Opory pro kombinované studium jednooborové biologie. Bioanalytické metody. Mgr. Jan Malý, Ph.D. Katedra biologie PřF UJEP

Opory pro kombinované studium jednooborové biologie

Bioanalytické metody

Mgr. Jan Malý, Ph.D. Katedra biologie PřF UJEP

Předmluva Tyto opory jsou určeny pro studenty magisterského stupně kombinovaného studia biologie na PřF UJEP. Smyslem těchto opor je především poskytnout studentovi vodítko k samostudiu ve formě souhrnu strukturovaných pojmů, doporučené literatury a modelových otázek. Dalším zdrojem informací ke studiu budou materiály, které studenti obdrží v průběhu kontaktní formy studia (prezentace z přednášek s obrazovým materiálem, protokoly k laboratorním cvičením). Opory v žádném případě nesuplují studijní literaturu, spíše shrnují nejzákladnější pojmy, jejichž znalost bude v průběhu kontroly studia od studenta očekávána. Členění na jednotlivé kapitoly volně kopíruje sylabus přednášek s určitými vzájemnými přesahy v některých oblastech, což je dáno poměrně komplexními principy jednotlivých metod. Každá kapitola obsahuje krátké shrnutí tématu, strukturovaný souhrn pojmů, otázky k samostudiu a doporučenou studijní literaturu. Předložené opory budou průběžně dále doplňovány a korigovány tak, jak si to trendy v jednotlivých oblastech vyžádají.

1.

Spektroskopické a fluorescenční metody studia biomolekul

1.1

Stručné vymezení obsahu kapitoly

Podstatou spektroskopických metod je interakce elektromagnetického nebo částicového záření s hmotou. Spektroskopické metody v bioanalytice využívají interakce vln elektromagnetického záření k získání důležitých kvalitativních i kvantitativních informací o biomolekulách ve vzorku. Zařízení, které umožňují na základě tohoto principu identifikovat, charakterizovat či kvantifikovat patřičné biomolekuly se nazývají spektrometry. Absorpční spektroskopie zaznamenává míru pohlcení elektromagnetického záření hmotou, naproti tomu emisní spektroskopie zaznamenává záření emitované (uvolněné) v průběhu energetických změn v atomech a molekulách. Tzv. UV-Vis spektrofotometrie využívá radiaci v oblasti ultrafialového a viditelného záření k indukci elektronových přechodů v molekulách. Jednou z nejběžnějších metod využívající UV-Vis spektrofotometrie je získání informace o koncentraci biomolekul na základě koncentrační závislosti absorbance vyjádřené tzv. Lambert-Beerovým zákonem. Infračervená spektroskopie využívá záření v infračervené oblasti spektra k indukci vibračních pohybů vazeb v molekulách/biomolekulách. IR spektrometr je využíván k proměření tzv. infračerveného spektra molekul, tj. závislosti transmitance na vlnočtu. Toto spektrum poskytuje důležité strukturální informace o biomolekule ve vzorku. Fluorescenční spektrofluorimetrie je typ elektromagnetické spektroskopie, poskytující absorpční a emisní fluorescenční spektra biomolekul.

1.2

Strukturovaný seznam pojmů k samostudiu

Úvod do spektroskopických metod Vlnová povaha elektromagnetického záření Spektroskopie, spektrofotometrie, spektrofotometr, vlnová povaha elektromagnetického záření, vztah mezi energií, vlnovou délkou a frekvencí, rychlost světla, elektromagnetické spektrum a jeho složky, foton, energie fotonu, Planckova konstanta. Interakce mezi zářením a hmotou Transmise a absorpce záření hmotou, elektromagnetické absorpční a emisní spektrum, základní a excitovaný stav atomů, vztah mezi frekvencí (vlnovou délkou) a excitační energií. Spektrometr a spektrofotometr Spektrometr – zdroje záření, monochromátor, kyveta, detektor, Spektrofotometr – intenzita funkcí vlnové délky, jednopaprskové a dvoupaprskové spektrofotometry – princip, dělení dle metod měření, způsobu získání dat, rozlišení intenzity. Absorpční spektroskopie – princip, atomová absorpční spektroskopie, UV-Vis, IR a Mossbauerova spektroskopie, Emisní spektroskopie – princip, fluorescenční, atomová emise, rentgenová fluorescence, Rozptylová spektroskopie – turbidimetrie, nefelometrie, rozptyl polarizovaného světla (cirkulární dichroismus), Ramanova spektroskopie, Resonanční spektroskopie – nukleární magnetická (NMR) a elektronová paramagnetická (spinová) resonanční spektroskopie (EPR, ESR). Princip a aplikace UV-Vis spektrofotometrie Základní principy Excitace biomolekul pohlcením fotonu, valenční elektrony a energetické hladiny, energie pohlceného fotonu, chromofory, auxochromy, mesomerní efekt, nejvyšší obsazený (HOMO) a nejnižší neobsazený (LUMO) molekulový orbital, vazebný a protivazebný molekulový orbital, excitace σ, π a n elektronů. Základní principy funkce UV-Vis spektrofotometru Transmitance (T), absorbance (A), vzorek a reference, optická hustota (OD), Lambert-Beerův zákon, extinkční koeficient, formulace základních závislostí, koncentrační omezení. Konstrukce spektrofotometru a metodologie měření

Jednopaprskový a dvoupaprskový (dual beam) spektrofotometr, zdroj záření – halogenová a deuteriová lampa, monochromátor, difrakční mřížka, detektor – fotodiodový, CCD (charge-coupled device), kyvety – typy a vlastnosti, postup měření – základní zásady Interpretace absorpčních spekter Absorpční/extinkční křivka, absorpční maximum, stanovení extinkčního koeficientu εmax, charakteristická spektra organických látek – R, K, B a E-pásy. Aplikace Strukturní analýza látek, Kvantitativní analýza – standardní koncentrační závislost, Kinetické parametry – rychlost reakcí, Příklady: stanovení obsahu proteinů – Lowryho metoda, Smithova (BCA) metoda, Bradfordova metoda, stanovení aminokyselin ninhydrinem, stanovení celkové DNA diaminobenzoovou kyselinou (DABA), stanovení redukujících cukrů ferricyanidem a fenolem v přítomnosti kyseliny sírové. Princip a aplikace infračervené spektroskopie Základní principy Energie infračerveného záření, vlnočet, blízké, střední a dlouhovlnné infračervené záření, vibrační módy molekul (symetrický a asymetrický stretching), ohybové módy molekul (scissoring, rocking, twisting, wagging), komplexnost vibračně-rotačních spekter, pružinový model a Hookův zákon, energie vibračních a rotačních módů (typ vazby, nasycenost vazby, typy atomů ve vazbě). Konstrukce IR a FTIR spektrometrů a metodologie měření IR spektrometr – zdroj (např. Nernstův filament, SiC), cela (např. NaCl), kolimovaný paprsek, monochromátor, detektor (termocoupler), FTIR (Fourier tansform infrared spectroscopy) – interferometr, interferogram, Fourierova transformace, příprava vzorku – pevný (např. KBr tabletování), plynný (NaCl nebo KBr cela), kapalný – nevodné prostředí (např. chloroform), korekce pozadí (reference). Interpretace IR spekter IR spektrum, maxima absorpce – vlnočet a intenzita, vlivy – čistota vzorku, typ solventu, materiál cely, -1 kalibrace spektrometru, absorpční pásy v IR oblasti – 4000-2500 cm X-H vazba (X = C, N, O, S), -1 -1 2500-1900 cm C≡X vazba (X= C, N), 1900-1500 cm C=X vazba (X = C, N, O), fingerprint oblast (otisku prstu) Aplikace Strukturní analýza molekul, dynamická IR spektrometrie, chemický, potravinářský průmysl, toxikologie. Princip a aplikace spektrofluorimetrie Základní principy Absorpční a emisní spektrum molekul, fluorescenční spektrum, fluorofory, fluorescence, základní a vybuzený stav molekul, zářivý a nezářivý přechod, separace absorpčního a fluorescenčního spektra. Konstrukce spektrofluorimetru a metodologie měření Spektrofluorimetr, zdroj UV záření, monochromátor, kyveta, detektor prošlého záření (fotonásobič), monochromátor pro emitované světlo, detektor (excitační a emisní spektrum). Aplikace Detekce přítomnosti a struktury biomolekul, vazebná kinetika a folding biomolekul (disociační konstanty, 3D struktura proteinů). Příklady – stanovení dsDNA pomocí etidium bromidu a DAPI, stanovení přítomnosti antigenů FITC značenými protilátkami.

1.3

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 I. Němcová a kol.: Spektrometrické analytické metody I. Karolinum Praha 2004. S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

2.

Základy enzymologie a enzymatických stanovení

2.1


Enzymy jsou biologickými katalyzátory, které urychlují konverzi substrátu na produkt v důsledku snížení aktivační energie chemické reakce. Enzymy jsou proteiny či glykoproteiny s aktivními místy, které jsou zodpovědné za katalytickou aktivitu. Jsou kategorizovány dle typu katalyzované reakce. Každý enzym má své unikátní E.C. číslo dle jednotné mezinárodní klasifikace. Funkce enzymu je vyjádřena kinetickými rovnicemi přeměny substrátu na produkt. Typ rovnice je závislý na množství současně zpracovávaných substrátů a způsobu vzniku enzym-substrátového komplexu. Nejjednodušším mechanismem je jednosubstrátová reakční kinetika vyjádřená vztahem MichaelisMentenové. Experimentálně se parametry této rovnice stanovují několika odlišnými způsoby, které však vždy vyjadřují závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu. Funkce enzymů může být ovlivněna inhibitory reversibilním (kompetitivním, nekompetetivním) či ireversibilním mechanismem. Množství enzymů se zpravidla nevyjadřuje koncentrací, ale enzymovou jednotkou či tzv. specifickou aktivitou, popř. jednotkou katal. Enzymy jsou v bioanalytických metodách často využívány ke stanovování koncentrací substrátů, aktivátorů či inhibitorů ve vzorku např. měřením počáteční rychlosti tvorby produktu či spotřeby substrátu. Dle způsobu detekce přítomnosti substrátu/produktu se dělí na metody optické, elektrochemické, radiochemické či kalorimetrické.

2.2


Úvod do problematiky enzymů Nomenklatura a klasifikace enzymů, jednotky enzymů, uplatnění v bioanalytice Princip funkce a definice pojmu enzym, aktivní místo, apoenzym, prostetická skupina (př. FAD, FMN), holoenzym, isoenzym (př. LDH – laktát dehydrogenáza), EC (Enzyme Commission) index (EC w.x.y.z), funkce oxidoreduktáz, transferáz, hydroláz, lyáz, isomeráz a ligáz (syntetáz), enzymová jednotka (I.U.) – definice, základní vztahy, rychlost obrátky enzymu, specifická aktivita – definice, jednotka S.I. – katal – definice, význam, enzymy v bioanalytice – stanovení koncentrace substrátů, aktivátorů a inhibitorů (př. Glukóza-oxidáza (GOx), křenová peroxidáza (HRP)). Základy enzymové kinetiky Komplex enzym-substrát (ES), aktivační energie a profil volné energie katalyzovaných reakcí, Jednoduchá jednosubstrátová enzymová kinetika – rovnice, závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu - lineární oblast (kinetika prvního řádu), saturace substrátem (kinetika nultého řádu), rovnice a konstanta (Km) Michaelis-Mentenové, disociační konstanta ES komplexu, experimentální stanovení parametrů rovnice – Eadie-Hofstedova, Hanesova a Lineweaver-Burkova metoda, kinetika jednosubstrátové dvouproduktové reakce, kinetika dvousubstrátových reakcí, ternární komplex, ping-pong mechanismus, příklady (GOx, LDH, pyruvát dehydrogenáza) Aktivátory a inhibitory enzymů Definice aktivátoru enzymatické reakce, příklady, definice enzymového inhibitoru, komplex enzyminhibitor (EI), reverzibilní a ireverzibilní inhibice – projev, příklady (inhibitory AChE), reverzibilní kompetitivní a nekompetitivní inhibice – rovnice, konstanty. Metody detekce enzymové aktivity a přítomnosti substrátů a inhibitorů Základní principy enzymatických stanovení Detekční limit, citlivost, kalibrační křivka v kvantitativní eseji, stanovení úbytku substrátu (př. stanovení močoviny) či tvorbou produktu (př. koenzym A (CoA)), přímá stanovení, nepřímá stanovení indikátory (př. dehydrogenázy, peroxidázy), rozdělení metod – časově konstantní (end-point eseje) a kinetická měření. Instrumentální metody enzymatických stanovení

Optické metody – absorbance (př. alkalická fosfatáza), fluorescence (fluorescenční barviva, zhášení fluorescence, př. stanovení proteázové aktivity), luminiscence (podstata bioluminiscence, luminolperoxidázový systém, luciferáza), nefelometrie, Elektrochemické metody – amperometrie (stanovení H2O2, ferrikyanidu, chinonů, aktivita oxidáz a dehydrogenáz), potenciometrie (stanovení změn pH, NH3 a CO2, iontově selektivní elektrody), konduktometrie (stanovení aktivity ureázy), Ostatní metody – radiochemické (radioaktivní prvky, př. GTP esej), manometrické (stanovení plynů, př. NH3 a CO2), kalorimetrické (isotermální titrační kalorimetrie (ITC), stanovení zdánlivé molární entalpie, endo- a exotermické reakce, př. HIV-1 proteáza, ureáza, trypsin), ultra-high-throughput eseje (HTA). 2.3

Příklad kontrolních otázek/úkolů 1. Enzym má molekulární váhu 47 kDa a je připraven v 100% čistotě ve fosfátovém pufru o specifické aktivitě 700 I.U./mg při 25°C a pH 7.5. Jedná se o monomerní enzym (jedno aktivní místo na jednu molekulu enzymu) a. Vypočítejte množství roztoku enzymu ve 100ml pufru saturovaného substrátem tak, aby se vytvořil roztok, který bude spotřebovávat substrát s počáteční rychlostí 5×10-7 M/min. b. Vypočítejte kcat enzymu 2. Enzym konvertuje substrát S na produkt P dle schématu jednoduché jednosubstrátové reakce s kinetikou dle Michaelis-Mentenové. V průběhu experimentu byly získány následující data: [S] (mM) Počáteční rychlost (mmol/min)

4,000 0,648

1,336 0,488

0,800 0,418

0,568 0,353

0,448 0,310

0,368 0,275

Využitím postupu dle Eadie-Hofsteeda spočítejte hodnoty Km a Vmax a kcat pro tento enzym. 3.

2.4

Pro který z typů substrátových esejí: (i) kinetický nebo (ii) end-point esej je nutné udržovat koncentraci substrátu pod hodnotou Km patřičného enzymu?

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. N. C. Price and L. Stevens, Fundamentals of Enzymology, 2nd ed., Oxford Science Publishers, London, 1989. P. Skládal: Biosensory, PřF MU, 2002. R. A. Copeland, Enzymes, 2nd ed., Wiley-VCH, New York, 2000. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

3.

Struktura a funkce protilátek, imunoaglutinační testy

3.1


Protilátky jsou glykoproteiny s molekulovou hmotností 150 kDa, se dvěma specifickými vazebnými místy pro molekulu antigenní povahy. Vznikají v průběhu imunitní odpovědi na imunogenní látku, tj. cizorodou látku s velikostí nad 1 kDa. Jako antigen se označují látky, schopné se vázat na složky

imunitního systému, jako jsou protilátky (humorální imunita), či lymfocyty (buněčná imunita). Hapteny jsou nízkomolekulární látky, neschopné ve volném stavu vyvolat imunitní odpověď. Protilátky proti haptenům se připravují jejich konjugací na nosičové molekuly. Protilátky se skládají ze dvou typů řetězců a z tzv. vazebného Fab fragmentu a Fc fragmentu. Existuje více typů protilátek (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD). Vazebné místo na antigenu se nazývá epitop, na protilátce paratop. Antigeny mohou mít na svém povrchu jeden nebo více stejných či odlišných epitopů. Nejběžnějším typem protilátek jsou tzv, polyklonální protilátky. Monoklonální protilátky jsou připraveny fúzí lymfocytů a nádorových plasmatických buněk. Vzniklé tzv. hybridní buněčné linie produkují pouze jeden typ specifických protilátek (rozpoznávají pouze jeden typ epitopu). Interakce protilátek s antigeny je primárního, popř. sekundárního (aglutinace, precipitace) typu. Hapteny poskytují pouze primární reakce. Asociační konstanta vazebné interakce protilátka-antigen je vyjádřena tzv. afinitou. Afinita protilátek je výrazně ovlivněna fyzikálně-chemickými vlastnostmi prostředí (pH, iontová síla, denaturační činidla). Nejjednodušší bioanalytická stanovení s protilátkami využívají princip aglutinace a precipitace. Aglutinační test slouží ke stanovení množství specifických protilátek v séru (titr), popř. ke stanovení krevních skupin. Precipitační testy slouží ke kvalitativnímu průkazu přítomnosti specifických protilátek v séru. Zpravidla jsou založeny na difůzi antigenu a séra v tenké vrstvě agaru a vzniku precipitačních zón. 3.2


Strukturní a funkční vlastnosti protilátek Molekulární struktura protilátek (lehký a těžký řetězec, Fab fragment, Fc fragment), typy imunoglobulinů a jejich funkce (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD), imunogen a vyvolání imunitní odpovědi, aktivace lymfocytů, antigeny, humorální a buněčná imunita, hapteny, sérum a antisérum, epitop a paratop, kategorie antigenů (determinace/valence), typy vazebných sil. Polyklonální a monoklonální protilátky Polyklonální protilátky (sérum, způsob přípravy, imunizace, vazba haptenů na nosiče, křížové reakce, interference), Monoklonální protilátky (způsob přípravy, tvorba hybridomů, selekce specifických hybridních buněk, výhody/nevýhody vzhledem k polyklonálním protilátkám). Interakce protilátek s antigeny Primární a sekundární vazebné Ab-Ag interakce, aglutinace, precipitace, afinita protilátek (rovnice, výpočet), afinita a vliv vlastností prostředí (pH, iontová síla, chaotropní látky, denaturační činidla), experimentální stanovení afinity protilátek (Scatchardův diagram). Principy analytických aplikací protilátek Aglutinace – princip (multivalentni antigen), princip aglutinačního testu (prozóna, aglutinační zóna, titr séra, význam a interpretace testu), stanovení krevních skupin, precipitační reakce (princip, odlišnosti od aglutinace, zóna ekvivalence, kvalitativní test zdvojenou difůzí, identifikace antigenu), princip kruhového imunodifúzního testu (SRID).

3.3

Příklad kontrolních otázek/úkolů 1. Byly připraveny dvě šarže polyklonálních protilátek. Obě šarže byly testovány aglutinačním testem pro stanovení jejich koncentrace. Šarže A vykázala titr 1:1024, šarže B titr 1:128. Která z šarží obsahuje více specifických protilátek? 2. Vysvětlete, proč Scatchardův diagram vykazuje lineární závislost pro monoklonální protilátky a nelineární závislost pro polyklonální protilátky.

3.4

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. P. Skládal: Biosensory, PřF MU, 2002. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

4.

Principy imunochemických metod

4.1


Kvantitativní imunochemická stanovení (imunoeseje) představují velmi rozsáhlou škálu bioanalytických metod, využívajících protilátky ke specifické vazbě a kvantitativnímu stanovení stopových množství nízko i vysokomolekulárních látek v komplexních biochemických médiích. Tyto metody využívají primární vazebné reakce mezi protilátkou a ligandem (antigenem). Sekundární vazebné reakce jsou potlačeny. Informace o vazbě je zprostředkována pomocí značek. Klasifikace metod je založena na faktu, zda (i) je před vlastním měřením přítomnosti značky provést separaci (heterogenní esej), či nikoliv (homogenní), (ii) zda je značena protilátka či antigen a (iii) dle typu značky, která je využita. Značení IgG/antigenů je umožněno kovalentní vazbou zesíťovacími činidly. Značky mohou být povahou fluorescenční, bioluminiscenční, radioaktivní, enzymové. Nejznámější a patrně nejrozšířenější metodou je tzv. ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay) využívající enzymatických značek jako jsou křenová peroxidáza (HRP) či alkalická fosfatáza (AP). Ta je prováděná běžně v mikrotitračních polystyrenových 96 jamkových destičkách. Rozšířené a citlivé jsou v současné době i imunostanovení založené na fluorescenčních značkách. 4.2


Kvantitativní imunoanalýza se značkou Kvantitativní imunoanalýza – základní princip, ligand, analyt, primární interakce, základní klasifikace (homogenní nebo heterogenní, typ značení (IgG, antigen), typ značky), ideální vlastnosti značek, typy značek dle povahy (fluorofory, chemiluminiscenční značky, enzymy, kofaktory, sekundární značky (např. biotin), elektroaktivní značky, nanočástice), značení protilátek/antigenů – homo(hetero)bifunkční zesíťovací činidla (př. NHS ester, maleimid, aldehyd, thiokyanát, a isothiokyanátové funkční skupiny, značení IgG periodátovým mechanismem, přečištění), modifikace haptenů (modifikace hydroxylů, aminoskupin, karboxyskupin, thiolů). Heterogenní imunoanalýza Imobilizace IgG na povrchu nosiče (latexové mikročástice, mikrotitrační destičky z polystyrenu, magnetické nanočástice atd.), separace navázaných Ab:Ag párů, metody založené na značení protilátek (primární a sekundární protilátky, sendvičový esej), metody založené na značení ligandů (kompetitivní provedení, vysoká citlivost), radioimunoanalýza (RIA, princip, omezení, příklady), fluorescenční imunoanalýza – typy fluoroforů (např. fluorescein, rhodamin, fykobiliproteiny), nepřímá, kompetetivní a sendvičová fluorescenční analýza (princip), FRET imunoanalýza (princip, př. sendvič IgG-fykoerytrin, IgG-fluorescein), časově rozlišená fluorescenční imunoanalýza (princip, výhody, příklad), chemiluminiscenční metody (princip, př. luminol), enzymatické metody (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay, kompetitivní, přímá), typy enzymů (př. křenová peroxidáza (HRP), alkalická fosfatáza (AP), β-galaktosidáza). Homogenní imunoanalýza

Definice homogenní imunoanalýzy (princip, výhody), fluorescenční metody (zesílená fluorescence, přímé zhášení fluorescence, nepřímé zhášení fluorescence, fluorescenční polarizační imunoesej (FPIA), FRET imunoesej), enzymové metody (enzymově zesílená imunoesej (EMIT), apoenzym reaktivační imunoesej (ARIS)). Validace imunochemických stanovení Vliv matrix (složky), standardy (eliminace vlivu matrix), kontrolní experimenty (vliv nespecifické interakce/vazby), standardní křivky (sigmoidní křivky vazba/log koncentrace), detekční limit, přesnost (reálné vzorky), křížová reaktivita (definice), selektivita protilátek, nespecifické interference, blokační činidla. 4.3

Příklad kontrolních otázek/úkolů 1. Která z komponent v heterogenní kompetitivní ligand - značené imunoanalýze je: (a) vázána na pevný povrch, (b) přítomna v omezené koncentraci, (c) přítomna v nadbytku?

4.4

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. Bruce A. a kol.: Základy buněčné biologie - Úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing, Ústí nad Labem, 2001. Šifner, F.: Vybrané kapitoly z biotechnologií, UK Praha, 1998. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

5.

Principy elektroforetických metod – elektroforéza proteinů a DNA, isoelektrická fokusace, kapilární elektroforéza

5.1


Elektroforéza je bioanalytická metoda využívaná v základním výzkumu a diagnostice biomolekul. Principielně je založena na separaci nabitých makromolekul v elektrickém poli. Elektroforetická mobilita biomolekul závisí na řadě faktorů, zejména pak na celkovém náboji, molekulární váze a jejich tercierní či kvarterní struktuře (tj. tvaru). Jelikož naprostá většina biopolymerů, jako jsou nukleové kyseliny, proteiny či glykoproteiny jsou nositelem náboje, je možné je separovat a kvantifikovat elektroforetickými metodami. Existuje řada typů elektroforetických postupů, v základě je možné je kategorizovat na tzv. hraniční, zonální a rovnovážnou elektroforézu dle principu migrace biomolekul v elektrickém poli. Separace v zonální elektroforéze zpravidla využívá nosné médium, jako je celulóza, škrobový gel, polyakrylamidový gel (PAGE) či agaróza, které mohou fungovat jako molekulární síta a napomáhat efektivnímu rozdělení makromolekul. Výsledkem separace makromolekul v gelu je typický pattern oddělených zón, které se mohou nespecificky či specificky zvýraznit využitím řady postupů. Přítomnost konkrétní zóny pak slouží k identifikaci či kvantifikaci konkrétní molekuly, popř. stanovení její molekulové hmotnosti/náboje. Nejrozšířenějším typem elektroforéz je pravděpodobně PAGE a agarózová elektroforéza, které se využívají v celé řadě specializovaných bioanalytických stanovení v klinické či forenzní medicíně, např. v diagnostice vrozených genetických vad, při identifikaci DNA, sekvencování DNA atd. Rovnovážná elektroforéza je nejčastěji reprezentována tzv. isoelektrickou fokusací (IEF), která umožňuje separovat makromolekuly v elektrickém poli dle hodnoty jejich isoelektrického bodu. Výhody této metody se často kombinují s denaturační PAGE elektroforézou

v tzv. dvojdimenzionální (2D) elektroforéze. Řada moderních separačních metod biomolekul je založena na separaci látek v elektrickém poli procházejícím tenkou kapilárou. V závislosti na principu transportu látek kapilárou je možné je dělit na tzv. kapilární elektroforézu (CE), využívající elektroosmotických jevů vznikajících v důsledku náboje vnitřní strany kapiláry a na tzv. kapilární zónovou elektroforézu (CZE) a kapilární isoelektrickou fokusaci (CIEF), které naopak elektroosmotický jev potlačují. Všechny tyto metody jsou zpravidla kombinovány s vysoce citlivými detekčními mechanismy, jako jsou laserem indukovaná fluorescence, hmotnostní spektrometrie či amperometrie a umožňují dělit velmi malé objemy (řádově µL-pL) vzorku. 5.2


Základní principy elektroforézy Princip elektroforézy Separační techniky, elektrické pole (formulace), mobilita, anoda, katoda, nosné médium, elektroforéza vs. elektrolýza, princip elektroforetické migrace (model, rovnice, interpretace, vliv pH, iontové síly, složení roztoku), základní rozdělení – hraniční elektroforéza, zonální elektroforéza, rovnovážná elektroforéza. Elektroforetická nosná média Papír (celulóza, popř. acetát celulózy, princip, uplatnění, výhody/nevýhody, 2D elektroforéza, separace aminokyselin, nukleotidů), škrobový gel (příprava, vlastnosti – molekulární síto, elektroforetické/chromatografické dělení, elektroosmóza – charakterizace modrým dextranem), polyakrylamidová elektroforéza (PAGE, příprava, molekulární síto, velikosti pórů vs. koncentrace, uspořádání – válcová, desková (vertikální), vzorkové jamky, nanesení vzorků, barevné značky, podmínky rozdělení – pH, napětí, fixace proteinů po rozdělení, vizualizace – barvení gelu, disková elektroforéza – princip, výhody, využití, určení molekulové váhy vzorku, denaturační SDS-PAGE – princip, výhody, použití), agarózová elektroforéza (struktura a vlastnosti gelu, velikost pórů, vertikální vs. horizontální uspořádání, elektroosmotický jev a jeho eliminace, aplikace v separaci DNA) Vliv experimentálních podmínek na elektroforetickou separaci Teplota (zahřívání gelu Joulovým teplem, chlazení gelu, vliv na separaci), pH (vliv na separaci DNA a proteinů, isoelektrický bod pI, optimální pH), iontová síla (vliv na separaci, optimální složení pufrů), elektrické pole (konstantní pole, gradientové pole – příprava gelu, vlastnosti, výhody). Detekce proteinů a nukleových kyselin po elektroforetické separaci Barviva a značení (mechanismy, příklady – silver staining, EtBr, Coomasie Brilliant Blue, značení enzymů reakcí se substrátem), Southern Blot (přenos DNA, princip, instrumentace), Northern Blot (přenos RNA, princip, instrumentace), Western Blot (přenos proteinů, princip, instrumentace), značení DNA hybridizací s DNA sondou (princip hybridizace, vznik heteroduplexu, stabilita, melting point Tm, značení sond - fluorofor, radioaktiní atom, biotin, instrumentace, využití) Aplikace zonální elektroforézy v bioanalytice Determinace náboje a molekulární váhy proteinů (Rf faktor, proteinový marker, Fergusonův diagram, KD faktor, kalibrační křivka KD/MW), Determinace a určení MW podjednotek proteinových komplexů (SDS-PAGE elektroforéza, princip, vyhodnocení mobility/MW), stanovení MW DNA agarózovou elektroforézou (limitace, lineární/cirkulární DNA), identifikace isoenzymů (definice isoenzymu, způsob separace, mechanismus identifikace), diagnostika vrozených genetických poruch (restrikční endonukleázy, princip metody, př. diagnostika vrozené anémie), DNA fingerprinting a polymorfismus délky restrikčních fragmentů (klinická a forenzní diagnostika, RFLP – princip, restrikce, Southern Blot, specifické značení DNA sondou, využití), DNA sekvencování (dideoxymetoda, Maxam-Gilbertova metoda, princip), imunoelektroforéza (imunobloting – princip, Western blot, detekce polyklonálními a monoklonálními protilátkami, kvalitativní stanovení, raketová elektroforéza – kvantitativní stanovení proteinů). Isoelektrická fokusace (IEF)

Amfolyty (definice, vlastnosti, isoelektrický bod pI, typy molekul), koncept isoelektrické fokusace (IEF, princip, statický a kontinuální gradient pH), nosné amfolyty (amfoterní vlastnosti, pufrační schopnost/nositel náboje, př. oligo(poly)aminy), praktické provedení IEF (vertikální PAGE, anodický a katodický pufr, stabilizace nosného amfolytu, nanesení a fokusace vzorku), využití (separace proteinů, výhody a omezení, př. separace hemoglobinů), imobilizované pH gradienty (IPGs, princip, příprava gelů, výhody a omezení), 2D elektroforéza (princip, postup – IEF, navazující SDS-PAGE, výhody a omezení). Kapilární elektroforéza (CE) Kapilára a elektroosmotický jev, kapilární elektroforéza (CE), kapilární zónová elektroforéza (CZE), elektroosmóza (princip, zéta potenciál, elektroosmotický tok, vliv pH, modifikace kapilár), hydrodynamické a elektrokinetické vpravení vzorku, detektory CE (základní typy – laserem indukovaná fluorescence, hmotnostní spektrometrie, amperometrická detekce, radiochemické metody), kapilární polyakrylamidová gelová elektroforéza (C-PAGE, potlačení elektroosmózy, separace molekulárním sítem, aplikace v DNA sekvencování dideoxy metodou), kapilární isoelektrická fokusace (CIEF, potlačení elektroosmózy chemickou modifikací kapilár). 5.3

Příklad kontrolních otázek/úkolů 1. Směs proteinů – cytochromu c a myoglobinu – je rozdělována polyakrylamidovou elektroforézou. Jejich hodnoty izoelektrického bodu (pI) jsou 9.6 a 7.2 a molekulové váhy 11.7 a 17.2 kDa. Ve kterém směru budou proteiny migrovat v elektrickém poli během separace (k anodě či katodě) při (a) pH 6.0 a (b) pH 8.5? 2. Které z typů značení DNA sond – ethidium bromidem či biotinem (skrze avidin-enzymový konjugát) – poskytne údaj o pozici všech elektroforeticky rozdělených fragmentů DNA na gelu? Které z typů značení poskytne informace pouze o pozici fragmentu se specifickou sekvencí? 3. Standardní a neznámé proteiny byly podrobeny SDS-PAGE elektroforéze. Na základě tabulky odhadněte molekulovou váhu neznámého proteinu.

Protein Aldoláza

158

Migrační vzdálenost 3.56

Kataláza

210

3.23

Ferritin

440

2.86

Thyroglobulin

669

2.51

?

3.03

Neznámý protein

MW (KDa)

4. Neznámý, vysoce přečištěný protein je podroben SDS-PAGE elektroforéze. Výsledkem jsou dva pásy odpovídající molekulové váze 50 a 70 KDa. Po obarvení a změření intenzit pásů bylo zjištěno, že 75 kDa pás poskytuje dvakrát větší plochu než 50 kDa pás. Jaký závěr je možné učinit o struktuře původního proteinu? 5. Z jakého důvodu je isoelektrická fokusace vhodná metoda pro separaci proteinů a glykoproteinů, ale nikoliv nukleových kyselin? Co by se stalo s DNA a RNA přítomnými ve směsi s proteiny podrobené IEF v rozsahu pH 6-8? 6. Z jakého důvodu je nutné při 2D elektroforéze směsi proteinů provést nejdříve isoelektrickou fokusaci a pak SDS-PAGE a ne naopak? 5.4

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001

Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. Bruce A. a kol.: Základy buněčné biologie - Úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing, Ústí nad Labem, 2001. Rosypal a kol. Úvod do molekulární biologie, vydavatelství MU, Brno, 1997 R. Westermeier, Electrophoresis in Practice, Wiley-VCH, New York, 2001. Šifner, F.: Vybrané kapitoly z biotechnologií, UK Praha, 1998. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

6.

Centrifugační metody v bioanalytice

6.1


Centrifugační metody jsou jednou z nejčastějších metod separace a analýzy částic biologické povahy. Na rozdíl od řady dalších umožňují tyto metody provádět separace široké škály velikostí částic od celých buněk, organel, fragmentů buněčných membrán až po izolované proteiny a nukleové kyseliny. Princip spočívá v sedimentaci částic v odstředivém poli. Rychlost sedimentace a konečný rovnovážný stav je ovlivněn řadou faktorů, jako je velikost částic, velikost odstředivé síly, viskozita roztoku, hustota částic aj. Tyto vlivy je možné částečně popsat Stokesovým zákonem a Svedbergovou rovnicí. Existuje několik typů centrifugačních technik, které se liší použitým rotorem (úhlový, výkyvný, vertikální), hustotním profilem roztoku (konstantní, gradientový) a způsobem separace látek (diferenciální, izopyknická a zonální). Z hlediska využití jsou pak tyto metody využívány jako tzv. preparativní, popř. analytické.

6.2


Základní principy centrifugačních metod Sedimentace, síly působící na částici v kapalině (gravitační pole, třecí síly, zpětná difůze), síly působící při centrifugaci, Stokesův zákon a rychlost sedimentace (vliv přetížení, viskozity, hustoty kapaliny a částice), definice RCF faktoru (relative centrifugal force), rpm (revolutions per minute), centrifugační síly ve výkyvných, úhlových a vertikálních rotorech (výhody, nevýhody, uplatnění v jednotlivých centrifugačních technikách), clearing faktor (k), densní gradienty (princip, výhody, materiály k tvorbě gradientů – potřebné vlastnosti, př. cukry, Ficoll, CsCl, koloidní částice, způsoby přípravy – vrstvy a lineární gradient, redistribuce v průběhu centrifugace). Typy centrifugačních metod a instrumentace Základní dělení metod (preparativní a analytická centrifugace), diferenciální centrifugace (separace subcelulárních komponent, výhody/nevýhody), zonální centrifugace (gradientová densní centrifugace, sedimentační koeficienty, separace proteinů, nukleoproteinů), isopyknická centrifugace (densní CsCl gradient, isopyknický bod, separace biomolekul v zónách, separace DNA a RNA, proteiny a glykoproteiny), analytická ultracentrifugace (nativní podmínky, určení velikosti molekul, sedimentační koeficienty, separace proteinů, DNA, virů, subcelulárních struktur), konstrukce analytické ultracentrifugy (UV-Vis detekce, zdroj, detektor), sedimentační koeficient, Svedbergova rovnice a konstanta. 6.3

Příklad kontrolních otázek/úkolů

1. Protein se během 4 hodinové centrifugace posunul z pozice 7.5 cm od osy rotace na vzdálenost 9.8 cm při 40 000 rpm. Vypočítejte hodnotu jeho sedimentačního koeficientu ve Svedbergových jednotkách. 2. Spočítejte maximální RCF (RCFmax) a minimální RCF (RCFmin) a průměrnou hodnotu RFC (RFCav) pro centrifugační zkumavku s meniskem 12 cm vzdáleným od osy rotace a dnem vzdáleným 22 cm od osy rotace. Rotor se točí rychlostí 27 000 rpm. Bude v případě poloviční rychlosti rotoru poloviční také hodnota RCF? 6.4

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. Bruce A. a kol.: Základy buněčné biologie - Úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing, Ústí nad Labem, 2001. Rosypal a kol. Úvod do molekulární biologie, vydavatelství MU, Brno, 1997 A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

7.

Chromatografické metody v bioanalytice

7.1


Chromatografické metody jsou využívány k separaci směsí komponent přítomných v tzv. mobilní fázi na základě jejich rozdílných interakcí se stacionární fází. Silnější interakce poskytuje delší retenční čas, který je definován jako čas, nutný k průchodu komponenty od aplikace vzorku do jeho odtoku z chromatografické kolony, tzv. eluce. Existuje řada chromatografických technik, lišících se typem mobilní fáze, stacionární fáze či mechanismem interakce mezi dělenou látkou a stacionární fází. V bioanalytických metodách se v největší míře využívají techniky s kapalnou mobilní fází, tzv. kapalinová chromatografie (LC). Nejběžnější způsob jejího využití spočívá ve speciální koloně naplněné granulovanou stacionární fází, kolem níž protéká fáze mobilní. Hnací silou průtoku je pak buď gravitace, nebo velmi často vysokotlaké vstřikování mobilní fáze (HPLC – high performance liquid chromatogramy). Dle interakce dělená látka-stacionární fáze se pak rozlišuje např. gelová permeační chromatografie (dělení molekulárním sítem), adsorpční chromatografie (adsorpce látek na sorbentu), afinitní chromatografie (specifické interakce ligandů) či ionexová (iontoměničová) chromatografie. Nejčastější využití v bioanalytice pak nachází tyto metody při separaci a charakterizaci proteinů či vysokomolekulárních látek ve směsích a při jejich charakterizaci, jako je např. odhad molekulové váhy či asociační konstanty specifické vazby k ligandu. 7.2


Principy a teorie chromatografického dělení molekul Princip chromatografických metod, mobilní fáze, stacionární fáze, kapalinová vs. plynová chromatografie, vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC - high performance liquid chromatografy, princip, instrumentace), teorie (lineární a objemová rychlost toku, retenční čas, relativní retence, kapacitní faktor, rozdělovací koeficient, eluent, teoretické patro, rozlišení), hlavní typy chromatografických metod dle stacionární fáze (na tenké vrstvě TLC, kolonová), mobilní fáze (plynová GC, kapalinová LC), mechanismu (gelová, ionexová, afinitní, adsorpční), chromatografie s normální (hydrofobní mobilní fáze, hydrofilní stacionární fáze) a obrácenou fází (RP-LC, hydrofilní mobilní fáze, hydrofobní povrch stacionární) Gelová permeační chromatografie

Stacionární fáze (vlastnosti, molekulární síto), separace látek v gelu - rychlost eluce vs. MW molekul, eluční objem, mrtvý objem, partiční (rozdělovací) koeficient, retenční koeficient, vliv tvaru molekul, gyrační poloměr molekuly (Rg), vliv elektrostatických interakcí (Donnanův potenciál, iontová síla), vliv nespecifických absorpcí, rozlišení (vliv difúzního koeficientu, rychlosti toku, velikosti částic, teploty, délka kolony, složení mobilní fáze), vlastnosti gelové matrice (hydrofilní materiál, př. dextran, agaróza, TM TM TM polyakrylamid, aerogely, xerogely, komerční materiály – Sephadex , Sephacryl , Sepharose ). Afinitní chromatografie Princip afinitní chromatografie, afinitní ligand (specifická vazba, typy afinitních ligandů – striktně či skupinově specifické), pracovní cyklus (vazba, promytí, eluce, regenerace kolony), vysoce účinná afinitní chromatografie (high-performance affinity chromatogramy HPAC, instrumentace), vlastnosti stacionární fáze, imobilizace afinitního ligandu (kovalentní vazba, metody vazby, požadavek spaceru,orientace ligandu, hustota aktivních míst), metody eluce (kompetiční eluce nízkomolekulární látkou, nespecifická eluce – změna pH, denaturace, iontová síla, chaotropní látky), stanovení asociačních konstant metodou HPAC. Ionexová chromatografie Princip iontoměničové chromatografie, aniont-ionexové a kationt-ionexové stacionární fáze, vliv pH a iontové síly na dělení nabitých molekul, koeficient selektivity (rovnovážně-termodynamický model pro malé ionty), instrumentace.

7.3

Příklad kontrolních otázek/úkolů 1. Směs dvou proteinů byla dělena gelovou permeační chromatografií při pH 7.1 v 0.05M fosfátovém pufru využitím pevné fáze Sephadex G-100. Nezadržené složky roztoku byly vyplaveny společně s modrým dextranem za 2.6 min., protein X a Y za 6.7 a 9.1 min. a. Vypočítejte relativní retenci α obou proteinů b. Který z proteinů měl vyšší molekulovou váhu? 2. Popište postup, kterým by bylo možné získat čistý preparát dehydrogenázy z roztoku ve směsi s řadou proteinů s podobnou molekulovou váhou. (nápověda: použijte postup z více chromatografických dělících kroků)

7.4

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. Bruce A. a kol.: Základy buněčné biologie - Úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing, Ústí nad Labem, 2001. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

8.

Hmotnostní spektrometrie biomolekul

8.1


Hmotnostní spektrometrie je v současné době jednou z široce rozšířených metod kvalitativní analýzy neznámých molekul se zvláštním zřetelem na identifikaci a charakterizaci makromolekul biologické povahy. Tyto metody jsou založené na principu tzv. měkké ionizace biologických vzorků, která poskytuje nabité ionty biomolekul v plynné fázi, které mohou být rozděleny a charakterizovány

elektrickým/magnetickým polem dle svého náboje a molekulové hmotnosti. Změnou elektrického napětí či magnetického pole v tzv. hmotnostním analyzátoru je možné dosáhnout proměření tzv. m/z spekter, tedy závislosti intenzity signálu poskytnutým dopadem nabité částice na detektor na poměru její molekulové váhy a náboje. Každé toto spektrum je unikátní pro analyzovanou molekulu a může tak být využito nejen k výpočtu její molekulové hmotnosti, ale i do jisté míry i k identifikaci. Tohoto faktu se využívá v řadě bioanalytických technik, zejména pak k identifikaci či sekvenaci a určení MW neznámých proteinů či peptidů. Existuje řada MS technik, které se liší typem ionizace, hmotnostního analyzátoru či detektoru. Nejčastějším uspořádáním zdroje iontů využívaným v biologii je zejména ionizace elektrosprejem (ESI) a ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI) v kombinaci s analyzátorem doby letu (TOF). Tyto metody jsou k biologickému vzorku šetrné a umožňují analyzovat až 300 kDa veliké proteiny. Často jsou kombinovány s chromatografickým předčištěním vzorku, například pomocí HPLC. 8.2


Úvod do teorie hmotnostní spektrometrie molekul Hmotnostní spektrometrie a kvalitativní analýza, ionizace vzorku, měkká ionizace v tzv. single focusing hmotnostních spektrometrech (princip ionizace, urychlení iontů, kinetická energie generovaných iontů, hmotnostní analyzátor – magnet, odstředivá a magnetická síla, detektor), m/z hodnota (výpočet a interpretace), způsob detekce různých m/z (skenování s proměnným magnetickým polem či urychlovacím napětím), aplikace v biologii – stanovení MW biopolymerů, posttranslační modifikace, mutace a polymorfismus DNA atd. Instrumentace Měkké ionizační metody Ionizace elektronovým svazkem (nevýhody, vznik mnoha fragmentů), Fast Atom/Ion Bombardment (FAB, vzorek v matrix, Xe, Cs+ popř. glycerol-NH4+ bombardment, mechanismus ionizace, výhody/nevýhody), Electrospray Ionization (ESI, princip elektrorozprašování, mechanismus vzniku nabitých makromolekul, výhody/nevýhody), Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI, matrix/vzorek – přiklad matrix, vaporizace laserem,výhody/nevýhody) Hmotnostní analyzátor Rozlišení a rozlišovací schopnost analyzátoru (pojem, definice), magnetický analyzátor, elektrostatický analyzátor (princip, využití), kvadrupólový analyzátor (instrumentace, princip), time-of-flight analyzátor (TOF, princip, instrumentace, výhody/nevýhody, kombinace s MALDI ionizací), quadrupólová iontová past (QIT, princip), kombinace detektorů a separačních metod (např. HPLC-MS, GC-MS atd.), detektory (elektronový násobič – dynody a princip zesílení signálu, scintilační detektory – dynody a princip zesílení signálu fotonásobičem) Interpretace a aplikace MS v bioanalytice Interpretace dat m/z spektru malých molekul (izotopický pík, nominální, monoizotopická a průměrná molekulová váha), m/z spektrum biomolekul (vícenásobně nabité iontové rodiny, kalibrace – př. lysozym, cytochrom c, hovězí trypsin atd.), Aplikace MS v bioanalytice Stanovení molekulové váhy biomolekul (ESI ionizace – nefragmentované ionty, více m/z píků téže molekuly, přesný výpočet MW), identifikace proteinů (přečištěný protein, enzymatické štěpení, MS otisk prstu (fingerprint), databáze), sekvenace proteinů/peptidů (purifikace proteinu 2D PAGE, štěpení proteázou, ESI ionizace, selekce fragmetu a CID fragmentace, určení m/z spekter a databáze, limitace), aplikace v analýze nukleových kyselin (omezení aplikace MS – příčiny, nutnost PCR amplifikace, detekce mononukleotidového polymorfismu (SNP)), identifikace bakterií MS (instrumentace, aplikace MALDI-TOF a interpretace spekter, praktická omezení).

8.3

Literatura

B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

9.

Základy molekulárně-biologických nukleových kyselin

9.1


metod

izolace

a

modifikace

Řada bioanalytických metod, které se zabývají analýzou charakteristických vlastností nukleových kyselin, je prováděna v návaznosti na izolaci, přečištění či enzymatickou úpravu DNA z organismu. Existuje řada metod izolace DNA či RNA z buněk, jednou z nejběžnějších je však izolace srážením z roztoku buněčného homogenátu fenol-chloroformem. V současné době je na trhu dostatek nejrůznějších kitů, které umožňují s dostatečnou čistotou a v krátkém čase izolovat nukleové kyseliny z různých typů vzorků. Izolovaná DNA je následně často podrobena specifickému štěpení pomocí restrikčních endonukleáz, poskytující směs fragmentů o různé délce. Tyto fragmenty pak mohou být využity v řadě navazujících technik, např. separovány a identifikovány elektroforézou a hybridizací s fluorescenčně značenou sondou, sekvenovány, vloženy do specifických DNA vektorů atd. Cílem této kapitoly je seznámit studenta se základními postupy izolace, separace, charakterizace a enzymatické úpravy nukleových kyselin, které se dále využívají v navazujících technikách. 9.2


Izolace, přečištění a charakterizace nukleových kyselin Rozrušení buněčných struktur (enzymy, detergenty – příklady), fenolová extrakce (princip, postup), separace centrifugací, srážení etanolem (princip, postup), štěpení nukleázami, alternativní postupy (chromatografie, komerční kity), spektroskopické a fluorescenční metody stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin (princip, postup), elektroforéza nukleových kyselin (specifické podmínky, pufry, barviva, instrumentace) Enzymatické úpravy nukleových kyselin Dělení funkce enzymů (substrátová specifita, typ reakcí – polymerázy, fosfatázy, kinázy, metylázy, ligázy, nukleázy), funkce běžně in vitro využívaných enzymů (DNA-polymeráza I, Klenowův fragment DNA-polI, terminální deoxyribonukleotidyltransferáza, reverzní transkriptáza, T4-polynukleotidkináza, T4-DNA-ligáza, Exonukleáza III, Nukleáza S1, DNAáza I, RNAáza), restrikční endonukleázy (princip štěpení, charakteristika restrikčních míst, restrikční fragmenty, tupé a kohezní konce, citlivost k metylaci bazí, nejběžnější restriktázy) Sekvencování DNA Princip a příprava materiálu k sekvencování, chemické (Maxamovo-Gilbertovo) sekvencování (obecný postup – příprava fragmentů DNA, chemické štěpení, dělení fragmentů PAGE, autoradiografická detekce), enzymatické (Sangerovo) sekvencování (postup – izolace DNA, replikace DNAP, PAGE a autoradiografie, variace – klonování a sekvencování ve vektoru), moderní přístupy v enzymatickém sekvencování (automatický proces, asymetrická PCR, značení fluorescenčními dideoxyribonukleotidy, kapilární elektroforéza), vyhodnocení sekvenace (vyhledání restrikčních míst, hledání repeticí, otevřených čtecích rámců, srovnávací databáze atd.), konstrukce restrikčních map (význam, principy

stanovení, varianty), polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP, definice, význam), fingerprinting (otisk) DNA (princip, význam)

9.3

Literatura

I. Mazura, K. Michalová, R. Brdička, J. Mácha: Speciální metody molekulární biologie, Karolinum, 2001, Praha, ISBN 80-246-0258-X V. Vondrejs: Genové inženýrství II, Karolinum, Praha, 2001, ISBN 80-246-0262-8 Rosypal a kol. Úvod do molekulární biologie, vydavatelství MU, Brno, 1997 B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, Vydavatelství VŠCHT PRAHA, 2001 Voet D., Voet J. G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1990. A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis: Bioanalytical Chemistry, Imperial College Press, 2007 S. R. Mikkelsen, E. Cortón: Bioanalytical Chemistry, Wiley Interscience, 2004, ISBN: 978-0-47154447-0.

10.

Základy genového inženýrství, selekce umělých vazebných ligandů

10.1


Genové inženýrství je pojem, který v sobě zahrnuje řadu postupů, vedoucí k cílené manipulaci se strukturou DNA a proteinů. Základem těchto postupů je technika klonování genů, tj. izolace a vnesení specifického úseku cizorodé DNA do tzv. vektoru (za vzniku rekombinantní DNA), jeho pomnožení v hostitelské buňce a získání mnoha identických kopií vloženého fragmentu DNA. Existuje řada typů vektorů, nejčastěji se jedná o upravené plazmidové či fágové DNA, které je možné specificky štěpit a spojovat s cizorodou DNA (inzertem) v tzv. klonovacím místě a následně je vpravit do hostitelské buňky (např. do kompetentních buněk, či elektroporací). Podle typu využití mohou vektory sloužit jak ke klonování DNA, tak pro tvorbu proteinových produktů (tzv. expresní vektory). Technika klonování genů je základní metodou pro tvorbu tzv. genových knihoven, tj. souboru různých fragmentů DNA klonovaných ve vektorech a uschovaných ve formě suspenze bakterií, definovaných kultur či suspenze fágových částic. Dle typu zdrojové DNA je pak možné získat knihovny tzv. genomové, cDNA či expresní knihovny. Ty se posléze využívají např. při izolaci konkrétních genů (hybridizací sondou, popř. imunologicky produkty expresních knihoven) či k mapování chromozomu. Základem proteinového inženýrství je cílená mutageneze DNA in vitro, která využívá techniky klonování genů, cílené výměny úseků klonované DNA a syntézy proteinových produktů s pozměněnou primární strukturou. Tyto techniky jsou často využívány pro selekci umělých vazebných ligandů (např. vazebných proteinů či DNA) s potenciálním využitím v substituci specifických protilátek v bioafinitních stanoveních.

10.2


Klonování DNA Základní terminologie a postupy (klonování DNA, molekulární klon, klonovací vektor, replikon, cizorodá DNA, rekombinantní DNA, inzert, genové inženýrství, transgenní organismy), postup (příprava rekombinantní DNA, vnesení do buněk, selekce klonů s rekombinantní DNA), význam a využití (izolace genů, studium regulačních sekvencí, analýza genomů) Příprava rekombinantních molekul DNA

Zdroje DNA ke klonování (genomová, reverzní transkript z mRNA, chemicky syntetizovaná DNA), genomová DNA (vyštěpení a úprava konců fragmentů, spojky, adaptory), cDNA (copy DNA, syntéza reverzní transkripcí z mRNA – mechanismus), umělá syntéza DNA (postup), příprava rekombinantního vektoru (rozštěpení endonukleázou, vazba s cizorodou DNA, ligace). Klonovací vektory a selekce rekombinantních klonů Plazmidové vektory (vlastnosti plazmidů – velikost, přenos do buňky, replikace, geny pro selekci, klonovací místa, mnohočetné klonovací místo, klonovací kapacita), transformace (kompetentní E. Coli, elektroporace), identifikace bakteriálních kolonií s rekombinantním plazmidem (restrikční analýza DNA, inzerční inaktivace, alfa-komplementace a detekce pomocí X-gal a IPTG induktoru, hybridizace), speciální vektory (expresní vektory – syntéza proteinů, kyvadlové vektory), odvozené od bakteriofága lambda (výhody – velikost inzertu, snadnost analýzy, rekombinantní DNA v kapsidách, tvorba DNA knihoven, inzerční a substituční vektory), selekce fágových klonů (inaktivace genu cI, selekce založená na alfa-komplementaci, selekce dle fenotypu Spi-) kosmidy, bakteriofág M13, umělé kvasinkové chromozomy (YAC) Genové knihovny Základní pojmy (genová knihovna, genomová knihovna, cDNA knihovna, expresní genová knihovna – charakterizace, výhody/využití), dělení knihoven dle vektorů, velikost knihovny (min. počet klonů), vyhledávaní genů v knihovně (hybridizace pomocí sond, imunochemické značení produktů genů) Mutageneze in vitro Definice pojmu, náhodná mutageneze (delece úseku DNA, inzerce náhodných úseků, chemická mutageneze, mutageneze v průběhu replikace analogy bází), cílená mutageneze (konstrukce mutagenních oligonukleotidů, klonování, selekce), kazetová mutageneze (postup, využití v proteinovém inženýrství)

10.3

Literatura


11.

Molekulárně biologické metody v klinické diagnostice

11.1


Rozvoj speciálních typů molekulárně biologických metod vedl v posledních desetiletích k rychlé expanzi nejen v oblasti základního výzkumu či biotechnologie, ale zejména pak v diagnostických metodách, především pak v cytogenetice. Cytogenetická vyšetření slouží např. ke stanovení karyotypu u nemocných s vrozenými vadami, diagnóze některých nádorových onemocnění, v prenatální diagnostice atd. Díky rozvoji molekulární biologie, zejména pak polymerázové řetězové reakce (PCR) a metod fluorescenční hybridizace in situ (FISH), bylo umožněno např. mapování genů na chromozómech, sledování domén chromozómů v interfázi atd. Metoda PCR je v současnosti

patrně nejrozšířenější molekulárně-biologickou metodou, s využitím v široké škále diagnostických technik v biologii, klinické a forenzní medicíně. Její unikátnost spočívá ve faktu, že technikou in vitro replikace dokáže selektivně v opakovaných cyklech amplifikovat úsek nukleové kyseliny, který může být dále analyzován, modifikován či pozměněn a využit v řadě navazujících postupů. V diagnostických metodách je využívána např. v detekci bodových mutací genů, identifikací osob (paternita, forenzní analýza), při detekci infekčního materiálu, v diagnostice dědičných chorob atd. Metody FISH jsou založeny na principu specifické hybridizace fluoroforem značených krátkých oligonukleotidů, tzv. sond, s komplementárními úseky genů fixovaných v mikroskopickém preparátu. Přítomnost/nepřítomnost dané sekvence (genu) v preparátu je pak zvýrazněna pod fluorescenčním mikroskopem. Díky vývoji nových typů fluoroforů s různou vlnovou délkou fluorescence je možné v jednom preparátu současně zobrazovat více specifických sekvencí.

11.2


Polymerázová řetězová reakce Princip PCR (Polymerase chain reaction) (in vivo replikace, templát, primery, DTP, DNA polymeráza), provedení a instrumentace (amplifikační cyklus - denaturace DNA, annealing primerů, replikace), preparativní PCR (definice, využití), asymetrická PCR (syntéza pouze ssDNA, instrumentace, využití – příprava sond), alelicky-specifická PCR (AS-PCR, detekce 1-nukleotidových záměn, princip), „Nested“ PCR (dvojnásobná PCR, princip a využití), „Multiplex“ PCR (současná amplifikace více úseků DNA, využití – např. analýza HIV, hepatitidy, M. Tuberculosis, princip), Diferenciální PCR (princip, využití), Kompetitivní PCR (princip, využití), Inverzní PCR (amplifikace neznámých úseků DNA, princip,využití), Alu repetetivní – PCR (princip, využití), „Gene walking“ PCR (princip, využití), Amplifikace cDNA konců (RACE, princip) Molekulární cytogenetika Cytogenetika člověka (definice, řešené problematické okruhy), chromozómové odchylky (numerické, strukturní autozomové, heterochromozómové), metody hybridizace in situ (HIS, princip metod, instrumentace, tvorba řezů, fixace, specifické barvení), fluorescenční hybridizace in situ (FISH, princip – fixace materiálu, denaturace teplotní/chemická, komplementace s fluorescenční DNA sondou, pozorování fluor. mikr., aplikace), typy fluorescenčních sond (centromerické, telometrické, lokusspecifické, malovací), hybridizace (mechanismus, vliv pH, teploty, salinity, organických rozpouštědel, délka sondy), nepřímá imunofluorescence (princip, biotinylace sond, vazba streptavidinu s fluoresceinem), fluorescenční mikroskop (instrumentace), mnohobarevná FISH (více sond, více fluorochromů, využití, příklady), komparativní genomová hybridizace (CGH, princip, využití), spektrální karyotypování (SKY, princip, využití). 11.3

Literatura


Opory pro kombinované studium jednooborové biologie. Bioanalytické metody. Mgr. Jan Malý, Ph.D. Katedra biologie PřF UJEP

Recommend Documents