Analýza hladin metalothioneinu v krvi u pacientů s karcinomem orofaryngu

Masarykova univerzita v Brně Klinika otorhinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku FN u sv. Anny v Brně Dizertační práce doktorského studia

Analýza hladin metalothioneinu v krvi u pacientů s karcinomem orofaryngu

MUDr. Zuzana Horáková

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat za recenzi a odborné vedení v průběhu doktorandského studia prof. MUDr. R. Kostřicovi, CSc. Za elektrochemickou analýzu krevních vzorků doc. Ing. R. Kizkovi a kolektivu jeho spolupracovníků v Laboratoři molekulární biochemie a bioelektrochemie Ústavu chemie a biochemie Agronomické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univezity v Brně. Za pomoc se statistickým zpracováním souboru děkuji kolegovi MUDr. R. Salzmanovi.

2

Souhrn Karcinomy hlavy a krku jsou nádory s vysokou incidencí, jejichž diagnostika není snadná. Jednou z příčin může být i absence spolehlivého nádorového markeru, který by nalezl uplatnění v klinické praxi. Recentní publikované práce se zabývaly problematikou overexprese metalothioneinu v nádorové tkáni u tumorů rozličných typů i lokalit. V naší prospektivní studie jsme ověřovali hypotézu o možné elevaci metalothioneinu v krvi indukované přítomností zhoubného nádoru. Elektrochemickou metodou jsme analyzovali hladiny metalothioneinu v plné krvi u pacientů se spinocelulárním karcinomem orofaryngu. Výsledky potvrdily signifikantní elevaci metalothionu ve srovnání s kontrolní skupinou zdravých jedinců. Metalothionein lze proto považovat za potenciální diagnostický marker zasluhující další studium.

Summary Head and neck carcinomas are of relatively high incidence and their diagnostics is far from being easy. One of the reasons might be absence of a reliable tumor marker which could be of use in a standard practice. Some recently published studies delt with overexpresion of metallotionein in tumor tissues. In our prospective study we tryed to verify hypothesis on elevation of metallothionein in blood in pacients with spinocellular carcinoma of oropharynx. Achieved results cofirmed significant elevation in comparison with the control group. According to these results we dare to consider metallothionein a potencial diagnostic marker which deserves futher investigation.

3

Obsah Souhrn ........................................................................................................................................ 3 1 Úvod ................................................................................................................................... 5 2 Prognóza nádorů hlavy a krku............................................................................................ 6 3 Nádorové markery.............................................................................................................. 8 4 Metalothionein ................................................................................................................. 10 4.1 Struktura ................................................................................................................... 10 4.2 Genová regulace a indukce ...................................................................................... 13 4.3 Funkce ...................................................................................................................... 15 4.4 MT a protinádorová léčba ........................................................................................ 17 4.5 MT a kancerogeneze ................................................................................................ 18 4.6 Detekční metody ...................................................................................................... 24 5 Cíl práce ........................................................................................................................... 26 6 Vlastní pozorování ........................................................................................................... 26 6.1 Klinický materiál...................................................................................................... 26 6.2 Metodika................................................................................................................... 30 6.3 Výsledky................................................................................................................... 32 7 Diskuse ............................................................................................................................. 38 8 Závěr................................................................................................................................. 43 9 Literatura .......................................................................................................................... 44

4

1 Úvod Při pohledu na přehled nejčastějších příčin úmrtí ve vyspělých zemích zjistíme, že první místo zaujímají kardiovaskulární, následované nádorovými onemocněními. Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) je diagnostikováno cca 11 milionů malignit ročně. Incidence neustále narůstá. Předpokládá se, že v roce 2020 bude činit více než 16 miliónů. Mortalita zhoubných nádorů překročila 6,7 miliónu ročně, což znamená, že přibližně každých pět sekund na zemi umírá jeden člověk na malignitu. Maligní nádory zaujímají mezi ostatními onemocněními mimořádné postavení nejenom pro jejich stále rostoucí incidenci, ale i pro náročnost léčebné péče. Společným cílem komplexní léčebně preventivní péče je v rámci primární prevence snížit incidenci. Dalším, neméně důležitým cílem je zkvalitnění časné diagnostiky nádorového onemocnění. Z těchto důvodů vytvořila WHO v roce 2002 Univerzální program pro kontrolu rakoviny. Jedním z hlavních bodů tohoto programu je „Screening a včasná diagnostika nádorového onemocnění“. V souladu s celosvětovým trendem se do boje proti rostoucí incidenci zhoubných nádorů zapojilo i Ministerstvo zdravotnictví ČR a Česká onkologická společnost vyhlášením programu zaměřeným na pokles výskytu zhoubných onemocnění v české populaci, který se má, kromě jiného, zaměřit na zlepšení včasné diagnostiky, kam náleží i hledání nových potencionálních nádorových markerů.

5

2 Prognóza nádorů hlavy a krku V USA je ročně zjištěno cca 45000 nových nádorů hlavy a krku, v Česku asi 3500 a incidence v posledních desetiletích kontinuálně stoupá. K možnostem diagnostiky a léčby nádorů hlavy a krku se v současnosti obrací velká pozornost.

Přes veškeré úsilí a

implementaci nových terapeutických postupů do klinické praxe se nepodařilo dosáhnout uspokojivých léčebných výsledků. Za posledních 30 let nedošlo k podstatnému poklesu morbidity a mortality. Prognóza patří mezi jednu z nejhorších vůbec. Dlouhodobě se pohybuje na cca 55% pětiletého přežití souhrnně pro všechny malignity hlavy a krku. U lokálně pokročilých, stále však kurabilních nádorů pětileté přežití zůstává na úrovni cca 30%. Prognóza pacienta závisí na mnoha klinickopatologických faktorech (lokalita, velikost tumoru, status lymfatických uzlin, grading, histologie, hloubka invaze, vzdálená diseminace). Jedná se o standardizované parametry, které bývají stanovovány rutinně u každého pacienta před léčbou a jako základní orientační prvky slouží k vytyčení léčebné strategie. (1, 2, 3) Prognostické faktory můžeme dělit na faktory ze strany pacienta a ze strany nádoru. a/Faktory pacienta: Obecně se dává do souvislosti nižší věk pacienta s horší prognózou, přestože tato korelace dosud nebyla jednoznačně potvrzena. Kouření se považuje za negativní rizikový faktor, zvláště potencovaný současným abusem alkoholu. Jedná se nejenom o rizikové faktory, ale současně i negativní prognostické faktory, nejčastěji vysvětlované špatným celkovým stavem pacientů a nižší tolerancí k protinádorové léčbě. b/Faktory nádoru: Anatomická lokalizace je důležitým, ne však nezávislým prognostickým faktorem. Empiricky se potvrdila horší prognóza u některých lokalit nádorů hlavy a krku (spodina dutiny ústní, kořen jazyka, hypofarynx). Velikost tumoru je jednoznačným prognostickým faktorem, což zohledňuje TNM klasifikace. Spolu s hloubkou invaze je určující hodnota T. Metastázy do lokoregionálních lymfatický uzlin jsou nezávislým negativním prognostickým faktorem. Vliv na přežití je zásadní a prognózu pacienta zhoršují cca o 50%. c/Histologické parametry: Množství různých návrhů klasifikace bylo v minulosti stanoveno pro grading. Nejrozšířenější systém dle Thomsona je založen na diferenciaci ( dobře, středně a špatně diferencované nádory). Někdy bývá považován stupeň diferenciace za nezávislý prognostický faktor, zřejmá je korelace s metastatickým potenciálem nádoru ( jednoznačně vyšší u nízce a nediferencovaných typů). Mezi další sledované parametry je možné zařadit perineurální šíření, neoangiogeneze, apoptotický index, mitotický index nebo celulární distribuce DNA. Jejich prognostická validita je však diskutabilní. (4,5)

6

Významnou negativní roli sehrává velká biologická variabilita nádorů. Nádory stejné klasifikace na základě rutinního stanovení TNM a histologie mohou reagovat na stejnou terapii zcela odlišným způsobem. Tato skutečnost by měla být podnětem pro další podrobnější studium biologie nádorů. Adjuvantní markery charakterizující tumory a predikující jejich chování by umožnily přesnější stratifikaci léčby. Raná období jsou často bezpříznaková a diagnostikována bývají převážně onemocnění lokálně pokročilá. Diagnostika stejně jako monitorování poléčeného stavu je limitováno možnostmi klinického vyšetření a zobrazovacích metod. Genetické změny provázející proces kancerogeneze jsou předmětem intenzivního studia. Předpokládáme, že se jedná o mnohastupňový proces akumulace genetických mutací v tumor- supresorových genech (TSG), které umožní nekontrolovatelný nádorový růst. Cílem výzkumu je přesná monitorace změn v genomu buňky pomocí průvodních „markerů“, které by přispěly k rychlejší a snadnější detekci premaligních lézí či raných stádií nádoru a současně by mohly být nositeli prognostické informace. (6,7)

7

3 Nádorové markery Základní definice je velmi obecná. Jako nádorový marker lze označit jakýkoliv znak, který s dostatečnou sensitivitou a specificitou odlišuje nádorový proces, specifickou skupinu nádorů, specifickou vlastnost nádoru atd. Nádorové markery jsou látky převážně proteinového charakteru, které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. Jsou detekovatelné v tkáni zhoubného nádoru (celulární nádorové markery) nebo v tělních tekutinách (humorální nádorové markery). Souvisí s růstem nádoru v organismu, jsou produkovány buď samotným nádorem (s nádorem asociované antigeny), nebo jinými tkáněmi jako odpověď na maligní proces v organismu (indukované nádorové markery). Mohou pronikat do tělesných tekutin, kde se stanovují jejich koncentrace. Koncentrace nádorových markerů má obvykle vztah k typu a rozsahu onemocnění. Jejich specificita, ale hlavně sensitivita jsou limitovány celou řadou faktorů. Většinou negativní nález nevylučuje přítomnost zhoubného nádoru. Přelom a nastartování rozvoje vyšetřování nádorových markerů nastal výzkumem tzv. nádorových antigenů, tj. látek, kterými se liší nádorová buňka od nenádorové. Princip absolutní odlišnosti je těžko splnitelný, protože malé množství těchto antigenů najdeme i u buňky nenádorové. Exprese genetických změn začíná v jedné nebo několika málo buňkách. Jedná se o několikastupňový proces, kdy na chromosomální úrovni dochází k postupnému nahromadění mutací genů kontrolujících proliferaci, diferenciaci a zánik buňky. Chemicky se jedná o skupinu značně heterogenní: proteiny (PSA, CA 125), produkty nádorového metabolismu, RNA, DNA (amplifikace onkogenů, např. c-myc, cyklin D1, n-myc). Základní použití onkomarkerů můžeme rozdělit na stanovení v rámci screeningu, diagnostiky, stanovení prognózy, predikce terapeutické odpovědi nebo monitorování průběhu onemocnění. a/ Screeningové markery - identifikují rizikovou skupinu v asymptomatické populaci. Screening

malignity

znamená

zjištění

přítomnosti

minimálního

asymptomatického

onemocnění. Podmínkou je marker s co nejvyšší, nejméně 80% sensitivitou a specifičností, což nesplňuje téměř žádný marker, V praxi se uplatňují zatím velmi omezeně. b/ Diagnostické markery - pomáhají při přesné diagnostice. Používají se na základě klinické a histopatologické zkušenosti. Diagnostika malignity má podobně vysoké nároky na sensitivitu a specificitu. Příčinou nízké sensitivity bývá jednak nedostatek orgánově specifických markerů (výjimkou je např. PSA u prostaty) a jednak opožděný průnik z nádorové tkáně do cirkulace, ke kterému dochází nezřídka v pozdějších stadiích onemocnění.

8

Příčinou nízké specificity bývá zejm. produkce i nemaligními patologickými procesy v tkáních. Je třeba zdůraznit, že normální hodnoty markerů nevylučují přítomnost malignity a naopak zvýšené hodnoty nejsou jednoznačným důkazem přítomnosti malignity. Určování hladin markerů je nápomocné při zjišťování nádorů u metastáz neznámého prima; markery nejsou orgánově, ale tkáňově specifické. c/Prognostické markery - jsou znaky poskytující informaci o biologické povaze onemocnění. Předléčebné hodnoty mají prognostický význam. Významné zvýšení hladin odpovídá pokročilému onemocnění, korelují s kratšími parametry přežívání. d/ Prediktivní markery předpovídají pravděpodobnost klinické odpovědi na daný terapeutický postup. e/Monitorující markery sledují aktivitu nádorového procesu po prodělané primární terapii. Nejširší možnosti spočívají ve sledování účinnosti léčby. Změny hladin většinou dobře odráží změny biologické aktivity maligní tkáně. Porovnání hladin markerů před a po operaci může poskytnou informaci o rozsahu a efektivnosti operace. V úvahu je nutno vzít poločas markeru, který se většinou pohybuje řádově v několika týdnech. Při dalším sledování se klade větší důraz na monitorací relativních změn hladin než na jejich absolutní hodnoty. Uplatní se především v časné diagnostice recidivy onemocnění. (8,9)

9

4 Metalothionein Metalothionein (MT) patří do superrodiny intracelulárních, kovy vázajících proteinů, ubikvitně přítomných ve všech živých organismech. MT láká pozornost biologů a chemiků vzhledem ke své pozoruhodné chemické struktuře, která podmiňuje jeho specificitu, stabilitu a dynamické chování. Zjištěna byla jeho přítomnost ve všech živých organismech.

U

obratlovců se MT nachází ve všech tkáních, v nejvyšší koncentraci se vyskytuje v játrech, ledvinách a střevě. Extracelulárně byly nízké koncentrace nalezeny v plasmě, moči a žluči. Jeho primární biologická role není zatím zcela objasněna. Zřejmé zatím zůstává, že může plnit mnoho rozlišných funkcí v závislosti na specifických požadavcích organismu. Jeho funkční rozmanitost vyplývá z jeho hlavních vlastností, což je redoxní kapacita a schopnost vázat kovy. Výzkum na savcích potvrdil šíři jeho uplatnění. Pro život se však žádná z funkcí nezdá být nezbytně nutná, jak bylo prokázáno na pokusech s geneticky modifikovanými myšmi zbavenými MT;

nicméně absence MT v organismu hendikepuje probanda v přežití ve

stresových podmínkách. Koncentrace MT v organismu je elevována za mnoha různých patologických i fyziologických podmínek. Dosavadní literární údaje potvrzují, že ke změně koncentrace MT dochází také v souvislosti s výskytem malignity. Tato skutečnost a její mechanismus se stává předmětem dalšího intenzivního studia.

4.1 Struktura MT je přítomen v organismech všech savců a při jejich vzájemném srovnání je patrná velká vývojová stabilita struktury. Molekulová hmotnost se pohybuje od 6500 do 7000 Da. Nejcharakterističtějšími rysy pro molekulární strukturu MT jsou absence aromatických aminokyselin (AK) a vysoký obsah cysteinu, který je uniformě zařazen do peptidického řetězce v neměnných sekvencích. Cystein je v aminokyselinovém složení zastoupen v 2333%. Počet a pozice cysteinových zbytků je stálý. Odlišnost AK, které jsou odpovědné za jednotlivé isoformy, jsou umístěny mimo tyto cysteinové sekvence. Molekula neobsahuje žádné disulfidové vazby, aromatické AK ani histidin.

Četné thiolové –SH skupiny

nezůstávají v molekule MT volné, ale vyvazují divalentní kovy do thiolových klastrů. Jedna molekula MT může současně vázat 7 divalentních nebo 12 monovalentních atomů v jedné molekule. Terciární struktura je charakterizována dvěma doménami, alfa a beta. Obě jsou globulární a podmiňují společný elipsoidní tvar molekuly. V obou doménách polypeptidový řetězec obtáčí spirálně kovové ionty, které jsou vázány výhradně koordinační komplexní

10

thiolovou vazbou přes cysteinové zbytky. Terciální struktura MT je dynamická. Stabilnější alfa doména (C konec) váže čtyři divalentní atomy kovu, a beta doména (N konec) váže pouze tři. Relativní afinita různých kovů k vazbě na MT se liší; pro Cu je asi 1000x silnější než pro Zn. Atomy kovu vázané in vivo na MT jsou málokdy tvořeny pouze jedním prvkem, většinou je v různém poměru zastoupeno více různých kovů. In vivo existují především molekuly MT s relativně nejvyšším podílem vázaného zinku. Snižováním pH se kovy od apometalothioneinu uvolňují. Vazba kovů je reakcí reverzibilní a rychlou. MT se stává donorem kovových iontů pro ligandy jiných intracelulárních proteinů, čímž se široce zapojuje do různých metabolických procesů v buňce. Protein bez navázaných kovových iontů, tzv. apoMT, je degradován mnohem rychleji než ZnMT, resp. CuMT. Zn je z MT rychle uvolňován a je schopný účastnit se na buněčných procesech a indukovat další syntézu MT. Pro větší specifikaci molekuly se užívají termíny ZnMT a CuMT pro MT, který váže pouze jeden kov. Dynamicky se chová i samotná molekula MT ve vztahu k vázaným iontům kovů. Pohyb atomů kovu přes celulární pool MT probíhá třemi cestami: uvolnění kovu současně s degradací proteinu, vzájemná výměna iontů ve vazbě, transfer komplexu protein-kov do jiného kompartmentu buňky, např. lysozymu. (10,11,12) (obr. 1)

Obr. 1 Schéma molekuly metalothioneinu

4.1.1

Isoformy MT zahrnuje multigenní rodinu, která se skládá z 10-12 genů lokalizovaných na

chromozomu 16. Jejich absolutní počet se však v jednotlivých literárních odkazech navzájem odlišuje. Stennard ve své studii uvádí celkem 14 genů, Coyle verifikoval 17 funkčních MT genů na chromozomu 16 kódující isoformy MTI (s indexy A B E F G H X) a MTIIA. Jedním

11

genem jsou kódovány MTIII a IV. Pouze asi polovina genů se exprimuje na proteinové úrovni. DNA obsahuje geny MT –IA, B, C a D tandemově uspořádané. Každý představuje jedinečný regulační mechanismus a jeho indukovatelnost je závislá na tkáni a vývojovém stadiu. Geny MT IC a D jsou pseudogeny, které nejsou exprimovány na proteinovou úroveň. Z nově objevených genů jsou MTIH a MTIX funkční a exprimovatelné, zatímco MTI I J K L jsou nefunkční. MT IA a IIA byly zkoumány na kultuře lidských kožních fibroblastů, extrahována byla jejich mRNA. Potvrzena byla rozdílná indukovatelnost obou isoforem. Odlišná je i bazální úroveň exprese, která je pro MTII několikanásobně efektivnější. MT I představuje asi 50% celkového MT, proto je nízká efektivita jeho exprese kompenzována velkým počtem kódujících genů. (13,14) MT III a IV nejsou ovlivněny indukčními faktory ovlivňující MT I a II. (15)

4.1.2

Tkáňová distribuce MT nacházíme ve všech tkáních v různých koncentracích. Nejvyšší tkáňová

koncentrace MT byla zjištěna v játrech, ledvinách, střevě a pankreatu. Isoformy jsou distribuovány v různém poměru v jednotlivých tkáních a jsou degradovány různou rychlostí. MT může být lokalizován jak v buněčném jádře, tak v cytoplasmě. MT vzhledem ke své malé velikosti může volně procházet do jádra. Předpokládáme, že nukleární retence MT je alespoň závislá na energii. Distribuce není závislá na celkovém obsahu MT v buňce, stejně tak nezáleží na typu a množství vázaných kovů. Rozdílná funkce se předpokládá v závislosti na subcelulární distribuci: ochrana proti oxidativnímu stresu při cytoplasmatické distribuci, ochrana proti cytotoxickému poškození a genová regulace mobilizací Zn pro transkripční faktory při nukleární distribuci. U normálně se dělících buněk byla prokázána distribuce MT v S a G2 v jádře, ve fázi G1 a při přechodu z G1 do S fáze dosahuje maxima cytoplasmatická exprese, v G0 zůstává pouze bazální koncentrace. MT je pravděpodobně součástí mechanismu kontrolované buněčné smrti, apoptosy. V nádorových buňkách je prokázána dominance nukleární lokalizace, MT může být považován za marker proliferace. (16)

12

4.2 Genová regulace a indukce MT I a MTII jsou ubikvitně exprimovány ve všech buňkách. Exprese genů MT I a II je ovlivnitelná širokou škálou různých podnětů. Regulace biosyntézy probíhá primárně na úrovni transkripce, kde elementy DNA odpovídají na regulační transkripční proteiny. (17) Promotery MTI a MTII genů umožňují bazální i indukovanou transkripci. Exprese MT může být ovlivněna ve smyslu aktivace i represe; většina impulsů působí aktivačně. Příkladem represibility exprese může být odpověď na cyclohexamid nebo jiné inhibitory proteosyntesy v experimetálních podmínkách. (obr. 2)

Obr. 2 Schéma indukce regulace exprese MT genu (GRF- glucocorticoid receptor factor; GRE- glucocorticoid response elements; ARE- antioxidant response element; MTF- metal transcription factor; MRE- metal response elements)

4.2.1

Indukce kovy Syntéza MT v játrech je indukovatelná různými kovy, cytokiny a hormony stresu,

stejně jako širokou škálou chemikálií. Za primární induktory se považuje Zn a Cu. Zajímavé je, že netoxické hladiny Cu neindukují MT, přestože je na něj in vivo fyziologicky vázán. Vazba Zn na MTF 1 (metal transcription factor) umožňuje vazbu tohoto proteinu na MRE (metal response elements) promoterové oblasti, která iniciuje transkripci MT genu. MTF1 se standardně vyskytuje v cytoplasmě, při stresu nebo expozici kovům dochází k přesunu do jádra a k vazbě na MRE. Podmínkou vazby MTF1 na MRE je nasycení proteinů Zinc- fingers zinkem. MTF1 přímo odpovídá na hladinu Zn, který aktivuje protein přímou alosterickou

13

interakcí. MTF1 je důležitý v regulaci počtu genů, které se účastní buněčné odpovědi na stres. Koncentrace podmiňující indukci a čas nezbytný k dosažení maxima hladiny se liší mezi jednotlivými kovy ( Zn, Cd, Hg, Cu a Bi). Zn a Cd patří mezi suverénně nejsilnější indukční faktory. Obecné mechanismy regulace syntézy MT jsou velice komplexní, odlišnými cestami působí nejen různé induktory, ale i tytéž induktory v různých tkáních. Obsah MT v játrech, ledvinách a střevě může být značně zvýšen na základě parenterálního nebo enterálního příjmu Cd, Cu nebo Zn. Pro syntézu MT je tedy podstatná interakce kovu s tkání. Vysvětlením může být schopnost tkáně vychytávat určitý kov ze systémové cirkulace, přístupnost kovu regulačním procesům v buňkách a inducibilita MT genů v buňkách. Isoformy MT mohou být indukovány různou měrou různými kovy v různých tkáních. Počet Metal regulatory element (MRE) se mohou pro jednotlivé strukturální geny lišit, dávají možnost pro působení různých regulačních faktorů navzájem agonisticky nebo antagonisticky.

4.2.2

Ostatní induktory Syntéza MT je rovněž indukována hormony včetně glukokortikoidů, glukagonu,

epinefrinu a dalšími faktory působící cestou cAMP, interferonu a interleukinu 1. Glukokortikoidy (GC) indukují MT nezávisle na ostatních regulačních systémech. Normálně se vyskytují GC v cytoplasmě v neaktivní formě, při aktivaci se přesunují do jádra a váží na GRE (glucocorticoid response element) aktivující MT I a II. Indukční potenciál je výrazně větší pro kovy (20-50x zvýší bazální produkci) než pro glukokortikoidy (2-4x). Stejně jako u proteinů akutní fáze dochází k indukci zánětem, infekcí a stresem. Stresové podmínky, které indukují syntézu MT, souvisí s redukcí Zn v plasmě.

Stres obecně vede k negativní

energetické bilanci, katabolismu, vč. katabolismu proteinů obsahujících Zn. Volný Zn pak stimuluje syntézu MT. Oxidativním stresem je MT I indukovatelný v závislosti na dávce při expozici oxidativním činidlům. K indukci dochází vazbou na všech šest MRE. MTF1 (metal transcription factor 1) se tak stává dominantním regulačním

proteinem v indukci MT.

Existuje také specifický mechanismus indukce oxidativním stresem cestou ARE ( antioxidant response element). (18) MT exprese je také alterována strukturálními změnami v organizaci chromatinu. Principem tohoto regulačního mechanismu je nejčastěji změna methylace korelující se změnou prostorového uspořádání chromatinu.

Dalším

mechanismem může být amplifikace MT I a II genů.

14

předpokládaným regulačním

Exprese a akumulace MT se liší v jednotlivých buňkách různých tkání a různého stupně diferenciace. V prenatálním období je obsah MT výrazně vyšší než u dospělých, k poklesu dochází během prvních dvou týdnů postnatálně. Současně dochází k přesunu MT z nukleárního prostoru do cytoplasmy.

Intracelulární koloběh

MT je charakterizován

poměrně rychlou dynamikou. Cílová buňka je vystavena působení kovu nebo glukokortikoidu, začíná indukovaná syntéza mRNA a stacionárního stavu dosáhne cca za 4 hodiny. Zvýšení syntézy proteinu je detekovatelné cca za 2-4 hodin, maximální hladiny MT je dosaženo za 1824 hodin. Po odstranění stimulačních faktorů dochází k poklesu hladiny za 12-22 hodin, bazální hladiny je dosažena za 48-72 hodin. (19)

4.3 Funkce Definovat jednoznačně funkci metalothioneinu v lidském organismu je poměrně složité.

Doposud bylo ověřeno jeho zapojení do mnoho odlišných fyziologických i

patologických procesů. Obecně se přijímá, že majoritní funkcí MT je účast na metabolismu kovů, tj. detoxikace a udržování poolu těžkých kovů a regulace buněčného metabolismu zinku a mědi. Z toho vyplývají i další funkce v buněčném vývoji a adaptaci na stres, ochrana proti gama, UV a RTG záření, resp. proti oxidativnímu stresu.

4.3.1

Metabolismus kovů MT reguluje pohyb Cu a Zn v buňce přímo, uvolněním iontu pro apoenzym nebo

metabolický kompartment, a nepřímo regulací koncentrace volných iontů. Tuto hypotézu podporuje korelace zvýšené výměnu zinku při zvýšené syntéze MT. Perorální příjem Zn koreluje s hladinami mRNA MT a vazbou Zn-MT. Naopak pokles celulárního MT znamená deficit Zn. Molekula

MT

je

zapojena

i

do

metabolismu

dalších

kovů,

např.

Cu.

V experimentálních podmínkách byla ověřena alterace jeho koncentrace při změně hladin Cu. Mulder popisuje ve své studii elevaci plasmatických koncentrací metalothioneinu u pacientů s hepatopatiemi spojenými se zvýšením koncentrace mědi v játrech, naopak typy hepatopatií, které nejsou asociovány s elevací mědi měly většinou normální hladinu MT. (20) Jaterní MT stoupá po podání širokého spektra toxických látek. Tímto způsobem játra zajišťují ochranu proti toxickému poškození. Je-li předem indukována zvýšená hladina MT klesá výrazně hepatotoxicita.

15

4.3.2

Oxidativní stres MT se stává redoxním proteinem, kde redoxní potenciál vzniká koordinací s okolím

vazbou a uvolňováním Zn. Redoxní potenciál klastrů je nízký, MT je snadno oxidován i slabými buněčnými oxidanty za současného uvolnění Zn. Posun k oxidovaným formám uvolňuje Zn, zatímco redukované formy ho vyvazují. (21) V okamžiku syntézy apothioneinu MT se stanou SH skupiny cysteinových zbytků součástí komplexu s kationty těžkých kovů v cytosolu. Mohou vychytávat superoxidové anionty a hydroxylové radikály, s afinitou více než 300x vyšší než

GSH, který je považován za základ antioxidativního obranného

mechanismu. (22) Zinkový deficit způsobuje oxidativní poškození makromolekul, akumulaci prooxidantů v různých tkáních. Glutathion bisulfid (GSSG) a ostatní disulfidy reagují s MT a postupně mohou metabolizovat všechny vázané Zn. (23) MT ochraňuje DNA a membrány proti oxidativnímu stresu mnohonásobně efektivněji než GSH na molekulární úrovni, jako velice efektivní lapač HO radikálů bráni poškození struktury DNA. MT zvyšuje odolnost buněk proti ozařování, v jehož průběhu dochází k poškození buňky radiolýzou vody za vzniku HO·. (24) Rozhodující je také subcelulární lokalizace MT. Cytoplasmatický MT má supresivní efekt na oxidativní poškození a cytotoxicitu těžkých kovů na rozdíl od nukleárního MT, který působí naopak protektivně na DNA proti UV záření a H2O2 . MT v mitochondriích reguluje kyslíkový metabolismus a ochranu proti oxidativnímu stresu. (25-30) Penkowa ve své studie potvrdila, že svalová zátěž je asociována se zvýšenou produkcí volných kyslíkových radikálů v kosterní svalovině.

Produkce radikálů

proporcionálně

vzrůstá se spotřebou kyslíku ve svalech, resp. s jeho metabolismem v mitochondriích. Exprese MTI a II byla zjištěna v experimentálních podmínkách v návaznosti na předchozí fyzickou zátěž, tj. indukována oxidativním stresem. (31)

4.3.3

MT a zánět Indukce MT se nejvíce projevuje v rámci odpovědi tkáně na zranění, infekci nebo

zánět. V tomto kontextu se MT považuje za protein akutní fáze. Narozdíl od ostatních proteinů akutní fáze, je indukce MT zánětlivými mediátory závislá na přítomnosti Zn. V rámci zánětlivé odpovědi dochází v játrech k extenzivní reorganizaci proteosyntézy a MT jako zdroj Zn se řadí mezi nejčasněji indukované proteiny. Vzrůst hladiny MT se projevuje již za 2-4 hodiny po zánětlivém impulsu. Přesný význam metalothioneinem řízené redistribuce zinku je nejasný. Teoreticky se předpokládá mechanismus snížení hladiny Zn v plasmě, která moduluje funkci leukocytů, včetně produkce cytokinů, zvyšuje pool intracelulárního zinku,

16

podporuje metabolické procesy a deplece zinku podporuje maximální aktivitu enzymů. MT působí také jako antioxidant v terénu zánětu nebo infekce.

4.3.4

MT a metabolismus MT je zapojen do metabolických procesů svou funkcí liganda Zn v buňce. Jako

strukturální nebo katalytický element je součástí více než 300 enzymů. V syntéze apoenzymů ovlivňuje DNA stabilitu. Další funkcí je vliv na produkci energie (vazbou APT na lyzinové zbytky v MT) a na mitochondriální respiraci (ZnMT zvyšuje permeabilitu vnitřní mitochondriální membrány). (32)

4.4 MT a protinádorová léčba Předem indukovaný MT chrání tkáně před poškozením způsobeným gama zářením i některými chemoterapeutiky ( např. cisplatina, doxorubicin, bleomycin, cyclophosphamide). Ve zdravé tkáni může indukovaný MT eliminovat nežádoucí toxické účinky léčby. Látky snižující hladinu MT, např. propargylglicin, mohou naopak zvyšovat efekt chemoterapie. Sekvenací intracelulárního cDDP vazbou na MT se snižuje cytotoxicita cDDP. Zkoumá se možnost indukce MT ve zdravé tkáni u onkologických pacientů jako možného způsobu redukce toxických nežádoucích efektů chemoterapie. Opakovanou expozicí stupňujícími se dávkami léčiva byla generovaná rezistentní buněčná linie. V mnoha případech byla na buněčných linií nádorových buněk prokázána zvýšená hladina MT ve srovnání s mateřskými buňkami. Ztráta rezistence u revertovaných linií byla provázena současným poklesem hodnot MT. Několik autorů potvrdlo experimentálně mechanismus chemorezistence na buněčných liniích na úrovni genových přenosů transferem genu pro MT. (33-36) Elevace obsahu MT je jedním z možných, ne však jediným, mechanismem buněčné rezistence na léčbu cis DDP. Byly studovány hladiny mRNA u sensitivních a rezistentních buněčných linií. Analýza podpořila hypotézu o zvýšené genové expresi, transkripci nebo zvýšené mRNA stabilitě. Celkový obsah Pt v buňkách byl vyšší v případě rezistentních linií, většina však byla vázána na MT. Jednalo se o vazbu na již syntetizovaný MT. V návaznosti na aplikaci cis DDP nedošlo k dalšímu zvýšení celkového obsahu MT. (37) Vazba Pt na MT in vivo byla pozorována po inkubaci ZnMT s cis DDP nebo trans DDP. V obou případech bylo dosaženo rovnováhy navázáním cca 40% podané Pt na MT. (38)

17

Sulfhydrylové skupiny v MT chrání DNA rovněž před radiací indukovaným poškozením a buněčnou smrtí. Ionizující záření působí v 10% poškození DNA přímou absorpcí energie a uvolňováním uhlíkových a následně peroxidových a kyslíkových radikálů, v 90% vzniká poškození DNA hydroxylovými radikály vzniklými radiolýzou vody. Oba mechanismy jsou inaktivovány vazbou radikálů na MT. Experimenty potvrdily, že preindukcí MT je radiační poškození redukováno. Mechanismus působení rtg, gama i UV záření je pravděpodobně stejný. Jednorázové ozáření cca 10 Gy nezvýšilo hodnotu MT. Při této vysoké dávce převažuje cytotoxický efekt, který neindukuje MT. Mnohočetné ozáření v nízké denní dávce cca 0,3Gy naopak působilo mnohem efektivněji. Subcelulární nukleární lokalizace MT je dalším faktorem, který snížil poškození DNA. V časných fázích působí proti cytotoxickému a v pozdních fázích proti genotoxickému účinku záření.

4.5 MT a kancerogeneze Mnoho poznatků směřuje k podpoře názoru o roli MT v kancerogenesi. Vysvětlením pro zvýšenou koncentraci MT v nádorových buňkách může být jejich zvýšené nároky na Zn metabolismus. Během rychlého růstu a zvýšené metabolické aktivity je Zn nutný pro syntézu a metabolismus nukleových kyselin. Tato hypotéza je podpořena skutečností, že klidové buňky obsahují významně menší hladinu MT mRNA než proliferující.

Demonstrovat

distribuci MT korelující s proliferační aktivitou buněk lze na příkladu kůže.

Odlišná

distribuce MT v kůži byla pozorována u různých kožních onemocnění. Zvýšená je koncentrace MT v proliferujících buňkách bazální vrstvy. (40,41) Buňky s deficitem Zn mají patrný menší růstový potenciál. Syntéza MT v těchto buňkách je dostatečná pro udržení rovnováhy mezi apoMT a kovy nasyceným MT.

ApoMT je v nenádorových buňkách

nacházen pouze přechodně při deficitu Zn, zatímco v nádorových buňkách byl detekován trvale bez výraznějšího Zn deficitu. ApoMT může pravděpodobně vyvázáním Zn kontrolovat genovou expresi. Dále se předpokládá, že odstranění Zn z proteinů vázaných na DNA generuje volné radikály a tím přispívá ke karcerogenesi. (42) Odebráním Zn dochází také k inaktivaci p53. ApoMT může v nádorových buňkách přes inaktivaci p 53 akcelerovat buněčný růst a životnost buněk. Další cestou kontroly metabolismu může být interakce s poolem GSH/GSSG redoxního systému. (43) Exprese MT genu a změny intracelulární lokalizace MT vytváří předpoklad, že se jedná o produkt onkogeneze. MT má některé vlastnosti fetoproteinů např. alfa fetoprotein, který se fyziologicky exprimuje během prenatálního vývoje a později v jistých typech nádorů. 18

Tyto proteiny se využívají jako tumor markery. Různá exprese MT v nádorech je závislá na růstu, ale i typu tumoru, histologii, morfologické heterogenitě, proliferaci a diferenciaci. Isoformy MT jsou v tkáních exprimovány specificky a mohou mít různé funkce. Změny v poměru isoforem mohou odrážet změny v proliferaci a diferenciaci jako následek methylace specifických genů. Specifická regulace lidského genu MT byla popsána na buněčných liniích a zdá se, že koreluje s methylací DNA a strukturou chromatinu, ale také s embryonálním základem nádorové tkáně. (44)

4.5.1

Exprese u tumorů Imunohistochemicky byla potvrzena exprese MT v různých typech nádorů, kde byla

asociována s procesem kancerogeneze. Exprese MT v nádorových tkáních koreluje často s proliferační kapacitou buněk nebo s indukcí apoptosy. Recentní studie potvrzují, že modulace exprese MT může zajistit změnu rezistence k chemoterapeutikům. (45) V následujícím přehledu jsou zmíněny literární odkazy na nejvýznamnější studie hodnotící imunohistochemicky expresi MT v nádorech různých typů a lokalizací.

4.5.1.1 Tumory hlavy a krku Sundelin studoval expresi MT v preparátech karcinomu jazyka. Méně diferencované oblasti vykazují pozitivitu MT a snížení počtu apoptos na rozdíl od více diferencovaných oblastí nádorové tkáně. Předpokládáme, že MT může přispívat k oddálení apoptosy, v normálním epitelu stejně jako v oblastech méně diferencovaných buněk karcinomu. Z normálních zdravých sliznic bylo 5/5 pozitivních v reakci na MT. Na rozdíl od jiných antigenů, které jsou distribuovány rovnoměrně ve všech vrstvách epitelu, MT je lokalizován pouze v bazálních a parabazálních vrstvách. Z karcinomů

bylo 22/24 v reakci na MT

pozitivních, MT byl signifikantně zvýšeně exprimován v nádorové tkáni. Při porovnání experese MT s klinickými a histologickými parametry nádoru nebyla odhalena jednoznačná korelace. (46) Ioachim ve své studii hodnotil expresi MT ve 44 spinocelulárních karcinomech hrtanu, 14 in situ karcinomech, 47 epiteliálních dysplasií, 11 papilomech a 21 keratózách. MT vykazoval ibikvitní přítomnost v cytoplasmě a jádře u maligních i benigních lézí. Průměrná hodnota exprese MT byla nejvyšší u karcinomů, nebyla patrná rozdílná exprese mezi karcinomy a karcinomy in situ, ale obě se

19

lišily signifikantně od ostatních typů

studovaných lézí. Výsledky naznačují možnou úlohu MT v kancerogenesi již od časných fází. V benigních lézích byla exprese MT lokalizována na bazální vrstvy epitelu, kde je výrazná proliferační aktivita. Potvrdila se asociace MT s horší prognózou a agresivnějším chováním tumoru. MT koreloval s p53 ve všech typech laryngeálních lézí. (47) Jayasurya

koreloval

expresi

MT

v souvislosti

s buněčnou

proliferací

v nasofaryngeálním karcinomu. Všechny karcinomy reagovaly pozitivně na MT, významně pozitivní vztah byl nalezen mezi MT a Ki67 pozitivitou. Hladina Zn v jádrech nádorových buněk byla signifikantně vyšší než v membráně a cytosolu, korelovala s proliferační aktivitou. Při bližší analýze byla objektivizována absence MT v cytoplasmě (lokalizace MT výhradně v jádře u nádorových buněk). V normálním epitelu nosohltanu reagovala pozitivně na MT pouze bazální vrstva. MT inverzně koreloval s apoptotickým indexem nádorové tkáně. (48, 49, 50) Hishikawa

analyzoval souvislost

mezi expresí MT, prognózou a metastatickým

potenciálem spinocelulárního karcinomu jícnu. Exprese MT byla signifikantně asociována s postižením uzlin (71% u N+ a 42% u N0) a se vzdálenými metastázami (29%pozitivních M + a 5% u M0 tumorů). Parametry přežití MT- negativních pacientů byly signifikantně lepší než u MT- pozitivních. Exprese MT, proteinu i mRNA, může být potenciálním markerem predikujícím metastatický a proliferační potenciál u těchto karcinomů. (51) Yamamoto imunohistochemicky stanovoval MT a p53 na biopsiích 30 pacientů se spinocelulárním

karcinomem

jícnu,

kteří

byli

léčeni

chirurgicky

po

předchozí

chemoradioterapii. Overexprese MT korelovala s odpovědí na CHRT na bázi cDDP. Mezi oběma skupinami nebyla zjištěna odlišnost při klinickopatologickém vyšetření. Ve skupině MT -/p53+ byla odpověď na CHRT 100%. MT negativita byla považována za nejlepší indikátor chemoradiosensitivity. Patologická odpověď tumoru korelovala s prognózou pacientů. Na základě dosažených výsledků může být MT považován za prognostický marker selektující pacienty s dobrou odpovědí na chemoradioterapii. (52) Nartey sledoval reexpresi MT genů v tumorech štítné žlázy na preparátech normální i nádorové tkáně. MT byl zjištěn v 91% zkoumaných nádorů a ve 20% preparátů nenádorové tkáně zdravé štítné žlázy. Potvrdil přítomnost MT v jádrech i cytoplasmě ve většině tumorů. (53) Kuo u thymomů sledoval overexpresi MT jako potenciální marker invazivity. Zkoumány byly preparáty neinvazivních, mikro i makro invazivních thymomů. Exprese MT se signifikantně lišila mezi třemi zmiňovanými skupinami na statisticky významné hladině. Nejsilnější, nikoli však výhradní, exprese byla 20

u invazivních typů. Mezi jednotlivými

histologickými typy nádorů byla nejsilnější exprese pozorována u vřetenobuněčných a spinocelulárních thymomů. (54)

4.5.1.2 Tumory ostatních lokalizací Tmory plic Ve srovnání s okolní tkání byla zvýšena exprese MT verifikována u nádorů plic, přestože lze oprávněně přepokládat, že i v normální plicní tkání byla hladina MT ovlivněna abusem cigaret.

Mariamma

retrospektivně hodnotil expresi MT v tkáni z biopsie

z malobuněčného karcinomu plic před léčbou.

Sledované parametry byly porovnány

s klinickými výsledky přežití pacientů. Byla nalezena silná inverzní korelace se stadiem a přežitím. Potvrdila se souvislost exprese MT a p53 se sníženými parametry přežití.(55) Kasahara potvrdil korelaci overexprese MT s rezistencí k cisplatině. Tyto poznatky ukázaly roli MT jako nezávislého negativního prediktivního markeru a současně možného markeru k selekci chemorezistentních tumorů. (56)

Tumory prsu Overexprese MT

byla zjišťována imunohistochemicky v normální prsní tkáni,

v různých benigních, preinvazivních a maligních lézích. V normální tkání a u lézí bez rizika malignizace byl MT přítomen v myoepiteliálních buňkách, zatímco většina luminálních buněk byla negativních. Karcinomy in situ a invazivní duktální karcinomy reagovaly pozitivně ve více než 50%. (57) V případě karcinomů pozitivně reagovalo 44% nádorů, a to nukleárně nebo cytoplasmaticky i nukleárně.

Vždy se jednalo o invazivní

duktální karcinomy.

Mucinózní, lobulární nebo intraduktální papilární karcinomy byly negativní. Statisticky byla potvrzena asociace mezi MT expresí a histologickým gradingem, exprese MT korelovala s kratším intervalem přežití. Nebyla potvrzena souvislost s metastatickým potenciálem nebo velikostí tumoru na statisticky významné úrovni. (58, 59,60) Schmid

naopak potvrdil

souvislost overexprese MT s horší prognózou, vyšším metastatickým potenciálem nádoru a s rezistencí k chemoterapii. (61)

21

Tumory ovaria Tan ve své studii hodnotil expresi MT u benigních, hraničních i maligních ovariálních nádorů. Signifikantně vyšší byla exprese u karcinomů. Exprese MT korelovala s progredující malignitou tumorů a může být považován za marker gradingu. Nejintenzivnější exprese MT byla potvrzena u serózních karcinomů. Rozdílná koncentrace mezi jednovrstevným a vrstevnatým epitelem u hraničních i maligních tumorů může odrážet jejich odlišnou proliferační aktivitu. MT se ukázal být potenciálním biologickým markerem pro grading serózních ovariálních tumorů. Podíl imunoreaktivních buněk přes 80% byl asociován s horší prognózou pacientů. (62,63)

Tumory kůže MT funguje jako endogenní protektivní faktor proti chemickému stresu nebo UV radiaci a karcerogenesi.

MT hladina korelovala s progresí epidermální hyperplazie. U

bazaliomů overexprese souhlasila s infiltrativním růstem. Overexprese MT dominovala v izolovaným skupinách buněk zejm. u fibroblastů a v místech intenzivního zánětu. U spinaliomů intenzita převyšovala bazaliomy. Weinlich v prospektivní studii hodnotil 520 pacientů s primárním kožním maligním melanomem. Pacienti byli sledováni 5 let. pozitivita

tumorů

byla

asociována

s progresí

onemocnění,

sníženým

MT

přežitím

a

metastázováním. V univariantní i multivariantní analýze spolu s dalšími prognostickými faktory (Breslowova klasifikace) prokázal, že overexprese MT je významný nezávislý negativní prognostický faktor. (64)

Tumory kolorekta Ofner sledoval imunohistochemicky pomocí monoklonární protilátky proti epitopu MT I a II isoforem 109 kolorektálních adenokarcinomů. Rozdíly v expresi MT statisticky významně korelovaly s stagingem (Dukova klasifikace) a postižením LU v době operace. Na rozdíl do mnoha jiných studií byla v tomto případě pozitivita MT asociována s příznivou prognózou pacientů.(65)

Tumory ledvin MT exprimovaný v renálních karcinomech byl většinou asociován s agresivnějším růstem a horší prognózou. Izawa

potvrdil významný inverzní vztah gradingu tumoru a

intenzity MT exprese. V normální renální tkáni byla zjištěna exprese MT cytoplasmaticky i nukleárně, s variabilní intenzitou, pouze v tubulárních buňkách. (66)

22

Tumory jater V případě zdravé i maligně transformované hepatální tkáně byly v několika recentních studiích zaznamenány inverzní výsledky ve srovnání s nádory ostatních lokalizací. V hepatocelulárním karcinomu silně pozitivně reagovaly nenádorové hepatocyty. Intenzivní exprese MT u nenádorových cirhotických nodulů v hepatocelulárním karcinomu a nízká exprese v cirhotických nenádorovéch játrech naznačuje vztah k maligní transformaci hepatocytů. Onosaka potvrdil rozdíl v koncentraci MT v maligních a nemaligních tkáních. MT v nemaligních tkáních byl převážně ve formě Zn MT a byl signifikantně vyšší než v maligních tkáních. V mnoha studiích byla potvrzena vysoká hodnota MT ve zdravých játrech, která klesá při nádorové transformaci (67- 69). (tab. 1)

autor Bier Fresno Sens Schmid Tetsumari Kasahara Mariamma Ofner Tan Murphy Onosaka Huang Izawa Kuo Weinlich Kuo Nartey Yamamoto Hishikawa Jayasurya Sundelin Ioachim

rok 1994 1993 2001 1993 1996 1991 2001 1994 1999 1991 1986 2002 1998 1994 2003 1997 1987 1999 1999 2000 1997 1999

lokalita tu prs prs prs prs prs plíce plíce kolorektum vaječník vaječník játra játra ledvina moč měchýř m. melanom thymom štítná žl. jícen jícen nosohltan jazyk hrtan

exprese MT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Tab 1 Přehled exprese MT v nádorech

23

prognóza 0 neg neg neg neg neg neg neg neg 0 poz 0 neg 0 neg 0 0 neg neg neg 0 0

4.6 Detekční metody Tradičně histologické metody určovaly hladinu MT v tkáni na základě biochemických vlastností, např. vysoké koncentrace SH skupin, disulfidických vazeb (Bohmova fixační metoda), iontů kovů asociovaných s proteinem (rtg analýzou). S dostupností komerčních protilátek proti MT E9 pro MTI a II isoformy (Dako) došlo s rychlému nárůstu počtu studií zabývajících se expresí MT v nejrůznějších typech tumorů. Imunohistochemicky nelze odlišit jednotlivé isoformy MT. Další metodou je reversní transkriptázová polymerázová řetezová reakce RT PCR a hybridizace in situ, které jsou schopny detekovat i velmi nízké hladiny MT. Naprostá většina dosud publikovaných studií, které objektivizují změny v expresi MT, se zaměřila na studium tkáňových preparátů nebo na buněčné linie v experimentálních podmínkách. Mnohem raritněji se vyskytují publikace hodnotící koncentraci MT v tělních tekutinách. Bez výjimky se jedná o soubory jiných než onkologických patologií. K detekci MT v tělních tekutinách, plasmě a moči, byla původně na laboratorních zvířatech vyvinuta metodika radioimmunoassay, později enzyme-linked immunosorbent assay pro lidský MT založená na použití anti human MT IgG. (70,71,72) Akintola vyvinul metodiku stanovující koncentraci

v séru

specifickou

pro

jednotlivé

isoformy

ELISA

(enzyme

linked

immunosorbent essay).(73)

4.6.1

Elektrochemické metody

V naší studii jsme ke stanovení krevní hladiny MT využili možností elektrochemie. Elektrochemickém stanovení je založeno na katalytických procesech, které probíhají při negativních potenciálech na rtuťových elektrodách (–1,7 až –1,9 V vs. Ag/AgCl/KCl). Mezi tyto procesy, které jsou provázeny vylučováním vodíku ze složek základního elektrolytu, řadíme Heyrovského prenátriovou vlnu a Brdičkovu reakci. Bylo zjištěno, že za katalytickou reakci odpovídají –SH skupiny, které jsou bohatě zastoupeny v molekule MT. Katalytické signály MT na rtuťových elektrodách studované potenciostatickými metodami poskytují možnost stanovení MT v oblasti nanomolárních koncentracích. Metodami galvanostatickými, především derivační chronopotenciometrickou rozpouštěcí analýzou (CPSA), je možné posunout se ještě k nižším detekčním limitům. Kombinací metody CPSA s technikou adsorptivního rozpouštěcího přenosu (AdTS) lze stanovovat MT na úrovni femtomolů ve velmi malých objemech vzorku (5 ul), což žádná stávající analytická metoda neumožňuje. (obr.3) Nejnovější výsledky získané metodou AdTS CPSA ukazují na možnost dosažení nižších

detekčních

limitů

po

přidání

komplexu

24

trichloridu

hexaaminokobaltitého

[Co(NH3)6]Cl3 do analytu. Touto modifikací původně navrženého postupu stanovení MT pomocí píku H pravděpodobně dochází k vytvoření sloučeniny komplexu [Co(NH3)6]Cl3 s molekulami MT ve prospěch katalytické reakce a tím i k nárůstu maxima katalytického signálu. (obr 4,5) Vzhledem k výhodám, které elektrochemické metody přináší, se elektroanalýza stala běžně používanou pro studium fyziologických koncentrací MT. Jednou z předností je časová nenáročnost a snadná příprava vzorku, na rozdíl od imunologických technik nebo metod založených na radioaktivním značení. Jedním z limitů je nemožnost diferencovat jednotlivé isoformy. Výhodou je naopak reprodukovatelnost měření. (74, 75)

Obr.3 AdTS DVP voltamogramy MT v závislosti na koncentraci

25

5 Cíl práce Základním cílem této prospektivní studie bylo stanovení hladin MT v plné krvi u pacientů se spinocelulárním karcinomem orofaryngu a dutiny ústní elektrochemickou metodou, porovnání získaných výsledků s kontrolní skupinou a analýza vztahu hodnot MT k histologickými a klinickým parametrům souboru. Výsledky mohou potvrdit nebo vyloučit možnosti využití MT jako potenciálního diagnostického či prognostického nádorového markeru u karcinomů hlavy a krku.

6 Vlastní pozorování 6.1 Klinický materiál 6.1.1

Soubor pacientů Zkoumaný soubor tvořili pacienti s maligními nádory hlavy a krku léčení na Klinice

ORL a chirurgie hlavy a krku Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně v období od ledna do prosince roku 2006. Podmínkou zařazení

byla histologická verifikace dříve neléčeného

tumoru. U všech pacientů byl z probatorní excize histologicky verifikován karcinom a stanovena přesná diagnóza, včetně TNM klasifikace.

Ze studie byli vyloučeni pacienti

s hematologickými malignitami, s kožními nádory, s recidivami primárních tumorů a pacienti s duplicitními nádorovými onemocněními. Ve sledovaném časovém období bylo na naší klinice verifikováno 159 primozáchytů zhoubných nádorů splňující výše zmíněné podmínky, 134 mužů a 25 žen. Průměrný věk pacientů byl 62,18 ± 9,85 let (medián 61; min. 40, max. 88). Nejčastější lokalizací nádorů byl orofarynx (58), larynx (48), hypofarynx (15) a dutina ústní (15); ostatní lokalizace byly zastoupeny jen okrajově (dutina nosní a PND- 7, nazofarynx 4, slinné žlázy 6, metastázy do krčních uzlin neznámého prima 4, parafaryngeální prostor 1, středouší dutina 1). (graf 1) Dle histologické klasifikace převažoval jednoznačně spinocelulární karcinom, v 149 případech. Ostatní histologické typy se vyskytovaly výjimečně ( adenokarcinom

3,

velkobuněčný karcinom

1,

2, acinocelulární karcinom

angiosarkom 1, lymfoepiteliom 1). (graf 2 )

26

2, adenocystický karcinom

hypofarynx

ostatní

dutina ústní

ostatní

14%

9%

6%

9% orofarynx 37% larynx

spinoca

31%

94%

Graf 1, 2 Rozložení primozáchytů nádorů v r. 2006 dle lokalizace a histologie

Naší snahou v rámci této pilotní studie bylo vytvoření maximálně homogenního souboru onkologických pacientů. Proto jsme zvolili pacienty s nádory pouze dvou, svým charakterem velmi podobných, lokalizací:

dutiny ústní a orofaryngu, a

jednoho

histologického typu, kterým byl spinocelulární karcinom. Vzorky plné krve k analýze byly odebrány po histologické verifikaci před zahájením terapie. Hodnoceno bylo celkem 73 pacientů. V souboru bylo 61 mužů a 12 žen, jejich věkový průměr činil 59,70 ±9,61 let (medián 58; min. 40, max. 88) . Při rozdělení spinocelulárních karcinomů dle stupně diferenciace jsme nejčastěji nalezli typ středně diferencovaný ( 46) , dále nízce diferencovaný (17), dobře diferencovaný (8) a nediferencovaný (2). (graf 3) Pokročilost onemocnění byla hodnocena dle mezinárodní TNM klasifikace. Většina nádorů byla diagnostikována až v pokročilém stadiu (st IV- 59, st III- 9, st II- 4, st I- 1). (graf 4) Rovněž podle hodnot T převažovaly lokálně pokročilé nádory (T 4- 41, T 3- 9, T2-17, T 1-6). (graf 5) O relativně vysokém metastatickém potenciálu svědčí nádorové postižení krčních lymfatických uzlin u vysokého podílu pacientů v době verifikace (N3-7, N2-43, N1-9, N0-14; N+ vs N0 : 59 vs 14). (graf 6 ) Vzdálené metastázy jsou u karcinomů hlavy a krku vzácné, vyskytly se pouze ve jednom případě.

23%

3%

11%

st I

st II

1%

5%

st III 12%

dobře středně nízce 63%

nediferencovaný st IV 82%

Graf 3, 4 Rozložení souboru dle diferenciace spinocelulárních karcinomů a dle stádia

27

T1 8%

N3

N0

10%

19%

T2 23%

N1

T4

12%

57% T3

N2

12%

59%

Graf 5, 6 Rozložení souboru dle hodnot T a N

Jak odpovídá literárním údajům o etiopatogenetickém vlivu kouření, jednoznačně převažovali kuřáci (62) nad nekuřáky (11). Výraznější abusus alkoholu (více než 3 j./den) byl zaznamenán u 28 pacientů. Pro hledání dalších možných korelací a pochopení mechanismů elevujících hladinu MT byla sledována také

míra zánětlivých změn na

hodnotách laboratorních markerů. U 27 nemocných byla hodnota

CRP elevována nad

fyziologickou normu (10 mg /l). Ze známých interkurencí, které by mohly ovlivňovat hladinu MT, jsme sledovali hepatopatie měřením hodnot jaterních enzymů. U 3 pacientů bylo zvýšeno nad normu ALT ( 0,78 ukat/l), AST (0,79 ukat/l), u 12 pacientů GMT (1,77 ukat/l). V souboru pacientů jednoznačně dominovali nemocní s lokálně pokročilým, často inoperabilním, onemocněním. V 13 případech velmi pokročilých nádorů mohla být aplikována pouze paliativní RT, v 1 případě pouze symptomatická terapie. V 3 případech nebyla léčba pro nízkou compliance pacienta dokončena. U 50 pacientů bylo léčbou dosaženo kompletní remise; 23 léčených pacientů remise nedosáhlo. Z 50 pacientů v kompletní remisi byla v 10 případech za dobu sledování verifikována recidiva. Z celého souboru nemocných bylo zaznamenáno 26 případů úmrtí, z nichž bylo 24 v souvislosti s nádorem; 47 pacientů dosud přežívá. Medián doby sledování pacientů od ukončení terapie v našem souboru činil 10,8 měsíců (min. 1; max. 19,9). Při hodnocení parametrů přežití jsme použili Kaplan Meierovy křivky pro kumulativní celkové přežití (over all survival- AOS) (graf 7), pro nádor specifické přežití (desease specific survival- DSS) (graf 8) a období bez recidivy (desease free interval-DFI). (graf 9) Vzhledem ke krátké době sledování jsme mohli získat pouze 12 a 18-ti měsíční hodnoty parametrů. Celkové 12-ti měsíční přežití (OAS) dosáhlo 71% nemocných a 18-ti měsíční OAS 43%. Křivka pro celkové kumulativní přežití se blížila křivce

28

kumulativního přežití s ohledem na základní diagnózu (DSS), která ukázala pro 12 měsíců 74% a pro 18 měsíců 45% přežívajících pacientů. Naprostá většina sledovaných pacientů zemřela v souvislosti s nádorovým onemocněním. 12-ti měsíční bezpříznakové období (DFI) dosáhlo 54% léčených, 18-ti měsíční DFI 50%. Patrný je relativně vysoký počet pacientů, kteří byli diagnostikováni až v pokročilém stádiu onemocnění a ani po aplikaci onkologické léčby nedosáhli kompletní remise.

Graf 7, 8 Kumulativní celkové přežití a přežití specifické pro nádor

Graf 9 Období bez recidivy

29

6.1.2

Kontrolní soubor

Hodnoty MT u pacientů s onkologickým onemocněním jsme srovnávali s kontrolní skupinou. Krevní vzorky byly odebrány se souhlasem pacientů v rámci preventivní prohlídky v Ústavu sportovní medicíny. Soubor tvořilo 58 zdravých

jedinců. Ve skupině byla

zastoupena obě pohlaví; 18 žen a 40 mužů. Všichni byli ve věkové kategorii mezi 15 a 52 lety, věkový průměr byl 32,0 ±12,4, medián 30 let. Zastoupeni byli kuřáci (9) i nekuřáci (49). U nikoho se nevyskytlo v anamnéze onkologické onemocnění. Hodnoty jaterních testů i zánětlivých markerů byly v čase odběru v normě.

6.2 Metodika 6.2.1

Elektrochemické stanovení metalothioneinu v krvi K analýze biologických vzorků jsme použili modifikovanou Brdičkovu reakci

katalytického vylučování sodíku ze základního elektrolytu v přítomnosti proteinů. Každý vzorek byl upraven podle navrženého postupu. Ze získaných vzorků plné krve bylo odebráno 100 µl a umístěno na 15 min. při 99 °C do termobloku (Eppendorf 5430, USA). Poté byly vzorky ochlazeny na 4 oC a centrifugovány při 4 oC, 15 000 g po dobu 30 min. (Eppendorf 5402, USA). Takto připravené vzorky byly analyzovány postupem adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulsní voltametrií (DPV) na přístroji AUTOLAB v klasickém tříelektrodovém uspořádání. AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 120 s, počáteční potenciál –0,6 V, konečný potenciál –1,6 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 1,05 mV/s, modulační amplituda 250 mV, Eads = 0 V, teplota 20 °C. Množství analyzovaného vzorku bylo 5 µl. Studovaný vzorek byl adsorbován na povrch pracovní elektrody, poté byl přebytečný roztok z povrchu elektrody omyt. Modifikovaná elektroda se umístila do měřící nádobky a následně byl nahrán voltamogram pomocí diferenční pulzní voltametrie. Pokud byl v roztoku přítomen protein (v našem případě metalothionein), došlo v akumulačním kroku k jeho adsorpci na povrch pracovní elektrody a ve výsledném voltamogramu můžeme pozorovat několik signálů. Ty zřejmě souvisejí jednak s elektroaktivitou vznikajícího komplexu proteinu s přítomnými ionty kobaltu (RS2Co), ale také s redukcí protonu (H+), který se tvoří při katalytické reakci proteinu. Při další analýze MT byl vyhodnocován katalytický signál Cat2. Množství obsaženého MT ve studovaných vzorcích bylo určeno metodou standardního přídavku. Výsledkem byla lineární závislost

30

standardního přídavku MT na zvyšující se koncentraci (y = 7177,7x + 7939,3; R2 = 0,9925) s limitem detekce (3 S/N) kolem 350 fmol (n = 10) a relativní chybou stanovení do 8 %.

6.2.2

Statistické zpracování a interpretace získaných dat

Ke statistickému zpracování jsme použili běžné neparametrické testy (Spearmanova korelace, Mann-Whitneyův U-test a Kruskal-Wallisovu ANOVA) pro srovnání rozdílu mezi hodnotami MT mezi jednotlivými skupinami. K určení délky bezpříznakového období byla použita Kaplan- Meierova analýzu přežívání. Hladinu P< 0,05 jsme považovali za statisticky signifikantní. Pro veškeré statistické analýzy jsme využili statistického programu STATISTICA for Windows v 7.1 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA).

31

6.3 Výsledky Elektrochemickou metodou měření jsme stanovili hladiny MT v plné krvi v souboru onkologických pacientů. (tabulka 2)

jméno věk pohl. JC 55 m BK 47 m EB 68 ž ZM 51 m MS 51 m AM 60 m MK 62 ž JF 54 m BD 56 m LH 75 ž LH 78 m JH 40 m JN 56 m JS 57 m JR 63 m OJ 68 ž SC 55 m ZS 62 m JS 55 ž JD 41 ž JK 88 m PR 56 m AS 51 ž GH 66 m JK 66 m FL 60 m JS 60 m AH 63 m PH 56 m MJ 56 m DK 69 m AP 68 m JJ 74 m JJ 72 m SP 64 m VS 58 m

T 1 4 2 2 1 4 4 4 4 4 2 4 2 4 4 1 4 4 2 2 4 4 3 4 4 4 4 4 2 3 4 3 4 2 4 4

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 1 1 0 2 2 2 2 0 0 1 0 2 0 2 2 3 1 2 1 2 0 2 2 0 2 0

M st gr MT 0 4 2 0,74 0 4 2 1,07 0 4 3 1,08 0 4 3 1,19 0 4 2 1,36 0 4 2 1,47 0 4 1 1,5 0 4 2 1,51 0 4 3 1,54 0 4 2 1,59 0 3 3 1,62 0 4 2 1,63 0 2 2 1,64 0 4 3 1,69 0 4 3 1,72 0 4 3 1,72 0 4 1 1,73 0 4 2 1,84 0 2 2 1,85 0 3 1 1,91 0 4 4 1,93 0 4 2 1,99 0 3 2 2,01 0 4 2 2,05 0 4 2 2,06 0 4 3 2,07 0 4 3 2,12 0 4 2 2,14 0 3 2 2,16 0 4 2 2,16 0 4 3 2,18 0 4 2 2,19 0 4 2 2,21 0 2 2 2,26 0 4 2 2,32 0 4 2 2,39

jméno věk pohl. FR 60 m JT 55 m JS 58 m JO 62 m JD 57 m JP 52 m MD 73 ž FP 65 m SS 56 m SK 62 m PC 46 m EV 61 m LH 47 m FR 52 m RS 81 ž LV 57 m JS 54 m EL 50 ž JV 53 m TM 57 m ZB 74 m JV 51 m LD 47 ž LH 44 m MH 55 m SM 53 ž BL 60 m KM 82 m VM 64 m JM 54 m JK 60 m LH 73 ž JF 56 m MK 61 m OA 47 m LK 72 m RK 64 m

Tab. 2 Soubor onkologických pacientů

32

T 4 4 1 1 4 3 3 3 2 2 4 4 4 4 4 4 2 2 1 2 4 2 3 4 4 4 2 3 2 3 4 4 4 4 4 4 2

N 2 1 2 1 2 0 2 0 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 0 0 2 2 0 2 3 2 2 1 3 3 3 1 2 3 2 2 2

M st gr MT 0 4 2 2,4 0 4 2 2,45 0 4 2 2,5 0 3 3 2,62 0 4 2 2,67 0 3 2 2,7 0 4 1 2,72 0 3 1 2,73 0 4 4 2,88 0 4 2 2,96 0 4 2 3,02 0 4 2 3,04 0 4 2 3,11 0 4 2 3,12 0 4 2 3,22 0 4 1 3,24 0 4 2 3,36 0 4 3 3,38 0 1 3 3,53 0 2 2 3,56 0 4 2 3,63 0 4 3 3,68 0 3 2 3,72 0 4 1 3,73 0 4 1 3,73 0 4 2 3,76 1 4 2 4,01 0 3 2 4,01 0 4 3 4,2 0 4 2 4,24 0 4 3 4,51 0 4 2 4,63 0 4 2 4,71 0 4 2 5,29 0 4 2 5,34 0 4 2 5,92 0 4 3 6,38

Získané hodnoty byly analyzovány a

korelovány se zavedenými onkologickými

parametry. Průměrná hladina MT byla 2,73 ±1,19 µM (medián 2,40; min. 0,74 , max. 6,38). Hladiny MT se významně nelišily u mužů a u žen, p=0,5 (Mann- Whitney). (graf 9) Při další analýze nebyla nalezena souvislost mezi koncetracemi MT a věkem, p=0,98, R= -0,002 (Spearman). (graf 10) Statisticky významný rozdíl jsme nezjistili mezi skupinami kuřáků a nekuřáků, p= 0,88 (Mann- Whitney). (graf 11) Abychom vyloučili vliv abusu alkoholu a hepatopatie na elevaci MT v krvi, porovnali jsme vzájemně skupinu pacientů s normálními a zvýšenými hodnotami GMT. Obě skupiny se v hodnotách MT statisticky nelišily, p=0,15 (Mann- Whitney). K vyloučení vlivu současně probíhajících zánětlivých změn jsme vzájemně srovnali pacienty s normálními hladinami CRP a pacienty s hodnotami CRP elevovanými nad fyziologickou normu (10 mg/l). Ani tyto skupiny se v hodnotách MT statisticky neodlišovaly, p= 0,29 (Mann- Whitney).

Graf 9, 10 Porovnání MT dle pohlaví a korelace s věkem

33

Graf 11 Porovnání MT u kuřáků a nekuřáků

Hodnoty hladiny MT v plné krvi u kontrolní skupiny byly 0,50 ± 0,20 µM (medián 0,49; min. 0,17, max. 0,90). Ve srovnání souboru mužů a žen nebyl nalezen rozdíl mezi pohlavími, p=0,07 (Mann- Whitney). Významný nebyl ani rozdíl mezi kuřáky a nekuřáky, p=0,80 (Mann- Whitney). Statisticky významně nekorelovala hladina MT s věkem, p=0,24, R=0,16 (Spearman). Primární účelem této studie bylo srovnání skupiny onkologických pacientů s kontrolní skupinou zdravých jedinců. Při vzájemném porovnání obou skupin byla zřejmá signifikantní elevace hladin u onkologicky nemocných. Odlišnost je patrná i na histogramu hodnot. (graf 12) Výsledek byl jednoznačně statisticky významný, p ‹10-6 (Mann- Whitney). (graf 13 ) Vzhledem k odlišnému věkovému složení obou souborů jsme k validizaci výsledků provedli srovnání pouze částí obou skupin vzájemně odpovídajících věkem i pohlavím (age/sex matched). I tento test pro věkem a pohlavím spárované skupiny potvrdil významnou rozdílnost v hladinách MT, p‹10-6 (Mann- Whitney) , n=20.

34

Graf 12, 13 Histogram hodnot a vzájemné porovnání MT u onkologického a kontrolního souboru

Na základě jednoznačné odlišnosti obou skupin jsme experimentálně stanovili hraniční hodnotu normální koncentrace MT na 1µM. Za těchto podmínek měl celý soubor kontrolních vzorků koncentrace nižší než tato hodnota, tj. 100% bylo v normě. Naopak u onkologických pacientů byly všechny kromě jedné hodnoty, tj. 98,7%, elevované nad 1 µM. (tabulka 3) Pro tuto podmínku normální hodnoty by na námi změřeném souboru byla stanovena sensitivita MT jako nádorového markeru 99%, specificita 100%, pozitivní prediktivní hodnota 100% a negativní prediktivní hodnota 98%. (tabulka 4)

onko

kontrola

MT‹1uM

1,3%

100%

MT›1uM

98,7%

0%

Tab.3 Rozložení hodnot MT

sensitivita specificita pozitivní prediktivní hodnota negativní prediktivní hodnota

99% 100% 100% 98%

Tab. 4 Parametry MT jako nádorového markeru

35

Výsledky byly dále korelovány se standardními klinickými a histopatologickými charakteristikami tumorů. Hodnotili jsme nádory dle lokální pokročilosti definované hodnotou T, tj. srovnávali jsme nízká stadia proti lokálně pokročilým. Mezi oběma skupinami nebyl patrný rozdíl, T1+2 vs 3+4 : p=0,56 (Mann-Whitney). (graf 14) MT významně nesouvisel s pokročilostí nádorů dle stadia, st. I+II vs st. III+IV : p=0,87 (Mann-Whitney). (graf 15) Ke zhodnocení korelace MT s metastatickým potenciálem jsme srovnali skupinu N0 vs N+. Nebyla zjištěna rozdílnost obou skupin, N0 vs N+ : p=0,43 (Mann-Whitney). (graf 16) Dále byly vzájemně porovnány všechny hodnoty N. Neodlišovaly se sice statisticky významně, nicméně je naznačen rozdíl N3 od ostatních hodnot N0-N2; p=0,15 (Kruskal Wallis). (graf 17) Z histologického hlediska byly korelovány

různé stupně diferenciace,

grading, spinocelulárních karcinomů; skupiny dobře a středně diferencovaných proti nízce a nediferencovaným spinocelulárním karcinomům. Grade 1+2 vs 3+4 se navzájem nelišily hodnotami MT, p=0,87 (Mann-Whitney). (graf 18) Z hlediska prognózy jsme hodnotili parametry DFI s MT. Inverzní korelace MT s délkou období bez recidivy zde sice byla naznačena, nikoliv na statisticky významné úrovni, p= 0,17, R= -0,19, n= 49 (Spearman). (graf 19)

Graf 14, 15 Porovnání MT dle hodnot T a dle stádií

36

Graf 16, 17 Porovnání MT dle hodnot N

Graf 18, 19 Porovnání hodnot MT dle gradingu a korelace MT s DFI

37

7 Diskuse Na

základě

dostupných

literárních

informací

hraje

ve

složitém

procesu

karceronogeneze svou zatím neúplně objasněnou roli také MT. V rozličných typech tumorů byla prokázána overexprese a intracelulární redistribuce MT v závislosti na typu tumoru, růstové fázi, diferenciaci a apoptotickém indexu. V mnoha případech korelovala s charakteristikami tumorů a predikovala jejich biologické chování. Všechny dostupné studie se však zabývaly výhradně expresí MT ve tkáni. Histologické vzorky tkáně byly hodnoceny semikvantitativně po imunohistochemockém zpracování. V naší studii jsme vycházeli z výše zmíněných dostupných poznatků o MT. Předpokládali jsme, že patologická exprese v nádorové tkáni může indukovat elevaci MT v cirkulaci. Využili jsme metodiky elektrochemického stanovení MT v krvi a ověřovali jsme potenciál MT jako krevního onkologického markeru. Humorální markery obecně mají v klinické praxi široké využití.

Jeho absence

v onkologii hlavy a krku se stává výzvou pro další studium. Existuje několik recentních studií hledajících nádorový marker pro malignity hlavy a krku. Jednotliví autoři se snažili ověřit aplikovatelnost buď již klinicky etablovaných markerů pro malignity jiné lokalizace nebo studovali zcela nové látky na základě pracovních hypotéz o kancerogenezi a biologii nádorů. Většina studií dosáhla pouze limitovaných výsledků. Některé hodnocené markery prokázaly svůj význam, většinou však pouze izolovaně, nejčastěji jako monitorující, méně často jako diagnostické či prognostické. Zkoumány byly markery z nejrůznějších etiopatogenetických skupin, např. celulární antigeny, molekuly intercelulární matrix, lytické enzymy, růstové faktory, cytokiny atd. Nejnadějnější výsledky na relativně rozsáhlých souborech byly získány pro CYFRA 21-1, M-CSF a MMP. Naopak nádorové markery hojně klinicky využívané pro karcinomy jiných lokalit na souborech karcinomů hlavy a krku při opakovaných pokusech neprokázaly přesvědčivé výsledky. Všechny potenciální markery jsou zatím pouze ve stadiu primárního výzkumu. Doposud žádný nedosáhl takového významu, který by ho opravňoval ke klinickému využití. Kuropkat sledoval hladiny M-CSF (macrophage colony stimulating factor) v séru u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku (SCCHN). Byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny M-CSF ve srovnání s kontrolní skupinou zdravých jedinců. Koncentrace MCSF v séru nekorelovala s velikostí tumoru dle TNM. (76) Kuropkat v další studii hodnotil hladiny MMP 3,8 a 9 (matrix metaloproteinase) a M-CSF v séru pacientů se SCCHN. Proti kontrolní skupině ukázaly výsledky přesvědčivou korelaci hladin MMP 3, 8 a M-CSF

38

s přítomností nádorového onemocnění. (77, 78) Doweck sledovala hladiny CYFRA 21-1 (fragment cytokeratinu 19) v séru u 38 pacientů se SCCHN.

Před zahájením léčby u

onkologicky nemocných pacientů byla potvrzena signifikantní elevace CYFRA 21-1 ve srovnání s kontrolní skupinou. S ohledem na parametry přežití a ve vztahu s TNM byla CYFRA 21-1 nezávislým prognostickým markerem; s pozitivní prediktivní hodnotou 75%. Během radioterapie ukazovaly konstantně zvýšené hladiny CYFRA 21-1 na kontinuální buněčnou smrt korelující s postradiační nekrosou. Na základě těchto výsledků považují autoři CYFRA 21-1 za možný nadějný nádorový a prediktivní marker pro karcinomy hlavy a krku. (79) Céruse ve studii zahrnující 300 pacientů s neléčenými verifikovanými SCCHN potvrdil dosaženými výsledky možnosti využití CYFRA 21-1 jako nádorového markeru. Už v pilotní studii autoři prokázali signifikantně elevovanou hladinu tohoto markeru. (80) Bongers , Kuropkat ,Ogawa, Lee na vlastních souborech rovněž získali pozitivní výsledky. (81-84) Negativního výsledku na rozdíl od výše zmíněných dosáhl Yen (167 pacientů). V jeho studii CYFRA 21-1 nepotvrdila svůj potenciál nezávislého screeningového, resp. diagnostického markeru, nicméně značnou sensitivitu prokázala při monitoraci recidivy. (85) TATI (tumor associated trypsin inhibitor)

je peptid příbuzný pankreatickému sekretorickému trypsin

inhibitoru. Ve zvýšené koncentraci byl zjištěn u mnoha různých nádorových onemocnění. Goumas ve své práci stanovoval TATI spolu s CYFRA 21-1 u SCCHN. Sensitivita, resp. specificita TATI byla stanovena na 67% ,resp. 94%, u cyfry 29%, resp. 95%. Oba markery signifikantně poklesly po radikální léčbě, korelovaly s diferenciací SCCHN. (86) Squamous cell carcinoma antigen (SCCAg) je dobře známý tu marker epidermálních karcinomů cervixu, plic, jícnu.

Lara

stanovil tento antigen ve tkáni a také v séru u

nemocných s laryngeálním karcinomem. Elevace SSCAg byla zjištěna se sensitivitou 78%, korelovala dobře s hodnotami T a persistencí po ukončené terapii. K reelevaci došlo zhruba 3 měsíce před histologickou verifikací recidivy. Poléčebné hodnoty byly výbornými predikčními údaji. (87) Pectisides potvrdil SCCAg jako marker reziduální nemoci a časný prediktor relapsu. (88) Mnoho dalších autorů se snažilo najít klinické využití pro SCCAg u karcinomů hlavy a krku, většinou s nepřesvědčivými výsledky. (89-98) Malina u pacientů se SCCHN stanovoval hladinu TPA ( tkáňový polypeptidový antigen) a TPS ( polypeptidový specifický antigen, tissue polypeptide antigen).

TPS byl signifikantně elevován proti

kontrolní skupině. Nejpřesvědčivější byly výsledky u dlouhodobé monitorace pacientů a časné detekce recidivy. (99) Anttonen sledoval sérový solubilní syndecan 1 u SCCHN. Potvrdil se jeho význam jako monitorujícího a prognostického markeru. (100) Warawdekar verifikoval statisticky významnou elevaci cFN (celulární fibronektin) u pacientů se SCCHN. 39

(65% pacientů s nádorem mělo koncentrace nad 80. percentilem normálních hodnot.) (101) Kuratomi hodnotil laminin gamma 2 u pacientů se SCCHN před léčbou. Elevaci hladiny v séru zjistil pouze ve 33% případů. Dobře korelovala se špatnou prognózou přežití, resp. s persistencí nádoru po léčbě. (102) Strojana sledoval předléčebné sérové koncentrace cystatinu C (inhibitor cysteinové proteásy), byly významně elevovány. Cystatin C koreloval s invazivitou nádorů a s TNM. (103, 104) Solubilní formy adhezivních molekul E cadherinu, E selektinu,

ICAM-1 (intercelulární adhezivní molekula) a PSA (protein vážící sialová

kyselina) byly zjištěny ve zvýšené koncentraci v krvi u pacientů se SCCHN,v některých případech korelovaly částečně s TNM nebo recidivou tumoru. (105, 106, 107) Papadimitrakupoulou

potvrdil sníženou expresi insulin-like growth faktoru během

kancenogeneze, její korelaci s přítomností nádoru a pokles sérové hodnoty jako negativní prognostický faktor u SCCHN. (108) Z multifunkčních cytokinů TNF α (tumor necrosis factor α) nebo proteiny akutní fáze neměly žádný podstatný vztah ke SCCHN. (109) Výsledky potvrdily pouze význam sérového IL2, IL8 a

IL 6 jako prognostických faktorů dobře

korelujících s parametry přežití. (110, 111) Hladiny VEGFR1 (vascular endothelial growth factor receptor) a EGFR (epidermal growth factor receptor) a zejm. VEGF (vascular endothelial growth factor) v séru u pacientů se SCCHN byly hodnoceny v rámci mnoha studií relativně často, neprokázaly však žádný zásadnější význam.(112-117) Význam genu p 53 v kancerogenezi je obecně uznáván; sérové hodnoty proteinu se však stanovují výjimečně. Chaw

sledoval prognostickou hodnotu p53 sérového proteinu a anti p53 protilátky.

Předléčebné hodnoty pacientů byly vyšší než u kontrol, protilátky byly přítomny u 30% pacientů, pouze u jedné kontroly. Signifikantně korelovaly s postižením LU. (118) Buntzel se věnoval studiu vztahu hladiny selenu v séru k nádorovému onemocnění. Koncentrace sérového selenu signifikantně korelovala s objemem tumoru u lokálně pokročilého nádoru hlavy a krku. (119) Overexprese antigenu CD 44 byla zjištěna u některých epiteliálních typů nádorů. Andratschke nepotvrdil CD 44v6 jako tu markeru u SCCHN. (120) V našem souboru onkologicky nemocných jsme stanovovali hladinu MT v krvi po histologické verifikaci před zahájením onkologické léčby. Získané hodnoty byly dále porovnávány s kontrolní neonkologickou skupinou a korelovány s dalšími onkologickými a histologickými parametry. Výsledek potvrdil statisticky významný rozdíl mezi oběma skupinami. K vyloučení možného zkreslení při odlišném věkovém složení jsme provedli porovnání věkově ekvivalentních části obou souborů. I při tomto srovnání byla potvrzena signifikantní odlišnost obou skupin.

40

Experimentálně jsme stanovili za hraniční hodnotu fyziologické normy koncentraci MT 1µM. Celý soubor kontrolních vzorků splňoval stanovenou podmínku, všechny koncentrace byly nižší než tato hodnota. Naopak v souboru onkologických pacientů byla pouze jednou zjištěna hodnota nižší než 1 µM. Ve všech ostatních případech byla hladina elevovaná nad 1µM. Pokud bychom považovali hodnotu 1 µM MT v krvi za normální, pak bylo v našem kontrolním souboru 100% hodnot v normě a v souboru onkologických pacientů 98,7% vzorků nad normou. Na základě analyzovaných výsledků byly pro hodnoty našeho měření stanoveny velmi dobré parametry daného markeru (sensitivita 99%, specificita 100%, pozitivní prediktivní hodnota 100% a negativní prediktivní hodnota 98%). Verifikace významné elevace MT v krvi v souvislosti s výskytem malignity by mohla být považována za klinicky pozoruhodný výsledek. MT se ukázal jako nadějný potenciální marker, který by zasluhoval další studium. Podařilo se najít jasně definovanou hraniční hodnotu, která pro náš soubor s vysokou spolehlivostí odlišila zdravé a onkologicky nemocné. Přes přesvědčivost získaných výsledků jsme si vědomi rizika spojeného s relativně nízkým počtem členů v obou souborech. K získání dalších informací a objektivizaci výsledků plánujeme navázat rozsáhlejší prospektivní studií, která by zahrnovala větší počet pacientů, včetně karcinomů dalších lokalit hlavy a krku. Nutností také zůstává zhodnocení širšího spektra kontrolních skupin, zahrnující také nenádorové patologické stavy, vůči kterým by byl onkologický soubor vymezen. Otázkou do budoucnosti zůstává možnost využití MT také jako prognostického, prediktivního, resp. monitorujícího markeru. Odpověď může přinést srovnání

MT

s parametry přežití (OAS a DFS) při dlouhodobějším sledování pacientů. Při zjištěné souvislosti hladiny MT s horší prognózou pacientů bychom mohli získat prostředek k eventuelní selekci pacientů vyžadující razantnější protinádorovou léčbu. Předmětem dalšího sledování zůstává souvislost hladiny MT s rezistencí na léčbu cisplatinou. Tato rezistence byla vysvětlena vyvázáním molekuly cDDP metalothioneinem. Ověření hypotézy by podpořilo význam MT jako prediktivní markeru chemorezistence. Další eventualitou může být využití MT jako monitorujícího markeru; tj. sledování pacientů v průběhu aplikace různých léčebných modalit a během dispenzarizace. Případná korelace s klinickým stavem a reelevace markeru by usnadnila včasnou diagnostiku recidivy onemocnění. Na stávajícím souboru jsme hledali bližší souvislosti mezi hodnotami MT a konkrétními parametry onemocnění. Nebyla zjištěna souvislost MT s pokročilostí nádorů, nelišila se raná stadia od lokálně pokročilých nádorů. Limitující v tomto srovnání zůstává nerovnoměrnost rozložení nádorů dle pokročilosti. Počtem jednoznačně převažovala 41

pokročilá stádia. Současně je nutné brát v úvahu velkou biologickou variabilitu v rámci téhož histologického typu a stádia nádoru, která není vyjádřitelná rutinním klinickým a histologickým vyšetřením, ale mohla by ovlivňovat produkci MT. Hladina MT nebyla ani významněji ovlivněna metastatickým potenciálem nádorů. Nenalezli jsme jasnou korelaci s hodnotou N, přestože je naznačena tendence vzestupu hodnot MT u vysokých hodnot N. MT se neměnila s histologickým gradingem, který může být považován za další z parametrů agresivity nádoru. Pro parametry přežívání jsme doposud získali pouze krátkodobé výsledky, tj. DFI a AOS jsme mohli stanovit pro 12 a 18 měsíců. Ani z těchto předběžných výsledků žádná signifikantní korelace s MT patrná nebyla. V mnoha literárních odkazech o expresi MT v nádorové tkáni bylo konstatováno, že exprese MT lze považovat za negativní prognostický marker,

resp.

marker

agresivního

chování

nádoru.

Verifikován

byl

jeho

vztah

k agresivnějšímu chování, nižší diferenciaci, pokročilému stadiu resp. horším parametrům přežití. Podobnou korelaci se na našem souboru ověřit nepodařilo, MT neměl jednoznačný vztah k žádnému ze sledovaných charakteristik nádoru ani parametrů přežívání. Vzájemně jsme srovnávali mezi sebou skupinu kuřáků a nekuřáků. Chtěli jsme ověřit hypotézu o možném vlivu kouření na elevaci MT. Kuřáctví lze považovat za dlouhodobý oxidativní stres, který by mohl reaktivně zvyšovat hladinu MT jako součást obranného mechanismu. Tento předpoklad se na našem souboru nepotvrdil. Obdobně je popsána souvislost MT se zánětlivými procesy. Některými autory bývá MT považován za protein akutní fáze zánětu v širším slova smyslu. U všech sledovaných pacientů jsme stanovili i hodnoty CRP, které jsou směrodatným ukazatelem akutního zánětu. Hladiny CRP a MT spolu vzájemně nekorelovaly. Analogicky jsme také hledali souvislost MT s hepatopatiemi. Hepatopatie u všech pacientů našeho souboru byla etiologie toxonutritivní, jejíž hlavním ukazatelem byl enzym GMT. Dle literárních údajů dochází na podkladě hepatopatie k vzestupu MT. (20) V našem souboru jsme nezjistili rozdíl mezi skupinou pacientů s normálními a patologickými hodnotami GMT.

42

8 Závěr V naší studii byl hodnocen soubor pacientů s karcinomem orofaryngu. Naměřené hodnoty MT v krvi před zahájením léčby byly analyzovány, srovnávány s kontrolní skupinou a hodnoceny souvislosti s klinickopatologickými charakteristikami onemocnění. Z analýzy získaných výsledků na našem souboru je patrné, že koncentrace MT v krvi u onkologicky nemocných se statisticky významně lišila od kontrolní skupiny. Experimentálně jsme stanovili hraniční hodnotu pro možnou diferenciaci fyziologických a patologických hodnot na 1µM. Za těchto podmínek by MT jako onkologický diagnostický marker pro náš soubor vykazoval vysokou sensitivitu i specificitu. Jedná se však o výsledky limitované velikostí hodnoceného souboru. K dalšímu ověření získaných výsledků se předpokládá rozšíření souboru onkologických pacientů. Nutností zůstává také zhodnocení širšího spektra kontrolních skupin, nejen fyziologických, ale i nenádorových patologických stavů. Hypotéza

a

možné

souvislosti

MT

s

bližšími

standardně

etablovanými

charakteristikami nádorového onemocnění naopak zatím potvrzena nebyla. Hodnoty MT nekorelovaly s pokročilostí nádoru, metastatickým potenciálem ani gradingem nádorů. Otázkou do budoucnosti zůstává ověření možností využití MT jako monitorujícího, prognostického, resp. prediktivního markeru při časné diagnostice recidiv, selekci pacientů s horšími parametry přežití, resp. identifikaci chemorezistentních nádorů.

43

9 Literatura 1/ Vermorken J.: Medical treatment in head and neck cancer. Annals of oncology 2000; 16: 258-264 2/ Chen A., Schrag N., Hao Y., Stewart A., Ward E.: Changes in treatment of advanced oropharyngeal cancer 1985-2001. Laryngoscope 2007; 117: 16-21 3/ Rassekh Ch., Johnson J. T., Eibling D. E.: Circulating markers in squamous cell carcinoma of the head and neck: a review. Eur J cancer 1994; vol 30B, 1: 23-28 4/ Hardisson D.: Molecular pathogenesis of head and neck squamous coll carcinoma. Eur Arch otorhinolaryngol 2003; 260: 502-508 5/ Sandri M., McMahon J., Parker A.: Laryngeal dysplasia: aetiology and molecular biology. Journal of laryngology 2006; 120: 170-177 6/ Myers E., Suen J., Myers J., Hanna E.: Cancer of the head and neck. Elsevier science 2003 7/ Nemeth Z., Belich N., Bogdan S., Ujpal M., Szabo G., Suba Z.: The prognostic role of clinical, morphological and molecular markers in oral squamous cell tumors. Neoplasma 2005; 52: 2 -5 8/ Hajdúch M., Jarošová M., Trojanec R., Indrák K., Špačková K., Papajík T., Cwiertka K.: Cytogenetické a molekulárně biologické markery v onkologii solidních nádorů a hematologických malignit. Klinická onkologie; suplement 2004:51-56 9/ Kaušitz J.: Význam a postavenie nádorových markerov v skríningu, diagnostike a sledovaní pacientov v onkológii. Onkológia 2006; 1: 155-158 10/ Coyle P., Philcox J., Carey L., Roge A.: Metallothionein: the multipurpose protein. Cell Mol Life Sci 2002; 59: 627-647 11/ Vallee B.: The function of metallothionein. Neurochem Int 1995; 27: 23-33 12/ Dunn M.A., Blalock T. L., Cousins R.J.: Metallothionein, minireview, proceedings of the society for experimental biology and medicine 1987; 185: 107-119 13/ Richards R., Heguy A., Karin M.: Structural and functional analysis of the human metallothionein Ia gene. Cell 1984; 37: 263-272 14/ Stennard F., Holloway A., Hamilton J., West A.: Characterisation of six additional human metallothionein genes. Biochimica et biophysica acta 1994; 1218: 357-365 15/ Quaife C., Findley S., Ericsson J., Froelick G. et al.: Induction of a new metallothionein isoform occurs during differentiation of stratified squamous epithelia. Biochemistry 1994; 33: 7250-7259 16/ Woo E., Kondo Y., Watkins S., Hoyt D., Lazo J.: Nucleophilic distribution of metallothionein in human tumor cells. Experimental cell research 1996; 224: 365-371 17/ Haq F., Mahoney M., Koropatnick J.: Signaling events for metallothionein induction. Mutation research 2001; 533: 211-226 18/ Oh S., Dagen J., Whanger P., Weswig P.: Biological function on metallothionein, its induction in rats by various stresses. Am J physiol 1978; 234: 282-285 19/ Brady F.O.: The physiological function of metallothionein. Biochemical press 1982;5: 143-145 20/ Mulder T., Janssens A., Verspaget H., Lamers C.: Plasma metallothionein concentration in patients with liver disorders: special emphasis on the relation with primary biliary cirrhosis. Hepatology 1991; 14: 1008-1012 21/ Maret W.: The function of zinc metllothionein a link between cellular zinc and redox state. J nutr 2000; 130: 1455-1458 22/ Viarengo A., Burlando B., Ceratto N., Panfoli I.: Antioxidant role of metallothioneins a comparative overview. Cellular and molecular biology 2000; 46: 407-417 23/ Ebade M., Leuschen M., Regaty H., Hamada F.: The Antioxidant properties of zinc and metallothionein. Neurochem Int 1996; 29: 159-166

44

24/ Miura T., Muraoka S., Ogiso T.: Antioxidant activity of metallothionein compared with reduced glutathione. Life sciences 1997; 60: 301-309 25/ Andrews G.: Regulation of metallothionein gene expression by oxidative stress and metal ions. Biochemical pharmacology 2000; 59: 95-104 26/ Sato O., Kondoh M.: Recent studies on metallothionein protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals. J exp med 2002; 196: 9-22 27/ Alscher D., Braun N., Biegger D., Stuelten Ch., Gawronski K., Murdter T., Kuhlmann U., Fritz P.: Induction of metallothionein in proximal tubular cells by zinc and its potential as an endogenous antioxidant. Kidney blood press res 2005; 28: 127-133 28/ Miesel R., Zuber M.: Reactive nitrogen intermediates, antinuclear antibodies and copper thionein in serum of patients with rheumatic diseases. Rheumatolo int 1993; 13: 95-102 29/ Cai L., Wang J., Li Y., Sum X. et al.: Inhibition of superoxide generation and associated nitrosative damage is involved in metallothionein prevention of diabetic cardiomyopathy. Diabetes 2005; 54: 1829 -1833 30/ Scheede Bergdahl C., Penkowa M., Hidalgo J., Olsen D., Schjerling P., Prats C., Boushel R., Dela F.: Metallothionein mediated antioxidant defense system and its response to exercise training are impaired in human type 2 diabetes. Diabetes 2005; 54: 3089-3094 31/ Penkowa M., Keller P., Keller C., Hidalgo J., Giralt M., Pedersen B.: Exercise induced metallothionein expression in human skeletal muscle fibres. Exp physiol 2004; 90: 477-486 32/ Li Y.: Zinc sensing mechanism involves linker peptides between the zinc fingers, Mol cell biol 2006; 26: 5580-5587 33/ Bakka A., Endresen L., Johnsen A., Edminson P., Rugstad H.: Resistance against cis dichlorodiammineplatinum in cultured cells with a high content of metallothionein. Toxicology and applied pharmacology 1981; 61: 215-226 34/ Zelazowski A., Garvey J., Hoeschele J.: In vivo and in vitro binding of platinum to metallothionein. Archives of Biochemistry and Biophysics 1984; 229: 246-252 35/ Kelley S., Basu A., Teicher B., Hacker M., Hamer M., Lazo J.: Overexpression of metallothionein confers resistance to anticancer drugs. Sceince 1988; 241: 1813-1815 36/ Satoh M., Cherian G., Imura N., Shimizu H.: Modulation of resistance to anticancer drugs by inhibition of metallothionein synthesis. Cancer Research 1994; 54: 5255-5257 37/ Vandier D., Calvez V., Massade L., Gouyette A., Mickley L., Foje T., Rixe O.: Transactivation of the metallothionein promoter in cisplatim-resistant cancer cells. Journal of the National Cancer Institute 2000; 92: 642-647 38/ Kizek R., Vacek J., Adam V. Vojtěšek B.: Vztah metalothioneinu k rakovině a protinádorové léčbě. Klin.biochem. Metab. 1990; 2: 72-78 39/ Cai Lu., Satoh M., Tohyama C., Cherian M.: Metallothionein in radiation exposure. Toxicology 1999; 132: 85-98 40/ van der Oord J.J., De Ley M.: Distribution of metallothionein in normal and pathological human skin. Arch dermatol res 1994; 286: 62-68 41/ Cherian M., Howell S., Imura N., Klaassen C. et al.: Role of metallothionein in carcinogensis. Toxikology and applied pharmacology 1994; 126: 1-5 42/ Jasani B., Schnid K.W.: Significance of metallothionein overexpression in human tumours. Histopatology 1997, 31, 211-214 43/ Pattanaik A., Shaw C., Petering D., Garvey J.: Basal Metallothionein in tumors. Journal of Inorganic Biochemistry 1994; 54: 91-105 44/ Cherian M., Jayasurya A., Bay B.: Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis. Mutation research 2003; 533: 201-209 45/ Theocharis S., Margeli A., Klijanienko J., Kouraklis G.: Metallothionein expression in human neoplasia. Histopathology 2004; 45: 103-118

45

46/ Sundelin K., Jadner M., Norberg-Spaak L., Davidsson A., Hellguist H.: Metallothionein and fas are expressed in squamous cell carcinoma of the tongue. Eur J Cancer 1997; 33: 18601864 47/ Ioachim E., Assimakupoulos D., Peschos D., Zissi A., Skevas A., Agnantis N.: Immunohistochemical expression of metallothionein in benign, premalignant and malignant epithelium of the larynx. Pathol Res Pract 1999; 195: 809-814 48/ Jayasurya A., Bay B., Yap W., Tan N., Tan B.: Proliferative potential in nasopharyngeal carcinoma. Carcinogenesis 2000; 21: 1809-1812 49/ Bay B., Jin R., Jayasurya A.: Analysis of metallothionein expression in human cancer. Acta histochem cytochem 2001; 34: 171-176 50/ Lian S., Hsu H., Lin S.: Serum copper and zinc levels in patients with nasopharyngeal carcinoma. Journal of the formosan medical association 1989; 88: 236-9 51/ Hishikawa Y., Koji T., Dhar DK., Kinugasa S., Yamaguchi M., Nagasue N.: Metallothionein expression correlates with metastatic and proliferative potential in squamous cell carcinoma of the oesophagus. British Journal of cancer 1999; 81: 712-720 52/ Yamamoto M., Tsujinaka T., Shiozaki H., Doki Y. et al.: Metallothionein expression correlates with the pathological response of patients with esophageal cancer undergoing preoperative chemoradiation therapy. Oncology 1999; 56: 332-336 53/ Nartey N., Cherian M., Banerjee D.: Immunohistochemical localization of metallothionein in human thyroid tumors. Am J Pathol 1987; 129: 177-182 54/ Kuo T.: Immunohistochemical metallothionein expression in thymoma. Histopathology 1997; 30: 243-248 55/ Mariamma J., Diponkar B., Kocha .W. et al.: Metallothionein expression in patients with small cell carcinoma of the lung. Cancer 2001; 92: 836-42 56/ Kasahara K., Fujiwara Y., Nishio K., Ohmori T. et al.: Metallothionein content correlates with the sensitivity of human small cell lung cancer cell lines to cisplatin. Cancer Research 1991; 51: 3237-3242 57/ Bier B., Douglas Jones A., Totsch M. et al.: Immunohistochemical demonstration of metallothionein in normal human breast tissue and benign and malignant breast lesions. Breast Cancer Research and Treatment 1994; 30: 213-221 58/ Fresno M., Wu W., Rodriguez J., Nadji M.: Localization of metallothionein in breast carcinomas. Virchows Archiv Pathol Anat 1993; 423: 215-219 59/ Sens M., Somji S., Garrett S., Beall C., Sens D.: Metallothionein isoform 3 overexpression is associated with breast cancers having a poor prognosis. American Journal of Pathology 2001; 159: 21-26 60/ Oyama T., Takei H., Hikino T., Iino Y., Nakajima T.: Immunohistochemical expression of metallothionein in invasive breast cancer in relation to proliferative activity, histology and prognosis. Oncology 1996; 53: 112-117 61/ Schmid K., Ellis I., Gee J., Darke B. et al.: Presence and possible significance of immunocytochemically demonstrable metallothionein overexpression in primary invasive ductal carcinoma of the breast. Virchows Archi Pathol Anat 1993; 422: 153-159 62/ Tan Y., Sinniah R., Bay B., Singh G.: Metallothionein expression and nuclear size in benign, bordeline and malignant serous ovarian tumours. Journal of Pathology 1999; 189: 6065 63/Murphy D., McGown A., Crowther D., Mander A., Fox B.: Metallothionein levels in ovarian tumours before and after chemotherapy. Br. J. Cancer 1991; 63: 711-714 64/ Weinlich G., Bitterlich W., Mayer V., Fritsch P., Zelger B.: Metallothionein overexpression as a prognostic factor for progression and survival in melanoma. British Journal of Dermatology 2003; 149: 535-541

46

65/ Ofner D., Maier H., Riedmann B., Bammer T.: Immunohistochemical metallothionein expression in colorectal adenocarcinoma. Virchows Archiv 1994; 425: 491-497 66/ Izawa J., Moussa M., Cherian G., Doig G., Chin J.: Metallothionein expression in renal cancer. Urology 1998; 52: 767-772 67/ Onosaka S., Min K., Fukuhara C., Tanaka K.: Concentrations of metallothionein and metals in malignant and non malignant tissues in human liver. Toxicology 1986, 38, 261-268 68/ Huang G., Yang L.: Metallothionein expression in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2002; 8: 650-653 69/ Cherian G.: The Significance of the nuclear and cytoplasmic localization of metallothionein in human liver and tumor cells environ. Health Perspect 1994; 102: 131-135 70/ Cousins RJ.: Measurement of human metallothionein by enzyme linked immunosorbent assay. Methods in enzymology 1991; 205: 131-139 71/ Mulder T., Janssens A., Verspaget H., Lamers C.: Development of a radioimmunoassay for human metallothionein. Journal of immunological methods 1990; 130: 157-161 72/ Nakayama A., Fukuda H., Ebara M., Hamasaki H., Nakajima K., Sakurai H.: A new diagnostic method for chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma base on serum metallothionein copper and zinc levels. Biol Pharm bull 2002; 25: 426-31 73/ Akintola D., Sampson B., Fleck A.: Development of an enzyme linked immunosorbent assay for human metallothionein 1 in plasma. J lab clin med 1995; 125: 119-127 74/ Kizek R., Trnkova L., Paleček E.: Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopotentiometry. Anal. Chem. 2001; 73: 4801-4807 75/ Kizek R., Vacek J., Trnková L., Klejdus B., Havel L.: Application of catalytic reactions on a mercury electrode for electrochemical detection of metallothioneins. Chemické Listy 2004; 98: 166-173 76/ Kuropkat C., Dünne A.A., Plehn S., Ossendorf M., Hez U., Renz H., Werner J.A.: Macrophage colony-stimulating factor as a tumor marker for squamous cell carcinoma of the head and neck. Tumor biology 2003; 25: 236-240 77/ Kuropkat C., Duenne A.A., Herz U., Renz H., Werner J.A.: Significant correlation of matrix metalloproteinase and macrophage colony-stimulating factor serum concentrations in patients with head and neck cancer. Neoplasma 2004; 51: 5 78/ Kuropkat C., Plehn S., Herz U., Dünne AA., Renz H., Werner JA.: Tumor marker potential of serum matrix metalloproteinases in patients with head and neck cancer. Anticancer research 2002; 22: 2221-2228 79/ Doweck I., Barak M., Urin N., Greenberg E.: The prognostic value of the tumour marker CYFRA 21-1 in carcinoma of head and neck and its role in early detection of recurrent disease. British journal of cancer 2000; 83: 1696-1701 80/ Céruse P., Rabilloud M., Chrrié A., Dubreuil C., Disant F.: Study of CYFRA 21-1, a tumor marker in head and neck squamous cell carcinoma. Annals of otology, rhinology and laryngology 2005; 114: 768-776 81/ Bongers V., Braaknuis BJ., Snow GB.: Circulating fragments of cytokeratin 19 in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Clin Otolaryngol 1995; 20: 479-482 82/Kuropkat C., Lippert BM., Warner JA.: Follow up with serum CYFRA 21-1 in patients with squamous cell carcinomas of the head and neck. Oncology 2002; 63: 3-13 83/ Ogawa T., Tsurusako Y., Nobuhiko K., Shinji N. Akagi H., Nishioka K, Rutka J.: Comparison of tumor markers in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Acta otolaryngol 1999; suppl 540: 72-76 84/ Lee JK., Hsieh JF., Tsai SC., Ho Y. et al.: Comparison of CYFRA 21-1 and squamous cell carcinoma antigen in detection nasopharyngeal carcinoma. Annal of otology, rhinology and laryngology 2001; 110: 775-783

47

85/ Yen TC., Lin WY., Kao CH., Cheng KY., Wang SJ.: A study of a new tumour marker, CYFRA 21-1 in squamous cell carcinoma of the head and neck, and comparison with squamous cell carcinoma antigen. Clin Otolaryngol 1998; 23: 82-86 86/ Goumas P., Mastronikolis N., Mastrokou A., Vassilakos P., Nikiforidis G.: Evaluation of TATI and CYFRA 21-1 in patients with head and neck squamous cell carcinoma. ORL 1997; 59: 106-114 87/ Lara P., Cuyas J.: The role of squamous cell carcinoma antigen in the management of laryngeal and hypopharyngeal cancer. Cancer 1995; 76: 758-64 88/ Pectisides D., Bouzaranis J., Economides N., Pozadzidou P., Gogou L., Koutsiouba P.: Squamous cell carcinoma antigen, carcinoembryonic antigen and tumor associated trypsin inhibitor for monitoring head and neck cancer. Int J Biol Markers 1993; 8: 81-87 89/ Minno Myogawa N., Kimuray H., Hamamoto K.: Tumor antigen 4. Its immunohistochemical distribution and tissue and serum concentrations in squamous cell carcinoma of the lung and esophagus. Cancer 1990; 66: 1505-1512 90/Prades JM., Vindimian M., Martin C.: Pre treatment serum levels of SCC antigen in epidermoid carcinoma of the upper respiratory and digestive tract. Ann Otolaryngol Cervicofac 1990; 107: 47-52 91/ Walther E., Dahlmann M., Gorgulla H.: Tumors markers in the diagnosis and follow up of head and neck cancer: role of CEA, CA 19-9, SCC, Tk and dTTPase. Head Neck 1993; 15: 230-235 92/ Kulpa J., Stasik Z., Skolyszewski J., Wojcik E., Rychlik U., Pudelek K.: Predictive value of SCC Ag, CYFRA 21-1 and selected acute phase proteins in radiotherapy of pharyngeal and laryngeal cancer. Neoplasma 2004; 51: 2 93/ Kuhel W., Chow H., Godwin TA., Minick CR., Libby DM.: Elevated carcinoembryonic antigen levels correlating with disease recurrence in a patient with adenoid cystic carcinoma. Head Neck 1995; 17: 431-436 94/ Walther EK., Dahlmann N., Gorgulla HT.: CEA, CA 19-9 in in the diagnosis and follow up of head and neck cancer. Head Neck 1992; 15: 200-215 95/ Pectasides D., Bourazanis J., Economides N. et al.: Squamous cell carcinoma antigen, carcinoembryonic antigen and tumour associated trypsin inhibitor TATI for monitoring head and neck cancer. Int J Biol Marders 1993; 8: 81-87 96/ Rosati G., Riccardi F., Tucci A.: Use of tumor markers in the management of head and neck cancer. Int J biol Markers 2000; 15: 179-183 97/ Clasen B., Pere P., Senekowitsch R., Menz E.: Das plattenepithelkarzinomassoziierte antigen als tumormarker bei der initialdiagnostik von karzinomen des kopf hals gebietes. Laryngo Rhino Otol 1990; 69: 275-280 98/ Straka M., Wagner R. Johnson J., Kachman K., Eibling D.: The lack of utility of a tumor marker panel in head and neck carcinoma. Arch otolaryngol head neck surg 1992; 118: 802805 99/ Molina R., Torres M., Moragas M., Filella X., Jo J., Gimonez N., Traserra J, Ballesta A.: Prognostic value of TPS in patients with head and neck malignancies: comparison with SCC. Anticancer research 1995; 15: 479-484 100/ Anttonen A., Leppa S., Heikkila P., Grenman R., Joensuu H.: Effect of treatment of larynx and hypopharynx carcinomas on serum syndecan-1 concentratins., Journal of cancer research and clinical oncology 2006; 10:1007-1010 101/ Warawdekar U., Zingde S., Iyer K., Jagannath P., Mehta A., Mehta N.: Elevated levels and fragmented nature of cellular fibronectin in the plasma of gastrointestinal and head and neck cancer patients. Clinica chimica acta 2006; 372: 83-93

48

102/ Kuratomi Y., Katayama M., Kidera K., Hayashida S. et al.: Blood concentration of laminin gamma 2 chain in patients with head and neck cancer. Nippon, Saga university (on line) 2006; 109: 517-523 103/ Strojan P., Svetic B. Smid L., Kos J.: Serum cystatin C in patients with head and neck carcinoma. Clinica chimica acta 2004; 344: 155-161 104/ Strojan P., Budihna M., Smid L., Svetic B., Vrhovec I., Skrk J.: Cathepsin B and L and stefin A and B levels as serum tumor markers in squamous cell carcinoma of the head and neck. Neoplasma 2001; 48: 66-71 105/ Liu C., Sheen T., Ko J., Shun C.: Circulating intercellular adhesion molecule 1, E selectin and vascular cell adhesion molecule 1 in head and neck cancer. British Journal of Cancer 1999; 79: 360-362 106/ Akcay F., Taysi S., Uslu C., Dogru Y., Gümüstekin A.: Levels of soluble intercellular adhesion molecule-1 and total sialic acid in serum of patients with laryngeal cancer. Japanese journal of clinical oncology 2001; 31: 12-20 107/ Bhatavdekar J., Vora H., Patel D.: Serum sialic acid forms as markers for head and neck malignancies. Neoplasma 1988; 35: 4 -10 108/ Papadimitrakupoulou BA., Brown EN., Liu DD., El Naggar AK., Lee JJ., Hong WK., Lee HY.: The prognostic role of loss of insulin like growth factor binding protein 3 expression in head and neck carcinogenesis. Cancer letters 2006; 239: 136-143 109/ Soylu L., Ozcan C., Cetik F., Paydas S., Kiroglu M. et al.: Serum levels of tumor necrosis factor in squamous cell carcinoma of the head and neck. Am J Otolaryngol 1994; 15: 281-285 110/ Tartour E., Deneux L., Mosseri V., Jaulerry C., Brunin F. et al.: Soluble interleukin 2 receptor serum level as a predictor of locoregional control and survival for patients with head and neck carcinoma: results of a multivariate prospective study. Cancer 1997; 79: 1401-1408 111/ Riedel F., Zaiss I., Herzog D., Gotte K., Naim R., Hormann K.: Serum levels of interleukin 6 in patiets with primary head and neck squamous cell carcinoma. Anticancer res. 2005; 25: 2761-2765 112/ Godhale A., Haddad R., Cavacini L., Wirth L. et al.: Serum concentrations of interleukin 8, vascular endothelial growth factor and epidermal growth factor receptor in patients with squamous cell cancer of the head and neck. Oral Oncol 2005; 41: 70-76 113/ Homer J., Greenman J., Drevs J., Mame D., Stafford N.: Soluble Tie 2 receptor levels independently predict locoregional recurrence in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck 2002; 24: 773-778 114/ Riedel F., Gotte K., Schwalb J., Wirtz H., Bergler W., Hormann K.: Serum levels of vascular endothelial growth factor in patients with head and neck cancer. Eur arch Otorhinolaryngol 2000; 257: 332-336 115/ Dietz A., Rudat V., Conradt C., Weidauer H., Ho A., Moehler T.: Prognostic relevance of serum levels of the angiogenic peptide bFGF in advanced carcinoma of the head and neck treated by primary radiochemotherapy. Head Neck 2000; 22: 666-673 116/ Teknos T., Cox C., Yoo S., Chepeha D., Wolf G., Bradford C., Carey T., Fisher S.: Elevated serum vascular endothelial growth factor and decreased survival in advanced laryngeal carcinoma. Head Neck 2002; 24: 1004-1011 117/ Yamanaka N., Harabuchi Y., Himi T., Kataura A.: Immunosuppressive substance in the sera of head and neck cancer patients. Cancer 1988; 62: 1293-1298 118/ Chow V., Yuen A., Lam K., Ho W., Wei W.: Prognostic significance of serum p53 protein and p53 antibody in patients with surgical treatment for head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck 2001; 23: 286-291

49

119/ Buntzel J., Micke O., Glatzel M., Frohlich D., Bruns F., Mucke R., Schonekaes K.: Serum selenium in head and neck cancer patients- a new marker of tumor activity. Anticancer research 2005; 25: 1711-1712 120/ Andratschke M., Chaubal S., Pauli C., Mack B., Hagedorm H., Wollenberg B.: Soluble CD 44v6 is not a sensitive tumor marker in patients with head and neck squamous cell cancer. Anticancer research 2005; 25: 2821-2826

50

Seznam použitých zkratek AdTS - adsorptivní rozpouštěcí přenos AK - aminokyselina ALT - alaninaminotransferáza AST - aspartátaminotransferáza AOS - celkové kumulativní přežití ARE - element odpovídající na antioxidant cDDP - cisplatina CPSA - chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza CRP - C reaktivní protein CYFRA 21-1 - fragment cytokeratinu 19 DFI - období bez recidivy DPV - diferenční pulsní voltametrie DSS - pro nádor specifické přežití GC - glukokortikoid GMT - gamma-glutamyltransferáza GRE - element odpovídající na glukokortikoid GSH - glutathion CHRT - chemoradioterapie CHT - chemoterapie IL - interleukin MMP - matrixmetaloproteináza MT - metalothionein MTF - faktor transportující kovy MRE - element odpovídající na kovy PND - paranazální dutiny RT - radioterapie SCCAg - antigen spinocelulárního karcinomu SCCHN - spinocelulární karcinom hlavy a krku TSG - tumor supresorový gen

51