OSNOVA PěEDNÁŠKY Molekulární biologie prokaryot x Prokaryotický genom, jeho složky a vzájemné interakce A. Bakteriální chromozom B. Plazmidy (F-, R-, Ti-, Col-plazmidy), C. Prokaryotické mobilní elementy (IS, Tn) x Mutace baktérií, jaderná segregace, fenotypové zdržení, fluktuaþní test, metody selekce mutant x Reparace mutaþních poškození DNA x Využití transpozonĤ ke studiu prokaryotického genomu (Transpozonová mutageneze) x ZpĤsoby pĜenosu genetické informace u prokaryot
Doporuþená literatura: Rosypal S. a kol.: Obecná bakteriologie, SPN Praha 1981. Joset F.: Guespin-Michel J. Prokaryotic Genetic. Blackwell Science ltd. 1993. Lewin B.: Genes V-VII, Oxford University Press, Oxford, New York Tokyo 1994-2000. Maloy S.R. et al.: Microbial Genetics, 2. vydání, Jones and Barlett Publ, Boston-London, 1994. Birge E.A.: Bacterial and bacteriophage genetics. Springer 2000. Rosypal S. a kol. Úvod do molekulární biologie. 1998-2002.
A. Konjugace B. Transdukce, kapsdukce C. Transformace x Restrikþní a modifikaþní systémy prokaryotických bunČk x
Evoluce bakteriálního genomu
Význam prokaryot z hlediska molekulární biologie
- Modelové organismy pro studium základních biologických procesĤ - krátká generaþní doba, vysoký poþet jedincĤ - snadná kultivace na definovaných pĤdách (alespoĖ u vČtšiny) - dobĜe pĜístupné studiu, snadná izolace biol. makromolekul a struktur - možnost sledování genomových zmČn v krátkých þasech studium evoluce
Praktický význam prokaryotických organismĤ - patogenita (parazitismus, symbioza) - využití v biotechnologiích (kvasný prĤmysl, pĜíprava nápojĤ a potravin) - producenti významných látek (antibiotika, enzymy, farmaka, sekundární metabolity) - producenti cizorodých látek pĜipravených metodami GI (inzulin, hormony aj). - pĜíprava probiotik - pĜíprava vakcín - využití extrémofilĤ a jejich produktĤ
Srovnání velikosti genomĤ prokaryot a eukaryot
U prokaryot neplatí paradox hodnoty C
replikony
Obsah GC = 22-75mol%
Prokaryota s lineárním chromozomem Streptomyces (ambofaciens, lividans) 10 Mb Borrelia burgdorferi (B. hermsii) 0.95 Mb Coxiella burnetii 2,1 Mb Paracoccus denitrificans - tĜi molekuly DNA 2 Mb; 1,1 Mb; 0,64 Mb, dvČ jsou lineární Agrobacterium tumefaciens
Genom Agrobacterium tumefaciens C58
BAKTERIE
Sekvencované genomy prokaryot
Haemophilus influenzae KW20 Mycoplasma genitalium G-37 Synechocystis sp.PCC 6803 Mycoplasma pneumoniae M129 Escherichia coli K12-MG1655 Helicobacter pylori 26695 Bacillus subtilis 168 Borrelia burgdorferi B3 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Aquifex aelicus Treponema pallidum Nichols Chlamydia trachomatis serovar D Rickettsia prowazekii Madrid E Helicobacter pylori J99 Chlamydia pneumoniae CWL029 Thermotoga naritima MSB8 Deinococcus radiodurans RI Vibrio cholerae EI Tor N16961 Campylobacter jejuni NCTC 11168 Chlamydia pneumoniae AR39 Chlamydia trachomatis MoPn Nigg Pseudomonas aeruginosa PAO1 Neisseria meningitidis Z2491 Xylella fastidiosa E. coli 0157:H7 EDL933 Mycobacterium leprae ARCHAEA Methanococcus jannaschii DSM 2661 Methanobacterium thermoautotrophicum Archaeoglobus fulgidus DSM 4303 Pyrococcus horikoshii (shinkaj) Aeropyrum pernix K1 Pyrococcus abyssi GE5 EUKARYOTA Saccharomyces cerevisiae S288C Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana Lidský genom (Collins) Lidský genom (Venter)
Velikost genomu (kb)
Poþet genĤ
rok
1830 580 3573 816 4639 1667 4214 1230 4411 1551 1138 1042 1111 1643 1236 1860 3284 4033 1641 1229 1069 6264 2184 2679 4100 3268
1850 468 3168 677 4289 1590 4099 1256 3959 1544 1041 896 834 1495 1052 1877 3187 3885 2106 1052 924 5570 2121 2904 (K12+1387) ~2000
1995 1995 1996 1996 1997 1997 1997 1997 1998 1998 1998 1998 1998 1999 1999 1999 1999 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2001 2001
1664 1751
1750 1918
1996 1997
2178 1738 1669 1765
2493 1979 2620 1765
1997 1998 1999 -
12,07 97,00 137,00 115,40 2693(84%) 2654(83%)
6294 19099 14100 25498 31780 39114
1997 1998 2000 2000 2001 2001
Typy sekvencí prokaryotického genomu
Kódující oblasti (ORF se známou nebo neznámou funkcí) Inzerþní sekvence Transpozony Profágy a defektní fágy
Sekvence pĜepisované do RNA (rRNA, tRNA)
Repetice (15 – stovky bp) ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Krátké roztroušené repetitivní sekvence Dlouhé roztroušené repetitivní elementy Mosaikové repetitivní elementy Hypervariabilní mikrosatelity, mononukleotidová opakování
i Chi-místa a jim podobné (oktanukleotidy) i Rhs elementy (9,6 kb u E. coli)
Výsledky získané ze srovnání sekvencovaných genomĤ (30 genomĤ - 45 Mbp DNA – 44 000 ORF, z nichž polovina má dosud neznámou funkci) 1. Poþet informaþních genĤ (napĜ. geny pro replikaci, transkripci nebo translaci aj) je v každém genomu zhruba stejný, i když se jejich velikosti liší až 5x. Tyto procesy vyžadují základní sadu proteinĤ. 2. Poþet genĤ ostatních funkþních kategorií (biosyntéza aminokyselin, získávání energie, metabolismus a transport, regulaþní funkce) je mnohem variabilnČjší a má tendenci se zvČtšovat 3. Se zvČtšováním velikosti genomu pĜibývá paralogních genĤ a zvČtšuje se též biochemická komplexita organismu. 4. Jedna þtvrtina ORF u každého druhu je jedineþná a nemá významnou sekvenþní homologii k žádné dostupné proteinové sekvenci. Horizontální pĜenos genĤ (z analýzy 17 kompletních genomĤ bakterií a 7 archeií – rozdíly v obsahu GC a používání kodonĤ) Poþet HT genĤ kolísá od 1,56 do 21,4%.
ýasto pĜenášené geny: operaþní geny pro komunikaci (regulace, bunČþné procesy) a bunČþnou strukturu MénČ þasto pĜenášené geny: informaþní geny (replikace, transkripce, translace aj) VČtšina HT genĤ je jen v jedné nebo dvou vývojových liniích. NČkteré z tČchto genĤ jsou geny tvoĜící þásti profágĤ, ostrovy patogenity, transpozony, intergázy, rekombinázy.
Genomické ostrovy (bloky DNA se znaky mobilních genetických elementĤ) - fitness ostrovy ¾ ¾ ¾ ¾
ekologické ostrovy saprofytické ostrovy symbiosové ostrovy ostrovy patogenity
TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH A. Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice x x x x x
Trinukleotid TGG – nejþastČjší trinukleotid E. coli (souþást penta nebo oktanukleotidĤ) Nonamer AAGTGCGGT (uptake signal sequence –USS) H. influenzae - 1465 kopií TandemovČ opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n nebo (GCC)n - vysoce repetitivní u E. coli, S. typhimurium a Shigella sp. Short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences - heptanukleotidová opakování u sinice Calothrix Major polymorphic tandem repeat (MPTR) - polymorfní 10-bp DR u Mycobacterium tuberculosis a dalších mykobakterií (podobnost s místy Chi a roztroušenými REP elementy)
B. Krátké roztroušené repetitivní sekvence (kratší než 50 bp) x x x x
REP (repetitivní extragenové palindromatické sekvence) 38 bp, 500 REP u E. coli PU (palindromic units) u E. coli a S. typhimurium. Mnohokopiový 26-mer (Ngrep) u Neisseria gonorrhoeae a N. meningitidis Mnohokopiový 24-mer DR element u Mycobacterium bovis (38 kopií)
C. Dlouhé roztroušené repetitivní elementy (vČtší než 50 bp) x x x x x x x x
intergenic repeat unit (IRU) enterococcal repetitive intergenic consensus (ERIC) 126 bp nebo zkrácené formy. Chromozomová lokalizace se liší u kmenĤ a druhĤ ERIC-like sekvence – celá bakteriální Ĝíše. RLEP (545 - 1063 bp) u Mycoplasma leprae 28 (0,6% genomu) Mx-rep u Myxococcus xanthus - 87 pb jádrová sekvence Dr-rep (SARK) u Deinocccus radidurans Element o variabilní délce (150-192 bp RepMP2, RepMP1, SDC1 (150 bp – 1 kb) u Mycplasma pneumoniae, v genomu 8-10 kopií.. RepMP2-like u Staphylococcus
D. Mosaikové repetitivní elementy x x x x
Bacterial Interspersed Mosaic Elements (BIME) – (kombinace REP a sedmi dalších repetitivních motivĤ). 500 u E. coli a dalších G- enterobakterií (Klebsiella pneumoniae, S. typhimurium) REP MP 1 300 bp element ohraniþený kratšími reeptitivními sekvencemi u M. pneumoniae. BOX elementy – rozptýlené repetitivní elementy u G+ (Streptococcus pneumoniae).
Chromozomové pĜestavby PodmínČny pĜítomností opakujících se sekvencí = substrát pro homologní rekombinace
x
Genetická organizace prokaryotického genomu - velmi kompaktní genom s malými mezerami mezi geny - vČtšina genomu obsazena strukturními geny - malá þást (11%) tvoĜena nekódující DNA - operonové uspoĜádání genĤ (vČtšinou funkþnČ pĜíbuzné) - poĜadí genĤ není u prokaryot konzervováno
Fyzikální organizace bakteriálního chromozomu - ds DNA, neobalené jadernou membránou 5 - vazba malých proteinĤ typu HU (histon-like) - 10 molekul, ovlivĖujících flexibilitu DNA (ohýbání DNA do kruhĤ) - 50 superhelikálních smyþek, bez úþasti RNA - kontrola stavu superhelicity: topoizomeráza, gyráza – rozmotání po replikaci, pĜichycení na membránu -
Charakteristika plazmidĤ
Struktura chromozomu E. coli
dsDNA – kružnicová nebo lineární, velikost: 1-1000 kb
Základní typy plazmidĤ: kryptické - funkce neznámá epizomální - reverzibilní intergace do chromozomu hostitele konjugativní - schopné pĜenosu konjugací mobilizovatelné – pĜenositelné za pĜítomnosti konjugativního plazmidu
PĜíklady plazmidĤ: * F-plazmidy (fertilitní faktor, konjugativní) - zodpovČdné za konjugaci, pĜíp. mobilizaci jiných plazmidĤ * R-plazmidy (R-faktory) - zodpovČdné za rezistenci k antibiotikĤm, Ĝada z nich konjugativní * kolicinogenní (Col-plazmidy) - tvorba proteinĤ s antibiotikovým charakterem (Enterobacteriaceae) * Ti-plazmidy (tumory indukující) - tvorba nádorĤ u dvoudČložných rostlin (Agrobacterium tumefaciens) * plazmidy odbourávající organické slouþeniny (Pseudomonas) * plazmidy podílející se na fixaci vzdušného dusíku (Rhizobium).
4,6 Mbp, 50% GC, 1 Pm
* Plazmidy používané jako vektory pro pĜenos DNA (pBR322, pUC)
