CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Magyar
0123
110-PKS-VPU/010512
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg
FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D-22880 Wedel Tel.: Fax:
++49/ 4103/ 8006-351 ++49/ 4103/ 8006-359
RENDELÉSI CÍM Tel.: Fax:
++49/ 4103/ 8006-111 ++49/ 4103/ 8006-113
110-PKS-VPU/010512
CMV-IgM-ELA Test PKS medac
Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, cytomegalovirus (CMV) elleni IgM antitestek kimutatására
Katalógusszám: 110-PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA!
BEVEZETÉS A Cytomegalovirus (CMV) a humán patogén Herpesviridae családba tartozik, melyet dupla szálú DNS genom jellemez. Ezekre a vírusokra jellemző, hogy latensen perzisztál a szervezetben az elsődleges fertőzés után. Ezért a vírus reaktivációja bizonyos körülmények között előfordulhat. A CMV fertőzés immunokompetens egyénekben rendszerint tünetmentes. Azokban az egyénekben, akik immunszuppresszáltak (pl. transzplantáltak, HIV fertőzöttek, tumoros betegek, újszülöttek) komoly tünetek variációja észlelhető. A CMV egyike a leggyakoribb patogéneknek prenatális fertőzésekben, mely komoly rendellenességeket okozhat, szintén beleértve a késői károsodásokat olyan gyerekekben, melyek tünetek nélkül születtek. A CMV-IgM-ELA Test PKS medac CMV IgM specifikus antitestek kimutatására használható szérum mintákban. Akut CMV fertőzés IgM antitestek kimutatásával demonstrálható. Figyelemmel kell lenni arra, hogy IgM antitestek nem minden esetben termelődnek. Immunszuppresszált betegek esetében például a reaktiváció és újrafertőződés során az IgM antitestek ritkán mutathatóak ki.
110-PKS-VPU/010512
1
A TESZT ELVE
A lemez anti-humán globulinnal van bevonva.
A mintában levő kötődik a lyukakhoz.
IgM
IgM
immuno-
szelektíven
A CMV-specifikus IgM antitestek kötődnek a peroxidázzal jelzett CMV antigénhez (AG = antigen, P = peroxidase).
Inkubáció a TMB-szubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le.
A teszt előnyei Nincs nem-specifikus reakció és nincs a reumatoid faktor által okozott álpozitív reakció. A magas IgG titer nem blokkolja az IgM antitesteket. A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetővé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhető csíkok felhasználását.
lehetővé
teszik
a
teszt
gazdaságos
Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerű ELISA készülékeken. 110-PKS-VPU/010512
2
A KIT TARTALMA Katalógusszám: 110-PKS 1.
MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (jelölés: CMM, kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhető, Ualakú, kecske anti-humán IgM immunoglobulinnal bevont, BSA és pH indikátor, felhasználásra kész.
2.
Control Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
3.
Control + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSA-t, fenolt, ProClinTM 300-at és gentamycin szulfátot tartalmaz.
4.
WB Mosó puffer: 1 flakon, ProClinTM 300 tartalmú.
5.
100
ml,
PBS/Tween
(10x),
7,2 –
7,4,
7,2 –
7,4,
VIR-DIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, felhasználásra kész, ProClinTM 300 tartalmú.
6.
pH
pH
ANTIGEN CMV-IgM-ELA (Enzim jelzett antigén): 2 fiola, mindegyik 5,0 ml, liofilizált, FCS-t tartalmaz, piros színű, HRP-vel konjugált.
7.
TMB TMB-szubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész.
8.
STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H2SO4), felhasználásra kész.
110-PKS-VPU/010512
3
1.
TÁROLÁS ÉS STABILITÁS
Anyag/Reagens Teszt kit
Állapot bontatlan
Tárolás 2...8 °C
Mikrotiterlemez
bontott
Kontrollok Mosó puffer Minta hígító CMV-IgM-ELA
bontott hígított bontott feloldott
TMB-szubsztrát Leállító oldat
bontott bontott
2...8 °C zacskóban szárítószerrel 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C -18 °C * 2...8 °C 2...8 °C
*
Osszuk le aliquot fagyasszuk.
részekre
és
felengedés
Stabilitás lejárati idő végéig 6 hét
6 hét 6 hét 6 hét 5 nap 6 hét 6 hét lejárati idő végéig után mégegyszer
ne
Ne használjuk a reagenseket a lejárati időn túl.
2.
SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK
2.1. Víz injekcióhoz (H2O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, hígításához.
vagy
műanyag
edények
a
mosó
puffer
és
a
minták
2.4. Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. Inkubátor, 37 °C. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 - 650 nm szűrőkkel.
3.
A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE
A mérés megkezdése előtt az összes komponenst szobahőmérsékletűre kell hozni a kondenzáció elkerülése érdekében. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát.
110-PKS-VPU/010512
4
3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színűek. A lyukakban időnként előforduló zöldes-barna elszíneződést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítőképességét nem befolyásolja. 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minőségű vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) előforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 °C) és/vagy szobahőmérsékleten keveréssel. 3.3. CMV-IgM-ELA A liofilizált CMV-IgM-ELA konjugátumot oldjuk fel 5 ml mintahígítóban. Óvatosan keverjük és ügyeljünk arra, hogy a dugóba ragadt részecskék is feloldódjanak. A CMV-IgM-ELA feloldás után piros színű és felhasználásra kész. Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, CMV-IgM-ELA) a különböző gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a minta hígító, a mosó puffer, a TMB-szubsztrát és a leállító oldat általában cserélhető az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények pontos betartása esetén nyerhetők. 4.
csak
a
használati
utasítás
MINTÁK
4.1. A kit szérum minták vizsgálatára alkalmas. A beteg minták 7 napig tárolhatóak 2-8 ºC-on. Hosszabb tárolás ≤ -20 °C alatt. Kerüljük az ismételt felolvasztást és fagyasztást. 4.2. A szérumok előkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroroganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A mintákat 1:100-szorosra kell hígítani mintahígítóval. A minták tovább hígíthatóak titer meghatározáshoz.
110-PKS-VPU/010512
5
5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a smítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, előmosás nem szükséges. 5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 μl hígított mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kékre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahőmérsékleten 30 percig nedves kamrában, illetve 60 percig 2 - 8 °C-on tarthatjuk. 5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig ( 5 perc) ( 1 °C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva.
37
o
C-on
5.4. Oldjuk fel a CMV-IgM-ELA-t (ld. 3.3.). 5.5. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 μl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szűrőpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel! 5.6. Adjunk CMV-IgM-ELA-t (piros színű) minden lyukba (kivétel A1). 50 μl ELA-t pipettázzunk a lyukakba, ha manuálisan dolgozzuk fel. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 μl ELA-t pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában előforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerősítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban működő automatával való kompatibilitást ellenőrizzük. 5.7. Inkubáljuk újra 60 percig ( 5 perc) 37 kamrában, vagy fóliával lezárva.
o
C-on ( 1 °C) nedves
5.8. Az inkubáció után mossuk a lemezt újra (ld. 5.5.).
110-PKS-VPU/010512
6
5.9. Adjunk 50 μl TMB-szubsztrát oldatot minden lyukba (A1-be is) és inkubáljuk 30 percig ( 2 perc) 37 oC-on ( 1 °C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik. 5.10. Állítsuk le a reakciót 100 μl leállító oldattal minden lyukba (A1-be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás előtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegőbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 5.B.
AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN
Negatív kontroll Pozitív kontroll Minta
Háttér (A1) -
Negatív kontroll 50 μl -
Pozitív kontroll 50 μl -
Minta 50 μl
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 μl mosóoldattal CMV-IgM-ELA
-
50/60 μl*)
50/60 μl*)
50/60 μl*)
Inkubáljuk 60 percig 37 °C-on, majd mossuk 3 x 200 μl mosóoldattal TMB-szubsztrát
50 μl
50 μl
50 μl
50 μl
Inkubáljuk 30 percig 37 °C-on sötétben Leállító oldat
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
Fotometrikus leolvasás 450 nm-en (ref. 620 - 650 nm) *) manuális/automatikus eljárás (ld. 5.6.)
110-PKS-VPU/010512
7
6.A.
AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG)
Olvassuk le az OD értékeket 450 nm-en (referencia hullámhossz 620 - 650 nm).
Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékből.
A negatív kontroll átlagos OD értéke < 0,100 legyen. A pozitív kontroll átlagos OD értéke > 0,800 legyen.
Cut-off = negatív kontroll átlag OD értéke + 0,140
Szürke zóna = Cut-off 10 % Ismételjük meg a vizsgálatot, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak.
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE
A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékű minták NEGATÍV-nak tekintendők.
A szürke zónába eső OD értékű minták KÉTES-nek tekintendők. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal később friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében.
A szürke zóna felső határánál nagyobb OD értékű minták POZITÍVnak tekintendők.
Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal és diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni.
Egyéb Herpesvírusok elleni antitestekkel bizonyos esetekben nem zárható ki.
A negatív mintákban előforduló nagyon nagy koncentrációjú lipidek álpozitív reakciót eredményezhetnek. A Hemoglobin, vagy Bilirubin nagy koncentrációja nem befolyásolja az eredményeket.
110-PKS-VPU/010512
való
további
keresztreakció
8
7.
TELJESÍTŐKÉPESSÉG
Az alábbi teljesítőképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során.
7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS FAJLAGOSSÁG 482, véradóktól és betegektől származó szérum mintát vizsgáltak a CMVIgM-ELA Test PKS medac teszttel, összehasonlítva egy a laborokban rutinban használt magas specificitású ELISA teszttel. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.
Referencia teszt
CMV-IgM-ELA Test PKS
negatív
pozitív
negatív
314
1
pozitív
1
166
Érzékenység = 99,40 % Fajlagosság = 99,68 % Pozitív prediktív érték: 99,40 % Negatív prediktív érték: 99,68 %
7.B. Minta
NC BC PC N° 1 N° 2 N° 3
PONTOSSÁG Teszten belüli szórás átlag OD 0,034 0,314 2,269 0,049 0,317 2,673
Minta
SD
CV (%)
n
0,005 0,013 0,048 0,008 0,023 0,086
15 4 2 16 7 3
24 24 24 27 27 27
NC BC PC N° N° N° N°
4 5 6 7
Tesztek közötti szórás (n = 11) átlag SD CV (%) OD 0,050 0,010 20 0,230 0,021 9 1,456 0,064 4 0,058 0,007 12 0,264 0,037 14 0,271 0,039 14 1,788 0,073 4
NC = negatív kontroll; BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza); PC = pozitív kontroll
110-PKS-VPU/010512
9
ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK
A kereszt szennyezés elkerülése fiolákat és kupakjaikat.
A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében.
Használat után a reagenseket az előírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében.
Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekből, illetve gyártásból származó reagensekkel történő felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is).
érdekében
ne
cseréljük
fel
a
EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK
A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani.
Az emberi eredetű reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAg-ra, HIV-1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erősen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredetű reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertőzőként kezeljük és az összes szükséges elővigyázatossággal használjuk.
MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendők. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és előírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelő cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében.
A kibocsátás dátuma: 01.05.2012
110-PKS-VPU/010512
10
IRODALOM Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban und Schwarzenberg, München, 9-30 (1990). Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at the 5th Int. Cytomegalovirus Conference (1995). Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der Cytomegalievirus-Infektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern in Serumproben von immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9), 480-484 (1996). Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag, 279-290 (1996). Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solid-phase enzyme immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol. 5, 629-634 (1977). Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G. and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy. Arch. Virol. 53, 177-184 (1977). Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an Enzyme-Labelled Antigen (ELA). J. Gen. Virol. 50, 59-68 (1980). Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, 585-589 (1991). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or long-term human Cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme immunoassays for the detection of HCMV-specific IgM antibody. Clin. Diagn. Virol. 2, 245-259 (1994).
110-PKS-VPU/010512
11
