Stanovení katepsinu B v séru a v moči u pacientů s karcinomem močového měchýře Kotaška, K.1, Dušek P.2, Průša, R.1, Veselý, Š.2, Babjuk, M2. 1)
Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2 LF UK a FN v Motole, Praha
2)Urologická klinika 2. LF UK a FN v Motole, Praha
Katepsin B Papainová cysteinová proteáza lokalizovaná v lysozómech (33-35kDa), těžký řetězec (29kDa) + lehký řetězec (6 kDa) MPR- aktivace
Preprokatepsin B
Prokatepsin B (46 kDa)
Endoplazmatické retikulum
Katepsin B (33 kDa)
Lysozóm Glykosylace a exkrece (5 %)
Gen 8p22 (11 exonů) Exprimován u nádorových procesů, podílí se na progresi řady tumorů (prsa, plíce, kolorektální karcinom, gliomy, prostata)
? Jaká je koncentrace katepsinu B u karcinomu močového měchýře?
Katepsin B Metabolizmus proteinů a udržování normálního metabolizmu buněk (štěpení membránových proteinů, aktivace antigen prezentujících buněk, degradace extracelulární matrix, remodelace tkání) Prokatepsin B Katepsin D, Katepsin G, uPA, tPA,elastáza Katepsin B
Degradace extracelulární matrix Yan a Sloane, 2003
aktivace prekurzorů
přímá aktivace
Karcinom močového měchýře -
nejčastější malignita močového traktu
-
Uroteliální karcinom - 90%, 10% karcinom skvamózních buněk, adenokarcinom, sarkom, karcinom malých buněk
-
V České republice se jedná o 6. nejčastější malignitu u mužů a 13. u žen.
-
Incidence v ČR se pohybuje okolo 23/100 000 obyvatel a stoupá s věkem
-
Mortalita 9/100 000
-
Diferencovanost, invazivita a metastázy (lymfatické uzliny, prostata, děloha, GIT-břicho)
? Jaký je vztah koncetrace katepsinu B k diferencovanosti a invazivitě tumoru?
Rizikové faktory, symptomy a léčba karcinomu močového měchýře Rizikové faktory -
Muži Věk > 50 let Evropská (Kavkazská) populace Kouření Strava (lipidy, mražené) Práce v chemickém průmyslu (barvy, laky) Bakteriální infekce Historie infekcí močového měchýře Dlouhodobé zavedení močových katétrů Cyklofosfamid, auramin, fenacetin Radioterapie Ca prostaty
Symptomy a příznaky - mikroskopická i makroskopická hematurie se zánětem - anemie, hubnutí, nechutenství - časté a bolestivé močení - dysurie, hydronefróza
Léčba Dle závažnosti - operativně - chemoterapie - imunoterapie
Klasifikace nádorů močového měchýře Dělení podle diferenciace GX
stupeň diferenciace nelze hodnotit
G1
pomalu rostoucí (dobře diferencované) Středně rychle rostoucí
G2 G3
(LG)
Rychle rostoucí (málo diferencované) (HG)
neoplazma
G1
Low grade (LG)
G2
High grade (HG)
G3
Klasifikace nádorů močového měchýře - diferencovanost
Papilární neoplazma Dobře diferencovaný (LG) Málo diferencovaný (HG)
Typy nádorů močového měchýře Močovody
Lamina propria
Urotelium (mukóza
Vnitřní svalovina Perivezikální tuková vrstva Metastázy (Rektum, GIT aj.)
Močová trubice T2-T4 – invazivní tumory Ta,Tis,T1 – neinvazivní tumory
T1-T4 - diferencované Ta, Tis - nediferencované
Klasifikace nádorů močového měchýře Stadium 0a
Ta
N0
M0
Stadium 0is
Tis
N0
M0
Stadium I
T1
N0
M0
Stadium II
T2a
N0
M0
T2b
N0
M0
T3a
N0
M0
T3b
N0
M0
T4a
N0
M0
T4b
N0
M0
jakékoliv T
N1-3
M0
jakékoliv Ta
N
M1
Stadium III
Stadium IV
Karcinomy Ta, T1 a Tis tvoří 75-85 % všech nádorů močového měchýře
Mechanizmus tumorogeneze uroteliálního karcinomu močového měchýře pTa Regulace exprese buněk uroteliální tkáně
9pDel (INK4A)
RAS FGFR3 PI3K 9pDel
povrchový papilární karcinom (LG)
superficiální 15% papilární karcinom (HG)
pT1
pTis Uroteliální tkáň
TP53 RB PTEN
60-80%
pT2
6qDel 11pDel 18qDel
Invazivní karcinom
5qDel, 3pDel,10qDel
Karcinom in situ (HG)
Castillo-Martin et al., 2010 modifikováno
Imunohistochemické metody • Histologické řezy tkáně fixované formolem a zalité do parafinu. • Primární myší monoklonální protilátka proti katepsinu B (klon CB131) • Antigen – prokaryotický rekombinantní protein komplementární s celou molekulou lidského katepsinu B Rozsah nádoru • Cystoskopie, zobrazovací metody (CT, NMR), histopatologie z operačního preparátu
Imunohistochemická detekce katepsinu B
A
B C Eijan et al, 2003
A- normální nález, katepsin B exprimován v cytoplazmě buněk lumina B- Málo diferencovaný TCC tumor s nízkou expresí katepsinu B v cytoplazmě C- invazivní tumor s intenzivní expresí katepsinu B
Charakteristika pacientů 78 pacientů, bez metastáz (M0) Invazivní
Neinvazivní
Celkem
Nediferencované tumory (HG)
38
13
51
Diferencované tumory (LG)
3 (T2a, NX, M0) 24 (T2, NX, MX) (T3a,N0, M0)
27
37
78
41
16 (N 1) 22 (N 0)
Biochemické metody Stanovení koncentrace katepsinu B v séru a v moči • EIA (RD Biosystems) Referenční rozmezí: Sérum: 27-126 ng/ml Moč: do 2,54 ng/ml U- kreatinin – enzymatická kreatinázová kolorimetrická metoda - ref. rozmezí 5,7 – 14,7 mmol/l Kontrolní skupina N = 94 Muži/ženy
Pacienti N = 78
p
40/54
57/21
Prům. věk (rozpětí)
55 (34-85)
68 (26-91)
S-katepsin B (μg/l) (median+SEM)
58,04+3,10
70,28+4,80
U-katepsin B (μg/l) (median+SEM)
1,35+0,45
4,37+1,43
<0,0001
U-kreatinin (mmol/l) (median+SEM)
8,40 +0,70
8,61+0,83
0,99
U-katepsin B/U-kreatinin (μg/mmol kreatininu)
0,17 + 0,04
0,56+ 0,13
<0,0001
0,002
Výsledky 100
U-Katepsin B S-Katepsin B U-katepsin B/U-kreatinin
S e n z itiv ita %
80 60
AUC
p
S- katepsin B
0,64
p<0,05
U-katepsin B
0,78
NS
U-katepsin B/kreatinin
0,79
NS
40 20 0
0
20
40
60
80
100
100% - Specificita% Cut off (ng/ml)
Specificita %
Senzitivita %
NPV%
PPV%
OR
S-katepsin B
90,5
71
62
39
87
4,11
U-Katepsin B
3,17
72
74
64
80
7,33
U-katepsin B/U-kreatinin
0,33
68
82
49
91
10,1
Výsledky
Diferencované (LG) N = 27
(H an é
N
D ife re n
fe re nc ov N ed i
)
0.0 G
) G
) (L G é co va n re n ife D
ed i N
D
if e re nc
fe re nc eo
va n
ov an é
é
(L
G
(H G
)
)
0
(H
0
0.5
ed ife re nc ov an é
5
1.0
)
50
10
(L G
100
p = 0.0240
p = 0,0081 1.5
é
15
p = 0,0018
U- Katepsin B (ng/ml)
S- Katepsin B (ng/ml)
150
Moč
co va n
Serum
U-katepsin B/U-kreatinin (μg/mmol)
Diferencované vs. Nediferencované tumory
Nediferencované (HG) N = 51
P
S-katepsin B (ng/ml)
52,07+6,06
86,0+6,2
p = 0,0018
U-katepsin B (ng/ml)
3,17+1,14
5,94 + 1,53
p = 0,0240
U-katepsin B/ kreatinin (μg/mmol kreatininu)
0,33+0,12
0,82 +0,18
p = 0,0081
Výsledky Moč
Serum
P<0,0001
1.0
40
0.5
20 0
ní z iv va in
in
va
z iv
ní ne
in
va
z iv
zi va in
ní
í vn
í vn zi va ne
in
0.0 ní
0
60
z iv
5
1.5
va
10
80
P<0,0001
in
15
2.0
ne
S -K atepsin B (ng /m l)
U- Katepsin B (ng/m l)
p = 0.061
100
20
U - k a t e p sin B /U -k r e a t in in ( μ g/m m ol)
Invazivní tumory vs. Neinvazivní tumory
Neinvazivní tumory Invazivní tumory P N = 37 N = 41 S-katepsin B (ng/ml)
57,90 + 6,94
85,78 + 6,54
p = 0,0610
U-katepsin B (ng/ml)
2,68 + 0,78
10,47 + 1,49
p < 0,0001
U-katepsin B/ kreatinin (μg/mmol kreatininu)
0,31 + 0,10
1,33 + 0,21
p < 0,0001
Další výsledky DIFERENCOVANÉ TUMORY (LG)
INVAZIVNÍ (Mediány)
NEINVAZIVNÍ (Mediány)
p
S-katepsin B (ng/ml)
30,1
55, 10
Nelze hodnotit
U-katepsin B (ng/ml)
10,8
3,32
p<0,05
U- katepsin B/kreatinin (μg/mmol kreatininu)
1,53
0,33
p<0,05
NEDIFERENCOVANÉ TUMORY (HG)
INVAZIVNÍ (Mediány)
NEINVAZIVNÍ (Mediány)
p
S-katepsin B (ng/ml)
85,4
75,3
p<0,05
U-katepsin B (ng/ml)
6,7
3,57
p<0,05
U- katepsin B/kreatinin (μg/mmol kreatininu)
1,04
0,50
p<0,05
Srovnání s literaturou Reference
Katepsin materiál metoda
invazivita
diferenciace
Staack et al. 2002
B,H,L
moč
fluorimetrie
ano L, ne B, H
HG - Ano L, ne B, H
Staack et al. 2004
B,H,L
Tkáňová kultura
fluorimetrie
----
HG – ne všechny LG – ano všechny
Eiján et al. 2003
B
tkáň
Imunohistochemie , WB
------
Korelace s progresí
Svatek et al. 2008
B,L
moč
ELISA
ne B, ano L
Ne B (HG i LG) Ano L (HG i LG)
Akpolat et al. 1998
B
tkáň
imunohistochemie
ano INV
ano
Ueda et al. 1993
B
tkáň
imunohistochemie
ano INV
ano HG
Kotaška et al. 2012
B
Sérum moč
EIA
Ano (Moč)
Ano (Sérum)
Závěry • 1. Koncentrace katepsinu B jsou zvýšené v séru i v moči pacientů s karcinomem močového měchýře Nejlepším ukazatelem je stanovení poměru U-katepsin B/kreatinin • 2. U diferencovaných tumorů je vhodné vyšetřit hladinu sérového katepsinu B • 3. U invazivních tumorů je vhodné vyšetřit hladinu katepsinu B v moči eventuelně poměr U-katepsin B/kreatinin
Současnost • Vliv včasného chirurgického zákroku na koncentraci katepsinu B • Může zvýšená koncentrace katepsinu B znamenat riziko remise nádoru? • Vliv genetických faktorů na koncentrace katepsinu B • Analýza přežívání pacientů (dlouhodobého i krátkodobého)
Děkuji za pozornost
