OPORY KE STUDIU JEDNOOBOROVÉ BIOLOGIE NA KATEDŘE BIOLOGIE PŘF UJEP BIOLOGIE PROKARYOT A VIRŮ JAN MALÝ KATEDRA BIOLOGIE PŘF UJEP

OPORY KE STUDIU JEDNOOBOROVÉ BIOLOGIE NA KATEDŘE BIOLOGIE PŘF UJEP

BIOLOGIE PROKARYOT A VIRŮ JAN MALÝ

KATEDRA BIOLOGIE PŘF UJEP 2005

OBSAH 1.

Úvod do mikrobiologie - postavení a místo mikroorganismů v přírodě

1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7.

Mikrobiologie - význam mikroorganismů Mikroorganismy a jejich životní prostředí Význam mikroorganismů pro člověka Historické kořeny mikrobiologie - Hook, van Leeuwenhoek, Cohn Historické kořeny mikrobiologie - Pasteur, Koch a první čisté kultury Historické kořeny mikrobiologie - položení základů obecné mikrobiologie Moderní éra mikrobiologie

2.

Struktura a funkce bakteriální buňky 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8.

3.

4.

5.

… 10

Metabolismus fototrofů Metabolismus fototrofů - anoxygenní fotosyntéza Metabolismus fototrofů - oxygenní fotosyntéza Metabolismus chemolitotrofů Anaerobní metabolismus - anaerobní respirace Anaerobní metabolismus - fermentace a synantrofie Oxidace uhlovodíků a role kyslíku v katabolismu organických látek Bakteriální fixace dusíku - nitrogenáza Genetika bakterií

5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5.

… 7

Dělení bakteriální buňky Růst bakteriální populace Techniky měření bakteriálního růstu Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv teploty Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv pH, osmotického tlaku a kyslíku Metabolismus bakterií

4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8.

… 3

Mikroskopie a morfologie buňky Buněčná morfologie prokaryot Struktura a funkce cytoplazmatické membrány prokaryot Buněčná stěna prokaryot Vnější membrána gram-negativních bakterií Povrchové struktury a inkluze prokaryot Struktura a funkce endospor Bakteriální lokomoce a struktura bičíků Růst bakterií

3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5.

… 1

Bakteriální chromozóm Mutace a rekombinace bakterií Výměna genetické informace u prokaryot Plasmidy - struktura a funkce Bakteriální konjugace

… 17

5.6. Bakteriální genetika a klonování genů 5.7. Mutageneze in vitro 6.

Evoluce a taxonomie prokaryot 6.1 6.2 6.3 6.4

… 21

Evoluce a první formy života Metody studia evolučních vztahů Evoluce prokaryot Taxonomie prokaryot a její vztah k fylogenezi

7.

Regulace růstu prokaryot a virů

7.1 7.2 7.3 7.4.

Fyzikální metody regulace růstu bakterií – sterilizace Chemické metody regulace růstu bakterií Antimikrobiální prostředky pro in vivo aplikaci Rezistence a hledání nových účinných látek

8.

Ekologie bakterií

8.1 8.2. 8.3. 8.4. 8.5. 8.6. 8.7.

Mikrobiální ekosystém Výskyt bakterií v půdě a sladkovodních ekosystémech Výskyt bakterií v mořských ekosystémech Cyklus uhlíku a kyslíku Cyklus dusíku Cyklus síry a železa Bioremediace

9.

Základy virologie

9.1 9.2 9.3

Stavba viru a virionu Životní cyklus viru - replikace Diverzita virů - definice základních typů

10.

Interakce mikroorganismů s člověkem

10.1. 10.2. 10.3. 10.4. 10.5.

Základní přehled interakcí mikroorganismů s člověkem Mikrobiální flóra člověka Patogenní interakce - patogeneze a její příčiny Virulentní faktory a toxiny Faktory ovlivňující infekci

11.

Základy epidemiologie

11.1. 11.2. 11.3. 11.4. 11.5.

Základní principy a pojmy epidemiologie Rezervoár nemocí a epidemie Přenos infekčních onemocnění Epidemiologie a zdravotnictví Současná epidemiologická rizika

… 24

… 27

… 31

… 37

… 43

Studijní opory biologie

Malý J. Biologie prokaryot a virů

1.

ÚVOD DO MIKROBIOLOGIE - POSTAVENÍ A MÍSTO MIKROORGANISMŮ V PŘÍRODĚ

1.1.

Mikrobiologie - význam mikroorganismů

Mikroorganismy představují početnou skupinu organismů zahrnující jednobuněčné, popř. klastry jednobuněčných eukaryontních mikroorganismů, prokaryontních mikroorganismů (bakterií) a nebuněčných virů. Mikroorganismy jsou často vhodné modelové organismy pro relativní jednoduchost, snadnou kultivaci, biochemické a genetické studie. Mikrobiologie patří mezi základní biologické vědy, zabývající se výzkumem mikroorganismů. Součástí mikrobiologie je jak základní, tak aplikovaný výzkum. Mikrobiologie se zabývá studiem řady praktických problémů v oblasti medicíny, zemědělství, životního prostředí, potravinářského a biotechnologického průmyslu. 1.2.

Mikroorganismy a jejich životní prostředí

V přírodních podmínkách se mikrobiální buňky vyskytují v asociacích zvaných populace. Populace buněk vzniká násobným dělením původní buňky. V daném prostředí je vetšinou přítomno více populací různých buněk - tzv. mikrobiální společenství. Vědní odvětví ekologie mikroorganismů se zabývá výzkumem mikrobiálních společenství. Ekosystém je soubor živých organismů a neživých složek životního prostředí v dané lokalitě. Nejdůležitější mikrobiální ekosystémy zahrnují vodní (moře, sladkovodní zdroje), terestrické ekosystémy (půda, podzemní prostory) a vyšší organismy (rostlina, živočich). Mikroorganismy jsou nezastupitelné v každém ekosystému, tvoří největší část biomasy na Zemi. 1.3.

Význam mikroorganismů pro člověka.

Patogenní mikroorganismy jsou původci infekčních onemocnění člověka. Počátky mikrobiologie byly spojeny s hledáním příčiny infekčních onemocnění. Znalost patogenů a mechanismu jejich působení umožnila omezit rozsah infekčních onemocnění v lidské populaci. Mikroorganismy jsou nepostradatelné v zemědělství. Symbiotické organismy fixující dusík omezují spotřebu hnojení. Bakterie v rumen přežvýkavců napomáhají trávení celulózy. Půdní bakterie přeměňují uhlík, dusík a síru do dostupné formy pro rostliny. Infekční onemocnění rostlin a živočichů způsobují ekonomické ztráty v zemědělství. Mikroorganismy způsobují velké ekonomické ztráty v oblasti potravinářské výroby. Mikrobiální hniloba znehodnocuje potraviny, je proto nutná konzervace potravin. Z důvodu potenciální kontaminace jsou nároky na hygienu přípravy potravin velmi vysoké. Důsledná -1-



hygiena omezuje nebezpečí potravinových nákaz. Mikroorganismy jsou nezastupitelné při fermentačních výrobách (jogurt, sýr, alkohol). Mikroorganismy přeměňují energii. Např. přírodní metan je produktem metanogenních bakterií. Fotoautotrofní organismy zachycují světelnou energii a přeměňují ji na biomasu. Bioremediace je schopnost mikroorganismů odstraňovat odpadní látky vzniklé činností člověka (pesticidy, nejrůznější toxické látky). Biotechnologie využívá mikroorganismy k průmyslovým syntézám řady látek. Rozvoj biotechnologie je umožněn rozvojem genového inženýrství. Např. inzulin je produkován modifikovanými bakteriemi s vloženým genem pro lidský inzulin. Některé příklady jsou shrnuty na Obr.1. 1.4.

Historické kořeny mikrobiologie - Hook, van Leeuwenhoek, Cohn

První pozorování mikroorganismů byly spojeny s vynálezem mikroskopu. V roce 1655 publikoval v časopise Micrographia Robert Hook první náčrty mikroorganismu - plodničky plísně (Obr.2). První pozorování bakterií bylo učiněno holandským obchodníkem Antoni van Leeuwenhoekem v roce 1676 a zveřejněno v roce 1684 v Londýně.. Za zakladatele bakteriologie je považován německý botanik Ferdinand Cohn (1828-1898). Jako první popsal životní cyklus rodu Bacillus a tvorbu endospor. Vytvořil základy bakteriální klasifikace a metodické postupy pro aseptickou práci při kultivaci mikroorganismů. Založil první odborný časopis věnující se bakteriologii. 1.5.

Historické kořeny mikrobiologie - Pasteur, Koch a první čisté kultury

O rozvoj mikrobiologie a řady mikrobiologických technik se zasloužil Louis Pasteur (18221895). Prokázal, že pokud je zamezeno kontaminaci okolí (vzduchu) sterilizací, nedochází k hnilobným procesům. Pasteurizace je technika sterilizace využívaná ke konzervaci potravin a nápojů. V průběhu let 1880 až 1890 vynalezl vakcínu proti anthraxu (sněti slezinné) a vzteklině. Robert Koch (1843-1910) experimentálně prokázal, že původce infekčních onemocnění je přenos mikroorganismů. Na základě studia antraxu došel k tzv. Kochovým postulátům. Vytvořil několik laboratorních metodik vedoucích k izolaci čistých bakteriálních kultur, především na podkladě ztužených medií ve formě agarových ploten. Objevil a izoloval původce tuberkulózy - bakterii Mycobacterium tuberculosis. Za tento objev obdržel Nobelovu cenu za medicínu a fyziologii v roce 1905 (Obr.3). 1.6.

Historické kořeny mikrobiologie - položení základů obecné mikrobiologie

-2-



Počátek 19. století přinesl narůstající objem poznatků o diverzitě a fyziologii mikroorganismů. Byl tak položen základ rozvoje tzv. obecné mikrobiologie. Martinus Beijerinck (1851-1931) izoloval řadu především půdních bakterií jejich kultivací na selektivních živných půdách, např. nitrifikační a sirné bakterie (Obr.4). Sergej Winogradsky (1856-1953) se zabýval rovněž studiem sirných a nitrifikačních bakterií. Je autorem konceptu chemolitotrofie, tj. schopnosti bakterií získávat energii oxidací inorganických látek (Obr.5). Objevil existenci chemoautotrofů, tj. bakterií získávajících uhlík ve formě CO2 (přičemž energii získávají z jiného zdroje než ze světelného záření, v protikladu proti fotoautotrofním organismům). Formuloval princip bakteriální fixace plynného dusíku. Objevil první virus. Je autorem klasické monografie Soil Microbiology. Shrnutí nejzásadnějších historických milníků v mikrobiologii je na Obr.6. 1.7.

Moderní éra mikrobiologie

Počátkem 20. století dochází k rozvoji aplikovaných odvětví mikrobiologie, jako je lékařská mikrobiologie (současně s rozvojem základů imunologie), půdní mikrobiologie, mořská mikrobiologie, ekologie mikroorganismů, mikrobiální technologie. Podstatný rozvoj zaznamenal i základní výzkum mikroorganismů. Ten přinesl nová vědní odvětví, jako je systematická mikrobiologie, fyziologie mikroorganismů, biochemie mikroorganismů. Nejvýznačnějším směrem druhé poloviny 20. st. je především rozvoj genetiky bakterií, který položil základy pro vznik molekulární biologie. Počátkem 70. let 20 st. se vyčlenil obor biotechnologie, zabývající se zpočátku genovými manipulacemi bakterií. Současná doba je charakterizována rozvojem genomiky a proteomiky (Obr.7). 2. STRUKTURA A FUNKCE BAKTERIÁLNÍ BUŇKY 2.1.

Mikroskopie a morfologie buňky.

Princip a základní techniky světelné mikroskopie. Limit rozlišení je 0,2 um. Při vysokém rozlišení je nutno využít modrého světla o techniky olejové imerze. Zvýšení kontrastu biologických vzorků je dosaženo barvením. K nespecifickému barvení bakterií se využívá např. metylová modř, krystalová violeť či safranin (Obr.1). Gramovo barvení umožňuje rozlišení bakterií dle stavby buněčné stěny (Obr.2, video.1). Mikroskopie s fázovým kontrastem zvyšuje kontrast buněk a snižuje tak potřebu barvení a tím i poškození mikroorganismu. Princip spočívá v existenci odlišného indexu lomu světla v buňkách a v okolním prostředí. Fluorescenční mikroskopie využívá fluorescence barviv po ozáření (např. -3-



barvivo DAPI). Mikroorganismy, které obsahují chlorofyl lze detekovat autofluorescencí (Obr.3). Mikroskopie atomárních sil (AFM) umožňuje vytvářet 3D obrazy mikroorganismů s vysokým rozlišením v in vivo podmínkách (Obr.4). Konfokální skenovací laserová mikroskopie (Confocal Scanning Laser Microscopy, CSLM) vytváří 3D obrazy mikroorganismů s vysokou ostrostí. Využívá se například ke studiu biofilmů (Obr.5). Obecně se využívá elektronová mikroskopie (v TEM nebo SEM uspořádání). Výhoda je velmi vysoké rozlišení, nevýhoda pozorování upraveného vzorku a možnost vzniku artefaktů (Obr.6 a 7). 2.2.

Buněčná morfologie prokaryot

Sférické bakterie se nazývají koky. Bakterie cylindrického tvaru označujeme jako tyčky. Existují další specifické tvary jako spirochety a filamentární bakterie (Obr.8). Časté je spojení buněk do řetízků. Prokaryota jsou proměnlivé velikosti v rozmezí 0.2 um až 750 um (rod Thiomargarita), obecně jsou menší než eukaryota. Malá velikost bakterií je podstatná z hlediska rychlé difúze molekul, rychlejšiho metabolismu a adaptace na vnější prostředí. Malý průměr zvyšuje poměr povrch/objem buněk. 2.3.

Struktura a funkce cytoplazmatické membrány prokaryot

Cytoplasmatická membrána vytváří rozhraní mezi vnitřním a vnějším prostředím obklopujícím buňku. Je vysoce selektivní semipermeabilní bariérou. Základní struktura fosfolipidové dvojvrstvy je cca 8 nm široká (Obr.9). Jednotková membrána (jm) je tvořena jednou fosfolipidovou dvojvrstvou. Ke stabilizaci dvojvrstvy přispívají některé ionty. Rozlišujeme integrální a periferní membránové proteiny. Model tekuté mozaiky popisuje tekuté vlastnosti membrán. Prokaryota nemají ve srovnání s eukaryoty steroly v membráně (až na řídké vyjímky), obsahují však hopanoidy. Archea mají odlišnou stavbu jm od ostatních organismů. Některé termofilní Archea mají pouze lipidovou monovrstvu (Obr.10). Hlavní funkce cytoplazmatické membrány je selektivní přenos látek, ukotvení proteinů a bioenergetická funkce - zásobárna a místo vzniku energie ve formě proton-motorické síly (Obr.11). Průchod iontů přes cytoplasmatickou membránu je omezen. Voda proniká samovolně difuzí nebo přes tzv. aquaporiny. Pro většinu látek je nutný přenašečový protein (Obr.12). Přenašeče jsou vysoce specifické a projevují saturační kinetiku (Obr.13). Prokaryota mají transportní systém typu jednoduchého transportu, skupinové translokace a tzv. ABC systém (Obr.14). V těchto transportních systémech je vyžadována energie (např. ATP, proton-motorická síla, jiné energeticky bohaté látky). Bakterie využívají tři typy transportních

-4-



mechanismů - uniport, symport, antiport (Obr.15). Bakterie Escherichia coli dopravuje disacharid laktózu přes cytoplazmatickou membránu pomocí jednoduchého transportu tzv. lac permeázou (Obr.16). Při skupinové translokaci dochází k modifikaci látky v průběhu transportu. Příkladem je fosfotransferázový systém dopravující cukry glukózu, mannosu a fruktózu do bakterie E. coli (Obr.17). Tzv. ABC transportní systém využívá vysoce specifické substrát-vázající proteiny v periplasmovém prostoru gram-negativních bakterií k jejich dopravě přes transportní kanál za současné hydrolýzy ATP cytoplasmatickou kinázou (Obr.18). Proteiny jsou přes cytoplasmatickou membránu transportovány translokázami. Nejdůležitější translokázovým systémem prokaryot je Sec (secretory) systém (např. translokace hydrolytických exoenzymů, jako amyláza nebo celluláza, nebo toxinů). 2.4.

Buněčná stěna prokaryot

Buněčná stěna buňky zabraňuje prasknutí (lýze) jako následku vysokého osmotického tlaku cytoplasmy (rovnající se tlaku cca 2 atmosfér). Prokaryota mají dvě základní varianty stavby buněčné stěny - gram-pozitivního a gram-negativního typu (Obr.19). Základní složkou buněčné stěny obou typů je modifikovaný polysacharid peptidoglykan. Peptidoglykan se skládá z opakujících se jednotek dvou cukerných derivátů. Vzniklé polymery jsou navzájem pospojované pomocí krátkých peptidických řetízků vycházejících z monomerních jednotek v hustou síť (Obr.20 a 21). Gram-pozitivní buňky mají tlustou vrstvu peptidoglykanu, gramnegativní tenkou vrstvu. Peptidové řetízky jsou většinou z D-aminokyselin a kyseliny diaminopimelové (DAP). Peptidoglykan je znám ve více jak 100 variantách, není u Archeot a Eukaryot. Gram-pozitivní buňky obsahují v buněčné stěně kyselinu teichovou (Obr.22). Některé řetězce kyseliny jsou ukotvené v cytoplazmatické membráně a nazývají se kyselina lipoteichová. Enzym lysozym specificky štěpí peptidoglykan a navozuje prasknutí bakterií. Lysozym je formou nespecifické obrany živočichů proti bakteriální infekci. Buňky natrávené lysozymem v izotonickém prostředí neprasknou, vznikají tak protoplasty - buňky bez buněčné stěny kulovitého tvaru (Obr.23). Některá Archea obsahují pseudopeptidoglykan polysacharid podobný stavbou peptidoglykanu (Obr.24). Buněčná stěna Archeí je většinou tvořena polysacharidy, glykoproteiny nebo tzv. parakrystalickou S-vrstvou (Obr.24). S-vrstvy jsou tvořeny proteiny (popř. glykoproteiny) s hexagonální symetrií. 2.5.

Vnější membrána gram-negativních bakterií

-5-



Gram-negativní buňky obsahují mimo cytoplazmatické membrány i tzv. vnější membránu. Skládá se z fosfolipidové (vnitřní) a lipopolysacharidové (LPS, vnější) vrstvy (Obr.25, 26). LPS se skládá z centálního (core) polysacharidu, tzv. O-specifického polysacharidu a lipidu A. Lipoproteiny spojují vnější membránu s peptidoglykanovu vrstvou. LPS, převážně lipid A je tzv. endotoxinem, který je toxickým agens patogenních bakterií. Proteinové kanály poriny procházejí vnější membránou a umožňují snadný přestup látek. Rozlišujeme nespecifické a úzce spefické poriny. Periplasma obsahuje periplasmové proteiny (hydrolytické enzymy, vázající proteiny, chemoreceptory). 2.6.

Povrchové struktury a inkluze prokaryot

Fimbrie a pili jsou krátké filamentární struktury skládající se z proteinů vycházejícího ven z buňky (Obr.28, 29). Fimbrie umožňují přisednutí bakterie na substrát či hostitele. Pili jsou delší jak fimbrie. Jsou receptory virů, mají rovněž funkci adhezinů a především umožňují tzv. konjugaci (tzv. sex pili). Parakrystalické S-vrstvy se vyskytují rovněž u bakterií. Přesná funkce není známa. Slizová pouzdra (popř. obaly) jsou tvořena hydratovanými polysacharidy různé tloušťky a viskozity (Obr.30). Umožňují vazbu na hostitele popř. u nepatogenních bakterií tvorbu biofilmů na povrchu substrátu. Buněčné inkluze slouží zejména k uchování zásobních látek, nejčastěji polyhydroxymáselné kyseliny (PHB) a glykogenu (Obr.31). Polyfosfátová tělíska a elementární síra ve formě sirných globulí vznikají v důsledku metabolismu některých bakterií (Obr.32). Magnetosomy slouží k směrovému pohybu bakterie v magnetickém poli (magnetotaxe). Jsou tvořeny magnetitem a obaleny membránou (Obr.33). Plynné vesikuly umožňují planktoním prokaryotům vznášivý pohyb ve vodním sloupci regulovanou změnou jejich hustoty (sinice, purpurové a zelené fototrofní bakterie, součást vodního květu v letních měsících, Obr.34) . Membrána plynného vesikula je tvořena proteiny, je nepropustná pro vodu, ale propustná pro plyny (Obr.35, 36). 2.7.

Struktura a funkce endospor

Některé bakterie mají schopnost tvořit tzv. endospory procesem sporulace. Endospory prokazují vysokou odolnost vůči extrémním fyzikálním a chemickým vlivům. Sporulace je známa především u bakterií rodu Bacillus a Clostridium. Struktura endospory je naprosto odlišná od obecné strutury bakteriální buňky (Obr.37). Skládá se z několika vrstev. Napovrchu je exosporium, proteinový obal, kortex (peptidoglykan), jádro (protoplast spóry) - obsahuje jaderný obal, cytoplasmatickou membránu, cytoplasmu, nucleoid, ribosomy atd.

-6-



Kyselina dipikolinová v komplexu s vápníkem stabilizuje dehydratovatovanou endospóru. Ke sporulaci dochází v nepříznivých podmínkách (vyčerpání živin) (Obr.38). Sporulaci předchází buněčná diferenciace s účastí více jak 200 genů, celkem se rozeznává 7 fází (Obr.39). Klíčení endospor je rychlé, zahrnuje proces aktivace, klíčení a objemový růst. 2.8.

Bakteriální lokomoce a struktura bičíků

Základem lokomoce bakterií je bičík, popř. klouzavý pohyb po substrátu. Dle umístění bičíku rozeznáváme polární bičík, peritrichu a lophotrichu (Obr.40, 41). Bičík je šroubovicovité stuktury skládající se z monomeru proteinu flagelinu. Bičík rotuje kolem osy. Vlákno bičíku je spojeno tzv. háčkem k bázi bičíku. Báze bičíku má odlišnou stavbu a je zakotvena v povrchových strukturách bakterie (buněčná stěna, membrány). Motor bičíku se skládá z několika stuktur vytvářejících strukturu rotoru a statoru (Obr.42). Stavba motoru je odlišná u gram-pozitivních a gram-negativních bakterií. Energie potřebná k rotaci bičíku pochází z protonového gradientu. Transport protonu skrze tzv. Mot protein roztáčí rotor (1 ot. spotřebuje cca 1000 protonů). Syntézy bičíku se účastní přes 40 genů. První je nasyntetizován motor a háček. Flagelin je syntetizován v cytoplasmě a dopraven kanálem na konec přirůstajícího bičíku (Obr.43). Rychlost a směr otáček bičíku je proměnlivý a regulovaný (Obr.44). U některých bakterií (filamentární sinice, myxobakterie) je znám klouzavý pohyb po substrátu (Obr.45). Existuje více mechanismů klouzavého pohybu. Např. sekrece slizu (polysacharid, cyanobakterie), pohyb vnějších proteinů (Obr.46). Bakteriální pohyb je řízen principem taxe, tj. pohybem v gradientu chemických látek (chemotaxe) nebo fyzikálního pole (např. fototaxe). Chemotaxe je umožněna směrováním pohybu bakterie činností bičíků, tj. střídáním rotace (Obr.47). Směrový pohyb za substrátem je umožněn prodloužením dopředné fáze pohybu. Chemoreceptory v membráně bakterií sledují proměnu koncentrace substrátu v čase. Existuje řada jednoduchých způsobů jak pozorovat chemotaxi bakterií (Obr.48). U řady fototrofních bakterií existuje fototaxe - pohyb organismu za zdrojem světla. Směrovost pohybu řídí fotoreceptor v membráně (Obr.49). Aerotaxe je směrový pohyb v gradientu kyslíku, osmotaxe v gradientu osmotického tlaku. 3.

RŮST BAKTERIÍ

3.1.

Dělení bakteriální buňky

Pod pojmem růst se v mikrobiologii rozumí nárůst počtu buněk v čase. Prokaryota se množí binárním dělením, z původní mateřské buňky vznikají vždy dvě dceřinné (Obr.1). Jako -7-



generace buněk se označují buňky vzniklé dělením v daný okamžik do okamžiku následujícího dělení. Průměrná doba existence jedné generace u E. coli je přibližně 20 minut. Tzv. Fts proteiny (filamentous temperature sensitive proteins) obdobné tubulinu u eukaryot jsou nepostradatelné pro dělení bakterií, mitochondrií a chloroplastů. Divisom je dělící aparát prokaryotní buňky, vznikající na podkladě Fts proteinů. Divisom se utváří koncentricky kolem středu buňky a predeterminuje rovinu dělení. Váže FtsI protein (neboli PBP, penicilin binding protein) který je cílovým místem účinku penicilinových antibiotik (Obr.2). Replikace DNA předchází dělení buňky a formování divisomu. Vývoj nových farmakologicky účinných látek inhibující činnost divisomu a tím i dělení bakterií představuje nový trend vývoje antibakteriálních léčiv. Tvar bakteriální buňky je udržován speciálními proteiny, připomínající strukturou aktin eukaryot (actin like proteins). Příkladem je protein MreB. Koky postrádají tento protein - jsou sférické. Syntéza peptidoglykanové buněčné stěny vznikajících dceřiných buněk je umožněná vkládáním nových podjednotek skrze póry v membráně vytvořených enzymy, tzv. autolysiny (Obr.3). Biosyntéza peptidoglykanu je umožněna existencí proteinu baktoprenolu (C55 alkohol), který přenáší prekursory peptidoglykanu přes cytoplasmatickou membránu (Obr.4). Posledním krokem syntézy je tzv. transpeptidace, tj. vytvoření peptidických vazeb mezi peptidovými řetízky souběžných vláken peptidoglykanu. Reakce je inhibována penicilinem a jeho deriváty. 3.2.

Růst bakteriální populace

Čas potřebný ke zdvojení bakteriální biomasy se nazývá generační doba (čas). Její délka závisí na typu bakterie a vnějších podmínkách (minuty až týdny). V experimentálních podmínkách je počáteční růst bakteriální biomasy exponenciálního charakteru o základu 2 (Obr.5). V logaritmickém uspořádání lze snadno odečíst generační dobu jako směrnici přímky. V uzavřeném systému (tzv. batch kultura) vzniká specifický průběh růstu bakteriální biomasy, který lze popsat tzv. bakteriální růstovou křivkou (Obr.6). Lag fáze je počáteční fáze po inokulaci, způsobená regenerací (popř. adaptací) buněk. Následuje exponenciální fáze jejíž průběh je závislý na podmínkách v kultivovaném prostředí. Stacionární fáze je v batch kultuře navozena spotřebováním substrátu nebo nahromaděním toxických produktů. Fáze odumírání je rovněž exponenciální, ale přesto pomalá. 3.3.

Techniky měření bakteriálního růstu

-8-



Nejjednoduším způsobem počítání buněk spočívá ve využití počítací komůrky (Obr.7). V určitých případech se buňky barevně popř. fluorescenčně značí. Metoda počítání kolonií je výhodná ve stanovení počtu pouze živých buněk (Obr.8). Je vždy nutné vytvoření série ředění (Obr.9). Faktor cfu (colony forming units) vyjadřuje počet narostlých kolonií. Využití turbidometrických měření (stanovení optické hustoty, OD) spočívá ve sledování rozptylu procházejícího světelného paprsku kyvetou s bakteriální biomasou. Vztah mezi hodnotou OD a množstvím biomasy vyjadřuje kalibrační křivka (Obr.10). Kontinuální kultura je narozdíl od batch kultury otevřeným systémem s konstantním kultivačním objemem. Nejčastějším uspořádáním kontinuální kultury je chemostat. Chemostat kontroluje stálou hustotu bakteriální biomasy a stálou koncentraci nejdůležitějších živin (Obr.11). Výhodou je možnost dosáhnout ustálého růstu kultivovaných buněk. 3.4.

Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv teploty

Kardinální body teploty (minimum, optimum, maximum) charakteristické pro každý organismus vymezují oblast teplot, při které je organismus schopný přežít. Nad maximální teplotou dochází k denaturaci proteinů, pod minimální teplotou pravděpodobně k nadměrnému tuhnutí membrán a nemožnosti produkce energie (Obr.12). Psychrofilové mají nízké teplotní optimum, mesofilové průměrné teplotní optimum, thermofilové optimum s vysokou teplotou a hypertermofilové mají extrémně vysoké teplotní optimum (Obr.13). Extremofilové obývají prostředí s extrémními podmínkami - extrémně chladné (antarktida, ledové pole) (Obr.14), popř. extrémně horké (horké prameny, podmořské vývěry horké vody atd.) prostředí. Psychrotolerantní organismus má teplotní optimum kolem 20 stupňů celsia, krátkodobě toleruje i velmi nízké teploty (kolem 0°C). Molekulární podstata odolnosti k mrazu spočívá v odlišné stavbě proteinů (více alfa-helixů) a membrán (více nenasycených mastných kyselin, membrána je tekutější). Hypertermofilové obývají horké prameny, blízko nebo dokonce nad bodem varu. Jedná se o širokou skupinu prokaryot zahrnující bakterie a Archea (Obr.15). Termofilové obývají stejné lokality v chladnějších zónách díky existenci teplotního gradientu (Obr.16). Princip teplotní odolnosti termofilů spočívá v termostabilních proteinech, stabilizátorech (např. diglycerol fosfát), membrány také obsahují nasycené mastné kyseliny (jsou tužší při běžné teplotě) popř. pouze lipidickou monovrstvu (Archea). Enzymy z termofilních organismů se uplatňují v biotechnologii (např. DNA polymeráza z Thermus aquaticus).

-9-

Studijní opory biologie 3.5.


Vliv přírodních podmínek na růst bakteriální populace - vliv pH, osmotického

tlaku a kyslíku Každý mikroorganismus má své růstové pH optimum. Acidofil je organismus, který roste optimálně při nízkém pH (např. bakterie Acidithiobacillus, Sulfolobus (Archea)). Alkalifilové obývají extrémně zásadité prostředí (pH 10 a více). Tato skupina je zastoupená např. bakterií rodu Bacillus a halofilními (slanomilnými) zástupci Archeií. Alkalifilové jsou zdrojem biotechnologicky významných enzymů (proteázy, lipázy). Neutrofilové mají pH optimum při pH 6 až 8. Halofilové vyžadují k růstu přítomnost vyšší koncentrace Na+ ve vodě (např. mořské bakterie). Halotolerantní organismus nevyžaduje přítomnost soli ve vodě, do jisté míry ji však toleruje. Extrémní halofil vyžaduje až 30% NaCl pro optimální růst (Obr.17). K překonání vysokého osmotického tlaku (k čerpání vody do buňky) koncentrují buňky v cytoplasmě osmoticky aktivní látky (manitol, glycin betain, glycerol atd). Aerob vyžaduje k růstu kyslík v množství (parciální tlak) rovnající se parciálním tlaku kyslíku v atmosféře za běžných podmínek. Mikroaerofil vyžaduje menší množství (parciální tlak) než je přítomno v atmosféře. Fakultativní aerob může růst i v anaerobních podmínkách. Anaerob nerespiruje kyslík. Aerotolerantní anaerob toleruje kyslík, přestože ho nespotřebovává. Obligátní (striktní) anaerob je v přítomnosti kyslíku inhibován v růstu či usmrcen (Obr.18). 4.

METABOLISMUS BAKTERIÍ

4.1.

Metabolismus fototrofů

Fototrofní bakterie využívají jako zdroje energie fotosyntézu. V závislosti na způsobu příjmu uhlíku rozeznáváme fotoautotrofy a fotoheterotrofy (Obr.1). Některé bakterie využívají vodu jako donor elektronů v oxygenní fotosyntéze. V jiných případech je donorem elektronů jiná molekula, kyslík nevzniká (anoxygenní fotosyntéza) (Obr.2). Bakterie obsahují chlorofyl (sinice), popř. bakteriochlorofyl. Absorpční spektrum bakteriochlorofylu je výrazně posunuto do oblasti dlouhovlnného červeného záření (Obr.3). Existuje řada bakteriochlorofylů lišících se strukturou a absorpčními maximy (Obr.4). Fotosynteticky aktivní membrány bakterií nejsou lokalizovány v chloroplastu jako u vyšších rostlin. Vznikají invaginací cytoplasmatické membrány (purpurové bakterie), jako uzavřené membránové systémy chlorosomy (zelené bakterie) a thylakoidní membrány (sinice). Bakteriochlorofyl je přítomný v tzv. reakčních centrech (RC) a světlosběrných anténnách (Obr.5). Nejefektivnější světlosběrnou anténou je chlorosom bakterie Chloroflexus (Obr.6).

- 10 -



Karotenoidy se v bakteriální fotosyntéze podílí na transferu energie do reakčního centra a detoxifikaci reaktivních kyslíkových radikálů (Obr.7). Fykobiliproteiny jsou hlavním pigmentem světlosběrných antén sinic a jsou uspořádány v komplexních proteinových komplexech fykobilisomech (Obr.8). 4.2.

Metabolismus fototrofů - anoxygenní fotosyntéza

Fotosyntetické reakční centrum purpurových bakterií je uloženo ve vchlípeninách cytoplasmatické membrány (Obr.9). Skládá se z několika transmembránových alfa-helixů, které tvoří tři základní proteiny L,M,H. Uvnitř RC se nachází tzv. speciální reakční pár bakteriochlorofylu a, který je zodpovědný za nábojovou separaci (Obr.10). Světelná energie zachycená anténou je transportována pomocí tzv. excitonů do RC, kde dochází k excitaci bakteriochlorofylu a. Elektron vzniklý nábojovou separací v RC je transportován po směru spádu redoxní energie mezi řadou kofaktorů na mobilní přenašeč v membráně bakterie QB a dále na membránové cytochromy (Obr.10, 11). Transport elektronu skrze membránu je spojen s transportem protonu a vzniku protonového gradientu. Cyklickou fotofosforylací se elektrony z cytochromů vrací do RC a vytváří se cyklus, při kterém jsou pumpovány protony přes membránu. Vzniklý protonový gradient je využit k tvorbě ATP protonovou ATPázou (Obr.11). Modelovou purpurovou bakterií s prostudovanými geny zodpovědnými za fotosyntézu je rod Rhodobacter. V případě autotrofních purpurových bakterií je tvořeno NADH, přičemž donorem elekronů jsou redukované anorganické látky, převážně sulfan (purpurové sirné bakterie). Ten je oxidován cytochromy c asociovanými s povrchem membrány. NADH je tvořeno zpětným elektronovým tokem z QB (Obr.12, 13). Vzniklá síra vytváří sirné globule uvnitř buňky (Obr.14). Systém tvorby redoxní síly pro fixaci oxidu uhličitého se mírně liší u jednotlivých typů anoxygenních bakterií (Obr.15). 4.3.

Metabolismus fototrofů - oxygenní fotosyntéza

Oxygenní fototrofní bakterie využívají světla k tvorbě ATP a NADPH za oxidace vody na kyslík. V membráně těchto bakterií existují dva odlišné proteinové komplexy zachytávající světelnou energii - fotosystém I a fotosystém II. Oba systémy jsou lokalizovány ve speciálních membránách - thylakoidech. Thylakoidy sinic (cyanobakterií) nejsou umístěny ve specializovaných organelách (chloroplastech), jako je tomu u vyšších rostlin. Elektronový transport v thylakoidech lze znázornit tzv. fotosyntetickým Z-schématem, který vyjadřuje závislost směru toku elektronů na redoxním potenciálu jednotlivých přenašečů (Obr.16).

- 11 -



Prvním krokem transportu elektronu je oxidace molekul vody na kyslík fotosystémem II. Po excitaci centrálního páru chlorofylu a (P680) je elektron předán následujícím přenašečům v řetězci. Po přijmutí elektronu z přenašeče plastocyaninu dojde k zachycení kvanta energie centrálním párem chlorofylu P700 fosystému I a předání elektronu řadou přenašečů na NADP za vzniku NADPH (Obr.16). Transportem elektronů přes membránu je vytvářen protonový gradient. Využitím protonového gradientu je syntetizováno ATP protonovou reverzibilní ATPázou. Tento systém současné tvorby ATP a NADPH je označován jako necyklická fotofosforylace. Při cyklické fotofosforylaci vzniká pouze ATP, elektron je namísto NADP vracen zpět do membrány na cytochrom b6f. Některé sinice dokáží využít sulfan k cyklické fotofosforylaci anoxygenního typu za tvorby NADPH a ATP. Vznikají opět sirné globule (Oscillatoria limnetica). Autotrofní fixace oxidu uhličitého je umožněna existencí Calvinova cyklu (Obr.17, 18). Karboxysomy prokaryot jsou buněčné inkluze obalené membránou obsahující enzym ribulóza-bisfosfát karboxylázu (RubisCO). Karboxyzomy zvyšují efektivitu fixace CO2. Obrácený Krebsův cyklus je alternativní fixační cestou CO2 zelených sirných bakterií (Obr.19a). Enzym citrát-lyáza štěpí citrát na acetyl-koenzym A a oxalacetát. AcetylCoA je využit k syntéze pyruvátu z CO2 za přítomnosti redukovaného ferredoxinu. Tzv. hydroxypropionátová cesta fixace CO2 je popsána u zelené bezsirné bakterie Chloroflexus (Obr.19b). Dvě molekuly CO2 jsou redukovány na glyoxylát. Tato fixace představuje evolučně nejstarší způsob autotrofního způsobu získávání uhlíku z CO2. 4.4.

Metabolismus chemolitotrofů

Chemolitotrofové získávají energii oxidací anorganických látek. Z hlediska příjmu CO2 jsou tyto bakterie jak autotrofní, tak v některých případech mixotrofní. Mixotrofie znamená možnost získání energie z anorganické látky a spotřeby organické látky za ůčelem získání uhlíku. Způsob získání ATP je podobný chemoorganotrofům, donorem elektronů je však anorganická látka, která je v průběhu procesu oxidována. Redoxní síla pro fixaci CO2 je buď samotná anorganická látka, popř. zpětný elektronový transport. Zdrojem anorganických látek jsou výsledkem geologické, biologické či antropogenní činnosti. Vhodnou anorganickou látkou je taková, při které se při spalování na kyslík (O2 je akceptorem elektronu) uvolní dostatek energie (Obr.20). Oxidace vodíku. Existuje řada bakterií a Archeí, které oxidují vodík kyslíkem, nitrátem, sulfátem atd. Membránový enzym hydrogenáza katalyzuje oxidaci vodíku a předává elektrony chinonovým přenašečům. Elektrony jsou přes řadu přenašečů dopraveny na kyslík - 12 -



(redukce na vodu). Výsledkem je tvorba protonového gradientu a ATP (Obr.21). Ve vodě rozpustná hydrogenáza vytváří NADH nutný k fixaci CO2 Calvinovým cyklem. Oxidace redukovaných forem síry. Nejběžnějším zdrojem elektronů v tomto případě je sulfan, elementární síra a thiosulfát. Produktem je sulfát. Při oxidaci sulfanu na sulfát dochází k uvolnění značné energie a okyselení prostředí. Sulfit-oxidáza je centrálním enzymem oxidující sulfit na sulfát. Elektron je transportován na cytochrom c a vzniká protonový gradient a ATP (Obr.22, 23). Ostatní redukované formy jsou nejdříve převedeny na sulfit příslušnými redoxními enzymy (např. APS reduktáza). Uvolněné elektrony jsou opět využity k membránovým procesům, k produkci NADH a fixaci CO2 v Calvinově cyklu. Oxidace železnatých iontů. Oxidace dvojmocného železa na trojmocné je energeticky málo významná a musí být produkována ve velkém množství aby vystačila k růstu bakterie. Trojmocné železo vytváří ve vodě nerozpustný hnědý hydroxid (Obr.24). Řada bakterií oxidujících železnaté ionty patří k obligátním acidofilům, neboť Fe2+ je stabilní v kyselém prostředí. Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans roste v prostředí s pH okolo 1 v důlních nádržích. V periplasmě bakterie oxiduje enzym rusticyanin Fe2+ na Fe3+ a odevzdává elektrony cytochromu c v cytoplasmatické membráně. Elektron je přenesen na cytochrom a a kyslík, který je redukován na vodu. Odejímané protony kompenzují případný pokles vnitřního pH, který vzniká při syntéze ATP. NADH pro Calvinův cyklus je tvořen zpětným elektronovým tokem z cytochromu c (Obr.25). Fe2+ je často zdrojem elektronu pro Calvinův cyklus anoxygenních fototrofů (fototrofních purpurových bakterií) (Obr.26). Nitrifikace. Nejběžnějším donorem elektronů jsou amoniak a nitrit. V průběhu nitrifikace dochází k oxidaci těchto molekul chemolitotrofními nitrifikačním bakteriemi. Nitritové bakterie (např. rod Nitrosomonas) oxidují amoniak na nitrit, nitrátové bakterie (např. rod Nitrobacter) oxidují nitrit na nitrát. Klíčovým enzymem nitritových bakterií je ammonium monooxygenáza, oxidující amoniak na hydroxylamin a hydroxylamin oxidoreduktáza, oxidující vznikající hydroxylamin na nitrit (Obr.27). Vzniklé elektrony jsou částečně využity terminální oxidázou Cyt aa3 k produkci protonového gradientu a redukci kyslíku na vodu. Klíčovým enzymem nitrátových bakterií je nitrit oxidoreduktáza, oxidující nitrit na nitrát. Elektrony uvolněné reakcí jsou dopraveny na terminální oxidázu Cyt aa3 a využity k tvorbě protonového gradientu a ATP (Obr.28). Oba druhy bakterií patří mezi autotrofy a vytváří NADH zpětným tokem elektronů. Některé nitrifikační bakterie mohou v anaerobních podmínkách oxidovat amoniak anoxygenní oxidací (tzv. anammox). V této reakci dochází - 13 -



oxidaci amoniaku nitritem za vzniku plynného dusíku. Proces je lokalizován v speciální membránou uzavřené organele anammoxosomu (Obr.29). Všechny typy nitrifikačních bakterií lze nalézt především v dusíkem bohatých odpadních vodách, kde jsou přítomny jak oxygenní, tak anoxygenní podmínky. 4.5.

Anaerobní metabolismus - anaerobní respirace

V procesu anaerobní respirace dochází k oxidaci substrátu, přičemž jako konečný elektronový akceptor slouží jiné molekuly, než kyslík (železité ionty, nitrát, nitrit, síranový aniont, elementární síra, CO2). Anaerobní respirace je umožněna existencí membránových systémů podobných membránovému systému aerobní respirace. Prokaryota jsou jak obligátními, tak fakultativními anaeroby. Anaerobní respirace je vždy méně energeticky výhodná než oxidace kyslíkem (Obr.30). Assimilační metabolismus anorganických látek slouží k jejich zabudování do složitějších molekul potřebných v organismu. V dissimilačním metabolismu jsou stejné typy molekul využity pouze jako akceptor elektronů. Produkt je v tomto případě vylučován z buněk ven exkrecí. Nitrátová respirace a denitrifikace. Nejčastějším dusíkatým akceptorem elektronů je nitrát. Procesem denitrifikace vzniká řada plynných produktů, včetně molekulárního dusíku (Obr.31). Dusík tak uniká z životního prostředí mnoha organismů do atmosféry. Toto je výhodou např. při čištění odpadních vod, naopak způsobuje určitou ztrátu v zemědělství. Klíčovým ezymem denitrifikace je nitrát reduktáza, která je snadno inhibována kyslíkem (Obr.32). Produkt reakce - nitrit je redukován nitrit reduktázou na oxid dusnatý (NO). V závislosti na typu bakterie proces redukce pokračuje až k plynnému molekulárnímu dusíku (např. Pseudomonas stutzeri) (Obr.33). Sulfátová respirace. Existuje celá řada potenciálních akceptorů obsahujících síru, z nichž nejčastější je sulfát (Obr.34). Sulfát redukující bakterie redukují sulfát až na plynný sulfan. Tyto bakterie jsou v biosféře velmi rozšířené. Sulfát je nejdříve aktivován ATP sulfurylázou na adenosinfosfosulfát (APS), ten redukován APS reduktázou na sulfit a ten redukován sulfit reduktázou na sulfan. Z APS je možné assimilační cestou přes meziprodukt fosfoadenosinfosfosulfát (PAPS) vytvářet organické molekuly využitelné v metabolismu (cystein, methionin) (Obr.35). Nejlépe je prostudován membránový systém bakterie Desulfovibrio (Obr.36). Zdroj elektronů je vodík, který je oxidován hydrogenázou. Elektrony jsou dopraveny transmembránovým complexem HMC pro enzymy redukující sulfát.

- 14 -



Bakterie může rozkládat též pyruvát (nebo laktát), ale ten opět produkuje vodík využitý hydrogenázou. Vzniká protonový gradient a ATP. Jako příklad častých substrátů u dalších bakteriálních zástupců lze uvést acetát (je rozkládán na CO2, který je využit v Calvinově cyklu) a HPO3-. Acetogeneze a methanogeneze. Acetogenní a methanogenní bakterie jsou striktní anaerobové využívající CO2 jako akceptor elektronů. Donorem je plynný vodík (Obr.37). Energie uvolněná během reakce je využita k tvorbě protonového gradientu a ATP. Donorem elektronů acetogenních bakterií jsou kromě vodíku i cukry, alkoholy a aminokyseliny, které jsou cestou přes acetyl-CoA a za spotřeby CO2 transformovány na kyselinu octovou. Metanogenní prokaryota (Archea) využívají H2 a CO2 k produkci methanu. Tento proces je velmi složitý a zahrnuje několik komplexních kroků. 4.6.

Anaerobní metabolismus - fermentace a synantrofie

Fermentace. Fermentace probíhá v anoxygenním prostředí za nedostatku alternativních elektronových akceptorů (sulfát, nitrát atd.). V průběhu fermentace je organická látka přeměněna na energii v podobě ATP (defosforylačními reakcemi) a na konečný fermentační produkt reakce, který je exkretován ven z buňky (Obr.38). Fermentace je energeticky nejméně výhodným způsobem oxidace organických látek. Energii (množství ATP) vytvořenou fermentací určité látky na produkt lze odhadnout ze znalosti energie hydrolýzy energeticky bohatých meziproduktů, které při fermentaci vznikají (Obr.39). Nejběžnější fermentační cesty běžné u bakterií (substrát a jednolivé produkty) jsou uvedené na Obr.40 a 41. Synatrofie označuje vzájemné, velmi úzké propojení metabolismu dvou odlišných druhů bakterií. V rámci této koexistence bakterií dochází k vzájemnému těsnému vyměňování produktů a substrátů metabolismu. Příkladem je produkce H2 jedním druhem bakterie a jeho okamžitá spotřeba jinou bakterií (Obr.42). Velmi často se s synantrofií setkáváme v anoxygenním prostředí. 4.7.

Oxidace uhlovodíků a role kyslíku v katabolismu organických látek.

Molekulární kyslík může být využit nejen jako akceptor elektronů v aerobní respiraci, ale jako přímý oxidant v nejrůznějších anabolických a katabolických pochodech prokaryot. Oxygenázy jsou enzymy které katalizují začlenění kyslíku do organických látek.

- 15 -



Dioxygenázy začlení oba atomy O2 do organické látky. Monooxygenázy pouze jeden atom, druhý je redukován na vodu. Donorem elektronu pro reakci je většinou NADH (Obr.43). Oxidace uhlovodíků. Řada bakterií je schopna využívat alifatické nasycené a nenasycené uhlovodíky jako zdroj elektronů v anaerobních podmínkách. Klíčovou reakcí je oxidace uhlovodíku kyslíkem pomocí monooxygenázy. Konečným produktem posloupností reakcí je acetyl-CoA (Obr.43). Bakterie rodu Pseudomonas mají schopnost využívat aromatické uhlovodíky (katechol, toulen, benzen) v aerobních podmínkách. První krok je opět oxidace uhlovodíku kyslíkem v přítomnosti mono- popř. dioxygenázy (Obr.44). Podobný proces je znám u některých anaerobních bakterií. Metanotrofie a metylotrofie. Methanotrofie je schopnost metabolizovat metan (CH4) na oxid uhličitý. Jedná se o speciální případ metylotrofie. Prvotním krokem reakce je oxidace metanu metan-monooxygenázou v aerobních podmínkách. Elektron potřebný k reakci je dodán cytochromem c z membrány, přičemž zdrojem energie je NADH (Obr.45). Metylotrofie spočívá v schopnosti bakterie získat energií oxidací C1 metylové skupiny přítomné v organické látce. 4.8.

Bakteriální fixace dusíku - nitrogenáza

Fixace molekulárního dusíku je významným místem vstupu dusíku do biosféry. Schopnost fixovat N2 mají pouze některá prokaryota (Obr.46). Řada z nich žije volně, valná část jako symbiont s vyššími rostlinami. Klíčovým enzymem je nitrogenáza, která katalizuje redukci N2 až na amoniak. Nitrogenáza se skládá z monomeru dinitrogenázy a dinitrogenázyreduktázy. Katalitická doména enzymu obsahuje tzv. FeMo-co centrum, které se skládá z atomů železa a molybdenu (Obr.47). Pro velmi nízkou reaktivitu N2 je k jeho redukci na NH3 (6 elektronů) vyžadována vysoká spotřeba energie (16-24 ATP). Nitrogenáza je účinně inhibována kyslíkem, jeho přístupu často brání heterocysta (sinice), rostlina (nody), popř. existence speciálních proteinů ostraňujících kyslík z okolí nitrogenázy (Obr.48). Princip redukce N2 na amoniak je znázorněn na Obr.49 a 50. Detekce přítomnosti a funkce nitrogenázy se provádí v přítomnosti acetylénu, který je nitrogenázou redukován na plynný ethylen. Ten je pomocí plynové chromotografie detekován (Obr.51).

- 16 -

Studijní opory biologie 5.

GENETIKA BAKTERIÍ

5.1.

Bakteriální chromosom


Nejlépe prostudovaným bakteriálním chromosomem je chromosom bakterie Escherichia coli (Obr.1). Pro sestavení podrobné mapy kruhové DNA byly původně využity techniky transdukce a konjugace. Dnes jsou více využívány techniky klonování genů a sekvenování DNA. Celková mapa genomu je rozdělena na "minuty" (jednotky používané hlavně v minulosti, dnes se využívají vzdálenosti v Kbp, tj. tisíce párů bazí) a velmi často se vyznačuje poloha několika restrikčních míst. Analýza genomů o velikosti jednotek Mbp je dnes prováděna automaticky a obrovský nárůst informací spojený s mapováním vytvořil nový vědní obor - bioinformatiku. Chromosom bakterie E.coli, v přírodě se nacházejícího kmene K-12 má velikost cca 4,6 Mbp a obsahuje přibližně 4300 otevřených čtecích rámců (ORF), tj. 88% genomu. Ostatní části jsou tvořeny geny pro tRNA a rRNA (1%), regulační sekvence (10%) a nekódující opakující se sekvence (0,5%). Strukturální geny jsou jak v klasterech, tak volně rozptýlené po genomu. Některé operony jsou transkribovány po směru chromosomu, jiné v protisměru. Replikace je zahajována v replikačním počátku, v tzv. oriC. Ukončena je v místě terminus. Přibližně 38% strukturálních genů je neznámé funkce. Průměrná délka proteinu je cca 300 aminokyselin. V genomu bakterie existují genové rodiny. Přibližně 20% genomu pochází z jiných bakteriálních druhů, které byly přeneseny horizontálním (laterálním) přenosem genetické informace. 5.2.

Mutace a rekombinace bakterií

Mutace je změna genetické informace kódované DNA, vetšinou malého rozsahu. Genetická rekombinace je záměna částí genomů dvou organismů velkého rozsahu. Prokaryota mají haploidní genom a nerozmnožují se pohlavní cestou. Genetická rekombinace je však umožněna tzv. laterálním (horizontálním) přenosem informace mezi dárcovskou a recipientní buňkou. Pro sledování výměny genetické informace mezi dvěma genomy je třeba využít tzv. genetické markery. Mutant je organismus nesoucí příslušnou mutaci. Mutant se liší od své původní linie genotypem a v určitých případech i fenotypem (mutantní fenotyp). Kmen, který je izolován z přírodních zdrojů se označuje jako divoký kmen (wild type). Bakteriální genotyp se vždy označuje třemi malými písmeny a koncovým velkým (hisC), které charakterizují genový produkt (protein HisC). Mutantní genotyp se dále označuje číslicí (hisC1). Bakteriální fenotyp se označuje rovněž třemi písmeny (první velké) a

- 17 -



znaménkem + nebo - v závislosti na přítomnosti či nepřítomnosti určité vlastnosti (např. Hismutant neumí syntetizovat histidin). Selekce mutantů je umožněna růstem bakterie v prostředí, které zvýhodňuje ten který fenotyp (např. selekce rezistentních kmenů bakterií antibiotikem). Screening je vyhledávání mutantů, u kterých není možno provést z různých důvodů selekci. Pro screening je možné využít např. techniku "replica plating" (Obr.2). Mutant, který vyžaduje dodání některé složky (histidin) do kultivačního média se označuje jako auxotrof, opak je prototrof (mutant His- je histidinovy auxotrof). Mutageneze. Mutageny jsou látky které ve zvýšení míře navozují mutace. Chemické mutageny jsou např. anology nukleotidových basí (replikační chyby), alkylační činidla (mutace na nereplikující se DNA), interkalační činidla (posunové mutace po replikaci DNA). Mutagenní záření lze rozdělit na neionizující a ionizující (elektromagnetické). UV záření produkuje thyminové dimery na DNA (chyby při replikaci a transkripci). Jako zdroje UV se v praxi využívá záření germicidní lampy (vlnová délka 260nm). Ionizující záření (rentgenové, gama záření) vytváří volné radikály (destrukce DNA). Existují mutace zavedené DNA polymerázou vdůsledku její špatné reparační aktivity. Bakterie se využívají ke screeningu mutagenů (karcinogenů) v životním prostředí. Nejzámější je tzv. Amesův test. Spočívá v pozorování míry zpětné mutace v auxotrofních mutantních kmenech kultivovaných na půdách v přítomnosti potenciálního mutagenu (His- E.coli) (Obr.3). Rekombinace. Rekombinace je fyzická výměna mezi genetickými elementy. Jedním z možností je homologní rekombinace, tj. výměna homologních sekvencí DNA, probíhající v několika krocích (nastřižení donorové DNA, vmezeření homologní sekvence do recipientní DNA, výměna homologních sekvencí, vznik heteroduplexu) (Obr.4). Donorová DNA se do bakterie může dostat transformací, transdukcí, popř. konjugací (Obr.5) 5.3.

Výměna genetické informace u prokaryot

Transformace. Transformace je proces při které dojde k začlenění volné cizorodé DNA do recipientní buňky. Mezi transformovatelné buňky patří zástupci gram-pozitivních i negativních prokaryot. Při lýze buněk jsou uvolněny fragmenty kolem 10kb obsahující cca 10 genů které jsou typickou délkou DNA vhodnou pro transformaci. Bakteriální transformace byla objevena již v 20. letech min. stolení (F. Griffith) u mutantních a wild type kmenů bakterie Streptococcus pneumoniae (Obr.6). Buňky, které je možné transformovat, jsou tzv. kompetentní. Kompetence je geneticky kódována a u přirozeně kompetentních buněk (např.

- 18 -



Bacillus subtilis) regulována. Způsob regulace příjmu DNA zahrnuje několik kroků (vazba DNA na povrchu membrány, nukleolitické štěpení, homologická rekombinace). Transfekce je transformace bakterie izolovanou virou DNA (fagová DNA). Transdukce. Během transdukce je přenášena DNA z buňky do buňky pomocí bakteriofága. V obecné transdukci dochází ke vtažení jakékoliv části hostitelského genomu do virionu bakteriofága namísto virové DNA (Obr.7). Ve specializované transdukci dochází k záměně části virové DNA za DNA hostitelského organismu a zbalení do virionu. Nejčastěji využívaným bakteriofágem v molekulární biologii je fág lambda bakterie E. coli. 5.4.

Plasmidy - struktura a funkce

Plasmidy jsou malé (1kbp-1Mbp) genetické elementy, které mají schopnost autoreplikace nezávislé na hostitelském chromosomu. Jsou většinou cirkulární a narozdíl od viru neprodukují ochranné obaly pro existenci vně buňky. Zpravidla jsou nositely neesenciálních, avšak mnohdy užitečných genů. Jsou známy stovky druhů (např. E. coli dosud až 300). Jsou tvořeny dsDNA s nadšroubovicovým vinutím, obsahují kontrolní oblasti replikace. Tzv. copy number označuje počet kopií plasmidů koexistujících v buňce (1-100). U gram-negativních bakterií se replikují systémem tzv. theta intermediátu (jako chromosom), u gram-pozitivních systémem valivého kruhu. Inkompatibilní plasmidy nemůžou koexistovat v jedné buňce současně. Episom je plasmid, který má schopnost se integrovat do chromosomu hostitelské buňky. Nejznámější plasmid E. coli se nazývá F plasmid (Obr.8). Konjugace je shopnost horizontálního přenostu DNA plasmidu a části chromozomu mezi dvěma buňkami, kódována plasmidem (Obr.9). Plasmidy, které poskytují schopnost konjugace, se nazývají konjugativní. Konjugace umožňuje přenos DNA mezi bakteriemi, rostlinnými buňkami a houbami. Plasmidy poskytují buňkám řadu ojedinělých schopností. Resistentní plasmidy (R plasmidy) poskytují resistenci proti antibiotiku a různým růstovým inhibitorům (Obr.10). Způsobují problémy v léčbě infekčních onemocnění. Plasmidy kódující toxiny a virulentní faktory napomáhají patologenním bakteriím kolonizovat hostitelský organismus (patogenní forma E. coli, plasmidově kódovaný hemolysin a enterotoxin). Bakteriociny jsou toxické proteiny kódované některými plasmidy, které umožňují inhibovat růst konkurenčních bakterií. Jsou zpravidla úzkospektrální (vzhledem k antibiotiku). Nejznámější jsou tzv. koliciny (producent

- 19 -



E. coli, Col plasmid) a subtilizin (B. subtilis). Pozměněné plasmidy jsou důležitým nástrojem genového inženýrství. 5.5.

Bakteriální konjugace

Bakteriální konjugace vyžaduje kontakt dvou buněk (Obr.11). Donorová buňka obsahuje konjugativní plasmid (např. F plasmid E. coli). Recipientní buňka plasmid neobsahuje. Sex pilus je spojující tenký útvar, umožňující transfer DNA z donorové do recipientní buňky. Při konjugaci dochází k přenosu DNA plasmidu a popř. části chromozomu donorové buňky a jeho začlenění do recipentní DNA (Obr.12). Plasmid se šíří dále z buňky do buňky jako infekční agens. Při ztrátě selekčního tlaku může dojít k eliminaci (ztrátě) plasmidu. Fplasmid integrovaný do choromosomu buňky (je episom) vytváří tzv. Hfr kmen. Buňky s neintegrovaným F-plasmidem jsou označovány jako F+. Při konjugaci Hfr a F- (recipientní buňky bez F-plasmidu) může dojít k přenosu chromozomální DNA z Hfr do F- a změně fenotypu recipientní buňky. 5.6.

Bakteriální genetika a klonování genů

Klonování genů je základem genového inženýrství. Smyslem klonování genu je izolovat kopie jednotlivých genů v čisté formě. Rekombinační in vitro techniky umožňují izolovat a kopírovat geny mimo vlastní organismus využitím znalostí struktury DNA a enzymologie (restrikční enzymy, DNA ligáza, polymerázová řetězová reakce (PCR), syntéza DNA). Izolace genu je vždy porováděna v několika krocích, zahrnujících izolaci a fragmentaci DNA, ligace fragmentů DNA do klonovacího vektoru (např. plasmid) a vložení vektoru do hostitelského organismu (Obr.13). Zpravidla vzniká tzv. DNA (genová) knihovna, ze které lze následně izolovat a namnožit požadovaný gen. Nejstarším klonovacím vektorem je upravený plasmid (např. plasmid pBR322, E. coli) (Obr.14). Plasmid s DNA vpravenou mechanismem inserční inaktivace mohl být selektován na přítomnost vložené DNA selekcí antibiotikem ampicilinem a tetracyklinem (Obr.15). Příkladem novějšího často využívaného typu plasmidu je pUC19 obsahující tzv. polyklonovací místo s řadou unikátních restrikčních míst a geny pro tzv. modro-bílou selekci rekombinantů (založené na aktivaci/deaktivaci enzymu beta-galaktosidázy a její kompletace v kompetentních buňkách E.coli). Existují také tzv. expresní plasmidové vektory, umožňující produkovat rekombinantní proteiny, nebo jejich části (produkty exprese vloženého genu) v bakteriálních buňkách. Jiným vektorem je bakteriofág lambda. Umožňuje zabalení velkých (až 20 kbp) úseků DNA do virionu in vitro

- 20 -



a efektivní infekci bakterií (efektivnější než transformace a transfekce) (Obr.16). Zpravidla se využívá pozměněných fágů jak je tzv. charon (Obr.17). Kosmidy jsou klonovacím vektorem založeným na modifikovaném plasmidu speciálními sekvencemi (cos oblast) umožňující jeho zbalení do fágového virionu. Je možné ho využít pro klonování až 50kbp úseků DNA. 5.7.

Mutageneze in vitro

Mutageneze in vitro (nebo cílená mutageneze) umožňuje kontrolované záměny úseků či basí DNA u cíleného organismu (v protikladu k mutagenům, kde mutace vzniká náhodně). Cílená mutageneze využívá možnosti syntézy krátkých úseků DNA (primerů) a klonovacích technik. Technika má vždy několik následných kroků (Obr.18). Izolovaný gen vložený do vektoru je kompletován s DNA primerem obsahující danou mutaci a replikován DNA polymerázou. Po transformaci hostitelských buněk jsou selektovány mutantní buňky pozitivní selekcí (např. na antibiotiku). Cílené bodové mutace se využívají např. při studiu role jednotlivých aminokyselin na funkci enzymů, popř. při studiu role enzymu v metabolismu buněk. Funkci některých genů lze eliminovat např. tzv. kazetovou mutagenezí (Obr.19). 6.

EVOLUCE A TAXONOMIE PROKARYOT

6.1.

Evoluce a první formy života

Vznik Země je pokládán do období před přibližně 4,6 miliardy let. Nejstarší horniny nalezené na Zemi jsou datovány do období před 3,86 miliard let (Austrálie, Jižní Afrika). První zdokumentované známky života podobnému mikroorganismům jsou známy právě z těchto hornin ve formě tzv. stromatolitů, starých cca 3.5 miliard let (Obr.1, 2, 3). Stromatolity jsou fosilní pozůstatky mikrobiálních společenství, pravděpodobně filamentárních anoxygenních fototrofních organismů. Původní atmosféra Země byla redukční povahy, anoxygenní a bez vody v kapalném skupenství (teplota nad 100°C). Experimentální simulací těchto podmínek (včetně UV záření) lze navodit vznik organických látek a jejich polymerů. Byly prokázány katalyzační schopnosti některých nerostů (montmorillonit) na vznik jednoduchých prebiotických ůtvarů (např. lipidické vesikuly, RNA) (Obr.4). Tyto podmínky pravděpodobně zaručily vznik prvních autoreplikujících se forem života (Obr.5). S objevem katalytické schopnosti RNA (ribozymy) je pravděpodobné, že první formou života byla založena na molekule RNA. Uzavřené RNA v lipidických vesikulech mohly procházet selekčním tlakem, který zvýhodnil ty, které dokázaly vytvořit proteiny a vysoce specifické katalitické molekuly enzymy (Obr.5). Následující přechod z RNA na DNA kódování byl pravděpodobně vyžádán - 21 -



potřebou vyší stability a řízené exprese genů. Energie prvních forem života byla získávána v anoxygenním prostředí chemolitotrofií nebo chemoorganotrofií (např. oxidace FeS a sulfanu, vodík) (Obr.6). Zdroj uhlíku byl nejspíše uhlík vázaný v organických molekulách vzniklý abiotickou cestou, popř. CO2. Oxygenní fotosyntéza vznikla cca před 2.8 miliardami let (sinice). Vznikající kyslík nejdříve oxidoval snadno redukovatelné látky (Fe2+ na Fe3+). Teprve pak se začal akumulovat v atmosféře. S narůstajícím množstvím kyslíku došlo k evoluci nových typů metabolismů využívající kyslík jak akceptor elektronů (aerobní respirace). Kyslík v atmosféře poskytl ochranu před UV zářením formou ozonu - první podmínku kolonizace souše (Obr.7, 8). Primitivní eukaryotické buňky měly vyvinutý obal kolem jádra a mitotický aparát. Organely (chloroplast a mitochondrie) vznikly později symbiotickou invaginací prokaryot (cca před 2 miliardami let) (Obr.9). Existuje řada společných znaků mezi organelami a prokaryotickými buňkami (typ a uspořádání chromosomu, struktura 16s RNA, dělení atd.) 6.2.

Metody studia evolučních vztahů

Některé geny a proteiny lze využít jako tzv. evoluční hodiny - jejich proměna v čase je významná z hlediska evoluce organismů. Jejich sekvenací (stanovením pořadí nukleotidů a aminokyselin) lze stanovit evoluční vzdálenosti mezi různými druhy organismů. Nejčastěji je využito srovnávání ribosomálních RNA a struktury ATPáz. U prokaryot se jedná o 16S rRNA a eukaryot 18S rRNA (Obr.10). Ribosomal Database Project (RDP) obsahuje cca 100 tis. sekvenovaných struktur rRNA různých organismů (http:/rdp.cme.msu.edu/html/). Struktura rRNA je získána pomocí PCR genu pro rRNA studovaného organismu a následným sekvenováním (Sangerovou metodou) přečištěného produktu (Obr.11). Následně se využívá počítačové srovnání v databázovém systému pro výpočet evoluční vzdálenosti (ED) a konstrukci fylogenetických stromů (Obr.12). Ze srovnávacích studií byly objeveny konzervované sekvence (otiskové sekvence) u jednotlivých skupin organismů, které lze využít jako fylogenetické značky pro jejich indentifikaci (Obr.13). Metoda FISH (fluorescent in situ hybridization) využívá fluorescenčně značených krátkých oligonukleotidů k in situ hybridizaci s rRNA zkoumaného organismu a jeho fylogenetickému zařazení (Obr.14 a 15). Tato metoda se využívá především v klinické praxi k rychlé identifikaci patogenních bakterií, popř. studiu složení bakteriálních společenství. 6.3.

Evoluce prokaryot

- 22 -



Evoluci všech organismů na Zemi lze popsat univerzálním fylogenetickým stromem popisujícím evoluční historii a vztahy tří základních vývojových linií - nadříše Bacteria, Archea a Eukarya (Obr.16). Spojujícím článkem všech vývojových linií je univerzální předchůdce. Horizontální přenos genetické informace byl v počátcích vývoje velmi běžný. Fylogeneticky nejblíže univerzálnímu předchůdci jsou dnes termofilické bakterie a Archea. Bakterie jsou rozděleny na cca 40 kmenů, Archea na 4 kmeny (Crenarchaeota, Euryarchaeota, Korarchaeota a Nanoarchaeota), v naprosté většině se jedná o extremofily (termofilové, halofilové). Jednotlivé nadříše byly ustanoveny na základě studia rRNA, avšak typické rozdíly jsou pozorovatelné i ze srovnání ostatních charakteristických buněčných komponent (buněčná stěna, lipidy, RNA polymeráza, syntéza proteinů). Nejdůlěžitejší charakteristiky jsou shrnuty na obrázku Obr.17. 6.4.

Taxonomie prokaryot a její vztah k fylogenezi

Klasická taxonomie prokaryot je založena na analýze fenotypu (výživa, morfologie, fyziologie) (Obr.18 a 19). Dnes se velmi často využívají další, převážně molekulárněbiologické přístupy (chemotaxonomie). Stanovení tzv. GC poměru (guanin vs. cytosin) např. pomocí teploty tání DNA (Obr.20). DNA:DNA hybridizace a její spec. případ genomová hybridizace je využívána ke sledování sekvenční podobnosti dvou úzce příbuzných organismů (Obr.21). Ribotyping je metoda identifikace bakterií spočívající v detekci rRNA sekvencí v kontrolovaně rozštěpené DNA (využitím endonukleáz).. Metoda multilocus sequence typing (MLST) využívá srovnání struktury 6-7 klíčových genů (tzv. housekeeping genes) a slouží k přesné identifikaci. Je využívána v klinické praxi k identifikaci patogenních prokaryot. Analýza obsahu mastných kyselin izolovaných z bakterií (metoda FAME - fatty acid methyl ester) je opět často využívaná metoda k identifikaci bakterií (Obr.22). Pravidla pro definici druhu platná pro rostliny a živočichy nelze aplikovat na prokaryota. K taxonomizaci se využívají výše jmenované metody, především pak struktura 16S rRNA. Např. definice druhu prokaryot spočívá více jak 5% sekvenční odlišnosti 16S rRNA od ostatních známých druhů. Je zachována klasická posloupnost kategorizace (příklad na Obr.23). K evoluci nového druhu bakterie pravděpodobně dochází procesem speciace z různých ekotypů (Obr.24). Odhadovaný počet prokaryot je cca 100tis - 1mil. druhů. Jejich objevu zpravidla brání nevhodné kultivační podmínky, které brání jejich růstu. Nomenklatura prokaryot je binomiální a je regulována Mezinárodním kódem bakteriální - 23 -



nomenklatury. Tento kód udává, jak je možné definovat a pojmenovat nové druhy bakterií a zavádí pravidla pro její taxonomizaci. Vzorky jednotlivých druhů bakterií jsou skladovány ve dvou světových sbírkách (American Type Culture Collection (ATCC), USA a German Collection of Microorganisms (DSMZ), Germany). Nově objevené druhy bakterií jsou povinně opublikovány v mezinárodním časopise International journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM, www.bacterio.cict.fr). Základním taxonomickým dílem je

Bergeyīs

Manual

of

Systematic

Bacteriology

a

The

Prokaryotes

(http://141.150.157.117:8080/prokPUB/index.htm). 7.

REGULACE RŮSTU PROKARYOT A VIRŮ

7.1.

Fyzikální metody regulace růstu bakterií - sterilizace

Sterilizace je proces, při kterém dochází k nevratnému poškození všech mikroorganismů. Bakteriocidní látky nevratně poškozují bakteriální buňky. Bakteriostatické látky projevují inhibiční ůčinek, který však může být vratný. Dekontaminace označuje způsob očistění určitého objektu tak, aby byl z hlediska nákazy neškodný. Dezinfekce je zaměřena na eliminaci patogenních organismů. Tepelná sterilizace je nejjednoduším a efektivním způsobem sterilizace (Obr.1). Při vysoké teplotě dochází k denaturaci proteinů. Efektivita tepelné sterilizace záleží na přítomnosti vody ve vzduchu. Je možné provádět tzv. horkovzdušnou

sterilizaci

a

sterilizaci

vodní

parou.

Endospory

jsou

značně

termorezistentní a proto je třeba sterilizaci provádět delší dobu, než je třeba k usmrcení normálních buněk. Autokláv je zařízení umožňující provádět sterilizaci horkou parou za zvýšeného tlaku (110 kPa, 121°C) (Obr.2). Pasteurizace (proces objevený L. Pasteurem) je proces využívaný k eliminaci růstu bakterií v některých termocitlivých tekutinách (mléko, pivo). Jedná se o pečlivě kontrolované, krátkodobé zvýšení teploty tekutiny pod bodem varu vody. Radiace (elektromagnetické záření, proudy nabitých částic atd) je často využíváným způsobem např. k sterilizaci čistých prostor (UV germicidní lampy), chirurgických nástrojů a potravin (rentgenové záření). Filtrace využívá speciálních membránových filtrů s malými póry (desítky až stovky nanometrů), které zachycují bakterie, popř. i viry (Obr.3, 4). Hloubkové filtry ze spleti jemných vláken se využívají např. k filtraci vzduchu ve speciálních boxech pro aseptickou práci, tzv. flow-boxech. 7.2. Chemické metody regulace růstu bakterií

- 24 -



Chemické agens je možné rozdělit dle cílového organismu a typu působení na bakteriocidní, bakteriolytické, fungicidní, viricidní a bakteriostatické, fungistatické a virostatické látky (Obr.5). Dle místa účinku pak na in vitro a in vivo působící látky. Tzv. vyřeďovací technikou lze získat informaci o minimální účinné koncentraci (MIC) aktivní látky (Obr.6). Sterilizační chemické prostředky zahubí všechny mikroorganismy včetně jejich endospor (SAVO, peroxid vodíku, ethylenoxid). Desinfekční prostředek zahubí mikroorganismy, nikoliv však endospory (etanol, detergenty). Sanitární prostředky pouze redukují množství přítomných mikroorganismů (mycí prostředky, prací prostředky atp.). Antiseptické a germicidní chemické prostředky zahubí či inhibují růst mikroorganismů a nejsou přitom škodlivé pro živou tkáň (dezinfekce poranění). Shrnutí základních zástupců jednotlivých kategorií je na Obr.7. 7.3. Antimikrobiální prostředky pro in vivo aplikaci Syntetická antimikrobiální léčiva (antimikrobiální chemoterapeutika) byla poprvé objevena německým vědcem P. Ehrlichem na počátku minulého století (salvarsan, léčba syfylitidy). Lze je rozdělit dle chemické struktury na několik typů. Mezi tzv. analogy růstových faktorů (analogy vitamínů, aminokyselin, purinů atd.) - patří např. sulfátová léčiva (sulfanilamid, analog kys. listové, inhibice streptokoků) (Obr.8), popř. isoniazid (analog nikotinamidu, léčba tuberkulózy). Další kategorií jsou analogy basí nukleových kyselin (fluorouracil) a chinoliny (ciprofloxacin, inhibice DNA gyrázy, Bacillus antracis). Antibiotika jsou původně přírodní látky s inhibiční povahou. Řada antibiotik je semisyntetické povahy (pro zvýšení toxického efektu). Existují široko a úzko-spektrální antibiotika lišící se šíří účinku na různé druhy bakterií (Obr.9). Existuje řada cílových míst působení antibiotik (Obr.10). Antibiotika mohou inhibovat syntézu proteinů (inhibice ribosomů), trankripci (syntéza mRNA), DNA polymerázu, funkci cytoplasmatické membrány a syntézu buněčné stěny. Beta-laktamová antibiotika (peniciliny, cefalosporiny) jsou nejvýznamější skupinou antibiotik, objevených A. Flemingem (1929) jako antimikrobiální látka produkovaná v Penicillium chrysogenum (Obr.11). Tato antibiotika se váží na PBP proteiny a inhibují transpeptidační reakci nutnou k dokončení syntézy buněčné stěny bakterie. Jsou účinná především proti gram-pozitivním buňkám, semisyntetické analogy i proti některým gram-negativním bakteriím. Cefalosporiny mají podobný účinek, jsou však širokospektrální

v

porovnání

s

peniciliny.

Aminoglykosidová,

makrolidová

a

tetracyklinová antibiotika jsou produkována bakteriemi (Obr.12, 13). Aminoglykosidová - 25 -



antibiotika inhibují proteosyntézu, nejznámější je streptomycin (v minulosti léčba tuberkulózy). Makrolidová antibiotika rovněž inhibují proteosyntézu (např. erytromycin). Tetracyklinová antibiotika (produkována streptomycety) jsou širokospektrální antibiotika inhibující proteosyntézu. Daptomycin je nové antibiotikum účinkující na principu depolarizace bakteriální membrány a odpojení bakterie od možnosti získávat energii. Antivirotika. Nalézt specifické inhibitory virů je velmi nesnadné, neboť jejich životní cyklus je úzce svázán s eukaryotní buňkou. S intenzivním výzkumem viru HIV (human immunodeficiency virus) tj. původcem AIDS, došlo k výraznému pokroku v oblasti syntéz antivirálních chemoterapeutik. Nejznámější příklady antivirotik a jejich funkce jsou na Obr.14. Řada těchto látek jsou analogy nukleosidů, inhibující činnost reverzní transkriptázy viru. Velmi nadějnou skupinou látek jsou inhibitory specifických virových proteáz (Např. HIV proteázy), které virus potřebuje k dokončení svého životního cyklu. Chemoterapeutika na bázi interferonů stimulují produkci antivirálních látek ve zdravých buňkách. Tvorba interferonů je přirozenou odpovědí na infekci u napadených buněk a způsobuje odolnost sousedních zdravých buněk tkáně vůči infekci. 7.4. Rezistence a hledání nových účinných látek Rezistence na antimikrobiální chemoterapeutika je způsobena přirozenou schopností bakterií bránit se nežádoucím inhibitorům ve svém okolí a je kódována geneticky. Podstatou rezistence je řada mechanismů, z nichž některé jsou uvedeny na Obr.15. Řada rezistencí je přenášena plasmidy, tzv. R-plasmidy. Ty kódují zpravidla enzym, který deaktivuje antibiotikum (např. beta-laktamáza, chloramfenikol acetyláza) (Obr.16). Rezistence je závažný problém vyžadující dodržení střízlivého nasazení antibiotik při terapii a důsledného užívání (důležitost užívání antibiotika po celou předepsanou dobu). Např. původce gonorrhei Neisseria gohorrhae je v současnosti téměř v každém případě rezistentní proti penicilinu, ačkoliv jeho použití bylo až do 80 let běžné. Přesto se řada antibiotik často využívá v zemědělství jako preventivní přídavek do potravy chovných zvířat. Screening nových potenciálních antibiotik a antivirálních látek je dnes možné provádět několika způsoby. Mezi klasické způsoby patří prohledávání přírodních zdrojů látek s cílem izolovat účinnou látku, dnes se hojně využívá robotizovaného screeningu knihoven syntetických analogů známých antibiotik (combinatorial chemistry) a počítačového modelování. Například známé inhibitory proteázy HIV-1(saquinavir) byly navrženy metodou počítačového modelování na základě znalosti 3D struktury aktivního místa s atomárním rozlišením (Obr.17). - 26 -


EKOLOGIE BAKTERIÍ

8.1.

Mikrobiální ekosystém


V přírodních podmínkách vytváří mikroorganismy populace. Metabolicky propojené populace vytváří společenství. Mikrobiální společenství interaguje s makroorganismy a společně vytváří ekosystém (Obr.1). Mikroorganismy zastupují v ekosystému důležitou roli recyklátorů uhlíku, síry, dusíku a železa. Zkoumáním těchto vztahů a přeměn se zabývá biogeochemie. Biogeochemický cyklus popisuje všechny chemické a biologické transformace, ke kterým u jednotlivých prvků dochází v průběhu cyklu. Nika jednotlivého druhu mikroorganismu je definována zastoupením určitých zdrojů energie a specifických fyzikálně-chemických podmínek vhodných k růstu a množení. Z hlediska rozměrů mikroorganismů je nutné studovat a popisovat fyzikálně-chemické poměry v mikroprostředí (např. různá mikroprostředí půdní částice, Obr.2). Mikroprostředí je vždy heterogenní a je charakterizováno řadou časově proměnných gradientů látek (např. gradient kyslíku). Růst bakterií v mikroprostředí je většinou pomalý, v důsledku nedostatku zdrojů energie a kompetice. Řada bakterií vytváří provázaná společenstva, která jsou definována jako syntrofická (viz. kapitola 4). Růst mikroorganismů je usnadněn na povrchu substrátu. Bakterie vytváří na povrchu pevných látek (někdy přímo substrátů) biofilmy, ve kterých jsou jednotlivé buňky provázány vrstvou adhesivních polysacharidů (Obr.3 a 4). Tvorba biofilmu je umožněna komunikací jednotlivých buněk skrze signální molekuly a chemotaktický pohyb buněk k povrchu vznikajícího biofilmu. Biofilm zaručuje obranu bakteriálních buněk před fyzikálně-chemickými a biologickými (imunitní odpověď) vlivy a usnadňuje jejich přežití. Biofilmy představují překážku léčby řady onemocnění. Biofilm, který vytváří Pseudomonas aeruginosa na vnitřním povrchu plic má za následek vznik onemocnění tzv. cystické fibrózy. Biofilmy jsou příčinou vzniku zubního kazu. Způsobují škody v distribučních sítích (koroze) a jsou potenciálním zdrojem jejich nákazy (Vibrio Cholerae). 8.2.

Výskyt bakterií v půdě a sladkovodních ekosystémech

Půda obsahuje minerální a organickou složku. Vznik půdy je navozen spolupůsobením biologických a fyzikálně-chemických faktorů, které rozrušují horninový podklad. Důležitý je vliv kořenů vyšších rostlin a mikroorganismů, které se nachází v tzv. rhizosféře. Postupnými zvětrávacími procesy se utváří tzv. půdní profil (Obr.5). Největší počet mikroorganismů lze nalézt právě v oblasti rhizosféry, a to především ve formě kolonizovaných půdních částic

- 27 -



(Obr. 6). Důležitým faktorem růstu je přítomnost vody, nejčastěji ve formě tzv. půdního roztoku a vázané vody na povrchu půdních částic. S pronikáním vody do hlubších vrstev půdního profilu se mění obsah rozpuštěného kyslíku a zastoupení jednotlivých typů bakterií (oxygenní a anoxygenní metabolismus). Rozložení živin v půdním profilu se rovněž mění s hloubkou. Nejvíce živin je zpravidla v horní části, tj. v rhizosféře. Bakterie lze nalézt i ve velkých hloubkách (stovky metrů), především sulfát-redukující a metanogenní bakterie. Sladkovodní ekosystémy zahrnují především jezera, řeky, vodní nádrže a prameny. Převážnou většinou přítomných mikroorganismů jsou fotoautotrofní cyanobakterie (sinice) a řasy v oxygenních zónách, naproti tomu anoxygenní fototrofní bakterie v anoxygenních zónách. Fytoplankton je tvořen řasami plovoucími volně ve vodě. Bentické řasy jsou přisedlé na povrchu dna (břehu). Fototrofní organismy jsou tzv. primárními producenty. Rozložení obsahu kyslíku ve vodě je rozhodující pro kolonizaci různých hloubkových profilů různými společenstvy. Fototrofní organismy produkují kyslík v povrchových vrstvách. Nespotřebované látky zpracují aerobní respirací chemoorganotrofové v hlubší vrstvě. V anoxygenní vrstvě při dně a ve velkých hloubkách se nacházejí společenstva anaerobních prokaryot a protozoí (eukaryota). Ve sladkovodních vodách dochází ke změnám ve stratifikaci vodního sloupce a obsahu kyslíku v závislosti na ročním období (Obr.7). V letním rozložení se dle teploty rozeznává vrchní vrstva (epilimnion) a spodní nemýchaná vrstva (hypolimnion). Vysoký obsah živin (splašky, zemědělská činnost) způsobuje přemnožení sinic a řas (vodní květ) v letním období. Jejich odumírání je spojeno se zvýšenou spotřebou kyslíku aerobními chemoorganotrofními bakteriemi a častým úhynem ryb (Obr.8). Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) charakterizuje obsah biologicky odbouratelných organických látek ve vodě. Stanovení BSK vzorků se využívá jako standardizovaná metoda ke stanovení čistoty odpadních vod. Vyšší obsah organických látek má za následek vyšší spotřebu kyslíku za stanovený čas v důsledku vyšší bakteriální aerobní respirace. 8.3.

Výskyt bakterií v mořských ekosystémech

Mořské ekosystémy se od sladkovodních výrazně liší, především v nízkém obsahu živin (dusík, fosfor, železo), které limitují rozšíření primárních producentů. Vzhledem k rozloze oceánů jsou však největším systémem, který kontroluje koloběh uhlíku na Zemi. Největším primárním producentem mořských oceánů jsou zelená fototrofní prokaryota, tzv. prochlorophyta (rod Prochlorococcus) a v tropických oblastech mořská sinice Trichodesmium (Obr.9, 10). Dalšími zástupci jsou tzv. aerobní anoxygenní fototrofní - 28 -



bakterie (rod Proteobacteria, např. Erythrobacter), provádějící anoxygenní fotosyntézu pouze v aerobních podmínkách. V hloubkových profilech do 300m se velmi často nachází zástupci rodu Proteobacteria s pigmentem proteorhodopsinem, obdobou bakteriorhodopsinu archeí (Halobacterium halobium). Proteorhodopsin zachycením světelné energie vytváří protonový gradient na cytoplasmatické membráně a podílí se tak na syntéze ATP. V rámci prokaryot existuje rozdílná stratifikace zastoupení zástupců bakterií a archeot (Obr.11). Množství prokaryot v horních vrstvách oceánů a moří je cca 10E5 - 10E6 buněk/ml. Celkový počet prokaryotních buněk v oceánech na Zemi se odhaduje na cca 1E28. Vodní sloupec vymezený přítomnosti světla se nazývá fotická zóna (do 300m). Do cca 1000m jsou přítomné chemoorganotrofní organismy. Vrstva od 1000m do cca 6000m je charakterizována poměrně nízkou biologickou aktivitou a označuje se jako hlubokomořská zóna (oblast). Je charakterizována nízkou teplotou (2-3°C), nízkým obsahem živin a vysokým tlakem (např. 500 atmosfér v 5000m). Bakterie žijící v této oblasti patří mezi psychrofily a zhlediska tolerance k tlaku na barotolerantní organismy a barofily (Obr.12). Biochemická podstata odolnosti velkému tlaku spočívá v odlišné stavbě enzymů, biologických membrán a buněčné stěny. Hydrotermální průduchy (ventaroly) se nachází v oblastech hlubokomořských zlomů, které jsou úzce spojeny s pohybem zemských desek, podmořskou sopečnou činností a vývěry magmatu. Z těchto průduchů proudí voda o vysoké teplotě a vytváří vhodné prostředí pro existenci společenstev organismů (Obr.13). Existují dvojí typy pramenů, teplé (teplota do 25°C) a horké (270-380°C), které se liší zastoupením organismů. V oblasti teplých vývěrů se často nachází obří mlži, červy a převážně chemolitotrofní bakterie oxidující síru, Fe+2, vodík a metan (Obr.14). Voda z horkých pramenů má příliš vysokou teplotu pro kolonizaci prokaryoty, nicméně extrémní termofilové se nacházejí v jejich blízkosti, díky existenci teplotního gradientu (Obr.15). 8.4.

Cyklus uhlíku a kyslíku

Globální cyklus uhlíku je velmi významným faktorem udržující stabilitu biosféry. Na cyklu se podílí jak mikroorganismy, tak makroorganismy. Především v souvislosti s rozvojem průmyslu v posledních 200 letech, dochází k výraznému antropogennímu ovlivnění cyklu a hrozbě globálních změn klimatu. Cyklus uhlíku je velmi úzce provázán s cyklem kyslíku (vazba kyslíku v uhlíkatých sloučeninách, vč. CO2). Existuje řada zásobních zdrojů (sinků)

- 29 -



uhlíku, z nichž nejdůležitější jsou horniny a z hlediska organismů vyšší rostliny a humus (Obr.16). Nejrychlejší výměna uhlíku v cyklu je skrze fixaci a uvolňování CO2 mezi atmosférou a organismy. V tomto procesu se uplatňuje především fotosyntéza a dýchací procesy eukaryot i prokaryot (Obr.17). Do cyklu se zapojuje i metan, především činností metanogenních a metanotrofních bakterií (Obr.18). Výraznou úlohu sehrávají i celulolytické mikroorganismy v rumen přežvýkavců a cecum ostatních býložravců (Obr.19 a 20). Napomáhají především trávení celulózy, tj. jejímu štěpení na cukry a jejich fermentaci. 8.5.

Cyklus dusíku

Dusík je nepostradatelná součást všech organických molekul. Obdobně jako kyslík a uhlík, i v případě dusíku dochází k jeho cyklické výměně (Obr.21). Největší zásobárnou dusíku na Zemi je plynný N2. Jeho fixaci provádí pouze omezená skupina organismů pomocí speciálního enzymu nitrogenázy (viz kapitola 4). Výměna dusíku mezi organismy však probíhá daleko častěji skrze dusík vázaný ve formě dusičnanů, dusitanů a amoniaku. Denitrifikací se dusík vrací z těchto forem zpět do atmosféry ve formě plynného N2. V průběhu dekompozice organických zdrojů dusíku dochází ke vzniku amoniaku - amonifikaci. Z něj se nitrifikací vytváří opět dusičnanové a dusitanové ionty. 8.6.

Cyklus síry a železa

Cyklus síry je komplexnější než cyklus dusíku z důvodu velkého množství oxidačních stavů síry. Část procesů je vykonána organismy, část spontánními chemickými reakcemi (Obr.22). Sulfan je uvolňován např. sopečnou činností, ale převážně vzniká bakteriální redukcí ze sulfátu (sulfát-redukující bakterie) v anoxygenním prostředí. Sulfan je často oxidován chemolitotrofními bakteriemi na síru až zpět na sulfát. Síra je někdy zpětně redukována na sulfidy (sirná hypertermofilní archeota). Častým produktem/zdrojem síry v mořské vodě je dimetylsulfid (DMS, degradační produkt osmoregulátoru mořských řas). Jeho transformací může vznikat opět sulfan, popř. dimetylsulfoxid (DMSO) jako produkt respirace DMS řady prokaryot. Železo patří mezi jeden z nejvíce zastoupených prvků v zemském obalu. Je přítomno ve dvou oxidačních stavech - jako dvoumocné (Fe2+) a trojmocné (Fe3+). Cyklus železa spočívá ve vzájemné přeměně těchto dvou stavů v důsledku chemických a biochemických přeměn (Obr.23). Fe2+ forma železa je uvolňována z vývěrů hlubokých pramenů, popř. v důlních

- 30 -



vodách a je následována její přeměnou na Fe3+ chemickou oxidací (při zásaditém pH), popř. oxidací železnatými bakteriemi (Leptotrix, Acidithiobacillus ferrooxidans). Železité ionty vytváří hnědý, ve vodě nerozpustný hydroxid (Obr.24). Bakterie schopné oxidovat železo ve formě nerostu pyritu (FeS2) jsou zodpovědné za kyselost důlních prostor a vod (pyrit je často přítomen v uhlí) (Obr.25). Tento fakt je významným ekologickým problémem doprovázející těžbu řady surovin (Obr.26) 8.7.

Bioremediace

Vysoká variabilita mikroorganismů a jejich metabolismů poskytuje možnost jejich využití při odstraňování toxických či jinak škodlivých látek z životního protředí. Tomuto přístupu se říká bioremediace. Řada kovů je vázána ve formě sulfidů. Jejich těžba klasickým způsobem je neefektivní. V řadě případů se využívá loužení kovů v přítomnosti sulfid-oxidujících bakterií (Acidithiobacillus ferrooxidans), zejména mědi (Obr.27, 28, 29) a zlata. Bioremediace ropy je využívána především k odstraňování ropných havárií (Obr.30). Celý proces spočívá ve schopnosti některých bakterií odbourávat nasycené i nenasycené uhlovodíky díky existenci enzymů oxygenáz (viz. kapitola 4). Xenobiotika jsou syntetické chemické látky, které nepatří mezi látky přirozeně se vyskytující v přírodě (např. pesticidy, polychlorované bifenyly atp.). Jejich bioremediace je pomalá, především z důvodu neexistence enzymových modifikačních systémů. Pesticidy (herbicidy, insekticidy, fungicidy) jsou z těchto látek nejrozšířenější. Rychlost jejich degradace je různá, často trvá i několik let (Obr.31 a 32). Velmi častým způsobem jejich degradace je reduktivní dechlorinace, kde molekula pesticidu je využitá jako akceptor elektronu v anoxygenním prostředí (Obr.33). Ekologický problém představují plasty (PVC, PE, PP atd.), které jsou biologicky téměř neodbouratelné. Biopolymery jsou alternativní, biodegradovatelné polymery, založené na bázi přírodních polymerů (např. PHV/PBH kopolymer, Obr.34). 9.

ZÁKLADY VIROLOGIE

9.1.

Stavba viru a virionu

Virus je genetický element, který se replikuje nezávisle na replikaci chromosomu buňky, avšak buňka (resp. její metabolismus a enzymový systém) je nezbytná pro jeho životní cyklus. V protikladu k plasmidům (viz. kapitola 5) však viry mohou existovat vně buňky po dlouhou dobu a šířit se tak z jedné hostitelské buňky do druhé infekcí. Infekce značí proces

- 31 -



průniku viru do hostitelské buňky. Studiem virů a jejich životního cyklu se zabývá virologie. Virus existuje v tzv. extracelulární formě ve formě virionu. Virion je nukleová kyselina obalená proteinovým obalem, popř. dalšími obaly v závislosti na typu viru. Virus v této formě je metabolicky neaktivní. Průnikem (infekcí) virové nukleové kyseliny z virionu do hostitelské buňky začíná intracelulární forma viru. V hostitelské buňce dochází k replikaci, vytvoření obalů viru a v závěrečné fázi k sestavení nových virionů a jejich uvolnění mimo buňku, často doprovázené její lyzí. Virální genom je zpravidla velmi malý (1000-5000 kbp) a kóduje pouze nezbytné geny pro řízení replikace a transkripce. Pro tyto procesy zpravidla využívá syntetického a metabolického aparátu buňky. Dle typu nukleové kyseliny dělíme viry na DNA a RNA viry, dále pak na jednořetězcové (ssRNA, ssDNA) a dvojřetězcové (dsRNA, dsDNA), popř. dle dalších kriterií (linearní, cirkulární vlákno, pozitivní a negativní, DNA a RNA retroviry) (Obr.1, 2). Viry je možné dělit dle hostitele na rostlinné, živočišné a bakteriální viry (bakteriofágy). Obdobně jako u bakterií existuje taxonomická klasifikace virů. Typická velikost virionu je v rozmezí 20-200nm. Nukleová kyselina viru je ve virionu zpravidla zabalena proteinovým obalem - kapsidou, která se skládá z monomerních proteinových

podjednotek kapsomer.

Ty se

skládají

v kapsomeru

samovolným

sebeorganizačním procesem (self-assembly). Pojem nukleokapsida označuje komplex nukleové kyseliny a kapsidy. Virion většinou obsahuje jeden nebo více specifických virových enzymů (lysozym, virové DNA a RNA polymerázy, reverzní transkriptáza), nutných k infekci či replikaci viru v buňce. Proteinová kapsida je u některých virů obalená jednotkovou membránou (obalené viry) (Obr.3) obsahující glykoproteiny kódované virem. Nukleokapsidy existují ve formě ikozaedrické a helikální symetrie (Obr.4). Ikozaedr je pravidelný 20-ti stěn skládající se z 60 kapsomer v útvaru blížící se kouli. Zpravidla se tato symetrie vyskytuje v jejích násobcích, vzniklých dalším dělením jednotlivých stěn (až 360 jednotek kapsomer) (Obr.5). Řada bakteriofágů je velice komplikované struktury, jejichž nukleokapsida se skládá z ikozaedrické i helikální symetrie doplněné řadou dalších proteinů (bičíky, bazální destičky atd.) (Obr.6). 9.2.

Životní cyklus viru - replikace

Životní cyklus viru v sobě vždy zahrnuje několik fází (Obr.7). Adsorpce (přichycení) viru na povrchu hostitelské buňky. Penetrace virionu nebo nukleové kyseliny dovnitř buňky. Syntéza nových kopií nukleové kyseliny a proteinových obalů virionu. Sestavení kapsomer - 32 -



a zabalení nových nukleových kyselin do virionů. Uvolnění nových virionů ven z buňky. Fáze sestavování kapsomer se často nazývá maturace. Období od počátku infekce do uvolnění nových virionů se nazývá latentní perioda. Růstová křivka virů je tzv. jednostupňová (Obr.8). Adsorpce viru na povrch buněk je specifická. Virion má na svém povrchu speciální proteiny, které mají vysokou afinitu k receptorům na povrchu hostitelských buněk. Receptorem je ve skutečnosti jakákoliv molekula (zpravidla ukotvená v membráně) buňky, která v buňce plní běžnou fukci. Její rozpoznání je tedy vlastnost (schopnost) viru tuto molekulu nalézt. Penetrace v sobě zahrnuje řadu procesů a její způsob je druhově specifický. Neobalené viriony se zpravidla rozpadají a do buňky vniká pouze nukleová kyselina a popř. speciální enzymy nesené ve virionu. Obalené viriony (převážně živočišné viry) pronikají do buněk celé a teprve uvnitř se rozpadají. Nejsložitější proces penetrace je u buněk s buněčnou stěnou, především u bakteriofágů (Obr.9). Zde se na procesu podílí řada strukturálně složitých útvarů virionu a enzym lysozym, který štěpí peptidoglykan v místě průniku bakteriofága do buňky. Restrikčně-modifikační systémy hostitelské buňky brání infekci buněk a eliminují cizorodou DNA včetně virových nukleových kyselin. Viry s nukleovou kyselinou typu ssDNA a RNA jsou odolné vůči specifickým nukleázám (ty rozpoznají pouze dsDNA), některé viry se brání metylací vlastní DNA (nejsou rozpoznány jako cizorodé). Viry lze rozčlenit dle jejich replikační strategie do sedmi skupin dle tzv. Baltimorova klasifikačního schématu (Obr.10). V rámci tohoto schématu se viry kategorizují dle typu nukleové kyseliny (DNA, RNA), zda se jedná o jedno- popř. dvou-řetězcové nukleové kyseliny (např. ssDNA a dsDNA) a dle transkripčního typu na pozitivní (+) a negativní (-). Konvencí je stanoveno, že pozitivní (+) RNA je mRNA, tj. může být translatována. Negativní (-) RNA je komplementární k mRNA, k správnému překladu je z ní nejdříve třeba získat (+) RNA. Typ vlastní nukleové kyseliny ve virionu pak rozhoduje o způsobu replikace, tj. celkové replikační strategie viru (příklady na Obr.10). U řady těchto syntéz je vždy nutná speciální polymeráza (např. RNA dependentní RNA polymeráza) zabalená ve virionu, která se podílí na některém z kroků replikace, neboť tyto syntézy nejsou buňce vlastní. Zvláštní skupinou virů jsou tzv. retroviry (např. HIV), u kterých dochází v průběhu replikace k přepisu RNA do DNA, procesem tzv. reverzní transkripce. Tento proces je katalyzován speciálním enzymem, reverzní transkriptázou. V průběhu replikace je v přesně stanovených intervalech syntetizována řada proteinů. Časné (ranné) proteiny jsou většinou nutné k vlastní replikaci

- 33 -



virové nukleové kyseliny, pozdní proteiny většinou zahrnují kapsomery a další komponenty budoucího virionu. 9.3.

Diverzita virů - definice základních typů

Bakteriofágy jsou viry, jejichž hostitelem je bakteriální buňka. Z hlediska morfologie se jedná o velmi různorodou skupinu (Obr.11). Mezi nejstudovanější bakteriofágy patří viry napadající enterické bakterie. Z hlediska obsahu nukleových kyselin je možné bakteriofágy dělit na ssDNA, dsDNA, ssRNA a dsRNA viry. Zřídka obsahují membránový obal. Zpravidla disponují kontraktilními bičíky, které napomáhají jejich uchycení na povrchu bakterie. Tyto typy bakteriofágů byly původně studovány jako modelové viry, dnes jsou hojně využívány v genovém inženýrství. Často se rozeznávají virulentní a temperované bakteriofágy. Virulentní bakteriofág způsobuje lýzy a smrt hostitelské buňky po infekci, temperovaný bakteriofág množí svůj genom společně s hostitelským genomem, aniž by navodil smrt buňky. Virulentní bakteriofágy byly historicky prvními dsDNA studovanými viry, na kterých byl objasněn princip replikace virů. Postupně byly pojmenovány indexem T1, T2-T7. Příkladem je bakteriofág T4, jehož virion se skládá z ikozaedrické hlavy, krčku napojující hlavu na prodloužený tubulární bičík a bazální destičku a řadu dalších příchytných struktur (dohromady 25 strukturálně odlišných proteinů). Genom T4 bakteriofága se skládá z lineární dsDNA o velikosti cca 170kbp a kóduje více jak 250 různých proteinů. Na konci vlákna obsahuje terminální repetice 3-6kbp, které slouží ke vzniku tzv. konkatemeru spojením více kopií zreplikovaného viru v hostitelské buňce. Tento konkatemer je následně rozštípán na monomery a ty jsou zabaleny do vznikající virové kapsidy (Obr.12). Proces infekce je velmi rychlý. Přibližně jednu minutu po infekci je zastavena veškerá sysntéza RNA a DNA hostitelské buňky a ihned je započata syntéza fágové RNA a DNA. Čtyři minuty po infekci začíná replikace fágové DNA. Genom T4 bakteriofága je rozdělen na ranné, střední a pozdní geny. Ranné a střednědobé geny jsou zodpovědné především za syntézu enzymů nutných pro replikaci a transkripci fágových DNA, produktem pozdních genů jsou především proteiny hlavy a bičíku (Obr.13). Lyze buňky a uvolnění zralých bakteriofágů je možné díky produkci enzymu T4 lysozymu, který naštěpí peptidoglykan bakterie a umožné její lýzy. Temperované bakteriofágy mohou za určitých okolností přejít do tzv. lyzogenního stavu, ve kterém většina genů viru není exprimována a virový genom (profág) se replikuje v součinnosti s hostitelským chromozomem, přičemž přechází z jedné generace hostitelské

- 34 -



buňky do druhé. Lyzogenie je přítomná nejen u bakteriofágů, ale vyskytuje se i u některých živočišných virů. Za určitých okolností může virus přejít z lyzogenního stavu do stavu lytického a způsobit tak rozpad hostitelské buňky (Obr.14). Profág je zpravidla integrován do bakteriálního chromozomu, v lytickém stavu dochází k jeho opětovnému vyštěpení z genomu. Lyzogenní stav je udržován produkcí represoru kódovaným virem, který zároveň navozuje imunitu hostitelské buňky vůči infekci dalším virem stejného typu. Kryptický virus vzniká mutací integrovaného viru a nemožnosti jeho zpětného vyštěpení z hostitelského genomu. Nejvíce studovaným temperovaným bakteriofágem je bakteriofág lambda, infikující E.coli. Tento virus je velmi podobný stavbou bakteriofágu T4 (Obr.15). Obsahuje lineární dsDNA s jednořetězcovými kohezivními konci (12 bazí), které slouží k cirkulaci DNA v hostitelské buňce (Obr.16, 17). Virus přetrvává v lyzogenním stavu díky tzv. lambda represoru. Přechod do lytického stavu je řízen akumulací regulačního proteinu Cro. Replikace tohoto viru v lytickém cyklu probíhá systémem valivého kruhu. Vznikající konkatemer je naštěpen v cos místech a sbalen v lineární formě do vznikajících virionů (Obr.18). V lyzogenním cyklu je bakteriofág integrován do bakteriálního chromosomu. Integrace je umožněna na zcela specifické místo a je umožněna speciálním proteinem DNA integrázou kódovanou virem. Živočišný virus využívá jako hostitele výhradně živočišnou buňku. Zásadní rozdílem od bakteriofágů je ten, že virus proníká do buňky i s obaly (celý virion) a jeho replikace je spjata s buněčným jádrem hostitelské buňky. Živočišné viry mají velmi různorodou morfologii a na základě této morfologie je založena jejich klasifikace (Obr.19). Obdobně jako u bakteriofágů, ke klasifikaci lze využít i Baltimorova klasifikačního schématu. Infekce živočišné buňky může mít na buňku různý dopad. Lytická infekce vede k zničení hostitelské buňky. V případě perzistentní infekce dochází k tvorbě a pomalému uvolňování virionů z buňky, ta ovšem přežívá. Při latentní infekci dochází ke zpoždění mezi lytickou fází a proběhlou infekcí. V některých případech může docházet k nádorové transformaci hostitelské buňky (Obr.20). Retroviry obsahují RNA genom, který je replikován skrze jeho DNA kopii. Retroviry kódují speciální enzym reverzní transkriptázu (RT), která syntetizuje DNA kopii dle RNA templátu v procesu reverzní transkripce. RT není vlastní pouze retrovirům, obsahují ji i některé DNA viry, např. virus hepatitidy B, nebo virus mozaiky květáku. Ve virionu je kromě RNA zabalena i reverzní transkriptáza, DNA endonukleáza (integráza) a proteáza (Obr.21). Retroviry mají převážně kancerogenní účinky. Mezi retroviry patří virus HIV (human immunodeficiency virus), způsobující onemocnění AIDS (acquired immunodeficiency

- 35 -



syndrome, syndrom získaného selhání imunity). Tento virus napadá T lymfocyty a způsobuje letální poruchu imunitního systému. Genom retroviru je tvořen dvěma pozitivními ssRNA, které kódují oblasti označené jak tzv. gag (kóduje strukturální proteiny), pol (kóduje RT a integrázu) a env (kóduje obaly virionu) (Obr.21). Replikace retroviru probíhá v několika krocích (Obr.22). Průnik do hostitelské buňky (infekce) fůzí s membránou buňky. Odstranění obalů retroviru. Reverzní transripce jednoho z vláken ssRNA. Integrace vzniklé dsDNA do genomu hostitelské buňky. Transkripce retrovirální DNA za vzniku virálních mRNA a genomových virových RNA. Enkapsidace nukleokapsid v cytoplasmě buňky. Průnik virionů přes membránu ven z buňky. Subvirální částice představují infekční částice podobné virům, nejedná se však o viry jako takové neboť jejich životní cyklus neodpovídá definici viru. Do této kategorie patří především viroidy a priony. Viroidy jsou malé cirkulární ssRNA molekuly které představují nejmenší známé patogeny (Obr.23). Způsobují především onemocnění u rostlin. Viroid nekóduje žádné obalové proteiny a extracelulární forma je výhradně holá RNA. Replikace viroidu je závislá pouze na hostitelském genomu. Infekce rostliny probíhá v místě jejího poranění, replikace viroidu probíhá v jádře buňky. Infikované rostliny jsou především ovlivněné v jejich růstu viroidy pravděpodobně působí jako regulační RNA. Zde je pravděpodobně i jejich evoluční původ. Priony jsou subvirální infekční částice, které neobsahují žádnou nukleovou kyselinu jsou tvořeny výhradně proteinem. Priony způsobují řadu infekčních onemocnění živočichů, jako je např. BSE (bovine spongioform encephalopathy, bovinní spogioformní encefalopatie), kuru, Creutzfeldt-Jakobovo onemocnění (CJD) u člověka - souhrně označované jako přenosná spongioformní encefalopatie (TSE) (Nobelova cena za objev v roce 1997 Stanley B. Pruisner, USA). Všechna onemocnění jsou způsobena přenosem infekční částice proteinu, a jeho následným množením v napadené tkáni (především v nervové tkáni). Výslekem je degenerace nervové tkáně. Pravděpodobný průběh infekce prionem je znázorněn na Obr.24. Infekční protein (prion) PrPSc je obdobou normálního funkčního glykoproteinu PrPc. Přítomnost prionu způsobuje denaturaci a akumulaci nefunkčního PrPc propagačním mechanismem.

- 36 -



INTERAKCE MIKROORGANISMŮ S ČLOVĚKEM

10.1. Základní přehled interakcí mikroorganismů s člověkem Lidský organismus je neustále vystaven působení obrovskému množství mikroorganismů. Výsledkem je ustavení vztahu mikrobiont-člověk, který ve svém důsledku může být pro člověka pozitivní ale i negativní. Normální mikrobiální flóra je tvořena stovkami druhů mikrobiont, které žijí na povrchu či uvnitř organismu člověka a zaběžných okolností neprojevují žádné patogenní účinky. Organismy, které žijí na povrchu či uvnitř organismu a způsobují poškození hostitelského organismu se označují jako parazité. Mikrobiální parazité se častěji označují jako patogeny. Výsledný vztah host-parazit závisí na patogenitě mikroorganismu. Hostitelský organismus může projevovat rezistenci či toleranci k patogenu. Příležitostný patogen způsobuje onemocnění pouze v případě nepřítomnosti rezistence hostitelského organismu, která je vůči tomuto patogenu běžná, avšak může dojít k jejímu narušení. Virulence je kvantitativní mírou patogenity daného patogenu, která se v různých podmínkách může lišit. Virulence je definovaná počtem buněk vykazujících patogenezi jako odpověď na infekci hostitele v daném časovém intervalu. Pojem infekce značí stav, kdy mikroorganismus přežívá v hostiteli ať jsou důsledky jeho růstu pro hostitele jakékoliv. Onemocnění je poškození (patogeneze) hostitelského organismu jako důsledek infekce. Pojem infekce a onemocnění nelze zaměnit. Lidský organismus představuje velmi výhodné podmínky pro růst mikroorganismů díky stálosti vnitřního prostředí (homeostáze). V rámci různých částí organismu se však podmínky pro růst různých organismů výrazně liší. Z tohoto důvodu lze nalézt charakteristické zástupce mikroorganismů kolonizujících např. dýchací trakt, povrch kůže, trávící trakt atd. Nejběžnější zástupci mikroorganismů tvořících běžnou mikroflóru člověka jsou uvedeny na Obr.1. Infekce hostitele zpravidla začíná průnikem mikroorganismu přes sliznice. Sliznice jsou tvořeny epiteliálními buňkami a vrstvou rozpustných glykoproteinů - mukózy. Ta zpravidla fyzicky brání průniku bakterie k epitelu (Obr.2). Po průniku bakterie mukózní vrstvou dochází k její následné invazi do hostitele. Bakterie jsou běžně přítomné v povrchových vrstvách organismu. Jejich přítomnost v jinak sterilních orgánech, v krvi, lymfě a nervovém systému indikuje závažné infekční onemocnění. 10.2. Mikrobiální flóra člověka

- 37 -



Mikroflóra kůže. Struktura kůže (Obr.3), obzvláště pak suchá epidermis zpravidla omezuje přítomnost bakterií na jejím povrchu, vyjma oblastí se zvýšenou sekrecí potu (podpaží, okolí pohlavních orgánů atp.). Zvýšená přítomnost bakteríí je často indikována v mazových žlázkách přiložených k vlasovým pouzdrům. Přechodná společenstva bakterií se nejsou schopna na kůži množit, rezidentní společenstva jsou množení schopná. Klasickými zástupci bakterií na kůži jsou grampozitivní druhy rodu Staphylococcus a zástupci korynebakterií. Častá je i bakterie Propionibacterium acnes, způsobující akné. Gramnegativní bakterie jsou řídké, především E.coli, pokuď dojde ke kontaminaci z trávícího ústrojí. Častá je bakterie Acinetobacter. Normální složení kožní mikroflóry ovlivňuje řada faktorů, jako je počasí (pot, suchá kůže), věk a osobní hygiena. Mikroflóra ústní dutiny. Ústní dutina představuje značně heterogenní podmínky pro růst bakterií. Sliny obsahují lysozym, který nespecificky ničí přítomné bakterie. Enzym laktoperoxidáza, která je rovněž přítomna ve slinách hubí bakterie tvorbou singletního kyslíku. Hustě jsou kolonizovány zuby ve formě dentálního plaku. Obecná stavba zubu je na Obr.4. Kolonizace zubního povrchu je umožněna na tenkém podkladě z glykoproteinů, tvořených ve slinách. Tento povrch je postupně kolonizován bakteriemi rodu Streptococcus (S. sanguis, S. sabrinus, S. mutants, S. mitis). Na podkladě těchto bakterií rostou postupně následné vrstvy plaku tvořené bakteriemi jako je Fusobacterium (filamentární bakterie), Borrelia (spirochety), grampozitivními tyčkami a gram-negativními koky (Obr.5). S nárůstem dentálního plaku souvisí i nárůst koncentrace organických kyselin v mikroprostředí povrchu zubu, které způsobují dekalcifikaci zubní skloviny (enamel) a vznik zubního kazu. Narušení povrchu zubu je počátkem další degradace zubní tkáně účinkem bakteriálních proteolytických enzymů. Další vývoj zubního kazu je velmi komplexní děj, na jehož progresi se podílí řada bakteriálních druhů (především Streptococcus). Přítomnost fluoridu ve vodě omezuje dekalcifikaci a tím vznik zubního kazu. Mikroflóra gastrointestinálního traktu. Trávící trakt je tvořen žaludkem, tentkým a tlustým střevem (Obr.6). Kyselé prostředí žaludku (pH=2) působí jako bariéra pro vstup bakterií do trávícího traktu. Vyjímkou je bakterie Helicobacter pylori, přítomná běžně na povchu žaludeční stěny. U některých jedinců může vyvolat vorbu žaludečních vředů. Složení bakteriální mikroflóry ostatních částí trávícího traktu je různorodé a záleží na typu diety jedince. Obdobně jako v žaludku, mikroflóra tenkého střeva je velmi řídká, opět díky kyselému prostředí. Směrem k tlustému střevu se vzrůstem pH narůstá i množství

- 38 -



bakteriálních druhů a jejich počet. Tlusté střevo je bohatě kolonizováno řadou bakteriálních druhů, které zpravidla fermentují řadu látek vzniklých natrávením potravy. Hojně se vyskytují fakultativní aerobové jako E. coli (10E7 bakterií na gram obsahu střev). Činností těchto bakterií vzniká anoxygenní mikroprostředí, které podporuje růst striktních anaerobů. Obligátní anaerobové jsou zastoupeny rody Clostridium a Bacterioides (10E10 až 10E11 bakterií na gram obsahu střev). Řada produktů vznikajících v gastrointestinálním traktu činností bakterií je pro člověka esenciálních, např. vitamíny K a B12. Mimo ně vznikají další především fermentační produkty, jako jsou plyny (H2S, CH4,H2), organické kyseliny atd. Bakterie tvoří až 1/3 celkové váhy exkrementů. Průměrná rychlost jejich dělení je cca 2krát za den. Používání antibiotik inhibuje nejen patogenní bakterie, ale i normální střevní mikroflóru. Narušení rovnováhy může vyústit v přemnožení příležitostných patogenů (rezistentní Stafylococcus, Clostridium, kvasinky Candida albicans). Obnovení původního stavu po vysazení antibiotik může trvat velmi dlouho. Mikroflóra dýchacího traktu. Horní dýchací cesty jsou kolonizovány microorganismy žijícími v místech zvlhčovaných produkcí mukózy. Rezidentní druhy jsou především stafylokoky, streptokoky, gramnegativní koky. Potenciálními patogeny jsou především Stafylococcus aureus a Streptococcus pneumoniae, za běžných okolností neškodných. Dolní dýchací cesty nemají rezidentní mikroflóru především díky řasinkovému epitelu, který odstraňuje zachycené bakterie a prach a vytlačuje je zpět do horní části dýchacích cest. Mikroflóra urogenitálního traktu. Vnitřní orgány, jako je močový měchýř, jsou zpravidla sterilní. Močová trubice je zpravidla kolonizována fakultativně aerobními gramnegativními tyčkami a koky. Bakterie E.coli a Proteus mirabilis mohou způsobit patogenní infekci močovodu. Typickou rezidentní bakterií vaginy dospělé ženy je Lactobacillus acidophilus, fermentující glykogen na kyselinu mléčnou a udržuje tak kyselé pH vnitřního prostředí. 10.3. Patogenní interakce - patogeneze a její příčiny Prvním krokem infekce hostitele patogenní bakterií je její penetrace do organismu (průnik přes mukózní vrstvu k povrchu epitelu, průnik kůží např. v místě poranění atd.) (Obr.7). Patogeny (viry, bakterie) mají schopnost specifické vazby na epiteliální buňky skrze makromolekulární interakce. Specifičnost vazby je jak v rámci druhu hostitele (specializace na určitého hostitele), tak v rámci samotného organismu (rozdílná adsorpce na různé epitely). Specifická vazba bakterie je umožněna např. polysacharidovým slizovým pouzdrem, popř.

- 39 -



kapsulí (Obr.8). Fimbrie a pily jsou proteinové útvary, které se procesu selektivní penetrace rovněž účastní vazbou na glykoproteiny exponované na povrchu hostitelské buňky. Nejprostudovanější jsou fimbrie typu I. enterických bakterií (Obr.9). Patogenní kmeny bakterie E.coli produkují fibrilární proteiny CFA (colonization factor antigens), váží se na sliznici a produkují enterotoxiny. Způsobují tak průjmová onemocnění. Po uchycení patogenu v místě vstupu do organismu pokračuje fáze tzv. invaze. Patogeny se dostávají do přímého styku se slizničním epitelem, popř. hlubší tkání. Kolonizace spočívá v nalezení živin a optimálního prostředí uvnitř hostitele a následného pomnožení patogenu. Zpravidla je kolonizace zpočátku lokalizovaná pouze v určitém místě (vzniká zde místní zánět jako reakce na průnik patogenu). V určitých případech se patogen dostane do lymfy (krve) a je šířen do ostatních částí organismu. Vzniká tak generalizovaná infekce. Virulence je zpravidla uváděna jako hodnota LD50 (letální dávka 50), tj. vyjadřuje počet buněk, potřebných k infekci takového rozsahu, jehož důsledkem je vyhynutí 50% buněk. Na Obr.10 je uvedeno srovnání vysoce virulentní bakterie Streptococcus pneumoniae a středně virulentní bakterie Salmonella typhimurium. Pojem atenuace označuje ztrátu patogenity některých původních patogenů v důsledku jejich kultivace v laboratorních podmínkách. Ztráta patogenity je způsobena selekcí nepatogenních forem v nepřítomnosti hostitelského organismu.Tyto nepatogenní kmeny jsou často využívány k produkci vakcín a imunizaci. Virulence patogenu má svůj původ v toxicitě a invazivitě patogenu. Toxicita patogenu je schopnost produkovat tzv. toxiny, které inhibují funkci či usmrcují hostitelskou buňku. Tímto způsobují onemocnění. Příkladem je exotoxin způsobující onemocnění tetanus. Ten je produkován bakterií Clostridium tetanii, která se dostane do styku s poraněnou tkání hostitele. Invazivita je schopnost patogenu růst v hostitelské tkáni v takové míře, že inhibuje obecné funkce hostitele. Onemocnění tak může nastat i v případě, kdy patogen neprodukuje toxin. Např. nejdůležitějším virulentním faktorem bakterie Streptococcus pneumoniae je polysacharidová kapsule, zamezující fagocytóze makrofágem. Diky tomu jsou tyto bakterie extrémě invazivní a účinně se množí především v plicích. Oba výše uvedené příklady jsou extrémní, neboť virulence je vždy způsobena pouze toxicitou, resp. vysokou invazivitou. Ostatní patogenní bakterie zpravidla kombinují obě možnosti, virulence je pak dána souhrou těchto faktorů. Typickým příkladem je bakterie Salmonella (Obr.11), která produkuje nejméně tři toxiny (enterotoxin, endotoxin, cytotoxin) a řadu dalších faktorů zaměřených proti imunitnímu systému hostitele. - 40 -



10.4. Virulentní faktory a toxiny Jako virulentní faktory jsou označovány extracelulární proteiny patogenních bakterií, které napomáhají vzniku onemocnění a odolnosti patogenu před imunitní obranou hostitele. Řada faktorů jsou enzymy, které napomáhají růstu a kolonizaci patogenu. Příkladem je hyaluronidáza streptokoků a stafylokoků, která štěpí extracelulární polysacharid hyaluronovou kyselinu - hostitelského organismu a rozrušuje tak jeho tkáň. Dalšími častými enzymy jsou lipázy, nukleázy, proteázy. Streptokináza, produkována bakterií Streptococcus pyogenes rozrušuje fibrinovou síť, vznikající v místě poranění a umožňuje tak progresivní kolonizaci. Koaguláza bakterie Staphylococcus aureus naopak podporuje vznik fibrinové sítě okolo bakterie, která ji chrání před makrofágy hostitele. Exotoxiny jsou toxické proteiny produkované patogeny do extracelulárního prostoru. Toxiny se dostávají zpravidla do celého organismu a způsobují patogenní reakce i na vzdálených místech od místa infekce. Exotoxiny se zpravidla dělí dle účinku na cytolytické toxiny, A-B toxiny, a superantigenní toxiny (Obr.12). Cytolytické toxiny způsobují lýzy buněk, např. rozrušením cytoplasmatické membrány. Do této kategorie spadají tzv. hemolyziny, tj. enzymy, které způsobují rozpad erytrocytů a jejich přítomnost je snadno stanovena kultivací patogenu na tzv. krevním agaru. Jelikož princip jejich účinku spočívá v rozrušení struktury fosfatidylcholinu - membránového lipidu - jsou často nazývány lecitinázy (fosfolipázy). A-B toxiny se skládají ze dvou kovalentně spojených jednotek, z nichž jedna (B) se váže na receptor v membráně hostitelské buňky a umožňuje transfer jednotky A do buňky. Tato jednotka je toxická a způsobuje smrt buňky. Příkladem je difteriální toxin, produkovaný bakterií Corynebacterium diphtheriae, původce onemocnění záškrtu (Obr.13). Jednotka A tohoto toxinu, která proniká do hostitelské buňky, zastavuje proteosyntézu změnou vlastností elongačního faktoru EF-2 a způsobuje tak postupnou smrt buňky. Toxin je kódován lysogenním bakteriofágem přítomným v patogenním kmenu bakterie. Botulotoxin je produkován neinvazivní bakterií Clostridium botulinum, která může být přítomna např. ve špatně skladované potravě. Botulismus je smrtelné onemocnění způsobené intoxikací tímto toxinem. Smrt je navozena selháním respiračního systému v důsledku paralyzace nervové soustavy (Obr.14). Princip toxicity spočívá v blokaci uvolnění nervového mediátoru acetylcholinu do nervosvalové ploténky a nemožnosti šíření nervového vzruchu na sval.

- 41 -



Botulotoxin je potenciálně nejúčinnější biologickou zbraní. Je prokázáno, že 1mg tohoto toxinu je schopen usmrtit až 1 milion prasat. Toxin tetanu je produkován obligátně anaerobní bakterií Clostridium tetanii, kolonizující anoxygenní mikroprostředí v místě poranění hostitele. Ačkoliv bakterie je neinvazivním patogenem, produkovaný toxin se dostává skrze motorické neurony do krční míchy a váže se na zakončení inhibičních interneuronů. Zde blokuje uvolnění neurotransmiteru glycinu, který za normálních okolností blokuje uvolnění acetylcholinu v nervosvalovém zakončení motoneuronů a tím inhibuje svalovou kontrakci. Nemožnost této normální reakce má za následek tetanus, tj. spastickou paralýzu svalu, který setrvává v neustálé kontrakci (Obr.15). Enterotoxiny jsou exotoxiny, které ovlivňují činnost převážně tenkého střeva, a způsobují rozsáhlou sekreci tekutiny do lumen střeva, silný průjem a zvracení. Tyto toxiny jsou produkovány řadou bakterií vznikajících ve zkažené potravě (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus) popř. v enterických patogenech (Vibrio cholerae, patogenní kmen Escherichia coli, Salmonella enteritidis). Nejprostudovanější enterotoxin je toxin bakterie Vibrio cholerae způsobující onemocnění choleru. Tento toxin je opět A-B toxin. Část A tohoto toxinu aktivuje enzym adenyl cyklázu v epitelu tenkého střeva, zvyšující obsah cAMP v epiteliálních buňkách. Zvýšená koncentrace cAMP způsobuje masivní transport chloridových a bikarbonátových iontů do střeva a masivní dehydrataci organismu v důsledku vysoké sekrece vody do střeva (Obr.16). Endotoxiny

jsou

toxické

lipopolysacharidy

mající

původ

ve

vnější

membráně

gramnegativních bakterií (Escherichia, Shigella, Salmonella) (viz kapitola 2). Jsou uvolněny po rozpadu bakterie (v kontrastu s exotoxiny, ty jsou produkovány živými bakteriemi, srovnání na Obr.22). Jejich uvolnění je příčinou řady fyziologických projevů hostitele. Vyvolávají horečnaté stavy, neboť stimulují v hostitelských buňkách produkci tzv. endogenních pyrogenů, které ovlivňují centra kontroly tělesné teploty v mozku. Stimulují uvolnění cytokinů, snížení množství lymfocytů a leukocytů, navozují nekrózu tkáně. Celková toxicita je však mnohem nižší než toxicita exotoxinů. 10.5. Faktory ovlivňující infekci Existuje řada hostitelských faktorů, které ovlivňují míru patogenicity mikroorganismu jak negativně (zvyšují riziko či projev infekce), tak pozitivně (zvyšují odolnost k infekci, snižují projev onemocnění). Věk hostitele je podstatným faktorem, ovliňujícím odolnost infekci.

- 42 -



Nízký věk a velmi vysoký věk zvyšují riziko infekce. Intestinální trakt novorozenců nemá vyvinutou přirozenou bakteriální mikroflóru a je velmi náchylný k patogenním infekcím. Příkladem je infantní botulismus. Bakterie Clostridium botulinum kolonizuje střevo kojenců a produkuje botulotoxin. Při vysokém věku je například zvýšené riziko respiračních onemocnění a infekce močových cest. Stres (únava, zvýšená námaha, špatné stravování, dehydratace atp) je velmi závažným faktorem, zvyšující predispozice pro infekci a intenzivnější průběh nemoci. Například zvýšená produkce hormonu kortisonu v průběhu stresu inhibuje zánětlivou reakci a snižuje tak aktivaci immunitní reakce potřebnou pro běžnou obranu proti nemoci. Kvalita stravování ovlivňuje především rovnováhu složení normální mikroflóry těla. Pokud dojde k jejímu narušení, nastává zvýšené riziko infekce patogenními organismy. Výraznými rizikovými faktory je např. kouření, nadbytečná konzumace alkoholu, drog, nedostatek spánku, akutní nebo chronická infekce jinými patogeny (např. HIV) atd. 11.

ZÁKLADY EPIDEMIOLOGIE

11.1. Základní principy a pojmy epidemiologie Epidemiologie se zabývá studiem výskytu, distribuce a kontrolou infekčních onemocnění v populaci. Praktické uplatnění zejména v oblasti kontroly onemocnění je úzce spjatá s veřejným zdravotnictvím a je nutně ovlivněna ekonomickými, politickými a kulturními poměry v dané oblasti. Např. kontrola závažných infekčních onemocnění v rozvinutých státech umožnila minimalizovat množství úmrtí v populaci na minimum, ačkoliv celosvětově jsou infekční onemocnění zodpovědné téměř za 30% všech úmrtí ročně. Cílem epidemiologie je vystopovat počátek rozšíření epidemie, její zdroj (ohnisko) a způsob přenosu. Epidemiologická data jsou získávána z klinických studií, hlášení o rozšíření nemoci, dotazníků atd. Nejedná se tedy o studium geneze onemocnění u jedince, ale v rámci celé populace. Epidemiologie využívá ustálenou terminologii. Prevalence (rozšíření) nemoci v populaci je definována jako procento nemocných jedinců v populaci v daný časový interval. Incidence (výskyt) nemoci znamená počet individuálních onemocnění v populaci v daný časový interval. Jako epidemie se označuje stav, pokud se nemoc vyskytuje v neobvyklém počtu jedinců v dané období. Pandemie je obecně rozšířená epidemie celosvětového rázu. Jako endemická se označují onemocnění, které jsou konstantně přítomná zpravidla s nízkou

- 43 -



incidencí v populaci (Obr.1). Endemická onemocnění jsou zpravidla málo virulentní a převážná většina populace je rezistentních, existují však jedinci, kteří jsou zdrojem nákazy. Sporadické případy nastávají v individuálních onemocněních v geograficky oddělených oblastech. Propuknutí nemoci označuje nález nových onemocnění v oblasti předchozích sporadických případů. Jako subklinická infekce se označuje případ, kdy nemocní jedinci neprojevují žádné nebo velmi malé symptomy onemocnění. Tyto jedinci jsou zpravidla nosiči (přenašeči) tohoto onemocnění, schopní infikovat další jedince. Mortalita značí incidenci úmrtí v populaci. Morbidita (chorobnost) označuje incidenci onemocnění v populaci. Morbidita ze statistického hlediska lépe vystihuje zdraví populace, neboť většina infekčních onemocnění projevuje relativně nízkou mortalitu. Průběh onemocnění jedince lze charakterizovat několika stádii. Infekce označuje počátek růstu patogenu v hostiteli. Inkubační perioda označuje dobu mezi infekcí a prvními projevy symptomů onemocnění (dny-roky, např. chřipka vs. AIDS). Akutní perioda je charakteristická maximálními projevy onemocnění (horečka, třes). Ústupová perioda - ústup onemocnění, ustupování symptomů. 11.2. Rezervoár nemocí a epidemie Rezervoár (ohnisko) nákazy je místo, kde přežívá životaschopný infekční agens a ze kterého může dojít k infekci jedince. Zdroj nákazy může mít povahu živého organismu (živočich), odumřelého organismu, nebo může přežívat např. v půdě (Clostridium tetani). V tomto případě může patogen přežívat i mimo hostitelský organismus. Pro řadu patogenů je však živý organismus jediným možným zdrojem, neboť jejich životní cyklus je s hostitelem úzce spjat. Příkladem jsou infekční nemoci přenášené z člověka na člověka, např. řada respiračních patogenů, sexuálně přenosných infekcí atd. Jako zoonóza je označována infekce, objevující se primárně u zvířat, ale příležitostně může dojít k infekčnímu přenosu na člověka. Tato infekce je však zřídka přenosná dále z člověka na člověka. Pokud k tomuto přenosu přeci jen dojde, může to znamenat vysoké riziko celosvětové pandemie (viz. aktuální problematika viru ptačí chřipky). Prevence této hrozby je zamezení šíření epidemie mezi zvířaty a snížení rizika přenosu na člověka. Příkladem je vymícení moru přenášeného hlodavci a hmyzem. Deratizace, redukující populaci hlodavců omezila i šíření onemocnění v lidské populaci, a to pravděpodobně účinněji, než případná imunizace. Obdobně byla snížena incidence bovinní tuberkulózy, zejména důslednou veterinární kontrolou a pasteurizací mléka. Za šíření infekce je zpravidla zodpovědný nosič (přenašeč). Může se jednat o akutního nosiče, který přenáší infekci pouze malou časovou periodu, zpravidla shodnou s inkubační dobou infekce.

- 44 -



Chronický nosič je nakažen a přenáší onemocnění douhodobě. Velmi často se jedná o jedince, kteří jsou vyléčeni z klinických příznaků nemoci, avšak stále je v nich přítomen latentní živý patogen (např. tuberkulóza, hepatitida). 11.3. Přenos infekčních onemocnění Mechanismus přenosu infekčních onemocnění vždy záleží na typu patogenu, zdroji a vektoru. Velmi často je přenos a tím i incidence onemocnění ovlivněna geografickými podmínkami (přítomnost zdroje, např. malárie v tropických oblastech), ročním obdobím (např. encefalitida, Obr.2), věkem, a dalšími parametry (zvýšený přenos chřipky v období školní docházky). Všechny přenosové mechanismy však mají společné znaky: (1) únik z původního hostitele; (2) cesta přenosu; (3) přenos na nového hostitele. Přímý přenos hostitelhostitel nastává v případě, že infikovaný hostitel je schopný přenést infekci na jiného hostitele přímo, tj. bez nutnosti zprostředkování přenosu. Nejčastějším případem tohoto typu je kapénková infekce, tj. přenos respiračních onemocnění (viróza, chřipka). Některé patogeny nejsou schopny přežít mimo organismus hostitele a jsou přenášeny pouze přímým kontaktem. Příkladem jsou sexuálně přenosné onemocnění, jako je syfilitida (původce Treponema pallidum) a kapavka (gonorrea, původce Neisseria gonorrhoeae), popř. infekční onemocnění kůže (stafylokoky). Nepřímý přenos mezi hostitely vyžaduje prostředníka přenosu. Ten může být neživé povahy (např. věci denní potřeby), nebo živý organismus (převážně členovci, obratlovci). V případě živého prostředníka se hovoří o vektoru. Členovci zpravidla přenáší patogen ve formě krve nasáté z jednoho hostitele. Zní se dostává do nového hostitele v okamžiku bodnutí. Epidemie může být způsobena obecným zdrojem, např. infekcí velkého počtu jedinců z jednoho zdroje (kontaminovaná voda, potraviny). Tímto způsobem vznikají především epidemie intestinálních onemocnění. Jiný typ epidemie vzniká v případě přímého přenosu (např. chřipka). Oba typy epidemií se liší dobou a velikostí incidence (Obr.3). Epidemie pocházející z obecného zdroje trvá krátkou periodu vyznačující se vysokou incidencí. V druhém případě incidence narůstá relativně pomalu, avšak epidemie trvá dlouhou dobu. V případě, že hostitelská populace se s daným typem patogenu dosud nesetkala, může nastat velmi závažná, explozivní epidemie. V běžném případě dochází během doby k vytvoření rezistence uvnitř populace hostitele a incidence klesá. Vytvoří se tak rovnováha mezi rezistencí populace a infekcí patogenem. V případě, že patogen je životně svázán s tímto typem hostitele, tato rovnováha je nutná k jeho přežití a dochází tak k jevu tzv. koevoluce. V - 45 -



rámci koevoluce dochází k vzájemnému ovlivnění evoluce hostitele a patogenu směrem k jejich oboustrannému přežití. Příklad koevoluce a jejího vývoje je zdokumentován na myxomatózním viru a australské populaci divokých králíků (Obr.4). Uměle navozená infekce s cílem vyhubit introdukované králíky v 50.letech 20.st. zahubila 95% jejich tehdejší populace. Dnešní virulence tohoto viru je vzhledem k původní virulenci velmi nízká a populace rezistentních králíků je co do počtu na tehdejší úrovni. Koevoluce je typická pro patogeny, které se šíří přímým přenosem. Patogeny, které se šíří přes vektory, či přes obecný zdroj nepodléhají koevolučnímu tlaku. Hromadná imunita označuje stav, kdy populace je rezistentní k určité infekci z důvodu imunity velkého počtu jedinců v populaci. Nutné procento imunních jedinců zaručujících tento stav se liší u různých patogenů a závisí především na jeho virulenci. U vysoce virulentích patogenů je toto procento velmi vysoké (chřipka, 90-95%). Díky těmto principům se řada epidemií vyskytuje v pravidelných cyklech. Typickým příkladem je chřipkové onemocnění, jehož rychlé rozšíření je dáváno do souvislosti se školním rokem a usnadněním jeho přenosu (Obr.5). 11.4. Epidemiologie a zdravotnictví Kontrola a snížení rizika epidemie infekčních onemocnění je prvořadým zájmem zdravotnické politiky naprosté většiny států světa. Důsledná kontrola zdrojů nákazy, růst životní úrovně, zlepšení hygienických podmínek a vakcinační programy výrazně snížily rozšíření infekčních onemocnění, které ještě v 19.století způsobovali rozsáhlé epidemie. Tento fakt bohužel platí především v rozvinutých zemích. V chudých rozvojových zemích je riziko vzniku rozsáhlých epidemií velmi vysoké (Obr.6). Epidemiologická kontrola je prováděna na několika úrovních, které mají za cíl minimalizovat riziko šíření infekce a eliminovat zdroje nákazy. Kontrola cílená proti zdroji nákazy. Pokuď je zdrojem nákazy domestikované zvíře (příklad zoonóz), pak kontrola šíření infekce mezi zvířaty omezuje riziko přenosu infekce na člověka. Zpravidla jsou uplatňovány imunizační programy, popř. nucená porážka infikovaných a potenciálně nakažených zvířat. Tento způsob kontroly se osvědčil např. při kontrole brucelózy a bovinní tuberkulózy, nově je uplatňován při kontrole bovinní spongioformní encefalopatie a ptačí chřipky. V případě, že zdrojem je divoká zvěř, kontrola je daleko obtížnější. Příkladem je kontrola vztekliny, infekčního onemocnění, jehož zdrojem je přednostně divoká zvěř s možným přenosem na domácí zvěř a člověka. Domácí zvěř je pravidelně očkována, u divoké zvěře toto nelze plně zaručit, obzvlaště v případě rozsáhlých - 46 -



areálů. Jestliže je zdrojem hmyz, je kontrola zpravidla prováděna chemickými insekticidy. Příkladem je kontrola malárie a žluté horečky hubením komárů. Používání některých prostředků však přineslo výrazné environmentální zatížení (např. insekticid DDT). V případě, že zdrojem je člověk, je zpravidla možné provádět účinnou kontrolu šíření důslednou imunizací populace. Kontrola šíření patogenu. Patogeny, které se šíří vodou či potravou je možné omezit preventivní kontrolou kontaminace a vhodnou úpravou pitné vody a potravy. Zavedené metodiky úpravy pitné vody výrazně omezily rozšíření břišního tyfu a enteropatogenů. Pasteurizace mléka snížuje riziko přenosu bovinní tuberkulózy na člověka. Kontrola šíření infekce vzduchem je nesnadná a zpravidla je možná do určité míry pouze v uzavřených prostorách s nucenou cirkulací vzduchu, který je filtrován. Imunizace (očkování). Onemocnění jako jsou neštovice, záškrt, tetanus, černý kašel, spalničky, příušnice, dětská obrna a vzteklina jsou přednostně kontrolovány imunizačními programy. Imunizace je zpravidla prováděna v dětském věku. Neboť účinnost ochrany imunizací v průběhu let klesá, je i v dospělém věku nezbytné přeočkování proti některým onemocněním (např. tetanus každých 10 let). Tato přeočkování jsou velmi důležitá, neboť nákaza některými typicky dětskými infekcemi v dospělém věku může mít velmi závažné důsledky (příušnice, spalničky, zarděnky u těhotných žen atd.). Tyto imunizační programy přinesly vymícení přírodně se vyskytujícího patogenu - viru neštovic. U jiných patogenů se jejich vymícení v brzké době předpokládá (dětská obrna, lepra). Karanténa je dalším ze způsobů kontroly. V tomto případě se jedná o omezení volného pohybu infikovaného jedince a snížení rizika přenosu nákazy v populaci. Nejedná se zpravidla o striktní izolaci ve specializované místnosti. Tento způsob se využívá pouze při nejrizikovějším stupni nákazy (např. SARS, Ebola). Dle mezinárodních konvencí je karanténa uplatňována zejména na nemocné neštovicemi, morem, cholerou, žlutou horečkou a tyfem. 11.5. Současná epidemiologická rizika Globální rozšíření infekčních onemocnění a riziko epidemie je neustále aktuální, zejména díky možnosti mutací stávajících patogenů a jejich následné vysoké virulenci, v důsledku změny hostitele či prostředí a celkové globalizace společnosti. Nově vznikající epidemie nemusí být nutně způsobeny dosud neznámým patogenem, ale může se jednat i o známá

- 47 -



onemocnění, u kterých se např. vyvinula rezistence na antibiotika, či selhává jejich kontrola. V moderní historii člověka jsou dobře zdokumentované opakující se epidemie infekčních onemocnění, jako jsou např. středověké morové epidemie, tzv. španělská chřipka (19181919), legionela (1980) a v současnosti AIDS. Největší recentní hrozbou je především vysoce virulentní a mortalitní SARS (severe acute respiratory syndrome) a v případě přímého přenosu mezi lidskou populací zmutovaný virus ptačí chřipky. Příklady některých ohnisek závažných infekčních onemocnění posledních let jsou na Obr.7. Existuje řada faktorů, které jsou zodpovědné za šíření nových patogenů: (1) lidská demografie a chování; (2) technologie a průmysl; (3) ekonomická úroveň a způsob využití půdy; (4) mezinárodní obchod a turismus; (5) selhání veřejné zdravotní kontroly; (6) adaptace a změna patogenů; (7) abnormální narušení rovnováhy hostitel-patogen. Demografické změny zejména v posledních 200 letech soustředily obrovské množství lidské populace do měst. Tento fakt výrazně napomáhá rychlému šíření infekčních onemocnění. Lidské rizikové chování je zodpovědné především za šíření sexuálně přenosných infekcí, jako je hepatitida a AIDS. Technologický pokrok se odráží např. ve schopnosti produkce a vývoje nových antibiotik, avšak na druhé straně způsobuje vznik rezistencí patogenů a jejich opětovné rozšíření (např. Streptococcus pneumoniae). Transport zboží a centralizované distribuční metody mohou zvýšit riziko nákazy, pokuď selže kontrolní mechanismus. Ekonomická úroveň a s ní související změny ve využívání půdy mohou přinést např. větší rozšíření vektorů a tím i zvýšení rizika přenosu infekce (horečka Rift Valey v Egyptě, 1970 - stavba přehrady, přemnožení komárů). Mezinárodní obchod a turistika napomáhá přenosu patogenů z endemických oblastí. Zde existuje řada závažných rizik přenosu onemocnění, ke kterému došlo např. v případě viru Margburg (filoviry pocházející z centrální Afriky, mortalita více jak 20%), popř. může dojít u jiných patogenů, jako je virus Ebola (centrální Afrika, mortalita 50%). Adaptace a mutace patogenů je problémem především v případě RNA virů jako je chřipka a HIV. Tyto genomy nemají korekci replikace a extrémně rychle hromadí mutace. To je činní velmi proměnlivým patogenem. Bakteriální rezistence jsou často vyvolány mobilními genetickými elementy, jako jsou plasmidy, bakteriofágy a transpozony, rychle šířícími odolnost vůči antibiotikům i v rámci různých patogenních druhů. Rezistence na antivirotika je opět běžná zejména v případě RNA virů (HIV).

- 48 -

OPORY KE STUDIU JEDNOOBOROVÉ BIOLOGIE NA KATEDŘE BIOLOGIE PŘF UJEP BIOLOGIE PROKARYOT A VIRŮ JAN MALÝ KATEDRA BIOLOGIE PŘF UJEP

Recommend Documents