CMV-IgA-ELA Test PKS medac
Český
0123
112-PKS-VPCZ/010512
VÝROBCE: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg
MARKETING: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D-22880 Wedel Tel.: Fax:
++49/ 4103/ 8006-351 ++49/ 4103/ 8006-359
ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK: Tel.: Fax:
++49/ 4103/ 8006-111 ++49/ 4103/ 8006-113
112-PKS-VPCZ/010512
CMV-IgA-ELA Test PKS medac Enzymoimunologický test se systémem kontroly pipetování na průkaz protilátek IgA proti cytomegalovirus (CMV) Katalogové číslo: 112-PKS POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO
ÚVOD Cytomegalovirus (CMV) patří do skupiny lidských patogenních herpetických vírů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyhle viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít k reaktivaci viru. Infekce cytomegalovirem probíhají u imunokompetentních osob obyčejně nenápadně. U imunosupresivních osob (např. pacienti po transplantaci, lidé infikovaní virem HIV, tumoroví pacienti nebo novorozenci) se však pozorují závažně symptomy nejrůznějšího druhu. Obyvlášť důležitý je CMV jako častý agens prenatálních infekcí. Tyto infekce mohou způsobit závažné poškození dítěte, přičemž nelze vyloučit pozdní poruchy také u dětí narozených bez symptomů. Specifické protilátky IgA proti CMV byli detekovány v sérech pacientů po transplantaci orgánů a korelovali s nálezem specifických protilátek IgM proti CMV. Protilátky IgA proti CMV mohou být z toho důvodu považovány za markry akutních infekcií. Kombinace detekce specifických protilátek IgA proti CMV společně s průkazem antigenu a průkazem specifických protilátek IgM proti CMV vedla u pacientů po transplantaci orgánů ke zvýšení specifity diagnózy infekce CMV.
112-PKS-VPCZ/010512
1
PRINCIP TESTU
Mikrotitrační deštička je pokryta protihumánním IgA.
Frakce IgA ze vzorek séra se váže na mikrotitrační deštičku.
Protilátky proti anti-CMV-IgA se vážou na peroxidázou konjugované CMV-IgA-ELA (AG = antigen, P = peroxidáza).
Inkubace se substrátem TMB (*). Reakce se zastaví přidáním kyseliny sírové. Absorpce se odčítá foto-metricky.
Výhody testu
Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky způsobené revmatoidními faktory.
Nedochází k blokování protilátek IgA vysokým titrem IgG.
Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat krok pipetování, při kterém dochází ke změnám barev.
Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu.
Testy lze automatizovat pro otevřené zařízení ELISA. 112-PKS-VPCZ/010512
každý
2
OBSAH SOURAVY Katalogové číslo: 112-PKS 1.
MTP Mikrotitrační destička: 12 proužků po 8 jamkách (označená jako CMA, s desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokrytá kozími protilátkami proti IgA, BSA a indikátorem pH, připravená k použití.
2.
CONTROL Negativní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClinTM 300 a gentamycin sulfát.
3.
CONTROL + Pozitivní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClinTM 300 a gentamycin sulfát.
4.
WB Promývací roztok: 1 lahvička s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), pH 7,2 - 7,4, obsahuje ProClinTM 300.
5.
VIR-DIL Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, pH 7,2 - 7,4, připravený k použití, obsahuje ProClinTM 300.
6.
ANTIGEN CMV-IgA-ELA (enzymem označený antigen): 4 lahvičky každá s obsahem po 5,0 ml, lyofilizovaný, zbarvený žlutě, obsahuje FKS, konjugovaný HRP.
7.
TMB Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravený k použití.
8.
STOP Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem každá po 11 ml, 0,5 M kyselina sírová (H2SO4), připravený k použití.
112-PKS-VPCZ/010512
3
1.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
Materiál/Reagencie Zkušební souprava
Stav Skladování neotevřená 2...8 °C
Mikrotitrační destička
otevřená
Kontroly Promývací roztok Roztok na ředění vzorků CMV-IgA-ELA Substrát TMB Roztok na zastavení reakce
2...8 °C v sáčku s desikantem otevřené 2...8 °C Zředěný 2...8 °C otevřený 2...8 °C rozpuštěný 2...8 °C otevřený 2...8 °C otevřený 2...8 °C
Stabilita do uplynutí použitelnosti 6 týdnů
6 týdnů 6 týdnů 6 týdnů 5 dní 6 týdnů do uplynutí použitelnosti
Nepoužívejte reagencie po uplynutí data jejich použitelnosti.
2.
DALŠÍ
POŽADOVANÉ REAGENCIE
A MATERIÁLY
2.1. Aqua ad iniectabilia (redestilovaná). Použití pouze deionizované vody může negativně ovlivnit výsledek testu. 2.2. Mikropipety pro potřebné objemy. 2.3. Čisté skleněné nádoby promývacího roztoku.
na
ředění
2.4. Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních destiček multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISA).
(např.
2.5. Inkubátor pro 37 2.6. Fotometr na 620 - 650 nm.
3.
o
nebo
nádoby
z umělé
hmoty
C.
mikrotitrační
destičky
s filtry
na
450
nm
a
PŘÍPRAVA REAGENCIÍ
Před zahájením testu vytemperujte všechny teplotu, aby nedocházelo ke kondenzaci.
komponenty
na
pokojovou
Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek.
112-PKS-VPCZ/010512
4
3.1. Mikrotitrační destička Hliníkový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření opět pevně uzavřít. Skladování a životnost nepoužitých mikrotitračních jamek jsou uvedeny pod bodem 1. Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín. Rovněž se objevující zeleno-hnědé skvrny v jamkách jsou způsobené zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a výsledek testu. 3.2. Promývací roztok Zmíchejte jednu objemovou (10x) s devíti částmi koncentrátu roztoku (10x) jamek budete potřebovat roztoku.
část koncentrátu promývacího roztoku aqua ad iniectabilia (např. 50 ml s 450 ml aqua ad iniectabilia). Na 8 10 ml zředěného roztoku promývacího
Krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit zahřáním (max. na 37°C) nebo promícháním při pokojové teplotě. 3.3. CMV-IgA-ELA Lyofilizát zřeďte s 5,0 ml roztoku na ředění vzorků. Uzavřená lahvička se musí lehce potřást, aby se částice z uzávěru dostali do roztoku. Po rozpuštění je CMV-IgA-ELA zbarvený žlutě a hotový k použití. Reagencie jednoho testu (mikrotitrační destička, kontroly, CMV-IgAELA) se nesmí zaměňovat s reagenciemi jiných šarží. Oproti tomu se roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a roztok na zastavení reakce u všech virologických testů firmy medac mohou principiálně zaměňovat. Reagencie jiných výrobců se obecně v tomto testu nesmí používat. Pouze při přesném dodržení reprodukovatelné výsledky.
4.
pracovních
předpisů
obdržíte
validní
a
VZORKY
4.1. Test je vhodný pro vzorky séra. Vzorky pacientů uchovávejte maximálně 7 dní při teplotě 2–8 °C. Delší uchovávaní se musí provádět při teplotě ≤ -20 °C. Vzorky se nesmí opakovaně zamrazovat a odmrazovat.
4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu séra např. deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminované mikroorganismami ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty. 112-PKS-VPCZ/010512
5
4.3. Séra rozřeďte v poměru 1:100 roztokem na ředění určení titru se vzorky mohou dále libovolně ředit.
vzorek.
Pro
5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Otevřete obal mikrotitrační deštičky a vyberte požadovaný počet mikrotitračních proužků (viz 3.1.). Mikrotitrační promývat.
deštičky
jsou
připraveny
k
použití
a
nemusí
se
5.2. Jamku A1 nechte prázdnou (viz 6.A.) pro určení pozadí. Do jamek na destičce napipetujte 50 µl zředěných vzorek, v duplikátech negativní kontrolu a pozitivní kontrolu. Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé jamce nezbarví, znamená to, že do ni nebyl napipetován vzorek nebo kontroly. V případě potřeby se může mikrotitrační deštička před zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně 30 minut při pokojové teplotě nebo při 2 - 8 °C maximálně po dobu 60 minut. 5.3. Inkubujte deštičku 60 minut ( 5 minuty) při 37 komora nebo inkubační fólie).
o
C (± 1
o
C) (vlhká
5.4. Rozpusťte CMV-IgA-ELA (viz 3.3). 5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 μl promývacího roztoku. Po dobu promývaní dbejte na to, aby se jamky pořádně naplnily. Po promytí vyklepete mikrotitrační deštičku na filtračním papíru. Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě ! 5.6. Do každé žlutě).
jamky
napipetujte
(kromě
A1)
CMV-IgA-ELA
(zbarvený
Při manuálním zpracování testu napipetuje do každé jamky 50 μl konjugátu. Upozornění: Při práci na automatizovaných přístrojích je potřebné naprogramovat 60 μl pro každou jamku, protože v inkubačních komorách těchto zařízení dochází k intenzivnímu vypařování.
112-PKS-VPCZ/010512
6
V rámci validace testu pro automatické zpracování se ukázalo, že tento test je v podstatě vhodný také pro automatické zpracování. Nicméně doporučujeme verifikovat jeho kompatibilitu s přístrojem, na kterém se bude pracovat. 5.7. Znovu inkubujte 60 minut ( 5 minuty) při 37 komora nebo inkubační fólie).
o
C (± 1
o
C) (vlhká
5.8. Po inkubaci promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5.). 5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 µl substrátu TMB a inkubujte 30 minut ( 2 minuty) ve tmě při teplotě 37 °C (± 1 oC) vlhká komora nebo inkubační fólie). Pozitivní vzorky se zbarví modře. 5.10.Přidáním 100 µl roztoku na zastavení reakce do každé jamky (včetně A1) se reakce zastaví. Modré zbarvení vzorek se změní na žluté. Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a zkontrolujte, zda-li v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Odečtení je nutno zastavení reakce.
provádět
během
15
minut
112-PKS-VPCZ/010512
po
přidání
roztoku
na
7
5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU Prázdná jamka (A1)
Negativní kontrola
Pozitivní kontrola
Vzorky
-
50 μl -
50 μl -
50 μl
Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku CMV-IgA-ELA
50/60 μl*)
-
50/60 μl*)
50/60 μl*)
Inkubujte 60 minut při teplotě 37 °C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku 50 μl
Substrát TMB
50 μl
50 μl
50 μl
Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 °C Roztok na zastavení reakce
100 μl
100 μl
100 μl
100 μl
Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. délka 620 - 650 nm) *) manuální/automatický postup (viz 5.6.)
6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA)
Fotometrické vyhodnocení se provází při (referenční vlnová délka 620 - 650 nm).
Od všech hodnot OD
Kritéria validity - Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,150. - Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,600.
vlnové
délce
450
nm
odečtěte OD pozadí (A1 jamka).
Pokud kriteriá validity najsou splnena, musí se test opakovat.
Cut-off = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140
Šedá zóna = cut-off 10 %.
112-PKS-VPCZ/010512
8
6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Vzorky s hodnotami OD pod spodní hranicí šedé zóny se hodnotí jako NEGATIVNÍ.
Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se hodnotí jako HRANIČNÍ. Tyhle séra se musí opět zkontrolovat po 14 dnech společně s nověodebraným vzorkem, aby se zjistil pohyb titru.
Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako POZITIVNÍ.
Výsledky testu se musí interpretovat vždycky společně s klinickým obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry.
Bylo sledovaných 59 potenciálně křížově reaktivních sér. Žádné z nich nebylo reaktivní v testu IgA.
Velmi vysoké hodnoty lipidů výsledky zkreslit. Vysoké hodnoty hemoglobinu a testu.
7.
mohou
v jednotlivých
bilirubinu
neovlivňují
případech výsledky
CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU
Při diagnostické evaluaci jsme zjistili následující charakteristické vlastnosti testu.
7.A. SPECIFITA Z celkově 300 sér od dárců krve bylo testem CMV-IgA-ELA Test PKS medac 296 sér detekovaných jako negativní. Zbývající čtyři séra – tři z nich hraniční a jedno slabě pozitivní v testu IgA – ukazovali všechny vysoké titry CMV-IgG, jedno sérum dokonce pozitivní CMV-IgM. V jiném porovnávacím referenčním testu bylo z těch samých 300 sér 284 negativních, 2 hraničních a 14 pozitivních.
112-PKS-VPCZ/010512
9
7.B. CITLIVOST Z celkově 105 sér, které byli uvedeným referenčním testem určené jako CMV-IgA pozitivní, detekoval test CMV-IgA-ELA PKS medac 101 sér jako pozitivní, 2 jako hraniční a 2 jako negativní. To odpovědá relativní citlivosti 96,2 %.
7.C. PŘESNOST Vzorky
NK SP PK Č. 1 Č. 2 Č. 3
Variace (n střední OD 0,047 0,341 1,601 0,047 0,223 2,473
intraassay = 24) SP CV (%) 0,007 15 0,014 4 0,047 3 0,006 13 0,010 4 0,052 2
Vzorky
NK SP PK Č. 1 Č. 2 Č. 3
Variace interassay (n = 11) střední OD SP CV (%) 0,044 0,005 11 0,276 0,034 12 1,391 0,119 8 0,052 0,008 15 0,201 0,020 10 2,184 0,187 9
NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnutá v soupravě); PK = pozitivní kontrola
VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCI SE MANIPULACE
Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých nezaměňujte lahvičky a jejich šroubové uzávěry.
Reagencie je potřebné ihned po použití uzavřít, k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci.
Po skončení testu se musí reagencie uložit tak, jak je uvedené v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost.
Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3.).
112-PKS-VPCZ/010512
reagencií, aby
nedošlo
10
INFORMACE TÝKAJÍCI SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ
Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti práce.
Reagencie lidského původu byli testovány na HBsAg, na protilátky proti HIV 1/2 a protilátky proti HCV a bylo zjištěno, že nejsou reaktivní. Přesto se musí s těmito reagenciemi a také s těmi, které obsahují součásti zvířecího původu, (viz obsah soupravy), pracovat jako s potencielně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy.
RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACIE Zbytky chemikálií a preparátů jsou všeobecně považovány za speciální odpad. Likvidace tohoto druhu odpadu se řídí národními a regionálními zákony a předpisy. Obraťte se na orgány místní správy nebo na organizace zabývající se odpady, které vám podají informace, jak tyhle nebezpečné odpady likvidovat.
Datum vydání: 01.05.2012
112-PKS-VPCZ/010512
11
LITERATURA Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDS-Forschung (AIFO), Heft 11, 634-638 (1987). Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A., Doerr, H. W.: Immunoglobulin A and M patterns to human cytomegalovirus during recurrent infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J. Virol. Methods 43, 65-76 (1993). Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system, compartment. Thesis European Medical Press (1985).
its
vascular
Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV) diagnostic potential of IgA class and IgG subclass-specific antibodies. Infection 15, 93-98 (1987). Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E., Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G and M to cytomegalovirus during recurrent infection in recipients of allogenic bone marrow transplantation. J. Infect. Dis. 163, 628-630 (1991). Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels, R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg, H., Saah, A. J.: Cytomegalo-virus IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV related diseases in homosexual men. J. Med. Virol. 35, 174-179 (1991). Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et al.: Virus-specific antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G and A in cytomegalovirus infections. Infect. Immun. 42, 237-244 (1983). Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti, M., Negro Ponzi, A.: CMV-specific polymeric and monomeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., Vol. 33, Nr. 4, 173-179 (1991). Nielsen, L. N., Sorensen, I., Andersen, H. K.: Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A, and G in congenital primary, and secondary cytomegalovirus infection studied by antibody-captured enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26, 654-661 (1988). Porath, A., Hanuka, N., Keynan, A., Sarov, I.: Virus-specific IgG, IgM, and IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol. 22, 223-230 (1987).
112-PKS-VPCZ/010512
12
Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of cytomegalovirus infection in renal and heart transplant recipients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 653-659 (1997). Sarov, I., Siqueira-Linhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard, M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J. P.: Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cyto-megalovirus infection. Intervirology 15, 228-234 (1981). Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virol. Methods 6, 161-169 (1983). Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytomegalovirus infections. Arch. Virol. 82, 173-180 (1984). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U., Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or long-term human cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Torfason, E. G., Källänder, C. and Halonen, P.: Solid-phase radioimmunoassay of serum IgG, IgM and IgA antibody to cytomegalovirus. J. Med. Virol. 7, 85-96 (1981). Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., Doerr, H. W. : Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects. Clin. Investig. 70, 503-507 (1992). Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol. 40, 28-34 (1993).
112-PKS-VPCZ/010512
13
