Samenvatting Curriculum Vitae List of publications Dankwoord
Wouter F. Tonnis
Wouter thesis2 copy3.indd 151
28-10-2014 14:29:07
SAMENVATTING De toediening van vaccins als stabiel poeder per inhalatie kan een oplossing zijn voor verscheidene nadelen van de huidige vaccinaties per injectie. Door vaccins te drogen in de aanwezigheid van de juiste suikers zouden ze zodanig kunnen worden gestabiliseerd dat ze getransporteerd en opgeslagen kunnen worden zonder de zogenaamde “cold-chain” (gekoelde omstandigheden) die bij de huidige vloeibare formuleringen noodzakelijk is. Dit zou kunnen leiden tot een kostenverlaging van vaccins waardoor hun beschikbaarheid in afgelegen en onderontwikkelde gebieden over de gehele wereld zou kunnen verbeteren. De toediening van vaccins aan de longen is naald-vrij, waardoor het risico op overdragen van ziektes als HIV en hepatitis B door hergebruik van naalden en prikincidenten tijdens massavaccinatieprogramma’s vermeden kan worden. Deze alternatieve toedieningroute behoeft minder assistentie van verpleegkundigen ten opzichte van de huidige parenterale vaccinatie en kan bovendien een uitkomst bieden voor personen met naaldangst. Tenslotte, voor ziektes die zich via de luchtwegen verspreiden, zoals de mazelen en influenza, volgt pulmonale vaccinatie de natuurlijke route van de ziekteverwekker en kan daardoor een locale immuunreactie opwekken in de porte d’entrée. Deze locale immuunreactie kan een betere bescherming geven tegen deze ziektes. In hoofdstuk 2 worden verschillende apparaten- en formuleringenopties, die gebruikt kunnen worden voor pulmonale vaccinatie, besproken. Vaccins worden dikwijls éénmalig gegeven. Daarom genieten goedkope inhalatieapparaten voor éénmalig gebruik de voorkeur. Vanzelfsprekend moeten deze apparaten ondanks deze eisen wel effectief zijn. In het verleden zijn vernevelaars met succes ingezet voor het toedienen van het mazelenvaccin aan de longen [1]. Het gebruik van perslucht of elektriciteit, de lange toedieningtijd en de grote restvolumes zijn echter grote nadelen van dit type apparaten. Droogpoederinhalatoren (DPI’s) hebben geen perslucht of elektriciteit nodig en de toediening duurt slechts enkele seconden. Wel moet een correcte inhalatiemanoeuvre aangeleerd worden, wat tijd en de assistentie van een deskundige vereist en een zeker niveau van begrip van de persoon die gevaccineerd wordt. Wegwerp DPI’s voor eenmalig gebruik genieten de voorkeur, maar de productie ervan moet goedkoop zijn om de kosten van vaccinatie laag te houden. Een voordeel van het gebruik van DPI’s is dat het vaccin als poeder toegediend wordt. Wanneer het vaccin geformuleerd wordt met de juist hulpstoffen en gedroogd onder de juiste omstandigheden, dan kan de houdbaarheid sterk verhoogd worden (zie ook hoofdstuk 3 en 4). Om poeders voor inhalatie te produceren zijn één-stapsprocessen zoals sproeidrogen, sproeivriesdrogen en drogen met behulp van superkritische vloeistoffen gewenst. Ten opzichte van processen die uit meerdere stappen bestaan, verlagen éém-stapsprocessen de productiekosten, de risico’s op contaminatie en kwaliteitsverschillen tussen de verschillende partijen. Om de houdbaarheid van op eiwit gebaseerde vaccins te verhogen, kunnen deze gedroogd worden in de aanwezigheid van suikers. Hoofdstuk 3 beschrijft de zoektocht naar de optimale suiker om de houdbaarheid van eiwitten na vriesdrogen te verhogen. Vier verschillende eiwitten werden gevriesdroogd in de aanwezigheid van verschillende typen suiker waarna de opslagstabiliteit werd bepaald. Uit de resultaten bleek dat de disaccharide trehalose het eiwit het meest stabiliseerde. Een nadeel van het gebruik van disacchariden is echter hun lage glasovergangstemperatuur (Tg) in vergelijking met oligo- en polysacchari152
Wouter thesis2 copy3.indd 152
28-10-2014 14:29:07
den. Deze lage Tg kan gemakkelijk leiden tot de vorming van plakkerige poeders die duidelijk niet geschikt zijn voor poederinhalatie. Grotere suikers zoals oligo- en polysacchariden hebben een hogere Tg. Deze suikermoleculen gedragen zich echter als starre staafjes en ze zijn volumineus, wat ervoor zorgt dat ze moeilijk een dichte coating om het onregelmatige molecuul-oppervlak van het eiwit kunnen vormen. Inuline is een uitzondering want het is een suikermolecuul dat niet star is maar juist flexibel. Daardoor werd verwacht dat inuline wel een dichte coating om het eiwitoppervlak kon vormen. Resultaten lieten inderdaad zien dat inuline een stabieler product gaf dan een oligosaccharide met hetzelfde molecuulgewicht en Tg maar met een starre moleculaire structuur (dextran 5 kDa). Een andere optie die in dit hoofdstuk onderzocht werd, is het gebruik van een mengsel van een disaccharide en een hoogmoleculair polysaccharide met een starre moleculaire structuur. Er werd verwacht dat het polysaccharide voor een hoge Tg zou zorgen, terwijl het disaccharide juist voor de dichte coating om het eiwit zou zorgen om zo het eiwit te beschermen tegen degradatie. Gebruik van de combinatie van trehalose en dextran 70 kDa bleek inderdaad een stabieler product te geven dan gebruik van enkel dextran 70 kDa. Beide succesvolle strategieën werden vervolgens toegepast op het hepatitis B vaccin in hoofdstuk 4. Het hepatitis B oppervlakte antigen (HBsAg) werd gesproeivriesdroogd in aanwezigheid van inuline of een mengsel van trehalose en dextran 70 kDa. Sproeivriesdrogen was gekozen als droogproces omdat hiermee in een éénstapsproces poederdeeltjes met een zodanige grootte geproduceerd kunnen worden dat ze geschikt zijn voor inhalatie. Stabiliteitsstudies lieten zien dat de houdbaarheid bij zowel 20 als 60 °C sterk was verbeterd ten opzichte de houdbaarheid van de huidige vloeibare hepatitis B vaccin formulering. In tegenstelling tot de huidige formuleringen konden beide poeders zelfs kortstondig temperaturen onder 0 °C weerstaan; omstandigheden die zo nu en dan voorkomen tijdens transport en opslag. De immunogeniciteit van de gesproeivriesdroogde poeders werd onderzocht door deze poeders op te lossen en vervolgens intramusculair toe te dienen bij muizen. Hierbij werd gevonden dat, naast de verbeterde houdbaarheid, sproeivriesdrogen van het vaccin ook leidde tot een verhoogde immunogeniciteit van het vaccin. Deze verbeterde immunogeniciteit werd alleen waargenomen wanneer zowel het antigeen als het suiker gesproeivriesdroogd waren. Deze resultaten wijzen er op dat sproeivriesdrogen van het hepatitis B vaccin in de aanwezigheid van inuline of een mengsel van trehalose en dextran 70 kDa resulteert in een product dat geschikt is voor inhalatie met tevens een verbeterde houdbaarheid en immunogeniciteit. Om de effectiviteit van pulmonale vaccinatie in preklinisch onderzoek te bepalen moet het poeder toegediend worden aan de longen van kleine proefdieren; vaak muizen. In hoofdstuk 5 werd het inhalatieapparaat dat vaak gebruikt wordt voor pulmonale toediening van poeder in kleine proefdieren (Penn-Century insufflator) geëvalueerd en vergeleken met een nieuw ontworpen apparaat: de aerosol generator. Resultaten lieten zien dat de Penn-Century insufflator beter in staat was om het poeder te deagglomereren, maar met de aerosol generator konden poederdeeltjes worden gegenereerd die zowel in vitro als in vivo een betere depositie vertoonden. Het onbevredigde depositiegedrag van het poeder gegenereerd met de Penn-Century insufflator kon worden verklaard door de hoge snelheid van de poederdeeltjes die uit de insufflator kwamen. Door de vorming van de aerosol en de daadwerkelijke toediening op te delen in twee stappen werd verwacht dat het depositiegedrag zou verbeteren. Poederdeeltjes toegediend met behulp van de aerosol generator bleSAMENVATTING 153
Wouter thesis2 copy3.indd 153
28-10-2014 14:29:07
ken inderdaad in staat om diep in de longen van muizen te penetreren, zoals aangetoond met visualisatie studies met behulp van een fluorescent label. Op dit moment is het nog niet duidelijk in welk deel van de longen het vaccin terecht moet komen om een optimale immuunreactie te induceren, maar wanneer blijkt dat het vaccin diep in de longen terecht moet komen, dan geniet het gebruik van de aerosol generator de voorkeur boven de Penn-Century insufflator. In hoofdstuk 6 werd geëvalueerd of depositie van het hepatitis B vaccin in de lagere delen van de longen vereist is voor een optimale immuunreactie . Depositie van een poeder in de lagere delen van de longen is veel moeilijker te bereiken dan depositie in de bovenste regionen van de longen, zoals bediscussieerd in hoofdstuk 2. Een studie in muizen liet zien dat wanneer het vaccin toegediend werd aan de bovenste delen van de longen er geen immuunreactie geïnduceerd werd, terwijl toediening diep in de longen (alveolair) wel leidde tot een immuunreactie. Mogelijke verklaringen kunnen gezocht worden in de verlengde verblijftijd na toediening diep in de longen in vergelijking met toediening hoog in de luchtwegen. Deze verlengde verblijftijd vergroot de kans op interactie met het immuunsysteem. Daarnaast kan de mogelijke diffusie van het vaccin vanuit de alveoli naar de afvoerende lymfe knopen van de longen, waar interactie met immuuncellen plaatsvindt, mogelijk de goede immuunreactie verklaren. Gebaseerd op data in de literatuur werd gespeculeerd dat diepe longdepositie niet noodzakelijk is voor alle vaccins, bijvoorbeeld het influenza vaccin lijkt niet diep in de long te hoeven worden toegediend[2]. Onze resultaten laten zien hoe belangrijk de plaats van depositie is na toediening aan de longen. Verder suggereren onze resultaten dat de optimale plaats van depositie verschillend kan zijn voor verschillende vaccins. Met dit aspect dient rekening te worden gehouden wanneer inhalatieapparaten en formuleringen ontwikkeld worden voor pulmonale vaccinatie. Hoofdstuk 7 laat een andere toepassing zien van pulmonale vaccinatie. In deze studie werd geëvalueerd of kippen beschermd kunnen worden tegen aviaire influenza (vogelgriep) door middel van passieve inhalatie van een gesproeivriesdroogd, niet-geadjuveerd, geïnactiveerd influenza vaccin. Kippen werden in een kist geplaatsts waarin het poeder werd verneveld. Provocatietesten met het H5N1 influenzavirus liet zien dat deze kippen beter beschermd waren dan de placebogroep. De resultaten van deze studie geven dus aan dat het in principe mogelijk is om kippen via passieve inhalatie te vaccineren hetgeen een aantrekkelijk alternatief zou kunnen zijn voor het preventief ruimen tijdens vogelgriepuitbraak. Vaccinatie was echter nog niet zo succesvol als vaccinatie via injectie. Het feit dat kippen die het geïnactiveerde virus vaccin met behulp van de insufflator direct aan de longen toegediend kregen net zo goed beschermd waren als kippen die het vaccin via een injectie kregen laat echter duidelijk zien dat bij een hogere dosis via passieve inhalatie kippen volledige beschermd zouden kunnen zijn. Daarom is verder onderzoek dat erop gericht is om de dosis via passieve toediening aan de longen van kippen te verhogen aan te bevelen.
154
Wouter thesis2 copy3.indd 154
28-10-2014 14:29:07
REFERENTIES [1] Bennett JV, Fernandez de Castro J, Valdespino-Gomez JL, et al. Aerosolized measles and measles-rubella vaccines induce better measles antibody booster responses than injected vaccines: randomized trials in Mexican schoolchildren. Bull World Health Organ 2002;80:806–12 [2] Minne A, Louahed J, Mehauden S, et al. The delivery site of a monovalent influenza vaccine within the respiratory tract impacts on the immune response, Immunology 2007;122:316–25
SAMENVATTING 155
Wouter thesis2 copy3.indd 155
28-10-2014 14:29:07
156
Wouter thesis2 copy3.indd 156
28-10-2014 14:29:07
CURRICULUM VITAE Wouter Tonnis was born on the 25th of December in 1983 in Groningen, The Netherlands. After obtaining his high school degree at the Werkman College in Groningen he started his study Pharmacy at the University of Groningen. He performed his master’s project at the Department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy under the supervision of Dr. W.L.J. Hinrichs and Prof. Dr. H.W. Frijlink. During his master’s project he studied stabilizing mechanisms for improving the storage stability of insulin. In 2010 he received his master’s degree in Pharmacy, after which he started as a PhD candidate at the department of Pharmaceutical Technology and Biopharmacy working on powder formulations for pulmonary vaccination. In his project he focused on preparing sugar-based powder formulations for various biopharmaceuticals and vaccines, pulmonary administration methods in mice, and on the application of pulmonary vaccination in mice and chickens. During his PhD research he supervised 15 bachelor’s and master’s projects. In the academic year 2013/2014 he was president of the Groningen Organization for PhD Education and Recreation (GOPHER).
CURRICULUM VITAE 157
Wouter thesis2 copy3.indd 157
28-10-2014 14:29:07
158
Wouter thesis2 copy3.indd 158
28-10-2014 14:29:07
LIST OF PUBLICATIONS Book chapters Tonnis WF, Huckriede A, Hinrichs WLJ, Frijlink HW. Pulmonary administration of subunit vaccines. In Subunit Vaccine Delivery (New York, Springer) (in press)
Journal articles Tonnis WF, Bagerman M, Weij M, Sjollema J, Frijlink HW, Hinrichs WLJ, de Boer AH. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powders over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. Eur J Pharm Biopharm 2014 (in press) Peeters B, Tonnis WF, Murugappan S, Rottier P, Koch G, Frijlink HW, Huckriede A, Hinrichs WLJ. Pulmonary immunization of chickens using non-adjuvanted spray-freeze dried whole inactivated virus vaccine completely protects against highly pathogenic H5N1 avian influenza virus. Vaccine 2014 (in press) Tonnis WF, Amorij J-P, Vreeman MA, Frijlink HW, Kersten GF, Hinrichs WLJ. Improved storage stability and immunogenicity of hepatitis B vaccine after spray-freeze drying in presence of sugars. Eur J Pharm Sci 2014;55:36-46 Tonnis WF*, Lexmond AJ*, Frijlink HW, de Boer AH, Hinrichs WLJ. Devices and formulations for pulmonary vaccination. Expert Opinion on Drug Delivery 2013;10:1383-97 Tonnis WF, Kersten GF, Frijlink HW, Hinrichs WLJ, de Boer AH, Amorij J-P. Pulmonary vaccine delivery: A realistic approach? J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 2012;25:249-60 Amorij JP, Kersten GF, Saluja V, Tonnis WF, Hinrichs WLJ, Slütter B, Bal SM, Bouwstra JA, Huckriede A, Jiskoot W. Towards tailored vaccine delivery: Needs, challenges and perpective. J Control Release 2012;161:363-76 *Authors contributed equally
LIST OF PUBLICATIONS
Wouter thesis2 copy3.indd 159
159
28-10-2014 14:29:08
160
Wouter thesis2 copy3.indd 160
28-10-2014 14:29:08
