Virale Diagnostiek: Van CPE tot PCR G. Ieven
21/09/04
Virusdiagnostiek
• Waarom • Technieken • Klinische toepassingen en strategiën
Waarom diagnostiek van virusinfecties • Verzamelen van epidemiologische gegevens - griep en vaccinatie - vaccinatiepolitiek - seizoensgebonden activiteit van - vb. Ifl, RSV, Rhino, Mycoplasma e.a…. • Wetenschappelijke argumenten: inzicht in pathogenese • Ondersteuning van beleid ten aanzien van individuele patiënt
Page 1
Virusdiagnostiek t.a.v. individuele patiënt • Stoppen of niet starten van antibioticatherapie - vb. bij respiratoire infecties • Toediening van specifieke antivirale therapie - vb. HIV, Herpes, Hepatitis virussen • Vermindering van hospitalisatieduur - vb. virale meningitis • Preventie van verspreiding van infectie → Voorwaarde: snelle diagnostiek: 24 - 48 h
Virusdiagnostiek: van CPE tot PCR
• Van laattijdig
tot
snel
• Van aspecifiek
tot
virusspecifiek
• Van minder gevoelig
tot
zeer gevoelig
Diagnostische methodes in de virologie
• Rechtstreekse diagnose: - aantonen van het virus zelf • Onrechtstreekse diagnose: - aantonen van de immuunrespons, meestal via specifieke antistoffen • Niet-virale parameters
Page 2
Doel van virus diagnostiek • Aantonen van een acute infectie - aantonen van virus hetzij rechtstreeks, hetzij onrechtstreeks • Aantonen van chronische infectie - opsporen van antistoffen (vb. seropositiviteit van HIV) - rechtstreeks aantonen van virus (vb. surface antigeen van hepatitis B) • Aantonen van reactivaties - meestal gesteund op rechtstreekse diagnose (vb. detectie van CMV bij immuungedeprimeerden) • Aantonen van immuniteit - opsporen van antistoffen
Onrechtstreekse virusdiagnose: aantonen van antistoffen • Aantonen van seropositiviteit - immuniteit - persisterende infectie • Seroconversie of titerstijging - acute infectie - reactivatie van chronische infectie • Aanwezigheid van IgM antistoffen - acute of recente infectie • Aantonen van verschillende antigenen kan bijkomende informatie geven vb. HBV, EBV
Virusdiagnostiek door serologische testen Voordelen • Vooral nuttig voor niet of moeilijk kweekbare virussen vb. hepatitis • Specifieke IgG: goede indicatoren voor voorbije infectie • Capture IgM testen: goede indicatoren voor recente infectie • Laat een retrospectieve diagnose toe ook indien geen klinisch monster in acute fase • Snel • Voor vele parameters geautomatiseerd
Page 3
Virusdiagnostiek door serologische testen Nadelen • Retrospectieve diagnose indien door KBR of IgG titerstijging • Kruisreactiviteit en interferentie (meestal IgM) vb. respiratoire virussen • Ongevoelig voor de diagnose van sommige congenitale infecties (vb CMV) • Niet aangewezen voor immuungecompromiteerde patiënten • Na bloedtransfusies mogelijks valse resultaten
Rechtstreekse virus diagnose • Elektronenmicroscopie • Virusisolatie door kweek - klassieke viruskweek met detectie van CPE - korte kweektechnieken met detectie van virale antigenen door monoclonale antilichamen • Antigeen detectie: rechtstreekse detectie van virale antigenen in klinische monsters • Genoomdetectie: detectie van viraal DNA/of RNA - probe technieken - nucleïnezuuramplificatie technieken
Taxonomy
Page 4
Virusdiagnostiek d.m.v. electronenmicroscopie • Belangrijk bij eerste benadering: - ontdekking van hepatitis virus - ontdekking van Ebola virus - identificatie van SARS als coronavirus, … • Op basis hiervan worden andere technieken uitgebouwd ten behoeve van klinische diagnostiek - ontwikkeling van antigeen voor serologische tests - ontwikkeling van monoclonale AL voor IF/Elisa - sequenceren van NZ voor latere amplificatiereacties
Electronenmicroscopie van Ebolavirus
Elektronenmicroscopie
Voordelen
Nadelen
• detecteert alle virussen • detecteert niet kweekbare virussen • lage werkingskosten
• ervaring vereist • lage gevoeligheid • hoge investeringskost
Page 5
Isolatie van virus uit patiëntenmateriaal • proefdieren: coxsackievirussen in babymuizen • bebroede kippeneieren: (1930’s): Influenza A in amnionholte • celkweken (1950’s): - conventionele viruskweek met CPE - versnelde viruskweek met IF zonder CPE na centrifugatie van beënte cellen
Conventionele viruskweek
• Virus isolatie - Gouden standaard - Gebaseerd op de min of meer specifieke inwerking van virussen op de cellen - Resultaat: de detectie van een CPE in de celculturen, syncytia of veelkernige reuscellen, inclusies, vacuolisatie
Conventionele virusisolatie
Page 6
CPE van Herpes simplex virus op Verocellen
CPE voor Rhinovirus op MRC5 cellen
CPE van mazelenvirus op Verocellen
Page 7
Beperkingen van conventionele celkweek • Niet alle virussen geven CPE: - Norwalk-, calici-, rota-, parvovirus: EM - paramyxovirussen: hemadsorptie - rubellavirus: interferentie • Specificiteit: identificatie noodzakelijk - vb. entero of rhinovirussen → pH gevoeligheid • Soms laattijdige diagnose: van enkele dagen tot weken • Afhankelijk van transport en bewaring patiëntenmateriaal • Arbeidsintensief, ervaren personeel noodzakelijk
Virus isolatie Voordelen
Nadelen
• gevoelig • detecteert meerdere virussen • virusisolaat voor verdere studie • detecteert levend virus • mogelijks snel resultaat in aangepaste versie
• langzaam (conventionele celkweek) • arbeidsintensief • verschillende cellijnen noodzakelijk
Invloed van Specimen • Kritisch!!! - Beperkte replicatie capaciteit in celculturen - Stabliliteit • Bron en methode van monstername • Tijdstip van afname in verhouding tot het begin van de symptomen • Transport naar het laboratorium:
Page 8
Invloed van Specimen : andere factoren
• Andere factoren die de succesvolle detectie kunnen beïnvloeden: - De leeftijd van de patiënt: bv jonge kinderen scheiden langer influenza virussen uit dan volwassenen - De immuunstatus van de patiënt: bv persistente uitscheiding van RSV in HIV geïnfecteerde kinderen
Invloed van Specimen: transport en bewaring • Transport naar het laboratorium - Zo snel mogelijk
Viabiliteit ↓ tijd
- Mengen met transport medium, transporteren op 4°C • Bewaren van de monsters: - Indien noodzakelijk bij 4°C (zo kort mogelijk) - -70°C (!vriesdooi effecten kunnen schade berokkenen ↓ infectiviteit en afbraak van genoom)
Snelle methoden voor virusdiagnostiek • Versnelde viruskweek met indirecte immunofluorescentie • Aantonen van virus: Elektronenmicroscopie en immuno EM • Aantonen van virusantigeen in direkt preparaat - indirecte immunofluorescentie vb. RSV - enzyme-immunoassay vb. RSV, HBV, rota, adeno - latex agglutinatie vb. rota, adeno • Aantonen van virusnucleïnezuur - hybridizatie - gen-amplificatie: PKR, LKR, ...
Page 9
Virusdetectie met IF na centrifugatie
Results of virus detection by CPE compared with IF on centrifuged shell vial cultures CPE
IFSV
Number of positives
%
Viruses detected
+ + -
+ +
44 1 33
56.4 1.3 42.3
30 HS, 5 ADE, 5 RSV, 1 VZV HS 18 HS, 5 ADE, 4 RSV, 3 CMV, 3 PFL
S.R. Pattyn et al. (1989)
Results of virus detection by CPE compared with IF on centrifuged shell vials cultures Number of Pos 78 107
IFSV pos. n % 77 105
98.7 98.1
CPE pos. n % 45 63
57.7 58.9
Pattyn et al. (1989) Schirm et al. (1992)
Page 10
IF van CMV op geïnfecteerde cellen
IF van Adenovirus op geïnfecteerde cellen
IF van CMV en adeno virus op geïnfecteerde cellen
Page 11
IF van HSV en VZV op geïnfecteerde cellen
Voordelen en beperkingen van versnelde viruskweek • Voordelen - diagnose na 24 - 48 h - sensitiviteit - specificiteit door detektie met MoAb’s • Beperking - afhankelijk van transport en bewaring patiëntenmateriaal - specificiteit: men vindt wat men zoekt
Snelle methoden voor virusdiagnostiek • Versnelde viruskweek met indirecte immunofluorescentie • Aantonen van virus: Elektronenmicroscopie • Aantonen van virusantigeen in direkt preparaat - indirecte immunofluorescentie vb. RSV - enzyme-immunoassay vb. RSV, HBV, rota, adeno - latex agglutinatie vb. rota, adeno • Aantonen van virusnucleïnezuur - hybridizatie - gen-amplificatie: PKR, LKR, ...
Page 12
Indirecte immunofluorescentie op monster: RSV
Results of respiratory viral detection by immunofluorescence on clinical samples (IFCS and in cell cultures after centrifugation (IFCC) Virus(n) IFCS + IFCC + INF (28) PFL (12) ADE (5) RSV (51)
Number of positive samples IFCS + IFCS % Positives IFCC - IFCC + IFCS IFCC
17 1 0 23
5 0 0 25
6 11 5 3
78.5 8.3 0 94
RSV (248) 177
61
10
96
82.1 100 100 51 S.R. Pattyn et al. (1991)
75 J. Schirm et al (1992)
Antigeendetectie door immunofluorescentie
Voordelen
Nadelen
• snel • onafhankelijk van verschijnen van CPE • gevoelig voor sommige virussen (vb. RSV) • laat kwaliteitscontrole toe van monster
• ervaring vereist • wisselende gevoeligheid • afhankelijk van kwaliteit van monster • specificiteit men vindt wat men zoekt, soms aspecifieke reacties
Page 13
Antigeen detectie door latex agglutinatie
Antigeendetectie door immunochromatografische methodes
Immunochromatografische en Latex testen voor snelle virusdetectie
Voordelen
Nadelen
• snel en eenvoudig • minder afhankelijk van monsterkwaliteit • specifiek
• minder gevoelig dan IF • geen controle op kwaliteit van monster • prijs
Page 14
Antigeendetectie door enzyme immuno assays • Voordeel: - gebruiksvriendelijk en snel, leent zich voor grotere reeksen - automatisatie, - verminderde kans op subjectieve beoordeling • Nadeel: - lage concentraties infectieus virus in respiratoire monsters van volwassenen - geen kwaliteitscontrole van het monster - Invloed van het gebruikte materiaal
Snelle methoden voor virusdiagnostiek • Versnelde viruskweek met indirecte immunofluorescentie • Aantonen van virus: Elektronenmicroscopie • Aantonen van virusantigeen in direkt preparaat - indirecte immunofluorescentie vb. RSV - enzyme-immunoassay vb. RSV, HBV, rota, adeno - latex agglutinatie vb. rota, adeno • Aantonen van virusnucleïnezuur - hybridizatie - gen-amplificatie: PKR, LKR, ...
Indicaties voor NAAT • Niet isoleerbare virussen: geen geschikte cellijnen • Andere technieken zijn minder efficiënt of te traag bv. CMV 6 weken • Zeer lage concentraties aanwezig in monster • Virus inactivatie gedurende transport of bewaring • Contaminatie met andere pathogenen • Leveren van bijkomende info - Opvolgen van therapie - Resistentie - Viral load
Page 15
NAAT: Technieken en evolutie • PCR: - Real Time PCR - Multiplex PCR • NASBA - Real Time NASBA - Multiplex NASBA • DNA chip • LCR • SDA, ...
NASBA Amplification: schematic diagram 5’
3’
Primer 1 Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase
3’
Primer 2
5’
T7 RNA polymerase
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase RNase H Primer 1
Detectie photon 620 nm
Magnetic Particle
Ru++
RNA amplicon
Working Electrode = ECL probe = target-specific capture probe
Page 16
Molecular beacons Molecular beacon DNA probe T G A A A
A
A
C
G C G G C
A
C T C C
NASBA RNA C G T T T C A T A G T A GG G A G G T A CG C A A G
GTA T
A
CC
TC
C C
G C
F
FQ
G
G
Q
•Single stranded RNA molecules •Isothermal amplification •Fast binding kinetics
Real Time PCR • Lightcycler: - 1)SYBR Green: bindt op dsDNA - 2)Hybridisatie probes - voordeel: - minder contaminatie: 1 tube - snelle reactie (kleine volumes in capillair) - uniforme protocols - automatiseerbaar - quantitatief
Conventional PCR vs Real Time PCR Conventional PCR
Real Time PCR
• amplificatie en detectie afz.
• 1 tube amplificatie en detectie
• Eindpunt meting
• continue meting en/of eindpunt meting • Je meet telkens op vast niveau (# cycli in reactie) • Smeltcurves (moment waarop beide strengen uiteen gaan)bv mutatie-onderzoek
Page 17
Multiplex amplificatiereacties • Multiplex formats: - Principe: detectie van ≠ virussen in 1 reactietube door het gebruik van verschillende primersets in deze tube - Nadeel: beïnvloeding van de amplificatiereactie door te werken onder suboptimale condities met als gevolg een lagere specificiteit en sensitiviteit
PCR : Aanbevolen controles Negatieve controles • extractie controle: - controle op contaminatie tijdens extractie - gesimuleerd klinische monster • reagens controle: - controle op contaminatie van reagentia - gebruik van solvens met geëxtraheerd nucleïnezuur Positieve controles • extractie controle: - positief klinisch monster • inhibitie controle: - door inclusie van gewijzigd target
PCR: Preventie van contaminaties SCHEIDING IN VERSCHILLENDE LOKALEN • Bereiding van reagentia - “clean room”: geen nucleïnezuren • Nucleïnezuur extractie • Amplificatiereacties (in geval van nested reacties, 2°PCR ronde eventueel nog scheiden) • Analyse van PCR producten
Page 18
Molecularie amplificatietesten in een klinisch diagnostisch lab • Diagnose van infectie • Diagnose van ziekte • Genotypering van virussen • Voorspelling van ziekte/status van infectie • Monitoring van antivirale therapie • Confirmatie van virus transmissie • Epidemiologie van infectie
Virusdiagnostiek: Diagnostische strategiën • Detectie van individuele infectieuze agentia: kwalitatief of kwantitatief: belangrijk in opvolging van behandelingen - hepatitis B, C - HIV - CMV • Syndroom gerichte benadering: “breed spectrum” aanpak van gericht op alle of meeste virussen die voor syndroom verantwoordelijk kunnen zijn. - respiratoire infecties - meningitis/encephalitis - gastro-intestinale infecties
Klinische syndromen en virale infecties Syndroom
Meest waarschijnlijk virus
Respiratoir
verkoudheid pharyngitis bronchiolitis pneumonie
Centraal zenuwstelsel
Meningitis Encephalitis
Gastrointestinaal
diarrhee
Rhinovirus Coronavirus Adenovirus Parainfluenza 1-3 Influenza A RSV CMV (immunogecompromiteerden) Echovirus Coxsackievirus A-B Herpes simplex CMV rotavirus adenovirus 40-41 Norwalk Like Hepatitis A-B-C
Hepatitis
Page 19
Virusdiagnostiek: Diagnostische strategiën
• Geoptimaliseerde technieken, eventueel combinaties van technieken rekening houdend met - gevoeligheid / specificiteit - snelheid - kostprijs
Gevoeligheid van verschillende moleculaire testen
Serum HBV DNA copijen/ml
Limiet in gevoeligheid
106
Vloeibare hybridisatie bDNA
104 102
Kwantitatieve PCR
tijd
Actieve CMV in Transplant Patienten
• Major complication in transplant patients : incidence 50-75 % after renal transplantation • Symptoms are unspecific and similar as in graft rejection • Different differential diagnosis and treatment implications • Early detection in high risk patients is essential for “early” or “preemptive” therapy.
Page 20
CMV in Transplant Patienten: Beschikbare Technieken
• pp65 antigenemie (Ag) • hybrid capture CMV DNA test (CMV-HCS) • PCR op witte bloedcellen (PCR-WBC) • PCR op plasma (PCR-Pl) • Kwantitatieve PCR op bloed fracties
Evaluatie van verschillende CMV detectie methoden bij transplantpatiënten • Evaluatie van de sensitiviteit, specificiteit, TAT - CMV hybrid capture systeem op leucocyten - pp65 antigenemie - PCR op leucocyten - PCR on plasma • Ontwikkelen van een optimale strategie om snel en door gebruiksvriendelijke methode een actieve CMV infectie te detecteren.
CMV Posttransplantatie: PCR op Leucocyten en op Plasma 80
ce lls /200.000 cellen/200.000) Pospos
70 60 50
pp 65
40
PCR WBC
30
PCR pl
20 10 0 0
3 10 17 24 31 38 45 52 59 66 73 80 87 94 10 Posttransplantatie (dagen) posttrans plantation (days)
Page 21
Chronologie van Test Resultaten voor CMV in Nier Transplant Patiënten 33 d Ag
36
68
3d
7d
PCR-Pl 43 d PCR-WBC 7d
12 d
51 d ↑ 4.1 weken post transplantatie
Monitoring CMV na Transplantatie UZA : 34 patiënten wekelijks opgevolgd gedurende 3 maanden 422 monsters vergelijking van 3 technieken voor opvolging Sensitiviteit
Gebruiksgemak
Kwantitatieve resultaten
PCR op leucocyten
+++
+
-
PCR op plasma
++
++
-
pp-65 antigenemie
+
+
+
Conclusies : opvolging door PCR, inidien positief → pp-65 antigenemie
Diagnose van ziekte CMV copies/ml Laag gevoelige test: prediktief voor ziekte
Zeer gevoelige test: niet prediktief voor ziekte
tijd
Page 22
Voorgestelde Strategie voor opvolging van Orgaantransplantaties • Vanaf transplantatie en gedurende de volgende 3 maanden: wekelijks PCR-WBC of PCR-Pl en bereiding van cellen voor de detectie van pp65 antigenemie tot fixatie stap. • Indien PCR-Pl positief is → pp65 IF op de bereide uitstrijkjes. • Voortzetting van deze procedure zolang de PCR-Pl positief is.
Virologische monitoring van transplant patiënten : pretransplantatie
• Donor serologie : HIV, HCV, HBsAg, HBc, CMV, EBV • Recipient serologie: HIV, HCV, HBsAg, HBc, CMV, EBV, HSV, VZV
Virologische monitoring van transplant patiënten: posttransplantatie • Wekelijke surveillance gedurende 3 maanden: CMV viremie (PCR, antigenemie) Bij symptomen respiratoir
Monster keelveger BAL bloed
Mogelijke oorzaken CMV, HSV, influenza RSV, parainfluenza adeno, CMV
Technieken virusisolatie/PCR IF/virusisolatie PCR
Gastrointestinaal
biopsie, faeces, bloed
CMV, HSV, adeno, rota (zeldzaam)
virusisolatie/PCR PCR en EM
CNS
CSV bloed
CMV, JC (zeldzaam) CMV
PCR PCR
adeno, BK
PCR, EM
Urinewegen urine (hemoragische cystitis)
Page 23
Influence of Prevalence on Predictive Values for given test : Se = 99%, Sp = 98% Prevalence
PPV
NPV
1°/°°° 1 °/°° 1% 2% 3% 4% 5% 10 % 20 % 30 %
4.9 % 4.7 % 33.3 % 50.0 % 60.0 % 67.0 % 72.0 % 84.0 % 92.0 % 95.0 %
99.99 % 99.99 % 99.98 % 99.98 % 99.97 % 99.96 % 99.95 % 99.89 % 99.75 % 99.56 %
Goldberg M, 1990; “L’epidémiologie sans peine”
Amplificationtests for the Detection of C. trachomatis Method
PCR
Assay
Amplicor Cobas Amplicor
Company
Hands-on Time
Amplif.
(hours)
control
Roche
3-3.75 2-2.5
Optional Optional
LCR
LCx
Abbott
1-1.5
No
TMA
Amp CT
Gen-Probe
2.5
No
SDA
ProbeTec ET
Becton-Dickinson
1-1.25
Yes
Sensitivity of Amplification Methods for the Detection of C. trachomatis on First Void Urine Author
Test
Sens.(%)
Spec. (%)
Reference
Chernesky
LCR
96
100
J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 2682
Quinn
PCR
93.3
Pasternack
PCR LCR
94 94
99.2 100
J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 402
Morre
PCR LCR
98.8 78.6
99.9 99.7
J. Clin. Microbiol. 1999; 37: 3092
Van Dyck
PCR LCR SDA
98.0 90.0 94.0
98.0 100 98.6
J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 1751
J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 1401
Page 24
Prevalence of C. trachomatis Infection in General Practice in Antwerp • Study population: 777 sexually active women, age 1540, visiting their GP • Methods: opportunistic screening by DNA on self-taken vaginal sample Age 14 - 17 18 - 22 23 - 27 28 - 35 36 - 40
1/50 (2%) 15/227 (6.6%) 15/260 (5.8%) 8 / 220 (3.6%) 0/30 (0%)
Overall prevalence: 4.96% Verhoeven V. et al, J. Med. Screening 2003; 10: 14-15
Possible Recommendations for Screening for Chlamydia trachomatis in a Sample of Women in General Practice • All women > 1 partner in the past year AND • All women with two of the following: - age 18 - 27 years - frequent postcoital bleeding - having symptomatic partners - no use of contraceptives would detect 92.3% of infections and 37.5% of the population would need to be screened Verhoeven V. et al, J. Med. Screening 2003; 10: 14-15
Recommendations and Reports on Screening Tests to Detect C. trachomatis Infections. • Potential adverse consequences caused by false positives: patients should be counceled regarding this potential: routine additional testing to improve predictive value of a positive screening test should be considered if low prevalence. • Selecting persons for testing who are at high risk can increase the prevalence of infection among the tested persons, thereby reducing screening costs. CDC, MMWR 2002; 51: 1-27
Page 25
Strategy for Detection of C. trachomatis: Medico-legal Aspects • Need for highest specificity: What may be appropriate for screening a sexually active adult may not be appropriate for testing a child for suspected sexual abuse Medico-legal implications Confirmatory testing is crucial if the probability of the infection is low Need for communication between clinician-lab
Virusdiagnostiek : CONCLUSIES Voorbijgestreefde Mythes 1) Isolatie van een virus is enkel van academisch belang 2) Het epidemiologisch belang van virusdiagnostiek situeert zich enkel buiten het ziekenhuis 3) Virale diagnostiek is te traag om klinisch relevant te zijn 4) Virale diagnostiek is uitermate duur 5) Virusdetectie is overbodig wegens beschikbaarheid van serologische tests.
Virusdiagnostiek: CONCLUSIES
“The time of retrospective viral diagnosis has gone to be replaced by rapid techniques which impact directly on patient management. More competition for healthcare resources means that new techniques are introduced at the expense of more traditional methods “with limited clinical use” Jeffery K, 2004
Page 26
Virusdiagnostiek: CONCLUSIES “Clinical virologists are having to work more closely with their clinical collegues to establish new diagnostic criteria, develop protocols for use of antiviral drug, and for monitoring of these patients with persistent infections. The diversity of diagnostic methods now available make communication between physicians and clinical virologists more important than ever before” Jeffery K, 2004
Page 27
