19
DPTE 2004-2010 - Resultaten uit de projecten van het stimuleringsprogramma voor Regeneratieve Geneeskunde
Jacqueline Alblas, UMC Utrecht
Weefselcellen verleiden met een implantaat
Herstel van bot na een trauma lijkt gemakkelijker dan het is. Het opvullen van kleine defecten met keramiek en cementachtige producten gaat nog wel, maar met het toepassen van botachtige constructen van een kubieke centimeter hebben weefselingenieurs de grootste moeite. Hoe kan het kunstmatige materiaal vervangen worden door natuurlijk weefsel en hoe kan ook het inwendige van het implantaat worden voorzien van voldoende zuurstof en voedingsmiddelen? Bioloog dr. Jacqueline Alblas stortte zich bij de afdeling Orthopedie van het UMC Utrecht op diverse aspecten van het herstel van bot. Ze komt tot de conclusie dat het misschien helemaal niet nodig is botregenererende matrixen in te zaaien met cellen. ‘Het werd steeds duidelijker dat de keramische implantaten met ingezaaide botcellen niet opleverden wat we ervan verwachtten’, herinnert Alblas zich het begin van het onderzoek naar botherstel. ‘Het was duidelijk dat we in het construct behalve botvormende cellen ook bloedvaatjes moesten zien te krijgen. Maar als we er al in slagen om bloedvaatjes in het construct te creëren, hoe moeten die dan in vredesnaam aansluiting krijgen op het bloedvaatstelsel van de gastheer? Het leek een onmogelijke opgave.’
Toch zijn Alblas en haar collega’s ermee aan de slag gegaan. Met behulp van de bloed vatvormende groeifactor VEGF (vascular endothelial growth factor), voorlopercellen van het bloedvat endotheel (endothelial progenitor cells, EPCs) en botstimulerende groeifactoren (zoals BMP-2) en voorlopercellen van bot (multi potente stromale cellen) bleken zowel bot als netwerken van bloedvatachtige kanalen te ontstaan. De onderzoekers experimenteerden met verschillende combinaties van groeifactoren en cellen en de tijdstippen waarop deze werden geactiveerd tijdens het botvormende proces. Ze kwamen tot een protocol waarbij de vorming van bloedvaatjes in het implantaat optimaal is. Alblas: ‘De aansluiting van de bloedvaatjes in het construct op de bloedsomloop van het proefdier bleek absoluut geen probleem te zijn. Je hoeft ze bijvoorbeeld niet aan elkaar te naaien. De bloedvatvorming is blijkbaar zo dynamisch, dat de vaatjes in het construct vanzelf aansluiten op de bloedsomloop. Het blijkt dat je heel veel kunt overlaten aan de natuur. Niemand weet bijvoorbeeld hoe de EPCs een netwerk doen ontstaan, er blijkt
heel veel vanzelf goed te gaan. Daardoor ben ik wel op een andere manier gaan denken over herstel van weefsel. Soms hoef je helemaal niet te sturen.’
Geen cellen inzaaien De onderzoekers van het UMC Utrecht hebben zelfs vastgesteld dat er in een goedwerkende matrix van botachtig materiaal met groeifactoren VEGF en BMP-2 helemaal geen voorlopercellen van welke soort dan ook hoeven te worden toegevoegd. Wordt de matrix geplaatst in een bot-omgeving dan zijn de groeifactoren voldoende om de in de omgeving aanwezige botcellen en bloedvatcellen te activeren tot het vormen van bot en bloedvaten. ‘We hebben aangetoond dat dit geldt voor een matrix die in het bot is geplaatst. Wil je botvorming onderzoeken met matrixen die niet in het bot zijn geplaatst, maar onder de huid in bijvoorbeeld spierweefsel, dan moet je er wel voorlopercellen in zaaien. Dat je voor botherstel geen cellen zou hoeven toe te voegen heeft vergaande consequenties voor het behandelen van patiënten. Je kunt dan volstaan met het implanteren van louter bioactieve matrixen. Dat zou een geweldige winst
Botvorming door allogene cellen
betekenen omdat je de stap van het oogsten en opkweken van cellen zou kunnen overslaan.’ Want het halen van de juiste cellen uit het beenmerg betekent een extra operatie voor de patiënt. Daarom hebben Alblas en haar collega’s aanvankelijk onderzocht of het mogelijk is om deze zogeheten multipotente stromale cellen (MSCs) uit andere bronnen te verkrijgen, op te kweken en in te vriezen voor later gebruik in patiënten. Die bronnen zijn bijvoorbeeld donaties uit het bekken van patiënten die een heupoperatie ondergingen of uit verwijderd botmateriaal. Er zijn bijna geen afstotingsreacties van de patiënt tegen deze cellen uit een vreemd lichaam te verwachten omdat de MSCs weinig afweerreactie zouden opwekken. Ze zouden zelfs de activiteit van het immuunsysteem onderdrukken. Alblas: ‘Het blijkt inderdaad mogelijk te zijn om de matrix in te zaaien met zulke allogene MSCs van een ander persoon en deze te implanteren zonder dat er ernstige afstoting ontstaat,
terwijl de botvorming in de matrix net zo goed is als in de implantaten met ingezaaide autologe cellen. We hebben die experimenten gedaan met constructen die bij geiten werden geïmplanteerd in onderhuids spierweefsel. Pas later bleek dat je helemaal geen cellen aan een bio-actief construct hoeft toe te voegen als je dit in het bot zelf implanteert.’
Bio-scaffolder In ideale omstandigheden is het wellicht niet nodig om voorlopercellen in te zaaien om bot te herstellen. Dat is echter minder duidelijk in minder optimale omstandigheden, bijvoorbeeld bij patiënten bij wie botbreuken niet willen helen of bij patiënten met kanker. Dan zijn waarschijnlijk toch implantaten met ingezaaide cellen nodig om de botver vanging te stimuleren. Voor het maken van zulke constructen die gaten in het bot kunnen opvullen en herstellen, hebben de Utrechtse onderzoekers in het kader van het DPTE-programma een Bio-scaffolder toegepast: een printer voor
botmatrixen met cellen. ‘We hebben die gebruikt om laagjes van een hydrogel met daarin verschillende cellen aan te brengen’, zegt Alblas. ‘Een hydrogel kan cellen bevatten en kan bij kamertemperatuur vloeibaar zijn en bij lichaamstemperatuur vast, zodat in het lichaam een stevig implantaat ontstaat. Gebruik je verschillende cellen, dan kun je een construct opbouwen met op de ene plaats vooral botvormende cellen en op de andere plek bloedvatcellen. Zo heb je de mogelijkheid om gedifferentieerd weefsel te vormen en dat te implanteren. We sleutelen nog aan de juiste verhoudingen en instellingen, want we kunnen nu nog geen bot maken met dezelfde structuur als dat in ons lichaam.’
20
DPTE 2004-2010 - Resultaten uit de projecten van het stimuleringsprogramma voor Regeneratieve Geneeskunde
Theo Smit, VUmc Amsterdam
Bot en kraakbeen uit buikvet
Aandoeningen van het bewegingsapparaat drukken zwaar op de Nederlandse samenleving. Niet alleen op de mensen die kampen met bijvoorbeeld lage rugpijn en mobiliteitsproblemen, ook ‘BV Nederland’ levert de toename van zulke aandoeningen door een vergrijzende bevolking een flinke strop. Tissue engineering van bijvoorbeeld versleten tussenwervelschijven in de ruggengraat is veelbelovend. Het fuseren van wervels door een ingebrachte verbinding en het stimuleren van botgroei met bot uit het bekken, wordt wereldwijd al bij anderhalf miljoen patiënten per jaar ingezet. Ook het regenereren van tussenwervelschijven met stamcellen vindt langzaam maar zeker toepassing. De klinische technieken daarvoor zijn echter nogal omslachtig. Dat moet beter kunnen, dacht biomechanisch ingenieur dr. ir. Theo Smit. Hij onderzocht een nieuw concept voor rugchirurgie: tissue engineering via een injectienaald.
‘Technieken die in de kliniek worden toegepast, moeten zo eenvoudig mogelijk zijn’, is Smits parool. ‘Dus moet je voor een behandeling mensen maar één keer opereren en geen ingewikkelde dingen in het laboratorium hoeven doen, zoals het opkweken van cellen.’ Daarom concentreerden Smit en zijn collega dr. Marco Helder zich bij het zoeken naar
stamcellen die bot en kraakbeen kunnen herstellen niet op het beenmerg, maar op vetweefsel. Daaruit kunnen veel meer stamcellen gehaald worden, zodat ze niet in het lab vermeerderd hoeven te worden. Bovendien zit in de rug relatief veel vet, zodat bij een rugoperatie gemakkelijk vetcellen kunnen worden verzameld. Belangrijk is natuurlijk dat ook de stamcellen uit vet, zich in vitro en vivo net zo goed laten sturen als stamcellen uit beenmerg laten sturen tot de vorming van bot, kraakbeen, spieren en endotheel- en zenuwcellen. Smit en zijn collega’s ontwierpen een methode die zij testten in geiten, die veel worden gebruikt als model voor rugproblemen. De onderzoekers slaagden erin op relatief eenvoudige wijze cellen uit het rugvet te halen door het vet klein te snijden, het door enzymen te laten afbreken, te filteren en te reinigen. Dat alles binnen anderhalf uur in een ruimte naast de operatiekamer. Smit: ‘De cellen ontwikkelen zich ook in de richting van bot- of kraakbeenweefsel en we kunnen uit vet honderd tot duizend keer meer cellen halen dan uit beenmerg. We hoeven de stam-
cellen dan ook niet uit het beenmerg in de bekkenkam van de patiënt te halen, wat ook niet altijd een pretje is. Nu kunnen we volstaan alles in één operatie uit te voeren. Dan zijn de cellen verser, zijn de kosten lager en hoeven we aan minder regels te voldoen dan als we de cellen in het laboratorium zouden opkweken.’
Diermodel voor oudere mens Bij de moderne rugoperaties voor hernia worden de twee wervels rond de versleten kraakbeen tussenwervelschijf aan elkaar vastgezet, zodat de zenuwen niet bekneld raken. Geïmplanteerde beenmergcellen moeten de wervels aan elkaar kitten doordat ze bot aan maken. Smit brengt de uit het vet gewonnen cellen in een dragermateriaal voordat dit wordt ingebracht in de constructie waarmee de wervels aan elkaar zijn verbonden. ‘De cellen uit het vet blijken veel sneller aan deze drager te hechten dan de cellen uit het beenmerg. Dat doen ze in tien minuten, terwijl dat anders een dag zou vergen’, zegt Smit. ‘Bovendien blijken vooral de stamcelachtige cellen eraan te hechten. Omdat de drager niet is te zien op röntgenfoto’s, kunnen we
Fibroblasten gekleurd voor F-actine op 9,7 kPA gels, gecoat met collageen I (links) of 80/20 mix van Coll I en Coll V (rechts)
de botgroei tussen de wervels mooi volgen met röntgenbeelden.’ Bij geiten is het fuseren goed gelukt. Overigens geschiedt die fusie ook als alleen dragermateriaal wordt ingebracht, al is die wat minder dan als er ook cellen worden bijgedaan. Wel heeft Smit nog bedenkingen bij de stabiliteit van de verbinding. ‘Bot groeit het best als het belast wordt, maar tegelijkertijd niet teveel vervormt. Als er teveel beweging tussen de wervels zit krijgen we geen bot maar zacht bindweefsel. Daarom worden in de kliniek de wervels ook aan elkaar vastgeschroefd, maar dat is weer een behoorlijke ingreep. Dat zou beter moeten kunnen, maar we weten nog niet hoe.’ Het vastzetten van de wervels is eigenlijk een second best oplossing. De beweeglijkheid van de ruggengraat vermindert erdoor en daarom zouden artsen de gedegenereerde tussenwervelschijf het liefst herstellen. De mogelijkheden daartoe hebben Smit en zijn medewerkers onderzocht in een speciaal ontwikkeld
diermodel. Bij bijna iedereen boven de zestig jaar, zet de degeneratie van de tussenwervelschijven in. Maar niet bij dieren, zoals geiten. De onderzoekers hebben echter bij geiten kunstmatig wel een langzame degeneratie van de tussenwervelschijven weten te bereiken. Ze spuiten een enzym in de schijf dat het kraakbeen langzaam oplost, zodat een degeneratie ontstaat die lijkt op die bij de ouder wordende mens. De eerste paar experimenten met dit model lijken erop te duiden dat ook het herstel van het kraakbeen door het inspuiten van vet cellen en dragermateriaal mogelijk is.
Interessant spanningsveld ‘Er zijn in geiten nog te kleine series gedaan en we kunnen daarbij ook niet speken van een zo doorslaand succes dat we nu direct de kliniek in kunnen gaan’, vindt Smit. ‘Er moet nog veel worden uitgezocht, zoals de aard van het dragermateriaal of de communicatie tussen de ingespoten cellen en die van de gastheer. Dit speelt vooral bij de
botcellen, die bot zowel kunnen opbouwen als afbreken. Welke signalen daarbij belangrijk zijn, proberen we nu te achterhalen. In de kliniek is men vaak niet zo geïnteresseerd in hoe een en ander precies werkt, als het maar werkt. Dat is een interessant spanningsveld, want wij weten graag exact hoe stamcellen kraakbeen van de beste structuur kunnen maken. Daarvoor moet je toch wat dieper in de fundamenten van de cellen duiken.’
21
DPTE 2004-2010 - Resultaten uit de projecten van het stimuleringsprogramma voor Regeneratieve Geneeskunde
Jan de Boer, UTwente
Selectie van botvormende donorcellen
Mesenchymale stamcellen zijn een belofte voor patiënten die te weinig bot hebben. Deze cellen die hun oorsprong hebben in één van de drie embryonale kiembladen, het mesenchym, en te vinden zijn in het beenmerg, kunnen zich ontwikkelen tot meer gespecialiseerde celtypen. Ze kunnen niet alle 220 verschillende celtypen die in het menselijk lichaam voorkomen worden, zoals een embryonale stamcel dat kan, maar wel een handvol typen, zoals vet-, bot-, kraakbeen- en spiercellen. Dr. Jan de Boer van de vakgroep Tissue Regeneration van de Universiteit Twente onderzoekt hoe mesenchymale stamcellen kunnen worden ingezet bij het herstellen van grote beschadigingen van bot. Mesenchymale stamcellen (MSCs) kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg van patiënten. ‘Het verwonderlijke is dat het bij de ene patiënt heel goed lukt om die cellen op te kweken tot botcellen en bot, maar dat het bij andere patiënten veel minder goed gaat’, zegt De Boer. ‘Gebruiken we mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van ratten of geiten, dan lukt het altijd. Er ontstaat in de door ons gebruikte test in muizen dan altijd meer bot dan uit MSCs van patiënten. Ook is er een groot verschil in botvorming tussen
patiënten onderling. Sommige menselijke MSCs doen het goed andere niet, maar ze doen het nooit beter dan ratten- of geiten MSCs. Wij proberen nu te achterhalen hoe dat komt.’ Al sinds de jaren ’90 is er een speurtocht gaande naar manieren om bot te vernieuwen. Bijvoorbeeld voor patiënten die te weinig bot hebben voor het zetten van schroeven bij een botbreuk of voor het vastzetten van tandheelkundige implantaten. Diverse technieken worden daarvoor ingezet - van het gebruik van keramische pasta’s die het omgevend botweefsel moeten stimuleren tot regeneratie, tot de toepassing van botcellen en stamcellen. De onderzoeksgroep waar De Boer werkt, heeft gekozen voor het in het laboratorium vermeerderen van uit patiënten geïsoleerde mesenchymale stamcellen uit het beenmerg. Deze cellen worden aangezet tot differentiatie zodat ze botcellen worden (osteoblasten). Die worden vervolgens ingezaaid in een dragermateriaal dat als implantaat wordt gebruikt. Hoewel experimenten met dieren tot hoop stemden, blijkt het botherstellend vermogen van door patiënten gedoneerde MSCs onvoldoende.
Usual suspects ‘Wij hebben gekeken naar de usual suspects, die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de verschillen: de snelheid van delen van de cellen, de mate van differentiatie in de kweek, de leeftijd van de patiënt. Het blijkt allemaal niet uit te maken’, zegt De Boer. ‘We hebben vervolgens gekozen voor het zoeken naar essentiële verschillen in gen-expressie. Van 62 donoren hebben we met behulp van de micro-array techniek gekeken naar de relatie tussen de expressie van 40.000 genen en het vermogen van deze cellen om bot te vormen. We hebben daarbij verschillende kenmerken gevonden. Door het gebruik van geavanceerde technieken om veel gegevens met elkaar te vergelijken, hebben we uiteindelijk een kenmerk gevonden dat met grote nauwkeurigheid voorspelt of donorcellen geschikt zijn voor de regeneratie van bot.’ Dat kenmerk is CADM1, een gen dat de informatie bevat voor een eiwit dat is betrokken bij de signaaloverdracht tussen cellen. De techniek die De Boer en zijn collega’s hebben gebruikt is ook gebruikt door het bedrijf Agendia, dat de zogeheten MammaPrint voor
Bioluminescent imaging of luciferase in living mice under the control of the collagen type I promoter. During ageing, the expression of the transgene declines.
de behandeling van borstkanker heeft ontwikkeld. De test op botvormende eigenschappen van MSCs heeft een vergelijkbare voorspellende waarde als de MammaPrint. ‘We hebben de techniek getest op een groep donoren en de eerste achttien daarvan hebben we foutloos voorspeld’, zegt De Boer enthousiast. ‘Er blijkt heel veel variatie te zijn. We hopen de tissue engineering in de kliniek te gaan toepassen voor bijvoorbeeld het verdikken van het kaakbot bij mensen die, volgens de test, goede botvormende eigenschappen hebben.’ Het uiteindelijke doel van De Boer en zijn collega’s is om een stap verder te komen, namelijk ook die mensen te kunnen behandelen van wie de mesenchymale stamcellen minder goede of zelfs slechte botvormende eigenschappen hebben. ‘CADM1 is een gen dat bij veel activiteiten in cellen, zoals de overdacht van signalen tussen cellen, is betrokken. We proberen nu te begrijpen wat de rol van CADM1 is bij de botvor-
ming en stoffen te ontwikkelen die deze rol stimuleren. We onderzoeken ook of CADM1 gebruikt kan worden in een test voor het bepalen van regeneratieve eigenschappen van cellen ten behoeve van andere weefsels.’
Reverse engineering Steeds vaker passen onderzoekers bij tissue engineering de techniek van reverse engineering toe. Die techniek is vergelijkbaar met de scholier die een opwindwekker uit elkaar haalt en weer in elkaar zet (en dikwijls enkele radertjes overhoudt). ‘We kijken in een testsysteem hoe iets in elkaar zit en proberen dan het effect van kleine door ons aangebrachte veranderingen te meten’, zegt De Boer. Het testsysteem voor de botvorming van menselijke opgekweekte en gedifferentieerde mesenchymale stamcellen is de naakte muis. Deze dieren hebben een genetische afwijking waardoor ze geen specifiek immuunsysteem ontwikkelen en ook geen afweerreactie ontwikkelen tegen geïmplanteerde men-
selijke cellen. De opgekweekte osteoblasten worden onder de huid van de muizen gebracht en na zes weken wordt onderzocht hoeveel bot ze hebben gevormd. De Boer: ‘Met behulp van reverse engineering zijn we erachter gekomen dat de behandeling van MSCs met het stofje cyclisch AMP er toe leidt dat de cellen niet alleen beter tot botcel differentiëren maar ook dat ze stoffen gaan uitscheiden die omliggende, nietgedifferentieerde MSCs, aan kunnen zetten tot differentiatie. De ontdekking van dat technische principe biedt veel mogelijkheden.’
