1. ANALÝZA POTRAVIN Kontaminanty
1
1.1. Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU)
2
CO JSOU PAU ? L Organické sloučeniny, které obsahují dvě nebo více
benzenových jader spojených do konjugovaných systémů
Příklady vzorců PAU
Naphthalen
Benzo[a]pyren
Koronen
! „Všudypřítomné“ kontaminanty, které vznikají v průběhu nedokonalého spalování organické hmoty
3
1
CO JSOU PAU ? ! Významné zdroje PAU: doprava výroba tepelné a elektrické energie spalování fosilních paliv zpracování ropy spalování odpadů
domácí topeniště požáry lesů, stepí,…
kouření
! Riziko pro člověka - potenciální karcinogeny (referenční sloučenina – benzo[a]pyren)
→ příjem - vzduch, voda, potraviny 4
FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI PAU PAU
Sumární vzorec
Počet arom. jader
Bod tání (°C)
128,2
80
Bod varu (°C)
Henryho konstanta (Pa.m3/mol)
C8H10
3,37
43,01
C12H10
3
154,2
96
279
3,47
3,92
12,17
Acy
C12H8
3
152,2
92
265-275
3,93
4,07
8,4
Fln
C13H10
3
166,2
116
293
1,98
4,18
7,87
Phe
C14H10
3
178,2
101
340
1,29
4,46
3,24
3
178,2
216
340
30
Log KOW
Ace
C14H10
218
Rozpustnost ve vodě (mg/l)
Naph
Ant
2
M (g/mol)
0,07
4,45
3,96
Flt
C16H10
4
202,3
111
375
0,26
5,33
1,04
Pyr
C16H10
4
202,3
149
360
0,14
5,32
0,92
B[a]A
C18H12
4
228,3
158
435
0,014
5,61
0,581
Chr
C18H12
4
228,3
255
448
0,001
5,61
0,065
B[a]P
C20H12
5
252,3
179
496
0,0038
6,04
0,046
B[b]F
C20H12
5
252,3
167
481
0,0012
6,57
-
B[k]F
C20H12
5
252,3
217
481
0,0055
6,84
0,016
DB[ah]A
C22H14
5
178,4
262
524
0,0005
5,97
-
B[ghi]P
C22H12
6
276,3
277
-
0,00026
7,23
0,075
I[cd]P
C22H12
6
276,3
163
-
0,0062
7,66
-
5
OBECNÉ SCHÉMA METODY STANOVENÍ PAU Homogenizace, sušení Extrakce
sonikace, Soxhlet, saponifikace ASE, MAE,
Rozetření vzorku s bezvodým Na2SO4 Hexan, aceton, dichlormethan, chloroform
Zakoncentrování extraktu rotační vakuová odparka
Přečištění Gelová permeační chromatografie, SPE
Stacionární fáze – gel Bio-Beads S-X3, mobilní fáze- chloroform
Zakoncentrování extraktu rotační vakuová odparka
Identifikace/kvantifikace HPLC/FLD GC/MS
HPLC – reverzní fáze, C18 polymerní kolony, gradientová eluce GC – nepolární kolony (typ DB-5MS) 6
2
Rizika nepřesných výsledků
•
Fotodegradace – ochrana vzorků, extraktů a standardů před světlem ⇒ použití
tmavých vialek, hliníkové folie
•
Sekundární kontaminace – nutné provádět slepý pokus v každé sérii vzorků – použití „čistých“ rozpouštědel a materiálů ⇒ redestilace
rozpouštědel, předextrakce extrakčních patron, speciální postup mytí laboratorního skla…
7
UKÁZKA CHROMATOGRAMU STANDARDU PAU - HPLC HPLC/FLD •Reverzní polymerní fáze (250 mm x 4 mm, 5μm) •Gradientová eluce (acetonitril/voda)
50
26.725 - I[cd]P
24.474 - DB[ah]A
20.826 - B]b]F
18.527 - Chr
14.893 - Pyr
17.762 - B[a]A
% ACN
12.690 - Ant
100
13.858 - Flt
150
10.454 - Fln
200
11.540 - Phe
7.647 - Naph
250
25.950 - B[ghi]P
300
23.102 - B[a]P
10.192 - Ace
21.910 - B[k]F
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\DATAHP~1\FLD154-4\DATA02\MJKOLONY\MNIST2.D) PMP1, Solvent A LU
0 0
5
10
15
20
25
min
8
HPLC/FLD - UKÁZKA CHROMATOGRAMU UZENÉHO SÝRA B[a]A
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (D:\HPCHEM\FLD154-4\DATA05\MJ050801\024-2501.D) LU
-235
-240
Fln
Chr
Naph
-245
DB[ah]A
B[b]F
-255
1500 -260
1000 -265
18
20
22
24
I[1,2,3-cd]P
-250
2000
B[ghi]P
B[k]F
2500
B[a]P
3000
LU
Ant
Phe
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (FLD154-4\DATA05\MJ050801\024-2501.D)
3500
26
28
min
BghiP IcdP
DBahA
BaP
BkF
BbF
BaA
Chr
Pyr
0
Flt
Ace
500
-500 0
5
10
15
20
25
min
9
3
UKÁZKA CHROMATOGRAMU STANDARDU PAU - GC GC/MS •Kolona DB-5MS Abundance
55000 50000
7
45000 6
3
40000
8
35000 30000 25000
9
Ion 228.0 00 (22 27.70 to 228.70): Ion 178.0 00 (23 33.70 to 234.70): Ion 192.0 77.70 to 278.70): Ion 202.0 15+1641.70 to 242.70): 22+23 Ion 216.0 51.70 to 252.70): 24 10 11184.0 17+18 to 276.70): Ion 75.70 14 27 25 13 19 20 21
5
12
12
NSTD D.D NSTD D.D NSTD D.D NSTD NSTD 29 NSTD 28
26
4
30
20000 15000
31 32 33
10000 5000 0
10.0012.00 014.001 16.0018.0020.0022.002 024.0026.00 4.00 6.00 8.00 8
Time--> 1 – 2-MeNaph, 2 – 1-MeNaph, 3 – Acy, 4 – Ace, 5 – Fln, 6 – DBT, 7 – Phe, 8 – Ant, 9 – 1-MePhe, 10 – Flt, 11 – Pyr, 12 – B[c]Fln, 13 – 1-MePyr, 14 – B[b]N[d]T, 15 – CP[c,d]P, 16 – B[a]A, 17 – Tri, 18 – Chr, 19 – 3-MeChr, 20 – 5-MeChr, 21 – 1-MeChr, 10 22 – B[b]F, 23 – B[j]F, 24 – B[k]F, 25 – B[e]P, 26 – B[a]P, 27 – I[1,2,3-c,d]P, 28 – DB[a,h]A, 29 – B[g,h,i]P, 30 – DB[a,l]P, 31 – DB[a,e]P, 32 – DB[a,i]P, 33 – DB[a,h]P
GC/MS - UKÁZKA CHROMATOGRAMU OLIVOVÉHO OLEJE Abundance
6 6000 5500
Ion I Ion I Ion I Ion I Ion I Ion I
184.00 192.00 202.00 216.00 234.00 228.00
(183.7 70 (191.7 70 (201.7 70 (215.7 70 (233.7 70 (227.7 17+18 70
to to to to to to
184.70): 242.70): 252.70): 302.70): 276.70): 278.70):
NESPOLE2.D NESPOLE2.D NESPOLE2.D NESPOLE2.D NESPOLE2.D NESPOLE2.D
5000 4500 4000
11
3500
10
3000
15+16
19
2500
78
2000 1500 1000
12
4 3
500 0
4.00
6.00
5
9
22+23 25 20 21 26 24
12 13
29
27 28
30 31 32 33
14 8.00 10.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.002
Time-->
1 – 2-MeNaph, 2 – 1-MeNaph, 3 – Acy, 4 – Ace, 5 – Fln, 6 – DBT, 7 – Phe, 8 – Ant, 9 – 1-MePhe, 10 – Flt, 11 – Pyr, 12 – B[c]Fln, 13 – 1-MePyr, 14 – B[b]N[d]T, 15 – CP[c,d]P, 16 – B[a]A, 17 – Tri, 18 – Chr, 19 – 3-MeChr, 20 – 5-MeChr, 21 – 1-MeChr, 22 – B[b]F, 23 – B[j]F, 24 – B[k]F, 25 – B[e]P, 26 – B[a]P, 27 – I[1,2,3-c,d]P, 28 – DB[a,h]A, 29 – B[g,h,i]P, 30 – DB[a,l]P, 31 – DB[a,e]P, 32 – DB[a,i]P, 33 – DB[a,h]P 11
1.2. Polychlorované bifenyly (PCB) a organochlorované pesticidy (OCP)
12
4
Úvod • Perzistentní organické polutanty (POPs) – Polychlorované bifenyly (PCB), organochlorové pesticidy (OCP) – Polychlorované dibenzo-dioxiny (PCDD) a dibenzo-furany (PCDF) • Vstup do životního prostředí a potažmo do potravních řetězců prostředí – Primární zdroje - přímá aplikace v praxi – Sekundární zdroje - likvidace odpadů, požáry, vedlejší produkty při průmyslových operacích, havárie
• Vlastnosti perzistentních látek – nízký stupeň (bio) degradace ⇒ vysoká perzistence – Vysoká lipofilita ⇒ kumulace v biotických materiálech životního prostředí/potravních řetězců 13
ortho
meta 3´
Přehled PCB 209 kongenerů
para
Clx
ortho 2
2´ 1´
4´ 5´ meta
para
4 6
6´ ortho
meta 3
1
ortho
Cly
5
x + y = n = 1 až 10
meta
Kruh 1 0
non-ortho PCBs
2
1
4
3 23
2 3 5
6 8 16
11 13 20
15 22
40
24
7
17
25
28
42
47
25
9 10
18 19
26 27
31 32
44 46
49 51
52
26
53
54
34
4
mono-ortho PCBs indikátorové PCBs
77
12
33
35
37
56
66
70
71
35
14
34
36
39
58
68
72
73
79
234
21
41
55
60
82
85
87
89
105
235 236
23 24
43 45
57 59
63 64
83 84
90 91
92 95
94 96
107 111 130 133 110 113 132 135 136
245
29
48
67
74
97
99
101
102
118
246
30
50
69
75
98
100 103 104 119 121 140 148 150 154 155
81 114
122
123
126 156
120
157
146 149
167 180
38
76
78
61
86
106
62 88 109 115 131 139 144 146 158 161 171 175 176 183 184 191 196 197 65 93 112 117 134 147 151 152 163 165 177 178 179 187 188 193 201 200 202 14 116 142 160 166 173 181 185 186 190 192 195 198 199 203 204 205 206 207 208 209 0
2
3
4
23
24
25
26
34
159 170 172 174
35
234
235
236
245
168
169 189
345
23456
162 164
153
2346
129 137 141 143
127
138
2345 2356
124 125
80 108 128
182
246
345
194
2345 2346 2356 23456
Kruh 2
Indikátorové kongenery PCB Nejčastěji se v technických směsích PCB používaji tzv. indikátorové kongenery
z
z Maximální přípustné hodnoty sumy indikátorových kongenerů PCB v potravinách jsou uvedeny ve Vyhlášce č. 305/2004 Sb. k Zákonu č. 110/1997 o potravinách, limity se týkají potravin s vyšším obsahem 15 lipidů, tj. ryb a rybích produktů
5
Průnik POPs do potravního řetězce
16
Kumulace v živých organismech • Biokoncentrace – přímý přestup látek z okolního prostředí do organismu • Biomagnifikace – příjem látek konzumací kontaminované potraviny a jejím trávením Bioakumulace = Biokoncentrace + Biomagnifikace • Faktory ovlivňující bioakumulaci – Lipofilita – Velikost a tvar molekul – Biologická dostupnost
– Biochemická degradabilita – Charakter organismu – Environmentální faktory 17
Popis analytické metody 1) Příprava vzorku Homognizace vzorku s bezvodým síranem sodným (desikace) 2) Extrakce Extrakce podle Sohleta (nejčastěji), sonikace, PLE… 3) Přečištění extraktu (odstranění lipidů) Gelová permeační chromatografie (GPC) Adsorpční chromatografie (silikagel, florisil…) 4) Identifikace & kvantifikace Plynová chromatografie s detektorem elektronového záchytu (GC/ECD) mńebo s hmotnostním detektorem (GC/MS) 18
6
Eluční profil PCB a rybího tuku na GPC stac. fáze: Bio Beads S-X3® mob. fáze: cyklohexan-ethylacetát Tuk
PCB 28
PCB 52
PCB 101
PCB 118
PCB 138
PCB 153
PCB 180
50
40
%
30
20
10
7
26
-2
-2
6
5
4 -2
-2 24
25
2
3 -2
22
23
0
1
-2 21
9
-2
-2 20
19
7
8
-1
-1 17
18
5
6
-1
-1 15
16
3
4
-1 14
2
-1
-1
12
13
0
1
-1
-1
-1 9
10
11
-9
-8 7
8
-7
-6 5
6
4
-5
0
fra kce (ml)
analyty
tuk
19
Ukázka chromatogramu reálného vzorku mateřského mléka (GC/2ECD) ECD1 A, (GC2ECD\JP070704\DEL103B.D)
250000
PCB 138
PCB 180
PCB170
PCB 187
PCB 141
Technická směs PCB - Delor 106
PCB 183
PCB 203
PCB 156
20000
Vzorek mateřského mléka
18000
20
25
30
35
40
min
HCB
PCB 138
PCB 180
PCB 153
15
200000
150000
PCB 151
PCB 110
22000
PCB 105
p,p´-DDE
ECD1 A, (GC2ECD\JP070504\M182.D) counts 300000
PCB 146
PCB 66/95
24000
PCB 101/84
26000
PCB 153
PCB 118
counts
p,p´-DDT
50000
PCB 118
beta-HCH
PCB 112
100000
0 10
15
20
25
30
35
40
45
20
min
Výřez chromatografických záznamů z GC/ECD pro směsný standard PCB a reálný vzorek rybí svaloviny Směsný standard PCB
Vzorek rybí svaloviny (cejn velký, Labe – Valy)
21
7
Chromatografický záznam standardu OCP (100 pg v nástřiku), kapilární kolony DB-5 a DB-17 (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm i.d.)
22
Chromatografický záznam vzorku ryby (Cejn velký, Labe – Hřensko) - detail
23
GC/MS-EI spektrum PCB 360
100
PCB 153
Cl
Cl
145 Cl
Cl
Cl
290
Cl
109 50 127
218
74 181
98 61 35
84 325
163 50
254
78 169
0 30 50 70 90 110 130 (mainlib) 1,1'-Biphenyl, 2,2',4,4',5,5'-hexachloro-
150
170
193 204 190
210
228 240 230
275 250
270
290
310
330
350
370
24
8
1.3. PESTICIDY 25
PESTICIDY „Všechny sloučeniny nebo jejich směsi určené pro prevenci, ničení, potlačení, odpuzení či kontrolu škodlivých činitelů, to znamená nežádoucích mikroorganismů, rostlin, a živočichů během produkce, skladování, transportu, distribuce, a zpracování potravin, zemědělských komodit a krmiv“ (definice FAO, Food and Agriculture Organization)
¾ široké spektrum fyzikálně chemických vlastností ¾ akutní/chronická dietární expozice ⇒ zdravotní riziko pro konzumenty ⇒ nutná kontrola výskytu reziduí a jejich koncentračních hladin ¾ rostoucí množství registrovaných látek pro ošetření zemědělských plodin
LEGISLATIVA: Vyhláška Ministerstva Zdravotnictví č. 158/2004 Sb., změněná vyhláškou 68/2005 Sb. (MRL jednotlivých pesticidů v potravinách a potravinových doplňcích) Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 54/2004 Sb., (O potravinách určených pro zvláštní výživu a o způsobu jejich použití). Legislativní limit pro počáteční a pokračovací kojeneckou výživu a obilné a ostatní kojenecké příkrmy: MRL = 0,010 mg/kg ZVLÁŠŤ NÍZKÉ MRL – Commission Directive 2003/13/EC of February 10, 2003 amending Directive 96/5/EC on processed cereal-based baby foods and baby foods for infants 26 and young children)
DĚLENÍ PESTICIDŮ (i) PODLE CÍLOVÉHO ŠKODITELE Skupina pesticidů insekticidy akaricidy fungicidy moluskocidy rodenticidy herbicidy regulátory růstu rostlin
Cílový škodlivý činitel hmyz pavoukovití plísně, cizopasné houby měkkýši hlodavci plevelné rostliny kulturní rostliny
(ii) PODLE MECHANISMU ÚČINKU ¾ systémové - penetrují kutikulou listů a jsou v rostlině dále translokovány ¾ kvasisystémové - mají omezenější mobilitu než pesticidy kontaktní, do kutikuly penetrují jen v omezeném rozsahu ¾ kontaktní - vykazující lokální účinek v místech, kde se nachází jejich povrchový deposit 27
9
STRATEGIE MULTIREZIDUÁLNÍCH METOD Poč Počet analytů analytů /typy matrice
MRM Pracovní Pracovní charakteristiky
Cena/dostupnost
¾metody pro daný pesticid/danou skupinu lá látek ¾umožň ujíí stanovení umožňuj stanovení slouč sloučenin široké irokého spektra fyziká fyzikálně lně-chemických vlastnosti ¾ princip: (i) homogenizace, (ii (ii)) extrakce organickým rozpouš rozpouštědlem, (iii (iii)) př přečištění primá primární rního extraktu, (iv (iv)) identifikace/kvantifikace a (v) konfirmace (potvrzení (potvrzení) cí cílových analytů analytů metodami kapalinové kapalinové a plynové plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (LC(LC-MS, GCGC-MS)
28
MULTIREZIDUÁLNÍ METODY: PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY PŘESNOST: ¾ opakovatelnost ¾ reprodukovatelnost ¾ správnost (zpravidla výtěžnost) CITLIVOST: směrnice kalibrační přímky MEZ DETEKCE a MEZ STANOVITELNOSTI: LOD – jaké množství analytu lze ještě spolehlivě prokázat LOQ – jaké množství analytu lze s definovanou přesností ještě stanovit LCL – nejnižší bod kalibrační křivky PRACOVNÍ ROZSAH a LINEARITA: ¾ v jakém koncentračním rozsahu lze měřit/kalibrovat ¾ v jakém rozsahu je kalibrační závislost lineární 29
MULTIREZIDUÁLNÍ METODY: OVĚŘENÍ PRACOVNÍCH CHARAKTERISTIK MRM Certifikované referenční materiály
Neexistují pro všechny matrice Drahé
Řešení
Omezená stabilita moderních pesticidů
Mezilaboratorní porovnání (Proficiency Testing, FAPAS® )
KALIBRACE Matriční efekty – ovlivnění signálu analytu koextrakty z matrice
GC/MS – nadhodnocení výsledků při použití standardů v čistém rozpouštědle (matrix induced response enhacement) LC/MS – časté podhodnocení výsledků při použití standardů v čisté rozpouštědle (ion suppression)
Použití matričních standardů pro kalibrace!
30
10
PŘÍKLADY ANALYTICKÝCH MRM POSTUPŮ:
X
STANOVENÍ (SEMI)VOLATILNÍCH PESTICIDŮ navážka vzorku, desikant, ethylacetát ⇒ Ultra Turrax HP GPC (PL–gel, mobilní fáze: ethylacetát-cyklohexan, 1:1, v/v)
EXTRAKCE
2. GC–MS/SIM (kvadrupól, EI) • konfirmace pozitivních vzorků
navážka vzorku, acetonitril ⇒ Ultra Turrax
PŘEČIŠTĚNÍ IDENTIFIKACE/ KVANTIFIKACE
1. GC–NPD, ECD • screening
STANOVENÍ POLÁRNÍCH PESTICIDŮ
KONFIRMACE
Nástřik: pulsní splitless, 1μl Nosný plyn: helium GC kolona: „nepolární“ DB-5MS (60 m x 0,25 mm x 0,25 µm)
LC-MS/MS Nástřik: 7μl Mobilní fáze: 0,01M octan amonný:methanol LC kolona: RP-C18 (150 mm x 3 mm x 5 µm)
31 ASPEC, Gilson, Francie
Waters Micromass Quattro Premier XE
GC/MS (EI/CI) systém Agilent 5975N
PŘEČIŠTĚNÍ I. ODSTRANĚNÍ INTERFERUJÍCÍCH MATRIČNÍCH KOMPONENT Z EXTRAKTU BÝVÁ PROVEDENO NA ZÁKLADĚ ROZDÍLNÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ ANALYTŮ A KOEXTRAKTŮ.
(1) EXTRAKCE KAPALINA-KAPALINA (LLE) Požadavky:
i) nemísitelnost použitých kapalin ii) analyty přecházejí nebo zůstávají pouze v jedné kapalině Výběr rozpouštědel: polarita, rozpustnost analytů Výhody: dobrá efektivitu a jednoduchost Nevýhody: spotřeba velkých objemů rozpouštědel (⇒ nutnost zakoncentrování pro další postup) vysoké nároky na čistotu rozpouštědel možnost tvorby emulzí sekundární kontaminace vzorku metoda používající mikrolitrové objemy: LPME (Liquid-phase micro extraction)
(2) GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE (GPC) Princip: dělení látek na základě efektivního objemu molekuly – menší molekuly pronikají hlouběji do póru gelu a mají proto větší retenční objem, než velké molekuly Další vlivy při separaci: tvorba vodíkových můstků, dipólové interakce, π-π interakce, disperzní síly VÝBĚR VHODNÉHO GELU: pracovní rozsah (tzv. vylučovací limit) – udává, jak velké molekuly již nejsou v gelu zadržovány Analýza pesticidů: styren-divinylové gely s malým vylučovacím limitem (např. rigidní PL- gel, měkký Bio Beads) Výhoda GPC: snadná automatizace
32
PŘEČIŠTĚNÍ II.
(3) EXTRAKCE NA TUHOU FÁZI (SOLID-PHASE EXTRACTION, SPE) Princip: vzájemné interakcích sorbentu, analytů a rozpouštědla. Nejběžnější uspořádání SPE: kolonky obsahující 0,1–1 g sorbentu Po nanesení vzorku může nastat několik situací: • analyty i interferující látky jsou sorbentem zadrženy, k eluci analytů nebo interferentů je potřeba změnit eluční sílu rozpouštědla • jsou zadrženy pouze analyty, interferující látky projdou kolonkou a analyty jsou eluovány rozpouštědlem s vyšší eluční silou • jsou zadrženy pouze interferenty a analyty kolonkou projdou
DISPERZNÍ SPE: malé množství sorbentu přidáno přímo do extraktu, po filtraci nebo centrifugaci se k analýze odebere alikvotní objem přečištěného extraktu (QuEChERS) Výhody: Sorbent přichází do styku s extraktem celým povrchem ⇒ čištění efektivnější a účinnější Nižší cena (menší množství sorbentu,nejsou potřeba komerční kolonky) Není potřeba zdroj vakua a eluční rozpouštědla jako u klasického SPE Celý proces velmi rychlý a jednoduchý Typy sorbentů používaných v SPE v multireziduální analýze pesticidů Normální fáze
Reverzní fáze
Iontoměniče
Grafitizované saze (GCB)
Oktadecilovaný silikagel (C18)
Silné anexy (SAX)
Alumina
Polymery (divinylbenzen, DVB)
Primární-sekundární amin (PSA)
Silikagel
Cyanopropyl (-CN)
Aminopropyl (-NH2)
Florisil
Silné katexy
33
11
UKÁZKA GC-MS CHROMATOGRAMŮ SMĚSI STANDARDŮ (KONCENTRAČNÍ HLADINA 0.8 – 3 µg/ml) ECD1 A, (JANA_T~1\ZKOUSKA\STD1.D) 5 Hz
16+17
43+44
ECD
4000
37+38
26+27
21 12
3000
13
30
77 69
57+58
80
24+25 19
32
15
95
50+52 47+48
35 2000
63+64
59+60
55
53
33+34
23
74 72
62
14 1000
65 68
54
49
42
61
56
73
67
40
70
79
76
87+88+89+90 78
71
81
82
83+84
85+86
91
92
93+94
0 20 NPD2 B, (JANA_T~1\ZKOUSKA\STD1.D) pA
30
50 28+29
60
70
min
70
min
43
37+38
6
1
120
40 22
NPD
140
5
27
14
8
3 4 2
7
17
41
36
57+58 45
32
23
20
80
55
33+34
24
10 11
100
31
63
66 77
50+51
72
35 46
18
60
39
26
9
78
75
42
67
40
81
70
80
40 20 0 20
30
40
50
60
Abundance TIC: std1deva.D\data.ms
MSD TIC/Scan TIC/Scan
900000 850000 800000 750000 700000 650000 600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000
34
50000
15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 Time-->
PRAKTICKÉ PRAKTICKÉ PŘÍKLADYKLADY- identifikace pozitivní pozitivních vzorků vzorků UKÁZKA GC-MS CHROMATOGRAMŮ Abundance
PHOSALONE (m/z 121, 182, 367) 55.70 260
Scan 3462 (58.418 min): mstd3smsc.D\data.ms 182
5000
Ion 121.00 (120.70 to 121.70): STD3C.D Ion 182.00 (181.70 to 182.70): STD3C.D Ion 367.00 (366.70 to 367.70): STD3C.D
Cl
4500
O
4000
240
O 207
CH2 S
3000
200 180
2500
160
2000
S
N
3500
220
281
140
1500 70 1000
120 100
97
60
221
0
55.30 55.40 55.50 55.60 55.70 55.80 55.90 56.00 56.10 56.20 56.30 56.40 56.50 56.60 56.70
80
249 267
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
Obr. 2: Hmotnostní spektrum phosalonu 55.93
Ion 121.00 (120.70 to 121.70): ML220.D Ion 182.00 (181.70 to 182.70): ML220.D Ion 367.00 (366.70 to 367.70): ML220.D
130
Ion121.00 (120.70to 121.70): ML222.D Ion182.00 (181.70to 182.70): ML222.D Ion367.00 (366.70to 367.70): ML222.D
55.65
341
m/z-->
Obr. 1: Chromatogram standardu phosalonu
170
367
154 138
500
80
P(OCH2CH3)2
121
125
160
120
150
115
140
110 105
130
100
120
95 110
90
100
85
90
80 75
80
70
70
65 55.40
60 55.40 Ti
55.50
55.60
55.70
55.80
55.90
56.00
56.10
56.20
55.60
55.80
56.00
56.20
56.40
56.60
56.80
35
56.30
Ti
Obr. 3: Chromatogram vzorku - pozitivní nález
>
Obr. 4: Chromatogram vzorku – bez nálezu
PRAKTICKÉ PRAKTICKÉ PŘÍKLADYKLADY- identifikace pozitivní pozitivních vzorků vzorků II. UKÁZKA LC-MS-MS CHROMATOGRAMŮ STD 20 24_03_2006-ESI+_67 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 106,15 2,28e3
7,60
100
Matriční standard %
Kvantifikační MS-MS přechod
4,27
4,47
3,43
8,32
7,87
4,78
8,62 10,60 10,99 11,36
5,14
0 2,00 3,00 4,00 24_03_2006-ESI+_67 Sm (Mn, 2x3)
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
12,19
11,00
12,00 13,00 2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 79,1 1,01e3
7,59
100
Konfirmační MS-MS přechod 12,65
11,51 11,06 11,24
%
5,46
10,46
3,03
0 2,00
6,02
3,81 4,04
2,85
3,00
4,00
5,00
6,30 6,45
8,93
8,45 8,07
6,00
7,00
12,47
10,78
9,66 9,94
9,14
8,00
DMST 11,96
9,00
10,00
11,00
Time 13,00
12,00
92/06
87/06
24_03_2006-ESI+_53 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 106,15 438
7,62
100
24_03_2006-ESI+_48 Sm (Mn, 2x3)
2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 106,15 5,99e3
7,58
100
Negativní nález
Pozitivní nález %
%
11,66 10,50 7,44
2,98
9,38
7,86
11,19 12,30
8,47
2,24
7,28 2,69
3,62 3,94
4,35
0 2,00 3,00 4,00 24_03_2006-ESI+_53 Sm (Mn, 2x3)
5,01
6,03
5,00
6,00
6,77 7,09
6,36
7,00
8,82
8,00
9,00
10,00
8,57
11,00
12,00 13,00 2: MRM of 32 Channels ES+ 12,51 215,1 > 79,1 548
100 8,53
Chybí konfirmace
10,49
12,62
10,19
0 2,00 3,00 4,00 24_03_2006-ESI+_48 Sm (Mn, 2x3)
5,00
6,00
7,00
8,00
9,65
9,00
10,26
10,00
11,10
11,00
7,55
100
12,49
12,00 13,00 2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 79,1 1,96e3
11,88
%
9,72
9,90
10,94 10,31 10,72
11,50
8,69 5,94
12,06 9,219,45
5,74
7,14
3,20
%
8,28
6,67 4,63
2,89
10,09 10,51
11,24
8,96
4,35 2,42
4,07
2,67
0 2,00
3,00
4,00
3,32
5,00
3,73 4,09
6,47
6,00
5,48
7,00
8,00
9,00
10,00
11,00
12,00
Time 13,00
0 2,00
3,00
4,00
5,00
8,04
6,45
6,00
7,00
8,00
8,76
9,02
9,00
9,19
11,66
10,40
9,56 9,70 6,67 6,81
5,21
10,05
10,00
12,38 11,84
11,01 11,22
11,00
36
12,00
12,69 12,86
Time 13,00
12
1.4. MYKOTOXINY
37
MYKOTOXINY toxické sekundární metabolity mikroskopických vláknitých hub hlavní producenti – Aspergillus, Penicillium, Fusarium výskyt - celosvětově rozšířené, napadají široké spektrum potravin a zemědělských plodin ke kontaminaci dochází v průběhu vegetace, skladování průnik do živočišných produktů mykotoxikosy – onemocnění zvířat i lidí (karcinogenní látky, potenciálně karcinogeny, toxické látky) faktory ovlivňující výskyt - vlastnosti mikromycet, typ substrátu, aplikované technologie pěstování, počasí, podmínky skladování, způsob zpracování surovin bioterorismus 38
legislativa
KLASIFIKACE MYKOTOXINŮ pestrá skupina nízkomolekulárních sloučenin nelze jednoduše rozdělit podle chemické struktury – nutnost zohlednit producenty, výskyt, toxické účinky aj. dle nejnovějších vědeckých studií a dlouhodobého výzkumu lze konstatovat, že mezi nejvýznamnější mykotoxiny patří 7 níže uvedených Producent
Mykotoxin
Aspergillus
aflatoxiny, ochratoxin A, patulin
Fusarium Penicillium
deoxynivalenol (DON),HT-2 a T-2 toxin, zearalenon, fumonisiny ochratoxin A
39
13
STANOVENÍ MYKOTOXINŮ
KRITICKÝ KROK NEHOMOGENNÍ MATERIÁL OHNISKA KONTAMINACE
VZORKOVÁNÍ EXTRAKCE
PŘEČIŠTĚNÍ IDENTIFIKACE A KVANTIFIKACE
Které analytické metody jsou používány????
40
STANOVENÍ MYKOTOXINŮ „INSTRUMENTÁLNÍ METODY“ OFICIÁLNÍ KONTROLA POTRAVIN
HPLC-UV HPLC-FLD HPLC-MS-MS GC-FID GC-ECD GC-MS
„RYCHLÉ METODY“ SCREENING
TLC ELISA LFD Biosensory IR-spektroskopie
TRENDY V ANALÝZE MYKOTOXINŮ Rychlejší metody, ale spolehlivé…. Jednoduchší metody, ale spolehlivé…. Levnější metody (práce, chemikálie…) Vyšší stupeň automatizace Multireziduální metody (více analytů součastně) 41
„RYCHLÉ METODY“ SCREENING ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )- Imunochemické stanovení LFD (Lateral Flow Device)- Imunochromatografická metoda Použití – testování přímo v terénu, screeningová analýza, v rozvojových zemích Výhody – rychlá, levná, nenáročná
42
14
Kompetitivní ELISA test ELISA soupravy obsahují destičku mikrotitračních jamek s navázanou protilátkou, sestavu pěti nebo šesti standardních roztoků o známých koncentracích. Analyzovaný mykotoxin obsažený v testovaném vzorku a konjugovaném antigenu soutěží o vazebná místa protilátky, na antigenu je navázaný enzym, který štěpí chromogen za vzniku barevné reakce. Čím víc mykotoxinu vzorek obsahuje, tím více vazebných míst je obsazeno. Naváže se méně konjugovaného antigenu a výsledná barevná reakce je slabší. Intenzita zbarvení je měřena při odpovídajících vlnových délkách. Výsledné koncentrace analytů jsou vypočteny na základě srovnání s absorbancí standardních roztoků. Příprava vzorků - vzorek se extrahuje destilovanou vodou nebo 70% roztokem metanol-voda v závislosti na analyzovaném mykotoxinu. Je nutné, aby všechny testované extrakty měly pH v deklarovaném rozmezí. Tato podmínka je obvykle bez problémů splněna u extraktů vzorků, pro které jsou ELISA soupravy výrobcem doporučeny. 43
„INSTRUMENTÁLNÍ METODY“ MULTIREZIDUÁLNÍ LC- MS METODA – 16 mykotoxinů Postup - 25 g vzorku s 100 ml ACN:H2O třepačka 2 hod, filtrace, naředění 4 x vodou, LC-MS systém
44 Zdroj: M. Spanjer et. al.: Single run LC-MS/MS analysis of mycotoxins subject to actual and upcoming EU legislation in one sample extract, 2nd World Mycotoxin Forum, 2003, Noordwijk, NL
Aflatoxiny
AFB1
Producenti: Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G), A. argeninicus a A. nomius 4 přirozené typy aflatoxinů: AFB1, AFB2, AFG1 a AFG2 jejich metabolity: AFM1, AFM2, AFM4, AFP1, AFQ1 Výskyt: obiloviny, mléko, sýry, vejce, maso, koření, oříšky Toxikologické účinky: akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a teratogenní pořadí toxicity a mutagenity je AFB1>AFG1> AFB2>AFG2 Analytický postup Extrakce- methanol, chloroform, voda nebo jejich směsi Přečištění- SPE (imunoafinitní kolonky IAC, MycoSep kolonky, C18 kolonky) Identifikace a kvantifikace - HPLC/FLD (normální či reverzní fáze, před nebo pokolonová derivatizace) HPLC/MS 45
15
Aflatoxiny
IAC
Příprava a extrakce vzorku - rozetření a navážení doporučeného množství vzorku,smíchání vzorku s roztokem NaCl a vodným methanolem, filtrace Ředění a filtrace - nařeďění potřebného množství extraktu, filtrace Absorbce a eluce - dávku filtrátu nechat protéct přes imunoafinitní kolonku Afla B promýt kolonku vodou, eluování aflatoxinů z kolonky methanolem a jímání eluátu do kyvetky Měření - derivatizace aflatoxinů přidáním vývojky do kyvetky,umístění kyvetku do měrné cely kalibrovaného fluorometru, na displeji fluorometru odečtění výsledků (B1 a B2) v ppb, nebo nástříknutí eluátu do kapalinového chromatografu 46
Ochratoxin A
Sytematický název: (R)-N-[(5-chloro-3.4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl–1-oxo-1H-2-benzo-pyran-7yl)karbonyl]-L-fenylalanin Producenti: P. verrucosum, A. ochraceus a některé další druhy Aspergillus Výskyt: cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich, v kávových bobech, v mase a vnitřních orgánech hospodářských zvířat Toxikologické účinky: nefrotoxicita, hepatotoxicita, genotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita 47
Ochratoxin A
48
16
Ochratoxin A Stanovení: Extrakce: 60 % ACN SPE přečištění: Imunoafinitní kolonky OchraTestTM VICAM; OCHRAPREPR R-BIOPHARM RHONE Analytická koncovka: HPLC-FLD (ex. 249 nm; em. 464 nm) Kolona: LichroSpher C18 Mobilní fáze: ACN:H2O:k. octová (99:99:2)
Parametry metody: LOD: 0,5 μg/kg Výtěžnost: 77,0 % Opakovatelnost: 4,5 %
FLD1 A, Ex=249, Em=464 (C:\ZALOHA~1\D\1\DATA\OA05\51017009.D) LU
Ochratoxin A
Psenicna mouka spike 0.005 mg/kg 75
70
65
60
55
49
50 0
2
4
6
8
10
12
14
min
Chromatogram: Pšeničná mouka spike 0,005 mg/kg
Patulin Sytematický název: 4-hydroxy-4H-furo[3,2-c]pyran-2(6H)-on Producenti: Penicillium, Aspergillus, and Byssochylamys hlavně P. patulinum a P. expansum Výskyt: Jablka, hrušky, hroznové víno, drobné ovoce a výrobky z nich Toxikologické účinky: Karcinogenita, mutagenita, neurotoxicita a imunotoxicita Legislativa: EC 1425/2003 (25 výživu).
g/kg pro jablka, 50
g/kg pro mošty a 10
g/kg pro dětskou
50
Patulin Parametry metody: LOD: 5 mg/kg Výtěžnost: 57,6 % Opakovatelnost: 5,6 %
Stanovení: Extrakce: 84 % ACN SPE přečištění: MycoSep®228 Analytická koncovka: HPLC-DAD (276 nm) Kolona: Hypurity AquaStar C18 Mobilní fáze: ACN : 0,005% k. octová (4:96)
DAD1 A, Sig=276,4 Ref=360,100 (C:\ZALOHA~1\D\1\DATA\PATULIN\05091367.D) mAU
Jablko spike 0,04 mg/kg
Patulin
0.8
0.6
0.4
0.2
0
51
-0.2 0
2
4
6
8
10
12
14
min
Chromatogram: Jablko spike 0,04 mg/kg
17
Fusariové mykotoxiny Deoxynivalenol (3a,7a,15-Trihydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-one) •Výskyt - nejfrekventovanější - cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich •Toxicita - dermatitidy, gastrointestinální onemocnění, hematologické onemocnění, imunotoxicita •Legislativa - Vyhláška 305/2004 Sb.; obiloviny pro přímou spotřebu a zpracované obilí, kromě tvrdé pšenice 0,5 mg/kg, chléb a jemné pečivo 0,35 mg/kg, Výrobky z obilovin určené pro dětskou výživu 0,1 mg/kg T-2 toxin (3-Hydroxy-4,15-diacetoxy-8-[3-methyl-butyryloxy]-12,13-epoxytrichothec-9ene) • Výskyt - cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich •Toxicita - dermatitidy, emetické účinky, imunotoxicita, karcinogenita? Zearalenon (μ-lakton 6-(10-hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl)-β-resorcyklové kyseliny) •Výskyt - cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich •Toxicita – estrogenní účinky •Legislativa - Vyhláška 305/2004 Sb.; dětská výživa a kojenecká výživa z obilovin 0,02 mg/kg, obiloviny a výrobky z obilovin 0,05 mg/kg 52
Fusariové mykotoxiny Parametry metody: Stanovení: LOD: 0,5 μg/kg Extrakce: ACN:H2O (84:16,v:v) SPE přečištění: MycoSep kolonky 226 Analytická koncovka: LC-MS/MS (iontová past) Kolona:Synergi Hydro RP (150mm x 3mm x 4µm) Mobilní fáze: gradient methanol, vodný roztok octanu amonného
Mycosep kolonky
53
18
