Základy analýzy potravin Přednáška 11

Základy analýzy potravin

Přednáška 11

LIPIDY Analytické úkoly: • • • • • • • •

izolace lipidů stanovení celkového obsahu lipidů (stanovení tuku) charakterizace tuku stanovením tukových čísel stanovení frakcí lipidů • triacylglyceroly, vosky • fosfolipidy... stanovení složení mastných kyselin stanovení stupně žluklosti tuku stanovení oxidační stability stanovení doprovodných látek lipidů

1


Přednáška 11

IZOLACE A STANOVENÍ TUKU Obvyklý postup izolace a vážkového stanovení tuku • příprava vzorku k extrakci tuku (uvolnění tuku z vazby na bílkoviny a sacharidy – hydrolýza a dále vysušení vzorku) • extrakce tuku nepolárním až středně polárním rozpouštědlem • odpaření rozpouštědla z extraktu a zvážení odparku Tuk = všechny nepolární netěkavé látky extrahované ze vzorku nepolárním rozpouštědlem (petrolether, hexan, diethylether...) Provedení extrakce • extrakce tuhého vzorku umístěného v extrakční patroně kondenzátem par rozpouštědla (Soxhletův nebo Twisselmannův extraktor) • extrakce varem v rozpouštědle s následným promýváním kondenzátem rozpouštědla (zařízení Soxtec) • extrakce tuhého vzorku v uzavřené nádobě velkým přebytkem rozpouštědla (např. při metodě dle Folche) • extrakce kapalina – kapalina v uzavřené nádobě (např. v přístroji pro extrakci dle Röseho a Gottlieba)

2


Přednáška 11

Některé extrakční metody stanovení tuku Metoda dle Soxhleta spočívá v extrakci (rozemletého a vysušeného) vzorku (příp. rozmíchaného s mořským pískem) hexanem, petroletherem nebo diethyletherem v Sohletově nebo Twisselmannově extraktoru po dobu 4-6 hod. Z extraktu ve varné baňce se odpaří rozpouštědlo (vakuová odparka, sušárna 103°C) a odparek se zváží. Použití: materiály s vysokým obsahem tuku, malým obsahem vody a sacharidů (olejniny) Postup dle Grossfelda (Použití: cereální materiály...) • částečná hydrolýza vzorku kys. chlorovodíkovou • filtrace, promytí vodou, vysušení • extrakce vysušeného vzorku dle Soxhleta Metoda dle Folche Použití: vzorky s vysokým obsahem bílkovin (maso) • • • •

extrakce směsí CHCl3 – CH3OH (2:1) homogenizací za studena filtrace reextrakce filtrátu vodou odpaření rozpouštědla z organické fáze, zvážení

Metoda dle Röseho a Gottlieba Použití: mléko, syrovátka, podmáslí... (rozhodčí metoda) • hydrolýza bílkovin amoniakem, přídavek ethanolu • opakovaná extrakce směsí petrolether – diethylether • odpaření rozpouštědla, zvážení odparku 3


Přednáška 11

Další metody stanovení tuku hlavní výhoda: rychlost stanovení Butyrometrická metoda Použití: mléko, mléčné výrobky • přídavkem H2SO4 se rozpustí bílkoviny v obalu tukových kuliček • uvolněný tuk se odstředí (přídavkem amylakoholu se dosáhne ostrého rozhraní) a v kalibrované části butyrometru se odečte objem tuku (butyrometr je cejchován v % tuku)

Denzitometrická metoda Použití: semena olejnin • homogenizace vzorku s 1,2-dichlorbenzenem • filtrace • stanovení hustoty filtrátu ⇒ odečtení obsahu tuku z tabulky (nutná kalibrace pro každý druh materiálu) NIR spektrometrie Použití: vzorky s obsahem tuku nad 0,2 % • měření log (1/R) tuhého vzorku 800-2500 nm • signály –CH2 – skupin mastných kyselin 1200, 1734, 1765, 2310, 2345 nm • individuální kalibrace pro každý typ vzorku 1

H-NMR spektrometrie 4


Přednáška 11

STANOVENÍ TUKOVÝCH ČÍSEL slouží k charakterizaci vlastností tuku Vlastnost tuku obsah volných mastných kyselin obsah veškerých mastných kyselin obsah esterově vázaných mastných kyselin obsah hydroxylových skupin obsah dvojných vazeb obsah polyenových kyselin

Ukazatel číslo kyselosti číslo zmýdelnění esterové číslo hydroxylové číslo jodové číslo rhodanové číslo

Číslo kyselosti je mírou obsahu volných mastných kyselin v tuku; vyjadřuje se jako hmotnost KOH (v mg) potřebného k neutralizaci kyselin obsažených v 1 g tuku Stanovení čísla kyselosti • rozpuštění tuku ve směsi ethanol – diethylether (1+1) • titrace alkoholickým roztokem KOH (c = 0,1 mol/l) na fenolftalein nebo thymolftalein číslo kyselosti = 56,11 . cKOH . VKOH / mv

[mg/g]

Poznámka: od spotřeby odměrného roztoku při titraci vzorku je třeba odečíst spotřebu při titraci slepého pokusu

Přípustné hodnoty čísla kyselosti sádlo max. 1,3 olivový olej panenský max. 6,6 rostlinné oleje rafinované max. 0,6

5


Přednáška 11

Číslo zmýdelnění se vyjadřuje jako hmotnost KOH (v mg) potřebného k neutralizaci mastných kyselin a hydrolýze (zmýdelnění) jejich esterů v 1 g tuku Stanovení čísla zmýdelnění • vzorek tuku se neutralizuje a hydrolyzuje varem (pod zpětným chladičem) s nadbytkem 0,5M alkoholického roztoku KOH • přebytek KOH se stanoví titrací roztokem HCl číslo zmýdelnění = 56,11 . cHCl . (V1-V2) / mv

[mg/g]

V1 je spotřeba při titraci slepého pokusu V2 je spotřeba při titraci vzorku Typické hodnoty čísla zmýdelnění sádlo olivový olej slunečnicový olej podzemnicový olej sójový olej řepkový olej

192-203 184-196 188-194 187-196 189-195 168-193

Esterové číslo vyjadřuje obsah esterově vázaných mastných kyselin; udává se jako hmotnost KOH (v mg) potřebného k hydrolýze esterů mastných kyselin obsažených v 1 g tuku esterové číslo = číslo zmýdelnění – číslo kyselosti Násobením esterového čísla faktorem 0,547 se vypočte obsah vázaného glycerolu v tuku (v mg/g)

6


Přednáška 11

Hydroxylové číslo se používá k vyjádření obsahu parciálních esterů glycerolu v tuku; vyjadřuje se jako hmotnost KOH (v mg) ekvivalentní obsahu hydroxylových skupin Titrační stanovení hydroxylového čísla parciální estery glycerolu obsažené v tuku se acetylují acetanhydridem O

O

CH2

O

C O

R

CH

O

C

R

CH2

OH

+

(CH3CO)2O

CH2

O

C O

R

CH

O

C O

R

CH2

O

C

CH3

+

CH3COOH

acetylovaný tuk se oddělí od acetanhydridu a octové kyseliny extrakcí hexanem a promytím organické fáze vodou. V acetylovaném vzorku se stanoví číslo zmýdelnění. Hydroxylové číslo se vypočte jako rozdíl čísel zmýdelnění acetylovaného a původního tuku. Spektrofotometrické stanovení hydroxylového čísla zvýšení obsahu esterových skupin po acetylaci parciálních esterů glycerolu se určí na základě těchto kroků: 1. konverze esterů glycerolu na hydroxamové kyseliny reakcí s NH2OH v alkalickém prostředí O CH2

O

C O

R NOH

CH

O

C O

R

CH2

O

C

CH3

+

3 NH2OH

2 R

C

OH

CH2OH

NOH

+

CH3

C

OH

+

CHOH CH2OH

2. tvorba barevných komplexů hydroxamových kyselin s Fe3+ a spektrofotometrické měření (530 nm) 7


Přednáška 11

Jodové číslo • je měřítkem nenasycenosti tuku (oleje) tj. obsahu dvojných vazeb • udává se jako množství halogenu vyjádřené jako hmotnost jodu v gramech, které se může adovat na 100 g tuku Stanovení jodového čísla spočívá v adici interhalogenové sloučeniny (Hanušova metoda – IBr, Wijsova metoda – ICl) na vzorek tuku; reakční doba je 1-2 hod Hanušova metoda: adice jodmonobromidu -CH=CH- + IBr → -CHBr-CHInadbytek IBr se převede reakcí s KI na ekvivalentní množství jodu IBr + KI → KBr + I2, které se stanoví titrací thiosíranem: I2 + 2S2O32- → 2I- + S4O62jodové číslo = 100 . cNa2S2O3 . (V1-V2) . 0,1269 / mv V1 je spotřeba odm. roztoku Na2S2O3 při titraci slepého pokusu [ml] V2 je spotřeba při titraci vzorku [ml] Hodnoty jodového čísla sádlo olivový olej slunečnicový olej podzemnicový olej sójový olej řepkový olej

45- 70 75- 94 110-143 80-106 120-143 94-126

olejová kys. linolová kys. linolenová kys. TAG (S,O,S) TAG (S,L,S) nebo (S,O,O) TAG (S,L,O) TAG (O,L,O) TAG (L,L,O) nebo (O,Ln,O) TAG (L,Ln,O) 8

89,9 181,0 273,5 28,5 57,2 86,0 114,9 144,0 173,2


Přednáška 11

STANOVENÍ FRAKCÍ LIPIDŮ TRIACYLGLYCEROLY Separační metody (dělení podle počtu C a dvojných vazeb) • TLC, Ag+-TLC • RP-HPLC, Ag+-HPLC (detekce RID, ELSD) • GC FOSFOLIPIDY obsah fosfolipidů v některých potravinách (% v sušině) sádlo rostlinné oleje surové rafinované máslo

< 0,1 0,5-3 < 0,01 0,5-1,5

vaječný žloutek játra ledviny ovoce, zelenina cereálie

20 3-4 1,5-3 0,5-1,5 0,5-1,5

Stanovení celkového obsahu fosfolipidů • • • •

izolace lipidového podílu (extrakce dle Folche) mineralizace tuku (nejčastěji směsí HNO3 + H2SO4) stanovení fosforu (spektrofotometrie) přepočet na obsah fosfolipidů

Přepočítávací faktory fosfolipid/fosfor palmitoyl linoloyl fosfatidylcholin oleoyl linoloyl fosfatidylcholin palmitoyl linoloyl fosfatidylethanolamin palmitoyl linoloyl fosfatidylinositol palmitoyl linoloyl fosfatidylserin

9

24,51 25,35 23,12 26,96 24,54


Přednáška 11

SLOŽENÍ MASTNÝCH KYSELIN LIPIDŮ Důvody pro stanovení složení MK • • • •

nutriční a biologická hodnota tuku (esenciální MK) identifikace druhu oleje nebo tuku posouzení oxidační stability (nasycené vs. polyenové MK) sledování technologických procesů

Analytické metody • chromatografické (GC, HPLC): základní složení • spektrometrické: doplňkové ukazatele • UV spektrometrie: obsah konjugovaných dienů, trienů • MIR spektrometrie: obsah trans - nenasycených MK • enzymové: stanovení esenciálních MK Stanovení mastných kyselin v tucích plynovou chromatografií vyžaduje derivatizaci. Mastné kyseliny (volné i vázané v lipidech) se převádějí nejčastěji na: • methylestery • butylestery (při analýze tuku, který obsahuje také nižší mastné kyseliny C4-C10 – např. mléčný tuk) Příprava methylesterů MK 1) hydrolýza (zmýdelnění) tuku záhřevem s 0,5M KOH v CH3OH v inertní atmosféře (tento krok se vynechává při stanovení volných MK) 2) esterifikace methanolem za přít. kyselého katalyzátoru (nejčastěji BF3), vzniklé methylestery se extrahují do hexanu nebo isooktanu

10


Přednáška 11

Alternativní postup: transesterifikace triacylglycerolů methoxidem sodným O CH2

O

C O

R

CH

O

C O

R

CH2

O

C

R

O

+

3 CH3ONa

3 R

C

OCH3

+

CH2

ONa

CH

ONa

CH2

ONa

(volné MK s methoxidem methylestery neposkytují) Podmínky GC stanovení MK (ve formě methylesterů) • náplňové nebo kapilární kolony s polární až středně polární stacionární fází • teplota kolony > 175°C • detektor FID • kvantifikace • vnitřní normalizace (s korekčními faktory) • vnitřní standard (methylester kyseliny s lichým počtem uhlíků např. pentadekanové) GC analýza methylesterů mastných kyselin řepkového oleje kolona 30 m × 0,75 mm i.d., film 1µm; stac. fáze Supelcowax 10; teplota kolony 180 °C

11


Přednáška 11

Stanovení konjugovaných dienových a trienových mastných kyselin UV spektrometrií

Systém konjugovaných dvojných vazeb vzniká v lipidech při oxidaci polyenových kyselin na hydroperoxidy nebo během technologického zpracování olejů (např. při bělení). Kojugované dieny absorbují UV záření při 233 nm, konjugované trieny vykazují absorpční maxima při 268 a 278 nm a minima při 262 a 274 nm. Postup: vzorek se rozpustí v hexanu a změří se absorbance proti čistému rozpouštědlu. Absorbance se přepočtou na absorptivity a = A/(b.m) m je hmotnost tuku [mg] v 1 ml měřeného roztoku Obsah konjug. dienů = 0,91 . (a233 – 0,07) [%] Obsah konjug. trienů = 1,316 . (a268 – 0,5 . (a262+a274)) [%] Poznámka: stanovení je rušeno přítomností barviv (karotenoidů...) Stanovení trans –nenasycených kyselin v lipidech infračervenou spektrometrií Triacylglyceroly se konvertují na methylestery, které se rozpustí v sirouhlíku a měří se IČ spektrum v intervalu 1100-910 cm-1(9-11 µm). Výška absorbačního píku při 970 cm-1je úměrná obsahu dvojných vazeb v konfiguraci trans (deformační vibrace vazby C-H na uhlících vázaných dvojnou vazbou trans). Ke kvantifikaci se použijí kalibrační roztoky methylesteru elaidové (trans 9oktadecenové) kyseliny.

12


Přednáška 11

Stanovení esenciálních mastných kyselin Podstatou stanovení je selektivní oxidace esenciálních MK kyslíkem za katalýzy lipoxygenasou (linoleát: O2-oxidoreduktasou). Do molekuly se zavádí hydroperoxidová skupina a vzniká konjugovaný systém dvojných vazeb: O OR O2 O

OOH

OR

+ O

OOH

OR

Měřeným ukazatelem obsahu esenciálních MK může být • změna koncentrace kyslíku • nárůst absorbace při 233 nm (konjugované dieny) • nárůst obsahu hydroperoxidů lze měřit spektrofotometricky např. na základě detekce Fe3+ vzniklých oxidací železnatých iontů hydroperoxidem: Fe2+ + R-O-O-H + H+ → Fe3+ R-O-H + H2O Fe3+ + n SCN- → [Fe(SCN)n]3-n

13


Přednáška 11

STANOVENÍ STUPNĚ ŽLUKLOSTI TUKU Žluknutí: soubor chemických změn tuku, který vede ke zhoršení organoleptických vlastností. Zahrnuje především oxidační a hydrolytické reakce. Fáze oxidačního žluknutí a analytické ukazatele Fáze 1) tvorba hydroperoxidů

Ukazatel peroxidové číslo obsah „polárních látek“ 2) vznik aldehydů (epoxidů, p-anisidinové číslo thiobarbiturové číslo cyklických peroxidů, obsah „polárních látek“ derivátů furanu...) 3) vznik oligomerních lipidů obsah oligomerů Peroxidové číslo

je ukazatelem obsahu primárních produktů oxidace tuku. Vyjadřuje se v µval na 1 gram tuku (tj. v µmol (1/2 ROOH) nebo µmol (1/2 02) na gram tuku) nebo v µg aktivního kyslíku (1/2 02) na 1 gram tuku. Jodometrické stanovení peroxidového čísla probíhá na základě reakcí ROOH + 2I- + 2H+ → I2 + ROH + H2O I2 + 2S2O32- → 2I- + S4O62-. Vzorek tuku rozpuštěný v chloroformu se po přídavku octové kyseliny a nadbytku KI titruje odměrným roztokem Na2S2O3.

14


Přednáška 11

Výpočet: PČ = 1000 . cNa2S2O3 . (V1-V2) / m [µmol (1/2 ROOH).g-1] PČ = 1000 . 16 . cNa2S2O3 . (V1-V2) / m [µg (1/2 02).g-1] V1 je spotřeba při titraci se vzorkem V2 je spotřeba při titraci bez vzorku (slepý pokus) m je navážka tuku Zhodnocení výsledku 10 µmol (1/2 ROOH)/g <2 < 0,5

Max. přípustná hodnota PČ tuku Tuk vysoké jakosti Zcela čerstvý tuk (olej) p-Anisidinové číslo

je měřítkem obsahu aldehydů (zejména 2-alkenalů), které vznikají jako sekundární produkty oxidace lipidů. Stanovuje se spektrofotometricky na základě reakce CH3O

NH2

+

R

CH

CH

CH

O - H2O

CH3O

N

CH

CH

CH

R

Reakce probíhá v roztoku tuku v isooktanu (nebo hexanu); rozpouštědlo a činidlo nesmí obsahovat zbytky vody. Absorbance produktu se měří při 350 nm. p-Anisidinové číslo se vyjadřuje jako 100 násobek absorbance roztoku obsahujícího 1 g tuku spolu s činidlem ve 100 ml roztoku změřené v 1 cm kyvetě. Normální hodnota p-anisidinového čísla: 2,0 ± 0,5

15


Přednáška 11

Thiobarbiturové číslo se používá také k vyjádření obsahu aldehydů, zejména malondialdehydu a 2-alkenalů, s nimiž poskytuje 2-thio-barbiturová kyselina červeně zbarvené produkty (absorbance se měří při 530 nm) HS 2

OH

N

+

N

O

HC

CH2

CH

O

OH - 2 H2O

OH

HO

N

N

S

CH

CH

CH

SH

N

N OH

HO

reakcí činidla s alkanaly vznikají žlutě zbarvené produkty. Thiobarbiturové číslo je vhodné ke sledování střední fáze žluknutí, pokud tuk obsahuje polyenové mastné kyseliny. Thiobarbiturové číslo se vyjadřuje jako zvýšení absorbance při 530 nm v 1 cm kyvetě vyvolané reakcí vzorku s činidlem v roztoku obsahujícím 1 mg tuku v 1 ml. Hodnoty thiobarbiturového čísla čerstvý olej žluklý olej

0,005-0,02 > 0,1

16


Přednáška 11

Obsah oligomerních lipidů se používá jako kritérium jakosti tuků ve smažících lázních. Obsah oligomerů nesmí být vyšší, než 12 %. Obsah oligomerů se stanovuje gelovou permeační chromato-grafií s refraktometrickou detekcí. Výsledný obsah se určí metodou vnitřní normalizace.

Triacylglyceroly

250 11,62 3 10,79 2 A

150

Látky s vyšší molekulovou hmotností

Volné mastné kyseliny Voda

10,35 1 A

100

50

0 0

5

10

15

16,15 5

200

14,59 4

Voltage [mV]

Příklad

20 Time [min.]

Stanovení oligomerních triacylglycerolů metodou GPC (= píky označené A, obsah 14,9 %) Podmínky analýzy: Kolona: PL gel Mixed E 300 mm × 7,5 mm × 3 µm (Hewlett-Packard) Mobilní fáze: tetrahydrofuran, průtok 0,6 ml/min Příprava vzorku: 100 µl oleje vysušeno bezvodým Na2SO4 a rozpuštěno v 1,5 ml tetrahydrofuranu Nástřik: 5 µl Detekce: refraktometr, teplota 30°C

17


Přednáška 11

STANOVENÍ OXIDAČNÍ STABILITY TUKU Oxidační stabilita tuku závisí na • přítomnosti nenasycených (zvláště polyenových) MK • fyzikálních a chemických podmínkách • přístup kyslíku, koncentrace kovů (Cu, Fe) • teplota, osvětlení • obsahu antioxidačních látek Důvody pro stanovení oxidační stability • odhad doby skladovatelnosti tuku (oleje) • účinnost antioxidantů Schaalův test 25 g oleje (tuku) se ve 150 ml kádince zahřívá na 60°C za přístupu vzduchu; průběžně (po 24 hodinách, později po několika dnech) se stanovuje peroxidové číslo (nebo se sleduje změna hmotnosti); z křivky PČ=f(t) se odečte indukční perioda (doba potřebná k nastartování rychlé tvorby peroxidů)

Metoda aktivního kyslíku (100°C, probublávání oleje vzduchem) Oxipres (100°C, tlak O2: 0,5 MPa, měření tlaku) 18

Základy analýzy potravin Přednáška 11

Recommend Documents