11. Oldal 2

4.

DNS amplifikációs protokollok a PowerPlex® ESX 17 rendszer használatával A felhasználó által biztosítandó eszközök és anyagok • GeneAmp® PCR System 9700 vagy 2720 PCR készülék (Applied Biosystems) • mikrocentrifuga • 0,2 ml-es MicroAmp® reakciócső vagy MicroAmp® optikai 96-lyukú reakciólemez (Applied Biosystems) • 1,5 ml-es mikrocentrifuga cső • aeroszol-rezisztens pipettahegy (lásd 9.F rész) A rutineljárás során 25 µl reakciótérfogatban 0,5 ng DNS templátból indul az amplifikálás az alábbi protokollban részletezett módon. A PowerPlex® ESX 17 rendszer a GeneAmp® PCR System 9700 PCR készülékkel történő használatra optimalizált. A GeneAmp® PCR System 2720 PCR készülékhez való amplifikációs protokollt is mellékeljük. 4.A. Az amplifikációs reakció összeállítása A keresztszennyezés elkerülése érdekében erősen javasolt kesztyű és aeroszolrezisztens pipettahegyek használata. A pre-amplifikációs és poszt-amplifikációs reagenseket tartsa külön helyiségekben. Az amplifikációs reakciót egy, erre a célra fenntartott helyiségben állítsa össze. Az amplifikációs reakciókat csak az erre a célra fenntartott eszközök, fogyóeszközök és anyagok használatával állítsa össze. A 9947A DNS koncentrációjának meghatározása a 260 nm-en mért abszorbancia alapján történt. Ezen kontroll DNS más módszerekkel, mint például qPCR-ral történő mennyiségi meghatározása eltérő értéket eredményezhet. Minden amplifikációhoz készítsen friss DNS hígítást. Ne tároljon hígított (pl. 0,25 ng/µl vagy alacsonyabb koncentrációjú) DNS-t. A sejtvonalból származó 9947A DNS allélikus, valamint STR lókuszok közötti kiegyensúlyozatlanságot mutat. Ne használjon sejtvonalból származó DNS-t érzékenységi tesztre. Az érzékenységi tesztekhez használandó DNS-t használat előtt egy éjszakán át tárolja 4°C-on.

!

A sikeres amplifikáció alapos, gondos előkészítést igényel. Az amplifikációs problémák elhárításával kapcsolatos útmutató a 7.A részben található. 1.

Várjon, míg a következő komponensek teljesen fel nem olvadnak: PowerPlex® ESX 5X Master Mix, PowerPlex® ESX 17 10X Primer Pair Mix, 9947A DNS, és amplifikációs minőségű víz. Megjegyzés: Használat előtt centrifugálja röviden a csöveket, hogy tartalmuk a cső alján összegyűljön, majd 15 másodpercig vortexelje a reagenseket. Az első centrifugálás után ne centrifugálja újra a 10X Primer Pair Mix-et, mivel az ismételt centrifugálás következtében a primerek összekoncentrálódhatnak a cső alján.

2.

Határozza meg az összemérendő reakciók számát. Számítsa bele a pozitív és negatív kontroll reakciókat is. A pipettázási hiba kompenzálására számítson hozzá további 1 vagy 2 reakciót. Ez ugyan további kis mennyiséget használ minden reagensből, viszont garantálja, hogy a PCR amplifikációs keverék mennyisége elegendő lesz valamennyi mintához. Garantálja továbbá, hogy minden reakció ugyanazt az összetételű PCR amplifikációs keveréket tartalmazza.

Promega Corporation· 2800 Woods Hollow Road· Madison, WI 53711-5399 USA· Ingyenes telefonszám az Egyesült Államokban: 800-356-9526· Tel: +1 608-274-4330· Fax: +1 608-277-2516· www.promega.com Part# TMD024 Oldal 2

Nyomtatva az Egyesült Államokban. 12/11

3.

Helyezzen minden reakcióhoz egy tiszta, 0,2 ml-es reakciócsövet egy állványba és lássa el azokat a megfelelő felirattal. Alternatív megoldásként használható megfelelően feliratozott MicroAmp® reakciólemez is.

4.

Egy steril, 1,5 ml-es csőbe mérje össze az 1. táblázatban felsorolt reagenseket. Az 1. táblázat a komponensek egy reakcióhoz szükséges térfogatát jelzi. A 9.D részben található egy, az egyes komponensek PCR amplifikációs mixhez szükséges mennyiségeinek kiszámítására szolgáló munkalap (5. táblázat). 1. táblázat. PCR amplifikációs keverék a PowerPlex® ESX 17 rendszerhez. PCR amplifikációs keverék komponens1 Víz, amplifikációs minőségű

Egy reakcióra számított térfogat 25,0 µl végső térfogatra

PowerPlex®

ESX 5X Master Mix

5,0 µl

PowerPlex®

ESX 17 10X Primer Pair Mix

2,5 µl

templát DNS (0,5 ng) 2,3

max. 17,5 µl

teljes reakciótérfogat 1Először

25 µl PowerPlex®

adjon amplifikációs minőségű vizet a reakciócsőbe, majd ESX 5X Master Mix és PowerPlex® ESX 17 10X Primer Pair Mix reagenseket. A templát DNS-t a 6. pontban kell hozzáadni. 2A DNS templátot nukleázmentes vízben vagy TE-4 pufferben (10mM Tris-HCl [pH 8.0], 0,1mM EDTA) tárolja. Ha a DNS templátot olyan TE pufferben tárolják,melynek kémhatása nem pH 8.0 vagy nagyobb koncentrációban tartalmaz EDTA-t, a hozzáadott DNS mennyisége nem haladhatja meg a végső reakciótérfogat 20%-át. A PCR amplifikáció hatékonyságát és minőségét erősen befolyásolják a pH változásai (a hozzáadott Tris-HCl hatására), a szabad magnézium-koncentráció (az EDTA kelátképző hatása következtében), valamint egyéb PCR inhibítorok hatásai, melyek a templát DNS-eredetétől és az alkalmazott DNS-extrakciós eljárástól függően alacsony koncentrációban jelen lehetnek. 3Az alkalmazott DNS-meghatározási módszertől függően eltérő DNS-koncentráció értékek mérhetőek (13). A DNS-templát itt ajánlott mennyisége a DNS-koncentrációnak a 260 nm-en mért abszorbanciával történt meghatározásán alapul. Erősen javasolt az optimális DNS-mennyiség meghatározása az Ön által használt DNS-mérési módszerrel.

5.

! 6. 7.

8.

5-10 másodpercig vortexelje a PCR amplifikációs keveréket, majd pipettázza a megfelelő mennyiségeket a reakciócsövekbe. A nem kellően összekevert (vortexelt) PCR amplifikációs keverék gyenge amplifikációt vagy lókuszok közti inbalanciát eredményezhet. Az egyes mintákhoz tartózó templát DNS-eket (0,5ng) pipettázza a PCR amplifikációs keveréket tartalmazó reakciócsövekbe. A pozitív amplifikációs kontrollhoz hígítsa a 9947A DNS-t úgy, hogy a kiveendő térfogat 1,0 ng DNS-t tartalmazzon. Ezt az 1,0 ng DNS-t tartalmazó térfogatot pipettázza a PCR amplifikációs keveréket tartalmazó reakciócsőbe. A negatív amplifikációs kontrollhoz pipettázzon amplifikációs minőségű vizet (templát DNS helyett) az amplifikációs keveréket tartalmazó PCRcsőbe.

Promega Corporation· 2800 Woods Hollow Road· Madison, WI 53711-5399 USA· Ingyenes telefonszám az Egyesült Államokban: 800-356-9526· Tel: +1 608-274-4330· Fax: +1 608-277-2516· www.promega.com Nyomtatva az Egyesült Államokban. 12/11

Part# TMD024 Oldal 3

4.B. Amplifikációs program Ez a kézikönyv a PowerPlex® ESX 17 rendszernek a GeneAmp® PCR System 9700 és 2700 PCR készülékekkel történő használatára vonatkozó protokollokat tartalmaz. Az amplifikáció és a detektálás során használt készülékek eltérhetnek. Az eltérő laboratóriumi készülékek használata esetén szükséges lehet a protokollok, beleértve a ciklusszámok és az injektálási idők optimalizálása. A Promega Corporation által végzett tesztek szerint 0,5 ng tisztított DNS templát amplifikációjához megfelelő a 30 ciklus. 1.

Helyezze a PCR-csöveket vagy a MicroAmp® reakciólemezt a PCR készülékbe.

2.

Válassza ki és futtassa le a javasolt protokollt. A GeneAmp® PCR System 9700 és 2720 PCR készülékekhez javasolt protokoll alább található. PCR protokoll1 96°C, 2 perc, majd: 94°C, 30 másodperc 59°C 2 perc 72°C, 90 másodperc 30 cikluson keresztül, majd: 60°C, 45 perc 4°C állás 1GeneAmp®

PCR System 9700 PCR készülék használata esetén a programnak 9600-os hűtési-fűtési (ramp) sebességgel kell futnia. A ramp sebesség a PCR program elindítása után állítható be. Megjelenik a Select Method Options képernyő. A ramp speed pontban válassza a „9600” opciót, és adja meg a reakciótérfogatot.

3.

A PCR program befejezése után tárolja a mintákat –20 °C-on, fénytől védett dobozban. Megjegyzés: Az amplifikált minták 4 °C-on vagy magasabb hőmérsékleten történő tárolása a PCR-termékek degradációjához vezethet.



5.

A készülék beállítása és minta-előkészítés 5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával A felhasználó által biztosítandó anyagok: • 95 °C szárazblokkos inkubátor, vízfürdő vagy PCR-készülék • jégkása vagy jeges vízfürdő • 96 lyukú lemezekkel kompatibilis centrifuga • aeroszol-rezisztens pipettahegyek • 3500/3500xL kapilláris array, 36 cm • 96 lyukú lemezekhez lemeztartó és aljzat (normál) (Applied Biosystems Kat.sz. 4410228) • POP-4™ polimer tasakban az Applied Biosystems 3500 vagy 3500xL készülékekhez Genetic Analyzer • anód puffer tartály • katód puffer tartály • kondicionáló reagens tasak az Applied Biosystems 3500 vagy 3500xL készülékekhez Genetic Analyzer • MicroAmp® optikai 96 lyukú reakciólemez és szeptumok • Hi-Di™ formamid (Applied Biosystems Kat.sz. 4311320) • PowerPlex® 5-Dye Matrix standardok, 3100/3130 (Kat.sz. DG4700)

!

A formamid minősége nagyon fontos. Használjon Hi-Di™ formamidot. A formamidot alikvotokban –20 °C-on fagyasztva tárolja. Az ismételt lefagyasztásfelolvasztás vagy a hosszú távú 4 °C-on történő tárolás a formamid bomlását okozhatja. A rossz minőségű formamid olyan ionokat tartalmazhat, melyek az injektálás során versengenek a DNS-sel, ami alacsonyabb csúcsmagassághoz és csökkent érzékenységhez vezet. A hosszabb befecskendezési idő nem biztos, hogy növeli a jelet.

!

A formamid irritáló, teratogén anyag: kerülje belégzését és a bőrrel történő érintkezést. Olvassa el a vegyszeren található figyelmeztető címkét, és a megfelelő elővigyázatossággal használja az anyagot. A formamiddal végzett munka során mindig viseljen gumikesztyűt és védőszemüveget. Mintaelőkészítés 1.

Az alábbiak szerint készítse elő a mintafelviteli koktélt CC5 Internal Lane Standard 500 és Hi-Di™ formamid összekeverésével: [(1,0 μl CC5 ILS 500) × (injektálások száma)] + [(10,0 μl Hi-Di™ formamid) × (injektálások száma)] Megjegyzés: A méretstandard csúcsok intenzitásának beállításához a mintafelviteli koktélban lévő belső standard térfogata megduplázható. A formamid mennyiségét tartsa 10,0 μl-en, és a 3. lépésben a lyukakhoz hozzáadott térfogatokat igazítsa a megváltozott belső standard térfogatnak megfelelően.

2.

10-15 másodpercig vortexelve keverje össze az elegyet.

3.

Pipettázzon 11 μl formamid/belső standard keveréket minden lyukba.



5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) 4.

Adjon hozzá 1 μl amplifikált mintát (vagy 1 μl allélikus létra keveréket). A lyukakat fedje a megfelelő szeptumokkal. Megjegyzés: A készülék detektálási határai változóak lehetnek; ezért szükség lehet az injektálási idő, az injektálási feszültség vagy a mintafelviteli koktéllal összekevert termék mennyiségének növelésére vagy csökkentésére. Ha a futtatási modulban szeretné módosítani az injektálási időt vagy a feszültséget, válassza az adatgyűjtő szoftverben lévő „Library” menüből az „Instrument Protocol” opciót. Ha a csúcsmagasságok a kívántnál magasabbak, a kívánt jelintenzitás elérése érdekében használjon kevesebb DNS-templátot az amplifikációs reakciókban vagy csökkentse a ciklusok számát 2-4 ciklussal.

5.

A légbuborékok eltávolítása érdekében centrifugálja a lemezt rövid ideig.

6.

A mintákat denaturálja 95 °C-on 3 percig, majd azonnal hűtse le jégkásán vagy jeges vízfürdőben szintén 3 percig. A mintákat csak a készülékre történő felvitelüket közvetlenül megelőzően denaturálja.



A készülék előkészítése A készülék karbantartási menetrendjével, a kapilláris array, a pufferek és a polimer tasak használatával, valamint a térbeli kalibráció végrehajtásával kapcsolatos utasításokat megtalálja az Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében. A mintákat az Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően analizálhatja. 1.

Nyissa meg a 3500 Data Collection szoftvert. A műszer vezérlőképernyője elindul (2. ábra). Gondoskodjon arról, hogy a fogyóeszköz információk (Consumables Information) és a karbantartási értesítések (Maintenance Notifications) elfogadhatóak legyenek. A fűtőblokk hőmérsékletét állítsa 60 °C-ra, majd az előfűtés elindításához válassza a „Start Pre-Heat” opciót legalább 30 perccel az első injektálás előtt.

2. ábra. A műszer vezérlőképernyője („Dashboard”).




Egy új készülék protokoll létrehozásához a „Library” menüben válassza az „Instrument Protocol”, majd a „Create” opciót. Használhat előzetesen létrehozott készülék protokollt is. A 3. ábra bemutatja a Promegánál az Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer készüléken használt beállításokat az alkalmazás típusát, a festékkészletet, a kapillárishosszt, a polimert, a futtatási modult és a megfelelő protokoll információkat illetően. Az alapértelmezett beállítások közül csak a festékkészlet beállítása változott. A készülék protokoll létrehozása során mindenképpen ugyanazt a festékkészletet használja, mint a Promega 5-dye spektrális kalibrálásához. Az ajánlott futtatási idő 1210 másodperc, és használja az alapértelmezett injektálási körülményeket.

!

A futtatási időt és az egyéb készülékbeállítási paramétereket minden laboratóriumban optimalizálni és validálni kell. Olyan nevet használjon, mely jellemzi az adott protokollt.

9393TA

Megjegyzés: Részletesebb információkért olvassa el az Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer készülékek felhasználói kézikönyvét.

3. ábra. A „Create New Instrument Protocol” ablak



3.

A QC protokollhoz használandó új méretstandard létrehozásához lépjen a „Library” menühöz. Válassza a „Size Standards”, majd a „Create” opciót. Használhat előzetesen létrehozott méretstandardot is.

9227TA

A méretstandardnak adjon „PPlex_ILS500” vagy más megfelelő nevet. Válassza az „Orange” festékszínt (Dye Color). A méretstandardokban a fragmentek 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 és 500 bázis hosszúságúak. Lásd a 4. ábrát.

4. ábra. A „Create New Size Standard” ablak.




Egy új QC protokoll létrehozásához lépjen a „Library” menühöz. Válassza a „QC Protocols”, majd a „Create” opciót. Használhat előzetesen létrehozott QC protokollt is.

9228TA

Olyan nevet használjon, mely jellemzi az adott protokollt. Válassza a 3. lépésben létrehozott méretstandardot. A QC protokollhoz tartozó beállításoknak az Applied Biosystems 3500 vagy 3500xL Genetic Analyzer készülék PowerPlex® ESX 17 rendszeréhez belsőleg validált körülményeken kell alapulnia. Az 5. ábra bemutat egy lehetőséget ezekhez a beállításokhoz.

5. ábra. A „Create New QC Protocol” ablak.



5.

Egy új assay létrehozásához lépjen a „Library” menühöz. Válassza az „Assays” opciót, majd a „Create” parancsot. Használhat előzetesen létrehozott assayt is.

9229TA

A „Create New Assay” ablakban (6. ábra) válassza a 2. lépésben létrehozott készülék protokollt, valamint a 4. lépésben létrehozott QC protokollt. Olyan nevet adjon, amely jellemzi az adott assayt. Válassza az „HID” alkalmazástípust. Egy lemezen az összes elnevezett mintához szükséges egy assay.

6. ábra. A „Create New Assay” ablak.




Egy új fájlnév konvenció létrehozásához (7. ábra) lépjen a „Library” menühöz. Válassza a „File Name Convention”, majd a „Create” opciót. Használhat előzetesen létrehozott fájlnév konvenciót is.

9252TA

A laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően válassza ki a fájlnév tulajdonságait (File Name Attributes), és mentse el egy jellemző néven.

7. ábra. A „Create New File Name Convention” ablak.



7.

Egy új eredmény csoport létrehozásához (8. ábra) lépjen a „Library” menühöz. Válassza a „Results Group”, majd a „Create” parancsot. Használhat előzetesen létrehozott eredmény csoportot is. A laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően válassza ki az eredmény csoport tulajdonságait (Results Group Attributes), és mentse el egy jellemző néven. Egy új lemez létrehozásához lépjen a „Library” menühöz, és a „Manage” menüből válassza a „Plates”, majd a „Create” opciót.

9253TA

8.

8. ábra. A „Create New Results Group” ablak.



5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) Olyan nevet használjon, mely jellemzi az adott lemezt. A legördülő menüből válassza az „HID” lemez típust (9. ábra).

9254TA

9.

9. ábra. Lemeztulajdonságok definiálása.

10. Válassza az „Assign Plate Contents” opciót (10. ábra). 11. A lyukakhoz rendeljen mintaneveket.

9255TA

12. A képernyő bal alsó részén, az „Assays” alatt használja az „Add from Library” opciót az 5. lépésben vagy előzetesen létrehozott assay kiválasztásához. Klikkeljen az „Add to Plate” gombra, és zárja be az ablakot.

10. ábra. Lemeztartalom hozzárendelése.



13. A „File Name Convention” alatt, a 6. lépésben vagy előzetesen létrehozott fájlnévkonvenció kiválasztásához használja az „Add from Library” opciót. Klikkeljen az „Add to Plate” gombra, és zárja be az ablakot. 14. A „Results Groups” alatt, a 7. lépésben vagy előzetesen létrehozott eredmény csoport kiválasztásához használja az „Add from Library” opciót. Klikkeljen az „Add to Plate” gombra, és zárja be az ablakot. 15. Jelölje ki a minta lyukakat, majd pipálja ki az „Assays”, a „File Name Convention” és a „Results Groups” adott mintákra vonatkozó jelölőnégyzeteit. 16. Válassza a „Link Plate for Run” opciót. 17. Megjelenik a „Load Plate” ablak. Válassza a „Yes” lehetőséget. 18. A „Run Information” ablakban (11. ábra) adjon meg egy futtatási nevet. Válassza a „Start Run” opciót (nincs feltüntetve).

11. ábra. Futtatási név megadása.



5.B. Az amplifikált fragmentumok kimutatása 2.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott ABI PRISM® 3100 vagy 3100-Avant Genetic Analyzer készülékkel vagy 3.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott Applied Biosystems 3130 vagy 3130xl Genetic Analyzer készülékkel. A felhasználó által biztosítandó anyagok • 95 °C-ra fűtött szárazblokkos inkubátor, vízfürdő vagy PCR készülék • jégkása vagy jeges vízfürdő • 96-lyukú lemezekhez használható centrifuga • aeroszol-rezisztens pipettahegyek • 3100 vagy 3130 kapilláris array, 36 cm • teljesítményoptimalizált polimer 4 (POP-4™) a 3100 vagy 3130 készülékhez • 10X genetic analyzer puffer EDTA-val • MicroAmp® optikai 96-lyukú reakciólemez és szeptumok • Hi-Di™ formamid (Applied Biosystems Kat.sz. 4311320) • PowerPlex® 5-Dye Matrix standardok, 3100/3130 (Kat.sz. DG4700)

!

!

A formamid minősége nagyon fontos. Használjon Hi-Di™ formamidot. A formamidot alikvotokban, –20 °C-on fagyasztva tárolja. Az ismételt lefagyasztásfelolvasztás vagy a hosszú távú, 4 °C-on történő tárolás a formamid bomlását okozhatja. A rossz minőségű formamid olyan ionokat tartalmazhat, melyek az injektálás során kompetálnak a DNS-sel, mely alacsonyabb csúcsmagassághoz és csökkent érzékenységhez vezet. A hosszabb befecskendezési idő nem biztos, hogy növeli a jelet. A formamid irritáló, teratogén anyag; kerülje belégzését és a bőrrel történő érintkezést. Olvassa el a vegyszeren található figyelmeztető címkét és a megfelelő elővigyázatossággal használja azt. A formamiddal végzett munka során mindig viseljen gumikesztyűt és védőszemüveget. Minta előkészítés 1.

Az alábbiak szerint készítse elő a mintafelviteli koktélt a CC5 Internal Lane Standard 500 és Hi-Di™ formamid összekeverésével: [(1.0 µl CC5 ILS 500) × (injektálások száma)] + [(10.0 µl Hi-Di™ formamid) × (injektálások száma)] Megjegyzés: A méretstandardcsúcsok intenzitásának beállításához a mintafelviteli koktélban lévő belső standard térfogata megduplázható. A formamid mennyiségét tartsa 10,0 μl-en, és a 3. lépésben a lyukakhoz hozzáadott térfogatokat igazítsa a megváltozott belső standard térfogatnak megfelelően.

2.


3.

Pipettázzon 11 µl formamid/belső standard keveréket minden lyukba.

4.

Adjon hozzá 1 µl amplifikált mintát (beleértve a pozitív-negatív kontrollt is) vagy 1 µl PowerPlex® ESX 17 Allelic Ladder Mix-et. Fedje le a lyukakat a megfelelő szeptummal. Megjegyzés: A készülék detektálási határai változók lehetnek; ezért szükség lehet az injektálási idő, az injektálási feszültség vagy a mintafelviteli koktéllal összekevert termék mennyiségének beállítására. Az adatgyűjtő szoftverben a „Module Manager”-t használja az injektálási idő vagy feszültség futtatási modulban történő módosításához. (Lásd Készülék előkészítése, alább.)



5.

Szükség esetén röviden centrifugálja le a lemezt a légbuborékok eltávolítása érdekében.

6.

Denaturálja a mintákat 95 °C-on 3 percig, majd azonnal helyezze jégkására vagy jeges vízfürdőbe 3 percre. A mintákat közvetlenül a készülékbe történő behelyezés előtt denaturálja.

Készülék előkészítése A tisztítással, a kapilláris array előkészítésével, a kalibráció elvégzésével és a polimer hozzáadásával kapcsolatos utasításokat a készülék felhasználói kézikönyve tartalmazza. A mintákat a 2.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott ABI PRISM® 3100 vagy 3100-Avant Genetic Analyzer vagy 3.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott Applied Biosystems 3130 vagy 3130xl Genetic Analyzer készülékhez mellékelt felhasználói kézikönyvben leírt módon analizálja, az alábbi kivételekkel: 1.

A Module Manager-ben válassza a „New” opciót. A Type legördülő listából válassza a „Regular” opciót, majd a Template legördülő listában a „HIDFragmentAnalysis36_POP4” opciót. Győződjön meg róla, hogy a befecskendezési idő 5 másodperc, a befecskendezési feszültség 3 kV és a futtatási idő 1500 másodperc. Adjon jól beazonosítható nevet a futtatási modulnak, majd válassza az „OK”-t. Megjegyzés: A készülékek érzékenysége eltérhet. Az injektálási idő és feszültség a Module Manager-ben beállítható. Az injektálási idő javasolt tartománya 3-22 másodperc, a befecskendezési feszültségé 1-3 kV.

2.

A Protocol Manager-ben válassza a „New” opciót. Adjon nevet a protokollnak. A Type legördülő listából válassza a „Regular” opciót, majd a Run Module legördülő listából válassza ki azt a futási modult, melyet a megelőző lépésben létrehozott. Végül a dye-set legördülő listában jelölje ki a „G5”-t. Kattintson az „OK”-ra.

3.

A Plate Manager modulban hozzon létre új lemez rekordot, a készülék felhasználói kézikönyvében leírtak szerint. A megjelenő párbeszédablakban az Application legördülő listában jelölje ki a „GeneMapper—Generic” pontot, majd válassza ki a megfelelő lemez típust (96-lyukú). Töltse ki a tulajdonos és az operátor ablakokat, majd kattintson az „OK” pontra. Megjegyzés: Ha a mintaadatok automatikus analízise szükséges, az ezzel kapcsolatos útmutatás a felhasználói kézikönyvben található.



5.B. Az amplifikált fragmentumok kimutatása 2.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott ABI PRISM® 3100 vagy 3100-Avant Genetic Analyzer készülékkel vagy 3.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott Applied Biosystems 3130 vagy 3130xl Genetic Analyzer készülékkel (folytatás) 4.

A GeneMapper lemez bejegyzésnél a megfelelő rubrikákban adja meg a mintaneveket. Gördítse jobbra az ablakot. A Results group 1 oszlopban válassza ki a kívánt eredmény csoportot. Az Instrument Protocol 1 oszlopban válassza ki a 2. lépésben létrehozott protokollt. Ellenőrizze, hogy ez az információ minden olyan sorban szerepeljen, mely mintanevet tartalmaz. Kattintson az „OK”-ra. Megjegyzés: Új eredmény csoport létrehozásához kattintson a „New” pontra az eredmény csoport oszlop legördülő menüjében. Válassza a General fület, majd adjon meg egy nevet. Válassza az Analysis fület, majd kattintson a „GeneMapper—Generic” opcióra az Analysis type legördülő listában.

5.

Helyezze a mintákat a készülékbe, és zárja be a készülék ajtaját.

6.

A spektrum ablakban válassza a G5 festékkészletet és ellenőrizze, hogy az aktív festékkészlet a PowerPlex® 5-festék rendszerhez generált fájl.

!

Nagyon fontos, hogy a megfelelő G5 spektrumot válassza a PowerPlex® 5-festék rendszerhez. Ha nem a PowerPlex® 5-festék rendszer az aktív festékkészlet, keresse meg a PowerPlex® 5-festék spektrumot a G5 festékkészlethez tartozó kalibrációs listában (List of Calibrations for Dye Set G5) és kattintson a „Set” pontra.

7.

A futástervezőnél keresse meg a 3. és 4. pontban létrehozott lemez bejegyzést és kattintson egyszer a névre a kiemeléshez.

8.

A lemez bejegyzés kiemelése után kattintson az autosamplerben lévő, az amplifikált mintákat tartalmazó lemeznek megfelelő lemez grafikára.

9.

Ha a lemez bejegyzést a lemezhez társította a rendszer, a lemez grafikája sárgáról zöldre vált, és a zöld színű „Run Instrument” nyíl aktívvá válik.

10. Kattintson az eszközlistán lévő zöld Run Instrument nyílra és indítsa el a minta futtatást. 11. Kövesse az elektroforézist az adatgyűjtő szoftver futási, megtekintő, array vagy kapilláris ablakában. Minden injektálás kb. 40 percig tart.



5.C. Az amplifikált fragmentum detektálása az ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer készülékkel

!

!

A felhasználó által biztosítandó anyagok • 95 °C-os szárazblokkos inkubátor, vízfürdő vagy PCR készülék • jégkása vagy jeges vízfürdő • 310-es kapilláris, 47 cm × 50 µm • teljesítményoptimalizált polimer 4 (POP-4™) • 10X genetic analyzer puffer EDTA-val • mintacsövek és szeptumok • aeroszol-rezisztens pipettahegyek • Hi-Di™ formamid (Applied Biosystems Kat.sz. 4311320) • PowerPlex® 5-Dye Matrix standardok, 310 (Kat.sz. DG4600) A formamid minősége nagyon fontos. Használjon Hi-Di™ formamidot. A formamidot alikvotokban, –20°C-on fagyasztva tárolja. Az ismételt lefagyasztásifelolvasztási ciklusok vagy a hosszú távú, 4°C-on történő tárolás a formamid bomlását okozhatják. A rossz minőségű formamid ionokat tartalmazhat, melyek a befecskendezés során kompetíciót jelentenek a DNS számára, mely alacsonyabb csúcsmagasságokhoz és csökkent érzékenységhez vezet. A hosszabb befecskendezési idő nem biztos, hogy növeli a jelet. A formamid irritáló, teratogén anyag; kerülje belégzését és a bőrrel történő érintkezést. Olvassa el a vegyszeren található figyelmeztető címkét és a megfelelő elővigyázatossággal használja azt. A formamiddal végzett munka során mindig viseljen gumikesztyűt és védőszemüveget. Minta előkészítés 1.

Az alábbiak szerint készítse elő a mintafelviteli koktélt a CC5 Internal Lane Standard 500 standard és Hi-Di™ formamid összekeverésével: [(1.0 µl CC5 ILS 500) × (befecskendezések száma)] + [(24.0 µl Hi-Di™ formamid) × (befecskendezések száma)] Megjegyzés: A méretstandard csúcsok intenzitásának beállításához a mintafelviteli koktélban lévő belső standard térfogata megduplázható. Ha a csúcsmagasságok túl nagyok, ajánlott a felviteli koktél tartalmának megváltoztatása 0,5 µl CC5 ILS 500-ra és 24,5 µl Hi-Di™ formamidra.

2.


3.

Keverjen össze 25,0 µl előkészített mintafelviteli koktélt és 1,0 µl amplifikált mintát (vagy 1 µl PowerPlex® ESX 17 Allelic Ladder Mix-et). Megjegyzés: A készülék detektálási határai változóak lehetnek; ezért szükség lehet az injektálási idő, az injektálási feszültség vagy a mintafelviteli koktéllal összekevert termék mennyiségének növelésére vagy csökkentésére. Az adatgyűjtő szoftverben a "Module Manager"-t használja az injektálási idő vagy feszültség futtatási modulban történő módosításához. (Lásd Készülék előkészítése, alább.)

4.

Szükség esetén röviden centrifugálja a csöveket a légbuborékok eltávolítása érdekében.



5.C. Az amplifikált fragmentum detektálása az ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer készülékkel (folytatás) 5.

Denaturálja a mintákat és a létrát 95°C-on 3 percig melegítve, majd azonnal helyezze jégkására vagy jeges vízfürdőbe 3 percre. A mintákat közvetlenül az injektálás előtt denaturálja.

6.

A reakciócsöveket állítsa össze a megfelelő automata mintaadagoló tálcán.

7.

Helyezze az autosampler tálcát a készülékbe, és zárja be a készülék ajtaját.

Készülék előkészítése A pumpa blokk tisztításával, a kapilláris készülékbe helyezésével, az autosampler kalibrálásával és a polimer fecskendőbe adásával kapcsolatos utasításokat a készülék használati útmutatója tartalmazza. 1.

Nyissa meg az ABI PRISM® 310 adatgyűjtő szoftvert.

2.

Az ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében leírtak szerint készítsen elő egy GeneScan® mintalapot. Adja meg a megfelelő mintainformációt a Sample Info oszlopban. A PowerPlex® ESX 17 Allelic Ladder Mix markert tartalmazó sorokban a fluoreszcein, JOE, TMR-ET, CXR-ET és CC5 festékekhez a „ladder” szót írja be a Sample Info oszlopba. Ezt az információt meg kell adni ahhoz, hogy az adatokat a PowerTyper™ ESX 17 makró segítségével sikeresen analizálni lehessen.

3.

Hozzon létre egy új GeneScan® injektálási listát. A legördülő menüből válassza ki a megfelelő mintalapot.

4.

A legördülő menüből válassza ki a „GS STR POP4 (1 ml) G5” modult. Állítsa 3 másodpercre az injektálási időt és 28 percre a futási időt. A további beállításokat hagyja változatlanul:

!

5.

Inj. Secs: 3 Inj. kV: 15,0 Run kV: 15,0 Run °C: 60 Run Time: 28 Szükség lehet az injektálási idő egyes készülékekhez történő optimalizálására. A 0,5 ng templát DNS-t tartalmazó mintákhoz 2–5 másodperc injektálási idő javasolt. Megjegyzés: A fragmentumok migrációja kismértékű eltérést mutathat hosszú ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer futások során. Ez a hőmérséklet vagy az oszlop változásának lehet a következménye. Nagyszámú minta analízise során a minták pontos genotipizálását segítheti, ha a futtatás során többször, különböző időpontokban allélikus létrát injektálunk. Válassza ki a megfelelő mátrix fájlt.



6.

6.

Az adatok automatikus analíziséhez jelölje be az auto analyze jelölőnégyzetet, valamint a megfelelő analízis paramétereket és méretstandardot. Az opciókkal kapcsolatos specifikus információk az ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében találhatóak.

7.

A mintatálca betöltése és az ajtó bezárása után a „Run” segítségével indítsa el a kapilláris elektroforézis rendszert.

8.

Kövesse az elektroforézis folyamatát a raw data és a status ablakokban. Minden mintánál kb. 35 percet vesz igénybe a pumpálás, a minta injektálása és az elektroforézise.

Adatelemzés 6.A. PowerPlex® ESX Panel, Bin és Stutter sorozatok GeneMapper® ID-X 1.2 verziójú szoftverrel A PowerPlex® ESX 17 rendszerrel generált adatok analízésének megkönnyítése érdekében létrehoztunk panel és bin fájlokat, ezzel lehetővé téve a genotípusok automatikus hozzárendelését a GeneMapper® ID-X szoftver használatával. Javasoljuk, hogy a felhasználók az Applied Biosystems által biztosított oktatáson ismerkedjenek meg a GeneMapper® ID-X szoftver megfelelő üzemeltetésével. Megjegyzés: Az itt említett panel és bin sorozatok kompatibilisek a GeneMapper® ID-X szoftver korábbi verzióival is. Első lépések 1.

A PowerPlex® ESX 17 rendszerhez a megfelelő panel, bin és stutter fájlok letölthetők az alábbi webhelyről: www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/

2.

Adja meg kapcsolati információit, és válassza a „GeneMapper ID-X” opciót. Válassza a „Submit” opciót.

3.

Mentse a PowerPlex_ESX_Panels_IDX_vX.x.txt, PowerPlex_ESX_Bins_IDX_vX.x.txt és a PowerPlex_ESX_Stutter_IDX_vX.x.txt fájlokat (az „X.x” a panel és bin fájlok legutóbbi verzióira vonatkozik) a számítógépére, és jegyezze meg a fájlok helyét.

A panel, bin és stutter fájlok importálása 1.

Nyissa meg a GeneMapper® ID-X szoftvert.

2.

Válassza a „Tools”, majd a „Panel Manager” opciót.

3.

Jelölje ki a „Panel Manager” ikont a bal felső navigációs panelen.

4.

Válassza a „File”, majd az „Import Panels” opciót.

5.

Lépjen az Első lépések részben letöltött panel fájlhoz. Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót.

6.

A navigácós panelen jelölje ki azt a PowerPlex ESX mappát, melyet az imént importált az 5-ös lépésben.



6.A. PowerPlex® ESX Panel, Bin és Stutter sorozatok GeneMapper® ID-X 1.2 verziójú szoftverrel (folytatás) 7.

Válassza a „File”, majd az „Import Bin Set” opciót.

8.

Lépjen az Első lépések részben letöltött bin fájlhoz. Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót.

9.

A navigációs panelen jelölje ki azt a PowerPlex ESX panels mappát, melyet az imént importált az 5-ös lépésben.

10. Válassza a „File”, majd az „Import Marker Stutter” opciót. Egy figyelmeztető ablak jelenik meg azzal a kérdéssel, hogy felül akarja-e írni a jelenlegi értékeket. Válassza a „Yes” lehetőséget. 11. Lépjen az Első lépések részben letöltött stutter fájlhoz. Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót. 12. A „Panel Manager" ablak alján klikkeljen az „OK”-ra. Ezzel elmenti a panel, bin és stutter fájlokat, és bezárja az ablakot 6.B. Méretstandard létrehozása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverrel A méretstandard létrehozása során két opció választható. Használja ezt a protokollt vagy a 6.C. részben leírt alternatív protokollt. 1.

Válassza a „Tools”, majd a „GeneMapper ID-X Manager” opciót.

2.

Válassza a „Size Standard” fület.

3.

Válassza a „New” opciót.

4.

A „Size Standard Editor” ablakban (12. ábra) válassza ki a „GeneMapper ID-X Security Group” lehetőséget a biztonsági csoportként. Ez lehetővé teszi a hozzáférést a szoftver minden felhasználója számára. Használhat más biztonsági csoportokat is.

5.

Adjon meg egy részletes nevet, mint például: „CC5_ILS_500_IDX”.

6.

A méret standard festék színének válassza a narancssárgát.

7.

Adja meg a belső standard fragmentumok méreteit (60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 és 500 bázis).

8.

Kattintson az „OK”-ra.



8257TA

12. ábra. A GeneMapper® ID-X „Size Standard Editor”.



6.C. A CC5 ILS 500 IDX méretstandard importálása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverbe A CC5_ILS_500_IDX.xml fájl letölthető a következő weboldalról: www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/ Mentse a CC5_ILS_500_IDX.xml fájlt a számítógépére, és jegyezze meg a fájl helyét. 1.


2.


3.

Válassza az „Import” opciót.

4.

Lépjen a saját számítógépén a CC5_ILS_500_IDX.xml fájlhoz.

5.

Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót.

6.

Válassza a „Done” opciót a változtatások mentéséhez és a GeneMapper ID-X Manager bezárásához.

6.D. Esettanulmány analízis módszer létrehozása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverrel Ezen utasítások iránymutatóként szolgálnak a GeneMapper® ID-X szoftverrel történő adatelemzés elkezdéséhez. Nem szolgálnak teljes körű útmutatóként a GeneMapper® ID-X szoftver használatához. Javasoljuk, hogy a felhasználók lépjenek kapcsolatba az Applied Biosystems képviseletével a szoftver megfelelő üzemeltetésével kapcsolatos oktatás érdekében. 1.


2.

Válassza az „Analysis Methods” fület.

3.

Válassza a „New” opciót, ezzel megnyitva egy új analízis módszer dialógus ablakot.

4.

Az „Analyis Method Editor" ablakban válassza ki a „GeneMapper ID-X Security Group” lehetőséget a biztonsági csoportként. Ez lehetővé teszi a hozzáférést a szoftver minden felhasználója számára. Használhat más biztonsági csoportokat is.

5.

Adjon meg egy jellemző nevet az analízis módszernek, mint például: „PowerPlexESX 17”.

6.

Válassza az „Allele” fület (13. ábra).

7.

Válassza ki a 6.A. részben importált bin fájlt.

8.

A „Use marker-specific stutter ratio if available” („Használja a markerspecifikus stutter arányt, ha rendelkezésre áll”) jelölőnégyzetet pipálja ki.



Javasoljuk, hogy a 13. ábrán bemutatott értékeket használja a stutter csúcsok megfelelő szűréséhez a PowerPlex® ESX 17 rendszer használata során. Szükség lehet ezen beállítások optimalizálására. Belső validációt kell végrehajtania.

8258TA

9.

13. ábra. A GeneMapper® ID-X „Allele” fül. Válassza ki a 6.A. részben importált bin fájlt.

10. Válassza a „Peak Detector” fület. A 14. ábra egy, a Promegánál használt példát mutat be a beállításokra. Szükség lehet ezen beállítások optimalizálására. Belső validációt kell végrehajtania. Megjegyzés: 1.

AAz analízis tartományaként választható teljes (full range) vagy a részleges (partial range) tartomány. Részleges tartomány használata esetén válasszon a saját adatain alapuló, megfelelő tartományt. A belső standard megfelelő méretkalibrációjához a kezdőpontot a primer csúcs után, illetve az első definiált belső méretstandard csúcs után adja meg.



6.D. Esettanulmány analízis módszer létrehozása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverrel (folytatás) A csúcsmagasság határértéke az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértéke általában 50-150 RFU között változik az ABI PRISM® 310, 3100 és 3100-Avant Genetic Analyzer, valamint az Applied Biosystems 3130 és 3130xl Genetic Analyzer készülékeken generált adatok esetében. A 2.-hoz: A csúcsmagasság határértéke az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértéke általában 50-150 RFU között változik az ABI PRISM® 310, 3100 és 3100-Avant Genetic Analyzer, valamint az Applied Biosystems 3130 és 3130xl Genetic Analyzer készülékeken generált adatok esetében. Az Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékekhez a Life Technologies 175 RFU analízis határértéket javasol az alapértelmezett injektálási körülmények használata esetére. A laboratóriumoknak azonban belső validációs vizsgálataik alapján kell meghatározniuk a csúcsmagasság határértékeit. A CC5 ILS 500 használata esetén a csúcsmagasságok általában kisebbek, mint más festékek esetén. Ezért a narancssárga festékre vonatkozó határérték alacsonyabb lehet, mint más festékek esetén.

3.

A normalizáció jelölőnégyzetet ki lehet pipálni függetlenül attól, hogy az adatgyűjtés során alkalmaztak-e normalizációt.

8259TA

2.

14. ábra. A GeneMapper® ID-X „Peak Detector" fül.



11. Válassza a „Peak Quality” fület. Itt a csúcs minőségével kapcsolatos beállítások változtathatók meg. Megjegyzés: A 11. és 12. lépésekkel kapcsolatos további információkat a GeneMapper® ID-X felhasználói kézikönyvében találhat 12. Válassza az „SQ & GQ Settings” fület. Ezek a beállítások megváltoztathatóak. 13

Válassza a „Save” parancsot az új analízis módszer mentéséhez.

14. Válassza a „Done” opciót a GeneMapper ID-X Manager-ből történő kilépéshez. Adatok feldolgozása az esettanulmány mintákhoz 1.

Válassza a „File”, majd a „New Project” opciót.

2.

Válassza az „Edit”, majd az „Add Samples to Project” opciót.

3.

Keresse meg a futtatási fájlokat. Jelölje ki a kívánt fájlokat, majd válassza az „Add to list”, azután pedig az „Add” parancsokat.

4.

A „Sample Type" oszlopban a legördülő menüből válassza ki az „Allelic Ladder”, „Sample”, „Positive Control” vagy a „Negative Control” opciót a mintának megfelelően. A megfelelő genotipizáláshoz a projektben minden mappának tartalmaznia kell legalább egy allélikus létra injektálást, mely a „Sample Type” oszlopban „Allelic Ladder”-ként szerepel.

5.

Az „Analysis Method” oszlopban válassza ki az ebben a részben előzőleg létrehozott analízis módszert.

6.

A „Panel” oszlopban válassza ki a 6.A. részben importált panel fájlt.

7.

A „Size Standard” oszlopban válassza ki a 6.B. részben létrehozott vagy a 6.C. részben importált méretstandardot.

8.

Ha ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer készülékről származó adatot analizál, a „Matrix” oszlopban válassza ki a megfelelő mátrix fájlt.

9.

Válassza az „Analyze” opciót (zöld nyíl gomb) az adatanalízis elindításához. Megjegyzés: Az alapértelmezés szerint a szoftver megjeleníti az „Analysis Requirement Summary”, az „Allelic Ladder Analysis Summary” és az „Analysis Summary” ablakokat a szoftver által végzett minőség vizsgálat után. Amint az egyes ablakok megnyílnak, biztosítsa, hogy minden feltétel teljesüljön. Ha az „Analysis Requirement Summary” ablak nem aktivált, szükség lehet további manuális hibaelhárításra.

10. Ha az analízis összes feltétele teljesül, megnyílik a „Save Project” ablak (15. ábra).



6.D. Esettanulmány analízis módszer létrehozása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverrel (folytatás) 11. Adja meg a feladat nevét.

9430TA

12. A legördülő menüből válassza ki az alkalmazandó biztonsági csoportot, majd klikkeljen az „OK”-ra.

15. ábra. A „Save Project" ablak.

Amikor az analízis befejeződik, megjelenik az „Analysis Summary” képernyő. Javasolt a grafikon nézetben a sárga és piros marker fejléc mezők áttekintése, és azok megfelelő kezelése a laboratóriumi standard üzemeltetési eljárások szerint. Lépjen a „Genotype” vagy a „Samples” fülhöz. A gyenge minőségű minták vizsgálatának elősegítése érdekében, használja a „Data Interpretation” grafikon beállításokat és a tartalmat tekintse át a „Quality Value Details” táblázatban. Az „Analysis Method Peak Quality” és az „SQ & GQ Settings” füleken megjelenített értékek alapértelmezett értékek, és befolyásolják a grafikon beállításokban megjelenített minőség értékeket. Ajánlott az ezeken a füleken megjelenített értékek módosítása a saját laboratóriumi adatanalízis protokolloknak megfelelően. 6.E. Adatbázis vagy apasági analízis módszer létrehozása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverrel Ezen utasítások iránymutatóként szolgálnak a GeneMapper® ID-X szoftverrel történő adatanalízis elkezdéséhez. Nem szolgálnak teljes körű útmutatóként a GeneMapper® ID-X szoftver használatához. Javasoljuk, hogy a felhasználók lépjenek kapcsolatba az Applied Biosystems képviseletével a szoftver megfelelő üzemeltetésével kapcsolatos oktatás érdekében. 1.


2.

Válassza az „Analysis Methods” fület

3.


4.

Az „Analyis Method Editor” ablakban válassza ki a „GeneMapper ID-X Security Group” lehetőséget a biztonsági csoportként. Ez lehetővé teszi a hozzáférést a szoftver minden felhasználója számára. Használhat más biztonsági csoportokat is.



Adjon meg egy jellemző nevet az analízis módszernek, mint például: „PowerPlexESX 17 20% Filter”.

6.


7.

Válassza ki a 6.A. részben importált bin fájlt.

8.

Javasoljuk, hogy a 16. ábrán bemutatott értékeket használja a stutter csúcsok megfelelő szűréséhez a PowerPlex® ESX 17 rendszer használata során. Szükség lehet ezen beállítások optimalizálására. Belső validációt kell végrehajtania.

8259TA

5.

16. ábra. A GeneMapper® ID-X „Allele” fül. Válassza ki a 6.A. részben importált bin fájlt.

9.

Válassza a „Peak Detector” fület. A 14. ábra egy, a Promegánál használt példát mutat be a beállításokra. Szükség lehet ezen beállítások optimalizálására. Belső validációt kell végrehajtania. Megjegyzés: 1.

Az analízis tartományaként választható teljes (full range) vagy a részleges (partial range) tartomány. Részleges tartomány használata esetén válasszon a saját adatain alapuló, megfelelő tartományt. A belső standard megfelelő méretkalibrációjához a kezdőpontot a primer csúcs után, illetve az első definiált belső méretstandard csúcs után adja meg.



6.E. Adatbázis vagy apasági analízis módszer létrehozása az 1.2 verziójú GeneMapper® ID-X szoftverrel (folytatás) 2.

3.

A csúcsmagasság határértéke az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértéke általában 50-150 RFU között változik az ABI PRISM® 310, 3100 és 3100-Avant Genetic Analyzer, valamint az Applied Biosystems 3130 és 3130xl Genetic Analyzer készülékeken. Az Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékekhez a Life Technologies 175 RFU analízis határértéket javasol az alapértelmezett injektálási körülmények használata esetére. A laboratóriumoknak azonban belső validációs vizsgálataik alapján kell meghatározniuk a csúcsmagasság határértékeit. A CC5 ILS 500 használata esetén a csúcsmagasságok általában kisebbek, mint más festékek esetén. Ezért a narancssárga festékre vonatkozó határérték alacsonyabb lehet, mint más festékek esetén. A normalizáció jelölőnégyzetet ki lehet pipálni függetlenül attól, hogy az adatgyűjtés során alkalmaztak-e normalizációt.

10. Válassza a „Peak Quality” fület. Itt a csúcs minőségével kapcsolatos beállítások változtathatók meg. Megjegyzés: A 10. és 11. lépésekkel kapcsolatos további információkat a GeneMapper® ID-X felhasználói kézikönyvében találhat. 11. Válassza az „SQ & GQ Settings” fület. Ezek a beállítások megváltoztathatóak. 12. Válassza a „Save” parancsot az új analízis módszer mentéséhez. 13. Válassza a „Done” opciót a GeneMapper ID-X Manager-ből történő kilépéshez. Adatok feldolgozása az adatbázis vagy apasági mintákhoz 1.


2.


3.

Keresse meg a futtatási fájlok helyét. Jelölje ki a kívánt fájlokat, majd válassza az „Add to list”, azután pedig az „Add” parancsokat.

4.

A „Sample Type” oszlopban a legördülő menüből válassza ki az „Allelic Ladder”, „Sample”, „Positive Control” vagy a „Negative Control” opciót a mintának megfelelően. A megfelelő genotipizáláshoz a projektben minden mappának tartalmaznia kell legalább egy allélikus létra injektálást, mely a „Sample Type” oszlopban „Allelic Ladder”-ként szerepel. Az „Analysis Method’ oszlopban válassza ki az ebben a részben előzőleg létrehozott analízis módszert

5.

A „Panel” oszlopban válassza ki a 6.A. részben importált panel fájlt.

6.

A „Size Standard” oszlopban válassza ki a 6.B. részben létrehozott vagy a 6.C. részben importált méretstandardot.



7.


8.

Válassza az „Analyze” opciót (zöld nyíl gomb) az adatanalízis elindításához. Megjegyzés: Az alapértelmezés szerint a szoftver megjeleníti az „Analysis Requirement Summary”, az „Allelic Ladder Analysis Summary” és az „Analysis Summary” ablakokat a szoftver által végzett minőség vizsgálat után. Amint az egyes ablakok megnyílnak, biztosítsa, hogy minden feltétel teljesüljön. Ha az „Analysis Requirement Summary” ablak nem aktivált, szükség lehet további manuális hibaelhárításra.

9.

Ha az analízis összes feltétele teljesül, megnyílik a „Save Project” ablak (15. ábra).

10. Adja meg a feladat nevét. 11. A legördülő menüből válassza ki az alkalmazandó biztonsági csoportot, majd klikkeljen az „OK”-ra. Amikor az analízis befejeződik, megjelenik az „Analysis Summary” képernyő. Javasolt a grafikon nézetben a sárga és piros marker fejléc mezők áttekintése, és azok megfelelő kezelése a laboratóriumi standard üzemeltetési eljárások szerint. Lépjen a „Genotype” vagy a „Samples” fülhöz. A gyenge minőségű minták vizsgálatának elősegítése érdekében használja az alapértelmezett „Data Interpretation” grafikon beállításokat, és a tartalmat tekintse át a Quality „Value Details” táblázatban. Az „Analysis Method Peak Quality” és az „SQ & GQ Settings” füleken megjelenített értékek alapértelmezett értékek, és befolyásolják a grafikon beállításokban megjelenített minőség értékeket. Ajánlott az ezeken a füleken megjelenített értékek módosítása a saját laboratóriumi adatanalízis protokolloknak megfelelően. 6.F. PowerPlex® ESX Panel és Bin Setek GeneMapper® ID 3.2-es verziójú szoftverrel A PowerPlex® ESX 17 rendszerrel generált adatok analízésének megkönnyítése érdekében létrehoztunk panel és bin fájlokat, lehetővé téve a genotípusok automatikus hozzárendelését a 3.2-es verzójú GeneMapper® ID szoftver használatával. Javasoljuk a 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftver használóinak, hogy az Applied Biosystems GeneMapper® ID Software „Human Identification Analysis Tutorial” oktatóanyag segítségével ismerkedjenek meg a szoftver helyes használatával. A 3.1 verziójú GeneMapper® ID szofver használóinak javasoljuk, hogy frissítsék szoftverüket a 3.2 verziószámúra. A 3.2 verzójú GeneMapper® ID szoftver használatával történő analízishez szüksége lesz a megfelelő panel és bin fájlokra. A PowerPlex_ESX_Panels_vX.x.txt és a PowerPlex_ESX_Bins_vX.x.txt fájlok, ahol az „X.x” a panel és bin fájlok legújabb verzójára utal.



6.F. PowerPlex® ESX Panel és Bin Setek GeneMapper® ID 3.2-es verziójú szoftverrel (folytatás) Első lépések 1.

A PowerPlex® ESX 17 rendszerhez szükséges panel és bin fájlok az alábbi címen tölthetők le: www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/

2.

Adja meg kapcsolati információit, és válassza a „GeneMapper ID version 3.2” opciót. Válassza a „Submit” opciót.

3.

A PowerPlex_ESX_Panels_vX.x.txt és a PowerPlex_ESX_Bins_vX.x.txt fájlokat mentse a számítógépére, és jegyezze meg a fájlok helyét.

A panel és bin fájlok betöltése Ezek az utasítások nagyvonalakban az Applied Biosystems GeneMapper® ID szoftver oktatóanyagot követik (1–4. oldal). 1.

Nyissa meg a 3.2. verziójú GeneMapper® ID szoftvert.

2.

Válassza a „Tools”, majd a „Panel Manager” opciót.

3.

Jelölje ki a „Panel Manager” ikont a bal felső navigációs panelen.

4.

Válassza a „File”, majd az „Import Panels” opciót.

5.

Lépjen az Első lépesek részben letöltött panel fájlhoz. Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót.

6.

A navigációs panelen jelölje ki azt a PowerPlex ESX panels mappát, melyet az imént importált az 5. lépésben.

7.

Válassza a „File”, majd az „Import Bin Set” opciót.

8.

Lépjen az Első lépesek részben letöltött panel fájlhoz. Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót.

9.

A „Panel Manager” ablak alján klikkeljen az „OK”-ra. A „Panel Manager” ablak automatikusan bezáródik.

6.G. Méretstandard létrehozása az 3,2 verziójú GeneMapper® ID szoftverrel A méretstandard létrehozása során két opció választható. Használja ezt a protokollt vagy a 6.H. részben leírt alternatív protokollt. 1.

Válassza a „Tools”, majd a „GeneMapper Manager” opciót.

2.


3.

Válassza a „New” opciót.

4.

Válassza a „Basic or Advanced” opciót. (17. ábra) A kiválasztott analízis módszer típusának meg kell felelnie a korábban létrehozott analízis módszer típusának. Klikkeljen az „OK”-ra.



5725TA

17. ábra. A „Select Dye and Analysis Method” ablak.

A „Size Standard Editor”-ban adjon meg egy részletes elnevezést, mint például: „CC5 ILS 500 advanced” (18. ábra).

6.

Válassza ki a narancssárgát a méretstandard festék színeként.

7.

Adja meg a belső standard fragmentek méreteit: (60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 és 500 bázis).

8.

Klikkeljen az „OK”-ra.

8199TA

5.

18. ábra. A „Size Standard Editor”.



6.H. A CC5 ILS 500 méretstandard importálása a 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftverbe A CC5_ILS_500.xml fájl letölthető a www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/ webhelyről: Mentse a CC5_ILS_500_IDX.xml fájlt a számítógépére, és jegyezze meg a fájl helyét. 1.


2.


3.

Válassza az „Import” opciót.

4.

Keresse meg a CC5_ILS_500.xml fájlt.

5.

Jelölje ki a fájlt, majd válassza az „Import” opciót.

6.

A változtatások mentéséhez és a „GeneMapper Manager”-ből történő kilépéshez válassza a „Done” opciót.

6.I. Esettanulmány analízis módszer létrehozása a 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftverrel Ezek az utasítások nagyvonalakban az Applied Biosystems GeneMapper® ID szoftver oktatóanyagát követik (5 – 11 oldal). 1.


2.


3.


4.

Válassza az „HID” opciót, majd klikkeljen az „OK”-ra. Megjegyzés: Amennyiben nem látja a HID opciót, Ön nem rendelkezik a GeneMapper® ID szoftverrel. Lépjen kapcsolatba az Applied Biosystems képviseletével

5.

Adjon meg egy jellemző nevet az analízis módszernek, mint például: „PowerPlexESX 17”.

6.


7.

Válassza ki a 6.F. részben importált bin fájlt.



8123TA

19. ábra. A GeneMapper® ID „Allele” fül Válassza ki a 6.F. részben importált bin fájlt.

8.


9.

Adja meg a 19. ábrán bemutatott értékeket a stutter csúcsok megfelelő szűréséhez a PowerPlex® ESX 17 rendszer használata során. Ezen beállítások helyes használatával és hatásaival kapcsolatos magyarázatot megtalálja az Applied Biosystems „Installation Procedures and New Features for GeneMapper ID Software 3.2” („Eljárások és új jellemzők telepítése a 3.2 verziójú GeneMapper ID szoftverhez”) című felhasználói bulletinjában. Megjegyzés: Ezen beállítások közül néhányat optimalizáltunk, és eltérnek a felhasználói bulletinben javasolt beállításoktól

10. Válassza a „Peak Detector” fület. A 20. ábrán bemutatott beállítások használatát javasoljuk. Megjegyzés: 1. Az analízis tartományaként választható teljes (full range) vagy a részleges (partial range) tartomány. Részleges tartomány használata esetén válasszon a saját adatain alapuló, megfelelő tartományt. A belső standard megfelelő méretkalibrációjához a kezdőpontot a primer csúcs után, illetve az első definiált belső méretstandard csúcs után adja meg.



6.I. Esettanulmány analízis módszer létrehozása a 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftverrel (folytatás) A csúcsmagasság határértéke az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértékek általában 50-150 RFU között változnak, és a laboratóriumoknak maguknak kell meghatározniuk. A CC5 ILS 500 használata esetén a csúcsmagasságok általában kisebbek, mint más festékek esetén. Ezért a narancssárga festékre vonatkozó határérték alacsonyabb lehet, mint más festékek esetén.

8187TA

2.

20. ábra. A GeneMapper® ID „Peak Detector” fül.

11. Válassza a „Peak Quality” fület. Itt a csúcs minőségével kapcsolatos beállítások változtathatók meg. Megjegyzés: A 11. és 12. lépésekkel kapcsolatos további információkat a GeneMapper® ID felhasználói kézikönyvében találhat. 12. Válassza a „Quality Flags” fület. Ezek a beállítások megváltoztathatóak. 13. A beállítások mentéséhez klikkeljen az „OK”-ra.



Adatok feldolgozása az esettanulmány mintákhoz 1.


2.


3.


4.

A „Sample Type” oszlopban a legördülő menüből válassza ki az „Ladder”, „Sample”, „Positive Control” vagy a „Negative Control” opciót a mintának megfelelően. A megfelelő genotipizáláshoz a projektben minden mappának tartalmaznia kell legalább egy allélikus létra injektálást, mely a „Sample Type” oszlopban „Ladder”-ként szerepel.

5.


6.

A „Panel” oszlopban válassza ki a 6.F. részben importált panel fájlt.

7.

A „Size Standard” oszlopban válassza ki a 6.G. részben létrehozott vagy a 6.H. részben importált méretstandardot.

8.


9.

Válassza az „Analyze” opciót (zöld nyíl gomb) az adatanalízis elindításához.

6.J. Adatbázis vagy apasági analízis módszer létrehozása 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftverrel 1.


2.


3.


4.

Válassza az „HID” opciót, majd klikkeljen az „OK”-ra. Megjegyzés: Amennyiben nem látja a HID opciót, Ön nem rendelkezik a GeneMapper® ID szoftverrel. Lépjen kapcsolatba az Applied Biosystems képviseletével.

5.

Adjon meg egy jellemző nevet az analízis módszernek, mint például: „PowerPlexESX 17_20%filter”.

6.


7.

Válassza ki a 6.F. részben importált bin fájlt.

8.




8188TA

6.J. Adatbázis vagy apasági analízis módszer létrehozása 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftverrel (folytatás)

21. ábra. A GeneMapper® ID „Allele” fül Válassza ki a 6.F. részben importált bin fájlt.

9.

Adja meg a 21. ábrán bemutatott értékeket a stutter csúcsok megfelelő szűréséhez a PowerPlex® ESX 17 rendszer használata során. Ezen beállítások helyes használatával és hatásaival kapcsolatos magyarázatot megtalálja az Applied Biosystems „Installation Procedures and New Features for GeneMapper ID Software 3.2” („Eljárások és új jellemzők telepítése a 3.2 verziójú GeneMapper ID szoftverhez”) című felhasználói bulletinjában.l

10. Válassza a „Peak Detector” fület. A 20. ábrán bemutatott beállítások használatát javasoljuk. Megjegyzés: 1. Az analízis tartományaként választható teljes (full range) vagy a részleges (partial range) tartomány. Részleges tartomány használata esetén válasszon a saját adatain alapuló, megfelelő tartományt. A belső standard megfelelő méretkalibrációjához a kezdőpontot a primer csúcs után, illetve az első definiált belső méretstandard csúcs után adja meg. 2. A csúcsmagasság határértéke az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértékek általában 50-150 RFU között változnak, és a laboratóriumoknak maguknak kell meghatározniuk. A CC5 ILS 500 használata esetén a csúcsmagasságok általában kisebbek, mint más festékek esetén. Ezért a narancssárga festékre vonatkozó határérték alacsonyabb lehet, mint más festékek esetén. Promega Corporation· 2800 Woods Hollow Road· Madison, WI 53711-5399 USA· Ingyenes telefonszám az Egyesült Államokban: 800-356-9526· Tel: +1 608-274-4330· Fax: +1 608-277-2516· www.promega.com Part# TMD024 Oldal 38

Nyomtatva az Egyesült Államokban. 2009. augusztus

11. Válassza a „Peak Quality” fület. Itt a csúcs minőségével kapcsolatos beállítások változtathatók meg. Megjegyzés: A 11. és 12. lépésekkel kapcsolatos további információkat a GeneMapper® ID felhasználói kézikönyvében találhat. 12. Válassza a „Quality Flags” fület. Ezek a beállítások megváltoztathatóak. 13. A beállítások mentéséhez klikkeljen az „OK”-ra. Adatfeldolgozás adatbázis vagy apasági mintákhoz 1.


2.


3.


4.

A „Sample Type” oszlopban a legördülő menüből válassza ki az „Ladder”, „Sample”, „Positive Control” vagy a „Negative Control” opciót a mintának megfelelően. A megfelelő genotipizáláshoz a projektben minden mappának tartalmaznia kell legalább egy allélikus létra injektálást, mely a „Sample Type” oszlopban „Ladder”-ként szerepel.

5.


6.

A „Panel” oszlopban válassza ki a 6.F. részben importált panel fájlt.

7.

A „Size Standard” oszlopban válassza ki a 6.G. részben létrehozott vagy a 6.H. részben importált méretstandardot.

8.


9.

Válassza az „Analyze” opciót (zöld nyíl gomb) az adatanalízis elindításához.

Promega Corporation· 2800 Woods Hollow Road· Madison, WI 53711-5399 USA· Ingyenes telefonszám az Egyesült Államokban: 800-356-9526· Tel: +1 608-274-4330· Fax: +1 608-277-2516· www.promega.com Nyomtatva az Egyesült Államokban. 2009. augusztus


6.K. Minta analízis GeneScan® szoftverrel PC operációs rendszerek esetén Nyissa meg a GeneScan® analízis szoftvert.

2.

Ellenőrizze egy vagy több mintafutás nyers adatait. Jelölje ki a minta fájl nevét, majd a Sample menüben válassza a „raw data” opciót. Helyezze úgy a kurzort, hogy a kereszt az alapvonalon, a nagy primer csúcstól jobbra helyezkedjen el (az első belső standard csúcs [narancssárga] előtt). Start pozícióként az ablak bal alsó részén megjelenő X értéket adja meg az analízis paraméterek között.

3.

A javasolt analízis paraméterek a 22. ábrán láthatóak. A csúcsmagasság határérték az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértéke általában 50-150 RFU között változik és laboratóriumonként eltérő. A CC5 festék csúcsmagasság határértékeként vegyen 50 RFU-t(nem látható az ábrán).

8200TA

1.

22. ábra. Az „Analysis Parameters” ablak. Az analízistartomány start pontjának - mely változhat - meghatározását a 6.K rész 2. lépése ismerteti.



4.

Az analízis paraméterek elmenthetőek a Params mappába; a legtöbb esetben ennek helye: C:\AppliedBio\Shared\Analysis\Sizecaller\Params

5.

Alkalmazza a tárolt analízis paramétereket a mintákra.

6.

Rendeljen hozzá új méret standardot. Válasszon ki egy minta fájlt és jelölje ki a méret standard mellett lévő nyilat. Kattintson a „define new” pontra. Rendeljen hozzá méret standardot 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 és 500 bázis. Mentse a méret standardot a Size Standards mappába: C:\AppliedBio\Shared\Analysis\Sizecaller\SizeStandards

7.

Alkalmazza a méret standardot a mintákra, majd analizálja a minta fájlokat. A PowerTyper™ ESX 17 makró és a Genotyper® szoftver használatával kapcsolatos további információ a 6.M részben található.

Megjegyzés: 1.

A készülék lineáris tartományán kívül eső csúcs magasságok műtermék csúcsokat generálhatnak a készülék szaturációja miatt (pl. túlzott mennyiségű minta bevitele esetén). Előfordulhat egyik színből a másikba történő átmosódás (pull-up). A telített jel kettős csúcs formájában is megjelenhet (osztott csúcs).

2.

Ha a csúcsmagasság nem esik a készülék lineáris érzékelési tartományába, a stutter csúcsok és a tényleges allél csúcsok magasságának aránya megnőhet, megnehezítve az allélek meghatározását. A csúcsmagasságok közötti egyensúly is kevésbé lehet egyöntetű.

3.

A készülékek között eltérés mutatkozhat az azonos mintákra vonatkozó relatív fluoreszcencia értékekre vonatkozóan. A különböző készülékek továbbá eltérnek a színérzékelés relatív hatékonyságában, mely befolyásolja a festék- színegyensúlyt.



6.L. Minta analízis GeneScan® szoftverrel és Macintosh® operációs rendszerek esetén 1.

Nyissa meg a GeneScan® analízis szoftvert.

2.

Ellenőrizze egy vagy több mintafutás nyers adatait. Jelölje ki a minta fájl nevét, majd a Sample menüben válassza a „raw data” opciót. Helyezze úgy a kurzort, hogy a kereszt az alapvonalon, a nagy primer csúcstól jobbra helyezkedjen el (az első belső standard csúcs [narancssárga] előtt). Start pozícióként az ablak bal alsó részén megjelenő X értéket adja meg az analízis paraméterek között.

3.

A javasolt analízis paraméterek: Analysis Range Data Processing

Peak Detection

Size Call Range Size Calling Method Split Peak Correction

Start: Defined in Step 2 Stop: 10000 Baseline: Checked Multicomponent: Checked Smooth Options: Light1 Peak Amplitude Thresholds2: B: 50 Y: 50 G: 50 R: 50 O: 50 Min. Peak Half Width: 2pts Min: 60 Max: 500 Local Southern Method None

1A

simítási opciókat (smooth options) a laboratóriumoknak egyénileg kell meghatározni. 2A csúcsmagasság határérték az a minimális csúcsmagasság, melyet a szoftver még csúcsként fogad el. A csúcsmagasság határértéke általában 50-150 RFU között változik és laboratóriumonként eltérő. A CC5 festék csúcsmagasság határértéket (Peak Amplitude Threshold) 50 RFU-ra állítsa be.

4.

Az analízis paraméterek a Params mappába menthetőek.

5.

Alkalmazza a tárolt analízis paramétereket a mintákra.

6.

Rendeljen hozzá új méret standardot. Válasszon ki egy minta fájlt, jelölje ki a méret standard mellett lévő nyilat, majd válassza a „define new” opciót. Rendeljen hozzá méret standardot 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 és 500 bázis. Mentse a méret standardot a Size Standards mappába.

7.

Alkalmazza a méret standardot a mintákra, majd analizálja a minta fájlokat. A PowerTyper™ ESX 17 makró és a Genotyper® szoftver használatával kapcsolatos további információ a 6.M részben található. A GeneScan® analízis szoftverrel kapcsolatos további információ a GeneScan® analízis szoftver felhasználói kézikönyvében található.



Megjegyzés: 1. A készülék lineáris tartományán kívül eső csúcs magasságok műtermék csúcsokat generálhatnak a készülék telítődése (szaturációja) miatt (azaz túlzott mennyiségű minta belvitele miatt). Előfordulhat egyik színből a másikba történő átmosódás (pull-up). A telített jel kettős csúcs formájában is megjelenhet (osztott csúcs). 2. Ha a csúcsmagasság nem esik a készülék lineáris érzékelési tartományába, a stutter csúcsok és a tényleges allél csúcsok magasságának aránya megnőhet, megnehezítve az allélek meghatározását. A csúcsmagasságok közötti egyensúly is kevésbé lehet egyöntetű. 3. A készülékek között eltérés mutatkozhat az azonos mintákra vonatkozó relatív fluoreszcencia értékekre vonatkozóan. A különböző készülékek továbbá eltérnek a színérzékelés relatív hatékonyságában, mely befolyásolja a festék- színegyensúlyt. 6.M. Minta analízis a Genotyper® szoftver és a PowerTyper™ ESX 17 makró segítségével A PowerPlex® ESX 17 rendszer által generált adatoknak a Genotyper ® szoftverrel történő analíziséhez és a genotípusok automatikus meghatározásához létrehoztuk az ehhez szükséges fájlt. A minták amplifikációját, az ABI PRISM® 310 vagy 3100 Genetic Analyzer készülékkel történő detektálását és a GeneScan® analízis szoftverrel történő analízisét követően a minta fájlok a Genotyper ® programba importálva a PowerTyper™ ESX 17 makró segítségével analizálhatóak. A PowerTyper™ ESX makró fájlok az alábbi címről tölthetőek le: www.promega.com/geneticidtools/powertyper/ A PowerTyper™ ESX 17 makró a 2.5 verziójú Macintosh® Genotyper ® szoftverrel, és a 3.6 vagy későbbi verziójú Windows NT® Genotyper® szoftverrel együtt használható. A Genotyper ® szoftvert telepíteni kell a számítógépre a PowerTyper™ ESX 17 használata előtt. Ellenőrizze, hogy a Sample Info (Macintosh® számítógépek) vagy a Color Info (Windows NT® operációs rendszerek) oszlop minden egyes, allél létra marker sornál a „ladder” szót tartalmazza. A makró a „ladder” szó alapján azonosítja az allél létra markert tartalmazó minta fájl(oka)t. Az PowerTyper™ ESX 17 makróba történő importálás után is hozzáadható vagy módosítható a mintával kapcsolatos információ. Ehhez jelölje ki a mintát, majd válassza a „show dye/lanes window” pontot a Views menüben. 1.

Vigye át a PowerTyper_ESX_17 makró fájlt számítógépe merevlemezén a kívánt helyre.

2.

Nyissa meg a Genotyper ® szoftvert, majd a PowerTyper_ESX_17 makró fájlt. A Genotyper ® szoftverrel kapcsolatos további információ a Genotyper ® analízis szoftver felhasználói kézikönyvében található.



6.M. Minta analízis a Genotyper® szoftver és a PowerTyper™ ESX 17 makró segítségével (folytatás) 3.

A File menüben válassza az „Import” opciót, majd importálja a GeneScan® projektet vagy az analizálandó minta fájlokat. Importálja a fluoreszcein, JOE, TMR-ET, CXR-ET és CC5 festékeket. Megjegyzés: Az importálni kívánt festék színek kiválasztása az Edit menü „Set Preferences” pontjában lehetséges.

4.

Kattintson duplán a Check ILS makró pontra. A makrók felsorolása az aktív ablak bal alsó sarkában található. Megjelenik egy plot ablak, mely a belső standardot (CC5 ILS 500) mutatja a CC5 (narancssárga) csatornában. Gördítse le az ablakot és ellenőrizze, hogy a belső standard fragmentum méretei helyesek. Szükség esetén ismételje meg a minták analízisét a GeneScan® szoftverrel és ismételten definiálja a belső standard fragmentumok méretét. Megjegyzés:

5.

1.

A szoftver egy allél létra marker mintát használ az allél méretek meghatározásához. A makro az első importált létra mintát használja az allélek meghatározásához.

2.

A Genotyper® szoftver Macintosh® változata megjeleníti a belső standard fragmentum méreteit. Viszont az elektroferogram nyers adatait jeleníti meg az analizált adatok helyett.

Eseti minta analízisénél kattintson duplán a POWER makróra. A POWER makró azonosítja az alléleket a létra mintában és minden lókuszhoz kiszámítja az eltolódást értéket. Ez az eljárás több percet is igénybe vehet. A folyamat befejezése után megjelenik egy, az allél létrákat (pl., D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 és Amelogenin) tartalmazó plot ablak. Adatbázis vagy apasági analízishez kattintson duplán a POWER 20% Filter makróra. Ez a makró magasabb szintű filter funkciót tartalmaz, mint a normál POWER makró, így kisebb szükség van a csúcs címkék manuális kijavítására. A POWER 20% Filter nem használható, ha keverékek is előfordulhatnak a minták között.

6.

Kattintson duplán az Allelic Ladders makróra. Megjelenik egy, a fluoreszcein allél létrákat (pl. D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 és Amelogenin), JOE allél létrákat (pl. D16S539, D2S1338, D1S1656 és D10S1248), TMR-ET allél létrákat (pl. FGA, D8S1179, vWA és D22S1045) és CXR-ET allél létrákat (pl. SE33, D19S433, D12S391 és D2S441) tartalmazó plot ablak. Erősítse meg, hogy a megfelelő allél meghatározásokat rendelte a rendszer az allél létrákhoz (6.O rész, 24. ábra és 9.A rész, 3. táblázat).

!

A szoftver egy allél létra marker mintát használ az allél méretek meghatározásához. A makro az első importált létra mintát használja az allélek meghatározásához. Ha a POWER makrót másodszor futtatja, a szoftver a második létrát használja; a POWER makró harmadik futtatásakor a szoftver a harmadik létrát használja, stb., amíg a projektben lévő valamennyi létra el nem fogy. Ha egy allél létrát nem analizál a



rendszer, vagy ha sok, a létrán kívül eső allélt talál a mintákban, ezeket újra kell analizálni a projektben található másik létra használatával. Megjegyzés: Az 50.2 és 48.2 FGA allélek magas stutterrel rendelkeznek. A PowerTyper™ ESX 17 makró ezeket a stutter csúcsokat 49.2 és 47.2 allélekként határozza meg. 7.

Kattintson duplán a Display Blue Data makróra valamennyi minta befecskendezés/sáv fluroeszcein adatainak megjelenítéséhez. Gördítse le az ablakot és szükség esetén végezze el a javításokat.

8.

Kattintson duplán a Display Green Data makróra valamennyi minta befecskendezés/sáv JOE adatainak megjelenítéséhez. Gördítse le az ablakot és szükség esetén végezze el a javításokat.

9.

Kattintson duplán a Display Yellow Data makróra valamennyi minta befecskendezés/sáv TMR-ET adatainak megjelenítéséhez. Gördítse le az ablakot és szükség esetén végezze el a javításokat.

10. Kattintson duplán a Display Red Data makróra valamennyi minta befecskendezés/sáv CXR-ET adatainak megjelenítéséhez. Gördítse le az ablakot és szükség esetén végezze el a javításokat. 11. A PowerTable, Make Allele Table vagy a Make CODIS Table makró segítségével hozza létre a megfelelő táblázatot. Alább látható a három rendelkezésre álló táblázat formátum. A PowerTable opció minta fájlonként maximum négy allélt enged meg. További információ, pl. az alacsony vagy magas csúcs jel szintén megjelenik. Az Allele Table és CODIS Table opciók lókuszonként csak két allélt engednek meg. Ha egy lókuszban több, mint két allél van jelen, a legkisebb azonosított alléleket tartalmazza a táblázat. Az Allele Table formátum a kategóriákat (lókuszokat) az oszlopokban jeleníti meg, a CODIS Table formátum viszont a sorokban. Ezek a táblázatok igény szerint egyénileg módosíthatóak. Az adatok táblázatba mentéséhez menjen a Table legördülő menübe, jelölje ki az „Export to File...” pontot, majd mentse el a fájlt a kívánt néven, a kívánt mappába. Az elmentett fájl a Microsoft® Excel szoftverrel megtekinthető és analizálható. 12. Mentse el az analizált adatokat. A File menüben válassza a „Save as” opciót.

!

A PowerTyper™ ESX 17 makró egy Genotyper ® fájl, mely felülírható, ha a „Save as” opció helyett a „Save” opciót használja.



6.M. Minta analízis a Genotyper® szoftver és a PowerTyper™ ESX 17 makró segítségével (folytatás) PowerTable formátum Sample Sample Peak Peak Peak Peak Over- Low Satura- Edited Edited Info Comment Category 1 2 3 4 flow Signal tion Label Row

Allele Table formátum Sample Category Category Category Category Category Category Category Category Info Allele 1 Allele 2 Allele 1 Allele 2 Allele 1 Allele 2 Allele 1 Allele 2

CODIS Table formátum Sample Info Category Peak 1

Peak 2

6.N. Kontrollok 1.

Tekintse meg a negatív kontrollal kapott eredményt. A jelen kézikönyvben megadott protokollok mellett a negatív kontroll nem tartalmazhat amplifikációs terméket.

2.

Tekintse meg a 9947A pozitív kontroll DNS-el kapott eredményt. Hasonlítsa össze a 9947A DNA allél repeat méreteket a lókuszspecifikus allél létrával. Az egyes lókuszokra várt 9947A DNS allél meghatározások a 4. táblázatban láthatóak (9.A rész). A sejtvonalból származó 9947A DNS allélikus és STR lókuszok közötti imbalanciát mutat.



6.O. Eredmények A 23. ábra a PowerPlex® ESX 17 rendszerrel kapott jellemző eredményeket mutat. A 24. ábra a PowerPlex® ESX 17 allél létra keveréket mutatja.

A.

B.

C.

D.

8247TA

E.

23. ábra. A PowerPlex® ESX 17 rendszer. Egy szekvenciát tartalmazó templát DNS-t (0,5 ng) amplifikáltak a PowerPlex® ESX 17 10X Primer Pair Mix-el. Az amplifikációs terméket a CC5 Internal Lane Standard 500 belső standarddal összekeverve Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készüléken, 3 kV, 5 másodperces befecskendezéssel futtatták. Az eredményt 3.2 verziójú GeneMapper ® ID szoftverrel analizálták. A. panel A fluoreszcein-jelölt lókuszok csúcsait tartalmazó elektroferogram: Amelogenin, D3S1358, TH01, D21S11 és D18S51. B. panel A JOE-jelölt lókuszok csúcsait tartalmazó elektroferogram: D10S1248, D1S1656, D2S1338 és D16S539. C. panel A TMR-ET-jelölt lókuszok csúcsait tartalmazó elektroferogram: D22S1045, vWA, D8S1179 és FGA. D. panel A CXR-ET-jelölt lókuszok csúcsait tartalmazó elektroferogram: D2S441, D12S391, D19S433 és SE33. E. panel A CC5 Internal Lane Standard 500 belső standard 60 bp és 500 bp közötti méretű fragmentumait ábrázoló elektroferogram.



A.

B.

24. ábra. A PowerPlex® ESX 17 allél létra keverék. A PowerPlex® ESX 17 allél létra keveréket Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készüléken, 3 kV, 5 másodperces befecskendezéssel futtattak. A mintafájlt 3.2 verziójú GeneMapper ® ID szoftverrel, és a PowerPlex® ESX panel és bin fájlokkal analizálták. A. panel A fluoreszcein-jelölt allél létra komponensek és allél meghatározásaik. B. panel A JOE-jelölt allél létra komponensek és allél meghatározásaik. Megjegyzés: A C és D panelek a következő oldalon láthatóak. Promega Corporation· 2800 Woods Hollow Road· Madison, WI 53711-5399 USA· Ingyenes telefonszám az Egyesült Államokban: 800-356-9526· Tel: +1 608-274-4330· Fax: +1 608-277-2516· www.promega.com Part# TMD024 Oldal 48


C.

8468TA

D.

24. ábra. A PowerPlex® ESX 17 allél létra keverék (folytatás). A PowerPlex® ESX 17 allél létra keveréket Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készüléken, 3 kV, 5 másodperces befecskendezéssel futtatták. A mintafájlt 3.2 verziójú GeneMapper ® ID szoftverrel, és a PowerPlex® ESX panel és bin fájlokkal analizálták. C. panel A TMR-ETjelölt allél létra komponensek és allél meghatározásaik. D. panel A CXR-ET-jelölt allél létra komponensek és allél meghatározásaik. Megjegyzés: Az A és B panelek az előző oldalon láthatóak. Promega Corporation· 2800 Woods Hollow Road· Madison, WI 53711-5399 USA· Ingyenes telefonszám az Egyesült Államokban: 800-356-9526· Tel: +1 608-274-4330· Fax: +1 608-277-2516· www.promega.com Nyomtatva az Egyesült Államokban. 2009. augusztus


6.O. Eredmények (folytatás) Műtermékek és stutter A stutter sávok gyakori amplifikációs műtermékek az STR analízisben (14, 15). A stutter termékek gyakran a valódi allél termékekhez képest egy repeat egységgel kisebb termékként jelennek meg, illetve ritkán lehetnek két repeat egységgel kisebbek, vagy egy egységgel nagyobbak is. A nagyobb számú repeatet tartalmazó allélekkel gyakran magasabb arányban társul stutter. A stutter mintázata és intenzitása kismértékben eltérhet az ugyanazon lókuszokhoz használt eltérő primer készletek között. A D22S1045 marker esetén fokozott stutter jelenség figyelhető meg, mivel ez egy trinukleotid repeat. A PowerPlex® ESX panel fájlok az egyes lókuszoknál megfigyelt legmagasabb stuttert használják a 3.2 verziójú GeneMapper® ID szoftverben, a GeneMapper® ID-X szoftverben és a Genotyper® szoftverhez tartozó PowerTyper™ ESX 17 makróban a lókusz-specifikus filter funkcióhoz. A stutter csúcsokon kívül az alábbi alacsony szintű műtermék csúcsok figyelhetőek még meg a PowerPlex® ESX 17 rendszerben. Lókuszok

Készülék

Műtermék méretek1

D21S11, D2S441, D1S1656 és SE33

ABI 310 és Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készülékek

n–2; n+22

Amelogenin

ABI PRISM® 310 és Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készülékek

n–13

PRISM®

65–71 bázis. A műtermék az Amelogenin előtt halad Csak ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer készülék

Csak Applied Biosystems 3103 Genetic Analyzer készülék

D10S1248

ABI PRISM® 310 és Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készülékek

72–73 bázis (férfi és női minták)4 77-78 bázis (csak férfi minták)4 76 bázis (férfi és női minták)4 85 bázis (csak férfi minták)4 60-64 bázis. A műtermék a D10S1248 előtt halad5

1Az

itt felsorolt műtermékek DNS-függők. bázis a valódi allél csúcs előtt, illetve után. 3Az n–1 műtermék jobban észrevehető magas input templát mennyiségek és allél csúcsmagasságok esetén. 4Ezek a változó méretű csúcsok az ABI PRISM® 310 és Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer készülékeken az Amelogenin amplikonból származó kettős szálú DNS-t reprezentálhat (a kettős szálú DNS-ről tudott, hogy gyorsabban halad kapilláris elektroforézis készülékekben, mint az egyszálú DNS). Ez a műtermék csak az X és Y allélek nagy csúcsmagassága esetén látható. 5Az alacsony szintű, DNS-függő műtermék csak magas input templát mennyiségek és allél csúcsmagasságok esetén észlelhető. A műtermék kb. 13-17 bázissal a legkisebb D10S1248 allél (8. allél) előtt vándorol. Ez a csúcs az analízis határérték alatt vagy felett lehet, a kapilláris elektroforézis készülék érzékenységétől függően. 2Két



tmd024v3:EIVD_TM.qxd

1/4/2012

5:03 PM

Page 61

23.

Gill, P. et al. (1997) Considerations from the European DNA Profiling Group (EDNAP) concerning STR nomenclature. Forensic Sci. Int. 87, 185–92.

24.

Frégeau, C.J. et al. (1995) Characterization of human lymphoid cell lines GM9947 and GM9948 as intra- and interlaboratory reference standards for DNA typing. Genomics 28, 184–97.

25.

Mandrekar, P.V., Krenke, B.E. and Tereba, A. (2001) DNA IQ™: The intelligent way to purify DNA. Profiles in DNA 4(3), 16.

26.

Krenke, B.E. et al. (2005) Development of a novel, fluorescent, two-primer approach to quantitative PCR. Profiles in DNA 8(1), 3–5.

27.

Greenspoon, S. and Ban, J. (2002) Robotic extraction of sexual assault samples using the Biomek® 2000 and the DNA IQ™ System. Profiles in DNA 5(1), 3–5.

28.

McLaren, B., Bjerke, M. and Tereba, A. (2006) Automating the DNA IQ™ System on the Biomek® 3000 Laboratory Automation Workstation. Profiles in DNA 9(1), 11–13.

29.

Cowan, C. (2006) The DNA IQ™ System on the Tecan Freedom EVO® 100. Profiles in DNA 9(1), 8–10.

30.

Bjerke, M. et al. (2006) Forensic application of the Maxwell™ 16 Instrument. Profiles in DNA 9(1), 3–5.

31.

Mandrekar, P. et al. (2010) Improved performance of the Maxwell® 16 low elution volume system for forensic casework. Profiles in DNA 13(2). This can be viewed online at: www.promega.com/profiles/1302/1302_05.html

Additional STR references can be found at: www.promega.com/geneticidentity/ 9.

Appendix 9.A. Advantages of Using the Loci in the PowerPlex® ESX 17 System The loci included in the PowerPlex® ESX 17 System (Tables 2 and 3) were selected because they meet the recommendations of the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI). The PowerPlex® ESX 17 System amplifies all ENFSI core loci plus SE33 in a single reaction. Table 4 lists the PowerPlex® ESX 17 System alleles revealed in commonly available standard DNA templates. Terminal nucleotide addition (16,17) occurs when Taq DNA polymerase adds a nucleotide, generally adenine, to the 3´ ends of amplified DNA fragments in a template-independent manner. The efficiency with which this occurs varies with different primer sequences. Thus, an artifact band one base shorter than expected (i.e., missing the terminal addition) is sometimes seen. We have modified primer sequences and added a final extension step of 60°C for 45 minutes (18) to the amplification protocols to provide conditions for essentially complete terminal nucleotide addition when recommended amounts of template DNA are used.

Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Printed in USA. Revised 12/11

Part# TMD024 Page 61


1/4/2012

5:03 PM

Page 62

Table 2. The PowerPlex® ESX 17 System Locus-Specific Information. Label

Chromosomal Location1

D18S51

Fluorescein

D21S11

Fluorescein

TH01

Fluorescein

D3S1358

Fluorescein

Amelogenin3

Fluorescein

18q21.33 (59.1Mb) 21q21.1 (19.476Mb) 11p15.5 (2.149Mb) 3p21.31 (45.557Mb) Xp22.1–22.3 and Y

STR Locus

D16S539

JOE

D2S1338

JOE

D1S1656

JOE

D10S1248

JOE

FGA

TMR-ET

D8S1179

TMR-ET

vWA

TMR-ET

D22S1045

TMR-ET

SE33

CXR-ET

D19S433

CXR-ET

D12S391

CXR-ET

D2S441

CXR-ET

16q24.1 (84.944Mb) 2q35 (218.705Mb) 1q42 (228.972Mb) 10q26.3 (130.567Mb) 4q28 (155.866Mb) 8q24.13 (125.976Mb) 12p13.31 (5.963Mb) 22q12.3 (35.779Mb) 6q14 (89.043Mb) 19q12 (35.109Mb) 12q (12.341Mb) 2p14 (68.214Mb)

Repeat Sequence2 5´→ 3´ AGAA (19) TCTA Complex (19) AATG (19) TCTA Complex NA GATA TGCC/TTCC TAGA Complex GGAA TTTC Complex (19) TCTA Complex (19) TCTA Complex (19) ATT AAAG Complex AAGG Complex AGAT/AGAC Complex TCTA

1Information

about chromosomal location of these loci can be found in references 20 and 21 and at: www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/chrom.htm

2The

August 1997 report (22,23) of the DNA Commission of the International Society for Forensic Haemogenetics (ISFH) states, “1) for STR loci within coding genes, the coding strand shall be used and the repeat sequence motif defined using the first possible 5´ nucleotide of a repeat motif; and 2) for STR loci not associated with a coding gene, the first database entry or original literature description shall be used”.

3Amelogenin

is not an STR but displays an 87-base, X-specific band and a 93-base, Y-specific band. 9947A DNA (female) displays only the 87-base, X-specific band.

Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Part# TMD024 Page 62

Printed in USA. Revised 12/11


1/4/2012

5:03 PM

Page 63

Table 3. The PowerPlex® ESX 17 System Allelic Ladder Information.

Label

Size Range of Allelic Ladder Components1,2 (bases)

D18S51 D21S11

Fluorescein Fluorescein

286–366 203–259

7–10, 10.2, 11–13, 13.2, 14–27 24, 24.2, 25, 25.2, 26–28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36–38

TH01 D3S1358 Amelogenin4 D16S539 D2S1338 D1S1656

Fluorescein Fluorescein Fluorescein JOE JOE JOE

152–195 103–147 87, 93 273–321 197–269 137–184

D10S1248 FGA

JOE TMR-ET

83–127 264–410

3–9, 9.3, 10–11, 13.3 9–20 X, Y 4–16 10, 12, 14–28 9–14, 14.3, 15, 15.3, 16, 16.3, 17, 17.3, 18, 18.3, 19, 19.3, 20.3 8–19 14–18, 18.2, 19, 19.2, 20, 20.2, 21, 21.2, 22, 22.2, 23, 23.2, 24, 24.2, 25, 25.2, 26–30, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 48.2, 50.2

D8S1179 vWA D22S1045 SE33

TMR-ET TMR-ET TMR-ET CXR-ET

203–251 124–180 79–118 267–417

7–19 10–24 7–20 4.2, 6.3, 8–20, 20.2, 21, 21.2, 22, 22.2, 23.2, 24.2, 25.2, 26.2, 27.2, 28.2, 29.2, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 34.2, 35-37, 39, 42

D19S433

CXR-ET

193–245

D12S391 D2S441

CXR-ET CXR-ET

130–182 88–124

5.2, 6.2, 8–12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2, 18, 18.2 14–17, 17.3, 18, 18.3, 19–27 8–11, 11.3, 12–17

STR Locus

1The

Repeat Numbers of Allelic Ladder Components3

length of each allele in the allelic ladder has been confirmed by sequence analyses.

2When

using an internal lane standard, such as the CC5 Internal Lane Standard 500, the calculated sizes of allelic ladder components may differ from those listed. This occurs because different sequences in allelic ladder and ILS components may cause differences in migration. The dye label and linker also affect migration of alleles.

3For

a current list of microvariants, see the Variant Allele Report published at the U.S. National Institute of Standards and Technology (NIST) web site at: www.cstl.nist.gov/div831/strbase/

4Amelogenin

is not an STR but displays an 87-base, X-specific band and a 93-base, Y-specific band. 9947A DNA (female) displays only the 87-base, X-specific band.




1/4/2012

5:03 PM

Page 64

Table 4. The PowerPlex® ESX 17 System Allele Determinations in Commonly Available Standard DNA Templates. Standard DNA Templates1 STR Locus

9947A

9948

2800M

D18S51

15, 19

15, 18

16, 18

D21S11

30, 30

29, 30

29, 31.2

TH01

8, 9.3

6, 9.3

6, 9.3

D3S1358

14, 15

15, 17

17, 18

Amelogenin

X, X

X, Y

X, Y

D16S539

11, 12

11, 11

9, 13

D2S1338

19, 23

23, 23

22, 25

D1S1656

18.3, 18.3

14, 17

12, 13

D10S1248

13, 15

12, 15

13, 15

FGA

23, 24

24, 26

20, 23

D8S1179

13, 13

12, 13

14, 15

vWA

17, 18

17, 17

16, 19

D22S1045

11, 14

16, 18

16, 16

SE33

19, 29.2

23.2, 26.2

15, 16

D19S433

14, 15

13, 14

13, 14

D12S391

18, 20

18, 24

18, 23

D2S441

10, 14

11, 12

10, 14

1Information

about strains 9947A and 9948 is available online at: http://ccr.coriell.org/Sections/Collections/NIGMS/?SsId=8 Information about the use of 9947A and 9948 DNA as standard DNA templates can be found in reference 24.

9.B. DNA Extraction and Quantitation Methods The DNA IQ™ System (Cat.# DC6700) is a DNA isolation and quantitation system designed specifically for forensic and paternity samples (25). This system uses paramagnetic particles to prepare clean samples for STR analysis easily and efficiently and can be used to extract DNA from stains or liquid samples, such as blood or solutions. The DNA IQ™ Resin eliminates PCR inhibitors and contaminants frequently encountered in casework samples. With DNA-rich samples, the DNA IQ™ System delivers a consistent amount of total DNA. The system has been used to isolate and quantify DNA from routine sample types including buccal swabs, stains on FTA® paper and liquid blood. Additionally, DNA has been isolated from casework samples such as tissue, differentially separated sexual assault samples and stains on support materials. The DNA IQ™ System has been tested with the PowerPlex® Systems to ensure a streamlined process. See Section 9.F for ordering information. For applications requiring human-specific DNA quantification, the Plexor® HY System (Cat.# DC1000) was developed (26). See Section 9.F for ordering information.

Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Part# TMD024 Page 64

Printed in USA. Revised 12/11


1/4/2012

5:03 PM

Page 65

The DNA IQ™ System has been fully automated on the Beckman Coulter Biomek® 2000 Laboratory Automation Workstation (27), Biomek® 3000 Laboratory Automation Workstation (28) and Tecan Freedom EVO® Liquid Handler (29). In addition, the DNA IQ™ Reference Sample Kit for Maxwell® 16 (Cat.# AS1040) and DNA IQ™ Casework Pro Kit for Maxwell® 16 (Cat.# AS1240) are available (30,31). For information about automation of laboratory processes on automated workstations, contact your local Promega Branch Office or Distributor (contact information available at: www.promega.com/worldwide/) or e-mail: [email protected] 9.C. The CC5 Internal Lane Standard 500

8248TA

The CC5 Internal Lane Standard 500 contains 21 DNA fragments of 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 and 500 bases in length (Figure 25). Each fragment is labeled with CC5 dye and can be detected separately (as a fifth color) in the presence of PowerPlex® ESX 17-amplified material. The CC5 ILS 500 is designed for use in each CE injection to increase precision in analyses when using the PowerPlex® ESX 17 System. Protocols to prepare and use this internal lane standard are provided in Section 5.

Figure 25. CC5 Internal Lane Standard 500. An electropherogram showing CC5 Internal Lane Standard 500 fragments.



11. Oldal 2

Recommend Documents