Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Význam dipeptidylpeptidázy-IV a homologních proteáz v procesech migrace a invaze
Edita Fejfarová Školitel: MUDr. Petr Bušek, Ph.D Praha 2010
Děkuji svému lab-guru Petrovi za trpělivé vedení a hodnotné rady při psaní této práce.
Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně na základě uvedené literatury a konzultací se svým školitelem. V Praze dne 26.4.2010
……………………. Edita Fejfarová
2
Seznam použitých zkratek: ADA – adenosin deamináza DipA – diprotin A DPP – dipeptidylpeptidáza ECM – extracelulární matrix FAP - fibroblastový aktivační protein G-CSF - faktor stimulující kolonie granulocytů GLP – glukagon-like peptide HPC - hematopoetické kmenové/progenitorové buňky mAb – monoklonární protilátka MMP – matrix metaloproteináza MT1-MMP – matrix metaloproteináza membránového typu NB - neuroblastoma NPY – neuropeptid Y Pg2 – plasminogen 2 PIP3 – fosfátidylinositol 3,4,5-trifosfát uPA – urokinázový plasminový aktivátor RANTES – regulated on activation, normal T cell expressed and secreted SDF-1α – stromal cell-derived factor α SS – Sézary syndrom
3
Abstrakt Migrace a invaze jsou děje probíhající přirozeně v organismu během embryogeneze, při imunitních reakcích či hojení ran. Velice důležitým faktorem jsou také u řady závažných onemocnění jako např. revmatická artritida a maligní nádory. Význam proteolytických enzymů v těchto procesech je nesporný - podílejí se na degradaci extracelulární matrix a tím usnadňují pohyb buňky. Dipeptidylpeptidáza-IV (DPPIV) odštěpuje pouhé dvě aminokyseliny od N-konce a na degradaci ECM se nepodílí. Rozpoznává a štěpí krátké peptidy mající jako předposlední AA prolin, který svému držiteli obvykle zajišťuje rezistenci vůči běžným typům proteáz. Mezi substráty DPPIV a homologních proteáz patří chemokiny uplatňující se v signalizaci migrace, jako jsou SDF-1α a RANTES či neuropeptid Y. Jejich štěpením a tím inaktivací se molekuly s DPPIV-podobnou aktivitou projevují jako modulátory migračního signálu na buňkách choriokacinomu, neuroblastomu, buňkách Sézaryho syndromu či epiteliálních buňkách migrujících v reakci na poranění. Dalším mechanismem proteáz s DPPIV-podobnou aktivitou je vazba na proteiny extracelulární matrix, čímž se spolupodílejí na adhezi buněk a tím ovlivňují jejich migrační schopnost. Vliv na migraci a invazi mohou mít i intracelulární enzymové homology DDP8 a DPP9, u kterých je mechanismus účinku již z podstaty lokalizace odlišný a je nejméně objasněn. Klíčová slova: DPPIV, FAP, migrace, invaze, DPP8, DPP9 4
Abstract Migration and invasion are processes which naturally occur in organism during embryogenesis, immune reactions or wound healing. These processes are very important factors in some serious diseases like rheumatoid arthritis and carcinogenesis. There is no doubt about contribution of proteases in these processes-many of them degrade extracellular matrix and thereby facilitate the movement of cells. While dipeptidylpeptidase-IV cleaves solely two amino acids from N-terminus so it is not considerably involved in ECM degradation. DPPIV and its homologues recognize peptides with proline on penultimate position, which causes resistance to ordinary types of proteases. Substrates of DPPIV and its activity homologues include chemokines implicated in signalling of migration - their cleavage and thus inactivation present DPPIV and DPPIV-like molecules as modulators of cell migration signalling in choriocacinoma, neuroblastoma, on Sézary cells or epithelial cells migrating in response to injury. Another activity of some DPPIV-like proteases is binding to the extracellular matrix proteins, when are helping in the attachment of cells and thus affect the migratory ability of the cells like ovarian cancer cells, prostate cancer cells, melanoma cells or kidney cells. Effects on migration and invasion have also intracellular enzyme homologues DDP8 and DPP9, mechanism of their action is merely known but as they are intracellular it is probably totally different. Key words: DPPIV, FAP, migration, invasion, DPP8, DPP9 5
Obsah: Migrace a invaze........................................................................................................................7 DPPIV a homologní proteázy....................................................................................................9 DPPIV.............................................................................................................................10 FAP..................................................................................................................................12 DPP8, DPP9....................................................................................................................13 Vliv DPPIV a homologních proteáz na migraci a invazi.........................................................13 Modulace signální molekuly pomocí DPPIV..................................................................14 Vliv DPPIV a FAP na migraci/invazi nezávislý na enzymové aktivitě..........................18 Vliv DPP8 a DPP9 na adhezi a migraci..........................................................................21 Shrnutí......................................................................................................................................21 Reference..................................................................................................................................23
6
MIGRACE A INVAZE Migrace je proces objevující se hojně v průběhu gastrulace, v dospělosti pak při obnově kůže a střevního epitelu, regeneraci tkání, imunitních reakcích, kdy v krvi cirkulující leukocyty migrují do přilehlých tkání, aby zneškodnily původce zánětu. Pokud se nejedná o buňku kolující v krvi, musí se migrující buňka pohybovat skrz extracelulární matrix (ECM), což bývá nazýváno invazí. Tyto děje se též významnou měrou podílí na důležitých patologických dějích, jako jsou artritida či nádorová onemocnění. (Ridley et al.,2003). Pohyb leukocytů jako příklad migrujících buněk za fyziologických podmínek sestává z následujících kroků: 1) vazba chemokinu na chemokinový receptor na leukocytu 2) přenos signálu pomocí G-proteinu spřaženého s chemokinovým receptorem 3) vedoucí až ke změně v expresi integrinů a polarizaci buňky, 4) adheze buňky na stěnu cévy pomocí integrinů a 5) transmigrace endotelovou vrstvou po uvolnění adheze na protilehlé straně od vedoucího výběžku spolu s kontrakcí aktin-myosinových vláken (De Nucci, 2009). Další pohyb leukocytů je skrze pojivovou tkáň, kde se pohybují takzvaným améboidním pohybem, při kterém nedegradují ECM, nýbrž se protahují skrze proteiny pojivové tkáně. Pohyb se uskutečňuje pomocí výběžků vznikajících intracelulárním tlakem na buněčnou stěnu (tzv. blebs). Buňka se při tom deformuje sama, nebo je schopna deformovat i okolní matrix (Mierke et al., 2008). Polarizace invadující buňky, která nevyužívá améboidní způsob pohybu, nýbrž štěpí extracelulární matrix, je řízena polymerizací aktinu, která následuje po nahromadění PIP3 na vedoucí straně (leading edge) a aktivaci Rho GTPázy. Na vedlejším výběžku dochází k seskupení proteolyticky aktivních enzymů (např. matrix metaloproteináz, MMP), což usnadňuje pohyb buňky napříč extracelulárním prostředím (Horowitz&Webb, 2003).
7
Proteolytické enzymy (metalo-, serin-, aspartyl-, cysteinové) se v procesech migrace a invaze uplatňují zpravidla při degradaci proteinů extracelulární matrix, či nepřímo aktivací dalších proteáz a proteolytických kaskád vedoucích k aktivaci přímo působící proteázy. Mezi hlavní rodinu degradující ECM patří matrix metaloproteinázy (MMP) a membránově vázané MMP (MT-MMP), které dohromady tvoří skupinu extracelulárních endopeptidáz. MMP se skládají z katalytické domény, prodomény a popřípadě transmembránové domény, katalytická doména obsahuje tři histidiny, které vážou Zn2+ (odtud v názvu metalo). Na zinečnatý ion se váže v inaktivní stavu cysteinový zbytek z prodomény, což zajišťuje ochranu proti nekontrolovanému tkáňovému štěpení, dále jsou MMP kontrolovány pomocí TIMP (Tissue Inhibitors of MetalloProteinases). Většina solubilních MMP je syntetizována jako inaktivní proenzymy, membránově vázané MT-MMP jsou aktivovány intracelulárně a na povrch membrány jsou exprimovány již aktivní. MMP jsou aktivovatelné například urokinázovým plasminovým aktivátorem (uPA), což je proteáza serinového typu aktivující také plasmin, který degraduje některé proteiny ECM, jako například fibronectin, vibronectin a fibrin. MMP2 a MMP9 jsou dle svého substrátu nazývané gelatinázy, obsahují kolagen-vazebné místo a jejich zvýšená exprese byla pozorována u rakoviny prsu, střeva, kůže, vaječníků, prostaty a dalších. Zvýšená exprese gelatináz je spojena se zvýšenou invazivností a metastázemi stejně jako se snížením přežití. MMP2, MMP9 a MT1-MMP byly popsány jako důležité regulátory v angiogenezi při růstu tumorů, intravazaci tumorových buněk, migraci a invazi metastazujících buněk do cílových tkání (van Hinsbergh & Koolwijk, 2008). Na povrchu buněk se kromě matrix degradujících proteáz nachází řada dalších proteolytických enzymů (tab. 1). Mezi ně patří i dipeptidylpeptidáza-IV, což je exopeptidáza odštěpující dipeptid a FAP, který má i gelatinázovou aktivitu. Jejich podíl na invazi není zřejmě dominantně založen na degradaci extracelulárních proteinů. V této práci chci nastínit dosavadní poznatky o vlivu těchto enzymovou specifitou i neenzymatickou aktivitou zajímavých proteáz, dipeptidylpeptidázy-IV a jejích homologů, na migraci a invazi buněk. Pozornost zaměřím především na hlavního představitele, tedy na dipeptidylpeptidázu-IV. Jejím nejbližším homologem je molekula fibroblastového aktivačního proteinu (fibroblast activation protein, FAP, sepráza) a dále intracelulárně lokalizované dipeptidylpeptidáza 8 (DPP8) a dipeptidylpeptidáza 9 (DPP9).
8
Tab. 1:
Přehled peptidáz na buněčném povrchu
Peptidáza Aminopeptidáza N Aminopeptidáza A Aminopeptidáza P X-Trp aminopeptidáza Pyroglutamyl-peptidáza Dipeptidylpeptidáza IV Angiotensin-konvertující enzym Angiotensin-konvertující enzym 2 Karboxypeptidáza M Karboxypeptidáza P γ-Glutamyl transpeptidáza Membránová dipeptidáza
zkratka APN APA APP
DPPIV (CD26) ACE (CD143) ACE2, ACEH CPM CPP γ-GT (CD224) MDB
katalytický typ metalo metalo metalo metalo metalo serino metalo metalo metalo metalo metalo metalo [převzato z Mentlein, 2004]
DPPIV A HOMOLOGNÍ PROTEÁZY Dipeptidylpeptidáza-IV je proteáza serinového typu, jež odštěpuje dvě N-terminální aminokyseliny z malých proteinů, pokud je předposlední aminokyselinou Pro nebo Ala (obr. 1). Podobnou proteolytickou aktivitu vykazují kromě samotné dipeptidylpeptidázy-IV FAP, DPP8 a DPP9.
Obr. 1.: Schéma naznačující substrátovou specifitu dipeptidylpeptidázy IV [Převzato z Mentlein, 2004]
9
DPPIV (dipeptidylpeptidáza-IV) Lidský gen pro DPPIV je lokalizován na dlouhém raménku chromozomu 2 (2q24.3) a obsahuje 26 exonů, je poměrně konzervován-vykazuje 85% podobnost s krysí sekvencí. DPPIV (CD26, ADA-binding protein) je enzymaticky aktivní dimer sestávající ze dvou 120kDa podjednotek (obr. 2). Dle katalytického místa patří tato proteáza mezi serinové proteázy, pořadí katalytické trias v primární sekvenci (Ser-Asp-His) je však odlišné v porovnání s klasickými serinovými proteázami (His-Asp-Ser ).
[Gorrell, 2005] Obr. 2: DPPIV homodimer, oba monomery zbarveny od modré po červenou. Oranžové a žluté zbytky Leu 294 a Val 341 jsou zásadní pro vazbu ADA. Glu 205 a Glu 206, zbarvené modře, jsou nutné pro enzymatickou aktivitu. Černě zakroužkovaná katalytická triáda jednoho z monomerů Ser-Asp-His.
DPPIV je lokalizovaná na buněčném povrchu, má transmembránovou oblast s extracelulárním C-koncem (typ II integrálních membránových proteinů), na němž se nachází devět potenciálních míst N-glykosylace. Existuje i solubilní forma DPPIV cirkulující v séru. Tato rozpustná forma, kratší o 39 aminokyselin tvořících transmembránovou doménu na N-konci, vykazuje enzymatickou aktivitu a od jiných dipeptidylpeptidáz je odlišitelná pomocí adenosin-deaminázového (ADA) vazebného místa (Durinx et al., 2000;Christopherson, 2002). Oproti transmembránové formě není pravděpodobně kódovaná jiným genem, ale odštěpena pomocí dosud nespecifikovaných proteolytických enzymů z buněčného povrchu.
10
DPPIV je exprimovaná v mnohých orgánech na endoteliálních buňkách kapilár a aktivovaných T lymfocytech, v gastrointestinálním traktu, žlučovodech, pankreatu, ledvinách, brzlíku, uzlinách, děloze, placentě, prostatě, potních a mléčných žlázách, dále v endoteliích jater, sleziny, plic či mozku (Gorrell, 2005). Dipeptidylpeptidáza-IV je exopeptidáza odštěpující dvě aminokyseliny z N-konce štěpené molekuly (aminopeptidáza). Uvolňuje zbytky ze specifických peptidů mající jako předposlední aminokyselinu prolin/alanin (obr. 1), jež jsou odolné ke štěpení relativně nespecifickými proteázami jako je trypsin, chymotrypsin. Je specializovaná na štěpení malých peptidů do 70 aminokyselin, jako jsou cytokiny, peptidové hormony, neuropeptidy či růstové faktory. Mezi substráty DPPIV se řadí například GLP-1, GLP-2, neuropeptid Y, substance P, SDF-1α (CXCL12), (tab. 2). Jako kompetitivní substrát působí diprotin A (Dip A), protein mikrobiálního původu, který je často používán jako inhibitor DPPIV (Mentlein, 2004). Funkce DPPIV není omezena pouze na proteolýzu, ale působí i jako vazebný protein, například pro adenosin deaminázu (ADA). DPPIV dále obsahuje vazebná místa pro proteiny extracelulární matrix (fibronektin, kolagen, gelatin) (Gorrel, 2005;Cheng, 1997;Ghersi, 2002). I přes svou velice krátkou cytoplazmatickou sekvenci (6 aminokyselin) je DPPIV schopna přenosu signálu do nitra buňky, zřejmě za pomoci dalších membránově vázaných molekul.
Tab. 2: biologické substráty dipeptidylpeptidázy-IV neuropeptidy
hormony
chemokiny
důsledek štěpení DPPIV inaktivace částečná inaktivace částečná inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace částečná inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace inaktivace částečná inaktivace
Endomorfin-2 Neuropeptid Y Substance P GRH GLP-1 GLP-2 GIP Glukagon Peptid YY SDF-1 (CXCL12) MDC (CCL22) I-TAC (CXCL11) Mig (CXCL9) Eotaxin (CCL11) LD78β (CCL3) RANTES (CCL5)
[převzato z Mentlein, 2004]
11
DPPIV za normálních okolností štěpí a tím inaktivuje GLP-1 (glukagon-like peptide 1), což je gastrointestinální peptid produkovaný po příjmu potravy. GLP-1 stimuluje sekreci inzulínu a redukuje sekreci glukagonu, čímž snižuje hladinu glukosy. Inhibice DPPIV, a tím prodloužení doby účinku GLP-1, je jedna z možností při léčbě diabetu typu 2. Při zablokování DPPIV nebo použití GLP-1 necitlivého k jejímu štěpení se prodlouží doba účinku GLP-1, tj. zvýší se sekrece insulinu a glukózová tolerance (Mentlein, 2004) DPPIV se uplatňuje v odbourávání prozánětlivých molekul jako je SDF-1α či RANTES, a tím například zmírňuje postup revmatické artritidy. DPPIV se také podílí na aktivaci T buněk (Ohnuma et al., 2008).
FAP (fibroblast activation protein, sepráza) Lidský gen pro FAP je umístěn na stejném chromozomu v blízkosti genu pro DPPIV (2q23). FAP je transmembránový protein typu II, který je složen ze dvou 97kDa podjednotek (obr. 3). S molekulou DPPIV vykazuje 52% podobnost a bylo pozorováno, že mohou tvořit heteromerní strukturu. Protein je lokalizován na aktivovaných fibroblastech, na buňkách rakoviny kůže, dále je zvýšena jeho exprese během embryogeneze a při některých zánětlivých onemocněních jater. FAP vykazuje DPPIV-podobnou proteolytickou aktivitu a gelatinázovou aktivitu na kolagenu typu I, jeho přirozené in vivo substráty však ještě nejsou přesně známy (Mentlein, 2004).
12
[O´Brien, O´Connor, 2008] Obr. 3: Třídimenzionální struktura FAP/seprázy ukazuje dimer. Extracelulární doména sestává ze dvou domén o osmi β listech (modře) a α/β hydrolázové domény (zeleně) obsahující katalytickou triádu. Katalytické zbytky jsou serin 624 (růžová), aspartát 702 (azurová) a histidin 734 (žlutá).
DPP8 a DPP9 Gen pro DPP8 je lokalizován na chromosomu 15q22, molekula DPP9 je kódována genem, jenž sídlí na 19p13.3. Dipeptidylpeptidáza 8 a dipeptidylpeptidáza 9 jsou solubilní cytosolické proteiny o molekulové hmotnosti 82kDa (Abbot et al.,2000), respektive o 98kDa (Olsen & Wagtmann, 2002) s DPPIV-podobnou aktivitou. In vitro byla prokázána jejich schopnost štěpit některé DPPIV substráty, jako například NPY či SDF-1α. Oproti DPPIV a FAP neobsahují transmembránovou doménu, N- ani O-glykosylace. Zda jsou katalyticky aktivní jako monomery či je zapotřebí dimerizace, není zcela jasné. DPP8 a DPP9 jsou exprimovány v lymfocytech a epiteliálních buňkách mnoha orgánů (Yu et al., 2009). Jejich fyziologická funkce je nejasná.
Vliv DPPIV a homologních proteáz na migraci a invazi Modulace signální molekuly pomocí DPPIV Ať už koluje buňka v krvi nebo je přichycená k jiným buňkám či k extracelulární matrix, její migrace musí být inicializována specifickým signálem. V regulaci tohoto procesu se mohou uplatnit ektopeptidázy DPPIV nebo FAP, jakožto extracelulárně lokalizované
13
peptidázy, pokud je signální molekula jejich substrátem. K modulaci signální molekuly a tím k regulaci migrace a invaze dochází dle Arscotta u neuroblastomových buněk (obr. 4). Signální molekulou nezbytnou pro iniciaci pohybu neuroblastomových buněk je SDF-1α (stromal cell-derived factor-1 α, CXCXL12). Tento chemokin je štěpen vlivem DPPIVpodobnou aktivitou (Lambeir et al., 2001) za vzniku zkráceného SDF-1α/CXCL12(3-68) neschopného vyvolat chemotaxi a navíc inhibujícího vazbu neštěpené formy chemokinu na receptor (Cristopherson et al., 2003). Neuroblastomové buňky (NB) exprimují oproti normálním strukturám pocházejícím z neurální lišty, kupříkladu melanocytům, nižší nebo téměř nedetekovetelnou hladinu DPPIV. Tomu odpovídá i enzymová aktivita, která je u NB asi pětkrát nižší než u melanocytů. Obnovení exprese DPPIV u vybraných linií s původně velmi nízkou enzymovou aktivitou vedlo ke zvýšení aktivity na hodnotu srovnatelnou s DPPIV enzymovou aktivitou u normálních melanocytů a projevilo se jako snížení SDF-1αindukované migrace i invaze u neuroblastomových buněk. Tento jev je blokovatelný inhibitorem DPPIV diprotinem A, což potvrzuje, že se jedná o vliv molekuly DPPIV, ke kterému je zapotřebí její enzymová aktivita. Inhibice enzymové aktivity DPPIV byla provázena obnovením aktivity matrix metaloproteinázy 9, na jejímž snižování se tedy možná podílí DPPIV. Vliv DPPIV na neuroblastomové buňky byl pozorován také in vivo. NB re-exprimující DPPIV injikované do myší daly vzniknout mnohem menším tumorům v porovnání s injikováním kontrolních NB buněk. V tumoru z NB re-exprimujích DPPIV byl zvýšený počet apoptotických buněk. DPPIV se nepodílí pouze na migraci a invazi NB buněk, se ztrátou exprese DPPIV se mění charakter tumoru. DPPIV tedy potlačuje in vitro migraci a invazi NB pomocí štěpení chemokinu SDF-1α, obnovení exprese DPPIV mělo u NB za následek též zvýšení apoptózy a in vivo se projevilo zmenšením tumorů (Arscott et al., 2009). Signální molekulou, jež je modulovatelná a modulovaná pomocí dipeptidylpeptidázyIV, je SDF-1α i v případě regulace migrace buněk T-buněčného lymfomu takzvaného Sézaryho syndromu (SS). Nádorové lymfocyty Sézaryho syndromu, vyznačující se mimo jiné ztrátou povrchových molekul jako je DPPIV, se nacházejí v kůži, uzlinách a periferní krvi. V cirkulujících SS buňkách a stejně tak v SS rakovinných lymfocytech infiltrovaných do kůže je hojně exprimován CXCR4 (receptor SDF-1α), jehož ligand, chemotaktická molekula SDF-1α, je exprimován v kůži. In vitro byla SDF-1α-indukovaná chemotaxe snížena přidáním solubilní DPPIV a naopak inhibice enzymové aktivity DPPIV vedla ke zvýšení chemotaxe, 14
což potvrzuje účast DPPIV na supresi pohybu buněk v gradientu chemokinu SDF-1α (obr. 4). Ačkoliv je SDF-1α přítomen i v jiných tkáních (kostní dřeň, plíce), SS buňky sem neprostupují. Možným vysvětlením je spoluúčast specifických ´skin-homing´ receptorů v SS buňkách (Narducci et al., 2006).
Obr. 4: Schématické shrnutí vlivu DPPIV na migraci indukovanou SDF-1α u neuroblastomových buněk, buněk Sézaryho syndromu a na homing hematopoetických kmenových buněk. U buněk choriokarcinomu se stejným způsobem podílí DPPIV na modulaci signálu, jež se uskutečňuje přes molekulu RANTES a její receptor.
SDF-1α je důležitý chemokin i pro hematopoetické kmenové/progenitorové buňky (HPC), které udržuje v kostní dřeni. Jeho štěpení pomocí DPPIV má vliv na uvolnění HPC buněk z kostní dřeně při mobilizaci indukované faktorem stimulujícím kolonie granulocytů (G-CSF, obr. 5). G-CSF pravděpodobně snižuje expresi CXCR4 i jeho ligandu SDF-1α (McCormick et al., 2009) a dále stimuluje štěpení SDF-1α DPPIV proteázou, což produkuje inaktivní SDF-1α/CXCL12(3-68), jež se neváže na CXCR4 receptor, nedrží tedy buňky nadále v kostní dřeni a ty mohou migrovat do krve (Cristopherson, et al., 2003b). Při mobilizaci hematopoetických kmenových/progenitorových buněk z kostní dřeně pomocí G-CSF je zapotřebí exprese DPPIV na povrch těchto buněk a její enzymová aktivita, jak napovídá pozorování, kdy stimulace G-CSF v knock-out DPPIV-/- myších nezvýšila počet do periferní krve mobilizovaných buněk, zatímco u wild-type DPPIV+/+ myší ano. Podávání DPPIV inhibitorů DPPIV+/+ myším během G-CSF indukované mobilizace vedlo ke snížení počtu mobilizovaných progenitorových buněk v periferní krvi v porovnání s vlivem G-CSF samotným.
15
Taktéž transplantace HPC buněk do periferní krve myši je úspěšnější při podávání DPPIV inhibitorů. (obr. 6). DipA aplikovaný na donorové buňky před transplantací se projevil na zvýšení homingu do recipientovy kostní dřeně oproti kontrolním buňkám (DPPIV+/+, bez aplikace DipA), transplantace buněk s delecí DPPIV (DPPIV-/-) byla ještě úspěšnější. Buňky ošetřené DipA vykazovaly dvojnásobné zvýšení SDF1-α indukované migrace a DPPIV-/deletované dokonce třikrát vyšší počet migrujících buněk také in vitro (Christopherson et al., 2002, 2003, 2004). Přidáním DipA zřejmě dochází k inhibici štěpení SDF-1α, jež směřuje injikované buňky z krevního řečiště do kostní dřeně. Neštěpená molekula SDF-1α udržuje HPC buňky v kostní dřeni, jejím štěpením-inaktivací umožňuje DPPIV jejich G-CSF indukovanou mobilizaci a naopak inhibicí DPPIV enzymové aktivity na povrchu HPC buněk v periferní krvi docílíme zvýšení počtu buněk atrahovaných chemokinem SDF-1α do kostní dřeně.
obr. 5: Hematopoetické progenitorové buňky (HPC) v kostní dřeni. Pokud se HPC buňkám dostává signálu v podobě SDF-1α, jsou drženy v kostní dřeni. Migrace HPC z kostní dřeně indukovaná pomocí granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) je závislá na přítomnosti DPPIV na povrchu těchto buněk. G-CSF pravděpodobně ovlivňuje štěpení SDF-1α, ve prospěch štěpené neaktivní formy a tím zvyšuje migraci HPC buněk z kostní dřeně. Přidáním inhibitoru dipeptidylpeptidázy IV, diprotinu A, je možné tento děj zvrátit v původní stav, kdy jsou buňky udržovány v kostní dřeni
16
Obr. 6: Hematopoetické progenitorové/kmenové buňky injikované do krve myší migrují do kostní dřeně na základě signalizace SDF-1α, expresí DPPIV, jež tuto signální molekulu štěpí a tím inaktivuje, buňka ztrácí migrační aktivitu. Inhibicí DPPIV je homing buněk do kostní dřeně obnoven.
Obdobný mechanismus regulace migrace lze nalézt u buněk choriokarcinomu (obr. 4) vzniklého z mimoděložního trofoblastu. Substrátem inaktivovaným pomocí DPPIV je v tomto případě RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) (Oravecz et al., 1997). RANTES receptor je přítomný na povrchu choriokarcinomových buněk linie JEG3 (Ishii et al., 2000), které na svém povrchu exprimují také DPPIV. Při pozorování vlivu DPPIV byly jako kontrolní použity buňky z choriokarcinomové linie BeWo, která je DPPIV negativní (Sato et al., 2002), ale má na svém povrchu přítomen RANTES receptor (Ishii et al., 2000). Inhibicí DPPIV přidáním DipA k JEG3 linii (DPPIV pozitivní) byla zvýšena invaze JEG3 buněk skrz Matrigel v závislosti na dávce inhibitoru. Na pohyb DPPIV negativních BeWo buněk neměl DipA žádný efekt. Z toho vyplývá, že enzymatická aktivita DPPIV hraje roli v omezování migrace choriokarcinomových buněk linie JEG3. Význam DPPIV na invazi trofoblastu je patrný i u normálního těhotenství, kdy exprese DPPIV je spojena s neinvazivním fenotypem a naopak buňky invadující DPPIV neexprimují. Zajímavé je, že upregulace DPPIV je vyvolatelná hypoxií (1%O2), jež je provázena redukcí invazní/migrační aktivity JEG3 buněk i primárního trofoblastu (Sato et al., 2002). DPPIV odštěpuje dva aminokyselinové zbytky z neuropeptidu Y (NPY) a mění jej na NPY3-36, jež je zapotřebí pro migraci endotheliálních buněk (obr. 7; Ghersi et al., 2001, Kitlinska et al., 2002). NPY je neurotransmiter uvolňovaný ze sympatických nervů, působí jako mitogen na buňky hladké svaloviny cév a podílí se na angiogenezi (Zukowska-Grojec et al., 1993,1998).
17
Jako reakce na zranění souvislé vrstvy endotheliálních buněk dochází k migraci buněk, které uzavírají vzniklý defekt. Tento pohyb je stimulován štěpenou formou NPY3-36. Štěpení zajišťuje DPPIV, jejíž exprese je u migrujících endotheliálních buněk zvýšena. Štěpením vzniklý NPY3-36 se váže s rozdílnou afinitou k receptorům oproti NPY. Receptory pro NPY jsou Y1-Y5, po zkrácení na NPY3-36 ztrácí NPY schopnost vázat se na Y1 receptor (hlavní receptor zprostředkovávající vasokonstrikci), ale aktivuje zbylé angiogenní non-Y1 receptory. Přidáním monoklonární protilátky (mAb) neutralizující enzymatickou aktivitu DPPIV došlo k redukci migrace u buněk v médiu s NPY1-36, ale ne u buněk v médiu obsahujícím již zkrácenou formu NPY3-36. Z toho vyplývá, že enzymatická aktivita DPPIV je důležitá pro migraci endotheliálních buněk, kde se uplatňuje při změně převážně vazkonostrikčně působícího NPY1-36 na angiogenní formu NPY3-36 (Ghersi et al., 2001).
Obr.7: Schéma znázorňující štěpení NPY pomocí DPPIV a jeho vliv na migraci endotheliálních buněk ukazuje rozdílnou specifitu štěpené a neštěpené formy k receptorům Y1-Y5. NPY3-36 se váže s větší afinitou na Y2-Y5 na úkor vazby k Y1 receptoru.
Vliv DPPIV a FAP na migraci/invazi nezávislý na enzymové aktivitě DPPIV a FAP se mohou zcela nezávisle na enzymové aktivitě podílet na adhezi buňky k okolním buňkám či k proteinům ECM, čímž mohou pozitivně i negativně ovlivňovat invazi a migraci. DPPIV inhibuje migraci a invazi buněk karcinomu vaječníku adhezí k fibronektinu na mesotheliálních buňkách (obr. 8; Kajiyama et al., 2002,2003; Kikkawa et al., 2003). Linie buněk karcinomu vaječníků SKOV3 mají nízkou expresi DPPIV a invadují více než linie exprimující hojně DPPIV. Transfekce SKOV3 linie buněk vektorem nesoucím DPPIV cDNA se projevila na jejich morfologii: z vřetenovitého protáhlého tvaru typického pro migrující 18
buňky se po transfekci staly buňky kulovité a lépe adherující. Buňky transfekované DPPIV vykazují redukovanou migraci i invazi in vitro, inhibice DPPIV enzymatické aktivity diprotinem A nevede ke znovuobnovení invazního fenotypu, který buňky měly před transfekcí. Stejné výsledky byly pozorovány in vivo, kde transfekované buňky s vysokou expresí DPPIV oproti netransfekovaným s nízkou expresí DPPIV neinvadují do peritonea. Je tomu tak proto, že buňky karcinomu vaječníku exprimující DPPIV jsou adherované k mesotheliálním buňkám, jež mají na svém povrchu fibronektin. K potvrzení role DPPIV při adhezi byla do NOS4 linie exprimující hojně DPPIV transfekována antisense cDNA pro DPPIV, což vedlo ke snížení adhezivního potenciálu NOS4 buněk k mesotheliím. V závislosti na expresi DPPIV u SKOV3 buněk je upregulována exprese molekul E-cadherinu a β-cateninu, které se podílejí na adherentních komplexech na povrchu buněk. Overexprese DPPIV u SKOV3 buněk byla také doprovázena snížením MMP2 (matrix metaloproteinázy 2), která je schopna proteolyticky štěpit komplexy extracelulární matrix (Kajiyama et al., 2002, 2003; Kikkawa et al., 2003).
DPPIV může mít při rozšiřování rakovinných buněk vliv i pokud je exprimována na zdravých buňkách, jak se ukazuje u buněk plicního endothelia, které exprimují DPPIV a přes ni vážou rakovinné buňky (krysí buňky rakoviny prsu), které mají na svém povrchu fibronektin (obr. 9). V tomto případě zprostředkovává vazba DPPIV-fibronektin adhezi tumorových buněk do plicního endothelia a zvyšuje pravděpodobnost metastáze do těchto míst (Cheng et al., 1997). 19
Strukturně i enzymatickou aktivitou sobě podobné molekuly DPPIV a FAP, mohou spolupracovat na ovlivnění migrace buněk. Na invadopodiích migrujících endotheliálních buněk (HUVEC) byla prokázána asociace DPPIV a FAP, které dohromady vytvářely 820kDa komplex. Tento komplex byl exprimován více na okraji rány, ale nebyl asociován se systémy integrinů a MMP podílejícími se na migraci a invazi, které jsou v těchto místech taktéž exprimovány. Tento komplex zřejmě přispívá k migraci endotheliálních buněk na kolagenu I a Matrigelu pomocí gelatin-vazebného místa na DPPIV, jehož inhibicí pomocí mAb byla narušena migrace. DPPIV-FAP komplex je nutný ve fázi rašení invadopodia, ale bez následné spoluúčasti matrix metaloproteináz a β1 integrinu není komplex dostačující pro migraci (Ghersi et al., 2006). Na molekulu DPPIV na povrchu buněk rakoviny prostaty (1-LN buňky) se nejspíše pomocí karbohydrátového řetězce váže plasminogen 2 (Pg 2). DPPIV je zde asociována s Na/ H výměníkem a prostřednictvím této vazby či přímé vazby na Na/H výměník Pg 2 ovlivňuje intracelulární pH. Po navázání plasminogenu na DPPIV dochází v buňce k aktivaci DAG/IP3 signální kaskády, zvýšení koncentrace intracelulárních vápenatých iontů má za následek změnu exprese MMP9, jež se svou proteolytickou aktivitou přispívá k invazivitě buněk. Pouze vysoce sialované Pg 2 gamma, Pg 2 delta a Pg 2 epsilon byly schopné zvýšit koncentraci vápenatých iontů v cytosolu a exprese MMP9 byla simulována pouze pomocí glykoformy Pg 2 epsilon (Gonzalez-Gronow et al., 2001, 2005, 2005). Vliv DPPIV na snížení migrace nezávislý na enzymové aktivitě byl pozorován také u buněk melanomu (Pethiyagoda et al., 2001) Vliv FAP na migraci a invazi buněk je mnohem méně prostudován. Z dosavadních poznatků je možno vyvodit, že pokud je do těchto dějů zapojen, migraci a invazi zvyšuje. Overexprese FAP zvyšuje adhezi, invazi a migraci lidských jaterních buněk na proteinech ECM a byla spojena se zvýšenou expresí MMP 2 a redukcí exprese integrinu 1 (Wang et al., 2005). Zvýšená adheze, migrace a proliferace v závislosti na míře exprese FAP byla popsána také u metastazujících ovariálních buněk (Chen et al., 2009).
20
Vliv DPP8 a DPP9 na adhezi a migraci Dipeptidylpeptidázu 9 overexprimující HEK (human embryonic kidney) buňky vykazují narušenou adhezi a sníženou migraci na kolagenu I a fibronektinu. Nadprodukce DPP8 i DPP9 zvyšuje staurosporinem indukovanou apoptózu, nadprodukce DPP9 zvyšuje i spontánní apoptózu, čímž mohou být zatíženy výsledky migračních testů. Ani katalytické místo ani integrin-vazebné místo na DPP9 nejsou pro ovlivnění migrace zapotřebí, což bylo prokázáno pomocí cílené mutace těchto oblastí. DPP9 overexprimující buňky dále vykazovaly redukci β-cateninu a tkáňového inhibitoru matrix-metaloproteináz 2 (Yu et al., 2006).
Shrnutí Dipeptidylpeptidáza IV se může uplatňovat v různých fázích procesu migrace/invaze. Je to především modulace signálu, jenž je schopna proteolyticky štěpit a tím aktivovat/inaktivovat/změnit štěpením signální molekuly její afinitu k receptorům. V takovém případě je zapotřebí její serin-proteázová enzymová aktivita. K modulaci signálu dochází například štěpením SDF-1α, který má vliv na migraci neuroblastomových buněk, hematopoetických kmenových buněk či Sézaryho buněk odvozených od T-buněčného lymfomu. Další DPPIV-substráty ovlivňující migraci/invazi, jsou chemokin RANTES a neuropeptid Y. Další možný vliv, který je pozorován i u molekuly FAP, je podíl na buněčné adhezi. Tato účast se uskutečňuje například na základě vazby DPPIV k fibronektinu. DPP8 a DPP9 vykazují obdobnou enzymatickou aktivitu jako DPPIV a mají na svém povrchu integrin vazebné místo, z důvodu své lokalizace v cytoplazmě se však budou do migračního procesu vměšovat zcela jiným způsobem. Mechanismus jejich vlivu na migraci není jasný. DPP8 a DPP9 overexpresí dochází ke změnám v zastoupení jiných proteinů spojených s migrací, nicméně enzymová aktivita ani zmíněné integrin-vazebné místo k těmto změnám zapotřebí nejsou. V některých případech buněk nádorového bujení je obnovení exprese DPPIV spojené s indukcí apoptózy (Wesley, 2004) a tím se vliv DPPIV projeví i na celkovém snížení počtu migrujících buněk. K obdobným výsledkům vedla i overexprese DPP9 (Yu, 2006), jejíž vliv bude jiného charakteru, nejen proto, že se jedná o intracelulární molekulu, ale také proto, že nešlo o obnovenou expresi u buněk, jež tuto schopnost ztratily spolu s nabitím malignity, nýbrž o overexpresi u embryonálních ledvinných buněk.
21
DPPIV a jí podobné proteázy jsou zajímavé nejen z hlediska výzkumu principů signálních kaskád, ale také jako možné cíle terapeutického zásahu. Pro tyto účely je nutné komplexnější poznání významu těchto molekul i za fyziologických podmínek.
22
Reference Abbott CA, Yu DM, Woollatt E, Sutherland GR, McCaughan GW, Gorrell MD.: Cloning, expression and chromosomal localization of a novel human dipeptidyl peptidase (DPP) IV homolog, DPP8. Eur J Biochem. 2000;267(20):6140-50. Albini Adriana & Benelli Roberto: The chemoinvasion assay: a method to assess tumor and ndothelial cell invasion and its modulation.. Nat Protoc. 2007;2(3):504-11. Arscott WT, LaBauve AE, May V, Wesley UV.: Suppression of neuroblastoma growth by dipeptidyl peptidase IV: relevance of chemokine regulation and caspase activation. Oncogene. 2009;28(4):479-91. Condeelis J, Segall JE.: Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 2003;3(12):921-30. Denucci CC, Mitchell JS, Shimizu Y.: Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Crit Rev Immunol. 2009;29(2):87-109. Review. Durinx C, Lambeir AM, Bosmans E, Falmagne JB, Berghmans R, Haemers A, Scharpé S, De Meester I.: Molecular characterization of dipeptidyl peptidase activity in serum: soluble CD26/dipeptidyl peptidase IV is responsible for the release of X-Pro dipeptides. Eur J Biochem. 2000;267(17):5608-13. Ghersi G, Chen W, Lee EW, Zukowska Z.: Critical role of dipeptidyl peptidase IV in neuropeptide Y-mediatedendothelial cell migration in response to wounding. Peptides. 2001;22(3):453-8. Ghersi G, Zhao Q, Salamone M, Yeh Y, Zucker S, Chen WT.: The protease complex consisting of dipeptidyl peptidase IV and seprase plays a role in the migration and invasion of human endothelial cells in collagenous matrices. Cancer Res. 2006;66(9):4652-61. Gonzalez-Gronow M, Grenett HE, Weber MR, Gawdi G, Pizzo SV.: Interaction of plasminogen with dipeptidyl peptidase IV initiates a signal transduction mechanism which regulates expression of matrix metalloproteinase-9 by prostate cancer cells. Biochem J. 2001;355(Pt 2):397-407. Gonzalez-Gronow M, Grenett HE, Gawdi G, Pizzo SV.: Angiostatin directly inhibits human prostate tumor cell invasion by blocking plasminogen binding to its cellular receptor, CD26. Exp Cell Res. 2005 303(1):22-31 Gonzalez-Gronow M, Misra UK, Gawdi G, Pizzo SV: Association of plasminogen with dipeptidyl peptidase IV and Na+/H+ exchanger isoform NHE3 regulates invasion of human 1LN prostate tumor cells. J Biol Chem. 2005;280(29):27173-8. Gorrell MD.: Dipeptidyl peptidase IV and related enzymes in cell biology and liver disorders. Clin Sci (Lond). 2005;108(4):277-92. Review. Horwitz R. and Webb H.: Cell migration. Current biology 2003;13(19):756-759 23
Cheng HC, Abdel-Ghany M, Elble RC, Pauli BU.: Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 1998;273(37):24207-15. Chen H, Yang WW, Wen QT, Xu L, Chen M : TGF-beta-induced fibroblast activation protein expression, fibroblast activation protein expression increases the proliferation, adhesion, and migration of HO-8910PM. Exp Mol Pathol. 2009;87(3):189-94. Cheng HC, Abdel-Ghany M, Pauli BU.: A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasi. J Biol Chem. 2003;278(27):24600-7. Chicoine MR, Silbergeld DL.: The in vitro motility of human gliomas increases with increasing grade of malignancy. Cancer. 1995 Jun 15;75(12):2904-9. Christopherson KW 2nd, Cooper S, Broxmeyer HE: Cell surface peptidase CD26/DPPIV mediates G-CSF mobilization of mouse progenitor cells. Blood. 2003a;101(12):4680-6 Christopherson KW, Cooper S, Hangoc G, Broxmeyer HE: CD26 is essential for normal GCSF-induced progenitor cell mobilization as determined by CD26-/- mice. Exp Hematol. 2003b;31(11):1126-34. Christopherson KW 2nd, Hangoc G, Broxmeyer HE: Cell surface peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal cell-derived factor-1 alpha-mediated chemotaxis of human cord blood CD34+ progenitor cells. J Immunol. 2002;169(12):7000-8 Christopherson KW 2nd, Hangoc G, Mantel CR, Broxmeyer HE: Modulation of hematopoietic stem cell homing and engraftment by CD26. Science. 2004;305(5686):1000-3 Ishii M, Hayakawa S, Suzuki MK, Yoshino N, Honda M, Nishinarita S, Chishima F, Nagaishi M, Satoh K.: Expression of functional chemokine receptors of human placental cells. Am J Reprod Immunol. 2000;44(6):365-73. Jung S, Ackerley C, Ivanchuk S, Mondal S, Becker LE, Rutka JT.: Tracking the invasiveness of human astrocytoma cells by using green fluorescent protein in an organotypical brain slice model. J Neurosurg. 2001;94(1):80-9. Kikkawa F, Kajiyama H, Ino K, Shibata K, Mizutani S.: Increased adhesion potency of ovarian carcinoma cells to mesothelial cells by overexpression of dipeptidyl peptidase IV. Int J Cancer. 2003;105(6):779-83. Kajiyama H, Kikkawa F, Khin E, Shibata K, Ino K, Mizutani S.: Dipeptidyl peptidase IV overexpression induces up-regulation of E-cadherin and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, resulting in decreased invasive potential in ovarian carcinoma cells. Cancer Res. 2003;63(9):2278-83 Kajiyama H, Kikkawa F, Suzuki T, Shibata K, Ino K, Mizutani S.: Prolonged survival and decreased invasive activity attributable to dipeptidyl peptidase IV overexpression in ovarian carcinoma. Cancer Res. 2002;62(10):2753-7.
24
Kitlinska J, Lee EW, Movafagh S, Pons J, Zukowska Z.: Neuropeptide Y-induced angiogenesis in aging. Peptides. 2002;23(1):71-7. Kopfstein L, Christofori G.: Metastasis: cell-autonomous mechanisms versus contributions by the tumor microenvironment. Cell Mol Life Sci. 2006;63(4):449-68. Lambeir AM, Proost P, Durinx C, Bal G, Senten K, Augustyns K, Scharpé S, Van Damme J, De Meester I.: Kinetic investigation of chemokine truncation by CD26/dipeptidyl peptidase IV reveals a striking selectivity within the chemokine family. J Biol Chem.2001; 276(32): 29839-45. Mastyugin V, McWhinnie E, Labow M, Buxton F.: A quantitative high-throughput endothelial cell migration assay. J Biomol Screen. 2004;9(8):712-8. McCormick PJ, Segarra M, Gasperini P, Gulino AV, Tosato G.: Impaired recruitment of Grk6 and beta-Arrestin 2 causes delayed internalization and desensitization of a WHIM syndromeassociated CXCR4 mutant receptor. PLoS One. 2009;4(12) Mierke CT, Rösel D, Fabry B, Brábek J.: Contractile forces in tumor cell migration. Eur J Cell Biol. 2008;87(8-9):669-76. Review. Narducci Maria Grazia, Enrico Scala, Antonella Bresin, Elisabetta Caprini, Maria Cristina Picchio, Daniele Remotti, Gianluca Ragone, Francesca Nasorri, Marina Frontani, Diego Arcelli, Stefano Volinia, Giuseppe Alfonso Lombardo, Giannandrea Baliva, Monica Napolitano, and Giandomenico Russo: Skin homing of Sézary cells involves SDF-1-CXCR4 signaling and downregulation of CD26/DPPIV. Blood 2006;107: 1108-1115 Ohnuma K, Dang NH, Morimoto C.: Revisiting an old acquaintance: CD26 and its molecular mechanisms in T cell function. Trends Immunol. 2008;29(6):295-301. Review Olsen C, Wagtmann N.: Identification and characterization of human DPP9, a novel homologue of dipeptidyl peptidase IV. Gene. 2002;299(1-2):185-93. Oravecz T, Pall M, Roderiquez G, Gorrell MD, Ditto M, Nguyen NY, Boykins R, Unsworth E, Norcross MA.: Regulation of the receptor specificity and function of the chemokine RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) by dipeptidyl peptidase IV (CD26)-mediated cleavage. J Exp Med. 1997;186(11):1865-72. Pethiyagoda CL, Welch DR, Fleming TP.: Dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) inhibits cellular invasion of melanoma cells. Clin Exp Metastasis. 2000;18(5):391-400 Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, Parsons JT, Horwitz AR: Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 20035;302(5651):1704-9. Review. Russell HV, Hicks J, Okcu MF, Nuchtern JG.: CXCR4 expression in neuroblastoma primary tumors is associated with clinical presentation of bone and bone marrow metastases. J Pediatr Surg. 2004;39(10):1506-11
25
Sato Y, Fujiwara H, Higuchi T, Yoshioka S, Tatsumi K, Maeda M, Fujii S.: Involvement of dipeptidyl peptidase IV in extravillous trophoblast invasion and differentiation. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(9):4287-96. Sedo A, Malík R.: Dipeptidyl peptidase IV-like molecules: homologous proteins or homologous activities? Biochim Biophys Acta. 2001;1550(2):107-16. Review. Suzuki SO, Iwaki T.: Dynamic analysis of glioma cells: looking into "movement phenotypes". Neuropathology. 2005;25(3):254-62. Review. van Hinsbergh VW, Koolwijk P.: Endothelial sprouting and angiogenesis: matrix metalloproteinases in the lead. Cardiovasc Res. 2008;78(2):203-12. Review Wang XM, Yu DM, McCaughan GW, Gorrell MD.: Fibroblast activation protein increases apoptosis, cell adhesion, and migration by the LX-2 human stellate cell line. Hepatology. 2005;42(4):935-45. Wesley UV, Tiwari S, Houghton AN.: Role for dipeptidyl peptidase IV in tumor suppression of human non small cell lung carcinoma cells. Int J Cancer. 2004;109(6):855-66. Wiggins H, Rappoport J.: An agarose spot assay for chemotactic invasion. Biotechniques. 2010;48(2):121-4. Yu DM, Ajami K, Gall MG, Park J, Lee CS, Evans KA, McLaughlin EA, Pitman MR, Abbott CA, McCaughan GW, Gorrell MD.: The in vivo expression of dipeptidyl peptidases 8 and 9. J Histochem Cytochem. 2009;57(11):1025-40 Yu DM, Wang XM, McCaughan GW, Gorrell MD.: Extraenzymatic functions of the dipeptidyl peptidase IV-related proteins DP8 and DP9 in cell adhesion, migration and apoptosis. FEBS J. 2006;273(11):2447-60. Zukowska-Grojec Z, Karwatowska-Prokopczuk E, Rose W, Rone J, Movafagh S, Ji H, Yeh Y, Chen WT, Kleinman HK, Grouzmann E, Grant DS.: Neuropeptide Y: a novel angiogenic factor from the sympathetic nerves and endothelium. Circ Res 1998;83:187–95. Zukowska-Grojec Z, Pruszczyk P, Colton C, Yao J, Shen GH, Myers AK, Wahlestedt C.: Mitogenic effect of neuropeptide Y in rat vascular smooth muscle cells. Peptides 1993;14:263– 8.
26
