

52

SAD2

CCTGCCCATCTGATGTATGA

CGAGCAAGAACTAGGTTCCA

50

Primer SAD didisain untuk mendapatkan spesifisitas primer untuk gen SAD kelapa sawit, dimana gen SAD merupakan gen kunci pada lintasan pembentukan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit, karena merupakan gen awal yang terbentuk ke arah lintasan pembentuk asam lemak tidak jenuh (diawali dengan pembentukan asam oleat oleh gen SAD). Biosintesis asam lemak kelapa sawit dikendalikan oleh gen-gen kunci penyandi enzim yang berperanan dalam pembentukan asam lemak pada tanaman secara umum. Biosintesis asam lemak menghasilkam asam palmitat (palmitic acid) dan asam stearat (stearic acid) yang merupakan produk asam lemak jenuh, sedangkan asam oleat (oleic acid) dan asam lonoleat serta asam linolenat merupakan produk asam lemak tidak jenuh. Proses pembentukan asam lemak tidak jenuh berhubungan dengan aktifitas gen SAD pada buah kelapa sawit, ini merupakan gen kunci yang berperanan penting dalam proses biosintesis asam lemak tidak jenuh (Basri et al. 2004). Isolasi DNA Genom dari Daun Kelapa Sawit DNA genom yang diisolasi berasal dari tanaman E. guineensis var. Tenera, Dura, Pisifera (Nigrescens), dan E. guineensis var. Tenera (Virescens) serta E. Oleifera untuk mendapatkan informasi sekuens gen SAD. Bahan isolasi DNA yang digunakan dapat digolongkan atas dua yakni dari daun muda yang berasal lapangan dan dari daun serta tahap multiplikasi embrio asal kultur jaringan (Gambar 7). Tenera berasal dari daun muda tanaman di lapangan, sedangkan untuk tanaman Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera berasal dari daun kultur jaringan embrio. Isolasi DNA dilakukan dengan metode CTAB Doyle dan Doyle (1990), yang dimodifikasi dengan melakukan pengulangan tahap penambahan CIA sampai 3x. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan kualitas hasil isolasi DNA yang lebih bagus tanpa bahan pengotor seperti karbohidrat dan metabolit sekunder. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid, sehingga diperlukan cara untuk menghindari hal tersebut (Syafaruddin dan Joko 2011).Saat proses isolasi DNA genom tanaman, keberadaan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisakarida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat.

19

A

B

Gambar 7. Bahan Isolasi DNA, a). Daun hasil kultur jaringan, b) daun tombak dari lapangan. Isolasi DNA menunjukan hasil yang baik, dilihat dari hasil uji kualitatif dan kuantitatif yang telah dilakukan. Hasil isolasi DNA secara kualitatif memperlihatkan intensitas pita hasil elektroforesis yang tampak jelas (Gambar 8). Adanya pita pada bagian awal proses migrasi menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan adalah DNA total. Hasil kuantitatif terdapat pada Tabel 3 dimana konsentrasi DNA yang didapat memadai dengan kemurnian bervariasi berkisar dari 1.8 – 2.0 kecuali virescens dengan kemurnian 1.72, namun ini masih dapat ditolerir karena menghasilkan produk amplifikasi yang bagus (Gambar 9). Tabel 3. Hasil isolasi 5 sampel sumber keragaman kelapa sawit NO 1 2 3 4 5

Sumber Keragaman Tenera Dura Pisifera Virescens E.oleifera

ng/µL 932 2443 130 172 658

260/280 1.94 1.86 1.83 1.72 2.06

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid (Safaruddin et al. 2011). Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0 (Sambrook et al. 1989).

20 1

2

3

4

1000 bp 500 bp

Gambar 8. Hasil elektroforesis DNA genom 1) Ladder 1 kb, 2) Tenera 3) Pisifera, 4). Dura

Amplifikasi Fragmen Genomik gen SAD Kelapa Sawit Hasil amplifikasi PCR menggunakan total genom kelapa sawit sebagai templat (cetidakan) dengan dua pasang primer SAD spesifik, SAD1 dan SAD2 menghasilkan satu pita tunggal fragmen DNA genomik. Primer SAD1 menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp pada semua sampel, sedangkan primer SAD2 menghasilkan pita tunggal fragmen DNA genomik yang berukuran 600 bp pada semua sampel. Representasi hasil elektroferogram produk PCR yang didapat pada sampel E.guineensis var. Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera dapat dilihat pada Gambar 9. Tenera SAD1

SAD2

Virescens SAD1

SAD2

Dura SAD1

SAD2

Pisifera SAD1

SAD2

E.oleifera SAD1

SAD2

1000 bp 500 bp

Gambar 9. Elektroforegram hasil SAD Primer pada E.guineensis Var. Tenera, Virescens, Dura, Pisifera dan E. oleifera Primer SAD1 yang diprediksi menghasilkan fragmen dengan ukuran 600 bp untuk mengamplifikasi DNA genom semua sampel kelapa sawit, Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan E.oleifera (open pollinated), ternyata menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp, diduga terdapat intron diantara sekuens primer yang didisain. Primer SAD 2 menghasilkan fragmen sekuen gen SAD dengan ukuran 600 bp sesuai dengan prediksi awal dan tidak menunjukkan adanya intron.

21 (A) Gen SAD : Ukuran 1715 bp pada aksesi U68756

F1

F2

R1

R2

(B) Prediksi produk PCR dengan primer spesifik SAD: Intron(507 bp)

SAD 1 (1100 bp)

SAD 2 (600 bp)

Gambar 9. Panjang sekuens yang dihasilkan oleh primer SAD 1 dan SAD 2. (a) Ukuran Gen SAD aksesi U68756, (b) Hasil amplifikasi Primer SAD 1 dan SAD 2 pada dua daerah yang berbeda. Identifikasi Sequense SAD Hasil analisis BLAST runutan DNA fragmen gen SAD dari 5 sampel keragaman kelapa sawit (Lampiran 2) yang berhasil diisolasi memiliki tingkat kemiripan 99% dengan sequense SAD kelapa sawit E.guineensis aksesi U68576 dan AF507965 serta E.oleifera aksesi AF940768 dan EU057621 (Tabel 4). Kemiripan dengan Vitis vinifera 80%, sedangkan dengan tanaman jagung (Zea mays) tingkat kemiripannya 79-80%. Hal ini mengindikasikan bahwa fragmen genomik DNA yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah benar sebagai fragmen DNA genomik dari gen SAD asal kelapa sawit. Tabel 4. Contoh tingkat kemiripan sequense sampel (Tenera) dengan informasi sequense SAD yang terdeposit di Bank gen, NCBI Aksesi U68756 FJ940768 EU057621 AF507965 AF143501 XM_002274672 FQ382367 NM_001137864 EU964659 EU960917 XM_002458948 XM_004971016 GU324450

Deskripsi Elaeis guineensis Elaeis oleifera Elaeis oleifera Elaeis guineensis Elaeis guineensis var. tenera Vitis vinifera Vitis vinifera Zea mays Zea mays clone 280673 Zea mays clone 229561 Sorghum bicolor Setaria italica Arachis hypogaea

Query cover (%) 100 100 90 90 94 71 71 71 71 71 70 70 71

Nilai E 0 0 0 0 0 2.00E-153 9.00E-151 4.00E-139 2.00E-137 9.00E-136 4.00E-134 3.00E-130 3.00E-125

Kemiripan (%) 99 99 99 99 89 81 81 80 80 79 79 79 78

22 Simpulan Dua pasang primer gen SAD spesifik berhasil didisain untuk mengisolasi fragmen gen SAD dari genom kelapa sawit yakni primer SAD1 dan SAD2. DNA genome dari daun kelapa sawit yang berasal dari lima sumber keragaman kelapa sawit lapangan, maupun yang berasal dari hasil kultur jaringan embrio menghasilkan kualitas dan kuantitas DNA genom yang baik. Fragmen gen SAD telah berhasil diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom 5 aksesi kelapa sawit yang terdiri atas satu aksesi spesies E.oleifera dan 4 aksesi dari spesies E.guineensis var tenera, Dura, Pisifera, dan Virescens menggunakan primer SAD1 yang menghasilkan fragmen dengan ukuran 1100 bp dan primer SAD2 yang menghasilkan fragmen gen SAD dengan ukuran 600 bp.

23

BAB IV IDENTIFIKASI DAN ANALISIS SNP BERDASARKAN KERAGAMAN NUKLEOTIDA GEN SAD KELAPA SAWIT Abstrak Gen Stearoyl ACP Desaturase (SAD) merupakan gen kunci yang mempengaruhi pembentukan asam oleat pada minyak kelapa sawit. Elaeis guineensis dan Elaeis oleifera adalah dua spesies kelapa sawit yang memiliki komposisi kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) yang berbeda, komposisi asam oleat E.oleifera lebih tinggi dibandingkan E.guineensis. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi dan menganalisis perbedaan susunan sekuens gen SAD kelapa sawit dan mendisain SNP marka berdasarkan lokus SNP yang teridentifikasi. Analisa nilai Tajima lima sumber keragaman gen SAD kelapa sawit adalah -1.283062, nilai negatif Tajima menandakan keragaman sequense gen SAD kelapa sawit rendah. Hasil identifikasi SNP pada fragmen genome gen SAD terdapat 13 lokus SNP yang digunakan untuk mendisain 26 pasang primer oligonukleotida untuk mengembangkan 13 lokus marka SNAP. Kata kunci : Marka, SNAP, SNP, Stearoyl ACP Desaturase (SAD), Kelapa sawit

24

SNP IDENTIFICATION AND ANALYSIS OF OIL PALM SAD (Stearoyl ACP Desaturase) GENE DIFFERSITY Abstrak The Stearoyl ACP desaturase (SAD) is a key enzyme that inffluence to oleic acid formation in palm oil. Oil palm have two spesies Elaeis guineensis and Elaeis oleifera that have different oleic acid (unsaturated fatty acids) composition. This experiments conducted to indentify the loci difference of bases constituent stearoyl acp desaturase and design of SNP markers based on SNP loci identified. The Tajima value of SAD of five sources of oil palm differcity is -1.283062, Tajima negative value indicated that the diversity of SAD sequense is narrow in oil palm. There were 13 SNP loci identify from oil palm SAD fragments genome and use to design 26 oligonucleotide primer pairs to develop the 13 loci markers SNAP. Kata kunci : oil palm, marka, SNAP, SNP, Stearoyl ACP Desaturase (SAD)

25 Pendahuluan Lipid atau lemak merupakan suatu senyawa biomolekul yang larut dalam pelarut organik seperti eter, kloroform dan benzen, tetapi tidak larut dalam air. Minyak merupakan salah satu sumber lipid/lemak alami yang terdapat pada tanaman. Tanaman sebagai sumber penghasil lemak yang signifikan karena banyak spesies tanaman menyimpan asam lemak dalam bentuk triasilgliserol pada biji (Jay et al. 2002). Kelapa sawit merupakan salah satu tanaman penyimpan dan penghasil asam lemak yang paling tinggi dibandingkan tanaman penghasil minyak lainnya. Kandungan asam oleat yang tinggi pada minyak konsumsi, baik untuk kesehatan karena dapat menurunkan kadar kolesterol LDL (Low Density Lipoprotein) dalam darah, ini dapat membantu mengurangi resiko penyakit jantung (Gambar 11). Tingginya kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) mengindikasikan tingginya nilai iodine pada minyak. Kedua faktor ini akan mempengaruhi tingkat liquiditas minyak kelapa sawit, minyak tidak akan mudah membeku walaupun berada pada suhu yang rendah. Hal ini penting apabila minyak kelapa sawit dimanfaatkan sebagai sumber energi, biofuel (Choo and Cheah 2000).

Gambar 11. Kandungan dan kualitas minyak nabati Sumber : Alberto HSHO Nutrisun Biosintesis asam lemak disamping dikontrol oleh DNA pada inti sel, juga terjadi di organel sel lain yakni pada plastid dan retikulum endosplasma (Zhang et al. 2012). Sintesis penyimpanan triasilgliserol lipid (TAG) terjadi melalui jalur gliserol 3-fosfat (Kennedy) di retikulum endoplasma. Lintasan biosintesis asam lemak pada tanaman secara umum digambarkan dalam bentuk diagram alur seperti pada Gambar 12, yang menggambarkan produk intermediat dan enzim kunci yang berperanan dalam setiap tahap lintasannya (Umi et al. 2002; Basri et al. 2002).

26

Gambar 12. Siklus biosintesis pembentukan asam lemak pada plastid tanaman

(Umi et al. 2002) Gen SAD pada Lintasan Pembentukan Asam Lemak. Stearoyl-ACP Desaturase 18:0-ACP (Strearoyl-ACP)

+ O2 + ferredoxin

18 :1-ACP (Oleoyl-ACP)

Gambar 13. Reaksi katalisasi gen SAD Sumber : Deborah et al. 1992 Gen SAD (∆9 18:0ACP desaturase) terdapat pada jaringan daun dan biji tanaman. Gen SAD berperan dalam pembentukan asam oleat dengan menambahkan satu ikatan rangkap dari 18:0 ACP menjadi 18:1-ACP. Semua enzim acyl-ACP desaturase menggunakan ferredoxin (Gambar 13) sebagai kofactor elektron donor, yang dilakukan dalam bentuk fotosintesis (David et al. 2000). Penentuan lokus genomik gen sintesis asam lemak pada kelapa sawit akan membantu memahami regulasi biosintesis asam lemak tanaman (Katayoon et al. 2001). Hal ini dapat dilakukan dengan memanfaatkan teknologi marka molekuler SNPs. SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Marka molekuler secara luas digunakan dalam penelitian tanaman dan pemuliaan tanaman secara ilmiah untuk mengetahui gen yang dapat mempengaruhi sifat agronomi tanaman yang dapat diisolasi dan diketahui posisinya pada peta genetik (Raj et.al., 2011). Marka molekuler dipakai sebagai alat bantu seleksi dan pengukur keanekaragaman genetik, yang telah diaplikasikan juga dalam mendukung pengembangan industri kelapa sawit, diantaranya Marka molekuler

27 SNPs (Single Nucleotide Polymorpism) pada warna buah kelapa sawit (Ooi et al. 2011) SNPs adalah pasangan basa tunggal pada genom yang berbeda antara satu individu dengan individu yang lainnya. SNPs adalah variasi DNA (deoxsi ribonucleic acid) yang terjadi ketika pada suatu lokasi yang bersesuaian hanya satu nukleotid yaitu A (adenin), C (sitosin), G (guanin), T (timin) dalam genom yang berbeda. Misalnya, urutan pasangan basa TAGATA dan TGGATA berbeda pada nukleotide kedua (Setiawan, 2008) Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi SNPs pada sekuens gen SAD dari 5 sumber keragaman kelapa sawit. Hasil identifikasi digunakan sebagai dasar untuk mendisain SNPs primer.

Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2013 sampai Juni 2013, di Laboratorium Teknologi Gen Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong, Tangerang, Banten. Bahan dan Alat Penelitian ini menggunakan data sekuen SAD yang dihasilkan dari percobaan sebelumnya. Data sekuen SAD yang digunakan dalam penelitian ini adalah seguense SAD dari spesies E.guineesis dan E.oleifera. Sekuens SAD spesies E. guineesis berasal dari varietas : 1. Dura, 2. Pisifera, 3. Tenera, 4. Virescens dan 5. spesies E.oleifera Bahan lain yang digunakan adalah agarose, etanol absolut, 5x phusion HF buffer, 10 mM dNTP, DMSO, Phusion Hot start II DNA Polymerase. DNA fragments Extraction kit (Genaid). Loading dye, Gelred, ladder 1 kb, pasangan primer SAD, SAD1 dan SAD2 10µM Alat yang digunakan meliputi mesin PCR, mesin DNA sekuensr, Elektroforesis tank, sentrifus, Water bath, mesin nanodrop, oven, mikrowave, pinset, bunsen, petri, mikropipet, shaker, tabung eppendorf, erlenmeyer, ice keeper, dan pipet tips. Alat gelas yang digunakan labu erlenmeyer 250 ml, tabung penyimpan bahan 200 mL. Allignment dan Identifikasi Posisi SNPs Hasil sekuens dari penelitian sebelumnya dialignment menggunakan CLUSTALW dengan program BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu.BioEdit/ bioedit.html), Mega 6 dan Geneous (http://www.geneous.com) (Drummond et al. 2011), selanjutnya dilakukan identifikasi posisi SNPs. Lokus SNPs dianalisis untuk mengetahui keberadaan SNPs pada exon atau intron, dan mengidentifikasi ada/tidaknya perubahan asam amino karena keberadaan SNPs pada exon. SNPs yang terdeteksi pada bagian intron, exon dan UTRs (Untranslated Regions) dijadikan sebagai dasar mendisain SNPs primer.

28 Disain SNPs Primer Primer spesifik yang berhubungan dengan bagian SNPs yang sudah teridentifikasi, didisain menggunakan Web SNAPER http://ausubellab.mgh. harvard.edu/ program SNAP (Single Nucleotide Amplified Polymorphisms). Amplifikasi Primer SNPs pada genom asal disain primer Primer SNPs digunakan pada genom awal yang jadi bahan untuk mendisain SNPs primer yang terdiri atas 5 sumber keragaman kelapa sawit yakni spesies E.oleifera, dan spesies E.guinenesis var dura, pisifera, tenera, dan virescence dengan PCR. Total volume mixed PCR adalah 20µL yang terdiri atas : 4 µL 5x Phusion HF buffer, 0.4 µL 10 µM dNTPs, masing-masing 1 µL Primer Forward dan Revers 10 µM, 0.2 µL Phusion Hot Start II DNA polymerase, 100 ng template DNA dan sisanya dH20. Reaksi PCR dilakukan dengan 30 siklus pada suhu 98ºC selama 30 detik, 98ºC selama 5 detik, 52ºC selama 30 detik, 72ºC selama 15 detik, dan 72ºC selama 5 menit.

Hasil dan Pembahasan Analisis Urutan Basa Gen Stearoyl ACP Desaturase (SAD) Berdasarkan hasil runutan DNA, fragmen genomik DNA yang diamplifikasi menggunakan pasangan primer SAD1 berukuran 1,100 bp. Hasil analisis juga menunjukkan keberadaan intron dengan panjang 507 bp (Gambar 14) pada fragmen DNA genomik yang diamplifikasi. Hasil amplifikasi dengan pasangan primer SAD2 menghasilkan fragmen sekuens SAD dengan ukuran 600 bp yang terdiri atas exon dan 3’UTRs (3-Untranslated Regions). Analisis runutan DNA hasil amplifikasi kedua pasang primer SAD1 dan SAD2 menunjukkan dua bagian ekson dengan total ukuran antara 969 - 1032 bp. Satu ekson pada posisi upstream dari intron, teridentifikasi mempunyai ukuran 148 bp, sedangkan satu ekson yang berada downstream dari intron, teridentifikasi mempunyai ukuran antara 821 - 884 bp. Bagian 3 UTRs yang teridentifikasi mempunyai ukuran 282 590 bp (Lampiran 2). Pensejajaran hasil sekuens fragmen genom 5 sampel sumber keragaman kelapa sawit bagian exon, intron dan 3 UTRs terdapat pada (Lampiran 3). Analisa nilai tajima menghasilkan nilai -1.283062, nilai negatif pada analisa ini menunjukkan keragaman sequense SAD kelapa sawit rendah, terbukti dengan hasil BLAST, semua sampel menunjukkan tingkat kemiripan yang tinggi satu sama lain (99%). Analisa urutan nukleotida fragmen intron (noncoding) gen SAD menunjukkan adanya 5 situs SNPs. Pada gen SAD kelapa sawit ditemukan lebih banyak SNPS ditemukan pada intron dari pada exon (coding) perpanjang basa. SNPs dua kali lipat lebih banyak terdapat pada urutan basa noncoding dari pada daerah coding tanaman Bunga Matahari (Judith et al. 2007). SNPs yang terdapat pada daerah noncoding, dapat mempengaruhi tingkat ekspresi gen, stabilitas RNA dan menghasilkan varian kuantitatif (Zang dan Zhang 2005).

29 ....|....| 5 GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT GTAAGTTTAT ....|....|

....|....| 15 CATGACAGTC CATGACAGTC CATGACAGTC CATGACAGTC CATGACAGTC ....|....|

....|....| 25 TAGTATTTGC TAGTATTTGC TAGTATTTGC TAGTATTTGC TAGTATTTGC ....|....|

....|....| 35 TCAATTTCTT TCAATTTCTT TCAATTTCTT TCAATTTCTT TCAATTTCTT ....|....|

....|....| 45 TAATTGATAT TAATTGATAT TAATTGATAT TAATTGATAT TAATTGATAT ....|....|

....|....| 55 TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG TTTCCTTGTG ....|....|

65 ATTATAGCAT ATTATAGCAT ATTATAGCAT ATTATAGCAT ATTATAGCAT ....|....|

75 CATCAAATTC CATCAAATTC CATCAAATTC CATCAAATTC CATCAAATTC ....|....|

85 TGATAAGAGT TGATAAGAGT TGATAAGAGT TGATAAGAGT TGATAAGAGT ....|....|

95 GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT GAGGGTGCAT ....|....|

105 TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC TTTGCTTGCC ....|....|

115 CGAACAAGCT CGAACAAGCT CGAACAAGCT CGAACAAGCT CGAACAAGCT ....|....|

Oleifera Tenera Pisifera Dura Virescens

125 TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG TCAAAGGTCG

135 CCAATCATGG CCAATCATGG CCAATCATGG CCAATCATGG CCAATCATGG

145 AGAAACTTCT AGAAACTTCT AGAAACTTCT AGAAACTTCT AGAAACTTCT

155 CTGAGATACA CTGAGATACA CTGAGATACG CTGAGATACA CTGAGATACA

165 GTTGTTATCT GTTGTTATCT GTTGTTATCT GTTGTTATCT GTTGTTATCT

175 CAAAATATGG CAAAATATGG CAAAATATGG CAAAATATGG CAAAATATGG


....|....| 185 GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT GCTTTTTTTT

....|....| 195 CTTTTATCTT CTTTTATCTT CTTTTATCTT CTGTTATCTT CTTTTATCTT

....|....| 205 TTTTTATTTT TTTTTATTTT TTTTTATTTT TTTTTATTTT TTTTTATTTT

....|....| 215 GAATAATTGG GAATAATTGG GAATAATTGG GAATAATTGG GAATAATTGG

....|....| 225 AGCAACTGCA AGCAACTGCA AGCAACTGCA AGCAACTGCA AGCAACTGCA

....|....| 235 AGTTACTTCA AGTTACTTCA AGTTACTTCA AGTTACTTCA AGTTACTTCA


....|....| 245 AAAATAGCTT AAAATAGCTT AAAATATCTT AAAATAGCTT AAAATAGCTT

....|....| 255 GCTTGATATT GCTTGATATT GCTTGATATT GCTTGATATT GCTTGATATT

....|....| 265 AAGTTATGCC AAGTTATGCC AAGTTATGCC AAGTTATGCC AAGTTATGCC

....|....| 275 TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT TGAGTTCTTT

....|....| 285 TATGTGTTCT TATGTGTTCT TATGTGTTCT TATGTGTTCT TATGTGTTCT

....|....| 295 TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC TTTAGGTTTC


....|....| 305 TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC TTTTTAGCCC

....|....| 315 ATTATTGGCT ATTATTGGCT ATTATTGGCT ATTATTGGCT ATTATTGGCT

....|....| 325 TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA TAGTGTTTTA

....|....| 335 TTATCTGGAT TTATCTGGAT TTATCTGGAT TTATCTGGAT TTATCTGGAT

....|....| 345 CAAACATCTT CAAACATCTT CAAACATCTT CAAACATCTT CAAACATCTT

....|....| 355 AGGATAGACT AGGATAGACT AGGATAGACT AGGATAGACT AGGATAGACT


....|....| 365 ATTTTGTATC ATTTTGTATC ATTTTGTATC ATTTTGTATC ATTTTGTATC

....|....| 375 TGTTAACAAA TGTTAACAAA TGTTAACAAA TGTTAACAAA TGTTAACAAA

....|....| 385 TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG TAGTTTGAAG

....|....| 395 CAGTGATTGC CACTGATTGC CAGTGATTGC CAGTGATTGC CACTGATTGC

....|....| 405 TTCCATAATT TTCCATAATT TTCCATAATT TTCCATAATT TTCCATAATT

....|....| 415 TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG TGTTCAGCCG


....|....| 425 ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA ATGCTGGAGA

....|....| 435 TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT TTGCTTGAAT

....|....| 445 TCATGGTATT TCATGGTATT TCATGGTATT TCATGGTATT TCATGGTATT

....|....| 455 TTTACTTGAT TTTACTTGAT TTTACTTGAT TTTACTTGAT TTTACTTGAT

....|....| 465 TGAATAGGTC TGAATATGTC TGAATATGTC TGAATATGTC TGAATAGGTC

....|....| 475 ACATCAATTA ACATCAATTA ACATCAATTA ACATCAATTA ACATCAATTA


....|....| 485 ATATCACTTT ATATCACTTT ATATCACTTT ATATCACTTT ATATCACTTT

....|....| 495 CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT CTTGTTTGCT

....|... 505 GTCTGTAG GTCTGTAG GTCTGTAG GTCTGTAG GTCTGTAG



Gambar 14. Identifikasi SNPs dari hasil pensejajaran urutan basa pada intron

30 Intron telah terbukti meningkatkan efisiensi transkripsi banyak gen pada berbagai organisme. Sebagai contoh, satu studi awal pada tikus menunjukkan bahwa transgen tanpa intron menunjukkan transkripsi 10-100 kali lebih rendah dibandingkan yang mengandung intron. Demikian pula dengan efisiensi transkripsi pengkodean gen pada Drosophila, dimana alkohol dehidrogenase berkurang setelah penghapusan intron. Salah satu cara intron dapat mempengaruhi transkripsi adalah dengan bertindak sebagai penerima elemen regulasi transkripsi (Brinster 1988; Mackenzie et al. 1996; Helve et al. 2003). Pada fragmen exon, untuk mendisain primer SNPs dilakukan penambahan 3 informasi sequense SAD dari aksesi kelapa sawit yang terdapat di NCBI (E.guineensis-Tenera aksesi U68756, E.oleifera aksesi EU057621 dan FJ940768) Lampiran 4. Hasil identifikasi memperlihatkan bahawa SNPs pada daerah exon gen SAD kelapa sawit yg dapat merubah asam amino (Non-synonymous) di 6 lokus SNPs, sedangkan 2 SNPs tidak merubah asam amino (synonymous) (Tabel 5). Mutasi titik di kodon pada posisi ke-3 jarang merubah asam amino (hanya 30% kemungkinan perubahan), sedangkan perubahan pada posisi pertama dan kedua selalu merubah asam amino sampai tingkat 96% (Vandamme 2009). Pensejajaran translasi asam amino dari sekuens sampel pada Gambar 15. Tabel 5. Identifikasi situs SNPs berdasarkan hasil pensejajaran (multiple allignment) DNA sequense fragmen genomik gen SAD dari spesies Elaeis guineensis var Tenera, Dura, Pisifera, Virescens dan spesies E. oleifera serta tiga aksesi NCBI (aksesi U68756 - E. guineensis var Tenera, aksesi FJ940768 dan EU057621 - E. oleifera). Lokasi SNPs Kode Lokus SNPs Posisi SNPs pada fragmen genomik Ref Alternatif alel Alt

Intron

2

1

3

4

5

307

395

541

615

A

G

G

T

G

T

C

G

6

7

Exon 8 9

3'UTR

10

11

12

13

Posisi SNPs pada fragmen 1397 762 1105 1099 812 904 1171 1283 1484 genomik Ref T G C T A A T T C Alternatif alel Alt A T T G G G C G T Ref F R F Y R D F F Residu a. amino Alt Y R F D G Y L C Posisi nukleotida varian pd Kodon triplet 2 2 3 1 1 3 1 2 Status mutasi: NS S S NS NS NS NS NS Keterangan : Kode asam amino: R = arginin, F = fenilalanin, Y = tirosin, D = asam aspartat, L = leusin, C = cistein, G = Glycine, NS = Non synomimus, S = synonimus

31

U68756-Ten Tenera-64 Dura-50 Pisifera-4 VirescensOleifera-6 FJ940768-O EU057621-O







....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 5 15 25 35 45 55 GTRDKGGAFL SFSFFHSLPP LSLSPKGEKR KEERRRKEER AMASMVAFRP EAFLCFSPPK ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------TKEGPFL SFSFFHSLPP SLSLLREKKG RKKGRRKEER AMASMVAFRP EAFLCFSPPK ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 65 75 85 95 105 115 TTRSTRSPRI SMASTVGPST KVEIPKKPFM PPREVHVQVT HSMPPQKIEI FKSLEDWAEN ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------TTRSTRSPRI SMASTVGPST KVEIPKKPFL PPREVHVQVT HSMPPQKIEI FKSLEDWAEN ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 125 135 145 155 165 175 NILVHLKPVE KCWQPQDFLP DPSSEGFHEE VKELRERSKE IPDGYYVCLV GDMITEEALP ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------NILVHLKPVE KCWQPQDFLP DPSSEGFHEE VKELRERSKE IPDDYYVCLV GDMITEEALP ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 185 195 205 215 225 235 TYQTMLNTLD GVRDETGASL TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------L TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI TYQTMLNTLD GVRDETGASL TSWAVWTRAW TAEENRHGDL LNKYLYLSGR VDMKQIEKTI ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --MKQIEKTI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 245 255 265 275 285 295 QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP MTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQEGAT FISHGNTARH AKDMGREVGS DMWYNCLGRE QYLIGSGMDP RTENSPYLGF IYTSFQERAT FISHGNTARH AKEHGDVKLA QICGTIASDE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 305 315 325 335 345 355 KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL -RHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL KRHETAYTKI VEKLFEIDPD GTVLSFADMM KKKISMPAHL MYDGQDDNLF EHFSAVAQRL ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 365 375 385 395 405 415 GVDTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGFSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGLSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP GVYTIDAKDYAD ILEFLINRWK VGELTGLSGE GKRAQDFVCT LAPRIRRIEE RAQERAKQAP

32

U68756-Ten Tenera-64 Dura-50 Pisifera-4 VirescensOleifera-6

....|....| 425 RIPCSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR RIPFSWIYGR

.... EVQL EVQL EVQL EVQL EVQL EVQL

Gambar 15. Pensejajaran prediksi asam amino aksesi sampel dengan asam amino yang terdeposit pada bank gen NCBI E.guineensis var Tenera aksesi U68756, E.oleifera FJ940768 dan RU57621. Disain SNPs Primer Polimorfisme pada 13 titik gen SAD yang terpilih menjadi dasar untuk membuat marka SNAP (4 lokus intron, 8 lokus exon dan 1 lokus pada 3’UTRs) gen SAD pada kelapa sawit dengan program SNAPER. Satu lokus SNPs pada intron posisi 193, (segitiga hitam pada Gambar 10) tidak digunakan karena primer yang dihasilkan berpeluang membentuk utas ganda dengan dirinya sendiri (high end self complementary). Disain primer spesifik marka SNAP berdasarkan hasil identifikasi lokus SNPs gen SAD pada kelapa sawit, dilakukan dengan bantuan perangkat lunak WebSnapper yang dapat diakses secara online di alamat website: http://ausubellab.mgh.harvard.edu/. Berdasarkan output WebSnapper, dipilih dua pasang primer yang selanjutnya diberi identitas sebagai primer Ref (sepasang primer reference [reference primer], yaitu primer Ref_forward dan Ref_reverse) dan sepasang primer Alt (sepasang primer alternate [alternate primer], yaitu Alt_forward dan Alt_reverse). Dua pasang primer dihasilkan untuk setiap lokus SNPS. Satu pasang primer rujukan (reference) dan satu pasang primer Alternatif (alternate) (Drenkard et al. 2000). Total ada 26 pasang primer yang dirancang untuk mengamplifikasi 13 lokus SNPs yang diidentifikasi, dengan kisaran ukuran 328 -374 bp. Runutan nukleotida masing-masing primer hasil disain dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. DNA sekuens dari 26 pasang spesifik primer yang digunakan untuk mengamplifikasi marka single nucleotide amplified polymorphism (SNAP) dari genomik DNA kelapa sawit. Kode SNPs Ref SNP 1 Alt Ref SNP 2 Alt Ref SNP 3 Alt

Primer Forward

Primer Reverse

Suhu Annealing (oC)

Ukuran

GGAGAAACTTCTCTGAGATGCA

GATCCTACAGACAGCAAACAAGA

51.0

374

GGAGAAACTTCTCTGAGATCCG

GATCCTACAGACAGCAAACAAGA

51.0

374

GCATAGTCCTTGGCTGGGTA

GGACAGAGAACAGCCCCTAC

48.0

354

GCATAGTCCTTGGCTGAGTC

GGACAGAGAACAGCCCCTA C

48.0

354

AAAAGAACTCAGGCATAACTTAATATCAAGCAACC

TACCTTTCTGGTAGAGTGGACATGAAGCAAATT

55.0

350

AAAAGAACTCAGGCATAACTTAATATCAAGCGAGA

TACCTTTCTGGTAGAGTGGACATGAAGCAAATT

55.0

350

33

Kode SNPS Ref SNP 4 Alt Ref SNP 5 Alt Ref SNP 6

Alt Ref

SNP 7 Alt Ref SNP 8 Alt SNP 9

Ref Alt Ref

SNP 10 Alt Ref SNP 11 Alt Ref SNP 12 Alt Ref SNP 13

Alt

Primer Forward

Primer Reverse

Annealing (oC)

CAAATTATGGAAGCAATCGC

TCAAATTCTGATAAGAGTGAGGGT

51.9

340

GAACAAATTATGGAAGCAATGAG


51.9

340

CATGGTATTTTTACTTGATTGAACAT

TTGTCATCCTGACCATCATACA

48.0

374

CATGGTATTTTTACTTGATTGAACAG


48.0

374

ATAGGTTCTGGAATGGATCCGAG

TGGGCTACTGCCGAGAAGTG

51.9

344

TGATAGGTTCTGGAATGGATCCTCT

TGGGCTACTGCCGAGAAGTG

51.9

344

GGTAAGAGAGCCCAGGAGTTC

GCTCATAAGATGATCTGTGATAGCT

51.0

366

GTAAGAGAGCCCAGGACGTT


51.0

366

AATCGTTTTCAAAACCCTATAACA

GATGACAACCTCTTCGAGCA

53.6

373

ATCGTTTTCAAAACCCTATCAAT


53.6

373

TATGTGGTACAATTGCCGCA

GAGCAAGAGTGCAGACGAAG

52.7

330

TATGTGGTACAATTGCCCCG

GAGCAAGAGTGCAGACGAAG

52.7

330

TGGGAAATGAAAGTCGTCCT

TTATTATGTTTGCTTGGTTGGAG

48.0

330

TGGGAAATGAAAGTCGCACC


48.0

330

AGTGGGTGAGTTAACCGCCT

GCTCATAAAATGATCTGTGATAGCT

50.2

361

AGTGGGTGAGTTAACCGGAC

GCTCATAAAATGATCTGTGATAGCT

50.2

361

CAAGCACCACGCATACATTT

TTTTCCTACATAGGAGTACTAATACACG

51.0

341

CAAGCACCACGCATACCATG

TTTTCCTACATAGGAGTACTAATACACG

51.0

341

CATAAAATGATCTGTGATAGCTTAGAAG

AGGTAAGAGAGCCCAGGACTT

50.2

328

ATAAAATGATCTGTGATAGCTTACAAA


50.2

328

Ukuran

Uji Primer SAD pada Aksesi Asal Keragaman Disain Primer SNPs 26 pasang primer SNPs yang telah didisain diujikan pada 5 aksesi asal keragaman gen SAD kelapa sawit yang dijadikan bahan untuk mendisain SNPs Primer yang terdiri atas E. guineensis nigrescens var. Tenera-64, Dura-50, Pisifera46, E.guineensis var. Virescens-34 dan E. oleifera-68 (open polinated). DNA genom dianalisis dengan 26 pasang primer spesifik SNAP. Hasil PCR

34 menunjukkan bahwa semua primer dapat mengamplifikasi lokus SNPs dengan baik pada semua sumber keragaman aksesi asal. Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan masing-masing pasangan primer untuk menguji efektivitas dan informativeness 26 pasangan primer spesifik marka SNAP yang dikembangkan. Efektivitas pasangan primer yang dievaluasi ditentukan berdasarkan kemampuannya untuk menghasilkan produk amplifikasi dari templat DNA genomik yang digunakan. Setiap pita DNA yang didapat dari hasil amplifikasi PCR pasangan primer SNPs dapat digunakan sebagai marka SNAP. Untuk itu, efektivitas dan informativeness pasangan primer SNAP spesifik yang telah dikembangkan perlu dievaluasi. Evaluasi pasangan primer SNAP dilakukan dengan mengoptimasi semua aspek yang mempengaruhi keberhasilan PCR, diantaranya dengan melakukan pengecekan dan optimasi suhu annealing untuk setiap primer pasangan primer yang digunakan. Perbedaan suhu annealing dengan skala sangat kecil 0.1-0.3 oC sangat mempengaruhi kualitas hasil amplifikasi PCR dengan primer SNAP. Oleh karena itu perlu dilakukan optimasi PCR lebih dahulu untuk masing-masing pasangan primer SNAP. Hasil optimasi menunjukkan suhu annealing untuk marka SNAP yang didisain berkisar dari 48 oC sampai 53.6 oC. Menurut Subandiyah, 2006 dalam Ardiana (2009), kegagalan dalam PCR sering disebabkan karena proses denaturasi yang tidak sempurna. Suhu yang diprogramkan biasanya 95 °C selama 30 detik atau 97 °C selama 15 detik. Namun untuk DNA yang mengandung G+C tinggi, suhu perlu dinaikkan atau waktu denaturasi diperpanjang tetapi tidak terlalu lama dan suhunya tidak terlalu tinggi karena akan merusak enzim Taq D-pol yang umumnya mempunyai waktu paruh 40 menit pada 95 °C. Simpulan Gen stearoyl ACP desaturase (SAD) sebagai gen kunci yang mempengaruhi pembentukan dan kandungan asam oleat dan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi. Fragmen gen SAD yang diisolasi dari berbagai sumber keragaman kelapa sawit mempunyai nilai Tajima negatif (-1.283062), yang menunjukkan keragaman sekuens SAD kelapa sawit rendah. Hasil identifikasi genome gen SAD terdapat 13 lokus SNPs, yang dikembangkan untuk mendapatkan 26 pasang primer oligonukletida marka SNAP.

35

BAB V APLIKASI MARKA SNAP UNTUK MEMPREDIKSI KANDUNGAN ASAM OLEAT (ASAM LEMAK TIDAK JENUH) PADA KELAPA SAWIT Abstrak

Kelapa sawit merupakan tanaman tahunan penghasil minyak nabati dengan kemampuan produksi tertinggi dibandingkan tanaman penghasil minyak lainnya. Salah satu komponen asam lemak utama yang mempengaruhi kualitas minyak kelapa sawit adalah asam oleat. Minyak dengan kandungan asam oleat yang tinggi dapat mengurangi resiko penyakit jantung. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mempercepat mendapatkan tanaman kelapa sawit unggul dengan kandungan asam oleat tinggi adalah dengan memanfaatkan teknologi marka molekuler. SNP (Single Nucletotide Polimorphisms) merupakan salah satu marka molekuler yang dapat digunakan untuk mengindikasikan kandungan asam lemak pada minyak nabati. Penelitian ini dilakukan untuk menguji 26 pasang marka SNAP yang berasal dari 13 lokus SNP pada 50 genom tanaman kelapa sawit yang berasal dari dua spesies kelapa sawit, Elaeis guineensis dan Elaeis oleifera untuk menindikasikan kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) kelapa sawit. Dari 13 marka SNAP yang berasal dari 13 lokus SNP, terdapat 6 lokus ( 2 di intron, 3 di exon dan 1 di 3UTR’s) yang dapat mengindikasikan kandungan asam oleat kelapa sawit.

Kata kunci : Asam lemak tidak jenuh, asam oleat, kelapa sawit, SNP, SNAP

36 APPLICATION OF SNAP MARKA FOR OLEIC ACID (UNSATURATED FATTY ACID) PREDICTION ON OIL PALM Abstract

The oil palm is a major vegetabel oil producing plant which has the highest yields per hectare of all the oil crops. It is necessary to improved, high-yield genetic material with better oil quality to meet the increase global demand for healthy and cheap vegetabel oil. The SNPs marka is one of technology, instead of convensional breeding technique that can be used to strengthen breeding program to get oil palm genetic material with high quality oil. Stearoyl Acyl-carrier-protein Desaturase (SAD) is a key enzyme for oleic acid biosynthesis. This enzyme play an important role in determining composition of unsaturated fatty acids in oil palm (Elaeis sp.). In this experiment there were 13 SNAP markas were used to evaluate 50 oil palm accessions consisted of E. guineensis and E. oleifera wich developed from previous research. Out of the 13 SNAP marka loci analyzed, six (6) loci (2 in intron, 3 in exon and 1 in 3’UTRs) part of SAD genomic fragment were polymorphic for E.guineensis and E. oleifera acessions. Since E. oleifera is known to have different unsaturated fatty acids compotition in its fruit than those of E. guineensis, these SNAP marka loci might be used to predict genetic variations and oleic acid composition and biosynthetic activities among segregated progenies derived from E. Guieneensis, E.oleifera and oil palm in general. Keywords : oleic acid, oil palm, palm oil, SNP, SNAP

37 Pendahuluan Marka molekuler berbasis keragaman DNA sekuens semakin luas digunakan dalam pemuliaan tanaman karena dapat berfungsi sebagai indikator tidak langsung untuk menyeleksi berbagai gen atau karakter penting yang pada tanaman (Raj et al. 2011). Munculnya banyak marka molekuler baru mempercepat proses menganalisis mutasi dalam penelitian biologi molekuler tanaman. Pemanfaatan marka molekular dalam menunjang pengembangan penelitian komposisi kandungan asam lemak pada tanaman penghasil minyak sudah mulai dilakukan seperti pada Tabel 7. Kandungan dan komposisi asam lemak yang berbeda pada E.guineensis dan E.oleifera mengindikasikan adanya perbedaan gen penyandi enzim yang berperanan dalam lintasan biosintesis pembentukan asam lemak pada genom kedua tanaman tersebut. Perbedaan ini dapat diidentifikasi dengan mengevaluasi keragaman DNA sekuen dari masing-masing gen terkait yang kemudian dikembangkan sebagai untuk marka molekular yang dapat digunakan untuk mengindikasikan kandungan dan komposisi asam lemak pada kelapa sawit. Introgresi gen target menggunakan marka molekuler dalam pemuliaan silang balik dapat meningkatkan efisiensi seleksi dan mengurangi jumlah generasi silang balik menjadi separuhnya dibandingkan dengan seleksi secara konvensional. Hal ini karena pemuliaan secara konvensional memerlukan tambahan beberapa generasi silang dalam secara berulang-ulang serta materi genetik dan tenaga yang lebih banyak. Pemuliaan untuk karakter kualitatif tanaman berhasil dikembangkan melalui pemuliaan secara konvensional dengan metode silang balik. Seperti dijelaskan sebelumnya, metode ini memiliki beberapa kelemahan, yaitu selain membutuhkan waktu yang lama, juga terdapat masalah besarnya linkage drag pada saat dilakukan introgresi gen donor dari plasma nutfah liar ke plasma nutfah komersial. Untuk menghindari linkage drag pada seleksi secara konvensional, dibutuhkan 100 generasi silang balik, sedangkan dengan menggunakan marka sebagai alat bantu seleksi hanya dibutuhkan dua generasi (Azrai, 2006). Introgesi gen target E.oleifera guna mengembangkan E.guineensis yang mempunyai karakter-karakter unggul yang dimiliki oleh E.oleifera menggunakan sistem pemuliaan silang balik (Hernawan et al. 2014). Evaluasi marka SNAP yang didasarkan atas keberadaan SNP pada fragmen gen kunci yang mempengaruhi kualitas minyak kelapa sawit, dapat membantu pemulia tanaman untuk secara tidak langsung menseleksi galur-galur hasil pemuliaan tanaman dengan daya hasil tinggi atau yang mempunyai keunggulan tertentu. Marka SNPs berbasis keragaman DNA sekuens dari fragmen gen tertentu paling banyak digunakan karena langsung berhubungan dengan fungsi gen target yang diinginkan, bersifat stabil, reliable dan mampu menghasilkan marka dengan resolusi yang bagus (Syvanen 2001). Identifikasi dan analisis SNPs dapat memanfaatkan informasi ESTs (Expressed Sekuens Tags) untuk sebagian besar spesies tanaman, yang ditunjang dengan data sequensing sehingga bisa ditemukan peta SNPs-nya (Raj et al. 2011).

38 Tabel 7. Variasi asam lemak dan gen pada pathway biosintesis TAG yang berasosiasi dengan tingginya kandungan minyak pada spesies tanaman yang berbeda. Gen Target FAD 2, FAD 3 Stearoyl—ACP desaturase FAD 2

Keragaman SNP for high oleic acid and low linolenic acid SNP for high stearic acid

Lokasi Variasi Gen Exon

Tanaman Brassica

Exon

Soybean

SNPs for high oleic acid

Exon

Peanut

FAD 3

SNP for low linolenic acid

Soybean

KAS I

SNPs & Indel associated with oleic acid content Indels, SNPs & SSRs associated with variation in composition & concentration of oil 3 bp variation leads to change in amino acid which contribute to high oleate content in oil 3 bp Insertion leads to high oleic acid content SSR linked to oleic acid content Deletion in soybean FAD 3 leads to reduced linolenate SNP associated with high palmitic acid content SSRs associated with high stearic acid SSRs & INDELs associat with high stearic acid Deletions associated with low palmitic acid content

Intron-Exon junction 5′UTR, Exon, Intron —

Exon

Peanut

Exon

Maize

Exon

Soybean Soybean

Exon

Soybean

—

Soybean

—

Sunflower

Exons and Introns

Soybean

KAS III, ACCase, Stearoyl—ACP desaturase, DGAT FAD 2 DGAT1 FAD 2 FAD 3 KAS III Stearoyl—ACP desaturase Stearoyl—ACP desaturase FatB

Soybean Maize

Sumber : Hindawi 2012

Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan marka SNAP yang dapat memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh dengan menganalisis hasil amplifikasi terhadap 50 aksesi kelapa sawit menggunakan 26 pasang primer SNP yang didisain. Lokus-lokus SNP spesifik dianalisis guna memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit.

39 Bahan dan Metode Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei 2013 sampai Desember 2013, di Laboratorium Teknologi Gen dan Kultur Jaringan Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong, Tangerang, Banten. Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah daun kelapa sawit Elaeis guinensis, Tenera, Virescens, Dura dan Pisifera dan somatik embrio pisifera, serta daun Elaeis oleifera (open polinated) (Lampiran 5). Bahan lain yang digunakan meliputi liquid nitrogen, buffer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) yang terdiri atas CTAB 2 %, 100 mM Tris (pH8), 20mM EDTA (pH8), 1.4 M NaCl, dan dH2O, kloroform - isoamil alkohol (24 : 1), agarose, etanol absolut, 5x phusion HF buffer, 10 mM dNTP, DMSO, Phusion Hot start II DNA Polymerase, Loading dye, Gelred, ladder 1 kb, dan 26 pasang Primer SNP Alat yang digunakan meliputi Elektroforesis tank, Laminar Air Flow Cabinet, sentrifus, Water bath, mesin nanodrop, timbangan analitik, oven, mikrowave, pinset, bunsen, petri, mikropipet, shaker, tabung eppendorf, erlenmeyer, ice keeper, mortar, spatula, Tabung Liquid Nitrogen dan pipet tips. Alat gelas yang digunakan labu erlenmeyer 250 ml, tabung penyimpan bahan 200 mL, dan cawan petri. Pelaksanaan Penelitian Persiapan Sampel berupa daun diperoleh dari material kelapa sawit koleksi Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT, Kebun PT. PN.8 yang ada di Cimulang dan Cikumpai, Bogor serta asal PT. Astra Agro Lestari. Daun yang digunakan dari laboratorium merupakan material hasil kultur jaringan yang berasal dari kultur embrio dan daun, sedangkan yang berasal dari lapangan daun yang digunakan berasal dari daun tombak yang masih berwarna putih. Bahan kimia untuk isolasi DNA, PCR, purifikasi, elektroforesis dan perunutan nukleotida disiapkan di laboratorium Teknologi Gen. Isolasi DNA Genom Aksesi Kelapa Sawit Isolasi DNA daun dilakukan berdasarkan metode CTAB Doyle dan Doyle (1990) yang dimodifikasi. Sampel daun digerus dengan bantuan nitrogen cair, kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 700 µl bufer ekstraksi. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam water bath selama 30 menit pada suhu 65oC. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 700 µL kloroform - isoamil alkohol (CIA) (24:1). Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4oC, supernatan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf baru. Prosedur penambahan CIA diulangi sampai dua kali dengan tujuan untuk mendapatkan hasil isolasi yang murni. Pelet DNA dicuci dengan menambahkan etanol absolut dua kali volume, kemudian disentrifugasi 10 menit dengan 12.000 rpm pada suhu 40C,

40 kedalam pelet ditambahkan etanol 70% dan disentrifus 12.000 rpm pada suhu 40C selama 5 menit, buang supernatan dan pellet dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 50 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). Pengecekaan kualitas dan kuantitas DNA genom dilakukan dengan elektroforesis (1% gel agarose) dan nanodrop. Amplifikasi SNAP Marka 50 genom aksesi kelapa sawit Primer SNP digunakan pada 50 aksesi kelapa sawit spesies E.oleifera, E.guinenesis var dura, pisifera, tenera, dan virescence dengan PCR. Total volume mixed PCR adalah 20µL yang terdiri atas : 4 µL 5x Phusion HF buffer, 0.4 µL 10 µM dNTPs, masing-masing 1 µL Primer Forward dan Revers 10 µM, 0.2 µL Phusion Hot Start II DNA polymerase, 100 ng template DNA dan sisanya dH20. Reaksi PCR dilakukan dengan 30 siklus pada suhu 98ºC selama 30 detik, 98ºC selama 5 detik, 52ºC selama 30 detik, 72ºC selama 15 detik, dan 72ºC selama 5 menit. Elektroforesis dan Analisa Hasil Amplifikasi SNP Hasil amplifikasi SNP dari aksesi kelapa sawit dianalisis dengan melakukan elektroforesis pada agarose 1%, untuk mengidentifikasi ada atau tidaknya band SNP. Data dianalisis menggunakan program NTSYSpc (Soleiman et al. 2011). Analisis lokus-lokus spesifik dilakukan berdasarkan informasi perbedaan fragmen sekuens genome gen SAD antara E.guineensis dan E.oleifera dan lokus-lokus yang dapat menyebabkan perbedaan asam amino pada E. Oleifera dengan program NTSYSpc.

41 Hasil dan Pembahasan Keragaman Gen SAD pada 50 Aksesi Populasi Kelapa Sawit Primer SNPs yang telah didisain dari tahap penelitian sebelumnya digunakan untuk menganalisis 50 aksesi kelapa sawit yang terdiri atas E. Guineensis nigrescens var. Tenera 29 tanaman, Dura 5 tanaman, Pisifera 10 tanaman, E.guineensis var. Virescens 4 tanaman dan E. oleifera 2 tanaman (open polinated) pada Lampiran 4. DNA genom berasal dari bagian daun, (daun muda yang berasal dari lapangan, daun hasil kultur jaringan embrio dan tahapan multiplikasi embrio kultur jaringan (Gambar 16).

a

b

C

Gambar 16. Bahan isolasi genom aksesi kelapa sawit a). Daun kultur embrio Virescens b). Daun tombak (pucuk) dari lapangan Tenera c). Multiplikasi embrio Pisifera 50 Aksesi DNA genom dianalisis dengan 26 pasang primer spesifik SNAP. Hasil PCR menunjukkan bahwa semua primer dapat mengamplifikasi lokus SNP dengan baik pada semua aksesi. Gambar 13 merupakan representasi elektroferogram hasil uji amplifikasi DNA genom dua aksesi kelapa sawit E. guineensis var. Tenera 08 dan Tenera 06 menggunakan pasangan SNAP spesifik primer untuk menghasilkan Marka SNAP pada masing-masing lokus (Lc) yang dianalisis. Interpretasi hasil analisis elektroferogram gambar 17 terdapat pada tabel 8. Tenera 08

Lc#1

Lc#3

Lc#5

Tenera 06

Lc#7

Lc#8

Lc#7

Lc#8

λ-DNA

500bp 250bp

Gambar 17. Elektroferogram hasil uji amplifikasi DNA genom dua aksesi kelapa sawit E. guineensis var. Tenera 08 dan Tenera 06 menggunakan pasangan SNAP spesifik primer.

42 Tabel 8. Interpretasi hasil analisis dua aksesi kelapa sawit spesies Elaeis guineensis Tenera 06 dan Tenera 08 dengan pasangan primer yang merepresentasikan sejumlah lokus SNP sebagaimana yang dihasilkan dalam elektroferogram pada Gambar 13. Lokus

Lc#1 Lc#3 Lc#5 Lc#7 Lc#8

Lc#7 Lc#8

Primer ID Ref Alt Ref Alt Ref Alt Ref Alt Ref Alt Ref Alt Ref Alt

Alternatif alel Skor hasil PCR Aksesi Elaeis guineensis Tenera 08 A G + G + T + T + G + C T + T + G Aksesi Elaeis guineensis Tenera 06 C + T T + G +

Genotipe

G/G

Hm

G/T

Ht

T/G

Ht

T/T

Hm

T/T

Hm

C/C

Hm

T/G

Ht

Keterangan: Ht = heterosigot, Hm = homozigot

Produk amplifikasi yang dihasilkan dari masing-masing primer pada lokus SNP merupakan alel dari lokus SNPs. Masing-masing situs SNPs yang digunakan sebagai dasar untuk menghasilkan pasangan primer dievaluasi. Evaluasi ada tidaknya hasil amplifikasi dari pasangan primer Ref dan pasangan primer Alt, dilakukan untuk menentukan konstitusi genetik individu tanaman yang diuji sebagai heterozigot atau homozigot. Hasil analisis klaster menggunakan NTSYSPc untuk mengelompokkan 50 aksesi kelapa sawit yang dievaluasi ke dalam kelompok-kelompok berdasarkan kesamaan alel pada 13 lokus Marka SNAP terdapat pada dendogram (Gambar 18). Tiga belas situs SNPs yang ditemukan pada fragmen genomik gen SAD berhubungan dengan DNA sekuens dari 26 pasang primer spesifik Marka SNAP menghasilkan 13 lokus Marka SNAP. Hasil analisis mampu membedakan aksesi E. oleifera aksesi No. 76 ke dalam kelompok terpisah bersama E. guineensis - Pisifera 41 dan 46. Namun tidak memberikan perbedaan spesifik berdasarkan keragaman varietas dan perbedaan spesies antara E.guineensis dan E.oleifera. E.oleifera-68 dan 76 tidak membentuk kelompok spesifik, diduga hal ini terjadi karena karakter gen SAD antara kedua spesies dan varietas tidak menunjukkan perbadaan spesifik pada 13 lokus SNP. Ini didukung oleh Shah et al. (2000) yang menemukan bahwa analisis southern blot tidak menunjukkan perbedaan karakter gen SAD antara dua spesies kelapa sawit E.guineensis dan E.oleifera maupun diantara tetua E.guineensis var Dura dan Pisifera serta tenera

43

Tenera.70 Dura.50 Tenera.72 Tenera.36 Tenera.31 Dura.43 Tenera.35 Pisifera.26 Tenera.49 Tenera.8 Tenera.18 Tenera.29 Tenera.5 Dura.27 Tenera.66 Tenera.82 Virescense.84 Tenera.4 Oleifera.68 Tenera.85 Pisifera.77 Tenera.80 Tenera.79 Virescense.75 Tenera.14 Pisifera.78 Virescense.73 Tenera.12 Tenera.69 Tenera.20 Tenera.64 Dura.58 Pisifera.57 Tenera.65 Tenera.25 Tenera.42 Tenera.59 Virescense.34 Pisifera.55 Tenera.52 Tenera.30 Pisifera.7 Tenera.81 Pisifera.87 Dura.3 Pisifera.54 Tenera.88 Pisifera.41 Oleifera.76 Pisifera.46 0.40

0.55

0.70

0.85

1.00

Coefficient koefisien

Gambar 18. Dendogram hasil amplifikasi 26 pasang SNAP primer pada 50 aksesi kelapa sawit.

Material yang berasal dari sumber yang berbeda (lapangan dan kultur jaringan) tidak memperlihatkan perbedaan dan pengelompokan spesifik dengan keduapuluh enam pasang primer. Ini menunjukkan bahwa material yang berasal dari kultur jaringan mempunya karakter gen SAD yang sama dengan material yang berasal dari lapangan. Hal ini mengindikasikan teknik kultur jaringan tidak menyebabkan perubahan atau mutasi pada gen SAD, karakter gen SAD stabil meskipun diperbanyak dengan teknik kultur jaringan.

Marka SNAP yang Mengindikasikan Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh Lokus SNPs pada situs 904 (Gambar 15), mempunyai alel alternatif nukleotida A pada sampel E. guineensis dan G pada sampel E. Oleifera aksesi EU057621 dan FJ940768. Mutasi titik yang terjadi dari nukleotida A menjadi G, menyebabkan terjadinya perubahan asam amino yang ditranslasi dari D (Aspartat) pada E. guineensis menjadi Y (Tirosin) pada E. oleifera.

44 (a) DNA Sekuens :

Tenera Oleifera Dura Pisifera Tenera-U68756 Oleife-FU940768 Oleife-EU057621 Virescense

-----------------------------------------

(b) Residu asam amino : Ten-U68756 E. oleifera - EU057621

E. oleifera - FU940768

----------

Gambar 19. Dua lokus SNPs gen SAD yang tergolong sebagai SNP nonsynonimous spesifik untuk spesies Elaeis oleifera. D = A.aspartat, Y = Tirosin, F= Fenilalanin, L = Leusin Lokus SNPs pada situs 1171, mempunyai alel alternatif nukleotida T pada sampel E. guineensis dan C pada sampel E. oleifera. Mutasi titik yang terjadi dari nukleotida T menjadi C, menyebabkan terjadinya perubahan residu asam amino F (fenilalanin) pada E. guineensis menjadi L (leusin) pada E. oleifera. Berdasarkan perubahan residu asam amino yang disandi, maka situs SNP 904 dan 1171 merupakan situs SNP non-synonimous. Jing et al. (2013) menemukan dua SNPs di daerah coding gen fad2 meningkatkan asam lemak polyunsaturated pada tanaman Tung Vernicia fordii yang berpotensi menjadi bahan alternatif energi. Perbedaan asam amino yang membentuk gen SAD pada E.oleifera diduga menyebabkan kandungan komposisi asam oleat yang lebih tinggi pada E.oleifera dibandingkan E.guineensis. Tingginya asam oleat berkorelasi dengan tingginya nilai Iodine pada minyak, yang merupakan salah satu indikasi untuk memenuhi persyaratan sebagai sumber biodiesel yang baik. Dimana dengan nilai Iodine yang tinggi, biodiesel lebih cair dan tidak mudah membeku pada suhu rendah (Choo dan Cheah 2000). Diantara 13 lokus marka SNAP yang dievaluasi, terdapat enam (6) lokus marka SNAP, 2 lokus di bagian intron (SNP 4 dan 5) dan 3 lokus di bagian exon (SNP 7,8,10), dan 1 di bagian 3UTRs (SNP 13) (Tabel 9). Hasil analisis gabungan keenam marka SNAP pada keenam lokus tersebut, dapat digunakan untuk menduga variasi aktivitas biosintesis dan komposisi asam oleat dan asam lemak tidak jenuh dalam buah kelapa sawit. Hasil analisis klaster yang mengelompokkan 50 aksesi kelapa sawit (Gambar 20) dengan 12 pasang Marka SNAP dari 6 lokus SNPs (Tabel 10), ke dalam kelompok-kelompok berdasarkan kesamaan alel untuk enam lokus. Analisis keenam lokus mampu membedakan aksesi E. oleifera aksesi No. 76 ke dalam kelompok terpisah dari 49 aksesi E. guineensis yang dievaluasi. Hasil analisis juga menunjukkan bahwa E. oleifera aksesi no. 68 masih mengelompok dengan aksesi E. guineensis – Pisifera No. 55, ini memungkinkan karena material E. oleifera yang

45 digunakan merupakan material persilangan open polinated. Tanda panah menunjukkan posisi dua aksesi E. oleifera. Tabel 9. Lokus marka SNAP yang dapat memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh Posisi SNP Kode Lokus SNP Posisi SNP pada fragmen genomik Ref Alternatif alel Alt Ref Residu a. amino Alt Posisi nukleotida varian pd Kodon triplet Status mutasi: Sinonimus (S) atau Non-sinonimus (NS)

Intron

Exon

3'UTRs

4

5

7

8

10

13

541 G C

615 T G

1105 C T F F

1099 T G Y D

904 A G D Y

1484 C T

3

1

3

S

NS

NS

Tenera 52 berada pada kelompok yang terpisah dengan 49 aksesi lainnya, diduga terjadi perbedaan sekuens karena mutasi pada 6 lokus gen penyandi pembentukan asam oleat yang memberikan perbedaan yang nyata dengan sekuens 49 aksesi lainnya. Hal ini dapat menyebabkan tenera 52 mempunyai kandungan asam oleat dan kandungan asam lemak tidak jenuh yang berbeda dibandingkan E.guineensis. Tenera-52 merupakan aksesi yang berasal dari lapangan, bukan dari hasil kultur jaringan, diduga terjadi mutasi alami pada aksesi Tenera-52 pada lokus-lokus yang analisis. Mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada materi genetik sehingga menyebabkan perubahan ekspresi. Perubahan dapat terjadi pada tingkat pasangan basa, tingkat satu ruas DNA, bahkan pada tingkat kromosom. Mutasi dapat terjadi alami maupun dengan diinduksi. Mutasi alami terjadi secara spontan yang tidak diketahui penyebabnya dan terjadi secara acak tanpa diketahui kapan terjadinya. Peluang terjadinya mutasi alami sangat kecil yaitu 10-6 –10-7 (Aisyah 2006). Mutasi alami ini terjadi secara lambat dan terus menerus sehingga memerlukan waktu yang lama untuk mengakumulasi dalam menghasilkan mutan. Tejadinya mutasi pada lokus SNPs sequense SAD yang dapat mempengaruhi kadar asam lemak tidak jenuh akan menambah keragaman pada tanaman kelapa sawit, yang dapat berdampak positif bila hal itu dapat meningkatkan kandungan asam lemak tidak jenuh pada tanaman tenera tanpa melalui transformasi atau mutasi induksi. Perlu dilakukan evaluasi lebih lanjut terhadap kandungan asam lemak Tenera-52.

46 Tabel 10. Lokus SNPs diferential yang mampu membedakan SAD asal E. oleifera dan asal E. guineensis dan berpotensi untuk memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh kelapa sawit. Kode SNP Ref SNP 4* Alt Ref SNP 5* Alt Ref SNP 7* Alt Ref SNP 8* Alt SNP 10*

Ref Alt Ref

SNP 13*

Alt

Sekuens Primer Forward

Sekuens Primer Reverse

CAAATTATGGAAGCAATCGC


GAACAAATTATGGAAGCAATGAG


CATGGTATTTTTACTTGATTGAACAT


CATGGTATTTTTACTTGATTGAACAG


GGTAAGAGAGCCCAGGAGTTC


GTAAGAGAGCCCAGGACGTT


AATCGTTTTCAAAACCCTATAACA


ATCGTTTTCAAAACCCTATCAAT


TGGGAAATGAAAGTCGTCCT


TGGGAAATGAAAGTCGCACC


CATAAAATGATCTGTGATAGCTTAGAAG


ATAAAATGATCTGTGATAGCTTACAAA


Anneal- Ukuran ing (oC) produk 51,9

340

51,9

340

48,0

374

48,0

374

51,0

366

51,0

366

53,6

373

53,6

373

48,0

330

48,0

330

50,2

328

50,2

328

6 lokus spesifik yang dapat mengindikasikan kandungan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit terdiri atas : 2 lokus berada di intron (lokus 4 dan 5), 3 lokus pada exon (lokus 7,8,10) dan 1 lokus (lokus 13) berasal dari bagian 3’UTRs (Untranslated Region). Ini adalah laporan pertama yang menunjukkan gabungan lokus SNPs pada intron, exon dan 3’UTR yang diduga dapat mengindikasikan kandungan asam lemak pada tanaman. Hasil transformasi tanaman kedelai (Glycine max), menggunakan sequense intron dari gen asam lemak oleil D12 desaturase FAD2-1A menyebabkan penurunan yang efisien dan spesifik transkripsi FAD2-1 dalam perkembangan benih, meningkatkan kandungan asam oleat dan menurunkan asam lemak tidak jenuh ganda (Polyunsaturated fatty acid, PUFA) (Andrew et al 2010). Lokus SNP pada exon yang mengindikasikan kandungan asam lemak pada kelapa sawit teridentifikasi sebagai lokus synamomous dan non-synamomous. Perubahan asam amino pada pada lokus exon menjadi salah satu hal yang menyebabkan kandungan asam lemak tidak jenuh yang berbeda pada tanaman kelapa sawit.

47 Oleifera.76 Oleifera.68 Pisifera.55 Tenera.49 Tenera.70 Tenera.85 Tenera.8 Tenera.66 Tenera.18 Tenera.81 Pisifera.26 Tenera.4 Tenera.72 Tenera.65 Tenera.79 Tenera.14 Pisifera.78 Virescense.75 Tenera.36 Tenera.80 Pisifera.77 Dura.27 Virescense.84 Tenera.59 Tenera.42 Virescense.34 Tenera.31 Pisifera.87 Dura.50 Tenera.82 Dura.43 Tenera.25 Tenera.35 Pisifera.54 Dura.3 Tenera.88 Dura.58 Tenera.12 Pisifera.57 Tenera.69 Tenera.20 Virescense.73 Tenera.64 Pisifera.7 Pisifera.46 Tenera.29 Tenera.5 Pisifera.41 Tenera.30 Tenera.52 0.40

0.55

0.70

koefisien Coefficient

0.85

1.00

Gambar 20. Dendogram 50 aksesi kelapa sawit dengan pada 6 Locus SNPs yang mengindikasikan biosintesis kandungan asam oleat Christoper et al. (2008) menemukan bahwa beberapa gen lebih bergantung pada 3’UTRs, dari pada promotor selama perkembangan benih. Unsur-unsur pengaturan 3'UTR diharapkan berfungsi setelah transkripsi di tingkat mRNA, tetapi pada prinsipnya bisa juga berfungsi pada tingkat DNA sebagai peningkat distal untuk memodulasi transkripsi. Pada kelapa sawit, dari hasil penelitian ini juga menunjukkan peranan penting 3’UTRs pada lintasan pembentukan asam lemak jenuh sebagai salah satu lokus untuk memprediksi kandungan asam lemak kelapa sawit bersama dengan lokus-lokus lainnya pada bagian intron dan exon. Marka SNP bersifat ko-dominan yang mampu dengan efektif membedakan individu kelapa sawit dengan genotipe heretozigot dari individu lain yang bergenotipe homozigot untuk lokus yang dianalisis sehingga sangat berguna dalam proses identifikasi dan material kelapa sawit. Marka SNAP yang dikembangkan berbasis keragaman DNA sekuens gen SAD asal kelapa sawit berpotensi untuk digunakan sebagai alat seleksi pemuliaan tanaman kelapa sawit untuk mendapatkan genotipe dengan kandungan asam lemak tidak jenuh (asam oleat) yang tinggi dan komposisi asam lemak spesifik sesuai kebutuhan industri pengolahan minyak kelapa sawit.

48 Simpulan Diantara 13 lokus marka SNAP yang dievaluasi, terdapat enam (6) lokus marka SNAP (2 lokus di bagian Intron, 3 lokus di bagian Exon dan 1 lokus di bagian 3’UTRs), yang dapat digunakan untuk menduga variasi aktivitas biosintesis dan komposisi asam lemak tidak jenuh dalam buah kelapa sawit umumnya dan kandungan asam lemak tidak jenuh oleat pada khususnya.

49

BAB VI PEMBAHASAN UMUM Kelapa sawit adalah komoditas unggulan Indonesia sebagau penghasil minyak kelapa sawit terbesar di dunia. Indonesia menjadi rujukan bagi negara produsen kelapa sawit lainnya untuk mengembangkan kelapa sawit. Keunggulan Indonesia dibandingkan negara lain sehingga bisa menjadi negara produsen dan konsumen terbesar kelapa sawit diantaranya, kondisi geografis Indonesia sebagai salah satu negara tropis yang luas dan dilintasi garis khatulistiwa cocok untuk pertumbuhan dan perkembangan kelapa sawit. Jumlah penduduk yang besar dengan upah tenaga kerja yang relative rendah dibandingkan dengan negara produsen lainnya menyebabkan biaya produksi kelapa sawit Indonesua relative lebih rendah sehingga dapat bersaing di pasar Internasional. Keberpihakan pemerintah atas pengembangan kelapa sawit, menjadi stimulasi dalam jangka waktu relative singkat Indonesia dapat melampaui Malaysia sebagai produsen kelapa sawit terbesar di dunia. Disamping itu, kelapa sawit komersial sekarang berasal dari biji kelapa sawit pertama yang diintroduksi ke Indonesia dan ditanam pertama kali di Kebun Raya Bogor. Pemuliaan kelapa sawit terkendala oleh problem-problem alamiah seperti lamanya siklus pemuliaan dan minimnya informasi genetik. Integrasi teknologi marka molekuler ke dalam program pemuliaan kelapa sawit dapat digunakan untuk memecahkan permasalahan tersebut. Secara garis besar, marka molekuler dapat memberikan kontribusi dalam mengidentifikasi plasma nutfah kelapa sawit, pemilihan tetua untuk program seleksi, pemetaan pautan genetik, serta seleksi sifatsifat penting kelapa sawit, baik sifat-sifat yang dikendalikan oleh sedikit gen (monogenik dan oligenik) maupun banyak gen (poligenik). Perkembangan teknologi marka berbasis PCR maupun cabang ilmu biometrika yang berkaitan dengan pemetaan genom akan mengukuhkan kontribusi marka molekuler untuk penciptaan kultivar-kultivar unggul kelapa sawit di masa yang akan datang (Dwiasmono,1998). Marka molekuler merupakan alat yang sangat baik bagi pemulia dan ahli genetik untuk menganalisis genom tanaman. Sistem ini telah merevolusi bidang pemetaan genetik dan dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan-pertanyaan yang berkaitan dengan keragaman genetik, klasifikasi dan filogeni dalam pengelolaan plasma nutfah, dan sebagai alat bantu dalam pemuliaan dan seleksi melalui markaan gen. Kegiatan seleksi pada pemuliaan secara konvensional dapat dipercepat jika dapat disinergikan dengan teknologi marka molekuler yang dikenal dengan nama marka assisted selection (MAS). Dengan MAS, kegiatan seleksi menjadi lebih efektif dan efisien karena seleksi hanya didasarkan pada sifat genetik tanaman, tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Marka molekuler juga dapat digunakan untuk pengklonan gen yang difasilitasi oleh peta marka molekuler pada tanaman jagung (Azrai, 2006). Salah satu kendala dalam pengembangan pemasaran minyak kelapa sawit secara global sebagai minyak konsumsi adalah rendahnya kandungan asam lemak tidak jenuh (asam oleat) minyak kelapa sawit dibandingkan minyak olive dan

50 kanola. Peningkatan kualitas minyak kelapa sawit dengan harga yang relative murah dibandingkan minyak nabati lainnya, diharapkan dapat mambantu pengembangan konsumsi minyak kelapa sawit di pasar dunia, serta dapat membantu mengatasi kampanye hitam terhadap komoditas kelapa sawit di tingkat Internasional. Kualitas minyak yang dipengaruhi oleh komposisi asam oleat pada minyak perlu ditingkatkan untuk memenuhi kriteria kebutuhan konsumen akan kualitas minyak konsumsi. Keragaman kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) pada kedua spesies kelapa sawit (E guineensis dan E.oleifera) diduga dipengaruhi oleh keragaman sequense gen SAD dalam pembentukan asam lemak tidak jenuh pada keduanya. Identifikasi keragaman sequense SAD menjadi titik tolak untuk mengembangkan marka SNAP berbasis SNP guna memprediksi kandungan asam lemak tidak jenuh pada kelapa sawit. Penelitain ini menunjukkan adanya keragaman sequense SAD pada lima sumber keragaman tanaman kelapa sawit, 4 varietas berasal dari spesies E. guineensis yang terdiri atas varietas Tenera, Dura , Pisifera dan Virescens, satu lagi berasal dari spesies E.oleifera (open polynated). Keragaman ditemukan pada intron, exon dan 3’UTR gen SAD, terdapat 13 lokus SNP yang digunakan untuk mendisain marka SNAP. Dari analisis tiga belas lokus tersebut yang diujikan pada 50 aksesi tanaman kelapa sawit diidentifikasi 6 lokus SNP yang dapat mengindikasikan kandungan asam lemak tidak jenuh kelapa sawit, yang dapat membedakan E.oleifera (Oleifera76) dengan 49 aksesi lainnya. Prospek pemanfaatan marka SNAP Asam Lemak kelapa sawit Hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan untuk pengembangan komoditas kelapa sawit guna menghasilkan tanaman dengan kandungan asam oleat tinggi yang baik untuk kesehatan. Kelapa sawit dengan kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) yang tinggi, bila dimanfaatkan sebagai sumber biodiesel memiliki tingkat liquiditas minyak yang tinggi meskipun digunakan di negara empat musim. Komersialisasi hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan oleh industri benih untuk menseleksi induk superior, sedangkan pada kultur jaringan kelapa sawit dapat digunakan untuk memilih tanaman induk yang berpotensi mengandung asam lemak tidak jenuh yang tinggi. Disamping itu dapat juga digunakan sebagai alat deteksi dini hasil transformasi untuk mendapatkan tanaman unggul dengan kandungan asam lemak tidak jenuh yang tinggi. Hasil penelitian ini telah terdaftar di Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Kementerian Hukum dan Hak Azazi Manusia Republik Indonesia untuk dipatenkan sejak 11 April 2014, nomor P00201402143 dengan judul Penanda SNAP (Single Nucleotide Amplified Polimorphism) Berbasis DNA Sekuens dari Fragmen Genomik Gen Stearoyl Acyl carrier protein Desaturase (SAD) sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh pada Kelapa Sawit (Lampiran 6).

51

BAB VI SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 1. Gen SAD sebagai gen kunci yang mempengaruhi pembentukan asam oleat telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari 5 (lima) sumber keragaman kelapa sawit. 2. Terdapat 13 lokus SNP yang dikembangkan untuk mendapatkan 26 pasang Marka SNAP gen SAD, yang berpotensi untuk mengidentifikasi keragaman kelapa sawit. 3. Diantara 13 lokus Marka SNAP yang dievaluasi, diperoleh enam (6) lokus Marka SNAP (2 lokus di bagian Intron dan 3 lokus di bagian Exon serta 1 lokus pada 3UTR’), yang dapat digunakan untuk menduga kandungan asam oleat (asam lemak tidak jenuh) kelapa sawit. Saran Marka SNAP yang dikembangkan berbasis keragaman sekuens SAD ini dapat dimanfaatkan untuk membantu percepatan pengembangan varietas tanaman kelapa sawit unggul (kandungan asam oleat tinggi), dengan melakukan verifikasi dan validasi pada populasi yang lebih besar yang melibatkan industri kelapa sawit.

52

DAFTAR PUSTAKA Aisyah IS. 2006. Mutasi Induksi. dalam: Sastrosumarjo S, editor. Sitogenetika Tanaman. Bogor: IPB. hlm 159 – 178 Asmini B, Febrimarsa. 2010. Analisis sekuens DNA daerah 5’–EGAD1 dari buah kelapa sawit normal dan abnormal hasil kultur jaringan Analysis of DNA sekuens of the 5’-flanking EGAD1 from normal and abnormal fruit from tissue culture derived oil palm. Menara Perkebunan, 78(2), 45-54 Azrai M. 2006. Sinergi Teknologi Marka Molekuler dalam Pemuliaan Tanaman Jagung. Jurnal Litbang Pertanian, 25(3) Bangun D. 1998. Strengthening Strategy of Oil Palm Agro Based Industry Toward Globalization Era. In Proceeding International Oil Palm Conference Comodity of the Past, today and Future. Nusa Dua Bali, September 23-25. Indonesia Basri MW, Siti NAA, Henson IE. 2004. Oil Palm – Achievements and Potential. Proceeding of 4th International Crop Science Congress, Brisbane, Australia. Brinster RL. 1988. Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 836–840 Choo YM, Cheah KY. 2000. Biofuel. dalam Advances In Oil Palm Research, Vol.1, P 1293-1345. Yusof B, Jailani BS, Chan KW, editors. MPOB, Malaysia. Cocchi META, Dafrallah T, Diaz-Chavez R, Dornburg VH, Hongo, Munyinda K, Sawe E, Shuma J, Togola I, Ulsrud K, Yamba FD. 2009. Improved agricultural practices in farming systems of semi-arid and arid Africa in view of future possibilities for bioenergy production. COMPETE (INCO-CT-2006-032448) Second Periodic Activity Report – Annex 2-2-1 Corley RHV, Tinker PB. 2003. The Oil Palm. World Agriculture Series. Blackwell Publishing. USA Christopher M, Geraldine S, Dominique R, Darae K. 2008. 3’UTRs Are the Primary Regulators of Gene Expression in the C. elegans Germline. Current Biology 18, 1476–1482, October 14, Elsevier Ltd David JS, Mi CS, John BO. 2000. Carrier Protein Desaturase Activities Are Differentially Influenced by Ferredoxin. Plant Physiology, Vol. 124, pp. 681– 692 Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12, 1315 Drenkard E, Richter BG, Rozen S, Stutius LM, Angell NA, Mindrinos M, Cho RJ, Oefner PJ, Davis RW, Ausubel FM. 2000. A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Am Soc Plant Phisiol 12 (4):1483-1492 Drummond AJ, Ashton B, Buxton S, Cheung M, Cooper A, Duran C, Field M, Heled J, Kearse M, Markowitz S, Moir R, Stones-Havas S, Sturrock S, Thierer T, Wilson A. 2012. Geneious v5.6. Dwiasmono.1998. Utilization of molecular markas for oil palm breeding Georgios B, Anastassias M, Nikos N, Polydefkis H. 2005. Spatial and temporal expressions of the two distinct oleate desaturases from Olive (Olea europaea L.). Plant Science 168 : 547-555

53 Hafiz MMH, Rashid AMS. 2011. Oil palm optical characteristics from two different planting materials. International Conference on Future Information Technology Vol.13 P.196-200 Hariyadi P. 2010. Sepuluh karakter unggul minyak sawit. Infosawit Hernawan YR, Yurna Y, Nanang S, Sujadi, Ernayunita, Rokhana F, Sri W, and Razak AP. 2014. Progress of Elaeis oleifera breeding in IOPRI. Abstracts Book, International Oil Palm Conference. June 17-19 2014, Bali, Indonesia. Herve LH, Ajit N, Melissa JM. 2003. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. Trends in Biochemical Sciences Vol.28 No.4 Hindawi. 2012. Variations for fatty acids and TAG biosynthesis pathway genes associated with high oil content in different plant species. Diunduh 18 Januari 2013 Tersedia pada http://www.hindawi.com/journals/cfg/2012/914843/tab1/ Jay JT, John BO. 2002. Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis in plants. Elsevier, Vol-4, Issue 1, P:12-21 Jing R, Ruixing G, Liang C, Eviatar N, Zhuowen Z, Dungfa S, and Junhua P. 2013. Single nucleotide polymorphisms of fad2 gene from tung tree, Vercia fordii, a potential biodiesel plant. Euphytica 194:93-107. Latiff A. 2000. The biology of the Genus Elaeis. in Advances in oil palm research, Vol.1, Yusof B, Jailani BS, Chan KW, editors. MPOB, Malaysia. Lubis UA. 1992. Kelapa sawit (Elaeis guineensis jacq.) di Indonesia. Rimbow offset, Medan Katayoon D, Heeyoung T, Patricia E, James B, and Jan GJ. 2001. Overexpression of 3-ketoacyl-acyl-carrier protein synthase IIIs in plants reduces the rate of lipid synthesis plant physiology, February 2001, Vol. 125, pp. 1103–1114, Masani AMY, Parveez AGK. 2008. Development of transformation vectors for the production of potencially high oleate transgenic oil palm. Electronic journal of Biotechnology Vol 11 No.3 McKenzie RW, Brennan MD. 1996. The two small introns of the Drosophila affinidisjuncta Adh gene are required for normal transcription. Nucleic Acids Res. 24, 3635–3642 Ooi CL, Leslie LET, Rajinder S. 2011. SNP marka for genetic studies and prediction of monogenic traits in oil palm. MPOB Information series, June. Pamin K. 1998. A hundred and fifty years of oil palm development in Indonesia: From Bogor botanical garden to the industry. In Proceeding International Oil Palm Conference Comodity of the Past, today and Future. Bali. Indonesia. Parveez GKA, Abrizah O, Masani AMY, Siti ANA, Umi R, Salamah, Ravigadevi S, Bahariah IB, Tarmizi AH, Zamsuri I, Kushari AD, Cheah SC, Basri MW. 2004. Genetic engineering for modifying fatty acid composition of palm oil. Proceeding of 16 International Plant Lipid Symposium, 1-4 June, Budapest, Hungary (in press) Raj TS, Gupta A, Riju A, Mahalaxmi M, Seal A, Arunachalam V. 2011. Computational identification and analysis of single-nucleotide polymorphisms and insertions/deletions in expressed sekuens tag data of Eucalyptus. Journal of Genetics Vol.90 e34-e38. Indian academy of Science. Rajanaidu N. Kushairi, Rafii M. Moch D. Maizura I, Jalani BS. 2000. Oil palm breeding and genetic resources, in Advances In Oil Palm Research, Vol.1, Yusof B, Jailani BS, Chan KW, editors. MPOB, Malaysia.

54 Ruangchai J, Prakit S, Sompong C, Tidakehiko, Sugunya W, Akito K, Peerasak S. 2011. A SNP in GmBADH2 gene associates with fragrance in vegetabel soybean variety “Kaori” and SNAP marka development for the fragrance. TAG Theoretical and Applied Genetics. Vol 122, No 3, 533-541, Ravigadevi S, Parveez AGK. and Cheah SC. 2000. Genetic engineering of oil palm. in Advance In Oil Palm Research. Yusof B, Jailani BS, Chan KW, editors. MPOB, Malaysia Sambrook J, Russel DW. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. New York: Cold-Spring Harbor Laboratory Press. 2nd edition 165p. Setiawan A. 2008. Penggunaaan statistic T2 dalam penentuan marka genetik yang berhubungan dengan penyakit. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Pendidikan Sains.

Shah FH, Omar R, Cha TS. 2000. Temporal regulation of two isoform of cDNA clones encoding delta 9-stearoyl-ACP desaturase from oil palm (Elaeis guineensis). Plant Science 152 ; 27-33 Siti NAA, Ravigadevi S, Ahmad PGK. 2001. Genetic modification of oil palm fo producing novel oils. Proceeding of Agriculture Conference, PIPOC. P;18-30. MPOB. Soleiman J, Samira J. 2011. NTSYSpc 2.02e Implementation in Molecular Biodata Analysis (Clustering, Screening, and Individual Selection). International Conference on Environmental and Computer Science IPCBEE vol.19. IACSIT Press, Singapore Subhas JB, Farida HA. 2012. Zygotic embryos with antisense palmitoyl-Acyl carrier protein thioesterase (PATE) gene. World Applied Scienses Journal 16 (3):362-369. Sundram K, Sambanthamurthi R, Tan Y. 2003. Palm fruit chemistery and nutrition. Asia Pasific Journal of Clinical and Nutrition. Vol 3 No 3 P 355-362 Syafaruddin, Joko TS . 2011. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (Blanco). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 - 17

Syvanen AC. 2001. Accessing genetic variation. Genotyping single nucleotide polymorphisms. Nat. Rev. Genet. 2, 930–942. Tan CP. 2009. Overview current research to improve competitiveness of palm oil products, Proceeding Seminar Tahunan Maksi. 29 Januari. Bogor. Umi SR, Darren SB, Patti AQ, John LH. 2002. Control analysis of lipid biosynthesis in tissue cultures from oil crops shows that flux control is shared between fatty acid synthesis and lipid assembly. Biochem. J. 364, 393±401 USDA statistic data. 2013. (Diunduh 28 Agustus 2013). Tersedia pada http://apps.fas.usda.gov/psdonline/circulars/oilseeds.pdf Vandamme AM, 2009. Basic consepts of molecular evolution. Di dalam: Lemey P, Salemi M, Vandamme A-M, editor. A practical approach to philogenetic analysis and hypothesis testing. Cambridge (GB). Univ Pr. Hal 1-23 Warta. 2008. Lokakarya kajian koleksi sumber daya genetik kelapa sawit plasma nutfah Indonesia No:20 Xeuyi H, Mandi LSG, Manju G, Steven AT. 2006. Altered FAD2 and FAD3 genes in brassica and the molecular marka-assisted detection thereoff. US paten. US 2006/0248611. US.

55 Zhang D, Zhang Z. 2005. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) discovery and linkage disequilibrium (LD) in forest trees. Forestry Studies in China 7:1–14 Zhang J, Liu H, Sun J, Li B, Zhu Q, Chen S, Zhang H. 2012. Arabidopsis fatty acid desaturase FAD2 is required for salt tolerance during seed germination and early seedling growth. Plos One . Vol 7. e30355 Zulkarnain E, Heldrian S, Ety Y, Delmi S. 2011. Pengaruh pemanasan terhadap kejenuhan asam lemak minyak goreng sawit dan minyak goreng jagung. Jurnal Indonesia Medicine Association, Vol: 61, No: 6.

56

Lampiran 1. Lokasi disain primer gen SAD spesifik (SAD 1 dan SAD 2) berdasarkan aksesi U68756 NCBI GenBank: U68756.1 LOCUS DEFINITION

EGU68756 1715 bp mRNA linear PLN 21-MAR-2000 Elaeis guineensis stearoyl-Acyl-carrier protein desaturase mRNA, partial cds. ACCESSION U68756 VERSION U68756.1 GI:1785861 KEYWORDS . SOURCE Elaeis guineensis (African oil palm) ORGANISM Elaeis guineensis Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Arecaceae; Arecoideae; Cocoseae; Elaeidinae; Elaeis. REFERENCE 1 (bases 1 to 1715) AUTHORS Shah,F.H. and Rashid,O. TITLE Nucleotide sequence of a complementary DNA clone encoding stearoyl-Acyl-carrier protein (Accession No. U68756) from Elaeis guineensis var tenera (PGR96-110) JOURNAL Plant Physiol. 112, 1399 (1996) REFERENCE 2 (bases 1 to 1715) AUTHORS Shah,F.H. and Rashid,O. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (02-SEP-1996) Genetics, The National University of Malaysia, Bangi, Selangor 43600, Malaysia FEATURES Location/Qualifiers source 1..1715 /organism="Elaeis guineensis" /mol_type="mRNA" /variety="tenera" /db_xref="taxon:51953" /tissue_type="mesocarp" CDS <1..1305 /EC_number="1.14.19.2" /codon_start=1 /product="stearoyl-Acyl-carrier protein desaturase" /protein_id="AAB41041.1" /db_xref="GI:1785862"

/translation="GTRDKGGAFLSFSFFHSLPPLSLSPKGEKRKEERRRKEERA MASMVAFRPEAFLCFSPPKTTRSTRSPRISMASTVGPSTKVEIPKKPFMPPREVH VQVTHSMPPQKIEIFKSLEDWAENNILVHLKPVEKCWQPQDFLPDPSSEGFHEEV KELRERSKEIPDGYYVCLVGDMITEEALPTYQTMLNTLDGVRDETGASLTSWAVW TRAWTAEENRHGDLLNKYLYLSGRVDMKQIEKTIQYLIGSGMDPRTENSPYLGFI YTSFQERATFISHGNTARHAKEHGDVKLAQICGTIASDEKRHETAYTKIVEKLFE IDPDGTVLSFADMMKKKISMPAHLMYDGQDDNLFEHFSAVAQRLGVDTAKDYADI LEFLINRWKVGELTGFSGEGKRAQDFVCTLAPRIRRIEERAQERAKQAPRIPCSW IYGREVQL"

57

ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 //

ggcacgagag ctctctctct gcaatggcgt accacgagga aaggttgaga cattcaatgc aatatcttgg gatccatcat atccctgatg acatatcaaa acttcttggg ctcaacaagt caatatctga atatacacct gccaaggaac aaacgccatg SAD 2 F ggtacggtgc atgtatgatg ggtgtcgaca gtgggtgagt cttgctccca cgcatacctt gttttggttt ctatatttat tcaggtcagg gcaggtgagg ctttcgtgta ttcttgctcg caatcttaag

acaaaggagg ggcctttctc ctcctaaggg agaaaaaagg cgatggtggc cttccgaccg gtaccagatc tcccaggatt ttccaaaaaa gcccttcatg cacctcagaa gattgagatt tgcatttgaa gcctgttgag cagaaggatt tcatgaagag SAD 1F gttattatgt ttgcttggtt caatgctcaa cacccttgat cagtctggac gagggcttgg atctatacct ttctggtaga taggttctgg aatggatcct catttcagga gagggcgact atggggacgt gaagttggct agacagctta tactaagatc tttcctttgc tgacatgatg gtcaggatga caacctcttc cagccaagga ctatgccgac taaccggctt ctctggggaa SAD 1 Rgattgaagaa ggatcaggag gcagctggat ctatggccgg aaataccagt tcttcagggt agggttttga aaacgattag atggggaaag ccgtagatac gatgctgttg aagtggtgtc ttagtactcc tatgtaggaa cttttttcaa tgtcgtatgc ataaaaaaaa aaaaaaaaaa

tctttctcct aaggaagaaa gaggcgttct tccatggcct cctccgcgtg tttaagtcat aagtgttggc gttaaggaac ggagatatga ggagttcgag actgctgaag gtggacatga aggacagaga ttcatttccc cagatatgtg gtggagaaac aagaagaaga gagcacttct atacttgagt ggtaagagag agagctcagg gaagtgcaac tggccaaaat cttaaaatcc tcttttaagc cagttggaaa aatgggctga ttcatctgga ctcga

tctttcactc ccttcctcct ggaggcgaaa agaagaaagg tatgcttctc tcctcccaag ccaccgttgg cccctccacc aggtacatgt tcaggtcaca tagaggactg ggcagaaaat agccccagga ttttctgcct tgagagaacg ctctaaggag tcactgaaga agctcttcct atgagacagg ggcaagcctt agaacagaca tggggacctt agcaaattga gaaaacaatc acagccccta ccttggtttt atgggaatac tgccaggcat gtacaattgc ctcagatgag tgtttgagat cgacccggat tctcaatgcc tgcccatctg cggcagtagc ccagcgtttg tccttattaa taggtggaaa cccaggactt cgtctgcact aaagggccaa gcaagcacca tctgagcatg accaatatct tttgcatctg catgtatcag atatatgctt tgttagtagg tatcacagat catcttatga 1R ccttcctgtt SAD tcaatgtttt ttactgtatc tggaacctag atgtctaaat ttcagtctat

58

Lampiran 2. Sequense Gen SAD dari 5 Sumber Keragaman Kelapa Sawit (1) Elaeis guineensis Var. Tenera (nigrescens) - Tenera-64 Exon, Intron ( intron yang di highlight) dan 3UTR’s, stop kodon gen SDA dengan garis bawah CCTTACTTCT AAGTATCTAT CTGGAATGGT TATAGCATCA AATCATGGAG TTTATTTTGA AGTTCTTTTA AACATCTTAG TTCAGCCGAT ATCACTTTCT CTCATTTCAG GTGAAGTTGG TCGTGGAGAA GATCTCAATG TAGCCCAGCG GAAAGTGGGT CCCAGGATCA GGATCTATGG GGGTTGGCCA ATCCATATAT AGATCATCTT TTTTCTTTCG

TGGGCAGTCT ACCTTTCTGG AAGTTTATCA TCAAATTCTG AAACTTCTCT ATAATTGGAG TGTGTTCTTT GATAGACTAT GCTGGAGATT TGTTTGCTGT GAGAGGGCGA CTCAGATATG ACTGTTTGAG CCTGCCCA TTTGGGTGTC GAGTTAACCG GGAGGATTGA CCGGGAAGTG AAATTTTGCA GCTTTGTTAG ATGAGCAGGT TGTATTAGTA

GGACGAGGGC TAGAGTGGAC TGACAGTCTA ATAAGAGTGA GAGATACAGT CAACTGCAAG TAGGTTTCTT TTTGTATCTG GCTTGAATTC CTGTAGGATC CTTTCATTTC TGGTACAATT ATCGACCCGG TCTGATGTAT TACACAGCCA GCTTCTCTGG AGAAAGAGCT CAACTCTGAG TCTGCATGTA TAGGTCAGGT GAGGGATGCT CTCCTATGTA

TTGGACTGCT ATGAAGCAAA GTATTTGCTC GGGTGCATTT TGTTATCTCA TTACTTCAAA TTTAGCCCAT TTAACAAATA ATGGTATTTT CTAGGACAGA CCATGGGAAT GCCTCAGATG ATGGTACGGT GATGGTCAGG AGGACTATGC GGAAGGTAAG CAGGAAAGGG CATGACCAAT TCAGCTATAT CAGGATGGGG GTTGAAGTGG G

GAAGAGAACA TTGAGAAAAC AATTTCTTTA TGCTTGCCCG AAATATGGGC AATAGCTTGC TATTGGCTTA GTTTGAAGCA TACTTGATTG GAACAGCCCC ACTGCCAGGC AGAAACGCCA GCTTTCCTTT ATGACAACCT CGACATACTT AGAGCCCAGG CCAAGCAAGC ATCTGTTTTG TTATAGGGTT AAAGCCGTAG TGTCCAGTTG

GACATGGGGA AATCCAATAT ATTGATATTT AACAAGCTTC TTTTTTTTCT TTGATATTAA GTGTTTTATT CTGATTGCTT AATATGTCAC TACCTTGGTT ATGCCAAGGA TGAGACAGCT GCTGACATGA CTTCGAGCAC GAGTTCCTTA ACTTCGTCTG ACCACGCATA GTTTAAATAC TTGAAAACGA ATACTCTTTT GAAACCTTCC

CCTTCTCAAC CTGATAGGTT TCCTTGTGAT AAAGGTCGCC TTTATCTTTT GTTATGCCTG ATCTGGATCA CCATAATTTG ATCAATTAAT TTATATACAC ACATGGGGAC TATACTAAGA TGAAGAAGAA TTCTCGGCAG TTAATAGGTG CACTCTTGCT CCTTTCAGCT CAGTTCTTCA TTAGCTTAAA AAGCTATCAC TGTTTCAATG

(2) Sequense Elaeis guineensis Var. Dura (nigrescens) - Dura-50 CCTTACTTCT AAGTATCTAT CTGGAATGGT TATAGCATCA AATCATGGAG TTTATTTTGA AGTTCTTTTA AACATCTTAG TTCAGCCGAT ATCACTTTCT CTCATTTCAG GTGAAGTTGG TCGTGGAGAA GATCTCAATG TAGCCCAGCG GAAAGTGGGT CCCAGGATCA GGATCTATGG GGGTTGGCCA ATCCATATAT AGATCATCTT TTTTCTTTCG CTCG



TTGGACTGCT ATGAAGCAAA GTATTTGCTC GGGTGCATTT TGTTATCTCA TTACTTCAAA TTTAGCCCAT TTAACAAATA ATGGTATTTT CTAGGACAGA CCATGGGAAT GCCTCAGATG ATGGTACGGT GATGGTCAGG AGGACTATGC GGAAGGTAAG CAGGAAAGGG CATGACCAAT TCAGCTAT CAGGATGGGG GTTGAAGTGG GGAAAATGGG

GAAGAGAACA TTGAGAAAAC AATTTCTTTA TGCTTGCCCG AAATATGGGC AATAGCTTGC TATTGGCTTA GTTTGAAGCA TACTTGATTG GAACAGCCCC ACTGCCAGGC AGAAACGCCA GCTTTCCTTT ATGACAACCT CGACATACTT AGAGCCCAGG CCAAGCAAGC ATCTGTTTTG TTATAGGGTT AAAGCCGTAG TGTCCAGTTG CTGATTACTG

GACATGGGGA AATCCAATAT ATTGATATTT AACAAGCTTC TTTTTTTTCT TTGATATTAA GTGTTTTATT GTGATTGCTT AATATGTCAC TACCTTGGTT ATGCCAAGGA TGAGACAGCT GCTGACATGA CTTCGAGCAC GAGTTCCTTA ACTTCGTCTG ACCACGCATA GTTTAAATAC TTGAAAACGA ATACTCTTTT GAAACCTTCC TATCTGGAAC

CCTTCTCAAC CTGATAGGTT TCCTTGTGAT AAAGGTCGCC GTTATCTTTT GTTATGCCTG ATCTGGATCA CCATAATTTG ATCAATTAAT TTATATACAC ACATGGGGAC TATACTAAGA TGAAGAAGAA TTCTCGGCAG TTAATAGGTG CACTCTTGCT CCTTTCAGCT CAGTTCTTCA TTAGCTTAAA AAGCTATCAC TGTTTCAATG CTAGTTCTTG

59

(3) Sequense Elaeis guineensis Var. Pisifera (nigrescens) - Pisifera-46 CCTTACTTCT AAGTATCTAT CTGGAATGGT TATAGCATCA AATCATGGAG TTTATTTTGA AGTTCTTTTA AACATCTTAG TTCAGCCGAT ATCACTTTCT CTCATTTCAG GTGAAGTTGG TCGTGGAGAA GATCTCAATG TAGCCCAGCG GAAAGTGGGT CCCAGGATCA GGATCTATGG GGGTTGGCCA ATCCATATAT AGATCATCTT TTTTCTTT

TGGGCAGTCT ACCTTTCTGG AAGTTTATCA TCAAATTCTG AAACTTCTCT ATAATTGGAG TGTGTTCTTT GATAGACTAT GCTGGAGATT TGTTTGCTGT GAGAGGGCGA CTCAGATATG ACTGTTTGAG CCTGCCCA TTTGGGTGTC GAGTTAACCG GGAGGATTGA CCGGGAAGTG AAATTTTGCA GCTTTGTTAG ATGAGCAGGT

GGACGAGGGC TAGAGTGGAC TGACAGTCTA ATAAGAGTGA GAGATACGGT CAACTGCAAG TAGGTTTCTT TTTGTATCTG GCTTGAATTC CTGTAGGATC CTTTCATTTC TGGTACAATT ATCGACCCGG TCTGATGTAT TACACAGCCA GCTTCTCTGG AGAAAGAGCT CAACTCTGAG TCTGCATGTA TAGGTCAGGT GAGGGATGCT

TTGGACTGCT GAAGAGAACA GACATGGGGA CCTTCTCAAC ATGAAGCAAA TTGAGAAAAC AATCCAATAT CTGATAGGTT GTATTTGCTC AATTTCTTTA ATTGATATTT TCCTTGTGAT GGGTGCATTT TGCTTGCCCG AACAAGCTTC AAAGGTCGCC TGTTATCTCA AAATATGGGC TTTTTTTTCT TTTATCTTTT TTACTTCAAA AATATCTTGC TTGATATTAA GTTATGCCTG TTTAGCCCAT TATTGGCTTA GTGTTTTATT ATCTGGATCA TTAACAAATA GTTTGAAGCA GTGATTGCTT CCATAATTTG ATGGTATTTT TACTTGATTG AATATGTCAC ATCAATTAAT CTATGACAGA GAACAGCCCC TACCTTGGTT TTATATACAC CCATGGGAAT ACTGCCAGGC ATGCCAAGGA ACATGGGGAC GCCTCAGATG AGAAACGCCA TGAGACAGCT TATACTAAGA ATGGTACGGT GCTTTCCTTT GCTGACATGA TGAAGAAGAA GATGGTCAGG ATGACAACCT CTTCGAGCAC TTCTCGGCAG AGGACTATGC CGACATACTT GAGTTCCTTA TTAATAGGTG GGAAGGTAAG AGAGCCCAGG ACTTCGTCTG CACTCTTGCT CAGGAAAGGG CCAAGCAAGC ACCACGCATA CCTTTCAGCT CATGACCAAT ATCTGTTTTG GTTTAAATAC CAGTTCTTCA TCAGCTAT TTATAGGGTT TTGAAAACGA TTAGCTTAAA CAGGATGGGG AAAGCCGTAG ATACTCTTTT AAGCTATCAC GTTGAAGTGG TGTCCAGTTG GAAACCTTCC TGTTTCAATG

(4) Sequense Elaeis guineensis Var. Virescens - Virescens-34 CCTTACTTCT AAGTATCTAT CTGGAATGGT TATAGCATCA AATCATGGAG TTTATTTTGA AGTTCTTTTA AACATCTTAG TTCAGCCGAT ATCACTTTCT CTCATTTCAG GTGAAGTTGG TCGTGGAGAA GATCTCAATG TAGCCCAGCG GAAAGTGGGT CCCAGGATCA GGATCTATGG GGGTTGGCCA ATCCATATAT AGATCATCTT TTTTCTTTCG CTCGAGATGA CTATGCCGAC AACCAGGACT CCACCTACCC GGTGCCATTG GATCGGATTG

TGGGCAGTCT ACCTTTCTGG AAGTTTATCA TCAAATTCTG AAACTTCTCT ATAATTGGAG TGTGTTCTTT GATAGACTAT GCTGGAGATT TGTTTGCTGT GAGAGGGCGA CTCAGATATG ACTGTTTGAG CCTGCCCAAT TTTGGGTGTC GAGTTAACCG GGAGGATTGA CCGGGAAGTG AAATTTTGCA GCTTTGTTAG ATGAGCAGGT TGTATTAGTA CAACCTCTTC ATACTTGAGT TTGTCTGCAC TTCACTGGAT GCACGCATGA GGATATAGC

GGACGAGGGC TAGAGTGGAC TGACAGTCTA ATAAGAGTGA GAGATACAGT CAACTGCAAG TAGGTTTCTT TTTGTATCTG GCTTGAATTC CTGTAGGATC CTTTCATTTC TGGTACAATT ATCGACCCGG TCTGATGTAT TACACAGCCA GCTTCTCTGG AGAAAGAGCT CAACTCTGAG TCTGCATGTA TAGGTCAGGT GAGGGATGCT CTCCTATGTA GAGCACTTCT TCTTATTAAT TCTTGCTCCA CAGGCCGGAA TACCTATTTA

TTGGACTGCT ATGAAGCAAA GTATTTGCTC GGGTGCATTT TGTTATCTCA TTACTTCAAA TTTAGCCCAT TTAACAAATA ATGGTATTTT CTAGGACAGA CCATGGGAAT GCCTCAGATG ATGGTACGGT GATGGTCAGG AGGACTATGC GGAAGGTAAG CAGGAAAGGG CATGACCAAT TCAGCTAT CAGGATGGGG GTTGAAGTGG GGAAAATGGG CGGCAGTAGC AGGTGAAGTG GGATCAGGAG GGCACTTGGA AGGATTGAGA

GAAGAGAACA TTGAGAAAAC AATTTCTTTA TGCTTGCCCG AAATATGGGC AATAGCTTGC TATTGGCTTA GTTTGAAGCA TACTTGATTG GAACAGCCCC ACTGCCAGGC AGAAACGCCA GCTTTCCTTT ATGACAACCT CGACATACTT AGAGCCCAGG CCAAGCAAGC ATCTGTTTTG TTATAGGGTT AAAGCCGTAG TGTCCAGTTG CTGATTACTG CCAGCGTTTG GGTGATTTAC GATGAAAAAG CATGACAAAC TAGCTAATAC

GACATGGGGA AATCCAATAT ATTGATATTT AACAAGCTTC TTTTTTTTCT TTGATATTAA GTGTTTTATT CTGATTGCTT AATAGGTCAC TACCTTGGTT ATGCCAAGGA TGAGACAGCT GCTGACATGA CTTCGAGCAC GAGTTCCTTA ACTTTGTCTG ACCACGCATA GTTTAAATAC TTGAAAACGA ATACTCTTTT GAAACCTTCC TATCTGGAAC GGTGTCTACA GGCTTCTCTG ATCAGGAAAG TTGTTTGTTA CAATGCTTGT

CCTTCTCAAC CTGATAGGTT TCCTTGTGAT AAAGGTCGCC TTTATCTTTT GTTATGCCTG ATCTGGATCA CCATAATTTG ATCAATTAAT TTATATACAC ACATGGGGAC TATACTAAGA TGAAGAAGAA TTCTCGGCAG TTAATAGGTG CACTCTTGCT CCTTTCAGCT CAGTTCTTCA TTAGCTTAAA AAGCTATCAC TGTTTCAATG CTAGTTCTTG CAGCCAAGGA GGGAAGGTAG GCCAACAGCA ATCAGTCTCA GAACAGTCAG

60

(5) Sequense Elaeis oleifera - E.oleifera 68 CCTTACTTCT AAGTATCTAT CTGGAATGGT TATAGCATCA AATCATGGAG TTTATTTTGA AGTTCTTTTA AACATCTTAG TTCAGCCGAT ATCACTTTCT CTCATTTCAG GTGAAGTTGG TCGTGGAGAA GATCTCAATG TAGCCCAGCG GAAAGTGGGT CCCAGGATCA GGATCTATGG GGGTTGGCCA ATCCATATAT AGATCATCTT TTTTCTTTCG



TTGGACTGCT ATGAAGCAAA GTATTTGCTC GGGTGCATTT TGTTATCTCA TTACTTCAAA TTTAGCCCAT TTAACAAATA ATGGTATTTT CTAGGACAGA CCATGGGAAT GCCTCAGATG ATGGTACGGT GATGGTCAGG AGGACTATGC GGAAGGTAAG CAGGAAAGGG CATGACCAAT TCAGCTAT CAGGATGGGG GTTGAAGTGG GGAAAATGG

GAAGAGAACA TTGAGAAAAC AATTTCTTTA TGCTTGCCCG AAATATGGGC AATAGCTTGC TATTGGCTTA GTTTGAAGCA TACTTGATTG GAACAGCCCC ACTGCCAGGC AGAAACGCCA GCTTTCCTTT ATGACAACCT CGACATACTT AGAGCCCAGG CCAAGCAAGC ATCTGTTTTG TTATAGGGTT AAAGCCGTAG TGTCCAGTTG

GACATGGGGA AATCCAATAT ATTGATATTT AACAAGCTTC TTTTTTTTCT TTGATATTAA GTGTTTTATT GTGATTGCTT AATAGGTCAC TACCTTGGTT ATGCCAAGGA TGAGACAGCT GCTGACATGA CTTCGAGCAC GAGTTCCTTA ACTTCGTCTG ACCACGCATA GTTTAAATAC TTGAAAACGA ATACTCTTTT GAAACCTTCC

CCTTCTCAAC CTGATAGGTT TCCTTGTGAT AAAGGTCGCC TTTATCTTTT GTTATGCCTG ATCTGGATCA CCATAATTTG ATCAATTAAT TTATATACAC ACATGGGGAC TATACTAAGA TGAAGAAGAA TTCTCGGCAG TTAATAGGTG CACTCTTGCT CCTTTCAGCT CAGTTCTTCA TTAGCTTAAA AAGCTATCAC TGTTTCAATG

61

Lampiran 3. Allignment Sequense Sampel (Exon, intron dan 3UTR’)

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 5 15 25 35 45 55 65

Vires-exon Oleifera-e Tenera-exo Pisifera-e Dura-exon Intron

CCTTACTTCT CCTTACTTCT CCTTACTTCT CCTTACTTCT CCTTACTTCT ----------

TGGGCAGTCT TGGGCAGTCT TGGGCAGTCT TGGGCAGTCT TGGGCAGTCT ----------

GGACGAGGGC GGACGAGGGC GGACGAGGGC GGACGAGGGC GGACGAGGGC ----------

TTGGACTGCT TTGGACTGCT TTGGACTGCT TTGGACTGCT TTGGACTGCT ----------

GAAGAGAACA GAAGAGAACA GAAGAGAACA GAAGAGAACA GAAGAGAACA ----------

GACATGGGGA GACATGGGGA GACATGGGGA GACATGGGGA GACATGGGGA ----------

CCTTCTCAAC CCTTCTCAAC CCTTCTCAAC CCTTCTCAAC CCTTCTCAAC ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 75 85 95 105 115 125 135

Vir-exon-i Oleifera-e Tenera-exo Pisifera-e Dura-exonVir-intron

AAGTATCTAT AAGTATCTAT AAGTATCTAT AAGTATCTAT AAGTATCTAT ----------

ACCTTTCTGG ACCTTTCTGG ACCTTTCTGG ACCTTTCTGG ACCTTTCTGG ----------

TAGAGTGGAC TAGAGTGGAC TAGAGTGGAC TAGAGTGGAC TAGAGTGGAC ----------

ATGAAGCAAA ATGAAGCAAA ATGAAGCAAA ATGAAGCAAA ATGAAGCAAA ----------

TTGAGAAAAC TTGAGAAAAC TTGAGAAAAC TTGAGAAAAC TTGAGAAAAC ----------

AATCCAATAT AATCCAATAT AATCCAATAT AATCCAATAT AATCCAATAT ----------

CTGATAGGTT CTGATAGGTT CTGATAGGTT CTGATAGGTT CTGATAGGTT ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 145 155 165 175 185 195 205


CTGGAATGGT CTGGAATGGT CTGGAATGGT CTGGAATGGT CTGGAATGGT --------GT

AAGTTTATCA AAGTTTATCA AAGTTTATCA AAGTTTATCA AAGTTTATCA AAGTTTATCA

TGACAGTCTA TGACAGTCTA TGACAGTCTA TGACAGTCTA TGACAGTCTA TGACAGTCTA

GTATTTGCTC GTATTTGCTC GTATTTGCTC GTATTTGCTC GTATTTGCTC GTATTTGCTC

AATTTCTTTA AATTTCTTTA AATTTCTTTA AATTTCTTTA AATTTCTTTA AATTTCTTTA

ATTGATATTT ATTGATATTT ATTGATATTT ATTGATATTT ATTGATATTT ATTGATATTT

TCCTTGTGAT TCCTTGTGAT TCCTTGTGAT TCCTTGTGAT TCCTTGTGAT TCCTTGTGAT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 215 225 235 245 255 265 275


TATAGCATCA TATAGCATCA TATAGCATCA TATAGCATCA TATAGCATCA TATAGCATCA

TCAAATTCTG TCAAATTCTG TCAAATTCTG TCAAATTCTG TCAAATTCTG TCAAATTCTG

ATAAGAGTGA ATAAGAGTGA ATAAGAGTGA ATAAGAGTGA ATAAGAGTGA ATAAGAGTGA

GGGTGCATTT GGGTGCATTT GGGTGCATTT GGGTGCATTT GGGTGCATTT GGGTGCATTT

TGCTTGCCCG TGCTTGCCCG TGCTTGCCCG TGCTTGCCCG TGCTTGCCCG TGCTTGCCCG

AACAAGCTTC AACAAGCTTC AACAAGCTTC AACAAGCTTC AACAAGCTTC AACAAGCTTC

AAAGGTCGCC AAAGGTCGCC AAAGGTCGCC AAAGGTCGCC AAAGGTCGCC AAAGGTCGCC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 285 295 305 315 325 335 345


AATCATGGAG AATCATGGAG AATCATGGAG AATCATGGAG AATCATGGAG AATCATGGAG

AAACTTCTCT AAACTTCTCT AAACTTCTCT AAACTTCTCT AAACTTCTCT AAACTTCTCT

GAGATACAGT GAGATACAGT GAGATACAGT GAGATACGGT GAGATACAGT GAGATACAGT

TGTTATCTCA TGTTATCTCA TGTTATCTCA TGTTATCTCA TGTTATCTCA TGTTATCTCA

AAATATGGGC AAATATGGGC AAATATGGGC AAATATGGGC AAATATGGGC AAATATGGGC

TTTTTTTTCT TTTTTTTTCT TTTTTTTTCT TTTTTTTTCT TTTTTTTTCT TTTTTTTTCT

TTTATCTTTT TTTATCTTTT TTTATCTTTT TTTATCTTTT GTTATCTTTT TTTATCTTTT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 355 365 375 385 395 405 415


TTTATTTTGA TTTATTTTGA TTTATTTTGA TTTATTTTGA TTTATTTTGA TTTATTTTGA

ATAATTGGAG ATAATTGGAG ATAATTGGAG ATAATTGGAG ATAATTGGAG ATAATTGGAG

CAACTGCAAG CAACTGCAAG CAACTGCAAG CAACTGCAAG CAACTGCAAG CAACTGCAAG

TTACTTCAAA TTACTTCAAA TTACTTCAAA TTACTTCAAA TTACTTCAAA TTACTTCAAA

AATAGCTTGC AATAGCTTGC AATAGCTTGC AATATCTTGC AATAGCTTGC AATAGCTTGC

TTGATATTAA TTGATATTAA TTGATATTAA TTGATATTAA TTGATATTAA TTGATATTAA

GTTATGCCTG GTTATGCCTG GTTATGCCTG GTTATGCCTG GTTATGCCTG GTTATGCCTG

62

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 425 435 445 455 465 475 485


AGTTCTTTTA AGTTCTTTTA AGTTCTTTTA AGTTCTTTTA AGTTCTTTTA AGTTCTTTTA

TGTGTTCTTT TGTGTTCTTT TGTGTTCTTT TGTGTTCTTT TGTGTTCTTT TGTGTTCTTT

TAGGTTTCTT TAGGTTTCTT TAGGTTTCTT TAGGTTTCTT TAGGTTTCTT TAGGTTTCTT

TTTAGCCCAT TTTAGCCCAT TTTAGCCCAT TTTAGCCCAT TTTAGCCCAT TTTAGCCCAT

TATTGGCTTA TATTGGCTTA TATTGGCTTA TATTGGCTTA TATTGGCTTA TATTGGCTTA

GTGTTTTATT GTGTTTTATT GTGTTTTATT GTGTTTTATT GTGTTTTATT GTGTTTTATT

ATCTGGATCA ATCTGGATCA ATCTGGATCA ATCTGGATCA ATCTGGATCA ATCTGGATCA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 495 505 515 525 535 545 555


AACATCTTAG AACATCTTAG AACATCTTAG AACATCTTAG AACATCTTAG AACATCTTAG

GATAGACTAT GATAGACTAT GATAGACTAT GATAGACTAT GATAGACTAT GATAGACTAT

TTTGTATCTG TTTGTATCTG TTTGTATCTG TTTGTATCTG TTTGTATCTG TTTGTATCTG

TTAACAAATA TTAACAAATA TTAACAAATA TTAACAAATA TTAACAAATA TTAACAAATA

GTTTGAAGCA GTTTGAAGCA GTTTGAAGCA GTTTGAAGCA GTTTGAAGCA GTTTGAAGCA

CTGATTGCTT GTGATTGCTT CTGATTGCTT GTGATTGCTT GTGATTGCTT CTGATTGCTT

CCATAATTTG CCATAATTTG CCATAATTTG CCATAATTTG CCATAATTTG CCATAATTTG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 565 575 585 595 605 615 625


TTCAGCCGAT TTCAGCCGAT TTCAGCCGAT TTCAGCCGAT TTCAGCCGAT TTCAGCCGAT

GCTGGAGATT GCTGGAGATT GCTGGAGATT GCTGGAGATT GCTGGAGATT GCTGGAGATT

GCTTGAATTC GCTTGAATTC GCTTGAATTC GCTTGAATTC GCTTGAATTC GCTTGAATTC

ATGGTATTTT ATGGTATTTT ATGGTATTTT ATGGTATTTT ATGGTATTTT ATGGTATTTT

TACTTGATTG TACTTGATTG TACTTGATTG TACTTGATTG TACTTGATTG TACTTGATTG

AATAGGTCAC AATAGGTCAC AATATGTCAC AATATGTCAC AATATGTCAC AATAGGTCAC

ATCAATTAAT ATCAATTAAT ATCAATTAAT ATCAATTAAT ATCAATTAAT ATCAATTAAT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 635 645 655 665 675 685 695


ATCACTTTCT ATCACTTTCT ATCACTTTCT ATCACTTTCT ATCACTTTCT ATCACTTTCT

TGTTTGCTGT TGTTTGCTGT TGTTTGCTGT TGTTTGCTGT TGTTTGCTGT TGTTTGCTGT

CTGTAGGATC CTGTAGGATC CTGTAGGATC CTGTAGGATC CTGTAGGATC CTGTAG----

CTAGGACAGA CTAGGACAGA CTAGGACAGA CTATGACAGA CTAGGACAGA ----------

GAACAGCCCC GAACAGCCCC GAACAGCCCC GAACAGCCCC GAACAGCCCC ----------

TACCTTGGTT TACCTTGGTT TACCTTGGTT TACCTTGGTT TACCTTGGTT ----------

TTATATACAC TTATATACAC TTATATACAC TTATATACAC TTATATACAC ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 705 715 725 735 745 755 765


CTCATTTCAG CTCATTTCAG CTCATTTCAG CTCATTTCAG CTCATTTCAG ----------

GAGAGGGCGA GAGAGGGCGA GAGAGGGCGA GAGAGGGCGA GAGAGGGCGA ----------

CTTTCATTTC CTTTCATTTC CTTTCATTTC CTTTCATTTC CTTTCATTTC ----------

CCATGGGAAT CCATGGGAAT CCATGGGAAT CCATGGGAAT CCATGGGAAT ----------

ACTGCCAGGC ACTGCCAGGC ACTGCCAGGC ACTGCCAGGC ACTGCCAGGC ----------

ATGCCAAGGA ATGCCAAGGA ATGCCAAGGA ATGCCAAGGA ATGCCAAGGA ----------

ACATGGGGAC ACATGGGGAC ACATGGGGAC ACATGGGGAC ACATGGGGAC ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 775 785 795 805 815 825 835


GTGAAGTTGG GTGAAGTTGG GTGAAGTTGG GTGAAGTTGG GTGAAGTTGG ----------

CTCAGATATG CTCAGATATG CTCAGATATG CTCAGATATG CTCAGATATG ----------

TGGTACAATT TGGTACAATT TGGTACAATT TGGTACAATT TGGTACAATT ----------

GCCTCAGATG GCCTCAGATG GCCTCAGATG GCCTCAGATG GCCTCAGATG ----------

AGAAACGCCA AGAAACGCCA AGAAACGCCA AGAAACGCCA AGAAACGCCA ----------

TGAGACAGCT TGAGACAGCT TGAGACAGCT TGAGACAGCT TGAGACAGCT ----------

TATACTAAGA TATACTAAGA TATACTAAGA TATACTAAGA TATACTAAGA ----------

63

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 845 855 865 875 885 895 905


TCGTGGAGAA TCGTGGAGAA TCGTGGAGAA TCGTGGAGAA TCGTGGAGAA ----------

ACTGTTTGAG ACTGTTTGAG ACTGTTTGAG ACTGTTTGAG ACTGTTTGAG ----------

ATCGACCCGG ATCGACCCGG ATCGACCCGG ATCGACCCGG ATCGACCCGG ----------

ATGGTACGGT ATGGTACGGT ATGGTACGGT ATGGTACGGT ATGGTACGGT ----------

GCTTTCCTTT GCTTTCCTTT GCTTTCCTTT GCTTTCCTTT GCTTTCCTTT ----------

GCTGACATGA GCTGACATGA GCTGACATGA GCTGACATGA GCTGACATGA ----------

TGAAGAAGAA TGAAGAAGAA TGAAGAAGAA TGAAGAAGAA TGAAGAAGAA ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 915 925 935 945 955 965 975


GATCTCAATG GATCTCAATG GATCTCAATG GATCTCAATG GATCTCAATG ----------

CCTGCCCAAT CCTGCCCA-CCTGCCCA-CCTGCCCA-CCTGCCCA-----------

TCTGATGTAT TCTGATGTAT TCTGATGTAT TCTGATGTAT TCTGATGTAT ----------

GATGGTCAGG GATGGTCAGG GATGGTCAGG GATGGTCAGG GATGGTCAGG ----------

ATGACAACCT ATGACAACCT ATGACAACCT ATGACAACCT ATGACAACCT ----------

CTTCGAGCAC CTTCGAGCAC CTTCGAGCAC CTTCGAGCAC CTTCGAGCAC ----------

TTCTCGGCAG TTCTCGGCAG TTCTCGGCAG TTCTCGGCAG TTCTCGGCAG ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 985 995 1005 1015 1025 1035 1045


TAGCCCAGCG TAGCCCAGCG TAGCCCAGCG TAGCCCAGCG TAGCCCAGCG ----------

TTTGGGTGTC TTTGGGTGTC TTTGGGTGTC TTTGGGTGTC TTTGGGTGTC ----------

TACACAGCCA TACACAGCCA TACACAGCCA TACACAGCCA TACACAGCCA ----------

AGGACTATGC AGGACTATGC AGGACTATGC AGGACTATGC AGGACTATGC ----------

CGACATACTT CGACATACTT CGACATACTT CGACATACTT CGACATACTT ----------

GAGTTCCTTA GAGTTCCTTA GAGTTCCTTA GAGTTCCTTA GAGTTCCTTA ----------

TTAATAGGTG TTAATAGGTG TTAATAGGTG TTAATAGGTG TTAATAGGTG ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1055 1065 1075 1085 1095 1105 1115


GAAAGTGGGT GAAAGTGGGT GAAAGTGGGT GAAAGTGGGT GAAAGTGGGT ----------

GAGTTAACCG GAGTTAACCG GAGTTAACCG GAGTTAACCG GAGTTAACCG ----------

GCTTCTCTGG GCTTCTCTGG GCTTCTCTGG GCTTCTCTGG GCTTCTCTGG ----------

GGAAGGTAAG GGAAGGTAAG GGAAGGTAAG GGAAGGTAAG GGAAGGTAAG ----------

AGAGCCCAGG AGAGCCCAGG AGAGCCCAGG AGAGCCCAGG AGAGCCCAGG ----------

ACTTTGTCTG ACTTCGTCTG ACTTCGTCTG ACTTCGTCTG ACTTCGTCTG ----------

CACTCTTGCT CACTCTTGCT CACTCTTGCT CACTCTTGCT CACTCTTGCT ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1125 1135 1145 1155 1165 1175 1185


CCCAGGATCA CCCAGGATCA CCCAGGATCA CCCAGGATCA CCCAGGATCA ----------

GGAGGATTGA GGAGGATTGA GGAGGATTGA GGAGGATTGA GGAGGATTGA ----------

AGAAAGAGCT AGAAAGAGCT AGAAAGAGCT AGAAAGAGCT AGAAAGAGCT ----------

CAGGAAAGGG CAGGAAAGGG CAGGAAAGGG CAGGAAAGGG CAGGAAAGGG ----------

CCAAGCAAGC CCAAGCAAGC CCAAGCAAGC CCAAGCAAGC CCAAGCAAGC ----------

ACCACGCATA ACCACGCATA ACCACGCATA ACCACGCATA ACCACGCATA ----------

CCTTTCAGCT CCTTTCAGCT CCTTTCAGCT CCTTTCAGCT CCTTTCAGCT ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1195 1205 1215 1225 1235 1245 1255


GGATCTATGG GGATCTATGG GGATCTATGG GGATCTATGG GGATCTATGG ----------

CCGGGAAGTG CCGGGAAGTG CCGGGAAGTG CCGGGAAGTG CCGGGAAGTG ----------

CAACTCTGAG CAACTCTGAG CAACTCTGAG CAACTCTGAG CAACTCTGAG ----------

CATGACCAAT CATGACCAAT CATGACCAAT CATGACCAAT CATGACCAAT ----------

ATCTGTTTTG ATCTGTTTTG ATCTGTTTTG ATCTGTTTTG ATCTGTTTTG ----------

GTTTAAATAC GTTTAAATAC GTTTAAATAC GTTTAAATAC GTTTAAATAC ----------

CAGTTCTTCA CAGTTCTTCA CAGTTCTTCA CAGTTCTTCA CAGTTCTTCA ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1265 1275 1285 1295 1305 1315 1325

Vir-exon-i Oleifera-e Tenera-exo

GGGTTGGCCA AAATTTTGCA TCTGCATGTA TCAGCTAT-- TTATAGGGTT TTGAAAACGA TTAGCTTAAA GGGTTGGCCA AAATTTTGCA TCTGCATGTA TCAGCTAT-- TTATAGGGTT TTGAAAACGA TTAGCTTAAA GGGTTGGCCA AAATTTTGCA TCTGCATGTA TCAGCTATAT TTATAGGGTT TTGAAAACGA TTAGCTTAAA

64

Pisifera-e Dura-exonVir-intron

GGGTTGGCCA AAATTTTGCA TCTGCATGTA TCAGCTAT-- TTATAGGGTT TTGAAAACGA TTAGCTTAAA GGGTTGGCCA AAATTTTGCA TCTGCATGTA TCAGCTAT-- TTATAGGGTT TTGAAAACGA TTAGCTTAAA ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1335 1345 1355 1365 1375 1385 1395


ATCCATATAT ATCCATATAT ATCCATATAT ATCCATATAT ATCCATATAT ----------

GCTTTGTTAG GCTTTGTTAG GCTTTGTTAG GCTTTGTTAG GCTTTGTTAG ----------

TAGGTCAGGT TAGGTCAGGT TAGGTCAGGT TAGGTCAGGT TAGGTCAGGT ----------

CAGGATGGGG CAGGATGGGG CAGGATGGGG CAGGATGGGG CAGGATGGGG ----------

AAAGCCGTAG AAAGCCGTAG AAAGCCGTAG AAAGCCGTAG AAAGCCGTAG ----------

ATACTCTTTT ATACTCTTTT ATACTCTTTT ATACTCTTTT ATACTCTTTT ----------

AAGCTATCAC AAGCTATCAC AAGCTATCAC AAGCTATCAC AAGCTATCAC ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1405 1415 1425 1435 1445 1455 1465


AGATCATCTT AGATCATCTT AGATCATCTT AGATCATCTT AGATCATCTT ----------

ATGAGCAGGT ATGAGCAGGT ATGAGCAGGT ATGAGCAGGT ATGAGCAGGT ----------

GAGGGATGCT GAGGGATGCT GAGGGATGCT GAGGGATGCT GAGGGATGCT ----------

GTTGAAGTGG GTTGAAGTGG GTTGAAGTGG GTTGAAGTGG GTTGAAGTGG ----------

TGTCCAGTTG TGTCCAGTTG TGTCCAGTTG TGTCCAGTTG TGTCCAGTTG ----------

GAAACCTTCC GAAACCTTCC GAAACCTTCC GAAACCTTCC GAAACCTTCC ----------

TGTTTCAATG TGTTTCAATG TGTTTCAATG TGTTTCAATG TGTTTCAATG ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1475 1485 1495 1505 1515 1525 1535


TTTTCTTTCG TTTTCTTTCG TTTTCTTTCG TTTTCTTT-TTTTCTTTCG ----------

TGTATTAGTA TGTATTAGTA TGTATTAGTA ---------TGTATTAGTA ----------

CTCCTATGTA CTCCTATGTA CTCCTATGTA ---------CTCCTATGTA ----------

GGAAAATGGG GGAAAATGGG-----------------GGAAAATGGG ----------

CTGATTACTG ---------------------------CTGATTACTG ----------

TATCTGGAAC ---------------------------TATCTGGAAC ----------

CTAGTTCTTG ---------------------------CTAGTTCTTG ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1545 1555 1565 1575 1585 1595 1605


CTCGAGATGA ---------------------------CTCG---------------

CAACCTCTTC ----------------------------------------------

GAGCACTTCT ----------------------------------------------

CGGCAGTAGC ----------------------------------------------

CCAGCGTTTG ----------------------------------------------

GGTGTCTACA ----------------------------------------------

CAGCCAAGGA ----------------------------------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1615 1625 1635 1645 1655 1665 1675


CTATGCCGAC ----------------------------------------------

ATACTTGAGT ----------------------------------------------

TCTTATTAAT ----------------------------------------------

AGGTGAAGTG ----------------------------------------------

GGTGATTTAC ----------------------------------------------

GGCTTCTCTG ----------------------------------------------

GGGAAGGTAG ----------------------------------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1685 1695 1705 1715 1725 1735 1745


AACCAGGACT ----------------------------------------------

TTGTCTGCAC ----------------------------------------------

TCTTGCTCCA ----------------------------------------------

GGATCAGGAG ----------------------------------------------

GATGAAAAAG ----------------------------------------------

ATCAGGAAAG ----------------------------------------------

GCCAACAGCA ----------------------------------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1755 1765 1775 1785 1795 1805 1815

65


CCACCTACCC ----------------------------------------------

TTCACTGGAT ----------------------------------------------

CAGGCCGGAA ----------------------------------------------

GGCACTTGGA ----------------------------------------------

CATGACAAAC ----------------------------------------------

TTGTTTGTTA ----------------------------------------------

ATCAGTCTCA ----------------------------------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1825 1835 1845 1855 1865 1875 1885


GGTGCCATTG ----------------------------------------------

GCACGCATGA ----------------------------------------------


....|....| 1895 GATCGGATTG ---------------.... ----------------------------

....|.... 1905 GGATATAGC --------......... -------------------------

TACCTATTTA ----------------------------------------------

AGGATTGAGA ----------------------------------------------

TAGCTAATAC ----------------------------------------------

CAATGCTTGT ----------------------------------------------

GAACAGTCAG ----------------------------------------------

66

Lampiran 4. Pensejajaran 5 Sequense Sampel dengan Aksesi Rujukan NCBI

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 5 15 25 35 45 55 65

Tenera ---------Oleifera ---------Dura ---------Pisifera ---------Tener-U68756 GGCACGAGAG Ole-FJ940768 ---------G Olei-EU057621---------Virescens ----------

------------------------------------ACAAAGGAGG ACAAAGGAGG -------------------

------------------------------------GGCCTTT-CT GGCCTTTTCT -------------------

------------------------------------CTCTTTCTCC CTCTTTCTCC -------------------

------------------------------------TTCTTTCACT TTCTTTCACT -------------------

------------------------------------CCCTTCCTCC CCCTTCCTCC -------------------

------------------------------------TCTCTCTCTC -CTCTCTCTC -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 75 85 95 105 115 125 135

Tenera Oleifera Dura PISIFERA TENER-U68756 Ole-FJ940768 Ole-EU057621 Virescens

------------------------------------TCTCCTAAGG TCTCCTAAGG -------------------

------------------------------------GAGAAAAAAG GAGAAAAAAG -------------------

------------------------------------GAAGGAAGAA GAAGGAAGAA -------------------

------------------------------------AGG-AGGCGA AGGGAGGCGA -------------------

------------------------------------AAAGAAGAAA AAAGAAGAAA -------------------

------------------------------------GGGCAATGGC GGGCAATGGC -------------------

------------------------------------GTCGATGGTG GTCGATGGTG -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 145 155 165 175 185 195 205


------------------------------------GCCTTCCGAC GCCTTCCGAC -------------------

------------------------------------CGGAGGCGTT CGGAGGCGTT -------------------

------------------------------------CTTATGCTTC CTTATGCTTC -------------------

------------------------------------TCTCCTCCCA TCTCCTCCCA -------------------

------------------------------------AGACCACGAG AGACCACGAG -------------------

------------------------------------GAGTACCAGA GAGTACCAGA -------------------

------------------------------------TCTCCCAGGA TCTCCCAGGA -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 215 225 235 245 255 265 275


------------------------------------TTTCCATGGC TTTCCATGGC -------------------

------------------------------------CTCCACCGTT CTCCACCGTT -------------------

------------------------------------GGCCCCTCCA GGCCCCTCCA -------------------

------------------------------------CCAAGGTTGA CCAAGGTTGA -------------------

------------------------------------GATTCCAAAA GATTCCCAAA -------------------

------------------------------------AAGCCCTTCA AAGCCTTTCC -------------------

------------------------------------TGCCTCCGCG TGCCTCCGCG -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 285 295 305 315 325 335 345


------------------------------------TGAGGTACAT TGAGGTACAT -------------------

------------------------------------GTTCAGGTCA GTTCAGGTCA -------------------

------------------------------------CACATTCAAT CACATTCAAT -------------------

------------------------------------GCCACCTCAG GCCACCTCAG -------------------

------------------------------------AAGATTGAGA AAGATTGAGA -------------------

------------------------------------TTTTTAAGTC TTTTTAAGTC -------------------

------------------------------------ATTAGAGGAC ATTAGAGGAC -------------------

67

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 355 365 375 385 395 405 415


------------------------------------TGGGCAGAAA TGGGCAGAAA -------------------

------------------------------------ATAATATCTT ATAATATCTT -------------------

------------------------------------GGTGCATTTG GGTGCATTTG -------------------

------------------------------------AAGCCTGTTG AAGCCTGTTG -------------------

------------------------------------AGAAGTGTTG AGAAGTGTTG -------------------

------------------------------------GCAGCCCCAG GCAGCCCCAG -------------------

------------------------------------GATTTT--CT GATTTT--CT -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 425 435 445 455 465 475 485


------------------------------------GCCTGATCCA GCCTGATCCA -------------------

------------------------------------TCATCAGAAG TCATCGGAAG -------------------

------------------------------------GATTTCATGA GATTTCATGA -------------------

------------------------------------AGAGGTTAAG AGAGGTTAAG -------------------

------------------------------------GAACTGAGAG GAACTGAGAG -------------------

------------------------------------AACGCTCTAA AACGCTCTAA -------------------

------------------------------------GGAGATCCCT GGAGATCCCT -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 495 505 515 525 535 545 555


------------------------------------GATGGTTATT GATGATTATT -------------------

------------------------------------ATGTT-TGCT ATGTT-TGCT -------------------

------------------------------------TGG--TTGGA TGG--TTGGA -------------------

------------------------------------GATATGATCA GATATGATCA -------------------

------------------------------------CTGAAGAAGC CTGAAGAAGC -------------------

------------------------------------TCTT---CCT TCTT---CCT -------------------

------------------------------------ACATATCAAA ACATATCAAA -------------------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 565 575 585 595 605 615 625


------------------------------------CAATGCTCAA CAATGCTCAA -------------------

------------------------------------CACCCTTGAT CACCCTTGAT -------------------

------------------------------------GGAGTTCGAG GGAGTTCGAG -------------------

------------------------------------ATGAGACAGG ATGAGACAGG -------------------

------CCTT ------CCTT ------CCTT ------CCTT GGCAAGCCTT GGCAAGCCTT ---------------CCTT

ACTTCTTGGG ACTTCTTGGG ACTTCTTGGG ACTTCTTGGG ACTTCTTGGG ACTTCTTGGG ---------ACTTCTTGGG

CAGTCTGGAC CAGTCTGGAC CAGTCTGGAC CAGTCTGGAC CAGTCTGGAC CAGTCTGGAC ---------CAGTCTGGAC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 635 645 655 665 675 685 695


GAGGGCTTGG GAGGGCTTGG GAGGGCTTGG GAGGGCTTGG GAGGGCTTGG GAGGGCTTGG ---------GAGGGCTTGG

ACTGCTGAAG ACTGCTGAAG ACTGCTGAAG ACTGCTGAAG ACTGCTGAAG ACTGCTGAAG ---------ACTGCTGAAG

AGAACAGACA AGAACAGACA AGAACAGACA AGAACAGACA AGAACAGACA AGAACAGACA ---------AGAACAGACA

TGGGGACCTT TGGGGACCTT TGGGGACCTT TGGGGACCTT TGGGGACCTT TGGGGACCTT ---------TGGGGACCTT

CTCAACAAGT CTCAACAAGT CTCAACAAGT CTCAACAAGT CTCAACAAGT CTCAACAAGT ---------CTCAACAAGT

ATCTATACCT ATCTATACCT ATCTATACCT ATCTATACCT ATCTATACCT ATCTATACCT ---------ATCTATACCT

TTCTGGTAGA TTCTGGTAGA TTCTGGTAGA TTCTGGTAGA TTCTGGTAGA TTCTGGTAGA ---------TTCTGGTAGA

68

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 705 715 725 735 745 755 765


GTGGACATGA GTGGACATGA GTGGACATGA GTGGACATGA GTGGACATGA GTGGACATGA -----CATGA GTGGACATGA

AGCAAATTGA AGCAAATTGA AGCAAATTGA AGCAAATTGA AGCAAATTGA AGCAAATTGA AGCAAATTGA AGCAAATTGA

GAAAACAATC GAAAACAATC GAAAACAATC GAAAACAATC GAAAACAATC GAAAACAATC GAAAACAATC GAAAACAATC

CAATATCTGA CAATATCTGA CAATATCTGA CAATATCTGA CAATATCTGA CAATATCTGA CAATATCTGA CAATATCTGA

TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG TAGGTTCTGG

AATGGATCCT AATGGATCCT AATGGATCCT AATGGATCCT AATGGATCCT AATGGATCCT AATGGATCCT AATGGATCCT

AGGACAGAGA AGGACAGAGA AGGACAGAGA ATGACAGAGA AGGACAGAGA AGGACAGAGA AGGACAGAGA AGGACAGAGA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 775 785 795 805 815 825 835


ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA ACAGCCCCTA

CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT CCTTGGTTTT

ATATACACCT ATATACACCT ATATACACCT ATATACACCT ATATACACCT ATATACACCT ATATACACCT ATATACACCT

CATTTCAGGA CATTTCAGGA CATTTCAGGA CATTTCAGGA CATTTCAGGA CATTTCAGGA CATTTCAGGA CATTTCAGGA

GAGGGCGACT GAGGGCGACT GAGGGCGACT GAGGGCGACT GAGGGCGACT GGGGGCGACT GAGGGCGACT GAGGGCGACT

TTCATTTCCC TTCATTTCCC TTCATTTCCC TTCATTTCCC TTCATTTCCC TTCATTTCCC TTCATTTCCC TTCATTTCCC

ATGGGAATAC ATGGGAATAC ATGGGAATAC ATGGGAATAC ATGGGAATAC ATGGGAATAC ATGGGAATAC ATGGGAATAC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 845 855 865 875 885 895 905


TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT TGCCAGGCAT

GCCAAGGAAC GCCAAGGAAC GCCAAGGAAC GCCAAGGAAC GCCAAGGAAC GCCAAGGA-C GCCAAGGAAC GCCAAGGAAC

ATGGGGACGT ATGGGGACGT ATGGGGACGT ATGGGGACGT ATGGGGACGT ATGGG-ACGT ATGGGGACGT ATGGGGACGT

GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT GAAGTTGGCT

CAGATATGTG CAGATATGTG CAGATATGTG CAGATATGTG CAGATATGTG CAGATATGTG CAGATATGTG CAGATATGTG

GTACAATTGC GTACAATTGC GTACAATTGC GTACAATTGC GTACAATTGC GTACAATTGC GTACAATTGC GTACAATTGC

CTCAGATGAG CTCAGATGAG CTCAGATGAG CTCAGATGAG CTCAGATGAG CTCGGACGAG CTCGGATGAG CTCAGATGAG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| SNP-10 915 925 935 945 955 965 975


AAACGCCATG AAACGCCATG AAACGCCATG AAACGCCATG AAACGCCATG AA-CGCCATG AAACGCCATG AAACGCCATG

AGACAGCTTA AGACAGCTTA AGACAGCTTA AGACAGCTTA AGACAGCTTA AGACAGCTTA AGACAGCTTA AGACAGCTTA

TACTAAGATC TACTAAGATC TACTAAGATC TACTAAGATC TACTAAGATC TACTAAGATC TACTAAGATC TACTAAGATC

GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC GTGGAGAAAC

TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT TGTTTGAGAT

CGACCCGGAT CGACCCGGAT CGACCCGGAT CGACCCGGAT CGACCCGGAT CGACCCGGAT CGACCCGGAT CGACCCGGAT

GGTACGGTGC GGTACGGTGC GGTACGGTGC GGTACGGTGC GGTACGGTGC GGTACGGTGC GGTACGGTGC GGTACGGTGC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 985 995 1005 1015 1025 1035 1045


TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC TTTCCTTTGC

TGACATGATG TGACATGATG TGACATGATG TGACATGATG TGACATGATG TGACATGATG TGACATGATG TGACATGATG

AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA AAGAAGAAGA

TCTCAATGCC TCTCAATGCC TCTCAATGCC TCTCAATGCC TCTCAATGCC TCTCAATGCC TCTCAATGCC TCTCAATGCC

TGCCCA--TC TGCCCA--TC TGCCCA--TC TGCCCA--TC TGCCCA--TC TGCCCA--TC TGCCCA--TC TGCCCAATTC

TGATGTATGA TGATGTATGA TGATGTATGA TGATGTATGA TGATGTATGA TGATGTATGA TGATGTATGA TGATGTATGA

TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT TGGTCAGGAT

69

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1055 1065 1075 1085 1095 1105 1115


GACAACCTCT GACAACCTCT GACAACCTCT GACAACCTCT GACAACCTCT GACAACCTCT GACAACCTCT GACAACCTCT

TCGAGCACTT TCGAGCACTT TCGAGCACTT TCGAGCACTT TCGAGCACTT TCGAGCACTT TCGAGCACTT TCGAGCACTT

CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA CTCGGCAGTA

GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT GCCCAGCGTT

TGGGTGTCTA TGGGTGTCTA TGGGTGTCTA TGGGTGTCTA TGGGTGTCGA TGGGTGTCTA TGGGTGTCTA TGGGTGTCTA

CACAGCCAAG CACAGCCAAG CACAGCCAAG CACAGCCAAG CACAGCCAAG CACAGCCAAG CACAGCCAAG CACAGCCAAG

GACTATGCCG GACTATGCCG GACTATGCCG GACTATGCCG GACTATGCCG GACTATGCCG GACTATGCCG GACTATGCCG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1125 1135 1145 1155 1165 1175 1185


ACATACTTGA ACATACTTGA ACATACTTGA ACATACTTGA ACATACTTGA ACATACTTGA ACATACTTGA ACATACTTGA

GTTCCTTATT GTTCCTTATT GTTCCTTATT GTTCCTTATT GTTCCTTATT GTTCCTTATT GTTCCTTATT GTTCCTTATT

AATAGGTGGA AATAGGTGGA AATAGGTGGA AATAGGTGGA AATAGGTGGA AATAGGTGGA AATAGGTGGA AATAGGTGGA

AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA AAGTGGGTGA

GTTAACCGGC GTTAACCGGC GTTAACCGGC GTTAACCGGC GTTAACCGGC GTTAACCGGC GTTAACCGGC GTTAACCGGC

TTCTCTGGGG TTCTCTGGGG TTCTCTGGGG TTCTCTGGGG TTCTCTGGGG CTCTCTGGGG CTCTCTGGGG TTCTCTGGGG

AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG AAGGTAAGAG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1195 1205 1215 1225 1235 1245 1255


AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC AGCCCAGGAC

TTCGTCTGCA TTCGTCTGCA TTCGTCTGCA TTCGTCTGCA TTCGTCTGCA TTCGTCTGCA TTCGTCTGCA TTTGTCTGCA

CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC CTCTTGCTCC

CAGGATCAGG CAGGATCAGG CAGGATCAGG CAGGATCAGG CAGGATCAGG CAGGATCAGG CAGGATCAGG CAGGATCAGG

AGGATTGAAG AGGATTGAAG AGGATTGAAG AGGATTGAAG AGGATTGAAG AGGATTGAAG AGGATTGAAG AGGATTGAAG

AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA AAAGAGCTCA

GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC GGAAAGGGCC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1265 1275 1285 1295 1305 1315 1325


AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC AAGCAAGCAC

CACGCATACC CACGCATACC CACGCATACC CACGCATACC CACGCATACC CACGCATACC CACGCATACC CACGCATACC

TTTCAGCTGG TTTCAGCTGG TTTCAGCTGG TTTCAGCTGG TTGCAGCTGG TTTCAGCTGG TTTCAGCTGG TTTCAGCTGG

ATCTATGGCC ATCTATGGCC ATCTATGGCC ATCTATGGCC ATCTATGGCC ATCTATGGCC ATCTATGGCC ATCTATGGCC

GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA GGGAAGTGCA

ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA ACTCTGAGCA

TGACCAATAT TGACCAATAT TGACCAATAT TGACCAATAT TGACCAATAT TGACCAATAT TGACCAATAT TGACCAATAT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1335 1345 1355 1365 1375 STOP1385 CODON 1395 Tenera Oleifera Dura PISIFERA TENER-U68756 Ole-FJ940768 Ole-EU057621 Virescens

CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT CTGTTTTGGT

TTAAATACCA TTAAATACCA TTAAATACCA TTAAATACCA TTAAATACCA TTAAATACCA TTAAATACCA TTAAATACCA

GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG GTTCTTCAGG

GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA GTTGGCCAAA

ATTTTGCATC ATTTTGCATC ATTTTGCATC ATTTTGCATC ATTTTGCATC ATTTTGCATC ATTTTGCATC ATTTTGCATC

TGCATGTATC TGCATGTATC TGCATGTATC TGCATGTATC TGCATGTATC TGCATGTATC TGCATGTATC TGCATGTATC

AGCTATATTT AGCTAT--TT AGCTAT--TT AGCTAT--TT AGCTATATTT AGCTAT--TT AGCTA--TTT AGCTAT--TT

70

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1405 1415 1425 1435 1445 1455 1465


ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT ATAGGGTTTT

GAAAACGATT GAAAACGATT GAAAACGATT GAAAACGATT GAAAACGATT GAAAACGATT GAAAACGATT GAAAACGATT

AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT AGCTTAAAAT

CCATATATGC CCATATATGC CCATATATGC CCATATATGC CCATATATGC CCATATATGC CCATATATGC CCATATATGC

TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA TTTGTTAGTA

GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA GGTCAGGTCA

GGATGGGGAA GGATGGGGAA GGATGGGGAA GGATGGGGAA GGATGGGGAA GGATGGGGAA GGATGGGGAA GGATGGGGAA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1475 1485 1495 1505 1515 1525 1535


AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT AGCCGTAGAT

ACTCTTTTAA ACTCTTTTAA ACTCTTTTAA ACTCTTTTAA ACTCTTTTAA ACTCTTTTAA ACTTTTTTAA ACTCTTTTAA

GCTATCACAG GCTATCACAG GCTATCACAG GCTATCACAG GCTATCACAG GCTATCACAG GCTATCACAG GCTATCACAG

ATCATCTTAT ATCATCTTAT ATCATCTTAT ATCATCTTAT ATCATCTTAT ATCATCTTAT ATCATTTTAT ATCATCTTAT

GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA GAGCAGGTGA

GGGATGCTGT GGGATGCTGT GGGATGCTGT GGGATGCTGT GGGATGCTGT GGGATGCTGT GGGATGCTGT GGGATGCTGT

TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG TGAAGTGGTG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| SNP-13 1545 1555 1565 1575 1585 1595 1605


TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA TCCAGTTGGA

AACCTTCCTG AACCTTCCTG AACCTTCCTG AACCTTCCTG AACCTTCCTG AACCTTCCTG AACCTTCCTG AACCTTCCTG

TTTCAATGTT TTTCAATGTT TTTCAATGTT TTTCAATGTT TTTCAATGTT TTTCAATGTT TTTCAATGTT TTTCAATGTT

TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG TTCTTTCGTG

TATTAGTACT TATTAGTACT TATTAGTACT TATTAGTACT TATTAGTACT TATTAGTACT TATTAGTACT TATTAGTACT

CCTATGTAGCCTATGTAGG CCTATGTAGG CCTATGTAGG CCTATGTAGG CCTATGTAGG CCTATGTAGG CCTATGTAGG

---------AAAATGG--AAAATGGGCT AAAATGGGCT AAAATGGGCT AAAATGGGCT AAAATGGGCT AAAATGGGCT

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1615 1625 1635 1645 1655 1665 1675


------------------GATTACTGTA GATTACTGTA GATTACTGTA GATTACTGTA GATTACTGTA GATTACTGTA

------------------TCTGGAACCT TCTGGAACCT TCTGGAACCT TCTGGAACCT TTTGGAACCT TCTGGAACCT

------------------AGTTCTTGCT AGTTCTTGCT AGTTCTTGCT AGTTCTTGCT AGTTTTTGCT AGTTCTTGCT

------------------CG-------CG-------CGCTTTTTTC CGCTTTTTTC CGCTTTTTTC CGAGATGACA

------------------------------------AATGTC-GTA AATGTCTGTA AATGTCTGTA ACCTCTTCGA

------------------------------------TGCTTCATCT TGCTTCATCT TGCTTCATTT GCACTTCTCG

------------------------------------GGAATGTCTA GGAATGTCTA GGAATGTTTA GCAGTAGCCC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1685 1695 1705 1715 1725 1735 1745


------------------------------------AATTTCAGTC AAATTCAGTC AA-------AGCGTTTGGG

------------------------------------TATCAATCTT TATCAATCTT ----AAAAAA TGTCTACACA

------------------------------------AAGATAAAAA AAGATATGTA AAAAAAAAAA GCCAAGGACT

------------------------------------AAAAAAAAAA AGGGGATTAA AAAAAAAAAA ATGCCGACAT

------------------------------------AAACTCGA-TGTTTTTCTT AAA------ACTTGAGTTC

---------------------------------------------CAAGCTTGCT ---------TTATTAATAG

---------------------------------------------TTGTATCCTG ---------GTGAAGTGGG

71

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1755 1765 1775 1785 1795 1805 1815


---------------------------------------------CGGCTAGAAA ---------TGATTTACGG

---------------------------------------------CTTATACTAA ---------CTTCTCTGGG

---------------------------------------------AAAAAAAAAA ---------GAAGGTAGAA

---------------------------------------------AAAAAAAA----------CCAGGACTTT

---------------------------------------------------------------GTCTGCACTC

---------------------------------------------------------------TTGCTCCAGG

---------------------------------------------------------------ATCAGGAGGA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1825 1835 1845 1855 1865 1875 1885


---------------------------------------------------------------TGAAAAAGAT

---------------------------------------------------------------CAGGAAAGGC

---------------------------------------------------------------CAACAGCACC

---------------------------------------------------------------ACCTACCCTT

---------------------------------------------------------------CACTGGATCA

---------------------------------------------------------------GGCCGGAAGG

---------------------------------------------------------------CACTTGGACA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1895 1905 1915 1925 1935 1945 1955


---------------------------------------------------------------TGACAAACTT

---------------------------------------------------------------GTTTGTTAAT

---------------------------------------------------------------CAGTCTCAGG

---------------------------------------------------------------TGCCATTGGC

---------------------------------------------------------------ACGCATGATA

---------------------------------------------------------------CCTATTTAAG

---------------------------------------------------------------GATTGAGATA

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 1965 1975 1985 1995 2005 2015 2025


---------------------------------------------------------------GCTAATACCA

---------------------------------------------------------------ATGCTTGTGA

---------------------------------------------------------------ACAGTCAGGA

---------------------------------------------------------------TCGGATTGGG

---------------------------------------------------------------ATATAGC---

-------------------------------------------------------------------------

-------------------------------------------------------------------------

72

Lampiran 5: Bahan Tanaman 50 Aksesi Kelapa Sawit Lapangan E.guineensis – Tenera

: 05,12,14,35,36,52,64,65,66, 69,70,72, 79,80,81,82,85,88 - Virescens : 73,75,84

Kultur Jaringan : E.guineensis - Tenera

: 04,08,18,20,25,30,31,42, 49,59,29 - Dura : 03,27,43, 50,58, - Pisifera : 07,26,41,46,54,55,57, 77,78,87 - Virescens : 34 E.oleifera (Camerun) : 68, 76

73

Lampiran 6. Pendaftaran Paten dan Nomor Paten

74

75

76

77

Terpenuhi Persyaratan Formalitas

78

79

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Solok pada tanggal 9 Maret 1976 anak kedua dari empat bersaudara pasangan suami istri Syamril dan Marni. Pendidikan S1 diselesaikan di Fakultas Pertanian, Jurusan Budidaya Pertanian Program Studi Teknologi Benih Universitas Andalas Padang Sumatera Barat pada tahun 1999. Tahun 2011 penulis mendapatkan beasiswa Karyasiswa Kementerian Riset dan Teknologi untuk melanjutkan studi S2 di Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, jurusan Agronomi dan Hortikultura, program studi/mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman. Saat ini Penulis bekerja sebagai peneliti di Balai Pengkajian Bioteknologi, BPPT (Badan Pergkajian dan Penerapan Teknologi) pada bidang bioteknologi tanaman khususnya bioteknologi kelapa sawit. Penulis semenjak tahun 2000 aktif meneliti kultur jaringan dan transformasi kelapa sawit yang bekerjasama dengan institusi dalam dan luar negeri baik swasta maupun pemerintah. Penulis terdaftar sebagai anggota organisasi profesi, MAKSI (Masyarakat Kelapa Sawit Indonesia), dan aktif mengikuti perkembangan pengkajian kelapa sawit pada seminar internasional yang dilaksanakan di Indonesia (Indonesian Oil Palm Conference, IOPC) dan Malaysia (PIPOC). Selama mengikuti program S2, penulis telah mengikuti kegiatan seminar nasional kelapa sawit yang diselenggarakan oleh MAKSI dan seminar Internasional kelapa sawit yang diselenggarakan oleh Pusat Penelitian Kelapa Sawit Indonesia. Poster dengan judul “Can SNAP marker be used as indicator of unsaturattedd fatty acid composition in oil palm?” telah disampaikan dalam kegiatan seminar Internasional Kelapa Sawit, Indonesian Oil Palm Conference (IOPC), Green Palm Oil for Food Security and Renewable Energy yang dilaksanakan di Nusa Dua Convention Center, Bali tanggal 17-19 Juni 2014. Hasil penelitian tesis ini telah dipatenkan dengan nomor P00201402143 dan judul “Penanda SNAP (Single Nucleotide Amplified Polimorphism) Berbasis DNA Sekuens dari Fragmen Genomik Gen Stearoyl Acyl carrier protein Desaturase (SAD) sebagai Indikator Kandungan Asam Lemak Tidak Jenuh pada Kelapa Sawit”, di Direktorat Jenderal Hak Kekayaan Intelektual, Kementerian Hukum dan Hak Azazi Manusia Republik Indonesia sejak 11 April 2014.

MARKA SNAP BERBASIS FRAGMEN GENOMIK GEN SAD SEBAGAI INDIKATOR KANDUNGAN ASAM LEMAK TIDAK JENUH KELAPA SAWIT RISMAYANTI

Recommend Documents