11. oldal. 1

1/11. oldal

DOT113v8: Használati utasítás a Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kitshez 5. verzió

Használati utasítás a Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kitshez (tipizáló készletek) 5. CE átdolgozás, 2014. Január 1. Rendeltetés A Biofortuna HLA SSPGo készletek kvalitatív DNS alapú készletek, amelyek a HLA allélok „alacsony felbontású” készletekkel vagy az allélok csoportspecifikus amplifikációjának „köztes/közepes felbontású” készletekkel való meghatározására szolgálnak. A közepes felbontású készletek általános definíciója szerint az eredmények többsége két számjeggyel egyértelműen meghatározható; pl. DQB1*02, DQB1*05, stb. A nagy felbontás általában azt jelenti, hogy az allélok nagy része négy számjeggyel határozható meg, pl. DQB1*02:01, DQB1*05:01, stb. A készlet olyan in vitro diagnosztikai termék, amelyet kizárólag képzett szakszemélyzet használhat. 2. Bevezetés A HLA molekulák fontos szerepet játszanak az immunitásban, és ezen belül a szervezet saját és nem saját antigénjeinek felismerésében; a legtöbb szervátültetés előtt el kell végezni a HLA-genotipizálást és a HLA-egyeztetést. A HLA antigének meghatározzák a T-sejt-mediált immunválasz specificitását, ezért a HLA-genotipizálás hasznos vizsgálati eszköz az immunrendszer rendellenességeinek vagy a patogénekre, vakcinákra vagy orvosi kezelésre adott immunválasznak a kimutatásában. A HLA-genotipizálás olyan betegségek diagnosztizálásra is alkalmas, amelyekben kimutatták, hogy a HLA allélokról kóroki tényezők lehetnek. A legtöbb HLA gén igen polimorf, és általában DNS-genotipizálás szükséges a HLA antigén pontos meghatározásához. A szekvenciaspecifikus primereket (SSP) használó PCR genotipizálás1 a HLA-genotipizálás egy olyan gyors módszere, amely kifejezetten a közepes felbontást igénylő esetek vizsgálatára alkalmas. A Biofortuna SSP készletek teljesen kiszárított reakciókomponenseket tartalmaznak, ideértve a polimerázt is, így a felhasználónak a PCR elvégzése előtt mindössze a DNS-t kell hozzáadnia. Minden tőlünk telhetőt megteszünk azért, hogy a készletfrissítések összhangban legyenek az IMGT adatbázisban szereplő új HLA összehangolt eredményekkel. A készletfrissítések az alábbi weboldalról tölthetők le: www.biofortuna.com. 3. A teszt leírása A PCR SSP azon az elven alapul, hogy csak azok a primerek amplifikálódnak, amelyek esetében a 3’ terminus teljesen megegyezik a célszekvenciával. Az eltérő (mismatched) primerek nem adnak pozitív amplifikációs terméket2. Az ún. „housekeeping” gén konzervált régióját amplifikáló belső kontroll primerpár minden PCR-reakciókeverékben szerepel; a belső kontroll primerpár a PCR-reakció megfelelőségét jelzi. Az SSP genotipizálás

C

V

C

2/11. oldal


általában több reakciót alkalmaz, melyek – együtt vizsgálva – jelzik a genotípust. Az amplifikált termékek vizualizálása agaróz gél-elektroforézis rendszerekkel történik, amelyek méretük alapján elkülönítik a DNS-fragmentumokat. 4. A készlet tartalma 

   

Polipropilén PCR-lemezek vagy -csíkok, amelyek 8–96 PCR-csőből állnak (a készlet típusától függően), minden egyes cső előre kimért fagyasztva szárított primert, polimerázt, dNTP-ket* és puffert tartalmaz. A lemezeket vagy csíkokat zárólappal vagy kupakkal lezárva, egyenként, fóliatasakban csomagolva szállítjuk, amelyben egy tasak deszikkálószert is elhelyezünk. PCR-csöveket lezáró lapok és kupakok. 1 db használati utasítás. Analitikai bizonylat. Az értelmezési táblázatok és az anyagbiztonsági adatlap (MSDS) a Biofortuna weboldaláról tölthetők le: www.biofortuna.com. Amennyiben nem tudja letölteni a weboldalról a dokumentumokat, kérjük, lépjen érintkezésbe területi képviselőjével.

*A CleanAmp™ dNTP-k licence a Biofortuna SSPGo termékekben való használatra a Trilink Biotechnologies Inc.-től származik. 5. Nem mellékelt reagensek, berendezések és eszközök      

  

Megfelelő, kalibrált pipetták és steril pipettahegyek, pl. P10 pipetta 10 µl-es szűrővel ellátott pipettahegyekkel. DNS izolációs készlet/eszköz. UV spektrofotométer. Polipropilén csövek. Steril, molekuláris tisztaságú víz. Az alábbi specifikációkkal rendelkező PCR-készüléket kell használni:  96 cellás PCR-készülék 104 °C-os, fűtött fedéllel az olajmentes működtetés érdekében.  Rampsebesség (felfűtési/hűtési sebesség): 1,0 °C/sec.  Hőmérséklet-tartomány: 4,0–99,9 °C.  A hőmérséklet pontossága: ± 0,25 °C a 35–99,9 °C-os tartományban.  A hőmérséklet-kalibráció visszavezethető egy referenciaszabványhoz.  A PCR-készüléket a 8. részben található PCR-ciklus-paraméterek segítségével állítsa be. Megjegyzés: A PCR-készülékre vonatkozó specifikus információkért olvassa el a gyártó által biztosított felhasználói útmutatót. A PCR-készülékeket az American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ([Amerikai Hisztokompatibilitási és Immungenetikai Társaság], ASHI) vagy a European Federation of Immunogenetics ([Európai Immungenetikai Társaság], EFI) akkreditációs szabályainak megfelelően kell kalibrálni. Gél-elektroforézis reagensek (agaróz, 0,5 × TBE, 1000 bázispáros DNS molekulatömeg-marker, 10 mg/ml etídium-bromid). Gél-elektroforézis berendezés (futtatókádak, tápegység, géldokumentációs rendszer UV-transzilluminátorral). Szoftver, hogy segítse a kézi elemzés SSPGo kit vizsgálati eredmények és az archív adatok tárolására is letölthető a Biofortuna honlapján www.biofortuna.com. Megjegyzés: A fenti körülmények, például a rampsebesség megváltoztatása befolyásolhatja a teszteredmények értelmezését.

6. Biztonság és figyelmeztetések  

In vitro diagnosztikai alkalmazásra. A vizsgálatokat kizárólag megfelelően képzett szakszemélyzet végezheti.

C

V

C

3/11. oldal


      

A tipizálási eredményeket megfelelő képesítéssel rendelkező személyzetnek kell ellenőriznie, és amennyiben az eredményeket klinikai döntéshozáshoz használják, másik tipizálási módszerrel meg kell azokat erősíteni. A reagenseket a jó laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően kell kezelni. Különítse el a pre- és a poszt-PCR munkaterületeket. Ne vigye vissza a poszt-PCR anyagokat a pre-PCR munkaterületre. Biológiai veszélyre vonatkozó figyelmeztetések: kezeljen minden vérterméket fertőzésveszélyesként. Biológiai veszélyre vonatkozó figyelmeztetések: az etídium-bromid potenciális karcinogén anyag. Használata során mindig viseljen védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és védőszemüveget. Biológiai veszélyre vonatkozó figyelmeztetések: gondossággal járjon el az UV-források kezelése során – mindig viseljen védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és védőszemüveget. Soha ne nézzen közvetlenül UV-fényforrásba. Az anyagbiztonsági adatlapok a www.biofortuna.com weboldalról tölthetők le.

7. Tárolás és stabilitás A Biofortuna SSPGo készletek 2–28 °C-os hőmérsékleten tárolandók. Miután a PCR-csöveket kivette a fóliatasakból, a reagenseket 3 órán belül DNS-sel rehidrálni kell. A lejárati időpontot lásd a csomagoláson. Ne használja fel a terméket a csomagoláson feltüntetett időponton túl. Ne használja fel a terméket, ha a fóliatasak sérült, vagy ha hiányzik a deszikkálószer a tasakból. Kizárólag a zárólapokat és -kupakokat használva biztosítsa, hogy a PCR-csövek a DNS hozzáadása után szorosan le legyenek zárva, mivel ennek hiányában a nem megfelelően lezárt csövekben a PCR-amplifikáció során párolgás léphet fel. Fordítson különös figyelmet a csövek széleinek, sarkainak lezárására. 1. megjegyzés: Ha szükséges, a tasakból kivett, még nem hidrált PCR-lemezeket és -csíkokat a DNS hozzáadása előtt 3 órán keresztül legfeljebb 21 °C-on és legfeljebb 60%-os páratartalom mellett lehet tartani. 2. megjegyzés: Miután DNS-sel hidrálta, a tasakból közvetlenül azelőtt kivett a PCR-csíkok és -lemezek legfeljebb 24 órán keresztül tárolhatók 2–8 °C-os hőmérsékleten, feltéve ha a csöveket jól lezárja, hogy megakadályozza a párolgást. 8. Használati utasítások A DNS-mintára vonatkozó követelmények A vizsgálat egyes reakcióit úgy optimalizálták, hogy 50–100 ng DNS-t használjanak fel, alapvető fontosságú azonban, hogy az egyes reakciókat pontosan 10 µl folyadékkal rehidrálják. Ezért a vizsgálatot 5–10 ng/µl DNS-koncentráció esetén kizárólag 10 µl DNS-sel lehet végezni. Kizárólag steril, molekuláris tisztaságú víz segítségével hígítsa a DNS-t. Vigyázat! Győződjön meg róla, hogy a végső DNS-minta nem tartalmaz 2,5 mM Tris/0,25 mM EDTA-nál többet. Kizárólag citráttal kinyert DNS-t és EDTA-val gyűjtött mintát használjon. Mivel a heparin gátolhatja a PCR-t, azt ajánljuk, hogy a DNS-t ne extrahálják heparinizált vérmintákból. A hemoglobin bizonyítottan interferál az SSPGo HLA készletekkel, ha 1 mg/dl-nél nagyobb koncentrációban van jelen a DNS-mintában. A DNS bármelyik hagyományos extrakciós módszerrel kinyerhető. Kérjük, biztosítsa, hogy a DNS-minta OD260/280 értéke UV-spektrofotometriával mérve 1,66 és 1,94 közé essen. Pre-PCR utasítások i. ii. iii.

Vegyen ki egy SSPGo lemezt vagy csíkot a fóliatasakból. Jegyezze fel a teszt tételszámát. Győződjön meg róla, hogy a teljes fagyasztva szárított pellet (PCR-reagens) a lemez vagy a csövek alján látható, mielőtt eltávolítja a zárólapot vagy kupakot. Ha nem, óvatosan ütögesse meg a csövet, hogy a pellet annak aljára kerüljön.

C

V

C

4/11. oldal


iv.

v. vi. vii. viii.

Kérjük, vegye figyelembe, hogy az egyes tesztlókuszok esetében az első reakció mindig halvány rózsaszínű a készlet többi részével ellentétben (vörös, amikor hidrált.) Egyes PCR-lemezek tartalmaznak egy bíbor színű integrális „templát nélküli kontroll” reakciót a lemez utolsó csövében. Steril eszközzel pipettázzon 10 µl DNS-oldatot a lemez vagy csík minden egyes reakciócellájába. Lásd a DNSmintára vonatkozó követelmények című 8. rész megjegyzését. Amennyiben a lemez tartalmazza a bíbor színű integrális „templát nélküli kontrollt”, pipettázzon a cellába 10 µl mintahígítót (DNS nélkül). Lásd a Templát nélküli kontrollra vonatkozó megjegyzést a 8. részben. Gondoskodjon arról, hogy a DNS minden egyes reakciócellában még a hőkezelés előtt hozzákapcsolódjon a száraz reagensekhez. Zárja le a reakciócellákat a zárólappal vagy PCR-cső-kupakokkal. A párolgás megelőzése érdekében szorosan zárja le a cellákat. Fordítson különös figyelmet a cella széleinek, sarkainak lezárására. Helyezze a lemezeket vagy a csíkokat a közvetlenül a PCR-készülékbe. Ügyeljen arra, hogy a csövek teljes egészükben a tartóban legyenek, és a fedél megfelelően zárjon. Amennyiben nem tartja be az itt közölt utasításokat, ez az egyes PCR-reakciók hibáját okozhatja a PCR-elegy párolgása és lecsapódása miatt. Futtassa a PCR-programot (lásd a PCR-paramétereket).

ÚJRASZUSZPENDÁLÁSRA VONATKOZÓ MEGJEGYZÉS: ügyeljen arra, hogy amikor a PCR-csöveket a fóliatasakból eltávolítja, a reagenseket azonnal rehidrálni kell a DNS-sel. További információkért lásd az 1. és 2. megjegyzést. TEMPLÁT NÉLKÜLI KONTROLLRA VONATKOZÓ MEGJEGYZÉS: egyes készletek a lemez utolsó reakciócellájában tartalmaznak egy templát nélküli kontrollt (NTC) is. Ez a reakciócella bíbor színű festéket tartalmaz annak érdekében, hogy megkülönböztethető legyen a többi reakciócellától. Az NTC-t úgy tervezték, hogy kimutassa a PCR szennyeződését, illetve a genomi DNS-szennyeződést, amely esetlegesen jelen lehet a DNS újraszuszpendálásához felhasznált vízben. Amennyiben a PCR-szennyeződés fennáll, különféle méretű amplikon(ok) jelennek meg. PCR-LEMEZEK/-CSÍKOK MAGASSÁGI PROFILJÁRA VONATKOZÓ MEGJEGYZÉS: javasoljuk, hogy a lemezek és a csíkok magassági profilja egyenlő legyen, ha ugyanabba a PCR-készülékbe helyezi őket. Az eltérő magassági profilok esetében nem megfelelő az érintkezés a PCR-készülék fűtött fedelével, ami gyenge vagy sikertelen PCR-amplifikációt okozhat. PCR-paraméterek Az alábbi PCR-paramétereket kell használni. Gondoskodjon arról, hogy a ramp- (felfűtési/hűtési) sebesség másodpercenként 1 °C legyen, és kapcsolja be a fedélfűtési funkciót. A teljes használati utasításért lásd a PCRkészülék gyártójának felhasználói kézikönyvét. A PCR-készülékeket az American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ([Amerikai Hisztokompatibilitási és Immungenetikai Társaság], ASHI) vagy a European Federation of Immunogenetics ([Európai Immungenetikai Társaság], EFI) akkreditációs szabályainak megfelelően kell kalibrálni. Denaturálás

94 °C

Denaturálás 96 °C Kapcsolódás (annealing) 66 °C Meghosszabbítás 72 °C Denaturálás 96 °C Kapcsolódás (annealing) 64 °C Meghosszabbítás 72 °C

5 perc 15 másodperc 50 másodperc 30 másodperc 15 másodperc 50 másodperc 30 másodperc

10 ciklus

20 ciklus

TARTÁS („HOLD”) 15 °C-on legfeljebb 72 óráig a gélfuttatás előtt. Ha szükséges, a PCR-lemezek 2-8 °C-on legfeljebb 24 óráig tárolhatók a gélfuttatás előtt. Mindig gondoskodjon arról, hogy a lemezek jól le legyenek zárva.

C

V

C

5/11. oldal


Gél-elektroforézis A következő utasítások a horizontális agaróz gél-elektroforézisre vonatkoznak. Készítsen el 2% agaróz gélt 0,5 × TBE (Tris/borát/EDTA) pufferben. Amikor a gél lehűlt kb. 60 °C-ra, adjon hozzá etídium-bromidot 0,5 µg/ml-es végkoncentrációban. Töltse ki a gélt, és helyezze be a mikrotiter fésűket (pl. 12 × 8 cella 9 mm-es sortávolsággal). A gél megszilárdulása után vegye ki a fésűket, és öntsön a gélre 0,5 × TBE puffert, úgy, hogy az befedje a gélt. Vigye fel a teljes PCR-terméket sorrendben a 2%-os agarózgélre, jegyezze fel az egyes reakciók pozícióját. 1000 bp-os létra használata javallott a méretmeghatározáshoz. Futtassa a gélt 20 percig 10 V/cm feszültség mellett. A készülékre vonatkozó részleteket lásd az elektroforézis készülék gyártójának használati utasításaiban. A gélek megjelenítéséhez képalkotó berendezésként UV-transzilluminátoros UV-géldokumentációs rendszert kell használni. Megjegyzés: A nem megfelelő elektroforézis nagyméretű, 600 bp-nál nagyobb amplikonok és kontrollamplikonok egybeolvadásához vezethet. Kérjük, győződjön meg arról, hogy az elektroforézis megfelelő az ilyen amplikonok kimutatásához. A túl hosszú ideig tartó elektroforézis a kisméretű amplikonok elvesztését eredményezheti. 9. Értelmezés Az SSPGo készleteket úgy tervezték, hogy az eredményeket manuálisan is meg lehessen határozni a www.biofortuna.com weboldalról letölthető értelmezési táblázatok segítségével. Amennyiben nem tudja elérni a weboldalt, kérjük, lépjen kapcsolatba a területi képviselőjével. Az értelmezési táblázatok tételspecifikus megjegyzéseket tartalmazhatnak, amelyek fontosak lehetnek az értelmezés szempontjából. A készlet- és a tételszám egyeztetése után rögzítse a gél fényképét a megfelelő értelmező sablonhoz. Vizsgálja meg a gél képét. Minden egyes reakció esetében egy pozitív kontrollsávnak is meg kell jelennie. Lásd az értelmezési táblázatokat, mivel az eltérő méretű lehet a különböző SSPGo termékek esetében. Előfordulhat, hogy a belsőkontroll sávok halványabban jelennek meg, amikor az allélspecifikus sávok is láthatók. Ha a képen látható allélspecifikus sáv, ám kontrollsáv nem, ezt ennek ellenére is pozitív eredményként kell értelmezni. Ne vegye figyelembe a 70 bp-nál rövidebb sávokat, mert ezek a nem kapcsolódott primereket jelölik. Határozza meg a pozitív reakciókat. A pozitív reakciókat a várt méretű sávok megjelenése jelzi, ahogyan ezt az értelmezési táblázatok is mutatják. Kérjük, vegye figyelembe, hogy egy adott reakcióban akár többféle méretű termék is lehet; ezek multiplex reakciók eredményei, és az értelmezési táblázatokban szerepelnek. Hasonlítsa össze a pozitív reakciókat az értelmezési táblázatokban szereplő ábrákkal. Egy reakció pozitív eredménye legalább egy, az értelmezési táblázatban szereplő, vonatkozó allél jelenlétét jelzi. Az allélok több csőben is amplifikálhatók – amennyiben az allél jelen van, minden vonatkozó reakció esetében pozitív eredményt kell adnia. Kontrollsáv

Az elektroforézis iránya

Allélspecifikus sáv

1. ábra: Példák pozitív reakciókra, amelyeket allélspecifikus sávok és kontrollsávok jelenléte jelez (1–3. reakció); negatív reakciókra, amelyeket a kontrollsávok jelenléte és az allélspecifikus sávok hiánya jelez (4–7. reakció); valamint sikertelen reakcióra, amelyet a sávok hiánya jelez (8. reakció). Ügyeljen arra, hogy a készlet tételszáma egyezzen az értelmezési táblázat tételszámával. Szoftver, hogy segítse a kézi elemzés SSPGo kit vizsgálati eredmények és az archív adatok tárolására is letölthető a Biofortuna honlapján www.biofortuna.com.

C

V

C

6/11. oldal


10. Minőségbiztosítás és minőség-ellenőrzés Minden egyes SSPGo tételt minőség-ellenőrzésnek vetünk alá, mielőtt a termék elhagyná a Biofortuna gyárát. Az egyes készlettételekből származó mintákat meghatározott humán DNS-mintapanel alapján ellenőrizzük a megfelelő teljesítmény biztosítása érdekben. Minden egyes reakciót minimum 47 jól karakterizált sejtvonal DNS-minta alapján validálunk. A Biofortuna azt ajánlja, hogy a laboratóriumok maguk is validálják az új tipizáló termékeket, mielőtt klinikai mintákkal használnák azokat. Kizárólag megfelelően oktatásban részesült és képzett szakszemélyzet végezhet diagnosztikai tipizálást, és az eredményeket a személyzet egy másik tagjának ellenőriznie kell. 11. Klinikai adatok Egy in vitro diagnosztikaieszköz-tesztelő vizsgálatban öt vizsgálóhelyen hasonlították össze az SSPGo HLA Typing Kits teljesítményét a „One Lambda” Labtype SSO előrejelző készülék teljesítményével. Az SSPGo vizsgálata érdekében végrehajtott lókusztipizálás az alábbi lókuszokhoz biztosított eredményeket: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLADQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 és HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8. Az SSPGo HLA Typing Kits klinikai teljesítménye nem kevesebb mint 95%-os megbízhatóság mellett, összesítve 98,3-100%-ban megfelelt az előrejelző készülék eredményének (SSO módszer) az I. és II. osztályú HLA allélek tesztelésében; a minta tesztelése teljes vérből származó DNS 5–10 ng/μl-es koncentrációja mellett zajlott. Ha kizárunk három (3) bizonyítottan nem egyező genotípus-meghatározási eredményt, 100% -osnak bizonyul az egyezés a minden egyes készlet 3-3 tételével elvégzett 1222 mintaelemzés esetében az Amerikai Egyesült Államok és az Egyesült Királyság területén lévő vizsgálóhelyek tesztjében. A SSPGo HLA Typing kits teszteredményeinek vizsgálóhelyek közötti ismételhetőségének vizsgálatát három vizsgálóhelyen végeztük 8 reprezentatív SSPGo PCR-reakció esetében, 4 ng/μl és 11 ng/μl-es koncentrációjú, biztosított DNS-minta segítségével. Ezek a koncentrációk a tesztkészletek koncentrációtartományának szélső értékeit képviselik. A 960 egyedi reakcióból 958 bizonyult azonosnak a DNS mintákkal, ezek egyenlően oszlottak meg a három külső vizsgálóhely között, ez összesen 99,7%-os eredménynek felel meg (alsó ellenőrzési határ: 0,995). A készletek közötti ismételhetőség vizsgálatát egy kiválasztott SSPGo HLA tesztkészlet három tételén végeztük egy vizsgálóhelyen, egy kezelő által végrehajtva. A DNS koncentrációtartománya 5–10 ng/μl volt. A SSPGo HLA tipizálás készletek közötti megismételhetősége 100%-osan megegyezett az előrejelző eszköz eredményeivel a SSPGo HLA tipizáló teszt három (3) készletén végezve; készletenként 130 DNS-mintából 130, összesen 390 bizonyult egyezőnek. Megegyező SSPGo HLA pozitív megerősítést kaptunk az I. és II. osztályú allélek esetében a LABType SSO segítségével végzett összehasonlító tesztelése során a klinikai mintákon. Az SSPGo HLA belső tesztje egyező eredményeket mutatott a referencia DNS-mintákkal, kivéve az elérhetetlen minták esetében, mint például bizonyos ritka HLA-DPB1 allélek és ritka HLA-B allélek és allélcsoportok, mint például az alábbiak: B*59:01, B*78 és B*83:01. Az alábbi allélcsoportok nem kerültek megerősítésre: B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 és DPB*105:01. 12. Irodalomjegyzék 1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67. 2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.

C

V

C

7/11. oldal


13. SSPGo hibaelhárítás útmutató Probléma Nincs amplifikáció a reakciókban

Lehetséges ok Az alkalmazott DNS koncentrációja nem megfelelő PCR-inhibitorok vannak a DNS-mintában Az alkalmazott DNSminta minősége nem megfelelő

Megoldás Mérje meg a DNS mennyiségét OD280 értéken, és ügyeljen arra, hogy reakciónként összesen 50–100 ng DNS-t adjon 10 µl térfogathoz. Ne használjon heparinizált vért. Kerülje az 1 mg/dl-nél több hemoglobint tartalmazó DNS-mintát. Ellenőrizze a DNS minőségét. Az OD260/280 aránynak 1,66 és 1,94 között kell lennie az UV-spektrofotométer adatai alapján. Gondoskodjon arról, hogy a DNS teljesen újraszuszpendálódjon az oldatban használat előtt.

A reagensek nem teljesen szuszpendálódtak újra A PCR-készülék nem megfelelően van beállítva

Gondoskodjon arról, hogy a DNS-minta molekuláris tisztaságú vízben legyen hígítva, és ne tartalmazzon 2,5 mM Tris/0,25 mM EDTA-nál többet. Gondoskodjon arról, hogy a pelletek teljesen rehidrált állapotban legyenek a DNS hozzáadásakor. Ügyeljen arra, hogy reakciónként 10 µl DNS-oldatot használjon. Gondoskodjon arról, hogy a PCR-programot helyesen állítsa be – a használati utasításoknak megfelelően. Ügyeljen arra, hogy a PCR-készülék fűtött fedele megfelelően legyen rögzítve és lezárva.

Elektroforézissel kapcsolatos problémák

További útmutatásért lásd a PCR-készülék használati utasításait. Gondoskodjon arról, hogy az elektroforézis tartály áram alatt legyen; ellenőrizze a tápegységet, és tisztítsa meg az elektródákat. Futtassa a gélt 0,5 × TBE pufferben. Ügyeljen arra, hogy 0,5 µg/ml friss etídium-bromidot használjon. Ellenőrizze, hogy a gél megjelenítésekor az UV-megvilágítás megfelelő mértékű-e.

Nem megfelelően zárták le a lemezeket

További útmutatásért lásd a gyártó futtatókádra és tápegységre vonatkozó használati utasítását. A nem megfelelően lezárt lemezek párologhatnak a PCR során. A Biofortuna az ajánlott zárólapokat a készletben szállítja. További zárólapokért vegye fel a kapcsolatot a forgalmazóval. Ügyeljen arra, hogy az összes cellát megfelelően lezárja. Fordítson különös figyelmet a cellák PCR-lemezhez vagy -csíkhoz közeli széleinek, sarkainak lezárására.

Véletlenszerű kontrollés/vagy allélspecifikusamplikon-

C

Gélhibák

Gondoskodjon arról, hogy minden cellát – helyes sorrendben – a gélbe töltsön, és hogy a cellákba azonos mennyiséget töltsön a PCRreakciókból. A gyártó utasításai szerint kalibrálja a pipettákat.

V

C

8/11. oldal


Probléma kiesés

Lehetséges ok

Megoldás Ellenőrizze, hogy a zsebek megfelelően ki legyenek alakítva a gélben. Gondossággal járjon el a fésűk kivételekor, mivel azok felszakíthatják a zsebek alját. Ügyeljen arra, hogy az agaróz teljesen fel legyen oldódva a gél öntése előtt. Ügyeljen arra, hogy a gélt ne futassa túl sokáig, mivel a kisebb amplikonok túlfuthatnak a végén. Ügyeljen arra, hogy a gélt elég sokáig futtassa ahhoz, hogy a sávok elkülönüljenek.

PCR-készülékkel kapcsolatos problémák

Használjon friss etídium-bromid oldatot. A hibák – különösen a vizsgálati készlet szélén előfordulók – abból fakadhatnak, hogy a fedél nem elég szorosan lett rögzítve. Ez a PCR-reakció során a PCR-csőben a cső felétől felfelé eső részen párolgáshoz és kondenzációhoz, valamint PCR-hibához vezethet. Kérjük, kövesse a gyártó PCR-készülék karbantartására és kalibrálására vonatkozó útmutatását.

Párolgással kapcsolatos problémák

DNS-problémák következtében fellépő, szórványos hibák

A használati utasítások alapján ellenőrizze, hogy a PCR-paraméterek helyesek-e. Ügyeljen arra, hogy az összes cella megfelelően le legyen zárva. Fordítson különös figyelmet a cellák PCR-lemezhez vagy -csíkhoz közeli széleinek, sarkainak lezárására. Ügyeljen arra, hogy a fedélfűtés be legyen kapcsolva, és a fedél által kifejtett nyomás megfelelő legyen. Gondoskodjon róla, hogy a Biofortuna zárólapjait használja (a készletben szállítva). További zárólapokért vegye fel a kapcsolatot a forgalmazóval. Nincs DNS: gondoskodjon arról, hogy minden cellában legyen DNS. Helytelen mennyiség: gondoskodjon arról, hogy minden egyes reakció esetében 10 µl DNS-oldat kerüljön hozzáadásra. Túl sok vagy túl kevés hozzáadott DNS: 200 ng feletti vagy 20 ng alatti koncentráció PCR-hibát okozhat.

Elmosódott gélkép

Gyenge amplifikáció

C

DNS

DNS-koncentrációval kapcsolatos problémák

A DNS-ben lévő szennyeződés szórványos vagy kiterjedt amplifikációs problémákhoz vezethet. Ellenőrizze a DNS koncentrációját és tisztaságát. Túl sok DNS hozzáadása a PCR-reakcióhoz elmosódott gélképet eredményezhet. Degradáció vagy túl kis tisztaság lehet a kiváltó ok. Szerezzen be új DNS-mintát. Ellenőrizze, hogy a DNS-koncentráció nem túl magas, vagy alacsony. Optimális: reakciónként 50–100 ng DNS 10 µl-ben.

V

C

9/11. oldal


Probléma

Lehetséges ok PCR-készülékkel kapcsolatos problémák

Gélhibák

Megoldás Kérjük, kövesse a gyártó PCR-készülék karbantartására és kalibrálására vonatkozó útmutatását. A használati utasítások alapján ellenőrizze, hogy a PCR-paraméterek helyesek-e. Ügyeljen arra, hogy az egyes zsebekbe azonos reakciómennyiséget töltsön (5 µl és 10 µl között). A gyártó utasításai szerint kalibrálja a pipettákat.

Nem specifikus amplifikáció

DNS-koncentrációval kapcsolatos problémák A reakciócellákat nem a helyes sorrendben töltötték be Új allélt azonosítottak

Nem értelmezhető amplifikációs mintázat

Az információt helytelenül specifikus sávként értelmezik

A reakciócellákat nem a helyes sorrendben töltötték be Egyedi PCR-hiba Hiányzó kis amplikonok

Új allélt azonosítottak a mintában

C

Használjon friss etídium-bromid oldatot. Ellenőrizze, hogy a DNS-koncentráció nem túl magas vagy alacsony. Optimális: reakciónként 50-100 ng DNS 10 µl-ben. Ellenőrizze a PCR-reakciók és a gélsávok helyes sorrendjét. Előzze meg a gél túlfolyását a szomszédos cellákból oly módon, hogy megfelelő mennyiséget tölt be, és ügyeljen arra, hogy a gél megszilárduljon a fésűk eltávolítása előtt. Korábban nem szekvenált allélok jelentkezhetnek új amplifikáció mintázattal. Ha régi értelmező mintát használ, töltse le az aktuális mintát a www.biofortuna.com weboldalról. Amennyiben ez sem tartalmazza az új mintázatot, ismételje meg a vizsgálatot egy másik Biofortuna készlet használatával, vagy szekvenciánként azonosítsa a tipizálási információkat. Ellenőrizze az Értelmezési táblázatokat a helyes sávméret tekintetében. Ellenőrizze, hogy a specifikus amplifikációk mérete helyes-e, illetve hogy az információt (átszennyezés, primer dimer) helytelenül amplifikációként értelmezték-e. Ellenőrizze a PCR-reakciók és a gélsávok helyes sorrendjét. Ellenőrizze, hogy minden belső pozitív kontroll jelen van-e. Végezze el újra az értelmezést úgy, hogy ne legyenek hiányzó reakciók. Túl hosszú elektroforézis, a kis amplikonok túlfutottak a gél végén vagy az etídium-bromid fronton, illetve elvesztek, mert bejutottak az előző gélzsebbe. Végezzen az Ön gélrendszerének megfelelő elektroforézist. Előfordulhat, hogy új allélokat fedeznek fel, ami olyan amplifikációs mintázatot eredményezhet, amely nem egyezik a jelenlegi alléllel (allélekkel). Kérjük, lépjen kapcsolatba területi képviselőjével.

V

C

10/11. oldal


14. Átdolgozások listája Átdolgozás:

A 4. és 5. verzió között

Az átdolgozás dátuma: 2014. január 21. Rész

Az átdolgozás leírása

4. rész: A készlet tartalma

A készletben levő lezárók hozzáadása

5. rész: Nem mellékelt reagensek, berendezések és eszközök

A 96 helyes PCR-készülék specifikációinak frissítése A készlet tárolási körülményeinek megváltozása 2–28 oC-ra A nem hidrált PCR lemezek és csíkok kezelése A hidrált PCR lemezek és csíkok kezelése

8. rész: Használati utasítások

A DNS hígítása steril, molekuláris tisztaságú vízben Az interferáló anyagok, és a DNS-tisztasági irányelvek frissítésének hozzáadása Az OD260/280 mérések frissítése Hozzáadva a fagyasztva szárított pellet helyzete a minta hozzáadása előtt A felsokszorozott termék tárolásai körülményeinek hozzáadása A gél-elektroforézis időtartamára vonatkozó megjegyzés hozzáadása

9. rész: Értelmezés

Mondat a tételspecifikus megjegyzésekről A készlet tételszámának pontosan meg kell egyeznie az értelmező táblázaton szereplő tételszámmal.

11. rész: Klinikai adatok

Újonnan hozzáadott rész

14 rész: Átdolgozások listája

Újonnan hozzáadott rész

C

V

C

11/11. oldal


15. Jelmagyarázat

X P i M V H 4: s28

g

:

Vizsgálatok száma Képviselő az Európai Közösségben Tekintse át a használati utasítást Gyártás helye In vitro diagnosztikum Lejárat napja Tárolási hőmérséklet Tételszám Forgalmazó Global Trade Item Number

16. A gyártó kapcsolattartási információi Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK T: +44 (0) 151 334 0182 E: [email protected] W: www.biofortuna.com 17. Fordítások FranÇaise: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska:

Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítás rendelkezésre áll Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga

www.biofortuna.com

C

V

C

11. oldal. 1

Recommend Documents