Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
Význam metalothioneinu v maligním potenciálu nádorových buněk Diplomová práce
Vedoucí práce: doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.
Brno 2013
Vypracoval: Bc. Markéta Sztalmachová
ZADÁNÍ
Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Význam metalothioneinu v maligním potenciálu nádorových buněk“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a byla zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně dne ......................................................
Podpis diplomanta ...........................................
Experimentální část této diplomové práce byla realizována na výzkumné infrastruktuře vybudované v rámci projektu CZ.1.05/2.1.00/03.0072 Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace.
Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky.
Poděkování Chtěla bych poděkovat doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D., vedoucímu své diplomové práce. Velké díky patří především RNDr. Michalovi Masaříkovi, Ph.D, za odborné vedení a pomoc při vypracování této práce, dále MUDr. Jaromíru Gumulcovi, Mgr. Martině Raudenské, Ph.D. a všem dalším kolegům z ústavu patologické fyziologie LF MU, kde tato práce vznikla. Díky patří také Dr. Vladimíru Pekaříkovi, Ph.D., za přípravu plazmidu. Obrovské díky patří mému příteli Tomášovi za obrovskou trpělivost a podporu. Také bych ráda poděkovala své mamince a celé rodině, za to že mě vedli správným směrem. Tato práce byla podpořena projekty NanoBioMetalNet CZ.1.07/2.4.00/31.0023 a CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.
Abstrakt Cílem této práce byla především analýza MT a ověření jeho vlivu v patogenezi nádorových onemocnění. Práce je zaměřena na nádorová onemocnění prsu a prostaty a roli metalothioneinu (MT) v jejich patogenezi. Experimenty byly prováděny na buněčných liniích (PNT1A, PC-3, 4T1, 4T1 se zvýšenou expresí MT), ale také na zvířecím experimentálním modelu (myši kmene Balb/c). Analýza byla provedena jak na úrovni expresí genů MT1 a MT2, tak na proteinové úrovni. U zvířecích modelů byla navíc provedena analýza exprese genů p53 a MTF-1. Bylo využito MTT testů, systému xCELLigence RTCA DP a real-time PCR. Z výsledků vyplývá, že exprese genů MT1, MT2, p53 a MTF-1 i hladina MT1 a MT2 na proteinové úrovni je ovlivněna typem tkáně. V jaterní tkáni u zvířat s indukovaným nádorem a suplementovaných zinkem je zvýšená exprese MT1 a MT2 genů. Byl prokázán vliv suplementace zinku na velikost nádorů. Klíčová slova Metalothionein, buněčné kultury, Balb/c myši, zinek, karcinomy prsu, metastázy
Abstract The aim of this work was mainly MT analysis and verification of its influence in the pathogenesis of cancer. I focused on breast cancer and prostate cancer and the role of metallothionein (MT) in their pathogenesis. Experiments were performed on cell lines (PNT1A, PC-3, 4T1, 4T1 overexpressing MT), but also in an animal experimental model (mice Balb / c). Analysis was performed at the level of gene expression of MT1 and MT2, and at the protein level. In animal models were also analyzed gene expression of p53 and MTF-first We used MTT assays, the xCELLigence RTCA DP and real-time PCR. The results show that the expression of genes MT1, MT2, p53 and MTF-1 and the level of MT1 and MT2 at the protein level is affected by the type of tissue. In liver tissue in animals with induced tumors and supplemented with zinc is overexpression MT1 and MT2 gene. The effect of the supplementation of zinc on tumor size has been shown. Keywords Metallothionein, Cell lines, Balb/c mouse, zinc, breast cancer, metastasis
Obsah 1
Úvod .......................................................................................................................... 9
2
Literární přehled ...................................................................................................... 10 2.1
Metalothionein (MT)........................................................................................ 10
2.1.1
Struktura metalothioneinu......................................................................... 10
2.1.2
Izoformy metalothioneinu......................................................................... 11
2.1.3
Biologické funkce metalothioneinu .......................................................... 13
2.1.4
Genová exprese a syntéza metalothioneinu .............................................. 16
2.1.5
Metabolizmus těžkých kovů a MT ........................................................... 18
2.1.6
Role metalothioneinů v karcinogenezi ..................................................... 19
2.2
Nádorová onemocnění prsu.............................................................................. 20
2.2.1
Biomarkery používané v diagnostice karcinomu prsu .............................. 20
2.2.2
Mutace supresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53 ............................... 21
2.2.3
Prediktivní faktory léčebné odpovědi ....................................................... 21
2.2.4
Metalothionein jako nový biomarker v diagnostice karcinomu prsu? ..... 23
3
Cíle práce ................................................................................................................. 24
4
Materiál a metodika ................................................................................................. 25 4.1
Materiál ............................................................................................................ 25
4.1.1
Chemikálie ................................................................................................ 25
4.1.2
Přístrojové vybavení ................................................................................. 25
4.1.3
Plazmid ..................................................................................................... 25
4.2
Metody ............................................................................................................. 26
4.2.1
Buněčné kultivace ..................................................................................... 26
4.2.2
MTT .......................................................................................................... 27
4.2.3
Real-time monitoring pomocí systému xCELLigence RTCA DP ............ 27
4.2.4
Transfekce prsní linie 4T1 ........................................................................ 27
4.2.5
Buněčná invazivita a migrace s použitím systému xCELLigence RTCA DP ............................................................................................................. 28
4.2.6
Izolace RNA z buněk a reverzní transkripce ............................................ 29
4.2.7
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z buněk ... 29
4.2.8
Pokusná zvířata ......................................................................................... 29
4.2.9
Aplikace nádorových buněk 4T1 zvířatům ............................................... 30
4.2.10
Sledování růstu nádoru a ukončení experimentu ...................................... 31
4.2.11
Izolace RNA z tkání a reverzní transkripce .............................................. 32
4.2.12
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z tkání..... 32
4.2.13
Příprava buněčných lyzátů ........................................................................ 32
4.2.14
Stanovení proteinů .................................................................................... 33
4.2.15
Stanovení MT pomocí Dot Blotu.............................................................. 33
4.2.16
Statistická analýza..................................................................................... 34
Výsledky .................................................................................................................. 35
5
5.1
Výsledky MTT testů ........................................................................................ 35
5.2
Real-time monitoring pomocí xCELLigence systému ..................................... 35
5.3
Invazivita a migrace buněčných linií ............................................................... 37
5.4
Stanovení exprese MT1 aMT2 z buněčných lyzátů ......................................... 41
5.5
Stanovení exprese MT1, MT2, MTF-1, p53 z tkáňových lyzátů ..................... 43
5.6
Stanovení MT z tkáňových lyzátů na proteinové úrovni ................................. 44
5.7
Zobecnění efektu suplementace zinkem a indukce tumoru na všechny tkáně . 45
5.8
Vliv suplementace zinkem, typu tkáně a indukce nádoru ................................ 46
6
Diskuze .................................................................................................................... 53
7
Závěr ........................................................................................................................ 56
8
Přehled použité literatury ........................................................................................ 57
9
Seznam obrázků....................................................................................................... 66
10
Seznam tabulek .................................................................................................... 67
11
Přílohy.................................................................................................................. 68
Seznam zkratek MT
metalothionein
AMK
aminokyselina
GSH
redukovaný glutathion
GSSG
oxidovaný glutathion
ATP
adenozintrifosfát
GTP
guanozintrifosfát
ROS
reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species)
DNA/RNA
deoxyribonukleová/ribonukleová kyselina
mRNA
mediátorová ribonukleová kyselina
MTF-1
metal regulační transkripční faktor
MRE
metal responzivní element
GIF
růstový inhibiční faktor (growth-inhibitory factor)
CA 15-3
nádorový antigen (cancer antigen 15-3)
CEA
karcinoemryonální antigen (carcinoembryonic antigen)
ER
estrogenový receptor
PR
progesteronový receptor
HER2
lidský receptor epidermálního růstového faktoru 2 (human epidermal growth factor receptor 2)
1
ÚVOD
Co stojí za vznikem nádorového onemocnění? Dá se mu účinně předcházet? Pokud už se tato nemoc objeví, jakou léčbu zvolit a jakou má člověk šanci, že léčba u něj bude účinná? Existuje mnoho nezodpovězených otázek na toto téma. Je jasné, že se ve většině případů nejedná o onemocnění vyvolané jediným faktorem, ale jedná se o multifaktoriální onemocnění. Není proto divu, že se dnes výzkumem na toto téma zabývá mnoho pracovišť. Těžko říci, zda se této chorobě dá předcházet, ale je důležité najít účinnou léčbu. V případě, že již u člověka rakovina propuknula, je velice důležité diagnostikovat tuto nemoc včas. Tímto problémem se dnes zabývá velké množství vědeckých pracovišť a mnoho z nich se zaměřilo na hledání markerů, které na nemoc upozorní. V praxi se již některé z těchto markerů používají, ale i přesto se stále nedaří boj s touto nemocí vyhrát. Z markerů, které se již zavedly do praxe, bych mohla zmínit prostatický specifický antigen (PSA), který se využívá v diagnostice karcinomu prostaty. U karcinomů prsu se jako prognostické markery používají estrogenový receptor, progesteronový receptor či HER2 receptor. U karcinomu prsu hraje ve vzniku tohoto onemocnění velkou roli také genetika, a proto se do praxe zavedlo genetické testování genů BRCA1 a BRCA2. Ženy s mutací v tomto genu mají zvýšené riziko vzniku této nemoci. Toto testování je také jednou z možností jak preventivně předcházet vzniku karcinomu prsu. V této diplomové práci se zabývám metalothioneinem, jakožto potenciálním markerem v karcinogenezi.
9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Metalothionein (MT) Metalothioneiny (MT) jsou nízkomolekulární intracelulární proteiny bohaté na cystein, jejichž hmotnost se pohybuje v rozmezí 6-10 kDa. [28, 31, 59, 80, 101] Cystein zaujímá až 30 % hmotnosti molekuly. [59, 91, 96, 97] Díky thiolovým skupinám cysteinu tvoří metalothionein vazby s atomy kovů, proto má důležitou roli v přenosu těžkých kovů a jejich detoxikaci. [2, 24, 28, 58, 60, 64, 91] MTs jsou termostabilní proteiny [16, 94] a obvykle se nachází v intracelulárním prostředí, ale můžeme je nalézt také v krvi, plazmě či mozkomíšním moku. [13] Nejvyšší koncentrace MT v těle jsou v játrech, ledvinách, střevech a slinivce břišní. [22] MT byl poprvé popsán v roce 1957, kdy ho při hledání látek zodpovědných za akumulaci dvojmocných kovů v buňkách ledvin izolovali M. Margoshes a B. L. Vallee. [65] Následně byl identifikován téměř ve všech organizmech, a to jak u bakterií, rostlin, bezobratlých, tak i u obratlovců. [63, 80, 91] Díky zvýšené akumulaci MT v organizmu, který byl vystaven působení těžkých kovů, je MT používán jako biomarker při sledování znečištění životního prostředí. [76, 81, 103] 2.1.1
Struktura metalothioneinu
Molekula MT je složena ze dvou domén, značených jako α a β domény. [30, 32, 59, 60, 95] β-doména obsahuje devět cysteinových zbytků a má tři vazebná místa. α-doména má 11 cysteinových zbytků a je schopna vázat 4 dvojmocné ionty (Obrázek č. 1). [33, 91, 95] Jedna molekula MT může navázat až 12 monovalentních iontů nebo 7 dvojmocných iontů kovů. Afinita k jednotlivým kovům klesá v pořadí Hg-Ag-Cu-Cd-Zn. [22, 59, 60] MT se obvykle vyskytuje v komplexu se zinkem či mědi (ZnMT a CuMT) nebo jako smíšená forma několika kovů (např. Zn, CuMT). U savců je dominantní především ZnMT forma. [91] Tento termostabilní protein je složen z 61–68 aminokyselin (AMK), 20 z nich jsou cysteiny a nenajdeme zde žádnou aromatickou aminokyselinu či histidin. [22, 33, 82, 95] Koordinace kovových iontů pak určuje trojrozměrnou strukturu. [16] Jako apo-MT je označována molekula, která neobsahuje kovy. [16] Je charakteristická šestkrát opakující se repeticí C-X-C (C značí cystein, X může být libovolná AMK) a jednou odlišnou sekvencí K-X(1,2)-C-C-X-C-C-P-X(2)-C. [28, 82]
10
Obrázek 1: Struktura metalothioneinu MT složený ze dvou domén (α-doména a β-doména). Tečkovaně jsou naznačeny vazby mezi cysteiny obsahující –SH skupiny (žlutě) a kovem (zeleně). Převzato z http://www.protein.pl [cit. 2012-03-28].
2.1.2
Izoformy metalothioneinu
Metalothionein má čtyři izoformy: MT1 až MT4 (Obrázek č. 2). Zatímco izoformy 1 a 2 se vyskytují v řadě tkání a dominantně vážou kovy, izoformy 3 a 4 se vyznačují buněčnou specifičností. [25, 38, 91, 95] Izoformy MT1 a MT2 se nachází především v játrech, slinivce, střevech a ledvinách. [6] Izoforma MT3, též nazývaná jako neuronový růstový inhibiční faktor (GIF- growth-inhibitory factor), se vyskytuje především v mozkové tkáni [69] a byla pozorována i v glomerulech ledvin. [25] Podílí se na vzniku, ale také na průběhu apoptózy mozkových buněk. [94] MT4 se nachází v epitelech a to hlavně v ústní dutině, horní části gastrointestinálního traktu a v kůži. [57, 82, 91, 99] Zapojuje se do regulace žaludečního pH a také chrání kůži před spálením a jinými kožními traumaty. [94]
11
Obrázek 2: Izoformy metalothioneinu a jejich lokalizace v savčím organismu. Upraveno dle [24]
Exprese MT1 a MT2 může být vyvolána mnoha faktory, jako jsou kovy, glukokortikoidy, cytokiny či oxidační stres. Exprese MT3 a MT4 je přísně tkáňově specificky regulována. [91] I přes různorodost výskytu jednotlivých izoforem v tkáních jsou mezi nimi patrné sekvenční shody, jako například vysoký podíl cysteinu (obrázek č. 3). [80] Izoformy MT1 a MT2 mají roli převážně v detoxikaci kovů, zatímco MT3 se podílí na udržování homeostázy zinku v neuronech. [28, 70, 82] Exprese genů MT1 a MT2 v orgánech může být mimo jiné ovlivněna pohlavím a věkem. [82] U dospělých savců byly MT1 a MT2 lokalizovány převážně v cytoplazmě, ale i v lysozomech, mitochondriích a v jádrech. Tyto dvě izoformy se vyskytují nejčastěji a byly rozsáhle studovány zejména ve vztahu k jejich roli v homeostáze kovů a detoxikaci. [38, 82] U lidí bylo detekováno osm funkčních (MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X a MT2A) a sedm nefunkčních (MT1C, MT1D, MT1I, MT1J, MT1K, MT1L a MT2B) izoforem MT1 a MT2. [36, 62] .
12
MT1 MDPN-CSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKG…....AADKCTCCA
61
MT2 MDPN-CSCASDGSCSCAGACKCKQCKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCSQGCICKE…….ASDKCSCCA
61
MT3 MDPETCPCPTGGSCTCSDKCKCKGCKCTNCKKSCCSCCPAGCEKCAKDCVCKGEEGAKAEAEKCSCCQ 68 MT4 MDPGECTCMSGGICICGDNCKCTTCSCKTCRKSCCPCCPPGCAKCARGCICKG…….GSDKCSCCP
62
Obrázek 3: Porovnání sekvencí AMK izoforem MT1 až MT4 u myši. Na konci sekvence je uveden počet AMK v daném proteinu. Červeně je vyznačen cystein. Upraveno dle [34]
2.1.3
Biologické funkce metalothioneinu
Metalothionein je považován za „víceúčelový protein“. [13, 16] Jedna z nejdůležitějších funkcí MT je detoxikace kovů, udržování jejich hladiny v buňkách (zachycení, skladování, distribuce a vyloučení kovu) a také ochrana před buněčným stresem. [9, 40, 76, 80, 83, 91, 99] MT má vysokou afinitu k zinku a je tedy silným akceptorem zinečnatých iontů, které do buňky vstupují z extracelulárního prostředí přes cytoplazmatickou membránu, z lysozomů po degradaci molekul obsahujících zinek nebo po vyloučení Zn 2+ z jiných vnitrobuněčných struktur. Zinek má zásadní význam pro zachování zdraví a je nezbytný pro fungování řady enzymů a transkripčních faktorů. [15, 38, 55, 99] Pět až dvacet procent zinku nacházejícího se v buňce je asociováno s MT. Díky tomuto „vychytávání“ je intracelulární koncentrace volného zinku nízká. [90, 91] Význam MT je stále zřetelnější především ve schopnosti udržovat homeostázu. [9, 69] Mnoho studií poukazuje na to, že MT je jeden z hlavních proteinů vázajících zinek. [99] I přes vysokou stabilitu komplexu ZnMT mohou být zinečnaté ionty uvolněny z molekuly a vznikne apo-MT a naopak, kdy se zinek naváže na apo-MT za vzniku molekuly ZnMT. Toto je možno sledovat u redoxních reakcí prostřednictvím redukovaného (GSH) a oxidovaného glutathionu (GSSG), které jsou katalyzovány proteiny obsahujícími selen. GSSG oxiduje ZnMT, dochází ke zvýšenému uvolňování Zn 2+ z molekuly a ke vzniku apo-MT. Tato forma MT může být degradována nebo použita v prostředí s vysokým obsahem GSH s pomocí selenu jako katalyzátoru. Pokud převládá GSH, váže se s MT a snižuje uvolňování zinečnatých iontů z molekuly. MT může být rychle regenerován s rostoucí koncentrací zinečnatých iontů (obrázek č. 4). [16, 23] Zatímco zvýšená koncentrace GSH snižuje koncentraci volného Zn2+, ROS a GSSG zvyšují uvolňování zinku ze ZnMT a jeho přenos do různých jaderných proteinů, které mají antioxidační působení. [82] Ve výše uvedených mechanizmech je redoxní stav jedním z hlavních regulátorů výměny Zn2+ mezi MT a dalšími intracelulárními molekulami. 13
[97] Extracelulární MT s navázaným kovem může být internalizován endocytózou následně vstupuje do lysozomů. V lysozomech je kov uvolněn a apo-MT je hydrolyzován. [82]
Obrázek 4: Zapojení MT v redoxním cyklu. Při zvýšené koncentraci Zn2+ dochází k jejich navázání na molekulu apo-MT. V oxidačním prostředí jsou zinečnaté ionty uvolňovány z molekuly MT a využity proteiny, jako jsou transkripční faktory či metaloenzymy. Oxidovaná forma apo-MTox může podlehnout degradaci nebo může být využita v redukčním prostředí s pomocí selenu jako katalyzátoru. MT se následně regeneruje při zvýšení koncentrace Zn2+. Upraveno dle [23]
Metalothionein, který váže zinek či měď je důležitým úložištěm těchto kovů, které jsou kofaktory enzymů a jsou nezbytně důležité pro růst buněk. [74, 93] V případě potřeby jsou z MT uvolněny a použity pro syntézu apoenzymů [1, 28, 91]. Poskytování zinku a mědi je zásadní pro buněčnou proliferaci, diferenciaci a vývoj v prenatálním i perinatálním období. [54, 71] Zinek se významně podílí na imunitních reakcích, v signalizačních drahách, rakovině a stárnutí, a změny v jeho hladinách byly pozorovány také při nervových onemocněních. [44] Díky vlivům na hospodaření s kovy může tedy MT působit jako významné neuroprotektivum. [13] Uvádí se, že MT se podílí i na regeneraci po částečném odstranění orgánu, ochraně před neurodegenerativními onemocněními, ale v některých případech byly pozorovány též genotoxické a karcinogenní účinky MT. [28, 55, 82]. Kromě funkce uvolňování zinku z molekuly má MT i silné antioxidační vlastnosti, a to díky vysokému obsahu thiolových skupin, které z něj činí molekulu ideální pro interakci s reaktivními formami kyslíku (ROS). [51, 91] MT odstraňuje volné radikály vzniklé při běžném metabolizmu či oxidačním stresem, snižuje jejich účinek 14
v cytoplazmě a je považován za stresový biomarker. [76] Dále se váže s GSH, který bojuje proti produkci volných radikálů v cytoplazmě. [60, 93] Metalothionein se též podílí na translokaci zinku do mitochondrií a jádra. [2, 58, 60, 70, 82] V mitochondriích byl MT detekován v mezimembránovém prostoru a předpokládá se, že sem vstupuje z cytoplazmy ve formě ZnMT přes vnější mitochondriální membránu. Mechanizmus zůstává prozatím neznámý. V závislosti na přítomnosti zinku v mitochondriích reguluje ZnMT aktivitu zinek-dependentních metaloenzymů a reguluje rychlost dýchání. [20] Rychlost uvolňování zinku z ZnMT může být podpořena a posílena vazbou ATP či GTP k metaloproteinu. Kovy rychle se hromadící v mitochondrii, případně i přes Ca2+ uniport ve vnitřní mitochondriální membráně, se váží na proteiny přenášející elektrony a zablokují oxidační fosforylaci, což má za následek nadprodukci ROS. Velká produkce ROS snižuje vazbu kovů na MT, jeho redoxní funkce a narušuje tvorbu ATP. Nadprodukce ROS může aktivovat mitochondriální proteiny zprostředkovávající signalizační kaskádu vedoucí buňky k apoptóze nebo nekróze. [82] V jádře je zinek potřebný pro normální funkci histonů a nehistonových proteinů, metaloenzymů (RNA a DNA polymerázy), transkripčních faktorů, zvláště pak pro „zink-finger“ proteiny, které regulují aktivitu jednotlivých genů. MT zde představuje hlavní donor zinku. Bylo zjištěno, že v játrech dospělých zvířat a lidí je na rozdíl od plodu či novorozence velmi nízký obsah jaderného MT. U rostoucích zvířat byl rovněž nalezen vysoký obsah MT v jádrech, což odráží zvýšenou potřebu zinku v rychle rostoucích buňkách či v reparačních procesech. [47] Jaderný MT pochází z cytozolu, ale přesný mechanizmus jeho přesunu do jádra není zatím znám. Díky své malé velikost může MT procházet jadernými póry, ale molekula nacházející se v cytoplazmě musí být aktivována zatím neidentifikovaným cytozolovým faktorem. V aktivaci by mohly hrát roli malé G-proteiny a perinukleární cytoskelet. [20] Následně může být molekula MT přepravována a uchovávána v jádře. Podnětem pro translokaci MT může být obecně redoxní stav v buňce. Transport do jádra je posílen při oxidačním stresu souvisejícím se zvýšenou produkcí ROS. [82] V poslední době se ukazuje, že zvýšená exprese MT v buňkách indukuje antiapoptotické účinky. [16, 86, 99] S antiapoptotickým účinkem souvisí aktivace transkripčního jaderného faktoru (NF-kB), který může být aktivován různými podněty (tumor nekrotizující faktor, interleukin 1, hypoxie či ROS). Molekula NF-kB vyskytující se v cytoplazmě se skládá z podjednotek p50 a p65 a dále z inhibiční podjednotky. Pouze 15
doména p65 obsahuje transaktivační doménu, která aktivuje transkripci genů. [96, 97] Aktivace NF-kB je uskutečněna disociací její molekuly, degradací inhibiční podjednotky a následně translokaci NF-kB z cytoplazmy do jádra, kde se váže na DNA a indukuje transkripci řady genů zapojených do buněčné transformace, proliferace a angiogeneze. Zajímavé je, že tyto podněty aktivují zároveň MT, který zajišťuje stabilizaci NF-kB na DNA (obrázek č. 5). [52, 99] V souvislosti s aktivací NF-kB v procesu karcinogeneze se jako karcinogeny a nádorové promotery uvádějí toxické kovy, UV záření, azbest, benzopyren, ROS a další. V některých studiích byla zdokumentována aktivace NF-kB v nádorových buňkách. Aktivace NF-kB byla následována proliferací těchto buněk. [96, 97]
Obrázek 5: Antiapoptotická role MT zprostředkovaná interakcí s NF-kB: NF-kB je složena ze dvou podjednotek P50 a P65, které jsou v cytoplazmě asociovány s inhibiční podjednotkou I-kB. Oxidací jsou aktivovány proteinkinázy a dochází k odštěpení inhibiční podjednotky I-kB od NF-kB. Inhibiční podjednotka je následně fosforylována a degradována. Disociační komplex NF-kB nyní může být translokován do jádra, kde se váže na DNA a aktivuje transkripci řady genů. MT zde působí jako stabilizátor vazby NF-kB na DNA. Upraveno dle [99]
2.1.4
Genová exprese a syntéza metalothioneinu
V savčím genomu se nachází více genů pro MT, které ho kódují. U hlodavců je MT řízen čtyřmi geny nacházející se na chromozomu 8 (MT1 až MT4). Lidský MT je kódován 17 geny, které se nachází na chromozomu 16. [9, 22, 29, 56] Z nichž 13 genů kóduje izoformu MT1, 2 geny izoformu MT2, jeden gen je určen pro izoformu MT3 a jeden 16
pro MT4. [69] U těchto genů byl zjištěn výrazný polymorfizmus a každá forma má také více izoforem, které se mohou vyskytovat v různých částech tkání. [16, 82, 95] Jejich přesné fyziologické role a funkční charakteristiky jsou zatím nejasné. V regulaci genové exprese MT má klíčovou roli metal regulační transkripční faktor (MTF-1), který aktivuje transkripci MT v reakci na přítomnost kovů či oxidační stres (obrázek č. 6). [92, 97, 99, 101] Za normálních okolností se MTF-1 v buňce nachází v inaktivním stavu s navázaným MTI, což je inhibitor bránící navázání MTF-1 na MRE. [42, 91] MRE je sekvence DNA nutná pro navázání MTF-1 a následné spuštění transkripce a nachází se v několika kopiích v promotoru všech genů pro MT. [38, 54, 62, 101] Po vstupu iontu kovu do buňky se tento iont naváže na MTI a uvolní se tím MTF-1, který může zahájit transkripci MT. Vzrůstající koncentrace těžkých kovů tak může indukovat syntézu MT. [39, 42] MTF-1 je kovy vázající protein složený z šesti zinkových prstů a vyskytuje se u mnoha živočišných druhů od hmyzu až po savce. [29, 74] Transkripční faktory, které jsou ovlivňovány kovovými ionty a regulují expresi genů, patří mezi metal-regulační proteiny. Metal-regulační proteiny mohou regulovat transkripci nebo stabilitu mRNA a následnou translaci. [38]
Obrázek 6: Schéma regulace genové exprese MT. Vstup zinečnatých iontů do buňky je zajištěn pomocí zinkového transportéru ZIP-1. MTF-1 aktivován zinečnatými ionty se váže na MRE v promotoru a spouští transkripci apo-MT. Volné zinečnaté ionty se poté vážou na molekulu apo-MT za vzniku komplexu ZnMT. Upraveno dle [22]
17
Biosyntéza MT je řízená několika faktory. Zvýšená syntéza MT je pozorována v reakci na poranění tkání, při infekci, zánětech či nádorových onemocněních. [22] Jedním z hlavních faktorů je indukce syntézy kovy. [81, 92, 95] Při zvýšeném příjmu zinku či mědi se zvýší syntéza MT, především v játrech a ve střevech, což je jeden z přímých mechanismů detoxikace těžkých kovů. Carey a kol. [17] zjistili, že syntéza MT je indukována také při reakci na lipopolysacharidy, které jsou uvolněny při potratech a také při působení teratogenních faktorů. Metabolizmus MT je velice citlivý na hormonální regulaci realizovanou prostřednictvím glukokortikoidů, katecholaminů, glukagonu, steroidů, interleukinu-6, angiotensinu-2 a různých stresových faktorů. [37, 92, 95] Syntéza MT je zvýšená u rychle proliferující tkáně, což má důležitou roli u normálních, ale i u nádorových buněk. Zvýšená koncentrace MT u proliferujících buněk je přičítána vyšší hladině zinku a mědi a byla zaznamenána u různých nádorových onemocnění. [28, 71] Některé studie ukazují zvýšenou syntézu MT1 a MT2 u proliferujících a diferencujících se buněk oproti buňkám nedělícím se. Za těchto podmínek byla zvýšená hladina MT jak na úrovni mRNA, tak na proteinové úrovni. [71, 87, 89, 99] Z těchto výsledků bylo navrženo, že MT buňku chrání před vysokou dávkou zinku vznikem ZnMT. [90] Metalothionein může být poměrně rychle degradován, přičemž hlavním místem odbouráváním jsou lysozomy. [95] Absence MT není smrtelná ani nijak škodlivá v případech, kdy není organizmus vystaven nadměrnému působení kovů. V případě absence MT je pozorována snížená tolerance ke kovům, vyšší citlivost k oxidačnímu stresu, náchylnost k zánětlivým procesům či infekcím. [16] 2.1.5
Metabolizmus těžkých kovů a MT
Těžké kovy se do organizmu dostávají absorpcí kůží, inhalací či ingescí. Vdechnutá látka, která se nerozpustí v mukózních hlenech přechází do alveol a následně se dostává do krve. Při ingesci toxicitu kovu ovlivňuje jeho forma, rychlost průchodu trávicím traktem a množství proteinů, jako jsou právě metalothioneiny. V obou těchto případech se uplatňují mechanizmy difúze či aktivního transportu vazbou na specifické bílkoviny. [1] Detoxikace kovů probíhá převážně v játrech a ledvinách, ovšem ke kumulaci kovů dochází i v mozku a kostech. Těžké kovy navázané na MT jsou tedy transportovány do ledvin a jater a následně vyloučeny močí a stolicí. [46, 84, 92, 100] Schéma metabolizmu těžkých kovů a zapojení MT v něm je uvedeno na obrázku č. 7.
18
Obrázek 7: Metabolizmus těžkých kovů. Těžké kovy se do organizmu dostávají inhalací, absorpcí nebo ingescí a dále se dostávají do krevního oběhu. Krví se šíří do jater či ledvin a následně jsou vyloučeny v komplexu s MT. Upraveno dle [67]
2.1.6
Role metalothioneinů v karcinogenezi
V posledních letech je MT zkoumán jako možný diagnostický marker progrese nádorů. Některé studie ukazují na zvýšenou hladinu MT v séru pacientů s karcinomem prsu, plic, trávícího systému, melanomu či urogenitálního traktu. [37, 40] Mezi expresí MT u jednotlivých typů nádorů existují rozdíly, což je projevem fenotypové rozmanitosti MT. [37] Obecně je zvýšená hladina MT spojena s horší prognózou. [6, 47] Zdá se, že MT může chránit nádorové buňky před apoptózou a zvyšovat tak odolnost nádorových buněk vůči radioterapii a chemoterapii. [13, 37, 86] Předpokládá se, že léky používané při nádorové terapii či jejich metabolity interagují s MT, čímž je inhibována přímá interakce léků s jejich cílem a snížená účinnost terapie. [47, 93, 98] MT také slouží jako dárce zinku pro transkripční faktory a může tak podporovat nádorovou buněčnou proliferaci či metastázování. [47] Na druhé straně některé studie zabývající se například karcinomem tlustého střeva nebo močového měchýře nepotvrdily významnou korelaci mezi expresí MT a karcinomy. [48, 73] Použití MT jako potenciálního markeru nádorové diferenciace a proliferace je ve stádium intenzivního výzkumu. [28] Biomedicínské aspekty MT byly zkoumány v onkologických studiích v souvislosti s cisplatinou, jakožto chemoterapeutikem. [27] Cisplatina je jedním z nejsilnějších protinádorových léků a je účinná u velké škály nádorů. Používá se také v kombinaci s radioterapií nebo spolu s chirurgickou léčbou. [53] Cytotoxické účinky cisplatiny jsou dány její vazbou na jadernou DNA. Narušením struktury DNA způsobí inhibici tran19
skripce a oprav jejího poškození [53] a také způsobuje okamžitou indukci syntézy MT. [16]
2.2 Nádorová onemocnění prsu Karcinom prsu je nejčastějším nádorovým onemocněním vyskytujícím se u žen a představuje 23 % z celkového počtu výskytu nádorových onemocnění. [49] I přes zvýšený výskyt se díky lepší terapii povedlo za posledních dvacet let snížit úmrtnost. [43] Karcinom prsu je komplexní genetické onemocnění charakterizované nahromaděním několika molekulárních změn. [79] Mezi faktory, které přispívají k rozvoji karcinomu prsu, patří postmenopauzální hormonální terapie, užívání perorální antikoncepce, pozdní věk při prvním porodu, konzumace alkoholu či obezita, ale také genetické či vrozené faktory. [3, 49, 75] Riziko vzniku karcinomu prsu roste v případě, pokud má žena blízkou příbuznou s tímto onemocněním nebo také pokud má více než jednoho vzdáleného příbuzného s tímto onemocněním. [68] K základním vyšetřovacím technikám patří mamografické vyšetření prsu, které se používá jako screeningová metoda. [14] V České republice se dle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví ČR č. 3/2010 Sb. o stanovení obsahu a časového rozmezí preventivních prohlídek provádí mamografické vyšetření u žen od 45 let věku ve dvouletých intervalech. Nicméně senzitivita mamografie se pohybuje v rozmezí 63 až 87 % a dochází k falešným negativitám. Je tedy na místě doplnit mamografické vyšetření například stanovením biomarkerů pro daný typ karcinomu. Každopádně je v dnešní době mamografie stále nejúčinnějším nástrojem pro časnou detekci karcinomu prsu. [61] 2.2.1
Biomarkery používané v diagnostice karcinomu prsu
Vyšetření biomarkerů je neinvazivní metoda a může omezit množství žen, které musejí podstoupit zbytečné bioptické vyšetření. Vyšetření nádorových markerů se v hojné míře používá při kontrole pacientů po léčbě, a tímto způsobem je možno včas rozeznat více než 50 % případů recidiv. [4] K rutinnímu vyšetření na přítomnost karcinomu prsu se dnes ve většině diagnostických center používá několik biomarkerů. Prvním markerem používaným v diagnostice karcinomu prsu byl Cancer antigen 15-3 (CA 15-3). Jedná se o cirkulující mucinový glykoprotein, jehož hladina v krvi se u zdravých jedinců pohybuje pod 30 U/ml. Senzitivita tohoto markeru dosahuje 50–80 %. [4] Dalším používaným markerem je karcinoembryonální antigen (CEA). Tento marker se používá i u ji20
ných typů nádorových onemocnění, přičemž u karcinomu prsu se jeho senzitivita pohybuje kolem 54 %. Používá se tedy společně s CA 15-3 jako marker druhé řady. U zdravých lidí se jeho hodnota v krvi pohybuje v koncentraci do 3 ng/ml. [4] CEA se vyskytuje ve 40–50 % případů s přítomností vzdálených metastáz, zatímco CA 15-3 je zvýšen především v případě lokálních karcinomů. [3] 2.2.2
Mutace supresorových genů BRCA1, BRCA2 a p53
U žen s významnou rodinnou anamnézou nádorového onemocnění prsu se používá genetické testování pro mutace v tumor supresorovém genu BRCA1 (breast cancer 1) nebo BRCA2 (breast cancer 2). [68] Gen BRCA1 je lokalizován na 17. chromozomu a je zapojen do řízení a kontroly buněčného cyklu a reparace poškozené DNA. Gen BRCA2 se nachází na 13. chromozomu a je zapojen do procesu homologní rekombinace. [72] Pacientky, u kterých byla zjištěna některá z těchto mutací, mají až devadesátinásobně zvýšené riziko vzniku karcinomu prsu. [3] Nositelem BRCA mutace je přibližně 25 % pacientek a i přes negativní výsledek mutačního testu může toto onemocnění propuknout. U nositelek těchto mutací se doporučuje běžné mamografické vyšetření, ale také preventivní odstranění prsu a chemoprevence. [85] Gen p53 je klíčový faktor v buněčné odezvě na poškození DNA a jeho mutací může dojít k rozvoji nádorových onemocnění. [45] Mutace genu p53 způsobuje zvýšené riziko onemocnění různými nádorovými onemocněními, včetně karcinomu prsu. [3, 93] Mutace genu p53 byla nejčastěji identifikována právě u tohoto onemocnění a je spojena s horší prognózou. Bylo prokázáno, že mutace v tomto genu je spojena s rezistencí k endokrinní terapii, radioterapii i k chemoterapii. [11] Dále byla také prokázaná pozitivní korelace mezi mutací genu p53 a zvýšenou hladinou MT1 a MT2 u nádorových onemocnění. [78] 2.2.3
Prediktivní faktory léčebné odpovědi
K hodnocení prognostických a prediktivních informací o reakci na léčbu pacientky se používají následující faktory: estrogenový receptor (ER), progesteronový receptor (PR) a HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). [79]. V současně době se uznává především kombinace těchto faktorů pospolu. V tomto případě se nejedná o cirkulující markery, ale stanovují se přímo z izolované tkáně. [77]
21
a) Estrogenový receptor (ER) byl poprvé identifikován v roce 1960 a následné studie prokázaly jeho významný vliv v karcinogenezi. Jeho inhibice prostřednictvím antagonistů estrogenu nebo blokací konverze androgenů na estrogen tvoří základ endokrinní terapie karcinomu prsu. Od roku 1970 se ER používá jako ukazatel endokrinní odpovědi na léčbu a také jako prognostický faktor pro předčasný návrat onemocnění [79] Až 65 % nádorů u žen mladších 50 let jsou ER+ a toto číslo se zvyšuje až na 80 % u žen starších 50 let. [7] ER+ nádory jsou dobře diferencované a vyznačují se nízkou agresivitou primárního nádoru a jsou spojeny s lepšími klinickými výsledky po chirurgickém odstranění. [19] U estrogen-negativních nádorů (ER-) je nepravděpodobné, že pacientka zareaguje na hormonální léčbu. [11, 79] Karcinom prsu je však poměrně heterogenní skupina nádorů a léčbu mohou ovlivňovat různé rizikové faktory, klinické chování a také biologie pacientů. Nádory jsou značně odlišné a bylo prokázáno, že na rozdíl od očekávaného, reagovalo na hormonální léčbu pouze cca 50 % pacientek s ER+ nádory. [18] Stejně tak je doloženo, že malá část pacientek s ER- nádory na hormonální léčbu reaguje. [8] b) Nádory pozitivní na progesteronový receptor (PR) tvoří další podstatnou část karcinomů prsu. PR+ nádory mají lepší prognózu než PR- karcinomy. Studie ukazují, že podobně jako ER status, může PR status předpovědět reakci na hormonální léčbu. Nicméně byly hlášeny i falešné PR pozitivity či falešně negativní výsledky. [5] c) Kombinace expresí obou výše uvedených hormonálních receptorů lze dosáhnout lepší předpovědi reakce na léčbu. Jsou uznány čtyři expresní kombinační skupiny: dvojitě pozitivní (ER+/PR+), jedna pozitivita (ER+/PR- nebo ER-/PR+) a dvojitě negativní (ER-/PR-). Nejčastěji se vyskytuje skupina dvojitě pozitivní (55–65 %) a vyznačuje se nejlepší prognózou a dobrou odezvou na hormonální léčbu. Uvádí se, že 75–85 % pacientek s nádory ER+/PR+ reagují na hormonální terapii, zatímco pacientky s nádory ER-/PRreagují pouze v 10 %. [26] Dvojitě negativní skupina nádorů (18–25 %) je spojena s absencí reakce na hormonální léčbu, vyšší recidivou karcinomu a s nižším celkovým přežitím. [10] Třetí nejvíce se vyskytující skupinou jsou ER+/PR- nádory (12–17 %) a zbytek tvoří skupina ER-/PR+. Hormonální te22
rapie je v těchto případech méně účinná než v případě dvojitě pozitivních karcinomů, úspěšnost se udává kolem 40 %. [26] d) Klinický význam exprese HER2 v roli karcinomu prsu byl uznán roku 1987. [88] Jeho zvýšená exprese je prokazatelná u 25–30 % invazivních karcinomů prsu a hraje důležitou roli v nádorové transformaci, proliferaci a procesu metastázování. [3] Některé studie naznačují, že zvýšená exprese HER2 zvyšuje rezistenci k hormonální léčbě u ER+/PR+ nádorů. [88] e) Analýzou kombinací výše uvedených tří markerů karcinomu prsu se zabývá mnoho studií. Většina z nich klasifikuje karcinomy ER+/PR+/HER2+ jako nádory luminálního typu, zatímco ER-/PR-/HER2- (tzv. tripl negativní karcinom) jako karcinomy bazálního typu. Luminální nádory zahrnují největší podíl karcinomů prsu a použití dalších markerů by mohlo mít důležitý klinický význam. U karcinomu ER+/PR+/HER2- byla pozorována nejlepší reakce na hormonální léčbu. [79] 2.2.4
Metalothionein jako nový biomarker v diagnostice karcinomu prsu?
Je známo, že estrogeny hrají významnou roli v tumorgenezi rakoviny prsu. U některých izoforem MT se předpokládá funkce podobná estrogenům a mohou mít vliv na diferenciaci nádoru prsu. [47, 78, 94] Zvýšená exprese MT u karcinomu prsu je spojována s horší prognózou onemocnění a větší pravděpodobností relapsu. [12, 37, 86] VazquesRamirez a spol. udávají, že zvýšená exprese MT u karcinomu prsu je asociovaná s metastatickým potenciálem, nikoli s přežíváním pacientů nebo recidivou. Studie ukazují, že u nádorových onemocnění prsu jsou zvýšené exprese MT2A, MT1E a MT1F izoforem [78, 93], přičemž nejvíce zvýšená je exprese MT2A. [47, 50, 102] Hladina MT stoupá s ohledem na klinické stadium nemoci. [11] Nejvyšší hladina MT2A je zaznamenávána u histologického gradingu 3, a to jak na úrovni mRNA, tak na úrovni proteinu. [50, 78, 93] U karcinomu prsu byla v mnoha případech pozorována signifikantně vyšší hladina MT v ledvinách a v játrech. [34] Jak víme MT je silně asociován s buněčnou proliferací, a proto je zkoumán jako potenciální prognostický biomarker nejen u nádorových onemocnění prsu.
23
3
CÍLE PRÁCE
Cílem této práce byla analýza MT u prostatických a prsních buněčných linií vystavených působení různých koncentrací zinečnatých iontů. Zaměřili jsme se na cytotoxicitu zinku pro jednotlivé linie a také na jejich invazivní a migrační schopnosti. Dalším krokem byla aplikace nádorových buněk pokusným zvířatům a následná charakterizace nádorové masy. Dalším cílem byla změna exprese genu pro metalothionein u prsní linie 4T1 pomocí transfekce expresního plazmidu a porovnání s netransfekovanou prsní linií. Dílčí cíle diplomové práce jsou tyto:
Kultivace zdravých a nádorových buněčných linií odvozených z karcinomu prostaty a prsu
Charakterizace buněčných linií a studium jejich invazivity, studium cytotoxicity zinku
Změna exprese genu pro metalothionein v nádorové prsní linii a porovnání invazivity s netransfekovanou linií
Aplikace nádorových prsních buněk pokusným zvířatům, sledování růstu nádorů a následná charakterizace nádorové masy
24
4
MATERIÁL A METODIKA
4.1 Materiál 4.1.1
Chemikálie
Médium RPMI 1640 (PAA, Rakousko), FBS- fetální bovinní sérum (PAA, Rakousko), ATB- penicillin/ streptomycin (PAA, Rakousko), 1 mM pyruvát sodný (PAA, Rakousko), glukóza (PAA, Rakousko), EDTA- kyselina ethylendiamintetraoctová (PAA, Rakousko), trypsin (PAA, Rakousko), PBS (Invitrogen, USA), matrigel (Sigma- Aldrich, Německo), ZnSO4 (Sigma-Aldrich, Německo), RNA TriPure Isolation Reagent (Roche, Švýcarsko), Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA), RIPA Buffer (Thermo Scientific, USA), RNA LATER (Applied, Biosystems, USA) 4.1.2
Přístrojové vybavení
Inverzní mikroskop NICON ECLIPSE TS100 (Nicon, Japonsko), centrifuga 5810 R (Eppendorf, Německo), CO2 termobox (Sanyo, Schoeller), přístroj na počítání buněk Casy Model TT System (Roche, Švýcarsko), laminární box Clean Air pro práci ve sterilním prostředí (Sanyo, Scholeller), Versa Max tunable microplate reader (Molecular Devices, USA), NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, USA), real-time PCR systém 7500 (Applied, Biosystems, USA), mixing block MB-102 (Alpha Laboratories, Hampshire), xCELLigence „Real-Time Cell Analyzer“ (Roche, Švýcarsko), homogenizátor ultra turrax T8 (IKA, Německo) 4.1.3
Plazmid
K transfekci buněčné linie 4T1byl využit expresní plazmid pMT10 vytvořený na pracovišti Středoevropského technologického institutu Masarykovy Univerzity. Plazmid byl pomnožen v DH5α kmeni E.coli. Plazmid pMT10 obsahuje: 1. inzert: kódující sekvence (ORF = open reading frame) lidského genu MT1A fúzovaná s HA štítkem (HA Tag sekvencí). HA Tag sekvence je úsek DNA kódující hemaglutininovou kotvu užitečnou pro detekci a purifikaci proteinu. 2. reportérový gen: oranžový fluorescenční protein mOrange (excitační a emisní maxima 548nm respektive 562 nm). 25
3. sekvenci zajišťující rezistenci k Ampicilinu 4. počátek replikace: pUC 5. eukaryotický promotor: CAG promotor (kombinace enhancerových sekvencí cytomegaloviru a promotoru pro kuřecí beta-aktin) 6. poly A signál (pA): králičí beta-globinový poly A signál 7. T2A peptid: pokud je klonován mezi geny, umožňuje efektivní výrobu a oddělování proteinů, v tomto případě MT1A a mOrange Struktura transkriptu byla následující: 3´-UTR - mOrange – T2A – MT1A – HA – pA Struktura exprimovaných proteinů byla následující: mOrange-T2A + MT1A-HA
4.2 Metody 4.2.1
Buněčné kultivace
Prsní nádorové buňky 4T1 byly izolovány ze spontánního prsního karcinomu myši BALB/c. Tyto buňky jsou vysoce náchylné k metastázování především do kostí, plic, jater a mozku. Buňky byly získány z Ústavu experimentální biologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity. Dále byly použity dvě prostatické linie: PNT1A a PC-3. Linie PNT1A je odvozena ze zdravé prostatické tkáně a byla získaná od 35letého muže post mortem. Linie PC-3 je odvozena z adenokarcinomu prostaty 62letého může a byla získaná z metastází bederních obratlů. Prostatické linie byly zakoupeny od HPA Culture Collections (Salisbury, UK). Buňky linie 4T1 byly kultivovány v médiu RPMI 1640 doplněným 10 % FBS, 100 U/ml penicillinu a 100 µg/ml streptomycinu, 1 mM pyruvátem sodným a 4,5 g/l glukózy. Buňky linie PNT1A byly kultivovány v médiu RPMI 1640 doplněným 10 % FBS, 100 U/ml penicillinu a 100 µg/ml streptomycinu. Linie PC-3 byla kultivována v médiu HAM´S F12 doplněným 10 % FBS, 100 U/ml penicillinu a 100 µg/ml streptomycinu. Buňky byly uchovávány v CO2 termoboxu (Sanyo, Schoeller) při 37 °C a 5% koncentraci CO2. Při kultivaci byla dále použita EDTA, která na sebe váže Ca2+ a Mg2+, jež se přirozeně vyskytují v kultivačním prostředí. Vyvázáním těchto iontů je ulehčena následná manipulace s buňkami. Trypsin používaný při pasážování buněk byl zakoupen
26
od PAA, Rakousko. Buňky byly kultivovány v plastových kultivačních láhvích o objemu 25 ml nebo na petriho miskách a průměru 10 mm (TPP, Švýcarsko). 4.2.2
MTT
MTT test se používá k určení toxicity látek vůči buněčným liniím. Princip testu je založen na redukci MTT na formazan a hodnotí viabilitu buněk v daném prostředí. MTT látka je žluté vodorozpustné tetrazolium barvivo, které živé buňky metabolizují na fialový formazan. Do 96 jamkové mikrotitrační destičky byla napipetována suspenze buněk, přičemž jamky ve sloupci 1 a 12 obsahovaly pouze čisté médium bez buněk. Na jednu jamku je počítáno s 10 000 buňkami. Takto naplněná destička byla vložena do CO2 termoboxu a buňky se nechali narůst na 70% konfluenci. Po této době byla k buňkám přidána koncentrační řada testované látky. V této fázi byla destička opět uložena na 48 hodin do CO2 termoboxu. Po této inkubační fázi byl odstraněn obsah jamek 1–12 a do jamek bylo napipetováno 200 µl čistého média a 50 µl MTT (5mg/ml destilované vody). Destička byla zabalena do alobalu, jelikož MTT látka se na světle rozkládá, a vložena do CO2 termoboxu na 4 hodiny. Poté byl obsah jamek opět odstraněn a do jamek bylo přidáno 200 µl DMSO a 25 µl glycinového pufru. V takto zhotovené destičce byla změřena absorbance při 570 nm (Versa Max tunable microplate reader). 4.2.3
Real-time monitoring pomocí systému xCELLigence RTCA DP
Real-time monitoring je metoda, která umožňuje nepřetržité sledování buněčné adheze a proliferace, životaschopnosti a cytotoxicity testovaných látek. Informace o růstu buněk, změnách a buněčné smrti jsou získávány během celého experimentu pomocí zlatých elektrod na dně jamek E-plate destičky. Do každé jamky byla na začátku experimentu napipetována buněčná suspenze, přičemž na každou jamku bylo použito 10 000 buněk. Takto připravená destička byla vložena do stanice, která je umístěná v CO2 termoboxu. V růstové fázi buněk byla poté přidána testovaná látka v koncentrační řadě a destička byla opět vložena do stanice. Systém zaznamenává data v námi zvolených intervalech a výstupem tohoto přístroje jsou růstové křivky. 4.2.4
Transfekce prsní linie 4T1
Buňky byly kultivovány v 75 ml kultivačních lahvích (TPP, Švýcarsko) na 70% konfluenci. Médium bylo odsáto a buňky byly dvakrát promyty fosfátovým pufrem. Ná27
sledně bylo k buňkám přidáno 10 ml čerstvého média. Plazmid pMT10 (22,5 µl o koncentraci 3500 ng/µl) byl rozsuspendován v 900 µl 150mM NaCl a bylo přidáno 67,5 µl PEI (polyethylenimin 1 mg/ml). Vše bylo promícháno a směs se nechala inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě. Následně byla směs s plazmidem přidána k buňkám do média. V CO2 termoboxu byly buňky inkubovány po dobu 24 hodin. Následně byla hodnocena úspěšnost transfekce pomocí fluorescenčního mikroskopu. Transfekované buňky budou dále označovány jako buňky 4T1t. 4.2.5
Buněčná invazivita a migrace s použitím systému xCELLigence RTCA DP
K analýze byl použit systém xCELLigence RTCA DP v kombinaci s CIM (Cell Invasion and Migration) destičkami. Tento systém umožňuje nepřetržitě monitorovat postup buněk z horní části destičky přes porézní membránu směrem do spodní části destičky. Na spodní straně membrány jsou mikroelektrody, které zaznamenávají postup buněk. Z petriho misky, na které byly buňky narostlé na 60–80% konfluenci bylo odsáto médium a miska byla propláchnuta 2 ml média bez séra, které bylo nahřáté na 37 ºC. K buňkám bylo přidáno 10 ml média bez séra a buňky byly vloženy zpět do CO2 termoboxu k vyhladovění. 16 jamková destička byla pomyslně rozdělena na dvě části, jedna část byla použita na studium migrace a druhá na studium invazivity buněk. K analýze buněčné invazivity byl použit matrigel (Sigma- Aldrich, Německo), který byl naředěn v poměru 1:40 s vychlazeným kultivačním médiem bez séra. Do osmi jamek horní části destičky bylo napipetováno 50 µl naředěného matrigelu a následně bylo 30 µl odpipetováno, tak aby v jamce zbylo jen 20 µl matrigelu. Pro migrační analýzu byla horní část destičky ponechána bez matrigelu. Destička byla poté vložena do CO2 termoboxu a matrigel se nechal 4 hodiny polymerovat. Do spodní destičky bylo napipetováno 178 µl média se sérem či bez něj dle příslušné buněčné linie. Sérum zde působí jako chemoatraktant. Horní část destičky byla spojena se spodní části a do každé jamky horní části destičky bylo napipetováno 30 µl média bez séra. Takto připravená destička byla vložena do CO2 termoboxu a hodinu se nechala temperovat. Z petriho misek s buňkami bylo odsáto bezsérové médium a buňky byly propláchnuty 2 ml EDTA. Následně byla k buňkám opět přidána EDTA a misky byly vloženy na tři minuty do termoboxu. Po této inkubaci byly buňky spláchnuty z povrchu misky pomocí pipety a buněčná suspenze byla přenesena do centrifugační zkumavky. Suspenze byla následně centrifugována při 300 g a 22 ºC po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn a buňky byly rozsuspen28
dovány v adekvátním objemu bezsérového média. Byla spočítána koncentrace buněk a buňky byly naředěny na koncentraci 7,5 × 105 buněk na 1 ml média. Do všech jamek destičky bylo nakonec napipetováno 100 µl naředěné buněčné suspenze a destička byla vložena do stanice a bylo spuštěno vlastní měření. Relativní změna impedance (buněčný index) byla měřena v intervalu 15 minut po dobu několika hodin. 4.2.6
Izolace RNA z buněk a reverzní transkripce
Pro izolaci RNA z buněčných kultur byl použit High pure total RNA izolační kit (Roche, Švýcarsko). Médium bylo odsáto z krabiček a buňky byly propláchnuty ledovým PBS. Poté byly buňky seškrábnuty a ve zkumavkách centrifugovány při 20 800 g, 5 minut při teplotě 4 °C. Následně byla provedena vlastní izolace dle pokynů výrobce. Vyizolovaná DNA byla následně použita pro syntézu cDNA. Celková RNA (600 ng) byla přepsána pomocí Transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche, Švýcarsko) dle návodu výrobce. 4.2.7
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z buněk
Připravená cDNA (20 µl) byla zředěna destilovanou vodou prostou RNáz na objem 100 µl a 5 µl bylo analyzováno pomocí 7500 real-time PCR systém (Applied Biosystems). Q-PCR byla provedena v triplikátech s využitím TaqMan genové expresní eseje. Amplifikovaná DNA byla analyzována srovnávací metodou Ct pomocí β-aktinu (Hs 00185826_m1 Actb, Mm 00607939_s1 Actb) jako endogenní kontroly pro geny MT1 (Hs 00185826_m1 Mt1, Mm 00496660_g1 Mt1) a MT2 (Hs 00794796_m1 Mt2, Mm 04207591_g1 Mt2). Q-PCR byla provedena za následujících podmínek: celkový objem 20 µl, počáteční inkubace 50 °C/2 min, následující denaturace 95 °C/10 min- celkem 45 cyklů 95 °C/15 sec, 60 °C/1 min. 4.2.8
Pokusná zvířata
Šest až osm týdnů staré myši (Mus musculus), samice BALB/c (hmotnost 21–27 g), byly chovány v prostředí s řízeným světelným a ventilačním režimem. Voda i krmivo bylo zvířatům přístupné ad libitum. Při pokusech byly dodržovány veškeré zásady pro práci s pokusnými zvířaty dle pokynů Evropského společenství. Pokusy byly prováděny na základě schváleného projektu pokusu č. 23473/2010-30. Zvířata byla rozdělena do čtyř skupin po osmi samicích. První skupina sloužila jako kontrola. Zvířatům ve druhé 29
skupině byl průběžně intraperitoneálně (i.p.) aplikován zinek v celkové dávce 150 mg/kg ZnSO4, která byla rozdělena do čtyř dávek ve schématu: 1. týden dávka 25 mg/kg, 2. týden dávka 50 mg/kg, 3. týden dávka 50 mg/kg a 4. týden dávka 25 mg/kg ZnSO4. Třetí a čtvrté skupině myší byla v den zahájení experimentu aplikována suspenze prsních nádorových buněk linie 4T1, přičemž čtvrtá skupina byla poté také suplementována zinkem v celkové dávce 150 mg/kg ZnSO4. 4.2.9
Aplikace nádorových buněk 4T1 zvířatům
Buňky byly kultivovány na 70% konfluenci v 25 ml plastových kultivačních láhvích. Po odsátí média a následném promytí EDTA a trypsinem byly buňky spláchnuty do kultivačního média a suspenze centrifugována při 800 g, 4 °C, 7 minut (Eppendorf, Německo). Supernatant byl odsát a peleta buněk byla rozsuspendována v PBS. Buňky byly spočítány pomocí Casy Model TT Systému (Roche, Švýcarsko) a následně bylo odebráno množství potřebné k aplikaci myším. Nádorové buňky byly myším aplikovány v celkové anestezii (1% narkamon + 2% rometar v dávce 0,5 ml na 100 g váhy) v množství 1 × 105 v 20 µl PBS a Matrigelu v poměru 1:1 do čtvrtého struku mléčné žlázy (pars abdominalis) viz obrázek č. 8.
30
Obrázek 8: Místo aplikace nádorových buněk. Nádorové buňky 4T1 byly aplikovány do čtvrtého mléčného struku (pars abdominalis). Upraveno dle http://www.informatics.jax.org/cookbook/
4.2.10 Sledování růstu nádoru a ukončení experimentu V průběhu experimentu byly všechny čtyři skupiny dvakrát týdně kontrolovány a byl sledován růst nádoru. V místě aplikace byla pomocí posuvného měřítka měřena délka a šířka nádoru a bylo prováděno také kontrolní vážení (viz. Přílohy, tabulka A). Experiment byl ukončen po měsíčním sledování. Myši byly uvedeny do celkové anestezie (1% narkamon+ 2% rometar v dávce 0,5 ml na 100 g váhy) a byla jim do eppendorfových zkumavek s 60 µl 0,5 M EDTA odebrána veškerá krev, která byla poté zamražena na 80 °C. Následně byla přestřižena páteř a mícha a odebrány orgány (plíce, játra, slezina, ledviny, mozek.) U nádorových skupin byl odebrán také primární nádor. Všechny tkáně byly rozděleny na dvě skupiny. Tkáně z první skupiny na analýzu proteinů byly vloženy do odběrových zkumavek a zamraženy na -80 °C. Tkáně z druhé skupiny byly vloženy do odběrových zkumavek obsahující RNA later a uloženy do lednice pro pozdější izolaci RNA.
31
4.2.11 Izolace RNA z tkání a reverzní transkripce Pro izolaci RNA ze tkání byl použit TriPure Isolation Reagent kit. Vzorky tkáně byly před homogenizací nakrájeny na malé kousky o hmotnosti 20 mg a byly doplněny 200 µl TriPure Isolation reagencie. Následně byla provedena důsledná homogenizace vzorku. Poté byl vzorek inkubován 5 minut při laboratorní teplotě (23 °C). V této fázi dochází k disociaci nukleoproteinových komplexů, což je důležité pro následnou čistotu vzorku. Po inkubaci bylo k vzorku přidáno 40 µl čistého chloroformu, vzorek byl 15 sekund vortexován a inkubován 15 minut při laboratorní teplotě. Dalším krokem byla centrifugace vzorku při 10 600 g, 15 min, 2 °C. Horní vrstva byla odebrána do čisté mikrozkumavky a bylo přidáno 100 µl izopropanolu. Vzorek byl promíchán, nechal se inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě a následně byl centrifugován při 10 600 g, 10 min, 2 °C. Supernatant byl odstraněn a pelet byl promyt 200 µl 75% etanolem. Po následné centrifugaci při 8 400 g, 5 min, 2 °C byl odstraněn supernatant, pelet se nechal vyschnout a poté byl rozsuspendován v 50 µl vody prosté RNázy. Následovala 15 minutová inkubace vzorku při 58 °C, promíchání a stanovení koncentrace RNA pomocí přístroje nanodrop. Izolovaná RNA byla použita pro syntézu cDNA pomocí first strand cDNA synthesis kit (Roche, Switzerland). 4.2.12 Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (q-PCR)- cDNA z tkání Připravená cDNA (20 µl) byla zředěna destilovanou vodou prostou RNáz na objem 100 µl a 5 µl bylo analyzováno pomocí 7500 real-time PCR systém (Applied Biosystems). Q-PCR byla provedena v triplikátech s využitím TaqMan genové expresní eseje. Amplifikovaná DNA byla analyzována srovnávací metodou Ct pomocí β-aktinu (Mm 00607939_s1 Actb) jako endogenní kontroly pro geny MTF-1 (Mm 00485274_m1 Mtf1), p53 (Mm 01731290_g1 Trp53), MT1 (Mm 00496660_g1 Mt1) a MT2 (Mm 04207591_g1 Mt2). Q-PCR byla provedena za následujících podmínek: celkový objem 20 µl, počáteční inkubace 50 °C/2 min, následující denaturace 95 °C/10 min- celkem 45 cyklů 95 °C/15 sec, 60 °C/1 min. 4.2.13 Příprava buněčných lyzátů Pro přípravu buněčných lyzátů bylo použito 20 mg vzorku nakrájeného na malé kousky. Pro analýzy byly připraveny dva druhy lyzátů: tepelné lyzát a RIPA lyzát. V případě RIPA lyzátu bylo ke vzorku tkáně přidáno 200 µl RIPA lyzačního pufru s přídavkem 32
inhibitoru proteináz a vzorek byl důkladně homogenizován. Následně byl vzorek centrifugován při 20 800 g, 30 minut, 4 °C. Supernatant byl odebrán do čisté zkumavky a zamražen na -80 °C pro následné stanovení proteinů. V případě tepelného lyzátu bylo ke vzorku přidáno 200 µl fosfátového pufru a vzorek byl homogenizován. Následně byl vzorek zahřán na 99 °C po dobu 15 minut, aby došlo k denaturaci proteinů. Po této denaturaci ve vzorku zůstanou pouze termostabilní proteiny, mezi které patří i MT. Po denaturaci vzorku byla provedena centrifugace při 20 800 g, 30 minut, 4 °C a supernatant byl uložen při teplotě -80 °C pro další analýzy. 4.2.14 Stanovení proteinů Celkové množství proteinů v lyzátech bylo stanoveno pomocí Pierce BCA Protein Assay Kit. Standard přiložený výrobcem (roztok BSA o koncentraci 2000 µg/ml) byl naředěn dle návodu výrobce na koncentrace: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml , 125 µg/ml a 25 µg/ml. Dále byl připraven BCA pracovní roztok smícháním roztoků BCA reagent A a BCA reagent B v poměru 50:1 v množství potřebném pro analýzu. Do 96 jamkové mikrotitrační destičky bylo napipetováno 10 µl standardu či vzorku a přidáno 200 µl BCA pracovního roztoku. Destička se nechala inkubovat 30 minut při teplotě 37 °C a poté byla zchlazena na pokojovou teplotu. Následně byla změřena absorbance při 562 nm na přístroji Versa Max tunable microplate reader od firmy Molecular Devices, jako blank byla použita voda. Koncentrace vzorků byla následně vypočítána z rovnice regrese získané z kalibrační křivky po proměření absorbancí koncentrační řady standardu. 4.2.15 Stanovení MT pomocí Dot Blotu Na nitrocelulózovou membránu bylo naneseno 1,5 µl jednotlivých vzorků tepelných lyzátů a membrána se nechala 15 minut zaschnout. Následně byla membrána hodinu blokována v 5% mléce s Tween 20 (5 g nízkotučného sušeného mléka na 100 ml vody s 20 µl Tween 20). Membrána byla poté opláchnuta PBS s Tween 20. Membrána byla následně zalita 10 ml mléka s 10 µl primární protilátky proti myšímu MT (králičí polyklonální IgG, Santa Cruz Biotechnology, USA). Membrána byla přes noc inkubována při 4 °C. Druhý den byla membrána 20 minut inkubována při laboratorní teplotě a následně čtyřikrát opláchnuta PBS. Následně byla membrána zalita 10 ml mléka s 10 µl sekundární protilátky konjugovanou s křenovou peroxidázou (prasečí protilátka proti 33
králičímu IgG+HRP, DakoCytomation, Dánsko). Při laboratorní teplotě byla poté membrána hodinu inkubována na třepačce. Následně byla membrána čtyřikrát po 15 minutách oplachována v PBS a jednou 10 minut v destilované vodě. Membrána byla poté položena na potravinovou fólii a inkubována ve tmě s 2 ml luminol reagentu (Western Blotting Luminol Reagent, Santa Cruz Biotechnology, USA) po dobu 5 minut. Membrána byla překryta filmem s fotoreaktivní vrstvou (Medical X-ray CP-BU Film, Agfa, Belgie) a ponechána 4 minuty. Nakonec byl film vyvolán (Manual fixing bath G354, manual developer G150, Agfa, Belgie). Membrány byly posléze digitalizovány na přístroji Genius Classic BIO (Syngene, MD, USA), z kalibrační křivky standardu MT o koncentraci 5 µg/µl byla odečtena fluorescence vzorků v softwaru GeneTools 4 (Syngene, MD, USA). 4.2.16 Statistická analýza Všechna data byla testována na normalitu pomocí vizuální aspekce histogramů a pomocí Kolmogorov-Smirnov testu adaptovaného dle Lillieforse, data s log-normálním rozložením dat byla zlogaritmována. Pro porovnání proměnných byla použita faktoriální analýza rozptylu, pro porovnání více proměnných také Bonferroniho post-hoc test. Pro analýzy závislostí byla použita korelace podle Pearlsona. Pokud není zmíněno jinak, rozdíl na hladině alfa < 0.05 byl považován za statisticky signifikantní. Pro testování byl použit software Statistica 10 (StatSoft, CA, USA).
34
5
VÝSLEDKY
5.1 Výsledky MTT testů Pro stanovení cytotoxicity zinku na buněčné linie byl použit MTT test. Aplikace zinku byla provedena po 48 hodinách od nasazení buněk do mikrotitrační destičky. Byly použity následující koncentrace zinku: 0, 25, 50, 75 a 100 µM. Z obrázku 9 je patrné, že u prostatické buněčné linie PNT1A (kontrolní linie) nedocházelo ke změnám absorbance, efekt přidaného zinku neměl tedy žádný vliv na životaschopnost buněk. Naopak u nádorových buněk PC-3 a 4T1 dochází po přidání zinečnatých iontů ke snížení viability buněk. U linie PC-3 docházelo k výraznému snížení viability u koncentrace 75 µM. U linie 4T1 můžeme pozorovat snížení životaschopnosti buněk již u koncentrace 50 µM. Dle výsledků MTT testu byly stanoveny následující hodnoty IC50: u linie PNT1A byla stanovena hodnota 199,5 µM, u linie PC-3 hodnota 86 µM a u prsní linie 4T1 byla stanovena hodnota 83,7 µM.
Obrázek 9: Výsledky MTT testu prostatických linií PNT1A a PC-3 a prsní nádorové linie 4T1. Z grafu je patrné, že prostatická linie PNT1A na aplikaci zinku nereagovala. U nádorových linií došlo ke snížení viability.
5.2 Real-time monitoring pomocí xCELLigence systému Real-time monitoring byl obdobně jako MTT test použit ke stanovení cytotoxicity zinku na jednotlivé buněčné linie. V čase 24 hodin po nasazení buněk do destičky byla u všech linií provedena aplikace zinku v koncentracích 0, 25, 50, 75 a 100 µM. V době 35
aplikace byla relativní impedance u prostatických linií poloviční, než tomu bylo u prsní nádorové linie. Impedance byla měřena po dobu 180 hodin a poté byl experiment ukončen. Z obrázku 10 je patrné, že u kontrolní prostatické linie PNT1A neměl zinek žádný vliv na viabilitu buněk ani v nejvyšší koncentraci (100 µM). Na obrázku 11 vidíme růstové křivky nádorové prostatické linie PC-3. U této linie dochází po přidání zinku ke smrti buněk již v koncentraci 50 µM. U prsní nádorové linie dochází ke snížení viability a zastavení růstu buněk taktéž při koncentraci 50 µM (obrázek 12). U jednotlivých linií byly opět stanoveny hodnoty IC50. U linie PNT1A byla stanovena hodnota 150,8 µM, u linie PC-3 byla stanovena hodnota 55,5 µM a linie 4T1, kde je hodnota IC50 52,8 µM.
Obrázek 10: Růstové křivky „zdravé“ prostatické linie PNT1A po přidání zinečnatých iontů v koncentracích 0–100 µM. Můžeme vidět, že tato linie nebyla přídavkem zinku nijak ovlivněna. Byla stanovena hodnota IC50 150,8 µM.
36
Obrázek 11: Růstové křivky nádorové prostatické linie PC-3 po přidání zinečnatých iontů v koncentracích 0–100 µM. Zde je patrné, že již při koncentraci 50 µM dochází k usmrcení buněk. Byla stanovena hodnota IC50 55,5 µM.
Obrázek 12: Růstové křivky nádorové prsní linie 4T1 po přidání zinečnatých iontů v koncentracích 0–100 µM. U této linie dochází ke snížení viability u koncentrace 50 µM. Byla stanovena hodnota IC50 52,8 µM.
5.3 Invazivita a migrace buněčných linií Pro analýzu migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A byl použit přístroj xCELLigence RTCA (Real Time Cell Analyser) DP v kombinaci s destičkami CIM 16 (Cell Invasion and Migration). Migrující buňky, které jsou v kontaktu s membránou, zvyšují relativní impedanci. Pro studium chemotaktické migrace bylo do spodní části destičky přidáno 10% FBS jako chemoatraktant (obrázek 13), v případě chemokinetické migrace bylo 37
médium ponecháno bez séra (obrázek 14). Chemokineze je náhodný pohyb buněk v přítomnosti rovnoměrně distribuovaných rozpustných faktorů. Chemotaxí je myšlena směrovaná migrace buněk, jejíž směr je dán koncentračním gradientem rozpustných faktorů. Z naměřených dat jsme zjistili, že buněčná linie PC-3 dosahuje vyšších hodnot relativní impedance ve srovnání s ostatními analyzovanými liniemi, a to zejména při použití chemoatraktantu, což ukazuje na zvýšenou migrační aktivitu těchto buněk.
Obrázek 13: Analýza chemotaktické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzovány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 8 hod. Pro monitorování chemotaktické migrace bylo do spodní části destiček přidáno 10% FBS.
Obrázek 14: Analýza chemokinetické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzovány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 8 hod.
38
Pro analýzu invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A byl použit přístroj xCELLigence RTCA DP v kombinaci s destičkami CIM 16, ve kterých bylo dno horní části destiček pokryto Matrigelem, který simuloval bazální membránu (obrázek 15 a 16). Pro studium chemotaktické invazivity bylo do spodní části destičky přidáno 10% FBS jako chemoatraktant. Relativní impedance buněk PC-3 byla oproti ostatním testovaným buněčným liniím (u kterých nedocházelo k nárůstu impedance) mírně zvýšena až po 20 hod pouze v případě chemotaktické invazivity.
Obrázek 15: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzovány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 24 hod. Membrány v jamkách horní destičky byly pokryty vrstvou Matrigelu. Pro monitorování chemotaktické invazivity bylo do spodní části destiček přidáno 10% FBS.
39
Obrázek 16: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly nasazeny v hustotě 75 000 buněk na jamku do destiček CIM 16 v médiu bez séra a analyzovány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 24 hod. Membrány v jamkách horní destičky byly pokryty vrstvou Matrigelu.
Kromě buněčné migrace a proliferace může přispívat k nárůstu relativní impedance také zvýšená adheze buněk k povrchu detektoru. Abychom otestovali také míru adheze buněk na elektrody destičky, byly všechny buněčné linie nasazeny v koncentraci 10 000 buněk na jamku do destiček E- plate, která se vyznačuje stejným povrchem elektrod jako destičky CIM 16. Buňky byly monitorovány po dobu 6 hodin v 15ti min intervalech. Z grafu je patrné, že adheze linií PC-3, 4T1 a 4T1t se mezi sebou výrazně neliší. U linie PNT1A je patrné, že k adhezi dochází značně pomaleji (obrázek 17).
Obrázek 17: Analýza kinetiky adheze buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Buňky byly nasazeny v hustotě 10 000 buněk na jamku do destiček E-plate a analyzovány v xCELLigence RTCA DP v intervalu 15 min po dobu 6 hod.
40
5.4 Stanovení exprese MT1 aMT2 z buněčných lyzátů Na obrázku 18 je znázorněna exprese izoforem MT1 a MT2 v buněčných liniích PNT1A, PC-3 a 4T1. U izoformy MT1 můžeme vidět snížení exprese u linie PC-3, u linie 4T1 nebyla pozorována významná změna. Exprese izoformy MT2 byla výrazně vyšší u obou nádorových linií (PC-3 a 4T1).
Obrázek 18: Exprese izoforem MT1 a MT2 v buněčných liniích
U všech buněčných linií byly stanoveny exprese MT1 a MT2 po aplikaci zinku v následující koncentrační řadě: 0, 25, 50, 75 a 100 µM. Na obrázku 19 jsou znázorněny exprese genu MT1. Nebyly pozorovány žádné signifikantní změny. U linie PNT1A můžeme s rostoucí koncentrací zinku pozorovat jen nepatrné změny v expresi. U linie PC-3 je pozorován trojnásobný nárůst exprese v koncentraci 25 µM a její následné výrazné snížení. U linie 4T1 byl pozorován obdobný trend ve změně exprese (sedminásobné zvýšení) u koncentrace 75 µM.
41
Obrázek 19: Stanovení exprese izoformy MT1 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1.
Na obrázku 20 jsou znázorněny změny exprese MT2 po aplikaci zinku. Můžeme vidět, že u prostatické nádorové linie PC-3 byla v nejvyšší koncentraci zinku (100 µM) 80krát vyšší exprese v porovnání s nulovou koncentrací (p= 0,001). U linie PNT1A bylo pozorováno pouze 9,5násobné zvýšeni exprese MT2 (p= 0,0127) a u linie 4T1 nedocházelo k signifikantním změnám v expresi (p= 0,2047).
42
Obrázek 20: Stanovení exprese izoformy MT2 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1.
5.5 Stanovení exprese MT1, MT2, MTF-1, p53 z tkáňových lyzátů Nejdříve byla analyzována exprese jednotlivých genů (obrázek 21). Exprese sledovaných genů se statisticky významně liší v závislosti na sledované tkáni (p < 0.001). Pro detailní porovnání byl použit Bonferroniho post-hoc test. Z důvodů velkého množství dat budu v následujících kapitolách uvádět pouze statisticky významné výsledky. Vysoká míra exprese byla u všech sledovaných genů pozorována v játrech a ledvinách. Všechny geny vykazovaly obdobné trendy exprese ve všech sledovaných tkáních, kromě mozku. Zatímco exprese MTF-1 a MT1 byla v mozku relativně vysoká, exprese p53 a MT2 byla v porovnání s ostatními tkáněmi na nízké úrovni.
43
Obrázek 21: Exprese genů MTF-1, p53, MT1 a MT2 v jednotlivých tkáních.
5.6 Stanovení MT z tkáňových lyzátů na proteinové úrovni Následně byla analyzována obdobným způsobem hladina MT proteinu (obrázek 22). Byl pozorován rozdíl MT mezi různými tkáněmi, avšak tento rozdíl byl pod hranicí statistické významnosti. Nejnižší hladina byla pozorována u jater a ledvin. U všech tkání ovšem byla pozorována velká variabilita v hodnotách. Co se týče závislostí mezi hladinou MT proteinu a expresemi sledovaných genů, byla prokázána pouze jediná slabá negativní korelace s MT1 (tabulka 1). Závislost mezi hladinou MT a expresí genu MT2 nebyla prokázána.
44
Obrázek 22: Hladina MT na proteinové úrovni v jednotlivých tkáních. Nejnižší hladina MT byla pozorována u jater a ledvin, naopak nejvyšší hladina MT byla u primárního nádoru, plic a mozku. Tabulka 1: Korelace mRNA - MT protein
MTF-1 [2-ddCt] MT (µg/g)
p53 [2-ddCt]
MT1 [2-ddCt]
MT2 [2-ddCt]
-0,2157
-0,1618
-0,2845
-0,1962
p=0,056
p=0,154
p=0,011
p=0,083
5.7 Zobecnění efektu suplementace zinkem a indukce tumoru na všechny tkáně Následně bylo předmětem studie zhodnotit, které faktory ovlivňují expresi sledovaných genů. Je-li suplementace zinkem brána jako samostatný efekt, ovlivňuje signifikantně pouze expresi p53. Signifikantně vyšší hladiny genu p53 byly zjištěny u zvířat nesuplementovaných zinkem (p < 0,009). Naproti tomu, indukce nádoru v organismu způsobila signifikantní změny hladin všech sledovaných genů; myši bez nádoru měly signifikantně vyšší hladinu sledovaných genů (p < 0,003). Při zohlednění obou proměnných společně bylo zjištěno, že u všech sledovaných genů dochází k signifikantnímu zvýšení exprese u těch zvířat, která nebyla suplementována zinkem a zároveň jim nebyl
45
indukován nádor (p < 0,05). Naopak zvířata suplementována zinkem a s indukovaným nádorem měla signifikantně nižší expresi sledovaných genů (p < 0,05).
5.8 Vliv suplementace zinkem, typu tkáně a indukce nádoru Předchozí přístupy přinesly kontroverzní výsledky, proto byly zohledněny všechny efekty dohromady. Z následujících grafů je patrné, že různé tkáně reagují na suplementaci zinkem rozdílně. Obecně lze říci, že u všech tkání, s výjimkou mozkové tkáně, dochází k podobnému fenoménu. V předchozí kapitole byla prokázána nižší hladina exprese u zvířat s indukovaným nádorem. Nicméně, u kombinace suplementace zinkem a indukce tumoru můžeme pozorovat různé hladiny expresí u různých tkání. To, jak se mění exprese, je výrazně závislé právě na typu tkáně. V jaterní tkáni dochází ke statisticky významnému zvýšení exprese obou izoforem MT pouze, mají-li zvířata indukován nádor a jsou suplementována zinkem (obrázek 23). Naopak v ledvinné tkáni zvířat, která jsou suplementována zinkem je hladina MT1 a MT2 genů vyšší bez závislosti na přítomnosti nádoru (obrázek 24). Obě tyto tkáně, u kterých byla prokázána nejvyšší míra exprese všech genů, se tedy výrazně liší ve své reakci na suplementaci zinkem a indukci nádoru.
Obrázek 23: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v jaterní tkáni.
46
Obrázek 24: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v ledvinné tkáni.
U plic nebyla zjištěna žádná nová skutečnost, pouze to co již bylo zmíněno výše: u plic je pozorována nižší exprese genů u zvířat, která byla suplementována zinkem a byl u nich indukován nádor (obrázek 25). Podobný výsledek byl pozorován u tkáně sleziny (obrázek 26).
47
Obrázek 25: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v plicní tkáni.
Obrázek 26: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů ve tkáni sleziny.
48
U mozkové tkáně můžeme vidět zajímavý fenomén: exprese MT2 je vyšší bez závislosti na suplementaci zinkem či indukci nádoru. Exprese genů MTF-1 a p53 klesají oproti ostatním variantám, pouze u zvířat suplementovaných zinkem a bez nádoru (obrázek 27).
Obrázek 27: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v mozkové tkáni.
Dále byla vyhodnocena zvlášť tkáň primárního nádoru, kde nebyly prokázány signifikantní rozdíly v hladinách sledovaných genů mezi zvířaty suplementovanými zinkem a zvířaty nesuplementovanými (obrázek 28).
49
Obrázek 28: Efekt suplementace zinkem na expresi genů ve tkáni primárního nádoru.
Na obrázku 29 je znázorněn efekt suplementace zinku na velikost nádoru. Velikost nádorů u zvířat bez suplementace zinkem byla při kontrolním měření ve 28. dni signifikantně větší (p= 0,04). Po ukončení experimentu byly rovněž nalezeny metastázy, především na slezině, plicích a orgánech GIT.
50
Obrázek 29: Efekt suplementace zinkem na velikost nádoru.
Dále byla analyzována hladina MT v závislosti na všech předchozích parametrech. Nebyly prokázány žádné signifikantní rozdíly v závislosti na uvedených skupinách. Hladina MT na proteinové úrovni se mění pouze v závislosti na typu tkáně, což bylo zmíněno výše. Z uvedeného vyplývá, že sledované tkáně se chovají několika způsoby a lze je rozdělit na několik modelů: model nádor, model nereflektující změny, model játra, model ledviny a obecný model, kam patří mozek, plíce a slezina. Můžeme tedy říci, že na základě změn sledovaných genů jsme schopni na základě genové exprese predikovat, o jakou tkáň jde, resp. obráceně, jsme schopni predikovat, zda dochází v určitém orgánu k reakci na suplementaci zinečnatými ionty či indukci tumorgeneze. Změny exprese genů u jednotlivých modelů jsou zaznamenány v tabulce 2.
51
Tabulka 2: Změny exprese genů u jednotlivých modelů. Žádná změna v expresi je označena —, Ø nestanoveno.
Modelová
Celková úro-
Exprese MT
Exprese MT
Exprese MT
tkáň
veň expresí
při suplemen-
za přítomnosti
za přítomnosti
všech genů
taci zinkem
tumoru
tumoru + suplementace
Obecný model
↓
↓
↓
↓↓
Model nádor
—
—
Ø
Ø
Model ledviny
↑
—
↑
—
Model játra
↑
—
—
↑
52
6
DISKUZE
Před začátkem experimentů byly u všech linií udělány testy viability buněk po přidání zinečnatých iontů. Byly použity dvě metody: MTT testy a real-time monitoring pomocí systému xCELLigence RTCA DP, díky němuž je možné nepřetržité sledování buněk. V době aplikace zinku byl pozorován pomocí xCELLigence systému rozdíl v impedanci mezi prostatickými liniemi a prsní linií. Vzhledem k tomu, že počet buněk v jamce byl na začátku experimentu shodný u všech linií, je tento rozdíl nejspíš způsoben rychlostí dělení buněk nebo velikostí buněk. Z výsledků MTT testu i real-time monitoringu je zřejmé, že prostatická linie PNT1A, na rozdíl od nádorových linií, nereagovala na aplikaci zinku změnami viability. Je známo, že „zdravá“ prostatická tkáň je schopna ve velké míře akumulovat zinečnaté ionty. [21] S nádorovým onemocněním prostata tuto schopnost ztrácí a buňka není schopna vyrovnat se s rostoucí koncentrací zinku, což je potvrzeno i našimi výsledky. Hodnoty IC50 byly stanoveny pro každou metodu zvlášť, přičemž výsledky z real-time monitoringu ukazují nižší hodnoty IC50 než je tomu u MTT testu. Tento nesoulad, jak píše Masařík a kol., může být způsoben změnou morfologie buněk, které jsou adherovány na dně destičky. [66] Buňky tedy nemusí být zinkem usmrceny, ale došlo pouze ke snížení velikosti buněk a tudíž k poklesu impedance. Migraci nádorových buněk lze charakterizovat jako schopnost buněk procházet mezibuněčnou hmotou do tkání sousedících s nádorem. Kdežto invazivita je charakterizována jako průnik nádoru do tkání s ním sousedících, předpokládá uvolnění buňky z mezibuněčných vazeb, motilitu a schopnost degradovat komponenty extracelulární matrix. Také se podílí na schopnosti nádorů metastázovat. Pro posouzení migrace buněk byly použity data naměřená do 8 hod od začátku měření, aby bylo zabráněno falešně pozitivnímu nárůstu relativní impedance v důsledku buněčné proliferace. V případě invazivity jsou buňky nuceny penetrovat přes vrstvu matrigelu, dochází tedy k pozdějšímu nárůstu relativní impedance, proto byla pro posouzení invazivity buněk použita data naměřená do 24 hod od začátku měření. Vazques-Ramirez a spol. udávají, že zvýšená exprese MT u karcinomu prsu je asociovaná s metastatickým potenciálem. [98] Toto tvrzení jsme chtěli ověřit experimentem na nádorových buněčných liniích 4T1 a 4T1t. Linie 4T1t byla transfekována expresním plazmidem, aby bylo dosaženo vyšší exprese MT. Naše výsledky plynoucí ze studia invazivity 4T1 a 4T1t linie tuto skutečnost bohužel nepotvrdily. Měření ukázalo, že míra adheze linií PC-3, 4T1 a 4T1t se mezi sebou výrazně 53
neliší a je tedy velmi pravděpodobné, že zvýšená relativní impedance linie PC-3 v migrační a invazivní analýze v destičkách CIM 16 je skutečně důsledkem vyšší migrační a invazivní aktivity těchto buněk. Naproti tomu adheze buněčné linie PNT1A je výrazně nižší než u ostatních testovaných linií, a proto migrační a invazivní aktivitu PNT1A nemůžeme srovnávat s migrační a invazivní aktivitou linií PC-3, 4T1 a 4T1t. U buněčných linií byly stanoveny exprese genů MT1 a MT2 po aplikaci zinku. Tak jak bylo uvedeno v publikaci Masařík a kol., u linie PC-3 došlo k výraznému zvýšení exprese především genu MT2. [66] U prostatických nádorových buněk je narušena regulace transportu zinku do buněk (zvýšený příjem zinku z extracelulárního prostředí) a tudíž se zvyšuje syntéza MT, aby došlo k vyrovnání hladiny volného zinku v intracelulárním prostředí. U exprese genu MT1 bylo u nádorových linií pozorováno se stoupající koncentrací výrazné zvýšení a následné snížení exprese. Tento jev lze vysvětlit jako obrannou reakci buněk na rostoucí koncentraci zinku, v důsledku vysoké exprese genu však dojde k vyčerpání buněk a jejich smrti. Bylo zjištěno, že jaterní tkáň obsahuje nejvyšší exprese všech sledovaných genů. Vzhledem k významnosti jaterních funkcí to není překvapující zjištění. Zajímavé zjištění však přináší hladina v nádorové tkáni, ta byla u všech sledovaných genů nízká. Neobvykle se chová mozková tkáň, jako jediná vykazuje rozdílné trendy pro různé geny: Zatímco exprese MTF-1 a MT2 je v této tkání vysoká, MT1 a p53 se exprimuje velmi málo. V případě primárního nádoru, sleziny a plic byly pozorovány nízké exprese sledovaných genů, naopak hladina MT proteinu byla u těchto tkání vysoká. Gumulec a kol. (in m.s.) prokázali minimální závislost mezi hladinou mRNA a hladinou výsledného proteinu. Při experimentech s buněčnými liniemi docházelo k přechodnému zvýšení exprese genů mezi různými časovými intervaly. Následně byl pozorován pokles exprese, zatímco hladina proteinu zůstala vysoká. [41] V případě, že exprese genů je snížená a hladina proteinu zvýšená, lze se domnívat, že hladina proteinu dosáhla optimální úrovně a další syntéza mRNA již není potřebná. Tato práce tento fenomén pouze potvrzuje. V rozporu s naším očekáváním byla pozorována signifikantně vyšší hladina exprese všech sledovaných genů u zvířat bez indukce nádoru. Jsou-li zohledněny faktory suplementace zinkem a přítomnost nádoru zároveň, je exprese genů nejvyšší u zvířat nesuplementovaných a bez nádoru. Jelikož však exprese genů byla měřena až na konci celého experimentu je možné, že jsme počáteční zvýšení exprese genů po suplementaci zinkem nezaznamenali. 54
Na úrovni proteinu byl sledován pouze MT a mezi jednotlivými skupinami zvířat nebyl pozorován žádný signifikantní rozdíl. Na proteinové úrovni v závislosti na typu tkáně byly nejvyšší hladiny MT zjištěny v plicní, mozkové a nádorové tkáni. Dle Coyle a kol. je nejvyšší hladina MT proteinu v játrech a ledvinách. [22] V našem experimentu však výsledky nekorelují s tímto tvrzením a tyto tkáně měly naopak signifikantně nejnižší obsah tohoto proteinu. Tento jev lze vysvětlit tím, že k detekci MT byla použita polyklonální protilátka proti všem myším izoformám MT. Nebyl tedy detekován pouze MT1 a MT2, jejichž hladiny jsou nejvyšší v játrech a ledvinách, ale všechny MT izoformy. Jak píše Eckschlager a kol., izoforma MT3 se podílí na udržování homeostázy zinku v neuronech. [28] Aplikací zinku myším jsme narušili rovnováhu zinku v mozkové tkáni, a tudíž došlo ke zvýšení syntézy MT3, což by mohlo mít za následek zvýšení hladiny celkového MT proteinu v mozkové tkáni oproti tkáním ostatním. Výsledky této práce ukazují signifikantní rozdíl mezi velikostí nádoru mezi jednotlivými skupinami. Zvířata, která byla suplementována zinkem, měla nádory menší v porovnání se skupinou, které nebyl zinek podáván. Můžeme tedy říci, že aplikace zinku by mohla mít vliv na zpomalení růstu nádoru. Tyto výsledky potvrzuje i studie Fong a kol. [35] Studie McQuitty a kol., rovněž potvrzuje, že růst nádorů byl omezen v prostředí při zinkové suplementaci, ovšem ještě větší snížení růstu nádorů, oproti kontrolám, pozorovali při zinkové deficienci. [67]
55
7
ZÁVĚR
O metalothioneinu se již delší dobu diskutuje jako o možném nádorovém markeru. Cílem této práce byla především analýza MT a ověření jeho vlivu v patogenezi nádorových onemocnění. Experimenty byly prováděny na buněčných liniích, ale také na experimentálních zvířatech. Analýza byla provedena jak na úrovni expresí genů MT1 a MT2, tak na proteinové úrovni. U zvířecích modelů byla navíc provedena analýza exprese genů p53 a MTF-1. V experimentech na buněčných liniích byla prokázána zvýšená exprese genu MT2 u prostatické nádorové linie PC-3. Tento fakt by mohl sloužit při diagnostice karcinomu prostaty. V experimentech na zvířatech byly pozorovány změny v expresích sledovaných genů v závislosti na druhu tkáně, přičemž nejvyšší exprese byla pozorována v jaterní a ledvinné tkání. V nádorové tkáni se všechny geny exprimovaly nejméně. V jaterní tkáni zvířat s indukovaným nádorem dochází ke zvýšení exprese genů MT1 a MT2 pouze v případě, jsou-li zvířata suplementována zinkem. Hladina MT na proteinové úrovni se rovněž, jako exprese genů, mění v závislosti na druhu tkáně. Velikost nádoru je ovlivněna suplementací zinkem. U zvířat, kterým byl podáván zinek, bylo dosaženo snížení velikosti nádorů.
56
8
PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY
1. ADAM, V.; FABRIK, I.; ECKSCHLAGER, T.; STIBOROVA, M.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Vertebrate metallothioneins as target molecules for analytical techniques. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2010, roč. 29. č. 5, s. 409418. 2. ADAM, V., PETRLOVÁ, J., WANG, J., ECKSCHLAGER, T., TRNKOVÁ, L., KIZEK, R. Zeptomole Electrochemical Detection of MetallothioneinsDepartment of Chemistry and Biochemistry Brno: Mendel University in Brno, 2010. 3. ADAM, Z., VORLÍČEK, J.,. Speciální onkologie. Brno: Vydavatelství Masarykovy univerzity, 2002. 4. ADAM, Z., VORLÍČEK, J., . Obecná onkologie. Brno: Vydavatelství Masarykovy univerzity, 2004. 5. ALLRED, D. C. Commentary: Hormone Receptor Testing in Breast Cancer: A Distress Signal from Canada. Oncologist, 2008, roč. 13. č. 11, s. 1134-1136. 6. ALONSO-GONZALEZ, C.; MEDIAVILLA, D.; MARTINEZ-CAMPA, C.; GONZALEZ, A.; COS, S.; SANCHEZ-BARCELO, E. J. Melatonin modulates the cadmium-induced expression of MT-2 and MT-1 metallothioneins in three lines of human tumor cells (MCF-7, MDA-MB-231 and HeLa). Toxicology Letters, 2008, roč. 181. č. 3, s. 190-195. 7. ANDERSON, W. F.; CHATTERJEE, N.; ERSHLER, W. B.; BRAWLEY, O. W. Estrogen receptor breast cancer phenotypes in the surveillance, epidemiology, and end results database. Breast Cancer Research and Treatment, 2002, roč. 76. č. 1, s. 2736. 8. BADVE, S.; NAKSHATRI, H. Oestrogen-receptor-positive breast cancer: towards bridging histopathological and molecular classifications. Journal of Clinical Pathology, 2009, roč. 62. č. 1, s. 6-12. 9. BAGHERI, P. M.; GOVAERTS, I.; DE LEY, M. Role of metallothionein in differentiation of leukemia cells. Molecular Biology Reports, 2011, roč. 38. č. 5, s. 3017-3022. 10. BARDOU, V. J.; ARPINO, G.; ELLEDGE, R. M.; OSBORNE, C. K.; CLARK, G. M. Progesterone receptor status significantly improves outcome prediction over estrogen receptor status alone for adjuvant endocrine therapy in two large breast cancer databases. Journal of Clinical Oncology, 2003, roč. 21. č. 10, s. 1973-1979. 11. BAY, B. H.; JIN, R. X.; HUANG, J. X.; TAN, P. H. Metallothionein as a prognostic biomarker in breast cancer. Experimental Biology and Medicine, 2006, roč. 231. č. 9, s. 1516-1521. 57
12. BAY, B. H.; JIN, R. X.; JAYASURYA, A. Analysis of metallothionein expression in human cancers. Acta Histochemica Et Cytochemica, 2001, roč. 34. č. 3, s. 171-176. 13. BLINDAUER, C. A.; LESZCZYSZYN, O. I. Metallothioneins: unparalleled diversity in structures and functions for metal ion homeostasis and more. Natural Product Reports, 2010, roč. 27. č. 5, s. 720-741. 14. CALDARELLA, A.; PULITI, D.; CROCETTI, E.; BIANCHI, S.; VEZZOSI, V.; APICELLA, P.; BIANCALANI, M.; GIANNINI, A.; URSO, C.; ZOLFANELLI, F.; PACI, E. Biological characteristics of interval cancers: a role for biomarkers in the breast cancer screening. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2013, roč. 139. č. 2, s. 181-185. 15. CAPASSO, C.; CARGINALE, V.; CRESCENZI, O.; DI MARO, D.; SPAIDACCINI, R.; TEMUSSI, P. A.; PARISI, E. Structural and functional studies of vertebrate metallothioneins: cross-talk between domains in the absence of physical contact. Biochemical Journal, 2005, roč. 391. č., s. 95-103. 16. CAPDEVILA, M.; BOFILL, R.; PALACIOS, O.; ATRIAN, S. State-of-the-art of metallothioneins at the beginning of the 21st century. Coordination Chemistry Reviews, 2012, roč. 256. č. 1-2, s. 46-62. 17. CAREY, L. C.; BERBEE, P. L.; COYLE, P.; PHILCOX, J. C.; ROFE, A. M. Zinc treatment prevents lipopolysaccharide-induced teratogenicity in mice. Birth Defects Research Part a-Clinical and Molecular Teratology, 2003, roč. 67. č. 4, s. 240245. 18. CLARKE, M.; COLLINS, R.; DAVIES, C.; GODWIN, J.; GRAY, R.; PETO, R.; EARLY BREAST CANCER TRIALISTS COLLABORATIVE, G. Tamoxifen for early breast cancer: An overview of the randomised trials. Lancet, 1998, roč. 351. č. 9114, s. 1451-1467. 19. COLE, K. D.; HE, H. J.; WANG, L. L. Breast cancer biomarker measurements and standards. Proteomics Clinical Applications, 2013, roč. 7. č. 1-2, s. 17-29. 20. COLVIN, R. A.; HOLMES, W. R.; FONTAINE, C. P.; MARET, W. Cytosolic zinc buffering and muffling: Their role in intracellular zinc homeostasis. Metallomics, 2010, roč. 2. č. 5, s. 306-317. 21. COSTELLO, L. C.; FRANKLIN, R. B. Zinc is decreased in prostate cancer: an established relationship of prostate cancer! Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2011, roč. 16. č. 1, s. 3-8. 22. COYLE, P.; PHILCOX, J. C.; CAREY, L. C.; ROFE, A. M. Metallothionein: The multipurpose protein. Cellular and Molecular Life Sciences, 2002, roč. 59. č. 4, s. 627-647.
58
23. CUMMINGS, J. E.; KOVACIC, J. P. The ubiquitous role of zinc in health and disease. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 2009, roč. 19. č. 3, s. 215240. 24. DALLINGER, R.; BERGER, B.; HUNZIKER, P. E.; BIRCHLER, N.; HAUER, C. R.; KAGI, J. H. R. Purification and primary structure of snail metallothioneinsimilarity of then-terminal sequence with histones H4 and H2A. European Journal of Biochemistry, 1993, roč. 216. č. 3, s. 739-746. 25. DING, Z. C.; NI, F. Y.; HUANG, Z. X. Neuronal growth-inhibitory factor (metallothionein-3): structure-function relationships. Febs Journal, 2010, roč. 277. č. 14, s. 2912-2920. 26. DOWSETT, M.; HOUGHTON, J.; IDEN, C.; SALTER, J.; FARNDON, J.; A'HERN, R.; SAINSBURY, R.; BAUM, M. Benefit from adjuvant tamoxifen therapy in primary breast cancer patients according oestrogen receptor, progesterone receptor, EGF receptor and HER2 status. Annals of Oncology, 2006, roč. 17. č. 5, s. 818-826. 27. EBERT, M. P. A.; GUNTHER, T.; HOFFMANN, J.; YU, J.; MIEHLKE, S.; SCHULZ, H. U.; ROESSNER, A.; KORC, M.; MALFERTHEINER, P. Expression of metallothionein II in intestinal metaplasia, dysplasia, and gastric cancer. Cancer Research, 2000, roč. 60. č. 7, s. 1995-2001. 28. ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; HRABETA, J.; FIGOVA, K.; KIZEK, R. Metallothioneins and Cancer. Current Protein & Peptide Science, 2009, roč. 10. č. 4, s. 360-375. 29. EGLI, D.; SELVARAJ, A.; YEPISKOPOSYAN, H.; ZHANG, B.; HAFEN, E.; GEORGIEV, O.; SCHAFFNER, W. Knockout of 'metal-responsive transcription factor' MTF-1 in Drosophila by homologous recombination reveals its central role in heavy metal homeostasis. Embo Journal, 2003, roč. 22. č. 1, s. 100-108. 30. EJNIK, J.; SHAW, C. F.; PETERING, D. H. Mechanism of Cadmium Ion Substitution in Mammalian Zinc Metallothionein and Metallothionein alpha Domain: Kinetic and Structural Studies. Inorganic Chemistry, 2010, roč. 49. č. 14, s. 6525-6534. 31. FABRIK, I.; KRIZKOVA, S.; HUSKA, D.; ADAM, V.; HUBALEK, J.; TRNKOVA, L.; ECKSCHLAGER, T.; KUKACKA, J.; PRUSA, R.; KIZEK, R. Employment of electrochemical techniques for metallothionein determination in tumor cell lines and patients with a tumor disease. Electroanalysis, 2008, roč. 20. č. 14, s. 1521-1532. 32. FABRIK, I.; KUKAČKA, J. P., R.; ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; KIZEK, R. Metalothionein a jeho klinický význam. FONS, 2008, roč. 18. č. 2, s. 20-22. 33. FALLER, P. Neuronal growth-inhibitory factor (metallothionein-3): reactivity and structure of metal-thiolate clusters*. Febs Journal, roč. 277. č. 14, s. 2921-2930.
59
34. FLORIAŃCZYK, B.; GRZYBOWSKA, L.; MARZEC, Z. Metallothionein and manganese concentrations in breast cancer and mastopathic tissues. Journal of PreClinical and Clinical Research, 2011, roč. 5. č. 2, s. 63-65. 35. FONG, L. Y. Y.; JIANG, Y. B.; RAWAHNEH, M. L.; SMALLEY, K. J.; CROCE, C. M.; FARBER, J. L.; HUEBNER, K. Zinc supplementation suppresses 4nitroquinoline 1-oxide-induced rat oral carcinogenesis. Carcinogenesis, 2011, roč. 32. č. 4, s. 554-560. 36. GARRETT, S. H.; SENS, M. A.; SHUKLA, D.; FLORES, L.; SOMJI, S.; TODD, J. H.; SENS, D. A. Metallothionein isoform 1 and 2 gene expression in the human prostate: Downregulation of MT-1X in advanced prostate cancer. Prostate, 2000, roč. 43. č. 2, s. 125-135. 37. GOULDING, H.; JASANI, B.; PEREIRA, H.; REID, A.; GALEA, M.; BELL, J. A.; ELSTON, C. W.; ROBERTSON, J. F.; BLAMEY, R. W.; NICHOLSON, R. A.; SCHMID, K. W.; ELLIS, I. O. Metallothionein expression in human breast-cancer. British Journal of Cancer, 1995, roč. 72. č. 4, s. 968-972. 38. GREISEN, P.; JESPERSEN, J. B.; KEPP, K. P. Metallothionein Zn2+- and Cu2+-clusters from first-principles calculations. Dalton Transactions, roč. 41. č. 8, s. 2247-2256. 39. GUMULEC, J.; MASARIK, M.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; HUBALEK, J.; HRABETA, J.; ECKSCHLAGER, T.; STIBOROVA, M.; KIZEK, R. Insight to Physiology and Pathology of Zinc(II) Ions and Their Actions in Breast and Prostate Carcinoma. Current Medicinal Chemistry, 2011, roč. 18. č. 33, s. 5041-5051. 40. GUMULEC, J., MASAŘÍK, M., KŘÍŽKOVÁ, S., BABULA, P., HRABEC, R., ROVNÝ, A., MASAŘÍKOVÁ, M., KIZEK, R. Zinek, jeho transport a metabolismus u karcinomu prostaty- vliv metalotioneinu 41. GUMULEC, J., SZTALMACHOVÁ, M., BALVAN, J., RAUDENSKÁ, M., TANHAUSEROVÁ, V., KNOPFOVÁ, L., POLANSKÁ, H., RUTTKAY-NEDECKY, B., SOCHOR, J., BABULA, P., BRÁZDOVÁ, M., ADAM, V., KIZEK, R., MASAŘÍK, M. Cisplatin-resistant prostate cancer model: differences in antioxidant system, apoptosis and cell cycle. 2013, roč. č., s. 42. GUNES, C.; HEUCHEL, R.; GEORGIEV, O.; MULLER, K. H.; LICHTLEN, P.; BLUTHMANN, H.; MARINO, S.; AGUZZI, A.; SCHAFFNER, W. Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the metal-responsive transcriptional activator MTF-1. Embo Journal, 1998, roč. 17. č. 10, s. 2846-2854. 43. HAYAT, M. J.; HOWLADER, N.; REICHMAN, M. E.; EDWARDS, B. K. Cancer statistics, trends, and multiple primary cancer analyses from the surveillance, epidemiology, and end results (SEER) program. Oncologist, 2007, roč. 12. č. 1, s. 2037.
60
44. HIDALGO, J.; ASCHNER, M.; ZATTA, P.; VASAK, M. Roles of the metallothionein family of proteins in the central nervous system. Brain Research Bulletin, 2001, roč. 55. č. 2, s. 133-145. 45. HOLSTEGE, H.; JOOSSE, S. A.; VAN OOSTROM, C. T. M.; NEDERLOF, P. M.; DE VRIES, A.; JONKERS, J. High Incidence of Protein-Truncating TP53 Mutations in BRCA1-Related Breast Cancer. Cancer Research, 2009, roč. 69. č. 8, s. 3625-3633. 46. CHAN, H. M., CHERIAN, M.G. Mobilization of hepatic cadmium in pregnant rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. , 1993, roč. 120. č., s. 308–314. 47. CHERIAN, M. G.; JAYASURYA, A.; BAY, B. H. Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2003, roč. 533. č. 1-2, s. 201-209. 48. JASANI, B.; SCHMID, K. W. Significance of metallothionein overexpression in human. Histopathology, 1997, roč. 31. č. 3, s. 211-214. 49. JEMAL, A.; BRAY, F.; CENTER, M. M.; FERLAY, J.; WARD, E.; FORMAN, D. Global Cancer Statistics. Ca-a Cancer Journal for Clinicians, 2011, roč. 61. č. 2, s. 69-90. 50. JIN, R. X.; CHOW, V. T. K.; TAN, P. H.; DHEEN, S. T.; DUAN, W.; BAY, B. H. Metallothionein 2A expression is associated with cell proliferation in breast cancer. Carcinogenesis, 2002, roč. 23. č. 1, s. 81-86. 51. JING, L.; WU, Y. L.; WU, J.; ZHAO, J.; ZUO, D. Y.; PENG, S. Q. Peroxiredoxins are involved in metallothionein protection from doxorubicin cardiotoxicity. European Journal of Pharmacology, roč. 659. č. 2-3, s. 224-232. 52. KAGI, J. H. R. Overview of metallothionein. Methods in Enzymology, 1991, roč. 205. č., s. 613-626. 53. KAROTKI, A. V.; VASAK, M. Reaction of human metallothionein-3 with cisplatin and transplatin. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2009, roč. 14. č. 7, s. 1129-1138. 54. KAYAALTI, Z.; ALIYEV, V.; SOYLEMEZOGIU, T. The potential effect of metallothionein 2A-5 A/G single nucleotide polymorphism on blood cadmium, lead, zinc and copper levels. Toxicology and Applied Pharmacology, 2011, roč. 256. č. 1, s. 1-7. 55. KAYAALTI, Z.; MERGEN, G.; SOYLEMEZOGLU, T. Effect of metallothionein core promoter region polymorphism on cadmium, zinc and copper levels in autopsy kidney tissues from a Turkish population. Toxicology and Applied Pharmacology, 2010, roč. 245. č. 2, s. 252-255.
61
56. KAYAALTI, Z.; SAHINER, L.; DURAKOGLUGIL, M. E.; SOYLEMEZOGLU, T. Distributions of interleukin-6 (IL-6) promoter and metallothionein 2A (MT2A) core promoter region gene polymorphisms and their associations with aging in Turkish population. Archives of Gerontology and Geriatrics, 2011, roč. 53. č. 3, s. 354-358. 57. KEPP, K. P. Full quantum-mechanical structure of the human protein Metallothionein-2. Journal of Inorganic Biochemistry, roč. 107. č. 1, s. 15-24. 58. KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.; KIZEK, R. Using of chicken antibodies for metallothionein detection in human blood serum and cadmiumtreated tumour cell lines after dot- and electroblotting. Electrophoresis, 2009, roč. 30. č. 21, s. 3726-3735. 59. KRIZKOVA, S.; FABRIK, I.; HUSKA, D.; ADAM, V.; BABULA, P.; HRABETA, J.; ECKSCHLAGER, T.; POCHOP, P.; DARSOVA, D.; KUKACKA, J.; PRUSA, R.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. An Adsorptive Transfer Technique Coupled with Brdicka Reaction to Reveal the Importance of Metallothionein in Chemotherapy with Platinum Based Cytostatics. International Journal of Molecular Sciences, roč. 11. č. 12, s. 4826-4842. 60. KRIZKOVA, S.; MASARIK, M.; ECKSCHLAGER, T.; ADAM, V.; KIZEK, R. Effects of redox conditions and zinc(II) ions on metallothionein aggregation revealed by chip capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, roč. 1217. č. 51, s. 7966-7971. 61. LACOMBE, J.; MANGE, A.; JARLIER, M.; BASCOUL-MOLLEVI, C.; ROUANET, P.; LAMY, P. J.; MAUDELONDE, T.; SOLASSOL, J. Identification and validation of new autoantibodies for the diagnosis of DCIS and node negative earlystage breast cancers. International Journal of Cancer, 2013, roč. 132. č. 5, s. 1105-1113. 62. LIU, Z. M.; CHEN, G. G.; SHUM, C. K. Y.; VLANTIS, A. C.; CHERLAN, M. G.; KOROPATNICK, J.; VAN HASSELTA, C. A. Induction of functional MT1 and MT2 isoforms by calcium in anaplastic thyroid carcinoma cells. Febs Letters, 2007, roč. 581. č. 13, s. 2465-2472. 63. LOEBUS, J.; PEROZA, E. A.; BLUTHGEN, N.; FOX, T.; MEYERKLAUCKE, W.; ZERBE, O.; FREISINGER, E. Protein and metal cluster structure of the wheat metallothionein domain gamma-E(c)-1: the second part of the puzzle. Journal of Biological Inorganic Chemistry, roč. 16. č. 5, s. 683-694. 64. MARET, W. Fluorescent probes for the structure and function of metallothionein. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2009, roč. 877. č. 28, s. 3378-3383. 65. MARGOSHES, M.; VALLEE, B. L. A cadmium protein from equine kidney cortex Journal of the American Chemical Society, 1957, roč. 79. č. 17, s. 4813-4814.
62
66. MASARIK, M.; GUMULEC, J.; HLAVNA, M.; SZTALMACHOVA, M.; BABULA, P.; RAUDENSKA, M.; PAVKOVA-GOLDBERGOVA, M.; CERNEI, N.; SOCHOR, J.; ZITKA, O.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; KIZEK, R. Monitoring of the prostate tumour cells redox state and real-time proliferation by novel biophysical techniques and fluorescent staining. Integrative Biology, 2012, roč. 4. č. 6, s. 672-684. 67. MCQUITTY, J. T.; DEWYS, W. D.; MONACO, L.; STRAIN, W. H.; ROB, C. G.; APGAR, J.; PORIES, W. J. Inhibition of tumor growth by dietary zinc deficiency. Cancer Research, 1970, roč. 30. č. 5, s. 1387-&. 68. METCALFE, K. A.; FINCH, A.; POLL, A.; HORSMAN, D.; KIM-SING, C.; SCOTT, J.; ROYER, R.; SUN, P.; NAROD, S. A. Breast cancer risks in women with a family history of breast or ovarian cancer who have tested negative for a BRCA1 or BRCA2 mutation. British Journal of Cancer, 2009, roč. 100. č. 2, s. 421-425. 69. MINAMI, T.; ICHIDA, S.; KUBO, K. Study of metallothionein using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2002, roč. 781. č. 1-2, s. 303-311. 70. MOLEIRINHO, A.; CARNEIRO, J.; MATTHIESEN, R.; SILVA, R. M.; AMORIM, A.; AZEVEDO, L. Gains, Losses and Changes of Function after Gene Duplication: Study of the Metallothionein Family. Plos One, roč. 6. č. 4, s. 9. 71. NAGEL, W. W.; VALLEE, B. L. Cell-cycle regulation of metallothionein in human colonic-cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, roč. 92. č. 2, s. 579-583. 72. NORMANNO, N.; RACHIGLIO, A. M.; ROMA, C.; FENIZIA, F.; ESPOSITO, C.; PASQUALE, R.; LA PORTA, M. L.; IANNACCONE, A.; MICHELI, F.; SANTANGELO, M.; BERGANTINO, F.; COSTANTINI, S.; DE LUCA, A. Molecular diagnostics and personalized medicine in oncology: Challenges and opportunities. Journal of Cellular Biochemistry, 2013, roč. 114. č. 3, s. 514-524. 73. OFNER, D.; MAIER, H.; RIEDMANN, B.; BAMMER, T.; RUMER, A.; WINDE, G.; BOCKER, W.; JASANI, B.; SCHMID, K. W. Immunohistochemical metallothionein expression in colorectal adenocarcinoma - correlation with tumor stage and patient survival. Virchows Archiv, 1994, roč. 425. č. 5, s. 491-497. 74. OKUMURA, F.; LI, Y.; ITOH, N.; NAKANISHI, T.; ISOBE, M.; ANDREWS, G. K.; KIMURA, T. The zinc-sensing transcription factor MTF-1 mediates zincinduced epigenetic changes in chromatin of the mouse metallothionein-I promoter. Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms, roč. 1809. č. 1, s. 56-62. 75. PARKIN, D. M.; FERNANDEZ, L. M. G. Use of statistics to assess the global burden of breast cancer. Breast Journal, 2006, roč. 12. č. 1, s. S70-S80. 76. PAUL-PONT, I.; GONZALEZ, P.; MONTERO, N.; DE MONTAUDOUIN, X.; BAUDRIMONT, M. Cloning, characterization and gene expression of a 63
metallothionein isoform in the edible cockle Cerastoderma edule after cadmium or mercury exposure. Ecotoxicology and Environmental Safety, roč. 75. č., s. 119-126. 77. PAVLOU, M. P.; DIAMANDIS, E. P.; BLASUTIG, I. M. The Long Journey of Cancer Biomarkers from the Bench to the Clinic. Clinical Chemistry, 2013, roč. 59. č. 1, s. 147-157. 78. PEDERSEN, M. O.; LARSEN, A.; STOLTENBERG, M.; PENKOWA, M. The role of metallothionein in oncogenesis and cancer prognosis. Progress in Histochemistry and Cytochemistry, 2009, roč. 44. č. 1, s. 29-64. 79. RAKHA, E. A.; REIS, J. S.; ELLIS, I. O. Combinatorial biomarker expression in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, 2010, roč. 120. č. 2, s. 293308. 80. REN, F.; JIANG, H.; SUN, J. L.; HE, L.; LI, W. W.; WANG, Y.; WANG, Q. Cloning, characterization, expression, and copper sensitivity of the metallothionein-1 gene in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Molecular Biology Reports, roč. 38. č. 4, s. 2383-2393. 81. RODRIGUES, P. G.; GONCALVES, L. M.; MAGALHAES, P. J.; PACHECO, J. G.; RODRIGUES, J. A.; BARROS, A. A. Voltammetric analysis of metallothioneins and copper (II) in fish for water biomonitoring studies. Environmental Chemistry Letters, roč. 9. č. 3, s. 405-410. 82. SABOLIC, I.; BRELJAK, D.; SKARICA, M.; HERAK-KRAMBERGER, C. M. Role of metallothionein in cadmium traffic and toxicity in kidneys and other mammalian organs. Biometals, roč. 23. č. 5, s. 897-926. 83. SANO, Y.; ONODA, A.; SAKURAI, R.; KITAGISHI, H.; HAYASHI, T. Preparation and reactivity of a tetranuclear Fe(II) core in the metallothionein alphadomain. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011, roč. 105. č. 5, s. 702-708. 84. SHAIKH, Z. A.; TOHYAMA, C. Urinary metallothionein as an indicator of cadmium body burden and of cadmium-induced nephrotoxicity. Environmental Health Perspectives, 1984, roč. 54. č. MAR, s. 171-174. 85. SHIH, H. A.; COUCH, F. J.; NATHANSON, K. L.; BLACKWOOD, M. A.; REBBECK, T. R.; ARMSTRONG, K. A.; CALZONE, K.; STOPFER, J.; SEAL, S.; STRATTON, M. R.; WEBER, B. L. BRCA1 and BRCA2 mutation frequency in women evaluated in a breast cancer risk evaluation clinic. Journal of Clinical Oncology, 2002, roč. 20. č. 4, s. 994-999. 86. SHIMODA, R.; ACHANZAR, W. E.; QU, W.; NAGAMINE, T.; TAKAGI, H.; MORI, M.; WAALKES, M. P. Metallothionein is a potential negative regulator of apoptosis. Toxicological Sciences, 2003, roč. 73. č. 2, s. 294-300.
64
87. SCHMIDT, C.; BEYERSMANN, D. Transient peaks in zinc and metallothionein levels during differentiation of 3T3L1 cells. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1999, roč. 364. č. 1, s. 91-98. 88. SLAMON, D. J.; CLARK, G. M.; WONG, S. G.; LEVIN, W. J.; ULLRICH, A.; MCGUIRE, W. L. Human-breast cancer - correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2 NEU oncogene. Science, 1987, roč. 235. č. 4785, s. 177182. 89. STUDER, R.; VOGT, C. P.; CAVIGELLI, M.; HUNZIKER, P. E.; KAGI, J. H. R. Metallothionein accretion in human hepatic cells is linked to cellular proliferation. Biochemical Journal, 1997, roč. 328. č., s. 63-67. 90. SUHY, D. A.; SIMON, K. D.; LINZER, D. I. H.; O'HALLORAN, T. V. Metallothionein is part of a zinc-scavenging mechanism for cell survival under conditions of extreme zinc deprivation. Journal of Biological Chemistry, 1999, roč. 274. č. 14, s. 9183-9192. 91. SUTHERLAND, D. E. K.; STILLMAN, M. J. The "magic numbers'' of metallothionein. Metallomics, 2011, roč. 3. č. 5, s. 444-463. 92. TAPIERO, H.; TEW, K. D. Trace elements in human physiology and pathology: zinc and metallothioneins. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2003, roč. 57. č. 9, s. 399411. 93. THEOCHARIS, S. E.; MARGELI, A. P.; KLIJANIENKO, J. T.; KOURAKLIS, G. P. Metallothionein expression in human neoplasia. Histopathology, 2004, roč. 45. č. 2, s. 103-118. 94. THIRUMOORTHY, N.; SUNDER, A. S.; KUMAR, K. T. M.; KUMAR, M. S.; GANESH, G. N. K.; CHATTERJEE, M. A Review of Metallothionein Isoforms and their Role in Pathophysiology. World Journal of Surgical Oncology, 2011, roč. 9. č., s. 95. USHAKOVA, G. A.; KRUCHINENKO, O. A. Peculiarities of the Molecular Structure and Functions of Metallothioneins in the Central Nervous System. Neurophysiology, 2009, roč. 41. č. 5, s. 355-364. 96. VALKO, M.; MORRIS, H.; CRONIN, M. T. D. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry, 2005, roč. 12. č. 10, s. 1161-1208. 97. VALKO, M.; RHODES, C. J.; MONCOL, J.; IZAKOVIC, M.; MAZUR, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. ChemicoBiological Interactions, 2006, roč. 160. č. 1, s. 1-40. 98. VAQUEZ-RAMIREZ, F. J.; GONZALEZ-CAMPORA, J. J.; HEVIAALVAREZ, E.; FERNANDEZ-SANTOS, J. M.; RIOS-MARTIN, J. J.; OTALSALAVERRI, C.; GONZALEZ-CAMPORA, R. P-glycoprotein, metallothionein and NM23 protein expressions in breast carcinoma. Pathology Research and Practice, 2000, roč. 196. č. 8, s. 553-559. 65
99. VASAK, M.; HASLER, D. W. Metallothioneins: new functional and structural insights. Current Opinion in Chemical Biology, 2000, roč. 4. č. 2, s. 177-183. 100. WAALKES, M. P., HARVEY, M.J., KLAASSEN, C.D. . Relative in vitro affinity of hepatic metallothionein for metals. Toxicol. Lett. , 1984, roč. 20. č., s. 33–39. 101. WANG, Y.; WIMMER, U.; LICHTLEN, P.; INDERBITZIN, D.; STIEGER, B.; MEIER, P. J.; HUNZIKER, L.; STALLMACH, T.; FORRER, R.; RULICKE, T.; GEORGIEV, O.; SCHAFFNER, W. Metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) is essential for embryonic liver development and heavy metal detoxification in the adult liver. Faseb Journal, 2004, roč. 18. č. 10, s. 1071-1079. 102. YAP, X. L.; TAN, H. Y.; HUANG, J. X.; LAI, Y. Y.; YIP, G. W. C.; TAN, P. H.; BAY, B. H. Over-expression of metallothionein predicts chemoresistance in breast cancer. Journal of Pathology, 2009, roč. 217. č. 4, s. 563-570. 103. ZORITA, I.; BILBAO, E.; SCHAD, A.; CANCIO, I.; SOTO, M.; CAJARAVILLE, M. P. Tissue- and cell-specific expression of metallothionein genes in cadmium- and copper-exposed mussels analyzed by in situ hybridization and RT-PCR. Toxicology and Applied Pharmacology, 2007, roč. 220. č. 2, s. 186-196.
9
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1: Struktura metalothioneinu MT složený ze dvou domén (α-doména a βdoména). Obrázek 2: Izoformy metalothioneinu a jejich lokalizace v savčím organismu. Obrázek 3: Porovnání sekvencí AMK izoforem MT1 až MT4 u myši. Obrázek 4: Zapojení MT v redoxním cyklu. Obrázek 5: Antiapoptotická role MT zprostředkovaná interakcí s NF-kB. Obrázek 6: Schéma regulace genové exprese MT. Obrázek 7: Metabolizmus těžkých kovů. Obrázek 8: Místo aplikace nádorových buněk. Obrázek 9: Výsledky MTT testu prostatických linií PNT1A a PC-3 a prsní nádorové linie 4T1. Obrázek 10: Růstové křivky „zdravé“ prostatické linie PNT1A po přidání zinečnatých iontů v koncentracích 0–100 µM. Obrázek 11: Růstové křivky nádorové prostatické linie PC-3 po přidání zinečnatých iontů v koncentracích 0–100 µM.
66
Obrázek 12: Růstové křivky nádorové prsní linie 4T1 po přidání zinečnatých iontů v koncentracích 0–100 µM. Obrázek 13: Analýza chemotaktické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Obrázek 14: Analýza chemokinetické migrace buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Obrázek 15: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Obrázek 16: Analýza chemotaktické invazivity buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Obrázek 17: Analýza kinetiky adheze buněk 4T1, 4T1t, PC-3 a PNT1A. Obrázek 18: Exprese izoforem MT1 a MT2 v buněčných liniích Obrázek 19: Stanovení exprese izoformy MT1 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1. Obrázek 20: Stanovení exprese izoformy MT2 u buněčných linií PNT1A, PC-3 a 4T1. Obrázek 21: Exprese genů MTF-1, p53, MT1 a MT2 v jednotlivých tkáních. Obrázek 22: Hladina MT na proteinové úrovni v jednotlivých tkáních. Obrázek 23: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v jaterní tkáni. Obrázek 24: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v ledvinné tkáni. Obrázek 25: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v plicní tkáni. Obrázek 26: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů ve tkáni sleziny. Obrázek 27: Efekt suplementace zinkem a indukce nádoru na expresi genů v mozkové tkáni. Obrázek 28: Efekt suplementace zinkem na expresi genů ve tkáni primárního nádoru. Obrázek 29: Efekt suplementace zinkem na velikost nádoru.
10 SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Korelace mRNA - MT protein Tabulka 2: Změny exprese genů u jednotlivých modelů.
67
11 PŘÍLOHY Seznam příloh: Příloha 1: Publikační aktivita Tabulka A: Přehled hmotností a velikosti nádorů během celého experimentu. Tabulka B: Popisná statistika- játra Tabulka C: Popisná statistika- ledviny Tabulka D: Popisná statistika- plíce Tabulka E: Popisná statistika- mozek Tabulka F: Popisná statistika- slezina Tabulka G: Popisná statistika- primární nádor
Příloha 1: Publikační aktivita Autor a spoluautor 7 vědeckých prací a 5 konferenčních abstrakt indexovaných v databázi Web of Science, suma citací bez autocitací: 14, h-index 3. Výběr z publikací: SZTALMACHOVA, M.; HLAVNA, M.; GUMULEC, J.; HOLUBOVA, M.; BABULA, P.; BALVAN, J.; SOCHOR, J.; TANHAUSEROVA, V.; RAUDENSKA, M.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.; KIZEK, R.; MASARIK, M. Effect of zinc(II) ions on the expression of pro- and antiapoptotic factors in high-grade prostate carcinoma cells. Oncology Reports, 2012, roč. 28. č. 3, s. 806-814. ISSN 1021-335X. SZTALMACHOVA, M.; GUMULEC, J.; CERNEI, N.; HLAVNA, M.; ZITKA, O.; BABULA, P.; ADAM, V.; KIZEK, R.; MASARIK, M. Prostate Specific Antigen, Metallothionein and Caveolin-1 as Markers of Formation and Development of Prostate Carcinoma. Chemicke Listy, 2012, roč. 106. č. 11, s. 1075-1080. ISSN 0009-2770. GUMULEC, J.; RAUDENSKA, M.; HLAVNA, M.; STRACINA, T.; SZTALMACHOVA, M.; TANHAUSEROVA, V.; PACAL, L.; RUTTKAYNEDECKY, B.; SOCHOR, J.; ZITKA, O.; BABULA, P.; ADAM, V.; KIZEK, R.; NOVAKOVA, M.; MASARIK, M. Determination of oxidative stress and activities of antioxidant enzymes in guinea pigs treated with haloperidol. Experimental and Therapeutic Medicine, 2013, roč. 5. č. 2, s. 479-484. ISSN 1792-0981. DOI: 10.3892/etm.2012.822 68
GUMULEC, J.; SOCHOR, J.; HLAVNA, M.; SZTALMACHOVA, M.; KRIZKOVA, S.; BABULA, P.; HRABEC, R.; ROVNY, A.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.; KIZEK, R.; MASARIK, M. Caveolin-1 as a potential high-risk prostate cancer biomarker. Oncology Reports, 2012, roč. 27. č. 3, s. 831-841. ISSN 1021-335X. DOI: 10.3892/or.2011.1587 HLAVNA, M.; RAUDENSKA, M.; HUDCOVA, K.; GUMULEC, J.; SZTALMACHOVA, M.; TANHAUSEROVA, V.; BABULA, P.; ADAM, V.; ECKSCHLAGER, T.; KIZEK, R.; MASARIK, M. MicroRNAs and zinc metabolism-related gene expression in prostate cancer cell lines treated with zinc(II) ions. International Journal of Oncology, 2012, roč. 41. č. 6, s. 2237-2244. ISSN 1019-6439. DOI: 10.3892/ijo.2012.1655 MASARIK, M.; GUMULEC, J.; HLAVNA, M.; SZTALMACHOVA, M.; BABULA, P.; RAUDENSKA, M.; PAVKOVA-GOLDBERGOVA, M.; CERNEI, N.; SOCHOR, J.; ZITKA, O.; RUTTKAY-NEDECKY, B.; KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; KIZEK, R. Monitoring of the prostate tumour cells redox state and real-time proliferation by novel biophysical techniques and fluorescent staining. Integrative Biology, 2012, roč. 4. č. 6, s. 672-684. ISSN 1757-9694. DOI: 10.1039/c2ib00157h MASARIK, M.; GUMULEC, J.; SZTALMACHOVA, M.; HLAVNA, M.; BABULA, P.; KRIZKOVA, S.; RYVOLOVA, M.; JURAJDA, M.; SOCHOR, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Isolation of metallothionein from cells derived from aggressive form of high-grade prostate carcinoma using paramagnetic antibody-modified microbeads off-line coupled with electrochemical and electrophoretic analysis. Electrophoresis, 2011, roč. 32. č. 24, s. 3576-3588. ISSN 0173-0835. DOI: 10.1002/elps.201100301
69
Tabulka A: Přehled hmotností a velikosti nádorů během celého experimentu.
70
1. skupina- váha (g) Směrodatná odchylka 2. skupina- váha (g) Směrodatná odchylka 3. skupina- váha (g) Směrodatná odchylka 3. skupina velikost nádoru (mm2) Směrodatná odchylka 4. skupina – váha (g) Směrodatná odchylka 4. skupina velikost nádoru (mm2) Směrodatná odchylka
Začátek pokusu 26,22 3,28 24,39 2,79 25,73 3,01 -
1. kontrola 26,3 3,41 25,35 2,75 25,73 3,15 -
2. kontrola 26,08 3,54 25,37 2,81 25,9 2,97 21,54
3. kontrola 26,02 3,63 25,84 2,49 25,87 3,17 81,1
4. kontrola 26,41 3,76 26 2,60 26,24 3,54 83,05
5. kontrola 26,59 3,48 25,66 2,72 26,31 3,11 117,1
6. kontrola 26,19 3,48 25,57 2,55 26,63 2,84 174,75
7. kontrola 26,21 3,82 25,99 2,72 27,27 2,86 189,43
8. kontrola 25,69 3,58 25,29 2,49 26,86 3,53 255,48
25,25 2,73 -
24,7 2,59 -
19,31 24,95 2,59 18,93
27,34 25,25 2,52 62,73
24,41 25,31 2,98 73,2
31,06 25,3 2,82 106,8
34,83 26,24 3,37 153,78
30,07 26,17 2,82 181,08
65,43 26,12 3,17 221,7
-
-
14,73
24,11
17,25
28,32
39,77
36,41
60,43
Tabulka B: Popisná statistika- játra Analyzovaný gen MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
Zn2+
Nádor
ne
ne
ne
Tkáň
Počet vzorků
Průměr
Medián
Minimum
Maximum
játra
8
88,837
1,155
0,004
364,065
ne
játra
8
5,807
1,216
0,021
Dolní kvartil
Hodní kvartil
Variance
Směrodatná odchylka
0,252
171,906
24661,437
157,040
26,151
0,293
8,632
84,203
9,176
MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ne
játra
8
5,345
1,275
0,007
25,329
0,251
7,186
78,304
8,849
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ne
játra
8
8,054
1,014
0,001
49,516
0,145
6,297
288,059
16,972
ne ano
ne ne
játra játra
3 8
121,029 1,584
48,592 0,826
14,173 0,002
300,320 6,120
14,173 0,053
300,320 2,394
24405,379 4,453
156,222 2,110
ano
ne
játra
8
1,283
0,469
0,002
5,833
0,156
1,587
3,867
1,966
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
71
MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ne
játra
8
1,892
0,709
0,004
9,267
0,049
2,173
9,903
3,147
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ne
játra
8
5,515
2,908
0,010
26,151
0,131
5,941
76,435
8,743
ano ne
ne ano
játra játra
3 8
29,270 0,914
34,129 0,518
11,879 0,002
41,804 3,500
11,879 0,072
41,804 1,313
241,582 1,403
15,543 1,184
ne
ano
játra
8
0,218
0,113
0,004
0,744
0,036
0,348
0,065
0,254
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ano
játra
8
0,454
0,154
0,005
1,680
0,033
0,787
0,377
0,614
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ano
játra
8
2,474
1,336
0,012
9,722
0,171
3,522
10,702
3,271
ne ano
ano ano
játra játra
4 8
19,043 0,297
12,864 0,084
0,000 0,002
50,445 1,478
6,323 0,033
31,763 0,330
475,054 0,245
21,796 0,495
ano
ano
játra
8
1,581
0,047
0,000
12,156
0,014
0,183
18,264
4,274
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ano
játra
8
3,026
1,611
0,793
8,156
0,915
5,101
7,583
2,754
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ano
játra
8
25,180
13,636
2,312
73,796
6,684
42,346
640,560
25,309
ano
ano
játra
5
10,057
10,663
0,000
20,313
7,755
11,553
53,558
7,318
MT [ug/g]
Tabulka C: Popisná statistika- ledviny Analyzovaný gen MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
Zn2+
Nádor
ne
ne
ne
Tkáň
Počet vzorků
Průměr
Medián
Minimum
Maximum
Dolní kvartil
ledviny
8
9,178
0,020
0,000
69,232
0,004
ne
ledviny
8
0,843
0,060
0,000
4,665
Hodní kvartil
Variance
Směrodatná odchylka
2,071
590,585
24,302
0,003
0,977
2,788
1,670
MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ne
ledviny
8
1,091
0,455
0,006
4,308
0,054
1,697
2,552
1,598
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ne
ledviny
8
3,500
2,826
0,166
8,156
1,615
5,398
7,661
2,768
ne ano
ne ne
ledviny ledviny
4 8
8,771 13,327
10,452 0,012
0,000 0,001
14,183 106,526
4,879 0,008
12,664 0,025
37,610 1418,130
6,133 37,658
ano
ne
ledviny
8
0,034
0,027
0,001
0,082
0,004
0,063
0,001
0,032
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
72
MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ne
ledviny
8
9,810
1,779
0,319
64,950
0,985
3,840
498,195
22,320
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ne
ledviny
8
19,598
0,896
0,091
151,338
0,459
1,321
2833,752
53,233
ano ne
ne ano
ledviny ledviny
4 8
15,501 0,018
17,824 0,015
7,455 0,000
18,902 0,056
12,226 0,008
18,777 0,023
29,491 0,000
5,431 0,017
ne
ano
ledviny
8
0,319
0,097
0,002
1,409
0,018
0,453
0,251
0,501
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ano
ledviny
8
0,042
0,042
0,015
0,069
0,017
0,067
0,001
0,024
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ano
ledviny
8
0,041
0,019
0,004
0,129
0,008
0,070
0,002
0,048
ne ano
ano ano
ledviny ledviny
4 8
13,085 0,011
11,090 0,007
0,000 0,003
30,161 0,033
4,990 0,005
21,181 0,015
157,745 0,000
12,560 0,010
ano
ano
ledviny
8
0,148
0,045
0,000
0,499
0,012
0,286
0,036
0,190
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ano
ledviny
8
1,910
0,181
0,049
13,377
0,081
0,664
21,566
4,644
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ano
ledviny
8
7,926
0,533
0,101
59,968
0,305
0,832
442,259
21,030
ano
ano
ledviny
4
9,124
11,728
0,000
13,041
5,745
12,503
37,421
6,117
MT [ug/g]
Tabulka D: Popisná statistika- plíce Analyzovaný gen MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
Zn2+
Nádor
ne
ne
ne
Tkáň
Počet vzorků
Průměr
Medián
Minimum
Maximum
Dolní kvartil
plíce
8
0,010
0,004
0,000
0,034
0,001
ne
plíce
8
0,249
0,043
0,000
1,092
Hodní kvartil
Variance
Směrodatná odchylka
0,019
0,000
0,013
0,006
0,403
0,148
0,385
MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ne
plíce
8
0,090
0,019
0,002
0,447
0,011
0,106
0,023
0,150
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ne
plíce
8
0,346
0,227
0,028
1,182
0,055
0,495
0,157
0,397
ne ano
ne ne
plíce plíce
4 8
176,293 0,368
68,738 0,002
21,090 0,000
546,607 1,478
21,403 0,000
331,184 0,729
62926,134 0,460
250,851 0,678
ano
ne
plíce
8
0,031
0,016
0,002
0,133
0,004
0,035
0,002
0,043
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
73
MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ne
plíce
8
0,023
0,009
0,000
0,097
0,003
0,030
0,001
0,033
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ne
plíce
8
0,013
0,010
0,000
0,029
0,005
0,023
0,000
0,011
ano ne
ne ano
plíce plíce
3 8
246,058 0,000
213,043 0,000
201,166 0,000
323,965 0,001
201,166 0,000
323,965 0,000
4587,404 0,000
67,730 0,000
ne
ano
plíce
8
0,001
0,001
0,000
0,004
0,001
0,001
0,000
0,001
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ano
plíce
8
0,002
0,001
0,000
0,007
0,000
0,004
0,000
0,003
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ano
plíce
8
0,011
0,002
0,000
0,074
0,000
0,005
0,001
0,025
ne ano
ano ano
plíce plíce
3 8
148,832 0,000
60,950 0,000
58,054 0,000
327,491 0,001
58,054 0,000
327,491 0,000
23941,523 0,000
154,730 0,000
ano
ano
plíce
8
0,001
0,001
0,000
0,002
0,001
0,002
0,000
0,001
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ano
plíce
8
0,000
0,000
0,000
0,001
0,000
0,000
0,000
0,000
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ano
plíce
8
0,001
0,001
0,000
0,004
0,000
0,002
0,000
0,001
ano
ano
plíce
4
112,604
75,983
17,274
281,175
23,945
201,263
14767,467
121,521
MT [ug/g]
Tabulka E: Popisná statistika- mozek Analyzovaný gen MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
Zn2+
Nádor
ne
ne
ne
Tkáň
Počet vzorků
Průměr
Medián
Minimum
Maximum
Dolní kvartil
mozek
5
0,039
0,023
0,001
0,092
0,022
ne
mozek
5
0,008
0,004
0,001
0,019
Hodní kvartil
Variance
Směrodatná odchylka
0,057
0,001
0,036
0,003
0,014
0,000
0,008
MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ne
mozek
5
0,015
0,008
0,001
0,049
0,003
0,014
0,000
0,020
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ne
mozek
5
2,827
0,426
0,228
11,404
0,228
1,849
23,447
4,842
ne ano
ne ne
mozek mozek
3 5
344,733 0,003
436,686 0,002
48,639 0,000
548,875 0,007
48,639 0,001
548,875 0,003
68900,682 0,000
262,489 0,003
ano
ne
mozek
5
0,000
0,000
0,000
0,001
0,000
0,000
0,000
0,000
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
74
MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ne
mozek
5
0,004
0,004
0,001
0,007
0,003
0,005
0,000
0,002
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ne
mozek
5
0,280
0,247
0,095
0,507
0,214
0,335
0,024
0,154
ano ne
ne ano
mozek mozek
3 5
61,633 0,058
58,933 0,009
52,199 0,002
73,768 0,171
52,199 0,002
73,768 0,105
121,773 0,006
11,035 0,077
ne
ano
mozek
5
0,003
0,002
0,000
0,012
0,001
0,003
0,000
0,005
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ano
mozek
5
0,004
0,003
0,002
0,010
0,003
0,004
0,000
0,003
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ano
mozek
5
0,300
0,095
0,081
0,710
0,081
0,532
0,090
0,300
ne ano
ano ano
mozek mozek
3 5
217,313 0,045
155,116 0,036
39,879 0,001
456,945 0,121
39,879 0,033
456,945 0,036
46387,222 0,002
215,377 0,045
ano
ano
mozek
5
0,006
0,003
0,000
0,020
0,002
0,003
0,000
0,008
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ano
mozek
5
0,005
0,004
0,002
0,010
0,003
0,005
0,000
0,003
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ano
mozek
5
0,225
0,127
0,043
0,733
0,093
0,129
0,082
0,286
ano
ano
mozek
4
47,764
15,122
12,132
148,680
12,132
83,396
4534,192
67,336
MT [ug/g]
Tabulka F: Popisná statistika- slezina Analyzovaný gen MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
Zn2+
Nádor
ne
ne
ne
Tkáň
Počet vzorků
Průměr
Medián
Minimum
Maximum
Dolní kvartil
slezina
7
0,250
0,004
0,000
1,734
0,000
ne
slezina
8
0,081
0,013
0,000
0,447
Hodní kvartil
Variance
Směrodatná odchylka
0,006
0,428
0,655
0,001
0,088
0,024
0,154
MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ne
slezina
8
0,156
0,027
0,000
0,916
0,004
0,135
0,099
0,315
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ne
slezina
8
1,290
0,108
0,007
5,217
0,010
2,430
4,418
2,102
ne ano
ne ne
slezina slezina
4 8
85,081 0,002
18,034 0,001
15,644 0,000
288,613 0,007
16,525 0,000
153,637 0,003
18412,700 0,000
135,693 0,002
ano
ne
slezina
8
0,073
0,031
0,000
0,255
0,003
0,133
0,010
0,101
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
75
MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ne
slezina
8
0,221
0,009
0,001
1,008
0,004
0,365
0,155
0,394
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ne
slezina
8
0,149
0,081
0,014
0,499
0,038
0,221
0,028
0,168
ano ne
ne ano
slezina slezina
3 7
17,077 0,000
16,756 0,000
14,866 0,000
19,608 0,001
14,866 0,000
19,608 0,001
5,699 0,000
2,387 0,001
ne
ano
slezina
7
0,009
0,006
0,000
0,028
0,001
0,014
0,000
0,010
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ne
ano
slezina
8
0,021
0,000
0,000
0,151
0,000
0,009
0,003
0,053
MT-2 [2
-ddCt
]
ne
ano
slezina
8
0,102
0,001
0,000
0,806
0,000
0,004
0,081
0,284
ne ano
ano ano
slezina slezina
4 7
139,576 0,000
25,257 0,000
10,846 0,000
496,942 0,001
17,861 0,000
261,290 0,000
56806,571 0,000
238,341 0,000
ano
ano
slezina
7
0,001
0,001
0,000
0,003
0,000
0,002
0,000
0,001
MT [ug/g] MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt] MT-1 [2
-ddCt
]
ano
ano
slezina
8
0,002
0,000
0,000
0,013
0,000
0,002
0,000
0,004
MT-2 [2
-ddCt
]
ano
ano
slezina
8
0,080
0,000
0,000
0,635
0,000
0,001
0,050
0,224
ano
ano
slezina
4
160,364
21,530
15,339
583,060
18,208
302,521
79418,172
281,812
MT [ug/g]
Tabulka G: Popisná statistika- primární nádor
Analyzovaný gen
76
Zn2+
Nádor
MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
ne
ano
ne
ano
MT-1 [2-ddCt]
ne
ano
MT-2 [2-ddCt]
ne
ano
MT [ug/g]
ne
ano
MTF-1 [2-ddCt] p53 [2-ddCt]
ano
ano
ano
ano
MT-1 [2-ddCt]
ano
ano
MT-2 [2-ddCt]
ano
ano
MT [ug/g]
ano
ano
Tkáň primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor primární nádor
Počet vzorků
Průměr
Medián
8
2,125
0,000
0,000
15,944
0,000
0,529
31,315
5,596
8
0,187
0,000
0,000
1,092
0,000
0,200
0,153
0,391
8
0,006
0,004
0,000
0,019
0,001
0,009
0,000
0,006
8
0,040
0,040
0,003
0,089
0,008
0,066
0,001
0,033
3
262,657
94,001
64,003
629,966
64,003
629,966 101412,190
318,453
8
0,003
0,002
0,000
0,012
0,000
0,005
0,000
0,004
8
0,013
0,002
0,000
0,088
0,000
0,007
0,001
0,030
8
0,037
0,010
0,000
0,211
0,002
0,030
0,005
0,072
8
0,123
0,016
0,000
0,756
0,008
0,090
0,067
0,260
4
108,206
59,464
19,432
294,464
23,605
192,806
16444,161
128,235
Minimum Maximum
Dolní kvartil
Hodní kvartil
Variance
Směrodatná odchylka
