EBV VCA-IgM-ELA PKS medac
Magyar
127-PKS-VPU/010512
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D-22880 Wedel Tel.: Fax:
++49/ 4103/ 8006-351 ++49/ 4103/ 8006-359
RENDELÉSI CÍM Tel.: Fax:
++49/ 4103/ 8006-111 ++49/ 4103/ 8006-113
127-PKS-VPU/010512
EBV VCA-IgM-ELA Test PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, Epstein-Barr vírus specifikus kapszid antigén (VCA) elleni IgM antitestek kvantitatív kimutatására szérumból Katalógusszám: 127-PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS Az Epstein-Barr vírus (EBV) a Herpesviridae családba tartozik. Duplaszálú DNS-t, kapszidot, burkot és bevonatot tartalmaz. Az EBV-re jellemzı, hogy latensen élethosszig perzisztál a szervezetben a primer fertızés után. Az összes felnıtt 90 - 95 %-a EBV-vel fertızött világszerte. A lefolyás, EBV primer fertızés immunkompetens egyénekben korai gyermekkorban fordul elı, általában tünetmentes. Fiatal felnıttekben az EBV fertızés mirigyláz (Pfeiffer kór) formában jelentkezik. Kissé immunszuppresszált egyénekben klinikailag csendes reaktiváció elıfordulhat. Masszívan immunszuppresszált egyénekben EBV-asszociált poliklonális B-sejt limfoma fordul elı. A Hodgkin-limfomák 60 %-ában EBV DNS van jelen. Az endémiásan jelentıs EBV-asszociált tumor megbetegedések a Burkitt limfóma és a nasopharyngealis karcinoma. Az antitest kimutatáshoz szükséges releváns antigén komplexek az EBV specifikus nukleáris antigén (EBNA), a vírus kapszid antigén (VCA) és a korai antigén (EA). Immunkompetens egyénekben a antitestek kimutatása a primer és korábbi fertızések, illetve a szeronegativitás megkülönböztetése céljából az EBV diagnózis fókusza. Az EBV szerológia fontos lehet a lymphadenopathya és tisztázatlan neurológiás betegségek addicionális diagnosztikájában. A releváns EBV szerológia összefüggésében az EBNA-1 IgG meghatározás az elsı lépés. Pozitív eredmény korábbi fertızésre utal. Negatív EBNA-1 IgG esetén a VCA IgG és IgM meghatározás alapvetıen fontos a fertızés státuszának megkülönböztetésében. Az EBV VCA-IgM-ELA PKS medac a vírus kapszid gp 125 fehérje elleni specifikus IgG antitesteket mutatja ki. A teszt gyorsan és könnyen kivitelezhetı. A µ-capture és ELA-módszer lehetıvé teszi a nagyon specifikus és érzékeny diagnosztikai értelmezést.
127-PKS-VPU/010512
1
A TESZT ELVE
A lemezt anti-humán IgM globulinnal vonták be.
immun-
A mintában levı IgM szelektíven kötıdik az antigénhez.
Az mAb-peroxidáz komplex és a VCA gp 125 antigén kötıdik az antiVCA-IgM specifikus antitestekhez (AG = antigén,P = peroxidáz).
Inkubáció a TMB-szubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le.
A teszt elınyei
A rheumatoid faktorok által okozott nem-specifikus és álpozitív reakciók nem jelentkeznek. A magas IgG titer nem gátolja az IgM antitesteket. A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhetı csíkok lehetıvé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken 127-PKS-VPU/010512
2
A KIT TARTALMA Katalógusszám: 127-PKS 1.
MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (jelölés: VCM, kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, Ualakú, kecske anti-humán IgM immunglobulinnal bevont, BSA és pH indikátor, felhasználásra kész.
2.
CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
3.
CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCS-t, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
4.
WB Mosó puffer: 1 flakon, ProClinTM 300 tartalmú.
5.
100
ml,
PBS/Tween
(10x),
VIR-DIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.
pH
pH
7,2 –
7,2
–
7,4,
7,4,
6.
ANTIGEN-DIL Antigén hígító: 1 flakon, 14 ml, Tris/NaCl, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.
7.
ANTIGEN Antigén: 6 liofilizált.
flakon,
mindegyik
2,0
ml,
EBV
VCA
gp
125/BSA,
8.
CON Konjugátum: 1 fiola, 0,35 ml, anti VCA gp 125-IgG egér monoklonális antitestek, HRP-vel konjugált, felhasználásra kész, piros színő, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
9.
TMB TMB-szubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész.
10.
STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H2SO4), felhasználásra kész. 127-PKS-VPU/010512
3
1.
TÁROLÁS ÉS STABILITÁS
Anyag/Reagens Teszt kit
Állapot bontatlan
Mikrotiterlemez
bontott
Kontrollok Mosó puffer Mintahígító Konjugátum Antigénkonjugátum keverék TMB-szubsztrát Leállító oldat
Tárolás 2...8 °C
2...8 °C zacskóban szárítószerrel bontott 2...8 °C hígított 2...8 °C bontott 2...8 °C bontott 2...8 °C felhasználásr szobahımérséklet a kész
Stabilitás lejárati idı végéig 6 hét 6 6 6 6 6
hét hét hét hét óráig
bontott
2...8 °C
6 hét
bontott
2...8 °C
lejárati idı végéig
Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2.
SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK
2.1. Víz injekcióhoz (H2O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosó puffer hígításához. 2.4. Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. 37 °C-os inkubátor. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 - 650 nm szőrıkkel. 3.
A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE
A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát.
127-PKS-VPU/010512
4
3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiterlemez lyukai halvány zöld színőek. A lyukakban idınként elıforduló zöldes-barna elszínezıdést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja. 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 °C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel. 3.3. Antigén-konjugátum keverék Oldjuk fel a liofilizált antigént 2,0 ml antigén hígítóval. Óvatosan keverjük meg, ügyelve arra, hogy a kupakba tapadt részecskék is feloldódjanak. Adjunk 50 µl konjugátumot 2,0 ml antigénhez 60 perccel a felhasználás elıtt. Az antigén feloldása és a konjugátum hozzáadása után az antigénkonjugátum keverék piros lesz és felhasználásra kész. A felhasználásra kész antigén-konjugátum szobahımérsékleten tárolva (ld. 1).
6
óráig
használható
Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, konjugátum, antigén, antigén hígító) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a mintahígító, a mosó puffer, a TMB-szubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények pontos betartása esetén nyerhetık.
127-PKS-VPU/010512
csak
a
használati
utasítás
5
4.
MINTÁK
4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas. A beteg minták 7 napig tárolhatóak 2-8 ºC-on. Hosszabb tárolás ≤ -20 °C alatt. Kerüljük az ismételt felolvasztást és fagyasztást. 4.2. A szérumok elıkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroorganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:100 arányban hígítjuk a mintahígítóval. meghatározáshoz további hígításokat készíthetünk.
Titer
5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat. (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges. 5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl hígított mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kék/zöld-re változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahımérsékleten 30 percig nedves kamrában tarthatjuk. 5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 kamrában, vagy fóliával lezárva.
o
C-on (± 1 °C) nedves
5.4. Készítsük elı az antigén-konjugátum keveréket (ld. 3.3). 5.5. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosó pufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel!
127-PKS-VPU/010512
6
5.6. Adjuk az antigén-konjugátum keveréket (piros színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl antigén-onjugátum keveréket manuálisan dolgozzuk fel.
pipettázzunk
a
lyukakba,
ha
Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 µl antigén-onjugátum keveréket pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában elıforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük. 5.7. Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 nedves kamrában, vagy fóliával lezárva.
o
C-on (± 1
o
C)
5.8. Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.4.). 5.9. Adjunk 50 µl TMB-szubsztrát oldatot minden lyukba (A1-be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 oC-on (± 1 °C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik. 5.10.Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1-be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiterlemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni.
127-PKS-VPU/010512
7
5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Háttér (A1) -
Neg. kontroll Poz. kontroll Minta
Negatív kontroll 50 µl -
Pozitív kontroll 50 µl -
Minta 50 µl
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3x 200 µl mosóoldattal Antigén-konjugátum keverék
-
50/60 µl*)
50/60 µl*)
50/60 µl*)
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3x 200 µl mosóoldattal TMB-szubsztrát
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
Inkubáljuk 30 percig 37 °C-on sötétben Leállító oldat
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Fotometrikus leolvasás 450 nm-en (ref. 620 - 650 nm) *) Manuális/automatikus módszer (ld. 5.5.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) ∗
Olvassuk le az OD értékeket 450 nm-en (referencia hullámhossz 620 - 650 nm).
∗
Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl.
∗
A negatív kontrollok átlag OD értéke < 0,150. A pozitív kontrollok átlag OD értéke > 0,800. A cut-off = negatív kontrollok átlag OD értéke + 0,140 Szürke zóna = cut-off ± 10 % Ismételjük meg az eljárást, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak.
127-PKS-VPU/010512
8
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE /A MÓDSZER KORLÁTAI ∗
A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékő minták NEGATÍV-nak tekintendık.
∗
A szürke zónába esı OD értékő minták KÉTES-nek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében.
∗
A szürke zóna felsı határánál nagyobb OD értékő minták POZITÍVnak tekintendık.
∗
Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal, továbbá az EBNA-1 IgG, a VCA IgG eredményekkel és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni.
∗
Egyedi esetekben más herpeszvírusok elleni antitestekkel történı keresztreakció nem zárható ki.
∗
A nagyon nagy lipid koncentráció befolyása nem zárható ki.
6.C. A MEDAC KITEKKEL VÉGZETT EBV-SZEROLÓGIA DIAGNOSZTIKUS ÉRTELMEZÉSE Az eredményeknek a fertızés státuszára vonatkozó alábbi értelmezése csak immunkompetens egyénekben végzett vizsgálatokra érvényes. EBNA-1 IgG + -
VCA IgG +/±/+/±/-
VCA IgM +
Értelmezés szeronegatív régi fertızés elsıdleges fertızés
Minden más kombináció tisztázatlannak értelmezendı. Tisztázatlan eredmény esetén további differenciál diagnosztikai módszerek szükségesek az értelmezéshez. A tisztázatlan eredmények csökkentése érdekében a medac EBV ELISA panel használatát javasoljuk.
127-PKS-VPU/010512
9
7.
TELJESÍTİKÉPESSÉGI JELLEMZİK
Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS SPECIFICITÁS 352 szérumot vizsgáltak a diagnosztikus kiértékelés során. Az eredményeket Prof. Dr. Enders és munkatársai, Stuttgart laboratóriumában és az Institute of Virology of the University Homburg/Saar intézményben értékelték ki. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük: Elızetes definíció (IFA) negatív cut-off pozitív 237 0 11 1 0 1 1 0 101
negatív EBV VCA-IgM-ELA cut-off PKS medac pozitív
Érzékenység Specificitás Egyezés:
= 89,4 % = 99,2 % 96 %
7.B. PONTOSSÁG
Minta NC BC PC N° 1 N° 2 N° 3
Teszten belüli szórás CV átlag OD SD n (%) 0.069 0.012 17 23 0.456 0.013 3 23 2 23 1.361 0.030 0.050 0.005 10 23 0.839 0.029 3 23 1.981 0.033 2 23
Tesztek közötti szórás Minta NC BC PC N° N° N° N° N°
4 5 6 7 8
átlag OD
SD
CV (%)
n
0.070 0.441 1.282 0.076 0.392 0.769 1.160 1.884
0.010 0.019 0.057 0.010 0.037 0.046 0.051 0.064
14 4 4 13 9 6 4 3
12 12 12 12 12 12 12 12
NC = negatív kontroll, BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza), PC = pozitív kontroll;
127-PKS-VPU/010512
10
ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK ∗
A kereszt szennyezés elkerülése fiolákat és kupakjaikat.
érdekében
ne
cseréljük
fel
a
∗
A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében.
∗
Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében.
∗
Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is).
EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK ∗
A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani.
∗
Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAg-ra, HIV-1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erısen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk.
MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes Az ilyen hulladékok megsemmisítése a hulladéknak tekintendık. nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: 01.05.2012
127-PKS-VPU/010512
11
IRODALOM Bauer, G.: Epstein-Barr-Virus – Bedeutung und Möglichkeiten der Labordiagnostik. Therapeutische Umschau 51(8), 558-562 (1994). Bauer, G.: The rational basis for efficient Epstein-Barr Virus (EBV) serology. Clin. Lab. 41(9), 623-634 (1995). Hille, A., Klein, K., Baumler, S., Grasser, F.A., Mueller-Lantzsch, N.: Expression of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1, 2A and 2B in the baculovirus expression system: serogical evaluation of human antibodies to these proteins. J. Med. Virol. 39 (3), 233-241 (1993). Linde, A.: Diagnosis of Epstein-Barr Virus - related diseases. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100, 83-88 (1996). Mertens, T., Haller, O., Klenk, H.-D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten. 65-70, Urban & Fischer Verlag (2004). Modrow, S., Falke, D. (Hrsg.): Molekulare Virologie. 454-460, Spektrum Akademischer Verlag (1997). Prang, N.S., Schwarzmann, F.: Aktuelle Perspektiven in der Diagnostik Epstein-Barr-Virus assoziierter Erkrankungen. Immun. Infekt. 4, 144151 (1997).
127-PKS-VPU/010512
12
