Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Výzkumný tým Kvalita rostlinných produktů (KRP)

S3

Strana:

1/ 68

ČINNOSTI LABORATOŘE VÝZKUMNÉHO TÝMU KVALITA ROSTLINNÝCH PRODUKTŮ

Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. – Výzkumný tým Kvalita rostlinných produktů (KRP) Směrnice S 3

ČINNOSTI LABORATOŘE VÝZKUMNÉHO TÝMU KVALITA ROSTLINNÝCH PRODUKTŮ Výtisk číslo: Zpracoval za společnost:

Ověřil:

Schválil:

Funkce:

Vedoucí Výzkumného týmu KRP

Funkce:

Představitel vedení pro kvalitu

Funkce:

Vedoucí Výzkumného týmu KRP

Jméno:

Ing. Václav DVOŘÁČEK, Ph.D.

Jméno:

Ing. Ludmila PAPOUŠKOVÁ, Ph.D.

Jméno:

Ing. Václav Dvořáček, Ph.D.

Datum:

29.8.2014

Datum:

29.8.2014

Datum:

29.8.2014

Podpis:

Podpis:

Podpis

Rozdělovník:

Seznámení s dokumentem:

Představitel vedení pro kvalitu

Všichni pracovníci Výzkumného týmu KRP

Odpovědnost za změnové řízení:

Funkce: Vedoucí Výzkumného týmu Kvalita rostlinných produktů

Jméno: Ing. Václav DVOŘÁČEK, Ph.D.

Tento dokument je duševním vlastnictvím instituce Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. – Výzkumného týmu KRP, rozmnožování a předávání třetí straně bez souhlasu vedoucího týmu KRP není dovoleno.

S3

Strana:

2/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

OBSAH: OBSAH: ................................................................................................................................ 2 LIST VYDÁNÍ: ....................................................................................................................... 6 1.

ÚČEL ........................................................................................................................... 7

2.

OBLAST PŮSOBNOSTI .............................................................................................. 7

3.

POJMY, DEFINICE A ZKRATKY ................................................................................. 7 3.1 3.2

POJMY A DEFINICE................................................................................................. 7 ZKRATKY .............................................................................................................. 8

4.

ÚČEL LABORATOŘE KVALITY VÝZKUMNÉHO TÝMU KRP .................................... 8

5.

PŘÍJEM, UCHOVÁNÍ A PŘÍPRAVA VZORKŮ GENETICKÝCH ZDROJŮ PŘED JEJICH ANALÝZAMI ................................................................................................................ 9 5.1

5.2

5.3

6.

PŘÍJEM VZORKŮ .................................................................................................... 9 5.1.1 Zásady příjmu vzorků genetických zdrojů do laboratoře ........................... 9 5.1.2 Postup při příjmu vzorků genetických zdrojů do laboratoře....................... 9 EVIDENCE A UCHOVÁNÍ VZORKŮ V LABORATOŘI DO DOBY JEJICH ANALÝZY ................ 9 5.2.1 Zásady uchování vzorků genetických zdrojů v laboratoři .......................... 9 5.2.2 Postup uchování vzorků genetických zdrojů v laboratoři do doby jejich analýzy..................................................................................................... 9 PŘÍPRAVA LABORATORNÍCH VZORKŮ GENETICKÝCH ZDROJŮ K ANALÝZÁM ............... 10 5.3.1 Zásady přípravy laboratorních vzorků genetických zdrojů k analýzám ... 10 5.3.2 Pomůcky ................................................................................................ 10 5.3.3 Postup při přípravě laboratorních vzorků k analýzám ............................. 10 5.3.4 Využití instrumentálního vybavení laboratoře pro analýzy vzorků genetických zdrojů ..................................................................................................... 10

LABORATORNÍ POSTUPY ....................................................................................... 12 6.1

6.2

6.3

STANOVENÍ VODY (ČSN 56 0512 – 7) .................................................................. 12 6.1.1 Princip .................................................................................................... 12 6.1.2 Pomůcky ................................................................................................ 12 6.1.3 Postup.................................................................................................... 12 6.1.4 Vyjádření výsledků ................................................................................. 12 STANOVENÍ OBSAHU DUSÍKU – KJELDAHLOVA METODA (ČSN EN ISO 5983 – 1) ..... 13 6.2.1 Princip .................................................................................................... 13 6.2.2 Pomůcky ................................................................................................ 13 6.2.3 Chemikálie ............................................................................................. 13 6.2.3.1 Roztok 35 % NaOH (4 litry) ...................................................... 13 6.2.3.2 Roztok titračního činidla (5 litrů)................................................ 14 6.2.3.3 Roztok 0,2 N roztok H2SO4 ....................................................... 14 6.2.3.4 Neutralizační roztok pro exhaust system 1013 ......................... 14 6.2.4 Postup.................................................................................................... 14 STANOVENÍ SEDIMENTAČNÍHO INDEXU – ZELENYHO TEST (ČSN ISO 5529) ............ 17 6.3.1 Princip .................................................................................................... 17 6.3.2 Pomůcky ................................................................................................ 17 6.3.3 Chemikálie ............................................................................................. 17 6.3.3.1 Roztok kyseliny mléčné ............................................................ 17 6.3.3.2 Roztok bromfenolové modři ...................................................... 17 6.3.4 Postup.................................................................................................... 17

S3

Strana:

3/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

6.3.5 Vyjádření výsledků a reprodukovatelnost ............................................... 18 STANOVENÍ OBSAHU MOKRÉHO LEPKU A LEPKOVÉHO INDEXU (DLE METODY ICC NO. 155) .......................................................................................................................... 18 6.4.1 Princip .................................................................................................... 18 6.4.2 Pomůcky ................................................................................................ 18 6.4.3 Chemikálie ............................................................................................. 19 6.4.4 Pracovní postup ..................................................................................... 19 6.4.5 Vyjádření výsledků a reprodukovatelnost ............................................... 19 6.5 STANOVENÍ ČÍSLA POKLESU PODLE PERTEN-HAGBERGA (ČSN EN ISO 3093, ICC STANDARD Č. 107, AACC METODA 56 – 81B) ....................................................... 20 6.5.1 Princip .................................................................................................... 20 6.5.2 Pomůcky ................................................................................................ 20 6.5.3 Postup.................................................................................................... 20 6.5.4 Vyjádření výsledků ................................................................................. 21 6.5.5 Interpretace hodnot pádového čísla ....................................................... 21 6.5.5.1 Pšenice pro pekařské účely ...................................................... 21 6.5.5.2 Žito ........................................................................................... 21 6.6 STANOVENÍ OBSAHU SUŠINY, NL A ŠKROBU POMOCÍ FT-NIR SPEKTROSKOPIE ........ 21 6.6.1 Princip .................................................................................................... 21 6.6.2 Pomůcky ................................................................................................ 22 6.6.3 Postup sběru NIR spekter a predikce sledovaných parametrů ............... 22 6.6.3.1 Program Macros Basic ............................................................. 22 6.6.3.2 Diagnostika Antarisu 2 programem Omnic ............................... 22 6.6.3.3 Vlastní skenování v programu Omnic ....................................... 22 6.6.3.4 Kvantifikace naměřených dat pomocí softwaru TQA................. 23 6.6.3.5 Údržba a optimalizace kalibračních modelů .............................. 23 6.7 STANOVENÍ DEOXYNIVALENOLU METODOU ELISA ................................................. 23 6.7.1 Princip .................................................................................................... 23 6.7.2 Pomůcky ................................................................................................ 24 6.7.3 Chemikálie a spotřební materiál ............................................................. 24 6.7.4 Postup.................................................................................................... 24 6.8 STANOVENÍ ZEARALENONU METODOU ELISA ........................................................ 25 6.8.1 Princip .................................................................................................... 25 6.8.2 Pomůcky ................................................................................................ 25 6.8.3 Chemikálie a spotřební materiál ............................................................. 26 6.8.4 Postup.................................................................................................... 26 6.9 STANOVENÍ OBSAHU ŠKROBU – EWERSOVA POLARIMETRICKÁ METODA (ČSN EN ISO 10520) ............................................................................................................... 27 6.9.1 Princip .................................................................................................... 27 6.9.2 Pomůcky a chemikálie ........................................................................... 27 6.9.3 Postup.................................................................................................... 28 6.9.4 Vyjádření výsledků a opakovatelnost ..................................................... 29 6.10 STANOVENÍ RELATIVNÍ TVRDOSTI ZRNA – PARTICLE SIZE INDEX (PSI) (AACC 55-30 Z R. 2000) ................................................................................................ 30 6.10.1 Princip .................................................................................................... 30 6.10.2 Pomůcky a chemikálie ........................................................................... 30 6.10.3 Postup.................................................................................................... 30 6.10.4 Vyjádření výsledků ................................................................................. 30 6.11 ELEKTROFORÉZA ZÁSOBNÍCH BÍLKOVIN PŠENICE A JEČMENE VE ŠKROBOVÉM GELU (SGE) - STANOVENÍ ODRŮDOVÉ PRAVOSTI A JEDNOTNOSTI............................................... 31 6.11.1 Princip metody ....................................................................................... 31 6.11.2 Pomůcky ................................................................................................ 31 6.11.3 Chemikálie a spotřební materiál ............................................................. 31 6.11.4 Postup.................................................................................................... 32 6.11.4.1 Příprava roztoků ....................................................................... 32 6.4

S3

Strana:

4/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

6.11.4.2 Příprava škrobového gelu a gelových sloupečků ...................... 32 6.11.4.3 Extrakce bílkovin ...................................................................... 32 6.11.4.4 Vlastní elektroforéza ................................................................. 33 6.11.4.5 Vizualizace bílkovinných spekter - fixování, barvení, odbarvení 34 6.11.4.6 Hodnocení elektroforeogramů .................................................. 34 6.11.4.7 Vyjádření výsledků zkoušky...................................................... 34 6.11.4.8 Protokol o zkoušce ................................................................... 34 6.11.4.9 Verifikace metody ..................................................................... 34 7.

STANOVENÍ GLUTENINOVÝCH ALEL METODOU SDS-PAGE .............................. 35 7.1 7.2 7.3 7.4

7.5 7.6 8.

PRINCIP METODY ................................................................................................. 35 POMŮCKY ........................................................................................................... 35 CHEMIKÁLIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL..................................................................... 36 PRACOVNÍ POSTUP .............................................................................................. 36 7.4.1 Příprava zásobních roztoků pro elektroforézu ........................................ 37 7.4.2 Příprava a nalévání gelu do gelových kazet ........................................... 37 7.4.3 Příprava roztoků pro extrakci gluteninů .................................................. 38 7.4.4 Extrakce gluteninů.................................................................................. 39 7.4.4.1 Extrakční postup pro analýzu LMW-GS a HMW-GS ................. 39 7.4.4.2 Zjednodušený extrakční postup pro analýzu HMW-GS............. 39 7.4.5 Vlastní elektroforéza .............................................................................. 40 7.4.6 Vizualizace bílkovinných spekter ............................................................ 41 7.4.6.1 Příprava roztoků pro fixaci bílkovin, barvení a sušení gelů ....... 41 7.4.6.2 Fixace bílkovin, barvení gelů .................................................... 41 7.4.6.3 Sušení gelů .............................................................................. 41 VYHODNOCENÍ ELEKTROFOREOGRAMŮ ................................................................. 41 VERIFIKACE METODY ........................................................................................... 42

LABORATORNÍ ANALÝZY DLE JEDNOTLIVÝCH PLODIN ..................................... 42 8.1

8.2

8.3

8.4

8.5

8.6

8.7

8.8

8.9

PŠENICE (TRITICUM SP.) ...................................................................................... 42 8.1.1 Základní ustanovení ............................................................................... 42 8.1.1 Seznam analýz ...................................................................................... 42 JEČMEN (HORDEUM VULGARE L.) ......................................................................... 43 8.2.1 Základní ustanovení ............................................................................... 43 8.2.2 Seznam analýz ...................................................................................... 43 TRITIKÁLE (TRITICOSECALE W ITT. ) ...................................................................... 43 8.3.1 Základní ustanovení ............................................................................... 43 8.3.2 Seznam analýz ...................................................................................... 43 POHANKA SETÁ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH.) ......................................... 44 8.4.1 Základní ustanovení ............................................................................... 44 8.4.2 Seznam analýz ...................................................................................... 44 POHANKA TATARSKÁ (FAGOPYRUM TATARICUM L.) ................................................ 44 8.5.1 Základní ustanovení ............................................................................... 44 8.5.2 Seznam analýz ...................................................................................... 44 PROSO SETÉ (PANICUM MILIACEUM L.) ................................................................. 44 8.6.1 15.1. Základní ustanovení ...................................................................... 44 8.6.2 15.2. Seznam analýz.............................................................................. 45 AMARANTUS (AMARANTHUS SP.) .......................................................................... 45 8.7.1 Základní ustanovení ............................................................................... 45 8.7.2 Seznam analýz ...................................................................................... 45 ČIROK (SORGHUM SP.) ........................................................................................ 45 8.8.1 Základní ustanovení ............................................................................... 45 8.8.2 Seznam analýz ...................................................................................... 45 BÉR (SETARIA P. BEAUV) .................................................................................... 46 8.9.1 Základní ustanovení ............................................................................... 46

S3

Strana:

5/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

8.9.2 Seznam analýz ...................................................................................... 46 9.

ARCHIVACE A PŘEDÁVÁNÍ VÝSLEDKŮ................................................................. 46

10.

PRAVIDELNÝ SERVIS A ÚDRŽBA ........................................................................... 46

11.

SOUVISEJÍCÍ DOKUMENTACE ................................................................................ 47

12.

PŘÍLOHY ................................................................................................................... 47 Příloha č. 1 - Přijímací protokol vzorků ....................................................................... 49 Příloha č. 2 – Evidenční protokol uchování vzorků...................................................... 50 Příloha č. 3 – Mlecí protokol ....................................................................................... 51 Příloha č. 4 – Stanovení obsahu vody a sušiny .......................................................... 52 Příloha č. 5 – Stanovení obsahu dusíku dle Kjeldahla ................................................ 53 Příloha č. 6 – Stanovení sedimentačního indexu ........................................................ 54 Příloha č. 7 - Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro sedimentační index ........ 55 Příloha č. 8 – Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu ......................... 56 Příloha č. 9 – Stanovení čísla poklesu ........................................................................ 57 Příloha č. 10 – Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro číslo poklesu ............... 58 Příloha č. 11 – Stanovení obsahu sušiny, NL a škrobu pomocí FT-NIRS ................... 59 Příloha č. 12 – Stanovení obsahu deoxynivalenolu (DON) ......................................... 60 Příloha č. 13 – Stanovení obsahu zearalenonu (ZEA) ................................................ 61 Příloha č. 14 – Stanovení alelické skladby HMW a LMW-gluteninů (SDS-PAGE) ....... 62 Příloha č. 15 – SGE Stanovení alelické skladby gliadinů (SGE) ................................. 63 Příloha č. 16 – Finální výsledky laboratorních analýz GZ............................................ 64 Příloha č. 17 – Provozní řád laboratoře výzkumného týmu KRP ................................. 65 Příloha č. 18 - Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda ............. 67 Příloha č. 19 - Stanovení relativní tvrdosti zrna (PSI) .................................................. 68

S3

Strana:

6/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

LIST VYDÁNÍ: Číslo vydání

List číslo

2

Celý dokument

3

4

Popis změny

Revize v souvislosti se zavedením nových laboratorních postupů a analýz

Příloha č.1- Změna vedoucího oddělení, změna 6, 8-9,11-16 příloh kap. 6.9, 6.10., příloha 16, 18, 19

revize dokumentu v oblasti názvu týmu a obsahu – zjišťování tvrdosti zrna a polarimetrického stanovení škrobu, doplnění odpovídajících příloh

Účinnost od

Iniciátor změny

01.09.2012

PMK

01.09.2013

PMK

01.09.2014

PMK

1.

S3

Strana:

7/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

ÚČEL

Tato směrnice popisuje činnosti spojené s příjmem vzorků do laboratoře výzkumného týmu KRP uchovávání vzorků do doby jejich analýzy, přípravu laboratorních vzorků vč. přehledu používaného instrumentálního vybavení, postupy jednotlivých laboratorních analýz, přehledy analyzovaných plodin s uvedením konkrétních analýz na plodinách prováděných a archivaci a předávání výsledků laboratorních analýz. Směrnice dále uvádí Provozní řád laboratoře (viz příloha č. 17), který jsou zaměstnanci laboratoře kvality výzkumného týmu KRP povinni dodržovat.

2.

OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato směrnice je platná ve společnosti Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. – Výzkumného týmu KRP.

3.

POJMY, DEFINICE A ZKRATKY

3.1

Pojmy a definice

Genová banka - zařízení, kde jsou uchovávány sbírky genetického materiálu ve formě semen, tkání nebo reprodukce schopných buněk rostlin nebo živočichů. Soubor zařízení sloužících k využívání a konzervaci genetických zdrojů. Hodnocení genetického zdroje - shromáždění a vyhodnocení údajů o genetickém zdroji stanovených metodikou Národního programu, zejména o variabilitě užitkových znaků, úrovni heterozygotnosti populace, výskytu specifických alel a dalších znaků, zjišťovaných pomocí standardních vědeckých metod. Charakterizace - popis podstatných vlastností organismu nebo systému. Stanovení znaků, které umožní rychlé a snadné odlišení fenotypů. Tyto znaky jsou obvykle vysoce dědivé, se stejnou expresí ve všech podmínkách, lehce zjistitelné pohledem. Obvykle jsou to morfologické znaky (včetně taxonomických), které mohou následně být doplněné i o biochemické a molekulární markery. Kolekce genetických zdrojů rostlin - genetické zdroje rostlin jednoho druhu (popř. i rodu) shromážděné pro účely dokumentace, studia, hodnocení a využívání, zejména však pro potřeby dlouhodobého uchování. Kolekce shromažďuje pokud možno veškeré genetické zdroje daného druhu vyskytující se na území státu (regionu). Je ucelenou organizační jednotkou v péči o genetické zdroje, za její vedení a uchování odpovídá kurátor kolekce. Kultivar/Odrůda - soubor rostlin náležející k nejnižšímu stupni botanického třídění, který lze vymezit projevem znaků vyplývajících z určitého genotypu nebo kombinace genotypů, odlišný od každého jiného souboru rostlin projevem nejméně jednoho z těchto znaků a považovaný za jednotku rozmnožovatelnou beze změny. Uskupení rostlin v rámci jednoho botanického taxonu nejnižší známé úrovně definované reprodukovatelným projevem svých odlišujících genetických vlastností. Národní program rostlin – dokument „Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a agrobiodiversity“ vydaný MZe, v němž jsou zakotveny zásady pro nekompetitivní projekt zaměřený na uchování a využívání genofondu rostlin. Je součástí širšího „Národního programu udržování a využívání genetických zdrojů pro výživu a zemědělství“, který zahrnuje mikroorganismy a hospodářská zvířata, ryby a včely.

S3

Strana:

8/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Polní pokus - termín je míněn ve smyslu ověřování (testování) vegetace v polních podmínkách, není zde míněn jako výzkumná (experimentální) činnost ve smyslu čl. 7.3 normy ČSN EN ISO 9001:2009. Řešitel kolekce (kurátor kolekce) - osoba zodpovědná za vedení kolekce Národního programu rostlin (shromažďování, konzervaci, charakterizaci, hodnocení, dokumentaci). Seťový seznam - seznamu genetických zdrojů, které budou do jednotlivých pokusů zařazeny. Vzorek genetického zdroje - jednoznačně identifikovatelná dávka semen nebo rostlinného rozmnožovacího materiálu reprezentujících genetický zdroj (odrůdu, šlechtitelskou linii nebo populaci), který je shromažďován a uchováván pro další využití.

3.2

Zkratky

ECN

Evidenční číslo národní, jednoznačný identifikátor genetického zdroje

GB

Genová banka

KRP HB

Kvalita rostlinných produktů Hlavní budova

GZ

Genetický zdroj

FT-NIR

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti s Fourierovou transformací

NP VÚRV

Národní program konzervace a využívání agrobiodiversity Výzkumný ústav rostlinné výroby,v.v.i.

NL [%] ML [%]

Obsah dusíkatých látek (hrubých bílkovin) Obsah mokrého lepku

GI [%]

Gluten index

ZS [ml] FN [s]

Sedimentační index podle Zelenyho Číslo poklesu

Škrob [%]

Obsah celkového škrobu

genetických

zdrojů

rostlin

a

SDS–PAGE metoda vertikální elektroforézy gluteninů pšenice v polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného SGE

metoda vertikální elektroforézy gliadinů pšenice a hordeinů ječmene ve škrobovém gelu v prostředí mléčnanu hlinitého

ELISA

enzymově značená imunoanalýza

DON

deoxynivalenol

PSI

Particle Size Index (Stanovení relativní tvrdosti zrna)

4.

ÚČEL LABORATOŘE KVALITY VÝZKUMNÉHO TÝMU KRP

Laboratoř výzkumného týmu KRP v rámci systému řízení managementu kvality zajišťuje požadovaná chemicko-technologická hodnocení vybraných druhů kulturních plodin pro potřeby hodnocení GZ a tvorby plodinových databází výzkumného týmu GB.

5.

S3

Strana:

9/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

PŘÍJEM, UCHOVÁNÍ A PŘÍPRAVA VZORKŮ GENETICKÝCH ZDROJŮ PŘED JEJICH ANALÝZAMI

5.1

Příjem vzorků

5.1.1 Zásady příjmu vzorků genetických zdrojů do laboratoře Vzorky genetických zdrojů (dále jen vzorky) musí plně reprezentovat množství, ze kterého byly odebrány, tj. vzorek musí být reprezentativní.

5.1.2 Postup při příjmu vzorků genetických zdrojů do laboratoře Vzorky jsou přijímány na základě smyslového posouzení suché, vyčištěné a bez zjevného poškození či silného napadení, s garantovanou požadovanou minimální hmotnosti dle požadované laboratorní analýzy. Vzorky musí být řádně označené a zabalené v neporušeném obalu. Řádné označení je provedeno standardním štítkem s charakterizací botanického zařazení, polního čísla (identifikačního čísla), ECN, názvu státu původu a ročníku sklizně. Rozsah přijímaného souboru je kontrolován dle aktuálního seťového seznamu pro daný sklizňový ročník přístupného na síťovém disku (případně v řízené kopii). Pro evidenci příjmu vzorků je dále zpracován v elektronické i písemné podobě Přijímací protokol vzorků do laboratoře (viz příloha č. 1) zahrnující základní identifikaci a obsah souboru, datum příjmu, označení dodavatele a příjemce včetně požadovaných analýz. V poznámce se uvede vyjádření ke kvalitě a množství vzorku. Písemná verze Přijímacího protokolu bude navíc obsahovat originální podpis dodavatele a pracovníka laboratoře, který vzorky přijal a bude uložena do příslušného šanonu s názvem Přijímací protokol vzorků. Po přijmutí vzorků obdrží v el. podobě příslušný dodavatel (řešitel plodinové kolekce) kopii Přijímacího protokolu. El. verze přijímacího protokolu bude vedena na síťovém disku s týdenním zálohováním. V případě nesplnění požadavků garantujících množství a kvalitu vzorku je toto zaznamenáno v Přijímacím protokolu a hodnocení takovýchto vzorků je řešeno individuálně po konzultaci vedoucího laboratoře s příslušným řešitelem plodinové kolekce.

5.2

Evidence a uchování vzorků v laboratoři do doby jejich analýzy

5.2.1 Zásady uchování vzorků genetických zdrojů v laboratoři Po přijetí vzorků je příslušný soubor vzorků zanesen do elektronické verze Evidenčního protokolu uchování vzorků (Příloha č. 2) vedeném na síťovém disku s týdenním zálohováním. Průběžně je vytištěna i papírová verze aktuálního stavu uchovávaných vzorků daného ročníku a uložena do příslušného šanonu s názvem Evidenční protokol uchování vzorků. Vzorky primárně skladujeme v laboratoři výzkumného týmu KRP a v příručním skladu laboratoře po dobu nezbytně nutnou k provedení laboratorních analýz a případné verifikaci.

5.2.2 Postup uchování vzorků genetických zdrojů v laboratoři do doby jejich

analýzy Přijaté vzorky jsou přechodně uskladněny v přilehlé chodbě k laboratoři výzkumného týmu KRP v místnosti č. 23 s označením vedoucího laboratoře (max. 4 měsíce). Odebrané laboratorní vzorky pro jednotlivé chemické analýzy jsou standardně označeny s vyznačením plánované analýzy a uloženy v regále rozborovny k bezprostřednímu zpracování pro analýzy. Zbytek původních vzorků v originálních obalech je uložen do příručního

S3

Strana:

10/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

skladu s řízenou teplotou (6 - 10 °C, tma) po dobu max. 10 měsíců a zaznamenán do Evidenčního sešitu příručního skladu laboratoře (viz q). Vzorky určené pro výzkumné projekty mohou být skladovány po celou dobu trvání projektu, případných dalších potřeb laboratoře (referenční vzorky). Namleté vzorky skladujeme v laboratorních podmínkách v regále rozborovny po dobu nezbytnou pro odležení a provedení analýz (max. 2 měsíc). Po skončení analýz jsou zbytky namletých vzorků zlikvidovány. Pro hodnocení čísla poklesu, genetických charakteristik (SDS-PAGE; SGE) a výskytu mykotoxinů (ELISA) mohou být vzorky uloženy i v 2. sekci laboratoře, v příručním skladu s označením HB 158.

5.3

Příprava laboratorních vzorků genetických zdrojů k analýzám

5.3.1 Zásady přípravy laboratorních vzorků genetických zdrojů k analýzám Z přijatého vzorku (semeno, vegetační části rostlin) jsou na základě požadovaných chemických analýz resp. požadavků jednotlivých metod kvantitativně odebírány laboratorní vzorky, jež jsou následně upraveny dle požadavků příslušné metody (viz níže).

5.3.2 Pomůcky Laboratorní předvážky, laboratorní šrotovací mlýn Cyklotec 1093, síto 0,8 mm, laboratorní šrotovací mlýn Cyklotec 1093, síto 0,5 mm, mlýn Brabender Sedimat, síto 150 m, střižný šrotovací mlýn SM 100 Retsch, síto 1 mm, Mlýn Retsch ZM 100, Mlýn Perten 120, síto 0,8 mm, laboratorní šrotovací mlýn Perten 3303, laboratorní šrotovací mlýn IKA 11A basic, mlýn Brabender Junior, hmoždířový homogenizační mlýn Fritsch Polverisette 2, Mechanické prostředky - kladívko, pevná tvrdá podložka ………

5.3.3 Postup při přípravě laboratorních vzorků k analýzám Připravíme si řádně označený papírový sáček s uvedením polního čísla (identifikačního čísla), ročníku a označení metody stanovení. Na předvážkách dle potřeby metody odvážíme potřebné množství laboratorního vzorku a kvantitativně jej převedeme do sáčku. Původní vzorek řádně uzavřeme a uložíme v originálním obalu.

5.3.4 Využití instrumentálního vybavení laboratoře pro analýzy vzorků

genetických zdrojů Mlýn Cyklotec 1093, síto 0,8 mm je používán pro přípravu semenných vzorků k následujícím metodám: ČSN 56 0512 – 7: Stanovení vody, ČSN EN ISO 5983 – 1: Stanovení obsahu dusíku – Kjeldahlova metoda,

S3

Strana:

11/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

ICC standard No. 155: Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu, a případným experimentálním aplikacím. Mlýn Perten 120, síto 0,8 mm je používán pro přípravu semenných vzorků k následující metodě: ČSN EN ISO 3093 Pšenice, žito a pšeničná a žitná mouka, pšenice tvrdá (durum) a semolina z pšenice tvrdé – Stanovení čísla poklesu podle Hagberga-Pertena, Laboratorní mlýnky (šrotovníky) Ika A10, Ika A11 a Retsch ZM100 jsou využívány pro přípravu vzorků k následujícím metodám stanovení mykotoxinů: 09-09-14 RIDASCREEN® FAST DON Instructions, R-Biopharm 09-08-26 RIDASCREEN® FAST Zearalenon Instructions, R-Biopharm Mlýn Brabender Sedimat, síto 150 m používán pro přípravu semenných vzorků k následující metodě: ČSN EN ISO 5529 Pšenice - Stanovení sedimentačního indexu - Zelenyho test Střižný mlýn SM 100 Retsch, síto 1 mm je používán pro zpracování vegetačních částí rostlin s max. vel. částic do 100 mm, předsušených v laboratorní sušárně jako přípravu k metodám: ČSN EN ISO 5983 – 1: Stanovení obsahu dusíku – Kjeldahlova metoda, a jiným experimentálním aplikacím. Laboratorní šrotovací mlýn Perten 3303 je využíván k přípravě semenných vzorků výhradně pro stanovení tvrdosti zrna pšenice: Metoda AACC 55-30: PSI – (tvrdost zrna pšenice) – (pouze pro experimentální účely), jiné experimentální aplikace laboratoře. Laboratorní šrotovací mlýn IKA 11A je používán pro přípravu velmi malých vzorků semen a vegetačních částí (max. 20 g) výhradně k experimentálním účelům. Hmoždířový homogenizační mlýn Fritsch Polverisette 2 je používán pro přípravu velmi malých vzorků semen a vegetačních částí (max 20 g) výhradně k experimentálním účelům. Mlýn Brabender Junior síto 240 m je výhradně používán ke mletí semenných vzorků obilovin pro reologické analýzy na přístroji Mixolab (ICC N°173), pouze pro experimentální účely. Laboratorní šrotovací mlýn Cyklotec 1093, síto 0.5 mm je výhradně používán pro mletí semenných vzorků obilovin pro experimentální účely: AA/AMG 11/01, AOAC metoda 996.11, AACC metoda 76.13, ICC Standartní metoda č. 168: enzymatického stanovení celkového škrobu, K-Amyl 04/06 Megazyme: Amylosa / Amylopectin, jiné. Zpracovaný vzorek je v případě mlýnů Cyklotec 1093, síto 0,8 mm, Mlýn Perten 120, Brabender Sedimat, síto 150 m, Střižný mlýn SM 100 Retsch, síto 1 mm a Laboratorní

S3

Strana:

12/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

šrotovací mlýny IKA 10 a 11A a Retsch ZM100 evidován v příslušném Mlecím protokolu (viz příloha č. 3) zahrnujícím základní údaje z identifikačního štítku vzorku, typ mlýnu, dobu namletí a návaznou analýzu. Protokoly jsou aktuálně vedeny v elektronické podobě (typ souboru xls.) uložené na síťovém disku s týdenním zálohováním. Průběžně je tištěna i papírová verze aktuálního stavu zpracování vzorků daného ročníku a uložena do příslušného šanonu s názvem Mlecí protokol.

6.

LABORATORNÍ POSTUPY

6.1

Stanovení vody (ČSN 56 0512 – 7)

6.1.1 Princip Obsah vody je stanoven jako úbytek hmotnosti vzorku, ke kterému dojde sušením za podmínek specifikovaných touto metodou.

6.1.2 Pomůcky Hliníkové vysoušecí misky s víčkem, mlýn Cyklotec 1093, síto 0,8 mm, elektrická sušárna opatřená ventilací a automatickou regulací teploty, exsikátor s porcelánovou deskou a silikagelem.

6.1.3 Postup Laboratorní vzorek semen nameleme na hrubost 0,8 mm (Cyklotec 1093). Laboratorní vzorek veg. části rostlin namelem na hrubost 1 mm (Retsch SM100). Misku s víčkem vysušíme v sušárně, 30 min při teplotě 130 – 133 C a poté necháme vychladnout v exsikátoru. Misku i s víčkem zvážíme s přesností 1 mg. Se stejnou přesností navážíme 5 g laboratorního vzorku a rozprostřeme jej do misky. Misku s odklopeným víčkem vložíme do předehřáté sušárny, nejméně 6 cm od stěn. Sušíme 60 min při teplotě 130 až 133 C. Po uběhnutí stanovené doby misky uzavřeme víčkem, vyjmeme ze sušárny a necháme vychladnout v exsikátoru. Po vychladnutí na laboratorní teplotu, cca 45 min, misky zvážíme opět s přesností 1 mg.

6.1.4 Vyjádření výsledků Hmotnostní zlomek vody w (%), vztažený k hmotnosti vzorku se vypočte podle vzorce:

w = ((m2 - m1) - m3) : (m2 - m1) x 100 m1 je hmotnost vysušené prázdné váženky (g), m2 je hmotnost váženky se zkušebním vzorkem (g), m3 je hmotnost váženky se zkušebním vzorkem po vysušení (g)

Hmotnostní zlomek sušiny s (%) je vyjádřen dle vzorce: s = 100 - w

S3

Strana:

13/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Rozdíl mezi dvěma hodnotami ze současných stanovení nebo provedených v krátkém časovém odstupu jedním pracovníkem nemá být větší než 0,2 absolutní hodnoty. Vyhodnocený vzorek je paralelně dokumentován v. elektronické i papírové verzi protokolu Stanovení obsahu vody a sušiny (Příloha č. 4) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a příslušnou kalkulaci výsledku. Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorních zkoušek

6.2

Stanovení obsahu dusíku – Kjeldahlova metoda (ČSN EN ISO 5983 – 1)

6.2.1 Princip Vzorek organického materiálu mineralizujeme koncentrovanou kyselinou sírovou v přítomnosti katalyzátoru (síranu měďnatého, síranu draselného a selenové tablety) při tv kyseliny sírové ve spalovacím hnízdě. Organicky vázaný dusík se uvolňuje ve formě amoniaku. Na automatickém analyzátoru Kjeltec je pak titračně stanoven obsah dusíku. Pomocí přepočítavacího faktoru f lze přepočítat obsah dusíku na obsah hrubých bílkovin. f = 5,70 pšenice, tritikale f = 6,25 ječmen, meziplodiny, minoritní plodiny

6.2.2 Pomůcky Mlýn Cyklotec 1093, síto 0,8 mm, předvážky s přesností 1 mg, spalovací hnízdo 2020 Digestor (Foss Tecator), Exhaust system 1013 Scrubber unit, 250 ml skleněné tuby, stojan, automatický analyzátor Kjeltec 2300 (Foss Tecator), kleště, odměrné sklo a míchadlo.

6.2.3 Chemikálie Katalyzátorová tableta, směs K2SO4 + CuSO4 (3,5 g  0,4 g / tubu), koncentrovaná kyselina sírová (H2SO4), destilovaná voda, 35 % roztok hydroxidu sodného (NaOH), titrační činidlo: kyselina boritá (H3BO3), bromkresolová zeleň, methylčerveň, methanol a 4 % hydroxid sodný, síran amonný (NH4)2SO4.

6.2.3.1

Roztok 35 % NaOH (4 litry)

Navážíme 350 g NaOH / 1 litr destilované vody (chystáme 2 + 2 litry). Hydroxid rozpouštíme v nerezových hrncích v digestoři za stálého v rukavicích. Necháme 1 hod. postát a pak přelijeme do 2 l odměrných baněk.

míchání,

Baňky 30 min chladíme ve dřezu a pak doplníme destilovanou vodou po rysku. Po 30 min opatrně přelijeme do kanystru a necháme odvzdušnit. Expirační doba roztoku max. 3 měsíce.

6.2.3.2

S3

Strana:

14/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Roztok titračního činidla (5 litrů)

Do kádinky navážíme 50 g kyseliny borité (H3BO3) a rozpustíme v destilované vodě, rozmícháváme na míchadle (rozpouští se neochotně). Roztok přelijeme do 2 litrové odměrné baňky a doplníme destilovanou vodou po rysku. Po té kyselinu boritou přelijeme do 5-ti litrové kádinky. Odměrnou baňku pečlivě vypláchneme destilovanou vodou. V kádince rozpustíme 0,05 g bromkresolové zeleni v 50 ml methanolu, přidáme 35 ml roztoku z 0,05 g methylčerveně rozpuštěné v 50 ml methanolu a ještě 2,5 ml 4 % roztoku NaOH (40 g/ litr, připravený zásobní roztok). Doplníme destilované vody a přelijeme roztok do kanistru. Kanistr promícháme a necháme odvzdušnit do druhého dne. Expirační doba roztoku max. 3 měsíce.

6.2.3.3

Roztok 0,2 N roztok H2SO4

Princip výpočtu: 1 val = 1 mol H+ = 0,5 mol H2SO4 => 0,2 val = 0,2 x 0,5 = 0,1 mol H2SO4 M (H2SO4) = 98,076 g/mol m = 98,076 x 0,1 = 9,8076 g/ litr 100 % kyseliny sírové pro 96 % kyselinu platí: (9,8076 x 100)/ 96 = 10,2163 » 10,22g ρ(H2SO4) = 1,8355 g/ml m = V x ρ => V = m / ρ = 10,2163 / 1,8355 = 5,566 ml kyseliny (pro přípravu 4 litrů roztoku odměříme 4 x 5,566 = 22,264 ml 96 % kyseliny) Kyselinu odměříme pipetou a lijeme vždy do destilované vody. U roztoků starších 2 měsíců znovu stanovit titr.

6.2.3.4

Neutralizační roztok pro exhaust system 1013

Připravíme 2 l 40% roztoku NaOH který doplníme destilovanou vodou do konečného objemu cca 15 l. Výška hladiny v exhaust systému by měla dosáhnout střední úrovně ve vyznačeném rozmezí vodoznaku umístěného na boku přístroje. Výměnu neutralizačního roztoku podmiňuje ztráta zásaditosti (pH < 7), která je průběžně kontrolována lakmusovým papírkem, a to nejdéle po 10 spálených sadách.

6.2.4 Postup Laboratorní vzorky nameleme na hrubost 0,8 mm. Zapneme spalovací hnízdo a necháme jej předehřát na teplotu 420 C. Do stojanu si nachystáme 20 skleněných tub. 2 tuby budou slepými pokusy bez vzorku. Do 18 tub navážíme 1 g šrotu, přidáme 1 selenovou tabletu a 3,5 g katalyzátorové směsi. Do všech tub nadávkujeme 12 ml koncentrované kyseliny sírové.

S3

Strana:

15/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Do vyhřátého hnízda vložíme stojan s tubami a zapneme exhaustor na 3. stupeň. Vzorky se spalují při teplotě 420 C po dobu 1 hodiny a 35 minut. Prvních 20 min běží exhaustor na 3. stupeň, pak jej stáhneme na 1,5 stupně. Po spálení necháme exhaustor běžet ještě 5 - 10 min na 3. stupeň a teprve potom stojan s tubami vyjmeme. Do každé tuby opatrně nalijeme 75 ml destilované vody a vzorky necháme cca hodinu vychladnout. Mineralizované vzorky jsou připraveny k vlastnímu stanovení obsahu celkového dusíku (NL) na automatickém analyzátoru Kjeltec 2300. Přístroj zapneme do sítě, pustíme kohoutek s vodou (chlazení) a zapneme hlavní spínač. Na ovládacím panelu přístroje stiskneme ENTER. Práce v přípravném režimu přístroje: Vložíme tubu se 75 ml destilované vody a na panelu stiskneme obrázek „ruky“: 6. možnost (vypuštění byrety H2SO4) a ENTER, 5. možnost (napuštění byrety H2SO4) a ENTER, 1. možnost (přidání titračního činidla) 2x ENTER, 4. možnost (nahřátí páry) ENTER (ENTREM také probublání vypneme). Práce v pracovním režimu přístroje: Na panelu se přepneme z „ruky“ na „vlnky“, nastavíme pomocí šipek Kjeldahl 2, Blank. Do tuby nalijeme 75 ml destilované vody, zavřeme dvířka a 1 - 2x přístroj propláchneme. Nastavíme Kjeldahl 1, Blank. Do tuby nalijeme 75 ml destilované vody, % NL  0,23. Nastavíme Kjeldahl 1, protein, faktor 5,70. Do tuby navážíme 0,15 g síranu amonného a rozpustíme v 75 ml destilované vody. Obsah NL síranu amonného je 18,03 ( 0,20) %, jinak opakujeme stanovení. Nastavíme Kjeldahl 1, Blank. Stanovíme spálený slepý vzorek, % NL  0,23. Nastavíme Kjeldahl 1, protein, faktor: Pšenice, tritikale = 5,70 Ječmen, meziplodiny, minoritní plodiny = 6,25 Postupně analyzujeme spálené vzorky, tuby vyndáváme vždy kleštěmi (tuby jsou horké). Výsledky zapisujeme do předem nadepsaného sešitu. Po ukončení stanovení se opět přepneme na Kjeldahl 2, Blank. Do tuby nalijeme 75 ml destilované vody a přístroj 2 - 3x propláchneme.

S3

Strana:

16/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Stanovení titru 0,2 N roztoku kyseliny sírové přímo na Kjeltecu Zapnutí přístroje, přípravný režim „ruka“, a přepnutí na pracovní režim „vlnovky“. Nastavíme Kjeldahl 2, Blank. Do tuby nalijeme 75 ml destilované vody a přístroj propláchneme. Nastavíme Kjeldahl 1, Blank. Do tuby nalijeme 75 ml destilované vody a stanovíme obsah NL. Nastavíme Kjeldahl 1, protein, faktor 5,70. Do 3 tub navážíme 0,15 g síranu amonného a každou dávku rozpustíme v 75 ml destilované vody, stanovíme obsah % NL a vypočteme průměr.

Výpočet: 0,2 N kyselina …..............…. % NL v SA = 18,03 x N kyselina ….................…. % NL v SA = průměr ___________________________________________________ Pro hledaný faktor kyseliny platí nepřímá úměra: x = (18,03 x 0,2): průměr Vypočtenou normalitu kyseliny sírové nastavíme na Kjelteku. Zmáčkneme ∟, přepíšeme faktor kyseliny, uložíme, Enter. Vrátíme se do pracovního režimu „vlnky“ a pokračujeme od kroku: Kjeldahl 1, Blank. Po skončení práce na přístroji Kjeltec vypneme přívod vody a přístroj odpojíme z el. zásuvky. Vyhodnocený vzorek je paralelně dokumentován v. elektronické i papírové verzi protokolu Stanovení obsahu dusíku dle Kjeldahla (Příloha č. 5) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Verifikace metody je dvoustupňová a probíhá v rámci každé analyzované sady 18 vzorků. První stupeň zahrnuje stanovení NL v referenční chemikálii Glycine pro elektroforézu (čistota min. 99 %) a to standardním procesem, kterým prochází ostatní testované vzorky (navážení, mineralizace a destilace). Dosažené hodnoty NL u glycinu při navážce 0,15g a bílkovinném faktoru f = 5,7 by měly oscilovat v rozmezí 15,95 % ± 0,30 %. Destilační proces mineralizovaných vzorků je při zapnutí destilační jednotky ověřován referenčním vzorkem: Síran amonný p.a. (čistota min. 99 %) rozpuštěného v 75 ml destilované vody. Deklarovaným obsahem NL při navážce 0,15g a bílkovinném faktoru f = 5,7 by měl oscilovat v rozmezí 18,03 % ± 0,20 %. Verifikace metody probíhá rovněž minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorních zkoušek.

6.3

S3

Strana:

17/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Stanovení sedimentačního indexu – Zelenyho test (ČSN ISO 5529)

6.3.1 Princip V roztoku kyseliny mléčné s přídavkem bromfenolové modři a zkoušené mouky (pšenice seté, jedozrnky dvouzrnky a špaldy) připravené za definovaných podmínek mletí a prosévání je připravena suspenze. Po předem určené době protřepávání a ustálení se stanoví objem sedimentu vzniklého sedimentací částeček mouky. Sedimentační index je číslo udávající objem sedimentu v mililitrech.

6.3.2 Pomůcky Mlýnek Sedimat Brabender, síto s oky o velikosti 150 m, váhy s přesností na 0,01 g, 100 ml odměrné válce s plochým dnem, dělenou stupnicí (ml) a plastovými zátkami, Seditestr - třepačka na válce s frekvencí 40 kmitů / min a časovým spínačem (každý kmit musí vychýlit válec o 60°, tedy 30°nad a pod vodorovnou plochou), nedělené pipety o objemu 25 ml a 50 ml.

6.3.3 Chemikálie Kyselina mléčná (2,8 mol/l), izopropylalkohol (99 – 100 %, V/V, obsah minerálních látek nepřevyšuje 40 mg/kg).

6.3.3.1

Roztok kyseliny mléčné

180 ml kyseliny mléčné důkladně promícháme s 200 ml izopropylalkoholu a doplníme destilovanou vodou na 1litr. Připravený roztok kyseliny mléčné se před použitím ponechá stát v klidu, v uzavřené baňce po dobu nejméně 48 hodin. Exspirace připraveného roztoku max. 2 týdny.

6.3.3.2

Roztok bromfenolové modři

4 mg (0,004 g) bromfenolové modři rozpustíme v 1litru destilované vody. Exspirace připraveného roztoku max. 2 týdny.

6.3.4 Postup Vzorky umeleme na laboratorním mlýnku Brabender (50 ml kádina) Do odměrného válce navážíme 3,20 g mouky (s přesností na 0,05 g), jež odpovídá pro vzorek o vlhkosti 13,9 - 14,1 %. Navážku vzorků s odlišnou vlhkostí upravíme podle Přepočítávací tabulky na korekci navážky pro sedimentační index (Příloha č. 7). Vždy navažujeme 2 opakování na 1 analyzovaný vzorek. Přidáme 50 ml bromfenolové modři, zazátkujeme a důkladně promícháme. Uzavřené válce vložíme do přístroje Sedi-test a zapneme ji (vzorky budou promíchány). Po zastavení Sedi-testu přidáme do každého odměrného válce 25 ml kyseliny mléčné a vložíme jej zpět do třepačky a přístroj opět zapneme (vzorky budou znovu promíchány a pak ponechány sedimentovat).

S3

Strana:

18/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Vyčkáme zaznění zvukového signálu. Z každého válce odečteme objem sedimentu s přesností 0,5 ml.

6.3.5 Vyjádření výsledků a reprodukovatelnost Sedimentační index je vyjádřen objem sedimentu v ml. Pro každý vzorek vypočteme aritmetický průměr ze 2 stanovení. Výsledek udáváme v celých číslech. Při diferenci větší než 2 ml je nutné stanovení opakovat, opět ve dvojici. Absolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými výsledky stanovení, získanými stejnou metodou se stejným materiálem, v různých laboratořích různými pracovníky při použití rozdílného laboratorního zařízení, nemá být větší než: 2 (absolutní hodnota) pro sedimentační index  20, 10 (relativní hodnota ) pro sedimentační index  20. Vyhodnocený vzorek je paralelně dokumentován v. elektronické i papírové verzi protokolu Stanovení sedimentačního indexu (Příloha č. 6) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorních zkoušek

6.4

Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu (dle metody ICC No. 155)

6.4.1 Princip Lepek je soubor pšeničných bílkovin nerozpustných ve vodě. Při navlhčení vodou tvoří bílkoviny souvislou lepkavou mřížku (mokrý lepek) z gliadinů a gluteninů, ve vzájemném poměru cca 75 % : 25 %. Gliadiny podléhají peptizaci a určují vláčnost a pružnost těsta. Gluteniny naopak vzniklé těsto utužují. Obsah a kvalita lepku jsou důležitým ukazatelem pekařské jakosti pšeničné mouky. Za standardních podmínek se z pšeničného šrotu (mouky) a 2 % roztoku chloridu sodného (NaCl) vytvoří těsto, které se ihned vypírá roztokem 2 % NaCl. Získaný lepek se odstřeďuje a současně protlačuje speciálním sítem. Zjišťujeme hmotnost mokrého lepku zbylého na sítě po odstředění a celkovou hmotnost získaného mokrého lepku. Jejich vzájemný poměr (gluten index, GI) charakterizuje jakost mokrého lepku.

6.4.2 Pomůcky Mlýn Cyklotec 1093, síto 0,8 mm, přístroj Glutomatik se standardní vypírací komorou o Ø 60 mm, výměnné polyesterové síto s Ø ok 88 μm (pšeničná mouka), 840 μm (pšeničný šrot), kanystr na 10 litrů (vypírací roztok), centrifuga s 6000 otáček/min a dvě kazety s otvory o Ø 22 mm, váhy s přesností ±0,01 g.

S3

Strana:

19/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

6.4.3 Chemikálie 2 % NaCl. Navažujeme 20 g NaCl na litr roztoku. Roztok připravujeme vždy čerstvý a nacháváme vytemperovat na laboratorní teplotu.

6.4.4 Pracovní postup Na laboratorním mlýnku semeleme vzorek cca 40 g zrna. Důkladně promícháme a stanovíme obsah sušiny. Vzorky necháme 7 – 14 dní odležet. Pro vlastní stanovení navážíme 10 g celozrnného šrotu o vlhkosti. Vzorek kvantitativně převedeme do vypírací komory se sítem o Ø ok 88 μm. Vždy navažujeme 2 opakování z jednoho vzorku. Předem je dobré síto navlhčit a vzorek rovnoměrně rozprostřít. Do každé vypírací komory se vzorkem přidáme 4,8 ml roztoku 2 % NaCl. Komory vložíme do přístroje Glutomatic a zapneme. Zkontrolujeme, zda svítí obě žlutá tlačítka (jedno problikává). V přístroji proběhne 20 s hnětení a poté 2 minuty vypírání lepku. Vyčkáme ukončení 1. fáze vypírání a opatrně komory vyjmeme z přístroje. Pod tekoucí vodou převedeme lepek do druhé komory se sítem o Ø ok 840 μm. Komory opět vložíme do přístroje Glutomatic a opětovně zapneme. Přístroj pokračujeme ve vypírání lepku další 3 minuty. Z vypraného lepku vytvoříme kuličku a vložíme ji do kazety s kovovým sítem. Kazety s oběma vzorky vložíme do centrifugy a necháme 60 s odstředit. Pak zvážíme lepek na sítě a celkový lepek, s přesností 0,01 g. Po skončení série stanovení je vhodné přístroj i sítka očistit.

6.4.5 Vyjádření výsledků a reprodukovatelnost Výsledek je vždy průměrem dvou souběžných stanovení, zaokrouhlujeme na 0,1.

GI = 100 x lepek na sítě [g] : celkový lepek [g] udává se v % Mokrý lepek ve vzorku [%] = (100 x celkový lepek [g]) : navážka [g]. Mokrý lepek v přepočtu na sušinu = (mokrý lepek x 86) : (100 – vlhkost vzorku).

S3

Strana:

20/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Rozdíl mezi výsledky dvou souběžných stanovení by měl být < 0,5% obsahu mokrého lepku. Pokud tomu tak není, je lépe stanovení zopakovat. Rozdíl pro lepkový index (GI): < 11 jednotek v intervalu 70 – 100 % < 15 jednotek v intervalu 0 – 70 % Vyhodnocený vzorek je paralelně dokumentován v elektronické i papírové verzi protokolu Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu (Příloha č. 8) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorních zkoušek.

6.5

Stanovení čísla poklesu podle Perten-Hagberga (ČSN EN ISO 3093, ICC standard č. 107, AACC metoda 56 – 81B)

6.5.1 Princip Pádové číslo (Falling number) je metoda pro stanovení aktivity α – amylázy v mouce obilovin (pšenice, tritikale, žito). Metoda je založena na rychlé gelatinizaci vodní suspense mouky ve vroucí vodní lázni a následném měření ztekucení škrobu působením α – amylázy. Pádové číslo se udává v sekundách. Hodnoty pádového čísla jsou komplexní inverzní funkcí obsahu α – amylázy ve vzorku (Pertenova rovnice ztekucení). Pádové číslo nám charakterizuje vnitřní porůstání zrna, poškození endospermu zrna hydrolytickými enzymy a následné nežádoucí změny technologické jakosti. U potravinářské pšenice by hodnota „FN“ neměla klesnout pod 220 s.

6.5.2 Pomůcky Falling number 1400 s příslušenstvím (zkumavky, zátky, míchadelko, násypka), Laboratorní mlýnek Cyklotec 1093 se sítem 0,8 mm, 25 ml pipeta, nálevka, Váhy s přesností ±0.05 g.

6.5.3 Postup Laboratorní vzorek semeleme na laboratorním mlýně se sítem 0,8 mm. Stanovíme obsah sušiny a podle vlhkosti vzorku upravíme navážku 7 g pro 15 %. Korekce navážky je vůči aktuální vlhkosti vzorku je uvedena v příloze Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro číslo poklesu (příloha č. 10). Do čisté zkumavky napipetujeme 25 ml destilované vody a kvantitativně převedeme vzorek. Zkumavka je zavřena zátkou a 30x intenzivně promíchána, suspenze homogenizována. Zátku vyjmeme, otřeme o stěny zkumavky a do suspenze vložíme míchadélko. Zkumavku s míchadlem vložíme otvorem v chladícím víku do vroucí vodní lázně. Příliš neotálíme s jednotlivými kroky, aby nedošlo k ovlivnění výsledků. Na zkumavku připojíme míchací nástavec a zapneme přístroj, po 5 s začne promíchávání rychlostí 2 zdvihy / s.

S3

Strana:

21/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Po 60 s se míchání zastaví v horní poloze, uvolní se míchadélko, tak aby vlastní vahou klesalo suspenzí a urazilo předepsanou dráhu. Zvukový signál oznámí konec zkoušky. Automatické počítadlo zobrazí hodnotu pádového čísla.

6.5.4 Vyjádření výsledků Pádové číslo je definováno jako celkový čas (s) od vložení viskometrických zkumavek do vodní lázně a začátku promíchávání do okamžiku, kdy míchadlo poklesne o předepsanou vzdálenost gelatinizovanou suspenzí. Opakovatelnost měření stejného vzorku je ±5 % z průměrné hodnoty pádového čísla. Velký význam pro přesnost měření má vzorkování.

6.5.5 Interpretace hodnot pádového čísla

6.5.5.1

Pšenice pro pekařské účely

< 150 vysoká aktivita α – amylázy, porostlé obilí, mazlavá střída chleba 200 – 300 optimální aktivita α – amylázy, obilí neporostlé, střída chleba dobrá > 300 nízká aktivita α – amylázy, střída chleba suchá, objem bochníku nízký

6.5.5.2 < 100 ≥ 120

Žito vysoká aktivita α – amylázy, porostlé obilí nízká aktivita α – amylázy, obilí neporostlé, minimum pro produkci pečiva

Vyhodnocený vzorek je paralelně dokumentován v. elektronické i papírové verzi protokolu Stanovení čísla poklesu (Příloha č. 9) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Validace metody probíhá minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorního porovnávání.

6.6

Stanovení obsahu sušiny, NL a škrobu pomocí FT-NIR spektroskopie

6.6.1 Princip Infračervená (IR) spektrometrie využívá absorpce infračerveného záření molekulami látek. Energie IR záření již nestačí na změny elektronových stavů, ale způsobuje změny vibračních a rotačních stavů molekul. Proto získáváme spektra vibračně-rotační. Z vlnočtu absorbovaného IR záření získáváme informace pro kvalitativní analýzu. Blízká IR oblast (NIR) využívá vlnočet 4 000 – 12 800 cm-1 v našem případě 4 000 – 10 000 cm-1. NIR spektra získáváme spektrometrem s Fourierovou transformací (FT – NIR). Tyto spektrometry využívají místo monochromátoru Michelsonova interferometru, který na principu interference zesiluje / zeslabuje záření z monochromatického zdroje. Část paprsku dopadá na polopropustný dělič (z KBr), od něj se odráží na pevné zrcadlo a dalším odrazem se vrací zpět k děliči paprsků. Druhá část paprsku prochází přes polopropustný dělič, odráží se od pohyblivého zrcadla a polopropustného děliče zpět. Zde se potkává s první částí paprsku a interferuje s ní. Interferencí se zesilují paprsky, které se potkávají ve fázi. Postupně se mění vzdálenost pohyblivého zrcadla a tím i vlnová délka zesíleného záření. Zpracovaný signál

S3

Strana:

22/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

počítač upraví matematickým postupem – Fourierovou transformací na absorpční NIR spektrum. Pomocí počítačových programů můžeme spektra prohlížet, upravovat a archivovat. Přiřazení změřených parametrů daného vzorku (zrna, mouky, namletých veg. části aj.) k jejich NIR spektru lze vytvářet kalibrační modely pro kvantifikaci obsahu sušiny, NL a škrobu u nezávislých vzorků.

6.6.2 Pomůcky FT – NIR Spektrometr Antaris II (Thermo Electron Corporation), počítač s potřebným programovým vybavením pro sběr a analýzu spekter (Macros Basic a Omnic) pro kalkulaci kalibračních rovnic a vyhodnocení nezávislých vzorků (TQA), program Excel, měřící kyvety z křemenného skla. referenční vzorek

6.6.3 Postup sběru NIR spekter a predikce sledovaných parametrů

6.6.3.1

Program Macros Basic

Spustím program Macros Basic a následujícím způsobem si vytvořím adresář pro ukládání spektrálních dat. File / Open / měření Mac / nalistovat 2. Stranu, na schématu 2x kliknout na Save as, zkopírovat koncovku #mv1#_#mv6#.spa, odkliknu Browse, vytvořím soubor pro ukládání spekter a vložím zkopírovanou koncovku, OK, znovu File / Save a zavřu program Macros basic, kontrola existence nově vytvořené složky (v případě již existující není potřeba).

6.6.3.2

Diagnostika Antarisu 2 programem Omnic

Spustím program Omnic a provedu následujícím způsobem diagnostiku spektrometru. Program Omnic / expect set „?“ / Diagnostic. Diagnostika se provádí každý den 30 min před vlastním měřením a zapisuje se do sešitu o měření na NIR spektrometru Antaris.

6.6.3.3

Vlastní skenování v programu Omnic

V programu Omnic se přepnu do režimu měření a pokračuji následujícím způsobem: Macro měření / měření pozadí / měření vzorku, identifikace vzorku: kategorie: plodina / řešitel / rok, vzorek: polní číslo / opakování / rok, vzorek nasypeme do kyvety, vrstva vysoká nejlépe 2 - 3 cm, vzorek sklepneme, naplněnou kyvetu vložíme do skenovacího okna přístroje, v programu Omnic spustíme proces skenování. (Obsluhující program Omnic umožňuje nastavení počtu subskenů, frekvenci měření pozadí přístroje a další parametry. Pro měření zrnin je nastaveno 64 subskenů.)

S3

Strana:

23/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Pozn. Před zahájením měření (skenování) vzorků v daném dni je vždy proměřen příslušný referenční vzorek (např. polystyren) a jeho hodnota je vyhodnocena příslušnou kalibrační rovnicí označenou určenou pro referenční materiály.

6.6.3.4

Kvantifikace naměřených dat pomocí softwaru TQA

Získaná spektra podrobíme kvantitativnímu vyhodnocení pomocí vytvořených kalibračních modelů na základě interních kalibračních postupů a referenčních metod. Kalibrační modely pro obsah sušiny, NL a škrob vycházejí z referenčních metod ČSN 56 0512 – 7, ČSN EN ISO 5983 a ČSN EN ISO 10520. Pro rutinní kvantifikace parametrů lze využít modely tvořené více jak 60 kalibračními daty alespoň ze 2 ročníků a hodnotou korelace křížové validace min. 0,85 a vyšší. Před každým rutinním měřením v daném dnu je proměřen 1 interní referenční vzorek obiloviny (pšenice, ječmen tritikale) s deklarovanou hodnotou obsahu zjišťovaného parametru a vyhodnocena zjištěná odchylka. Doba uchování interních referenčních vzorků je max. 1 rok. Kalibrační modely jsou vytvářeny pomocí programu TQA s využitím nabídnutých matematických prostředků (nejčastěji metoda PLS, Partial Least Squares). Prostřednictvím těchto modelů pak vyhodnotíme spektra vzorků a jednotlivé zvolené znaky zrna kvantifikujeme. Postup je popsán následovně: File / Open Method / najdu si potřebnou aktuální kalibraci plodiny a hodnoceného znaku, otevřu okno Diagnostics, zvolím možnost Multiple Summary, najdu si na síťovém disku VURV NICOLET ANTARIS příslušný adresář se spektry, otevřu si jej a spektra označím do bloku. Program TQA mi sám vytvoří v programu Excel výsledkovou tabulku s hlavičkou použitého kalibračního modelu, identifikací spekter a predikovanými hodnotami sledovaného znaku, který je v příslušném složce zálohován na síťovém disku jako pracovní verze. Vyhodnocený vzorek je paralelně dokumentován v elektronické i papírové verzi protokolu Stanovení obsahu sušiny, NL a škrobu pomocí FT-NIRS (Příloha č. 11) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Pozn. FT-NIR spektroskop lze od 1.9. 2014 využít i pro screeningové odhady dalších parametrů: PSI, Zelenyho sedimentace, obsahu mokrého lepku a čísla poklesu u pšenice seté.

6.6.3.5

Údržba a optimalizace kalibračních modelů

Kalibrace jsou každým rokem doplňovány, aktualizovány a optimalizovány. Interní validace probíhá na nezávislých vzorcích s možností porovnání predikce s příslušnou laboratorní analýzou a v rámci každoročního mezilaboratorního porovnávání.

6.7

Stanovení deoxynivalenolu metodou ELISA

6.7.1 Princip Podstatou analýzy je specifická imunitní vazba antigen (i.e. deoxynivalenol)– protilátka. Protilátka je ukotvena v mikrotitračních jamkách a o vazebná místa soutěží volný deoxynivalenol obsažený ve vzorku a definované množství deoxynivalenolu konjugovaného s enzymovou jednotkou. Po odmytí nenavázaného volného a konjugovaného deoxynivalenolu je do jamek přidán chromogenní substrát a enzymový konjugát konvertuje substrát na modrý produkt. Standardní doba enzymové reakce je zajištěna načasovaným přidáním stop činidla,

S3

Strana:

24/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

které změní barvu produktu z modrého na žlutý. Intenzita barvy je tak nelineárně závislá na koncentraci deoxynivalenolu ve vzorku.

6.7.2 Pomůcky Přístroj pro výrobu destilované vody, Laboratorní skleněné baňky 50 ml, Skleněné zkumavky 5 ml nebo větší, Váhy (lab 154), Automatický dávkovač kapalin Dispensette 50 ml, Stopky, Třepačka, Vortex genie 2, Diodová podložka pro ELISA destičky Im-a-loc, Elektronická pipeta Biohit eLine 50 – 100 ul, Elektronická multikanálová pipeta Biohit eLine 50 – 1200 ul, Destičkový spektrofotometr Tecan Sunrise.

6.7.3 Chemikálie a spotřební materiál ELISA set R5901 RIDASCREEN®FAST DON, Špičky pro pipety Biohit 50 – 1000 µl a 50 – 1200 µl, Destilovaná voda, Filtrační papíry průměr 15 cm.

6.7.4 Postup Pracovní postup se řídí přednostně pokyny výrobce setu v anglickém jazyce, který při jeho dodržení garantuje kvalitu výsledků v souladu s EN DIN ISO 9001. 1. Příprava pufru Kit R5901 obsahuje balíček pro přípravu pufru. Jeho obsah se rozpustí v 1 l destilované vody. Doba použitelnosti 1 měsíc při 4°C. Pufr je doporučen pro vzorky pšenice a produkty z ní. Ostatní vzorky mohou být promývány destilovanou vodou. 2. Příprava vzorku Navážit 5 g mletého vzorku do skleněné zábrusové baňky s rovným dnem a přidat 100 ml destilované vody. Navážka vzorku se může lišit, ale poměr vzorku a vody (diluční faktor) musí být vždy 1:20, baňku uzavřete zábrusovou skleněnou zátkou a pečlivě třepejte 3 minuty, přefiltrujte směs přes skládaný papírový filtr do další skleněné baňky, pro stanovení použijte 50 l čirého filtrátu, pokud je ve vzorku vyšší rozsah deoxynivalenolu, než je kalibrační rozsah daný výrobcem, vzorek je nutné ředit destilovanou vodou a po naředění homogenizovat za pomoci vertexu. 3. Analýza Vyjměte pouze potřebné množství proužků, zbytek pečlivě zabalte a vraťte do lednice (28°C), vložte odpovídající počet proužků do rámečku. Zapište pozice standardů a vzorků. Analýza vzorku je opakována nejméně dvakrát, vzorek je umisťován do sousedících jamek, standardy jsou připraveny přímo k použití. Při jejich označování byl uvažován diluční faktor 20 pro vzorky, který odpovídá doporučenému postupu. Koncentrace DON tedy mohou být

S3

Strana:

25/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

odečítány přímo ze standardní kalibrační křivky a standardy mohou být také promývány pufrem, pipetujte 50 l standardu nebo vzorku do jamek, užijte vždy novou špičku pro každý standard nebo vzorek. Pro zvýraznění pozic jamek, do kterých má být pipetováno použijte světelnou destičku Im-a-loc, pipetujte 50 l enzymového konjugátu na dno každé jamky (lahvička s červenou zátkou) – použijte multikanálovou pipetu, přidejte 50 l DON protilátky do každé jamky (černá zátka) – použijte multikanálovou pipetu, zamíchejte pečlivě jemným kruhovým pohybem destičky a inkubujte ji přikrytou 5 minut při pokojové teplotě, vylijte tekutinu z jamek do výlevky. Vyklepněte zbytky tekutiny 3x o filtrační papír (buničinu) – jamky dnem nahoru. Použijte střičku nebo multipipetu, naplňte jamky destilovanou vodou (pro pšeničné vzorky promývacím pufrem). Znovu vyprázdněte jamky a odstraňte zbytky tekutiny. Opakujte promytí ještě 2x, přidejte 100 l substrátu/chromogenu do každé jamky. Promíchejte, zakryjte alobalem a inkubujte 3 minuty při pokojové teplotě, přidejte 100l stop činidla do každé jamky (žluté víčko). Dobře promíchejte a změřte při 450 nm. Odečtěte hodnoty absorbance do 10 minut, kvantifikace analytu je prováděna pomocí externí kalibrační křivky, ke kvantifikaci je využíván specializovaný software RIDA®SOFT Win. Vyhodnocený vzorek je dokumentován v. elektronické verzi protokolu Stanovení obsahu deoxynivalenolu (Příloha č. 12) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorních zkoušek a/nebo pomocí analýzy certifikovaných referenčních materiálů.

6.8

Stanovení zearalenonu metodou ELISA

6.8.1 Princip Podstatou analýzy je specifická imunitní vazba antigen (i.e. zearalenon)– protilátka. Protilátka je ukotvena v mikrotitračních jamkách a o vazebná místa soutěží volný zearalenon obsažený ve vzorku a definované množství zearalenonu konjugovaného s enzymovou jednotkou. Po odmytí nenavázaného volného a konjugovaného zearalenonu je do jamek přidán chromogenní substrát a enzymový konjugát konvertuje substrát na modrý produkt. Standardní doba enzymové reakce je zajištěna načasovaným přidáním stop činidla, které změní barvu produktu z modrého na žlutý. Intenzita žlutého zbarvení je tak nelineárně závislá na koncentraci zearalenonu ve vzorku.

6.8.2 Pomůcky Přístroj pro výrobu destilované vody, Laboratorní skleněné baňky 50 ml, Skleněné zkumavky 5 ml nebo větší, Váhy (lab 154), Automatický dávkovač kapalin Dispensette 50 ml, Stopky, Třepačka, Vortex genie 2,

S3

Strana:

26/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Diodová podložka pro ELISA destičky Im-a-loc, Elektronická pipeta Biohit eLine 50 – 100 ul, Elektronická multikanálová pipeta Biohit eLine 50 – 1200 ul, Destičkový spektrofotometr Tecan Sunrise.

6.8.3 Chemikálie a spotřební materiál ELISA set R5502 RIDASCREEN®FAST ZEA, Špičky pro pipety Biohit 50 – 1000 µl a 50 – 1200 µl, Destilovaná voda, Filtrační papíry průměr 15 cm, Metanol HPLC gradient grade.

6.8.4 Postup Pracovní postup se řídí přednostně přiloženými pokyny výrobce setu v anglickém jazyce, který při jeho dodržení garantuje kvalitu výsledků v souladu s EN DIN ISO 9001.

1. Příprava extrakčního roztoku Připravte roztok metanolu v destilované vodě v poměru metanol: voda 70:30 (v/v). takto připravený roztok lze použít po dobu 6 měsíců od data přípravy. 2. Příprava vzorku Navažte 5 g mletého vzorku do skleněné zábrusové baňky s rovným dnem a přidat 25 ml připraveného extrakčního roztoku. Navážka vzorku se může lišit, ale poměr vzorku a vody (diluční faktor) musí být vždy 1:5, baňku uzavřete zábrusovou skleněnou zátkou a pečlivě třepejte 3 minuty, přefiltrujte směs přes skládaný papírový filtr do další skleněné baňky, do skleněné 5 ml zkumavky pipetujte 1ml filtrátu a 1 ml destilované vody. Homogenizujte vortexováním, na nanášení použijte 50 l této směsi, pokud je ve vzorku vyšší rozsah zearalenonu, než je kalibrační rozsah daný výrobcem, vzorek je nutné ředit 35 % roztokem metanolu připraveného ředěním extrakčního roztoku destilovanou vodou v poměru 1:1 (v/v) a po naředění homogenizovat za pomoci vortexu 3. Analýza Vyjměte pouze potřebné množství proužků, zbytek pečlivě zabalte a vraťte do lednice (28°C), vložte odpovídající počet proužků do rámečku. Zapište pozice standardů a vzorků, standardy jsou připraveny přímo k použití. Při jejich označování byl uvažován diluční faktor 10 pro vzorky. Koncentrace zearalenonu tedy mohou být odečítány přímo ze standardní kalibrační křivky, pro zvýraznění pozic jamek, do kterých má být pipetováno použijte světelnou destičku Ima-loc, pipetujte 50 l standardu nebo vzorku do jamek, užijte vždy novou špičku pro každý standard nebo vzorek, přidejte 50 l enzymového konjugátu na dno každé jamky (červená zátka) – použijte multikanálovou pipetu, přidejte 50 l protilátky do každé jamky (černá zátka) – použijte multikanálovou pipetu. Zamíchejte pečlivě jemným kruhovým pohybem destičky po stole a inkubujte ji přikrytou 10 minut při pokojové teplotě,

S3

Strana:

27/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

vylijte tekutinu z jamek do výlevky. Vyklepněte zbytky tekutiny 3x o filtrační papír (buničinu) – jamky dnem nahoru. Použijte střičku nebo multipipetu, naplňte jamky destilovanou vodou. Znovu vyprázdněte jamky a odstraňte zbytky tekutiny. Opakujte promytí ještě 2x, přidejte 100 l substrátu/chromogenu do každé jamky. Promíchejte, zakryjte alobalem a inkubujte 5 minut při pokojové teplotě, přidejte nebo 100l stop činidla do každé jamky (žluté nebo oranžové kapátko). Dobře promíchejte a změřte při 450 nm. Odečtěte do 10 minut. Vyhodnocený vzorek je dokumentován v. elektronické verzi protokolu Stanovení obsahu zearalenonu (Příloha č. 13) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a hodnotu výsledku. Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně v rámci mezilaboratorních zkoušek a/nebo pomocí analýzy certifikovaných referenčních materiálů.

Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda (ČSN EN ISO 10520)

6.9

6.9.1 Princip Tento postup specifikuje polarimetrickou metodu stanovení obsahu škrobu v přírodním škrobu, s výjimkou škrobu s vysokým obsahem amylózy. Není použitelná u modifikovaného škrobu nebo předbobtnalého škrobu (rozpustného ve vodě). Metoda stanovení má dva kroky. V prvním kroku se jeden podíl vzorku hydrolyzuje zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a po vyčiření a filtraci se optické otáčení měří polarimetricky. Druhý podíl vzorku se smíchá s 40 % (VA/) ethanolem za účelem extrakce rozpustných cukrů a polysacharidů o nízké molární hmotnosti. Filtrát se následně zpracuje obdobně jako pro krok č. 1. Faktorem násobený rozdíl mezi měřeními v krocích 1 a 2 pak udává obsah škrobu ve vzorku. POZNÁMKA - Nejdůležitějšími body metody jsou doba trvání a teplota hydrolýzy, jakož i správné použití a kalibrace polarimetru. Podstatné je také stálé míchání ve vodní lázni, která by měla mít přiměřenou velikost, aby bylo možno zajistit rychlý nárůst teploty a stabilní teplotní podmínky.

6.9.2 Pomůcky a chemikálie    

Odměrné baňky na 100 ml Vodní lázeň vyhřívaná vroucí vodou nebo Polarimetr Anton Paar MCP 200 nastavitelný na vlnovou délku 589,3 nm s 200 mm měrnými trubicemi Analytické váhy s přesností vážení na 0,001 g

Pokud není stanoveno jinak, používají se chemikálie pouze čistoty p.a. a voda, která odpovídá požadavkům podle ISO 3696, stupeň 2.  

Zředěná kyselina chlorovodíková, c(HCI) = 7,7 mol/l. (63,7 ml kyseliny chlorovodíkové (p20= 1,19 g/ml) se doplní vodou na 100 ml). Zředěná kyselina chlorovodíková, c(HCI) = 0,309 mol/l. (25,6 ml kyseliny chlorovodíkové (p20 = 1,19 g/ml) se doplní vodou na 1000 ml).

S3

Strana:

28/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

POZNÁMKA - Koncentrace se kontroluje hydroxidem sodným [c(NaOH) = 0,1 mol/l] a methylčervení jako indikátorem: Na 10 ml HCI by se mělo spotřebovat 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH.   

Zředěný ethanol, 40 % (V/V) (p20 = 0,948 g/ml) Carrezův roztok I (10,6 g hexakyanoželeznatanu draselného trihydrátu [K4Fe(CN)6 • 3 H20] se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 100 ml). Carrezův roztok II (21,9 g octanu zinečnatého dihydrátu [Zn(CH3COO)2 • 2 H20] a 3 g ledové kyseliny octové se rozpustí ve vodě a vodou doplní na 100 ml.

6.9.3 Postup Stanovení celkového optického otáčení Vzorek se mele tak, aby částice vzorku prošly sítem s otvory 0,5 mm. Takto připravený vzorek se homogenizuje. Vzorek se naváží s přesností na 0,001 g (m1). Naváží se 2,5 g +0,05 g (m,) zkušebního vzorku a převede do odměrné baňky na 100 ml. Přilije se 25 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové (0,309 mol/l) a obsah se protřepe, aby se analytický vzorek rovnoměrně rozptýlil. Přilije se dalších 25 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové. Odměrná baňka se ponoří do vroucí vodní lázně a soustavně se první 3 min. protřepává Odměrná baňka se ve vroucí vodní lázni ponechá 15 min +5 s. Krátce před vyjmutím se třepáni nebo míchání ukončí. Okamžitě se přilije 30 ml studené vody a pod tekoucí vodou se rychle ochladí na teplotu 20 °C +2 °C. Přilije se 5 ml Carrezova roztoku I a 1 minutu se protřepává. Dále se přilije 5 ml Carrezova roztoku II a opět se 1 minutu protřepává. Baňka se doplní se po rysku vodou. Roztok se promíchá a zfiltruje vhodnou filtrační nálevkou a filtračním papírem KA1 (d = 240mm). Není-li filtrát úplně čirý, vyčiření se opakuje s 10 ml Carrezových roztoků. Optické otáčení roztoku (α1) se měří na polarimetru (Anton Paar MCP 200) v měřicí trubici 200 mm. Stanovení optického otáčení látek rozpustných ve 40 % (V/V) ethanolu Naváží se 5 g +0,1 g homogenizovaného vzorku (m2) a převede do odměrné baňky na 100 ml. Přilije se asi 80 ml roztoku ethanolu (40% V/V). Odměrná baňka se potom nechá stát 1 hodinu při teplotě místnosti; během této hodiny se šestkrát silné protřepe, aby se zajistilo důkladné promíchání analytického vzorku s ethanolem. Potom se doplní ethanolem (40% V/V) na 100 ml, homogenizuje se a filtruje. 50 ml filtrátu (ekvivalentní množství k 2,5 g zkušebního vzorku) se odpipetuje do 100ml odměrné baňky. Přilije se 2,1 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové (7,7 mol/l) a důkladné se protřepe. Odměrná baňka se připojí ke zpětnému chladiči a ponoří do vroucí vodní lázně. Po 15 min +5 s se odměrná baňka vyjme z vroucí vodní lázně a ochladí se na teplotu 20 °C +2 °C. Přilije se 5 ml Carrezova roztoku I a 1 minutu se protřepává. Dále se přilije 5 ml Carrezova roztoku II a opět se 1 minutu protřepává. Baňka se doplní se po rysku vodou. Roztok se promíchá a zfiltruje vhodnou filtrační nálevkou a filtračním papírem KA1 (d = 240mm). Není-li filtrát úplně čirý, vyčiření se opakuje s 10 ml Carrezových roztoků. Optické otáčení roztoku (α2) se měří na polarimetru (Anton Paar MCP 200) v měřicí trubici 200 mm. POZNÁMKA: Hodnoty stanovení optické otáčivosti látek rozpustných v etanolu lze u obilnin zanedbat.

S3

Strana:

29/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

6.9.4 Vyjádření výsledků a opakovatelnost Obsah škrobu, w, v sušině zkušebního vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle následující rovnice: W = 2000/ αD20 . [ (2.5 . α1 / m1) – (5 . α2 / m2)] . 100 / w1 kde je: α1 - číselná hodnota celkového optického otáčení ve stupních α2 - číselná hodnota optického otáčení látek rozpustných v ethanolu ve stupních m1 - číselná hodnota hmotnosti zkušebního vzorku v gramech m2 - číselná hodnota hmotnosti zkušebního vzorku v gramech pro rozpustnost v ethanolu w1 - číselná hodnota obsahu sušiny zkušebního vzorku v hmotnostních procentech αD20 - číselná hodnota měrného optického otáčení čistého škrobu ve stupních, měřená při vlnové délce 589,3 nm (tab. 1). Výsledky jsou zaneseny do formuláře uvedeném v příloze č. 18. POZNÁMKA: Stanovení sušiny (vody) se provede dle postupu v kap. 6.1 této směrnice Tab. 1 Číselná hodnota αD20 (ve stupních)

Druh škrobu Rýžový škrob Bramborový škrob Kukuřičný škrob Pšeničný škrob Ječný škrob Ovesný škrob

+ 185,9 + 185,7 + 184,6 + 182,7 + 181,5 + 181,3

Jiné druhy škrobu a škrobových

+ 184,0

směsí Absolutní rozdíl mezi dvěma výsledky, kterých dosáhne se stejným zkušebním materiálem stejný pracovník na stejném zařízení v nejkratším možném časovém rozpětí nepřekročí hodnotu opakovatelnosti podle tabulky 2 pro udané druhy škrobu. Tab. 2 Druh škrobu

klíčky

Opakovatelnost, r % (m/m)

Kukuřice

2,2

Brambory Pšenice Kukuřičné

1,0 2,0 1,4

S3

Strana:

30/ 68


Vydání:

4

6.10 Stanovení relativní tvrdosti zrna (AACC 55-30 z r. 2000)

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

– Particle size index (PSI)

6.10.1 Princip Textura pšeničného zrna ovlivňuje výslednou kvalitu bílé či celozrnné mouky. V průběhu mletí (drcení) zrna a jeho následného třídění na sítě dochází u zrn s tvrdším endospermem k tvorbě většího podílu ostrohranných částic, jež zůstávají na sítě. Hmotností podíl částic prošlých přes síto k celkové navážce tak nepřímo vyjadřuje tvrdost zrna tzv. Index velikosti částic (PSI).

6.10.2 Pomůcky a chemikálie       

Laboratorní mlýnek firmy Perten LM 3303 vybavený hlavou č. 2 Kruhové síto s deklarovanou velikostí ok 75 μm Prosévačka AS 200 basic s řízeným vertikálním kmitem a časovačem Laboratorní váha s přesností min. ± 0,01 g Čističe sít (6 gumových kostiček o velikosti hrany 1cm) Vysavač Jemný štětec

6.10.3 Postup Ke stanovení se použije dobře vyčištěné zrno s rozsahem vlhkosti 11 – 13 %. Na příslušném mlýnku se umele 22 – 23 g zrna. S přesností na 0,01 g se naváží 10 g získaného šrotu, který se na příslušném prosévač s využitím čističů sít proseje přes síto s deklarovanou velikostí ok 75 μm po dobu 10 minut a amplitudou kmitu 80. Získaný prosev se zváží s přesností na 0,01 g a stanovení se provádí ve dvou opakováních (viz Příloha č. 19). Po každém prosevu se ze síta pečlivě odstraní zbylý šrot pomocí štětce a vysavače

6.10.4 Vyjádření výsledků Provede se výpočet indexu PSI se zaokrouhlením na 1 desetinné místo dle vzorce: PSI % = (hmotnost propadu pod sítem (g) / hmotnost vzorku (g)) x 100 .

Stupnice relativní tvrdosti zrna (PSI) Kategorie

PSI (%)

Extra tvrdá

≤ 7,4

Velmi tvrdá

7,5 – 12,4

Tvrdá

12,5 – 16,4

Středně tvrdá Středně měkká

16,5 – 20,4 20,5 – 25,4

Měkká

25,5 – 30,4

Velmi měkká

30,5 – 35,4

Extra měkká

≥ 35,5

S3

Strana:

31/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

6.11 Elektroforéza zásobních bílkovin pšenice a ječmene ve škrobovém gelu (SGE) - stanovení odrůdové pravosti a jednotnosti 6.11.1 Princip metody Elektroforéza prolaminové složky zásobních bílkovin pšenice (gliadiny) a ječmene (hordeiny) představuje účinnou metodu pro identifikaci odrůd těchto obilovin. Elektroforetické dělení bílkovin vychází z toho, že jednotlivé složky bílkovin se liší elektrickým nábojem a hmotností. Bílkovinné složky se proto pohybují ve stejnosměrném elektrickém poli s různou rychlostí. Výsledkem elektroforézy je elektroforetické spektrum typické pro danou odrůdu, které se skládá z určitého počtu bílkovinných složek, jejichž projevem jsou elektroforetické pruhy lišící se polohou ve spektru a intenzitou zbarvení, která je závislá na koncentraci jednotlivých bílkovinných složek.

6.11.2 Pomůcky Přístroj pro výrobu destilované vody, Elektroforetický systém pro elektroforézu ve skleněných trubičkách se zdrojem stejnosměrného proudu DESATRONIC 3000/200, Stolní centrifuga MPW-52, Váhy OWALABOR (lab. 155), Váhy Chyo Petit Balance MK 200 B (lab. 155), Lednice LIEBHERR PREMIUM, Vortex genie 2, Automatická pipeta 20 – 200 ul, Teploměr (0-100°C), Bunsenův kahan, Laboratorní odměrné baňky skleněné 2000 ml, 500 ml, Laboratorní baňky s kulatým dnem skleněné 250 ml, Stojánky pro 2 ml plastové centrifugační mikrozkumavky, Injekční stříkačka s jehlou, Gumový balónek s hadičkou, Skleněné zkumavky 25 ml a 10 ml a příslušné stojany na zkumavky, Gumové zátky (dolní průměr 7 mm), Plastová střička 250 ml, Skleněné láhve s uzávěrem na zásobní roztoky 2 000 ml, 3 000 ml, Stopky, Kovová špachtle, Vodní lázeň pro přípravu škrobového gelu,

6.11.3 Chemikálie a spotřební materiál Ethanol, Methylenová zeleň, Mléčnan hlinitý, Kyselina mléčná, Škrob pro elektroforézu, Močovina,

S3

Strana:

32/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Kyselina trichloroctová (TCA), Nigrosin rozpustný ve vodě, 2ml plastové centrifugační mikrozkumavky, Špičky pro pipety 20 – 200 µl, Destilovaná voda, pH papírky v rozsahu pH 3,4-1,9, Gumové rukavice.

6.11.4 Postup Pracovní postup se řídí ČSN 46 1085-1 (Pšenice obecná a ječmen, Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty, část 1: elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE).

6.11.4.1 Příprava roztoků Extrakční roztok: 65 % etanol (v/v), (32,5 ml 96 % etanolu se smíchá s 155 ml destilované vody a přidá se 0,2 g methylenové zeleně). Elektrodový pufr: 3 g mléčnanu hlinitého a 5,4 ml kyseliny mléčné (h=1,2 g . cm -3) se doplní do 2000 ml destilovanou vodou (pH 3,1-3,2. – zkontroluje se pH papírkem v rozsahu pH 3,4-1,9). Pufr se uchovává při teplotě 4° - 8°C. Připravujte vždy čerstvý. Gelový pufr: Z připraveného elektrodového pufru se odměří 500 ml a přidá se 0,7 ml kyseliny mléčné. Takto připravený gelový pufr se uchovává při teplotě 4° - 8°C nejdéle 1 týden. Fixační roztok: 100 g kyseliny trichloroctové se doplní vodou do 1000 ml Barvicí roztok: 0,25 g nigrosinu se rozpustí a dobře rozmíchá v 1000 ml destilované vody.

6.11.4.2 Příprava škrobového gelu a gelových sloupečků Připravte si 30 skleněných trubiček, které jsou součástí elektroforetického setu pro SGE. Fixou označte na všech trubičkách rysku ve výši 110 mm. Na konec každé skleněné trubičky (blíže k rysce) nasaďte gumovou hadičku a připravte si 30 kroužků (hadičky i kroužky jsou součást vybavení pro SGE). Navažte 9,6 g močoviny. Do skleněné baňky s kulatým dnem (250 ml) navažte 8,5 g škrobu pro elektroforézu, přidejte 80 ml gelového pufru a důkladně promíchejte. Směs škrobu a pufru zahřejte na vroucí vodní lázni na teplotu 72°-75°C (kontrolujte teploměrem), poté přidejte připravenou močovinu a dokonale rozmíchejte mimo vodní lázeň. Směs za stálého míchání ochlaďte pod tekoucí vodou na teplotu cca 55°C. Do kádinky o objemu 250 ml odlejte část gelu tak, aby se vytvořila dně cca 5mm vrstva gelu. Baňku umístěte pevně na podložku (součást setu SGE). Ponořte skleněnou trubičku volným koncem do gelu a gel nasajte ústy prostřednictvím gumové hadičky do skleněné trubičky cca 2 mm nad vyznačenou rysku. Gel v trubičce stabilizujte přehnutím gumové hadičky cca v polovině a zajistěte připraveným kroužkem. o délce cca 100 mm, která se přehne a zajistí kroužkem Sloupce gelu nechte v trubičkách ztuhnout při laboratorní teplotě po dobu 16 - 24 hodin.

6.11.4.3 Extrakce bílkovin Do stojánku si připravte 24 plastových centrifugačních zkumavek (2 ml).

S3

Strana:

33/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Ze zkoumaného vzorku (pšenice nebo ječmen) odeberte 24 zrn. Zrna postupně rozdrťte kladívkem mezi listy hladkého papíru na tvrdé podložce a drť z jednotlivých zrn vložte do připravených centrifugačních zkumavek. Do každé zkumavky přidejte 0,2 ml extrakčního roztoku, zkumavky uzavřete a protřepte na vortexu. Ponechte se stát při laboratorní teplotě 20 minut a znovu protřepte na vortexu. Uložte do chladničky. Následujícího dne bezprostředně před elektroforetickou analýzou vzorky odstřeďte stolní centrifuze po dobu 2 min.

6.11.4.4 Vlastní elektroforéza Připravte a zkontrolujte elektroforetické zařízení pro SGE. Jednotlivé trubičky s gelem postupně opatrně krouživým pohybem vyjměte z kádinky, zbytky gelu smyjte pod tekoucí studenou vodou, umístěte jednotivě do stojánku na zkumavky a sejměte kroužky i hadičky z trubiček. Vyjměte stojánek se vzorky z lednice a vzorky odstřeďte stolní centrifuze po dobu 2 min. Supernatanty (0,04 ml) naneste automatickou pipetou na povrch připravených sloupečků škrobového gelu (1vzorek/ 1 trubička) a kapalinu zasypte sypkým škrobem pomocí kovové špachtličky tak, aby na povrchu sloupce zůstala tenká vrstvička suchého škrobu. Elektrodový pufr vyndejte z lednice a nalijte po rysku do dolní elektroforetické nádoby. Skleněné trubičky se škrobovým gelem a extrakty upevněte do horní nádoby elektroforetického přístroje a sestavte přístroj. Opatrně převrstvěte škrobem zasypané extrakty ve skleněných trubičkách elektrodovým pufrem pomocí injekční stříkačky s jehlou. Doplňte elektrodovým pufrem horní elektrodovou nádobu přístroje po rysku a zakryjte víkem. Připojte přístroj ke zdroji stejnosměrného proudu a nastavte požadované proudové podmínky (1,5 mA/trubičku; 400 V) a zapněte elektroforézu. Po 20min. se přístroj vypněte, odpojte od zdroje, vyjměte horní elektrodovou nádobu a slijte pufr do připravené kádinky. Skleněné trubičky vyjměte jednotlivě do stojánku na zkumavky a nad výlevkou odstraňte zasypávací škrob z trubiček proudem destilované vody ze střičky. Trubičky upevněte do horní nádoby elektroforetického přístroje a sestavte přístroj. Gely opět převrstvěte elektrodovým pufrem pomocí injekční stříkačky, poté naplňte horní elektrodovou nádobu slitým elektrodovým pufrem a zakryjte víkem. Připojte přístroj ke zdroji stejnosměrného proudu a nastavte požadované proudové podmínky (1,5 mA / trubičku; 400 V) a zapněte elektroforézu. Zapište čas začátku elektroforetického dělení a sledujte proudové podmínky. Jakmile trakční barvivo (methylenová zeleň) dosáhne spodního okraje separačního gelu, zapište čas a vypočtěte dobu dělení „t“. Celkovou dobu dělení určíte vynásobením vypočteného času „t“ koeficientem 1,5. Po uplynutí požadované doby dělení bílkovin přístroj vypněte, odpojte od zdroje a vylijte pufr z horní elektrodové nádoby. Skleněné trubičky s gelem vyjměte jednotlivě do připraveného stojánku na zkumavky. Odstraňte pufr z dolní elektrodové nádoby. Přístroj umyjte pod tekoucí vodou, vypláchněte destilovanou vodou a vysušte.

S3

Strana:

34/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

6.11.4.5 Vizualizace bílkovinných spekter - fixování, barvení, odbarvení Používejte ochranné pracovní pomůcky – gumové rukavice, ochranné brýle! Připravte si stojánek s 24 zkumavkami (25 ml) a každou naplňte do 2/3 fixačním roztokem (10 – 20 min. před koncem elektroforetického běhu - 6.8.4.4.). Po skončení elektroforézy (6.8.4.4.) škrobové gely převedou do připravených zkumavek: hadičku gumového balonku (součást setu SGE) nasaďte na konci skleněné trubičky tam, kde byly nanášeny extrakty a gel vytěsněte mírným tlakem vzduchu do připravených skleněných zkumavek. Gely ponechte ve fixačním roztoku 60 min. Pak opatrně slijte roztok z gelů do připravené kádinky a beprostředně po slití ihned každou zkumavku naplňte barvicím roztokem. Barvěte 24 hodin. Barvicí roztok slijte a každou zkumavku hned naplňte tekoucí vodou, kterou během 3 hodin 3 krát vyměňte. Po odbarvení jsou elektroforetická spektra vzorků připravena pro hodnocení.

6.11.4.6 Hodnocení elektroforeogramů Identifikace elektroforetických gliadinových nebo hordeinových spekter se provádí porovnáním se standardními vzorovými elektroforetickými spektry jednotlivých odrůd pšenice obecné nebo ječmene. Při tom se vizuálně srovnává počet jednotlivých elektroforetických pruhů, jejich vzájemná poloha charakterizovaná relativní elektroforetickou mobilitou a intenzitou zbarvení. K eliminaci diferencí vzniklých případnými odlišnými podmínkami jednotlivých analýz lze uplatnit gliadinové referenční zóny. Při identifikaci elektroforetických spekter je vhodné vyčlenit pomocí hodnot relativní elektroforetické mobility a intenzity zbarvení alelické gliadinové nebo hordeinové bloky (včetně výše uvedených referenčních zón) a provést jejich porovnání s přehledem etalonových souborů vyčleněných alelických bloků odpovídajících konkrétním genotypům resp. odrůdy.

6.11.4.7 Vyjádření výsledků zkoušky Hodnoty se zjišťují z celkového počtu hodnotitelných elektroforeogramů, nikoliv z celkového počtu elektroforetických analýz, provedených v rámci zkoušky příslušného vzorku. Hodnotitelným se rozumí elektroforeogram s jednoznačně odečitatelnými pruhy, popř. gliadinovými nebo hordeinovými alelickými bloky. Každý platný elektroforeogram se zařadí mezi pozitivní nebo negativní výsledky zkoušky. V jednotlivých skupinách výsledků zkoušky se sečtou obilky a dále se sečte celkový počet hodnocených obilek. Tak se získá počet nežádoucích genotypů x a celkový počet zkoušených a hodnocených obilek n. ve zkoušeném vzorku. Výskyt jednotlivých genotypů identifikovaných ve zkoušené dávce se vyjadřuje v procentech.

6.11.4.8 Protokol o zkoušce Vyhodnocený vzorek je dokumentován v. elektronické verzi protokolu (Příloha č. 15) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a výsledek.

6.11.4.9 Verifikace metody Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně pomocí analýzy referenčních etalonových odrůd pšenice resp. ječmene se specifickým počtem a umístěním gliadinových resp. hordeinových složek. Jako etalony jsou používány: standardní vzorek odrůdy ozimé

S3

Strana:

35/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

pšenice Bohemia a standardní vzorek odrůdy jarního ječmene Tolar, poskytnuté Ústředním kontrolním a zkušebním ústavem zemědělským (ÚKZÚZ). Celý proces optimálního elektroforetického rozdělení gliadinů pšenice a hordeinů ječmene je prověřován samostatnou společnou analýzou 12 jednotlivých zrn standardní odrůdy pšenice Bohemia a 12 jednotlivých zrn standardní odrůdy Tolar. Jednotlivé gliadinové a hordeinové pruhy jsou charakterizovány relativní elektroforetickou mobilitou (REM), která je stanovena ve vztahu ke gliadinové zóně se standardní neměnnou REM 55,0, která je determinována lokusem Gld 1D. Referenční elektroforetické pruhy pro odrůdu pšenice Bohemia jsou gliadinové pruhy o REM 18,0 (Gld 1D); 34,0 (Gld 1B) a 88,0 (Gld 6D). Referenční elektroforetické pruhy pro odrůdu ječmene Tolar jsou hordeinové pruhy o REM 35,0 (Hrd A); 62,0 (Hrd B) a 86,0 (Hrd F). Naměřené elektroforetické mobility referenčních pruhů by měly odpovídat těmto hodnotám v rozsahu ±1 mm při přiložení rysky kalibrovaného pravítka o hodnotě 55 mm ke standardnímu pruhu REM 55 odrůdy pšenice Bohemia.

7.

STANOVENÍ GLUTENINOVÝCH ALEL METODOU SDS-PAGE

7.1

Princip metody

Gluteniny jsou zásobní bílkoviny, které mají polymerní charakter a jejich jednotlivé podjednotky jsou vázány disulfidickými vazbami, které lze účinkem redukčních činidel rozštěpit na vysokomolekulární podjednotky gluteninů (HMW-GS)* a nízkomolekulární podjednotky gluteninů (LMW-GS)*. HMW- a LMW-GS vytváří alelické kombinace, na jejichž základě mohou být odrůdy charakterizovány. Jejich výskyt je v přímé vazbě k technologické jakosti zrna pšenice, zejména k pekařské kvalitě, což je důležité pro řadu zpracovatelských technologií. Pro analýzu gluteninů se nejběžněji používá technika elektroforézy v polyakrylovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS), kdy se bílkoviny pohybují v gelu na základě rozdílné velikosti molekul. Výhodou metody SDS-PAGE je možnost charakterizace jak HMW-GS tak LMW-GS současně v jednom gelu. LMW-GS se vyskytují v úzkém spojení s gliadiny, proto musí vlastní elektroforéze předcházet speciální vícenásobná extrakce, kdy dochází k odseparování gliadinů. Předností metody je genetická interpretace získaných výsledků tj. jejich vyjádření ve formě gluteninových alelických vzorců - tzn. relativní nezávislost na případných metodických odchylkách v hodnotách relativních elektroforetických mobilit na jednotlivých gelech.

7.2

Pomůcky Přístroj pro výrobu destilované vody, Elektroforetický systém P10DS – OWL (velikost gelu 20 x 20 cm, tloušťka 1,5 mm) se zdrojem stejnosměrného proudu CONSORT E815, Elektroforetický systém Mini-PROTEAN BIO- RAD (velikost gelu 8 x 7,3 cm, tloušťka 0,75 mm) se zdrojem stejnosměrného proudu DESATRONIC 500/100, Termostat JULABO, Stolní centrifuga MPW-52, Prosvětlovací panel, Vortex genie 2, Elektromagnetická míchačka, Vodní lázeň, Ultrazvuková lázeň K-5, Laboratorní digestoř, Lednice LIEBHERR PREMIUM, pH metr, Váhy Chyo Petit Balance MK 200 B (lab. 155),

S3

Strana:

36/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Váhy Sartorius A 200 S (lab. 155), Automatické pipety 0,5-10 µl, 2-20 µl,10 - 100 µl ,20 – 200 µl, 200-1000µl, 1000-5000 µl, Teploměr (0 - 100°C), Mikrostříkačka Hamilton 0 – 50 µl, Laboratorní odměrné baňky skleněné 1000 ml, 500 ml, 200 ml, 100 ml, Odměrné válce skleněné 1000 ml, 500 ml, 200 ml, 100 ml, Injekční stříkačka s jehlou, Plastová střička 250 ml, Plastové láhve s uzávěrem na zásobní roztoky 1000 ml, 500 ml, 200 ml, 100 ml Stopky, Plastové nádoby na fixaci a barvení gelů, Kádinky, Stojánky pro 2 ml a 1,5 ml plastové centrifugační mikrozkumavky.

7.3

Chemikálie a spotřební materiál Ethanol, 1-Propanol, Tris(hydroxymethyl) aminomethan (Tris), Kyselina chlorovodíková (HCl), Dodecylsulfát sodný (SDS), Glycerol, Bromfenolová modř, 2-Mercaptoethanol, 1,4-Dithiothreitol (DTT), 4-Vinylpyridin (VP), Akrylamid (AA), Bisakrylamid (BIS), 40 % Akrylamid (AA-40) komerční roztok, 2 % Bisakryamid (BIS-2) komerční roztok, Persíran amonný (APS), TEMED (N,N,N',N' - tetramethylethylendiamin), Glycin, Kyselina trichloroctová (TCA), Kyselina octová, Glycerol, Methanol, Coomassie Brilliant Blue R-250, Špičky pro pipety 10 0,5-10 µl, 2 - 20 µl,10 - 100 µl ,20 – 200 µl, 200-1000µl, 1000-5000, 2 ml a 1,5 ml plastové centrifugační mikrozkumavky, Destilovaná voda, Gumové rukavice, Respirátory.

7.4

Pracovní postup Pracovní postup se řídí metodikou UPOV TG/3/11, 96-10-18. Používejte ochranné pracovní prostředky (gumové rukavice, respirátory, brýle).

S3

Strana:

37/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

7.4.1 Příprava zásobních roztoků pro elektroforézu Č.

Roztok

Z1

AA a BIS Gelový pufr 8,8:

Z2

0,75 M TrisHCl

Příprava 150 g akrylamidu a 4 g bisakrylamidu rozpustit ve 450 ml destilované vody a doplnit destilovanou vodou na objem 500 m

Poznámka Skladovat při laboratorní teplotě

45,5 g Tris rozpustit ve 450 ml destilované vody, kyselinou chlorovodíkovou (HCl) upravit pH na 8,8 a doplnit destilovanou vodou na objem 500 ml

Skladovat v chladničce

6,1 g Tris rozpustit ve 170 ml destilované vody, kyselinou chlorovodíkovou (HCl) upravit pH na 6,8, doplnit destilovanou vodou na objem 200 ml. Přidat špetku bromfenolové modře pro obarvení roztokul


pH 8,8 Gelový pufr 6,8: Z3

0,25 M TrisHCl pH 6,8

Z4

10% roztok SDS

5 g SDS nasypat do 50 ml odměrné baňky, doplnit destilovanou vodou po rysku a promíchat.

Skladovat při laboratorní teplotě

Z5

10% roztok APS

0,5 g APS nasypat do 5 ml odměrného válce a doplnit na objem 5 ml a skleněnou tyčinkou promíchat

Připravovat vždy čerstvý

30,3 g Tris, 144 g glycinu a 10 g SDS rozpustit v 900 ml destilované vody a doplnit destilovanou vodou na objem 1000 ml

Skladovat při laboratorní teplotě

Smíchat Z6 (Zásobní elektrodový pufr) s destilovanou vodou v poměru 1:9

Připravovat vždy čerstvý den před elektroforézou (skladovat v lednici)

Z6

Z7

Zásobní elektrodový pufr: 0,25 M Tris; 1,92 M glycin pH 8,3

Provozní pufr

Z7.1. Pro P9SD připravit 1400 ml (140 ml Z7 smíchat s 1260 ml destilované vody) Z7.2. Pro Mini-PROTEAN připravit 800 ml (80 ml Z7 smíchat se 720 ml destilované vody)

7.4.2 Příprava a nalévání gelu do gelových kazet Sestavte suché a čisté gelové kazety dle typu přístroje (P10DS nebo Mimi-PROTEAN); při montáži se řiďte přiloženými pokyny výrobce. Od horního okraje kratší skleněné desky udělejte voděodolným fixem rysku (3 cm pro P10DS, 2 cm pro Mimi-PROTEAN). Připravte si 10% dělicí gel; množství gelu se řídí typem přístroje. Pro 2 gely sestavy P10DS je potřeba 108 ml gelového roztoku (35 ml Z1, 52,5 ml Z2, 1 ml Z4, 17,5 ml destilované vody, 62,5 µl TEMED a 1 ml Z5). Pro 2 gely sestavy Mimi-PROTEAN je potřeba 24,5 ml gelového roztoku (8 ml Z1, 12 ml Z2, 240 µl Z4, 4 ml destilované vody, 14,2 µl TEMED a 240 µl Z5).

S3

Strana:

38/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Jednotlivé složky gelového roztoku přidávejte za pomalého míchání do kádinky (250 ml) v pořadí tak, jak je uvedeno v předchozím bodě (polymerace je nastartována přidáním TEMEDu a APS). Gelový roztok pečlivě nalijte do gelových kazet 1 mm nad vyznačenou rysku tak, aby se netvořily vzduchové bublinky. Povrch gelového roztoku převrstvěte opatrně destilovanou vodou pomocí injekční stříkačky s jehlou a nechte 30 minut polymerovat při laboratorní teplotě. Po skončení polymerace vodu slejte, povrch gelu osušit filtračním papírem. Nyní jsou kazety připraveny k nalití horního - zaostřovacího gelu. Připravte si 4,6% zaostřovací gel; množství gelu se řídí opět typem přístroje. Pro 2 gely sestavy P10DS je potřeba 33,4 ml gelového roztoku (5 ml Z1, 16,7 ml Z3, 330 µl Z4, 11 ml destilované vody, 13,3 µl TEMED a 330 µl Z5). Pro 2 gely sestavy Mimi-PROTEAN je potřeba 13,4 ml gelového roztoku (2 ml Z1, 6,7 ml Z3, 130 µl Z4, 4,4 ml destilované vody, 5,3 µl TEMED a 130 µl Z5). Jednotlivé složky gelového roztoku přidávejte za pomalého míchání do kádinky (100 ml) v pořadí tak, jak je uvedeno v předchozím bodě (polymerace je nastartována přidáním TEMEDu a APS). Ihned vložte hřebeny pro tvorbu jamek a ponechte polymerovat 60 min při laboratorní teplotě. Poté uložte gelové kazety s gelem do chladničky do druhého dne.

7.4.3 Příprava roztoků pro extrakci gluteninů Č.

Roztok

E1

60 % Ethanol

E2

E3

Příprava

Poznámka

60 ml 96 % ethanolu rozmíchat ve 36 ml destilované vody


50 % 1-Propanol v 0,08 M Tris-HCl pH 8,0

50 ml 1-propanolu rozmíchat v 50 ml roztoku E3


0,08 M Tris-HCl pH 8,0

4,844 g Tris rozpustit ve 450 ml destilované vody, kyselinou chlorovodíkovou (HCl) upravit pH na 8,0 a doplnit destilovanou vodou na objem 500 ml


E4

Vzorkový pufr

Smíchat 2 g SDS, 0,02 g bromfenolové modře, 40 ml glycerolu a 1 ml 2mercaptoethanolu a doplnit roztokem E3 na objem 100 ml


E5

Roztok E2 + DTT

40 mg DTT smíchat se 4 ml roztoku E2


E6

Roztok E2 + VP

60 µl VP smíchat se 4 ml roztoku E2


Extrační roztok

Smíchat 30 ml roztoku Z2, 24 ml roztoku Z4, 12 ml glycerolu, 6 ml 2-mercaptoethanolu a 48 ml destilované vody

Skladovat v digestoři

E7

pouze pro HMWGS

S3

Strana:

39/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

7.4.4 Extrakce gluteninů

7.4.4.1

Extrakční postup pro analýzu LMW-GS a HMW-GS

Připravte si stojánek s příslušným počtem 2ml centrifugačních mikrozkumavek, řiďte se podle počtu jamek v gelu (součástí elektroforetického setu jsou hřebeny s 15 resp. 20 zuby pro tvorbu jamek). Z každého zkoumaného vzorku pšenice odeberte 2 zrna. Zrna postupně rozdrťte kladívkem mezi listy hladkého papíru na tvrdé podložce a drť z jednotlivých zrn vložte do připravených centrifugačních zkumavek. Přidejte 0,5 ml extrakčního roztoku E1 do každé mikrozkumavky, protřepte na vortexu a nechte stát ve tmě při laboratorní teplotě do druhého dne. Vložte na 10 min do ultrazvukové lázně a poté 30 min inkubujte ve vodní lázni při 65C. Centrifugujte 5 min na stolní centrifuze a poté supernatanty odstraňte. Do každé mikrozkumavky přidejte k pevným zbytkům (peletám) 0,5 ml extrakčního roztoku E1, dobře promíchejte jehlou a krátce protřepte na vortexu. Vložte na 10 min do ultrazvukové lázně a poté 30 min inkubujte ve vodní lázni při 65C. Centrifugujte 5 min na stolní centrifuze a poté supernatanty odstraňte. Do každé mikrozkumavky přidejte k pevným zbytkům (peletám) 0,5 ml extrakčního roztoku E1, dobře promíchejte jehlou a krátce protřepte na vortexu. Vložte na 10 min do ultrazvukové lázně a poté 30 min inkubujte ve vodní lázni při 65C. Centrifugujte 5 min na stolní centrifuze a poté supernatanty odstraňte. V digestoři přidejte do každé mikrozkumavky 100 l roztoku E5 (E2 + DTT), pelety dobře promíchejte jehlou a krátce protřepte na vortexu. Vložte na 10 min do ultrazvukové lázně a poté 30 min inkubujte ve vodní lázni při 65C. V digestoři přidejte do každé mikrozkumavky 100 l roztoku E6 (E2 + VP) a krátce protřepte na vortexu. Inkubujte 15 min ve vodní lázni při 65C a 3 min centrifugujte na stolní centrifuze. Z každé mikrozkumavky odpipetujte 100 l extraktu a přeneste do nových 1,5 ml mikrozkumavek, které jste si předem připravili do stojánku. Do každé mikrozkumavky přidejte 100 l vzorkového pufru E4. Inkubujte 15 min ve vodní lázni při 65C a 3 min centrifugujte na stolní centrifuze. Získané extrakty jsou připraveny pro elektroforézu. Připravené extrakty je možno uchvávat v ledničce po dobu 1 měsíce. Poznámka: LMW-GS společně s HMW-GS lze analyzovat pouze pomocí elektroforetického systému P10DS.

7.4.4.2

Zjednodušený extrakční postup pro analýzu HMW-GS

Připravte si stojánek s příslušným počtem 2 ml centrifugačních mikrozkumavek, řiďte se podle počtu jamek v gelu. Z každého zkoumaného vzorku pšenice odeberte 2 zrna. Zrna postupně rozdrťte kladívkem mezi listy hladkého papíru na tvrdé podložce a drť z jednotlivých zrn vložte do připravených centrifugačních zkumavek. Do každé mikrozkumavky přidejte 0,3 ml extrakčního roztoku E7 a protřepte na vortexu.

S3

Strana:

40/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Ponechte 2 hodiny stát při laboratorní teplotě a poté zahřejte 2 minuty na vroucí vodní lázni. Po vychladnutí centrifugujte mikrozkumavky 4 min. a supernatanty převeďte do připravených nových 1,5 ml mikrozkumavek. Získané extrakty jsou připraveny pro elektroforézu. Připravené extrakty je možno uchvávat v ledničce po dobu 1 měsíce. Poznámka: HMW-GS lze analyzovat jak pomocí elektroforetického systému P10DS – velikost gelu, tak pomocí elektroforetického systému Mini – PROTEAN (úspora chemikálií)

7.4.5 Vlastní elektroforéza Připravte a zkontrolujte elektroforetické zařízení, které budete používat pro SDS-PAGE. V případě použití P10DS nastavte chladicí zařízení (termostat JULABO je připojený na pevno k elelektroforetrické jednotce P10DS) na 10°C a nechte temperovat. V případě použití elektroforetického zařízení Mini – PROTEAN chlazení odpadá. Vyjměte z lednice připravené gelové kazety a provozní pufr Z7 (Z7.1. pro P10DS; Z7.2. pro Mini-PROTEAN). Opatrně vyjměte z gelu hřebeny, pomocí injekční stříkačky s jehlou promyje na výlevkou jamky v gelu provozním pufrem Z7. Kazety s gelem nainstalujte do příslušné elektroforetické jednotky dle pokynů výrobce. Jamky v gelu společně s celou horní elektrodovou nádobou naplňte provozním pufrem. Vyjměte z lednice připavené extrakty analyzovaných vzorků a aplikujte do gelových jamek. Množství nanášeného extraktu mikrostříkačkou Hamilton do každé gelové jamky záleží na typu přístroje: v případě P10DS se nanáší 15 µl; v případě Mini-PROTEAN se nanáší 5 µl. Naplňte dolní elektrodovou nádobu provozním pufrem Z7 po rysku a uzavřete víkem. Připojte přístroj k příslušnému zdroji stejnosměrného proudu a nastavte požadované proudové podmínky: a) P10DS - CONSORT E815:  Zapněte zdroj stejnosměrného proudu do trvale naprogramovaného režimu Prog P5-1 (60 mA, 600 V, 300 W, 30 min.), po uplynutí 30 min. zařízení automaticky vypne,  přepněte zdroj do trvale naprogramovaného režimu Prog P6-1 (80 mA, 600 V, 300 W) a uveďte zařízení do chodu,  zapište čas začátku elektroforetického dělení a sledujte proudové podmínky.  jakmile trakční barvivo dosáhne spodního okraje separačního gelu, doba dělení se prodlouží o 30 minut,  elektroforetické dělení ukončete vypnutím zdroje stejnosměrného proudu a odpojte elektroforetrickou jednotku,  elektroforetické dělení trvá cca 6 hodin, podle toho je nutno plánovat začátek pokusu, b) Mini – PROTEAN - DESATRONIC 500/100:  Nastavte na zdroji stejnosměrného proudu proudové podmínky 20 mA, 200 V a uveďte zařízení do chodu,  zapište čas začátku elektroforetického dělení a sledujte proudové podmínky,  jakmile trakční barvivo (Bromfenolová modř) dosáhne spodního okraje separačního gelu, zapište čas a vypočtěte dobu dělení „t“,  celkovou dobu dělení určíte vynásobením vypočteného času „t“ koeficientem 1,5. Vypněte elektroforetické zařízení, odpojte elektroforetickou jednotku od zdroje, odkryjte víko, vylejte pufr a dle návodu vyjměte kazety s gelem.

S3

Strana:

41/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Elektroforetickou jednotku vymyjte destilovanou vodou a vysušte.

7.4.6 Vizualizace bílkovinných spekter

7.4.6.1

Příprava roztoků pro fixaci bílkovin, barvení a sušení gelů

Č.

Roztok * Fixační činidlo:

Příprava

Poznámka

200 g kyseliny ¨trichloroctové rozpustit v 900 ml destilované vody a doplnit destilovanou vodou na objem 1000 ml

Skladovat za lab. teploty

Směsný roztok

Smíchat 650 destilované vody s 250 ml methanolu a 100 ml kyseliny octové


B1

Barvicí roztok

Rozpustit 0,25 g Commassie Brilliant Blue R 250 v 500 ml směsného roztoku S1


G1

2 % roztok glycerolu

F1

20 % Kyselina trichloroctová

S1

Smíhat 20 ml glycerolu s 980 ml destilované vody


* uvedené roztoky možno použít opakovaně (max. 10x)

7.4.6.2

Fixace bílkovin, barvení gelů

V průběhu dělení si připravte dvě skleněné či plastové průhledné nádoby (velikost dle rozměrů gelu) a do každé nádoby nalijte do poloviny roztok F1. Z gelových kazet dle pokynů výrobce vyjměte skleněné desky s gelem, odstraňte plastové spacery, pomocí plastové špachtle oddělte od gelu jednu skleněnou desku, pomocí téže špachtle sesuňte gel do připravené nádoby s roztokem F1 a fixujte 60 min. Poté slijte roztok F1 a gely přelijte směsným roztokem S1. Po 30 min. odstraňte roztok S1 a přelijte gely barvicím roztokem B1 a barvěte do druhého dne. Druhý den odstaňte roztok B1 a odbarvujte 60 min. v roztoku S1 a poté v destilované vodě 2 hodiny. Poté lze gely hodnotit na prosvětlovacím panelu.

7.4.6.3

Sušení gelů

Připravte si pro každý gel skleněnou desku (rozměry desky musí být větší než velikost výsledného gelu). Připravte si pro každý gel dva obdélníky z celofánu (rozměry prvního obdélníku se rovnají rozměrům skleněné desky; (strany druhého obdélníku jsou cca o 2 cm delší než strany skleněné desky). Připravený celofán a gel ponořte do nádob (viz 6.9.4.6.2.) s roztokem G1. Po 2 hodinách ozprostřete na skleněnou desku 1. celofánový obdélník, položte na něj gel, přikryjte 2. celofánovým obdélníkem a okraje celofánu přehněte pod skleněnou desku. Sušte při laboratorní teplotě v dostatečné vzdálenosti od zdrojů tepla a světla. Usušené gely archivujte.

7.5

Vyhodnocení elektroforeogramů

Vyhodnocení získaných elektroforeogramů a identifikaci LMW- a HMW- GS alel se provádí na základě porovnání s etalonovými vzorky se známým složením. Vyhodnocený vzorek

S3

Strana:

42/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

je dokumentován v. elektronické verzi protokolu Příloha č. 14) zahrnující identifikaci vzorku, termín stanovení a výsledek. Verifikace metody probíhá minimálně jednou ročně pomocí analýzy referenčních etalonových odrůd pšenice.

7.6

Verifikace metody

Proces elektroforetického dělení gluteninů pšenice je standardně ověřován pokaždé v rámci jednotlivých elektroforetických standardních etalonových odrůd pšenice s různou skladbou gluteninových alel. Jako etalony jsou používány standardní vzorky odrůd ozimé pšenice Globus a jarní pšenice Saxana, poskytnuté Ústředním kontrolním a zkušebním ústavem zemědělským (ÚKZÚZ). Celý proces optimálního dělení gluteninů pšenice prověřován zařazením příslušně upravených (dané metodou) jednotlivých zrn standardních odrůd pšenice do každé gelové desky každého elektroforetického běhu. Odrůda pšenice Globus má deklarovanou skladbu gluteninových alel Glu A1a (1), Glu B1d(6+8), Glu D1a(2+12) a Glu A3d, Glu B3g, Glu D3c. Odrůda Saxana má deklarovanou skladbu gluteninových alel Glu A1a (1), Glu B1c(7+9), Glu D1d(5+10) a Glu A3a, Glu B3b, Glu D3b. Pokud by se alelická sestava u standardních odrůd lišila od deklarovaných údajů, je nutno elektroforézu zopakovat

8.

LABORATORNÍ ANALÝZY DLE JEDNOTLIVÝCH PLODIN

8.1

Pšenice (Triticum sp.)

8.1.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu pšenic Genové banky VÚRV. Za pšenici se považují zralé obilky pšenice (Triticum spp.), a to ozimých i jarních forem pšenice seté (Triticum aestivum L.), pšenice jednozrnky (Triticum monococcum L.), dvouzrnky (Triticum dicoccon Schrank), pšenice tvrdé (Triticum durum Desf.) a pšenice špaldy (Triticum spelta L.).

8.1.1 Seznam analýz Stanovení vody – ČSN 56 0512 – 7, nebo metodou FT-NIR Spektroskopie. Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983 - 1, nebo metodou FT-NIR spektroskopie. Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu - ICC No. 155. Stanovení sedimentačního indexu – Zelenyho test ČSN - ISO 5529. Stanovení čísla poklesu podle Perten-Hagberga - ČSN EN ISO 3093. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 nebo metodou FT-NIR Spektroskopie. Stanovení relativní tvrdosti zrna – PSI (AACC 55-30, r. 2000), nebo metodou FT-NIR Spektroskopie. Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA. Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA. Elektroforéza zásobních bílkovin pšenice a ječmene ve škrobovém gelu (SGE) - stanovení odrůdové pravosti a jednotnosti. Stanovení gluteninových alel metodou SDS-PAGE.

S3

Strana:

43/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů, např. ve ve formě screeningových analýz s využitím FT-NIR spektroskopie. Stanovení čísla poklesu je prováděno pouze namátkově u vybraných kontrolních vzorků.

8.2

Ječmen (Hordeum vulgare L.)

8.2.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu ječmene Genové banky VÚRV. Za ječmen se považují zralé obilky ječmene (Hordeum vulgare L.) a to jeho ozimých i jarních forem.

8.2.2 Seznam analýz Stanovení vody – ČSN 56 0512 – 7, nebo metodou FT-NIR Spektroskopie.. Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983 - 1, nebo metodou FT-NIR spektroskopie. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 nebo metodou FT-NIR Spektroskopie. Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA Elektroforéza zásobních bílkovin pšenice a ječmene ve škrobovém gelu (SGE) - stanovení odrůdové pravosti a jednotnosti Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů.

8.3

Tritikále (Triticosecale Witt. )

8.3.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu Tritikále Genové banky VÚRV. Za tritikále se považují zralé obilky tritikále (Triticosecale Witt.) a to jeho ozimé i jarní formy.

8.3.2 Seznam analýz Stanovení vody – podle ČSN 56 0512 – 7. Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983 - 1, nebo metodou FT-NIR spektroskopie. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 nebo metodou FT-NIR Spektroskopie. Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů.

8.4

S3

Strana:

44/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Pohanka setá (Fagopyrum esculentum Moench.)

8.4.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu pohanky seté Genové Banky VÚRV. Za pohanku setou se považují zralé nažky pohanky seté (Fagopyrum esculentum Moench.).

8.4.2 Seznam analýz Stanovení vody – podle ČSN 56 0512 – 7. Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983 - 1, nebo metodou FT-NIR spektroskopie. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů.

8.5

Pohanka tatarská (Fagopyrum tataricum L.)

8.5.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu pohanky tatarské Genové banky VÚRV. Za pohanku tatarskou se považují zralé nažky pohanky tatarské (Fagopyrum tataricum L.).


8.6

Proso seté (Panicum miliaceum L.)

8.6.1 15.1. Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu prosa setého Genové banky VÚRV. Za proso seté se považují zralé obilky prosa setého (Panicum miliaceum L.).

S3

Strana:

45/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

8.6.2 15.2. Seznam analýz Stanovení vody – podle ČSN 56 0512 – 7. Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983 - 1, nebo metodou FT-NIR spektroskopie. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů.

8.7

Amarantus (Amaranthus sp.)

8.7.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu amarantu Genové banky VÚRV. Za amarantus se považují zralé obilky amarantu (Amaranthus spp.).


8.8

Čirok (Sorghum sp.)

8.8.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu čiroku Genové banky VÚRV. Za čirok se považují zralé obilky čiroku zrnového (Sorghum bicolor var. eusorghum), čiroku cukrového (Sorghum saccharatum var. saccharatum), čiroku technického (Sorghum saccharatum var. technicum) a sudánské trávy (Sorghum sudanense).

8.8.2 Seznam analýz Stanovení vody – podle ČSN 56 0512 – 7 Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů.

S3

Strana:

46/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Bér (Setaria P. Beauv)

8.9

8.9.1 Základní ustanovení Tento pracovní postup stanoví analýzy prováděné na sortimentu béru Genové banky VÚRV. Za bér se považují zralé obilky béru vlašského (Setaria italica), čumízy (Setaria italica subsp. maxima) a moháru (Setaria italica subsp. moharia).

8.9.2 Seznam analýz Stanovení vody – podle ČSN 56 0512 – 7. Stanovení obsahu dusíku – ČSN EN ISO 5983. Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda - ČSN EN ISO 10520 Stanovení obsahu deoxynivalenolu metodou ELISA Stanovení obsahu zearalenonu metodou ELISA Poznámka: Seznam analýz může být rozšířen o skupinu experimentálních metod specifikovanou v projektových metodikách příslušných vědeckých úkolů.

9.

ARCHIVACE A PŘEDÁVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Vypracované Protokoly z hodnocení vzorků GZ jsou uchovávány v elektronické podobě na laboratorním síťovém disku serveru výzkumného týmu GB i v papírové verzi v šanonu příslušné analýzy a uloženy v laboratoři č. 23 výzkumného týmu GB a č. 154 HB, 155 HB a 156 HB. Přístup k datům a jejich editaci či opravy mají pouze pracovníci laboratoře výzkumného týmu GB a KRP. Finální výsledky analyzovaných GZ jsou průběžně doplňovány do protokolu Finální výsledky laboratorních analýz GZ (Příloha č. 16) umístěným na síťovém disku oddělení výzkumného týmu GB s přístupem všem řešitelům plodinových kolekcí. Předávání výsledků průběžně zajišťuje vedoucí laboratoře nebo jím pověřený pracovník laboratoře.

10.

PRAVIDELNÝ SERVIS A ÚDRŽBA

Pravidelný servis a údržba zařízení zahrnuje plánované jednoroční preventivní servisní (popřípadě i validační) prohlídky následujících složitějších zařízení: Falling number 1400, Glutomatic 2200, Nicolet Antaris NIR II, Chladící technologie 1.6 kW- teplotní čidlo, Demineralizátor vody DEMOS, Analyzátor dusíku automatický, Viskozimetr. Každoročně je vypracován interní laboratorní plán údržby, který je umístěn na síťovém disku laboratoře a je veden i v tištěné podobě. Do tištěné verze plánu údržby jsou přikládány i další (neperiodické) záznamy provedených oprav a údržby zařízení. Tyto údaje jsou v případě měřidel a přístrojů označených jako PMN zaznamenány v příslušné evidenční kartě měřidel.

11.

S3

Strana:

47/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

SOUVISEJÍCÍ DOKUMENTACE

Příručka kvality Ř 01 Vnitřní řád S 1 Činnost genové banky S 2 Polní pokusy s genetickými zdroji a související činnosti PP 1 Kalibrační postupy Výzkumných týmů KRP a GB Rámcová metodika Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a agro – biodiverzity ČSN EN ISO 9001:2009 Systémy managementu kvality - Požadavky ČSN 56 0512 – 7 Metoda zkoušení mlýnských výrobků. Část 7: Stanovení vody ČSN EN ISO 5983 – 1 Stanovení obsahu dusíku – Kjeldahlova metoda ČSN EN ISO 10520 Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda ČSN EN ISO 3093 Pšenice, žito a pšeničná a žitná mouka, pšenice tvrdá (durum) a semolina z pšenice tvrdé – Stanovení čísla poklesu podle Hagberga-Pertena ČSN EN ISO 5529

Pšenice - Stanovení sedimentačního indexu - Zelenyho test

ČSN 46 1081 (1998:): 1. Pšenice obecná a ječmen. Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty, část 1: Elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu (SGE). TG/3/11, 96 -10-18, (1996): Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability. Wheat. (Aditional usefull explanation). ICC standard No. 155: Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu AACC 55-30 Metodika z roku r 2000 - Stanovení relativní tvrdosti zrna (Particle size index) 09-09-14 RIDASCREEN® FAST DON Instructions, R-Biopharm 09-08-26 RIDASCREEN® FAST Zearalenon Instructions, R-Biopharm

12.

PŘÍLOHY

Příloha č. 1 - Přijímací protokol vzorků Příloha č. 2 – Evidenční protokol uchování vzorků Příloha č. 3 – Mlecí protokol Příloha č. 4 – Stanovení obsahu vody a sušiny Příloha č. 5 – Stanovení obsahu dusíku dle Kjeldahla Příloha č. 6 – Stanovení sedimentačního indexu Příloha č. 7 - Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro sedimentační index Příloha č. 8 – Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu Příloha č. 9 – Stanovení čísla poklesu Příloha č. 10 – Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro číslo poklesu Příloha č. 11 – Stanovení obsahu sušiny, NL a škrobu pomocí FT-NIRS Příloha č. 12 – Stanovení obsahu deoxynivalenolu (DON) Příloha č. 13 – Stanovení obsahu zearalenonu (ZEA) Příloha č. 14 – Stanovení alelické skladby HMW a LMW-gluteninů (SDS-PAGE) Příloha č. 15 – SGE Stanovení alelické skladby gliadinů (SGE) Příloha č. 16 – Finální výsledky laboratorních analýz GZ

S3

Strana:

48/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 17 – Provozní řád laboratoře výzkumného týmu KRP Příloha č. 18 – Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda Příloha č. 19 – Stanovení relativní tvrdosti zrna (PSI)

S3

Strana:

49/ 68


Vydání:

4

Příloha č. 1 - Přijímací protokol vzorků

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

S3

Strana:

50/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 2 – Evidenční protokol uchování vzorků

S3

Strana:

51/ 68


Vydání:

4

Příloha č. 3 – Mlecí protokol

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

S3

Strana:

52/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 4 – Stanovení obsahu vody a sušiny

S3

Strana:

53/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 5 – Stanovení obsahu dusíku dle Kjeldahla

S3

Strana:

54/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 6 – Stanovení sedimentačního indexu

S3

Strana:

55/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 7 - Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro sedimentační index Obsah vody zkušebního vzorku [%]

[g]

Obsah vody zkušebního vzorku [%]

[g]


[g]


0,00

2,75

0,10

2,75

4,60

2,88

4,70

2,89

9,20

3,03

13,80

3,19

9,30

3,03

13,90

0,20

2,76

4,80

3,20

2,89

9,40

3,04

14,00

3,20

0,30

2,76

0,40

2,76

4,90

2,89

9,50

3,04

14,10

3,20

5,00

2,90

9,60

3,04

14,20

0,50

3,21

2,77

5,10

2,90

9,70

3,05

14,30

3,21

0,60

2,77

5,20

2,90

9,80

3,05

14,40

3,21

0,70

2,77

5,30

2,91

9,90

3,05

14,50

3,22

0,80

2,77

5,40

2,91

10,00

3,06

14,60

3,22

0,90

2,78

5,50

2,91

10,10

3,06

14,70

3,23

1,00

2,78

5,60

2,92

10,20

3,06

14,80

3,23

1,10

2,78

5,70

2,92

10,30

3,07

14,90

3,23

1,20

2,79

5,80

2,92

10,40

3,07

15,00

3,24

1,30

2,79

5,90

2,92

10,50

3,07

15,10

3,24

1,40

2,79

6,00

2,93

10,60

3,08

15,20

3,25

1,50

2,79

6,10

2,93

10,70

3,08

15,30

3,25

1,60

2,80

6,20

2,93

10,80

3,09

15,40

3,25

1,70

2,80

6,30

2,94

10,90

3,09

15,50

3,26

1,80

2,80

6,40

2,94

11,00

3,09

15,60

3,26

1,90

2,81

6,50

2,94

11,10

3,10

15,70

3,26

2,00

2,81

6,60

2,95

11,20

3,10

15,80

3,27

2,10

2,81

6,70

2,95

11,30

3,10

15,90

3,27

2,20

2,81

6,80

2,95

11,40

3,11

16,00

3,28

2,30

2,82

6,90

2,96

11,50

3,11

16,10

3,28

2,40

2,82

7,00

2,96

11,60

3,11

16,20

3,28

2,50

2,82

7,10

2,96

11,70

3,12

16,30

3,29

2,60

2,83

7,20

2,97

11,80

3,12

16,40

3,29

2,70

2,83

7,30

2,97

11,90

3,12

16,50

3,30

2,80

2,83

7,40

2,97

12,00

3,13

16,60

3,30

2,90

2,83

7,50

2,96

12,10

3,13

16,70

3,30

3,00

2,84

7,60

2,98

12,20

3,13

16,80

3,31

3,10

2,84

7,70

2,98

12,30

3,14

16,90

3,31

3,20

2,84

7,80

2,98

12,40

3,14

17,00

3,32

3,30

2,85

7,90

2,99

12,50

3,15

17,10

3,32

3,40

2,85

8,00

2,99

12,60

3,15

17,20

3,32

3,50

2,85

8,10

2,99

12,70

3,15

17,30

3,33

3,60

2,85

8,20

3,00

12,80

3,16

17,40

3,33

3,70

2,86

8,30

3,00

12,90

3,16

3,80

2,86

8,40

3,00

13,00

3,16

3,90

2,86

8,50

3,01

13,10

3,17

4,00

2,87

8,60

3,01

13,20

3,17

4,10

2,87

8,70

3,01

13,30

3,17

4,20

2,87

8,80

3,02

13,40

3,18

4,30

2,88

8,90

3,02

13,50

3,18

4,40

2,88

9,00

3,02

13,60

3,19

4,50

2,88

9,10

3,03

13,70

3,19

Navážka

Navážka

Navážka

Navážka [g]

S3

Strana:

56/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 8 – Stanovení obsahu mokrého lepku a lepkového indexu

S3

Strana:

57/ 68


Vydání:

4

Příloha č. 9 – Stanovení čísla poklesu

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

S3

Strana:

58/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 10 – Přepočítávací tabulka na korekci navážky pro číslo poklesu Obsah vody zkušebního vzorku [%]

Navážka pro 15 % obsah vody při základu 7 g

9,00 9,20 9,40 9,60 9,80 10,00 10,20 10,40 10,60 10,80 11,00 11,20 11,40 11,60 11,80 12,00 12,20 12,40 12,60 12,80 13,00 13,20 13,40 13,60 13,80 14,00 14,20 14,40 14,60 14,80 15,00 15,20 15,40 15,60 15,80 16,00 16,20 16,40 16,60 16,80 17,00 17,20 17,40 17,60 17,80 18,00

6,40 6,45 6,45 6,45 6,50 6,50 6,55 6,55 6,55 6,60 6,60 6,60 6,65 6,65 6,70 6,70 6,70 6,75 6,75 6,80 6,80 6,80 6,85 6,85 6,90 6,90 6,90 6,95 6,95 7,00 7,00 7,00 7,05 7,05 7,10 7,10 7,15 7,15 7,15 7,20 7,20 7,25 7,25 7,30 7,30 7,30

S3

Strana:

59/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 11 – Stanovení obsahu sušiny, NL a škrobu pomocí FT-NIRS

S3

Strana:

60/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 12 – Stanovení obsahu deoxynivalenolu (DON)

S3

Strana:

61/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 13 – Stanovení obsahu zearalenonu (ZEA)

S3

Strana:

62/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 14 – Stanovení alelické skladby HMW a LMW-gluteninů (SDS-PAGE)

S3

Strana:

63/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 15 – SGE Stanovení alelické skladby gliadinů (SGE)

S3

Strana:

64/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 16 – Finální výsledky laboratorních analýz GZ

S3

Strana:

65/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 17 – Provozní řád laboratoře výzkumného týmu KRP Základní údaje a﴿ Název pracoviště: Laboratoř výzkumného týmu KRP b) Název provozovatele: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. c﴿ Adresa zařízení: VÚRV v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně, 161 06 c﴿ Vedoucí laboratoře: Ing. Václav Dvořáček, Ph.D. d﴿ Kontakt: tel.: 233 022 418, fax 233 022 286, e-mail: [email protected] e) Provozní řád laboratoře výzkumného týmu KRP je k dispozici v laboratoři. Popis laboratoře a) Laboratoř týmu KRP tvoří dvě pracoviště, umístěná v prostorách genové banky a v hlavní budově VÚRV. Předmětem zájmu pracoviště jsou jakostní a genetické analýzy rostlinného materiálu. b) Laboratoř umístěná v genové bance je tvořena 4 místnostmi o celkové ploše cca 84 m2 1. Biochemická a molekulární laboratoř (místnost č. 22) zaměřená na genetické a molekulární analýzy kulturních plodin. 2. Přípravna a rozborovna vzorků (místnost č. 23, laboratoř 2) pro přípravu a zpracování vzorků k následným analýzám 3. Technologická laboratoř (místnost č. 23, laboratoř 1) zaměřená na chemickotechnologické analýzy rostlinného materiálu 4. Příruční sklad vzorků (místnost č. 23) c) Laboratoř umístěná v HB je tvořena 4 místnostmi 1. Chemická laboratoř č. 154 zaměřená na analýzy mykotoxinů a dalších přírodních látek 2. Laboratoř elektroforézy č. 155 zaměřená na elektroforetické analýzy proteinů v polyakrylamidovém gelu 3. Laboratoř určování pravosti odrůd č. 156 zaměřená na elektroforetické analýzy ve škrobovém gelu za účelem určování odrůd 4. Příruční sklad a mlýnice č. 158a pro skladování a přípravu vzorků d) Pracovní místnosti jsou vybaveny laboratorním nábytkem, laboratorními přístroji a pomůckami podle provozních požadavků místnosti. V laboratořích jsou k dispozici ochranné pracovní pomůcky (latexové rukavice, roušky, ochranné brýle, obličejový štít). V chodbě místnosti č. 23 je na zdi zavěšena přenosná lékárnička. Příruční lékárna a oční sprcha je uložena přímo v technologické laboratoři, místnost č. 23 GB, č. 156 HB. Havarijní sprcha není k dispozici. V laboratoři č. 154 HB se pracuje se stlačeným dusíkem. Lihové kahany jsou využívány pouze v digestoři laboratoře biochemické a molekulární, místnost č. 22 a v laboratořích 155 a 156 HB.

S3

Strana:

66/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

e) Chemikálie jsou uloženy k tomu určených bezpečnostních skříních. Bezpečnostní listy k jednotlivým chemikáliím jsou k dispozici v technologické laboratoři, místnost 23, bezpečnostní listy k chemikáliím používaným v laboratořích HB jsou uloženy v laboratoři č. 155. Chemikálie jsou skladovány v originálních obalech s původním značením. Zásobní roztoky jsou značeny lihofixem, případně štítky. f)

Sortiment chemikálií používaných v laboratoři zahrnuje jak běžné laboratorní chemikálie (NaCl, NaOH, KOH, H2SO4, CuSO4, ethanol, kyselina mléčná apod.) tak nebezpečné (toxické) chemikálie (methanol, toluen, polyakrylamid, 2-chloroethanol, 2-mercaptoetanol) podléhajících evidenci.

g) V laboratoři pracuje pravidelně 8 zaměstnanců. S vědomím ved. laboratoře mohou v laboratoři pracovat i další pracovníci oddělení výzkumného týmu KRP h) Pracovní a sociální zázemí pro pracovníky (kanceláře, šatna, koupelna a WC) se nachází v téže budově genové banky vzdálené cca 20 - 30 m od laboratoře; pro laboratoře v hlavní budově se nachází na téže chodbě ve vzdálenosti max. 20 m od laboratoří. i)

Úklid podlahy a umyvadel provádí uklízečka po ukončení pracovní doby. Úklid povrchů stolů a přístrojů si zajišťuje každý pracovník sám.

j)

Ostatní tříděný odpad vynáší uklízečka 1x denně do kontejneru. Nebezpečný odpad je skladován separátně v prostoru (skříni), k tomuto účelu určeném a odvážen smluvní firmou ve vyhlášených termínech odvozu nebezpečného odpadu.

k) V laboratořích platí Požární poplachová směrnice VÚRV, v.v.i i pravidla pro práci s nebezpečnými látkami a hořlavinami. Jejich znění je k nahlédnutí v obou laboratořích výzkumného týmu KRP, biochemické a molekulární (místnost č. 22) tak i technologické (místnost č. 23) a v laboratoři určování pravosti odrůd (místnost č. 156 HB) l)

Vstup do laboratoře je povolen pouze pracovníkům laboratoře, případně osobám s pověřením vedoucího laboratoře.

Povinnosti pracovníků laboratoře a) Dodržovat všechny bezpečnostní a hygienické předpisy vyplývající z pracovní činnosti. b) Po skončení práce vypnout všechny elektrické přístroje a uzavřít přívod plynu a zajistit vstupy do laboratoře. V laboratoři neprovádět práce, které tam nepřísluší

S3

Strana:

67/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 18 - Stanovení obsahu škrobu – Ewersova polarimetrická metoda

S3

Strana:

68/ 68


Vydání:

4

Počet příloh:

19

Účinnost od:

01.09.2014

Příloha č. 19 - Stanovení relativní tvrdosti zrna (PSI)

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Výzkumný tým Kvalita rostlinných produktů (KRP)

Recommend Documents