VYUŽITÍ KMENOVÝCH BUNĚK K LÉČBĚ PORANĚNÉ RŮSTOVÉ PLOTÉNKY Experimentální studie

KLINIKA DĚTSKÉ CHIRURGIE, ORTOPEDIE A TRAUMATOLOGIE LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY

DISERTAČNÍ PRÁCE

Podpořeno grantovým úkolem IGA MZ ČR Registrační číslo: NR/8483-2

Název projektu:

VYUŽITÍ KMENOVÝCH BUNĚK K LÉČBĚ PORANĚNÉ RŮSTOVÉ PLOTÉNKY Experimentální studie

Řešitel:

MUDr. Ladislav Plánka

Školitel:

Prof. MUDr. Petr Gál, Ph.D.

Doba studia:

2002–2007 1

Obsah

Obsah ..............................................................................................................................2 Předmluva .......................................................................................................................3 Úvod................................................................................................................................4 Cíl studie........................................................................................................................16 Teoretický úvod a experimentální východiska ...............................................................18 Materiál a metodika.......................................................................................................21 Statistické hodnocení ....................................................................................................33

VÝSLEDKY ..................................................................................................................38 Skupina A – Prevence vzniku kostního můstku – autologní transplantace ....................38 Skupina B – Léčba kostního můstku – autologní transplantace ....................................43 Skupina C – Prevence vzniku kostního můstku – allogenní transplantace ....................47 Skupina D – Léčba kostního můstku – allogenní transplantace ....................................52

Statistické shrnutí .........................................................................................................58 Diskuse..........................................................................................................................61 Závěr .............................................................................................................................67 Literatura ......................................................................................................................69 Seznam vyobrazení........................................................................................................84 Příloha 1 ........................................................................................................................88 Příloha 2 ........................................................................................................................91

2

Předmluva

Řešení předkládané experimentální studie úzce navazuje na předchozí projekty Kliniky dětské chirurgie, ortopedie a traumatologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. V těchto projektech se autoři pokusili o důkladnou analýzu vzniku a chování kostního můstku, který je závažným problémem dětské skeletální traumatologie, stejně tak jako traumatologie veterinární. Na experimentálních zvířatech byly vytvořeny modelové situace kostních poranění a hledaly se moderní možnosti prevence a léčby kostního můstku implantací autologních chondrocytů. Předkládaná disertační práce podává ucelenou informaci o další fázi výzkumu, kdy byly autologní chondrocytární grafty nahrazeny mezenchymovými kmenovými buňkami. Komplexní experimentální studie byla, podobně jako ty předchozí, značně časově i technicky náročná. V jejím průběhu bylo provedeno 150 operačních výkonů v celkové anestezii, experimentální zvířata absolvovala stovky zobrazovacích vyšetření a po jejich utracení navázala velmi podrobná morfometrická měření, histologická vyšetření, radiografické analýzy a statistická hodnocení. Poděkování autora patří všem spolupracovníkům, především pak Prof. MVDr. Aloisi Nečasovi, Ph.D., dále Ústavu živočišné fyziologie a genetiky Akademie věd v Liběchově za poskytnutí prostorového i odborného zázemí cytologické laboratoře, operačního sálu a chovu zvířat. Dík patří rovněž všem ostatním nejmenovaným osobám za kontinuální nebo nárazovou spolupráci. Hlavní dík patří mému školiteli, Prof. MUDr. Petru Gálovi, Ph.D., za citlivé a profesionální odborné vedení, za dodávání optimismu ve chvílích badatelské krize, za podněcování touhy po nových objevech a za přátelskou atmosféru v průběhu celého mého postgraduálního studia.

Ladislav Plánka, Brno, 15. 1. 2007

3

Úvod

Traumatologie je v současné době velmi dynamicky se rozvíjející chirurgický obor humánní i veterinární medicíny. Podle zákona č. 95/2004 Sb., o podmínkách získávání a uznávání odborné způsobilosti a specializované způsobilosti k výkonu zdravotnického povolání lékaře, zubního lékaře a farmaceuta, stojí již jako samostatný specializační obor. Tento vývoj kopíruje celkový trend postupné diverzifikace odborné medicíny do stále specializovanějších podoborů. Avšak samotná péče o úrazy jako taková není ničím novým a je hluboce zakořeněna v naší společnosti již od prvopočátku lidstva. Úraz byl vlastně první patologií, která mohla být v primitivních počátcích získávání lékařského vědění přesněji „diagnostikována“, a tím pádem i „léčena“. Úraz měl jasnou etiologii, jeho mechanismus se odehrával často přímo před očima starověkých „lékařů“ a bylo jej tedy možno rychleji pochopit, analyzovat a navrhnout řešení. Historické nálezy dokumentují poranění skeletu a primitivní způsoby jejich léčby, dokazují i to, že některé zlomeniny se po těchto způsobech léčení hojily a zhojily. Zmínky o ošetřování a léčbě poranění byly nalezeny už v Mezopotámii nebo v Egyptě (2500–2000 let př. n. l.). Princip tahu a protitahu u léčby zlomenin byl znám již chirurgům ve staroindickém lékařství, dobré znalosti o vykloubeních byly objeveny u Aztéků. Větší množství dochovaných nálezů pochází z antického Řecka, nejen ze spisů Homérových, ale především Hippokratových. Záznamy o ošetřování ran, o obvazech apod. se objevují v dílech Celsových, Gallenových i v dílech alexandrijských lékařů. Ve středověku se soudobá traumatologie nadále rozvíjela, zejména zásluhou francouzských a anglických chirurgů, jako např. Ch. J. Duverney, J. L. Petit, P. J. Desault, F. Chiparit, P. Pott. Základním omezením rychlejšího rozvoje operačního léčení zlomenin byla v té době infekce. Teprve s objevem principů asepse nastal zlom v léčbě poranění a první úspěšnou osteosyntézu zlomeniny pately provedl v roce 1877 J. Liste. V průběhu 19. století se postupně chirurgie rozvíjí a spolu s tím se objevují i publikace, které popisují příznaky zlomenin (Dupuitren, 1847) a způsoby léčby zlomenin (Desault, 1811; Cooper, 1832). Na konci 19. století se chirurgové V. J. Kuzmin, P. Delbet, A. Lambotte a další snažili o první nitrodřeňové fixace dlouhých kostí, které byly propracovány G. Küntcherem. Ten začal v roce 1940 provádět nitrodřeňovou fixaci hřebem. Modifikace této metody se 4

používají dodnes (obr. 1). Švýcarská společnost s názvem Arbeitsgemeinschaft für Studium der Osteosynthesefragen (AO) propracovala a zdokonalila instrumentárium a používané metody (obr. 2). Pro rozvoj a vývoj traumatologie byl nezbytný objev anestezie a resuscitačních postupů, objev asepse a antisepse, antibiotik a v neposlední řadě i objev X paprsků W. K. Röntgenem v roce 1895, který zdokonalil diagnostiku nejrůznějších poranění a onemocnění. Dětská traumatologie je v dnešní době zcela jistě samostatný obor. Dětský traumaObr. 1: Proximální zajištěný nitrodřeňový hřeb femuru (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

tolog častěji stojí před rozhodnutím, kdy je

již třeba zahájit operační řešení a kdy to ještě není nutné. Upřednostňování konzervativních postupů vyplývá z velké remodelační schopnosti dětských kostí a vůbec z celkově rychlejší regenerace mladého organismu (obr. 3). První dochovaná zmínka o dětských zlomeninách je v Hippokratově práci Senex Divinius. V průběhu dalších století se v textech objevují jednotlivé popisy „zvláštních“ dětských poranění kostí, z nichž první jsou datovány

Obr. 2: AO manuál, základní principy léčení zlomenin (zdroj: archív autora).

Obr. 3: Spontánní remodelace po zlomenině distálního radia (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

5

Obr. 4: Bryantova trakce pro konzervativní léčbu zlomeniny dlouhé kosti v dětském věku (zdroj: P. Gál., Miniinvazívní osteosyntéza zlomenin horní končetiny u dětí – se souhlasem autora).

Obr. 5: Perkutánní fixace zlomeniny vnitřního kotníku (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

až do období 17. století. V pracích z 19. století se začínají objevovat zmínky o poraněních růstové ploténky. Za první samostatnou publikaci, která se věnuje dětským zlomeninám, je v současnosti považována Polandova monografie, která byla poprvé vydána v roce 1898 v Londýně pod názvem „Traumatic Separation of the Epiphyses“ (Poland, 1898). Přináší nový náhled na dětské zlomeniny, zejména na jejich hlavní odlišnost od zlomenin v dospělém věku, tedy na poranění růstové ploténky. V dalších letech 19. století a ve 20. století pak vychází stále více textů, které se zabývají pouze dětskými zlomeninami. Na přelomu 19. a 20. století se dětské zlomeniny léčí především konzervativně, i když jsou popisována první operační řešení, která využívají postupy používané u zlomenin v dospělosti. Ve 20. století se náhled na terapii dětských zlomenin postupně mění a dětská traumatologie se vyčleňuje od obecné traumatologie jako samostatný uznávaný obor. Během let se zakládají dětská traumatologická oddělení a budují se samostatná dětská traumatologická centra. 6

Obr. 6: Suprakondylická zlomenina distálního humeru ošetřená technikou miniinvazivní osteosyntézy (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

Obr. 7: Epifyzeolýza SH II proximálního humeru ošetřená technikou miniinvazivní osteosyntézy (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

Současně s tím, jak se obor dětské traumatologie osamostatňuje, dochází i ke změně strategie léčebných postupů u dětských zlomenin. Modifikují se metody využívané u poranění v dospělém věku a objevují se nové způsoby a principy léčby používané výhradně pro dětské zlomeniny. Na rozdíl od dříve používaných jednoduchých konzervativních způsobů léčby se ve 20. století začínají používat metody agresivnější, trakční (obr. 4), provádějí se dokonalejší zavřené repozice využívající RTG kontrolu. S postupným rozvojem anestézie jsou stále častěji prováděny otevřené repozice a fixace. V dalším vývoji je pak objevena možnost zavřené repozice s využitím perkutánní fixace (obr. 5). V 90. letech 20. století se technika perkutánní fixace postupně zdokonalila, začínají se používat moderní implantáty. Do rozvoje perkutánní fixace zasáhla zásadním způsobem miniinvazivní metoda léčby (Gál, 1993), (obr. 6, 7). Ve Francii chirurgové objevili nové 7

Obr. 8: Průběh elastického stabilního nitrodřeňového hřebování (ESIN) při zlomenině diafýzy femuru (zdroj: archív autora).

Obr. 9: Průběh elastického stabilního nitrodřeňového hřebování (ESIN) při zlomenině diafýzy femuru znázorněný rentgenogramy (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

techniky fixace, které využívají implantáty z titanových slitin. Popsali techniku perkutánní repozice zlomeniny hlavičky radia na horní končetině (Metaizeau, 1980) a postupně vyvinuli novou techniku elastického stabilního nitrodřeňového hřebování – ESIN (Metazieau, 1983), (obr. 8, 9). Tato metoda se týká především diafyzárních zlomenin na dolní končetině 8

a v přístupu ke zlomeninám v dětském věku znamenala další výrazný pokrok (obr. 10). Jak již bylo zmíněno, zlomeniny v dětském věku se odlišují od zlomenin v dospělosti. Nejslabším místem ve skeletu dětí je růstová ploténka (obr. 11). Při působení velké síly na přilehlé oblasti pak dochází spíše k jejímu poranění, než k luxacím v přilehlých kloubech, jak se děje v dospělosti. Tento typ poranění se na celkovém Obr. 10: Zlomenina diafýzy stehenní kosti ošetřena technikou ESIN (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

počtu všech skeletálních traumat v dětském věku podílí přibližně 20 %. I přes veškeré pokroky v léčbě těchto zranění se počet neuspokojivých výsledků pohybuje okolo 5 %. Na rozdíl od většiny tkání v lidském organismu probíhá růst kostní tkáně apozicí, přičemž je nutná remodelace kostí. Ta způsobuje, že růstové procesy kosti jsou velmi složité. U rostoucích kostí se nacházejí struktury, které již v dospělém věku chybějí. Na kosti rozlišujeme několik zá-

Obr. 11: Anatomie dětské kosti (a) a rentgenogram dětského kolene se znázorněním růstových zón (b). (zdroj: Thomson Gale, a part of the Thomson Corporation, www.humanillnesses.com).

kladních struktur zodpovědných za její růst. Jsou to epifýza, růstová ploténka, metafýza, obvodové růstové struktury a síť kolagenních vláken. Z těchto struktur je nejdůležitější růstová ploténka, která je zodpovědná za růst dlouhé kosti do délky, a tím i za růst celé končetiny. Na růst kosti mají vliv jak faktory genetické, tak faktory zevního prostředí, které mohou být obecné (hormonální, nutriční) – ovlivňující všechny růstové chrupavky organismu, nebo mohou být místní (mechanické, cévní, zánětlivé, traumatické) –

Obr. 12: Normální histologická stavba růstové chrupavky (zdroj: http://www.gla.ac.uk/ibls/fab/tutorial/generic/bone5.html).

ovlivňující jednotlivé růstové chrupavky a mohou ovlivnit velikost a tvar konkrétní poraněné kosti. 9

Růstová ploténka z největší části zajišťuje růst kostí do délky. Je vysoce diferencovaná, nachází se mezi epifýzou a metafýzou kosti. Podobně utvářená chrupavka odděluje během růstu i apofýzy. Makroskopicky mají jednotlivé růstové ploténky rozdílné tvary, ale téměř všechny se blíží konstrukci komolého kužele, kdy nejužší jsou na straně přivrácené k epifýze. Během růstu se výška růstové ploténky nemění a změny v rychlosti růstu kostí jsou dány změnami v mitotické aktivitě buněk proliferační zóny chrupavky. Výjimkou je období, kdy dochází k jejímu uzávěru. Rozdíly ve tvaru jednotlivých růstových chrupavek jsou tak zodpovědné za rozdílnou frekvenci poranění jednotlivých regionů. Mikroskopická stavba růstové chrupavky je složitá. Je tvořena hyalinní chrupavčitou tkání s mezibuněčně probíhajícími svazky kolagenních vláken. Chondrocyty jsou postaveny do sloupců, které u dlouhých kostí probíhají v podélné ose kosti. V její stavbě rozlišujeme několik diferencovaných vrstev: rezervní (germinativní) vrstva, proliferativní vrstva a hypertrofická vrstva (obr. 12). Na straně přivrácené k epifýze kosti se nachází rezervní, neboli germinativní vrstva. Buňky jsou difúzně rozptýleny, netvoří charakteristické sloupce. V buňkách je obsaženo velké množství glykogenu, probíhá v nich syntéza proteinů. Chondrocyty v této vrstvě mají jen minimální proliferační aktivitu. Na rezervní vrstvu navazuje vrstva proliferativní, která obsahuje již seřazené sloupce chondrocytů. Ty jsou vytvářeny z mateřských chondrocytálních buněk a jako jediná vrstva je zdrojem buněk nových. Funkcí této vrstvy je produkce základní mezibuněčné hmoty a proliferace chrupavčitých buněk. Růstová chrupavka je téměř z poloviny své výšky tvořena právě touto vrstvou. Další vrstvou růstové chrupavky je vrstva hypertrofická. Buňky této vrstvy jsou objemné a dochází u nich k regresivním změnám. Hypertrofií buněk dochází k relativnímu snížení množství mezibuněčné hmoty a kolagenních vláken v ní probíhajících, což způsobuje, že linie lomu u epifyzeolýz probíhá právě v této vrstvě. Současně při bázi hypertrofické vrstvy začínají mezibuněčná septa kalcifikovat. Podle strukturálních a biochemických změn, ke kterým v této vrstvě dochází, Wrighton tuto vrstvu ještě dále dělí na zónu maturace, degenerace a provizorní kalcifikace. Na tuto vrstvu pak navazuje metafýza kosti. Důležitými součástmi, které zodpovídají za růst kosti, jsou také obvodové růstové struktury, mezi něž patří Ranvierův osifikační žlábek a Lacroixův osifikační prstenec. Ranvierův žlábek byl poprvé popsán v roce 1873. Je to povrchová struktura nacházející se mezi epifýzou a metafýzou, která obkružuje proliferativní vrstvu růstové chrupavky. 10

Je složen z vrstvy extrémně zhuštěných nediferencovaných buněk, z vrstvy méně zhuštěných buněk a z vrstvy, jež obsahuje fibroblasty a fibrocyty. Fibrózní vrstva je silná a přispívá k mechanickému zpevnění kosti na přechodu růstové chrupavky a metafýzy. V roce 1950 byl popsán perichondrální osifikační Lacroixův prstenec, který na obvodu zpevňuje růstovou chrupavku, a tím zvyšuje mechanickou odolnost růstové ploténky, zejména proti střižným a tlakovým silám. Tvar růstové ploténky a stupeň osifikace epifýzy tak ovlivňují pravděpodobnost vzniku i prognózu různých typů Obr. 13: Klasifikace epifyzeolýz dle Saltera-Harrise (zdroj: Jon C. Thompson, Netter's Concise Atlas of Orthopaedic Anatomy).

epifyzeolýz. Některé typy jsou častější v určitých věkových skupinách. Linie

lomu nemusí vždy probíhat pouze ve vrstvě hypertrofické růstové chrupavky a může zasahovat i do dalších vrstev, což pak negativně ovlivňuje prognózu poranění. Pro zvolení správného přístupu k léčbě poranění v oblasti růstové chrupavky, pro komunikaci a současně i pro stanovení prognózy určitého typu poranění bylo nutné klasifikační sjednocení. Klasifikačních schémat existuje více a dnes se obecně nejčastěji používá klasifikace podle Saltera a Harrise (1963), kterou později Rang doplnil o další typ zlomeniny (Havránek, 1991).

Klasifikace dle Saltera-Harrise s Rangovou modifikací (obr. 13): 1. Linie lomu prochází jen růstovou chrupavkou, nedochází ke zlomenině kosti. 2. Linie lomu zasahuje do metafýzy a z ní odlamuje trojúhelníkovitý fragment (Thurston-Hollandův trojúhelník). 3. Linie lomu vychází z kloubu, kříží kostěné jádro epifýzy a probíhá do periferie růstovou chrupavkou. 11

4. Zlomenina postupuje z epifýzy, její linie kříží růstovou chrupavku a pokračuje do metafýzy. 5. Axiálním násilím dochází ke kompresi růstové ploténky. 6. Dochází k vytržení periferních struktur růstové zóny i s kostěnými fragmenty metafýzy a epifýzy.

Typ 1 a 2 dle Saltera-Harrise jsou označovány rovněž jako epifyzární separace a jsou prognosticky příznivé. Typ 3 a 4 jsou pak již epifyzárními frakturami a mají prognózu horší, častěji u nich dochází ke komplikacím a vzniku trvalých následků, které se léčí velmi obtížně. Poranění růstových plotének, zvláště 3, 4, 5 a 6 typu podle Saltera-Harrise, jsou tak v dětském věku prognosticky velmi nepříznivými úrazy. Narušením enchondrální osifikace a normální chondrogeneze v oblasti růstové chrupavky může dojít k poruše růstu kosti (zpomalení či zástava), jejíž příčinou je kostní můstek mezi epifýzou a metafýzou.

Existuje několik typů kostního můstku: 1. periferní typ – působí angulární deformity 2. centrální typ – způsobuje zkrácení bez angulace 3. kombinovaný typ – vyvolává angulární deformitu i zkrácení postižené kosti – prognosticky nejzávažnější (Rockwood, 1984)

Iatrogenním poškozením při repozici a fixaci fraktury (obr. 14) může vzniknout osteonekrotický můstek a ve štěrbině po nedokonalé repozici epifyzeolýzy můstek vyhojovací (Laer Von, 1984). Klinické důsledky kostních můstků jsou často velmi Obr. 14: Průchod kovového implantátu růstovou chrupavkou distálního radia (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

závažné (Bak, 1997) a jejich řešení je možné jen složitými korekčními operacemi (Hove, 1997),

nebo komplikovanou resekcí můstku a implantací tukového štěpu (Langeskiolt, 1981), často se složitou diagnostikou nejčastěji pomocí MR (Petit, 1996). Léčba komplikací, které jsou vzniklým kostním můstkem způsobeny (zkrácení kosti, jiné deformace v růstu) je velmi obtížná a je téměř vždy chirurgická. Rozlišují se dva základní principy léčby. První z nich řeší již vzniklou deformitu, a to pomocí distrakční 12

epifyzeolýzy, chondrodiatázy, případně dočasné zástavy růstu. Používají se různé techniky, od osteotomií až po metody Wagnerovy a Ilizarovovy. U metody distrakční epifyzeolýzy se k prodloužení nebo korekci angulace končetiny využívají síly působící v růstové ploténce. Dá se použít pouze těsně před předpokládaným přirozeným uzávěrem růstové zóny, neboť při ní dochází k jejímu zničení. Chondrodiatáza představuje modifikaci distrakční epifyzeolýzy, kdy se k prodloužení postižené kosti používá pomalejší distrakce epifyzární ploténky. Dá se použít rovněž jen u dětí těsně před uzávěrem růstové zóny. Při použití metody kalotaxe je nejprve provedena submetafyzární kortikotomie, po které následuje pomalá distrakce svalku. Po dosažení potřebné délky končetiny je distrakce ukončena. Při Wagnerově technice jsou nutné tři operační zákroky, kdy při prvním se provede otevřená diafyzární transverzální osteotomie ve středu diafýzy a diastáza kosti až do dosažení požadované délky kosti. Následuje druhý operační výkon, kdy jsou do distrakční štěrbiny umístěny autogenní kostní štěpy. Při třetí operaci se odstraňuje fixační materiál. Pokud se jedná jen o korekci angulační deformity, je možné postupovat dvoudobě – první dvě operace se provádějí najednou. Při Ilizarovově technice se rovněž provádí kortikotomie, ale osteotomem se přerušují pouze 3/4 obvodu kosti a zbývající část je přerušena pomocí ohnutí a twistu, aby se ochránilo krevní zásobení a periost, které pak podporují růst svalku. Následuje kontrolovaná distrakce kosti až do požadované délky kosti. Jiné metody léčby se zaměřují na odstranění již vzniklého můstku a na umožnění růstu kosti do délky vyplněním defektu po resekci allogenním tukovým štěpem (Langeskiold, 1975, 1981), štěpem z fascie nebo šlachy (Janarv, 1998), případně silikonovými náhradami. Zřídka se volí arteficiální zástava růstu poškozené růstové ploténky (Bak, 1997), doplněná o stejný zásah na kontralaterální straně. Ve stadiu rozsáhlého experimentálního zkoumání jsou transplantace růstové chrupavky (Park, 1994; Jouve, 1998; Lee, 1998; Gál, 2002). Typickým příkladem rizikového poranění růstové ploténky u dětí je oblast distálního femuru, a to v preadolescentním a adolescentním věku. Není sice příliš časté, ale vzhledem k tomu, že ploténka zajišťuje až 70 % růstu femuru do délky, což je asi 40 % růstu celé dolní končetiny, jsou případné následky tohoto poranění klinicky velmi závažné. Kromě toho může dojít k poškození cév a nervů v popliteální oblasti, zejména při těžkém traumatu u dopravních nehod, jež jsou častým etiologickým faktorem těchto fraktur (Kleinman, 1998). 13

Léčba spočívá v anatomické repozici a stabilizaci úlomků většinou Kirschnerovými dráty (obr. 15). Dle některých autorů by implantát neměl křížit růstovou ploténku (Pešl, 1995). Vzhledem k věku zraněných a výrazným tahům měkkých tkání v okolí zlomeniny lze předpokládat, že zejména u polytrau-

Obr. 15: Stabilizace zlomeniny distálního femuru dvěma Kirschnerovými dráty procházejícími růstovou ploténkou (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

matizovaných pacientů, kteří utrpěli například i trauma hlavy, je nutná rigidnější forma fixace. Otázkou pak zůstává, zda je možná dostatečná retence úlomků zlomeniny bez toho, aniž by implantát křížil růstovou ploténku. Stejně komplikovaná jsou i poranění

Obr. 16: Epifyzeolýza SH II distálního radia (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

Obr. 17: Epifyzeolýza SH II proximálního humeru (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem).

růstové ploténky distální tibie, kdy kompresní osteosyntéza transfyzárně vede-

ným tahovým šroubem je přímo nutností (Toupin, 1997). Z hlediska možného využití chondrocytálních štěpů je zajímavá rovněž problematika náhrad předních zkřížených vazů v koleni u pacientů poraněných ještě před uzávěrem růstových plotének, kdy při zavádění náhrad vazu dojde k poškození růstové chrupavky (Lo, 1997). V budoucnu se chirurgie v oblasti růstové ploténky navíc zřejmě uplatní i v rámci dětské onkologie při resekcích tumorů kostí (Cool, 1997). Fraktury v oblasti růstové zóny (physeal fractures) patří mezi závažná a relativně častá poranění kostí u dětí i u rostoucích zvířat. U dětí představují poranění růstové ploténky 20 % všech případů zlomenin (Rogers, 1970) s tím, že četnost poranění jednotlivých lokalizací se liší. Epifyzeolýza distálního radia (obr. 16) tvoří asi 20 %, traumata proximální růstové zóny humeru (obr. 17), epifyzeolýzy distální tibie a fibuly, humeru a femuru 2–10 % všech poranění kostí (Ashcraft, 2005). U psů bývá růstová ploténka postižena přibližně ve čtvrtině až třetině případů fraktur dlouhých kostí končetin, přičemž predominuje poranění typu Salter-Harris II (Dvořák et al., 2000; Maretta and Schrader, 1983; Salter and Harris, 1963). Nejčastější jsou u psů epifyzeolýzy distálního femuru, co do 14

četnosti poranění růstových zón pak následují epifyzeolýzy distálního humeru, proximálního femuru, distální ulny a proximální a distální tibie (Maretta and Schrader, 1983). S výjimkou humeru bývá u dlouhých kostí končetin nejčastěji postižena růstová ploténka (RP), která je pro růst dané kosti do délky nejdůležitější (např. distální RP ulny, distální RP femuru) (Carrig et al., 1975; Maretta and Schrader, 1983). Regenerační kapacita buněk poškozené růstové zóny je malá a v místě poranění RP se vytvoří kostní můstek. Experimentálně bylo prokázáno, že zabírá-li kostní můstek 7–9 % plochy RP, vede poranění RP dlouhých kostí končetin k poruše růstu dané kosti (Gál et al., 2002; Janarv et al., 1998). V závislosti na lokalizaci kostního můstku (centrální, periferní) může dojít ke zkrácení, nebo angulární deformitě postižené končetiny, případně ke kombinaci těchto abnormalit růstu (Campbell et al., 1959; Ford and Key, 1956; Key and Ford, 1958). Uvádí se, že u lidí vede 25–35 % epifyzeolýz ke zkrácení a deformitě poraněné kosti, přičemž v 10 % případů dochází k funkčním problémům s postiženou končetinou (Mann and Rajmaira, 1990; Mizuta et al., 1987). U psů vznikne deformita kosti v 5–10 % případů uzávěru RP a většinou je třeba provést korekční osteotomii, aby byla obnovena normální funkce končetiny (Maretta and Schrader, 1983). Deformitou končetiny bývají postižena nejčastěji střední a velká plemena psů ve stáří do 5 měsíců v době poranění s tím, že největší deformity se vyvíjí po Salter-Harris V poranění distální RP ulny (Fox, 1984; Henney and Gambardella, 1989; Piermattei and Flo, 1990).

15

Cíle studie

Experimentální studie se komplexně zabývá transplantací mezenchymových kmenových buněk do oblasti poškozené růstové ploténky. Cílem je detailně propracovat metodu prevence a léčby kostního můstku po iatrogenním poranění růstové ploténky tak, aby jí bylo možné aplikovat do klinické praxe. Experimentálně získané výsledky, které navážou na poznatky získané v minulých studiích, mají významným způsobem obohatit současné postupy léčby komplikací, které doprovázejí některé případy zlomenin kostí končetin v růstové ploténce u dětí. Stejným způsobem budou velkým přínosem pro léčbu tohoto poranění i v oblasti veterinární medicíny.

Pracovní hypotéza Traumata růstových plotének dlouhých kostí končetin představují u dětí prognosticky velmi nepříznivá poranění s vysokým rizikem trvalých následků. K narušení fyziologického procesu enchondrální osifikace dochází buď přímo úrazem, nebo iatrogenním poškozením při repozici a případné fixaci v místě zavedení implantátu. To vede k poruše růstu kostí do délky v důsledku vzniku kostních můstků mezi epifýzou a metafýzou. Klinické následky mohou být velmi vážné a jejich řešení spočívá ve složitých korekčních operacích. Osteosyntéza provedená napříč ploténkou je proto považována za vysoce rizikovou. V některých indikacích je však velmi výhodná, mnohdy přímo nutná. V předchozím experimentu provedli autoři vyplnění vytvořeného defektu v růstové ploténce chondrocytárním štěpem na nosiči z tkáňového lepidla. V tomto místě následně došlo ve většině případů k novotvorbě chrupavčité tkáně a nevytvořil se zde kostní můstek. Tento nový a dosud nepopsaný způsob prevence vzniku kostního můstku po osteosyntéze nabízí novou hypotézu. Je třeba experimentálně nalézt jiný zdroj chrupavčitých buněk pro transplantaci. Vzhledem k současným vědeckým poznatkům se nabízí varianta využití kmenových buněk, které jsou schopny po patřičném nasměrování diferencovat v různé tkáně lidského organismu. Stanovili jsme si alternativní pracovní hypotézu, která předpokládá úspěšnou diferenciaci kmenových buněk v chrupavčité buňky růstové zóny, které tuto následně zrekonstruují a zamezí tak vzniku růstových deformit dlouhých kostí u dětí. 16

Cíle práce 1. Vypracování metodiky experimentálního operačního postupu. 2. Specifikace zdroje a dalšího zpracování kmenových buněk včetně značení. 3. Vyhodnocení léčebných výsledků metody s využitím různých druhů verifikace (radiologická, morfometrická, klinická, histologická). 4. Doporučení dalších kroků aplikace závěru experimentu do klinické humánní praxe. 5. Kompletace zjištěných poznatků do závěrečné práce.

Konečný cíl PROPRACOVÁNÍ EXPERIMENTÁLNÍ TECHNIKY TRANSPLANTACE MESENCHYMOVÝCH KMENOVÝCH BUNĚK DO DEFEKTŮ V OBLASTI RŮSTOVÉ PLOTÉNKY TAK, ABY MOHLA BÝT PŘEVEDENA DO DALŠÍ ČÁSTI KLINICKÝCH STUDIÍ A KLINICKÉ PRAXE.

17

Teoretický úvod a experimentální východiska

Poranění růstové zóny a následné defekty růstu kostí jsou předmětem studií již řadu let. Metoda elongace kosti provedená osteotomií, vyplnění defektu autospongioplastikou a následně fixace zevním fixátorem je dnes běžná na většině ortopedických pracovišť, která se léčbou těchto nemocí zabývají. Nově se zkouší možnost vyplnění defektu po osteotomii biodegradabilní kostní náhradou (ChronOs, Norian SRS, HA) (Gál et al., 2006; Slongo and Joeris, 2006; Kopylov et al., 1999; Goodman et al., 1998). Modernější přístup ukázaly studie z let 1999–2002. Po odběru autologního štěpu chrupavčité tkáně se provedla kultivace in vitro. Na modelu selete se potom do defektu růstové zóny implantovala suspenze vlastních chondrocytů, které vyplnily defekt a průkazně se tím zmenšila incidence kostního můstku a následně defekt dalšího růstu kosti. Metodou volby se dnes díky potvrzení možného použití v jiných oborech jeví implantace kmenových buněk (KB). Do místa destrukce by se tak implantoval prekurzor, který je za vhodných podmínek schopen diferencovat do požadovaných buněčných populací. V našem případě do žádoucí populace chondrocytů růstové zóny.

Zdroj kmenových buněk Existuje několik typů kmenových buněk, které mohou být použity pro buněčnou terapii. Dvě hlavní skupiny představují embryonální kmenové buňky a dospělé, nebo také orgánově specifické kmenové buňky (adult stem cells – AS buňky). Tyto AS buňky se mohou diferencovat na prekurzorové buňky mozkové, jaterní i svalové tkáně. Jejich plasticita tedy není o mnoho menší, než embryonálních KB. Takto plastických je jen nepatrný zlomek buněk v dřeni – asi 1 na 10 miliard. Zatím je možné je poznat jen podle úspěšného výsledku pokusu, identifikační markery se usilovně hledají. Alespoň několik takových buněk se podařilo získat z 80 % zpracovaných vzorků dřeně. Předkládaná práce obsahuje experimentální aplikaci orientovanou výlučně na AS buňky. Dalším z nových, velmi překvapujících poznatků je nález KB v některých orgánech. Dosud se předpokládalo, že KB jsou jen v tkáních, v nichž z KB terminálně diferencované buňky žijí jen poměrně krátce a rychle se obnovují (krev, kůže), zatímco většina tkání je neobsahuje a nemá v sobě již žádný buněčný potenciál k obnově (mozek, ledviny atd.). Zřejmě tomu tak není. 18

Obr. 18: Mesenchymální kmenová buňka (zdroj: International Society for Stem Cell Research).

I když převažující část základního výzkumu byla realizována na modelu laboratorních myší, je stále jasnější, že myší buňky nepředstavují optimální model pro lidské kmenové buňky. Je obtížné extrapolovat z údajů získaných na myších, jak se budou chovat lidské buňky, především po transplantaci do cílových tkání. To je jeden z hlavních důvodů, proč jsme zvolili použití AS buněk králíka jako vhodnějšího biomedicínského modelu (obr. 18). V tomto projektu zdůvodňujeme, proč je nezbytné přímé srovnání buněk derivovaných z kostní dřeně experimentálních zvířat a člověka. Jenom dlouhodobé sledování buněk diferencovaných in vitro ze stromálních buněk kostní dřeně a jejich přímé srovnání s buňkami izolovanými z mezenchymových tkání, především s chondrocyty a osteocyty, může poskytnout dostatek informací pro vypracování bezpečných metodik, které budou navrženy ke klinickým zkouškám.

Etické aspekty Při vytvoření lidských embryonálních kmenových buněk je proměněno lidské embryo (a tudíž potenciální lidská bytost) v masu buněk, ze které už tato bytost vzniknout nemůže. Tvorbu lidských embryonálních buněk proto mnozí lidé vnímají jako zničení lidského života a je pro ně nepřijatelná podobně jako umělé přerušení těhotenství. 19

Společnost se tak dostává do nelehké situace. Na jedné straně se jí nabízí perspektiva úspěchů v boji s chorobami, které dnešní medicína zvládá jen s obtížemi, nebo je vůbec neumí léčit. Na druhé straně je tento příslib zatížen faktem, že tu dochází k dezintegraci lidského zárodku. Řešení tohoto sporu lze nalézt jen diskusí. Diskuse o lidských embryonálních kmenových buňkách bohužel nejednou sklouzává z věcné konfrontace stanovisek v hádky plné emocí. Využití adultních kmenových buněk prostým odběrem kostní dřeně naproti tomu velmi elegantně řeší i tento etický aspekt a v případě úspěšných studií s AS buňkami tento problém prakticky zcela odpadne.

20

Materiál a metodika

Základní metodou experimentu byla transplantace MSCs do defektu růstové chrupavky na modelovém zvířeti. Cílem bylo detailně propracovat metodu prevence vzniku a léčby kostního můstku tak, aby je bylo možné aplikovat v další části preklinického výzkumu. Metodické postupy byly zvoleny tak, aby v rámci technických a finančních možností umožnily řešení studie. Použitým experimentálním zvířecím modelem byl laboratorní králík (novozélandský bílý – obr. 19), zvířata pocházela z komerčních chovů. Zvolený model je zcela vhodný jednak vzhledem k nízkým nákladům a zejména vzhledem k podobným studiím probíhajících na stejných modelech. Je tedy možné adekvátní srovnání s recentními studiemi. Experimentální skupina zahrnovala celkem 60 králíků různého pohlaví v hmotnostním intervalu 2,38 ± 0,38 kilogramů při ustájení. Stáří králíků při operaci bylo 5 týdnů. Vybrána byla distální růstová chrupavka femuru, která je u těchto zvířat otevřena přibližně do čtvrtého až šestého měsíce věku. Distální růstová chrupavka zajišťuje 70–80 % růstu kosti do délky (Havránek, 1991). Zvířata byla rozdělena do dvou základních skupin

Obr. 19: Novozélandský bílý králík (zdroj: archív autora).

21

Skupina

Popis

po třiceti a každá z nich do

A

Prevence vzniku kostního můstku – transplantace autologních MSCs

dalších dvou skupin podle

B

Léčba kostního můstku – transplantace autologních MSCs

C

Prevence vzniku kostního můstku – transplantace allogenních MSCs

typu transplantace (auto-

D

Léčba kostního můstku – transplantace allogenních MSCs

logní/allogenní). Přesný popis skupin experimentál-

Tab. 1: Experimentální skupiny.

ních zvířat ukazuje tab. 1. Sekundární rozdělení záviselo na úspěšnosti kultivace izolované linie autologních buněk, proto bylo v konečném výsledku početně nerovnoměrné. Operována a implantována byla vždy pravá dolní končetina, tedy pravá stehenní kost, a levá dolní končetina (levá stehenní kost) sloužila jako kontrolní.

Obr. 20: Odběr kostní dřeně u králíka (zdroj: archív autora).

Obr. 21: Odebrané vzorky kostní dřeně (zdroj: archív autora).

22

Odběr kostní dřeně Každému králíkovi byla ihned po ustájení odebrána krev kostní dřeně injekční jehlou (hypodermic needle 20G/40 mm) do stříkačky (5 ml, Baxter) s 2 ml PBS (Phosphate Buffered Saline, Dulbecco), 2 % FBS (Fetal Bovine Serum, StemCell) a Heparinem 5 IU/ml (obr. 20). Z punkce křídel obou kyčelních kostí u pětitýdenního králíka byly odebrány přibližně 4 ml krve kostní dřeně (obr. 21).

Skupiny A a C Ve skupině s označením A a C šlo o metodu ověření použití MSCs při prevenci vzniku kostního můstku. Po vizuálním ověření průběhu růstové zóny byl bateriovou vrtačkou (Colibri system, SYNTHES) vytvořen defekt v laterální části distální RP femuru tak, aby rozsah poškození růstové zóny překračoval 9 % její plochy (Gál et al., 2002; Janarv et Obr. 22: ACUFEX – MosaicPlasty Precision, Smith+Nephew, USA (zdroj: archív autora).

al., 1998). Z toho důvodu byl použit vrták o průměru 3,5 mm (ACUFEX – MosaicPlasty Precision, Smith+Nephew, USA –

obr. 22), kterým byl z laterální plochy laterálního kondylu femuru těsně dorzolaterálně nad odstupem m.extensor digitorum longus vyvrtán dorzomediálním směrem otvor hluboký

Obr. 23: Připravené operační pole (zdroj: archív autora).

23

Obr. 24: Operační pole a nástroje (zdroj: archív autora).

12 mm (tak aby byl poškozen laterální úsek distální RP femuru včetně přilehlé oblasti epifýzy a metafýzy). Vyvrtaný otvor byl před implantací skafoldu s autogenními MSCs rozšířen 3,5 mm dilatátorem (Dilatator, ACUFEX – MosaicPlasty Precision, Smith+Nephew, USA) z mozaikoplastiky. Směs skafoldu a MSCs byla připravena v jamkách mikrotitrační destičky (TPT), ze které byl implantát ve formě válce o průměru 3,5 mm a výšce 10 mm odebrán vodičem vrtáku (Drill Guide) a opatrně zaveden pěchovadlem (Delivery Tamp) do defektu vyvrtaného v laterálním kondylu femuru. Aby bylo zamezeno vycestování tranplantátu, byl otvor v místě laterální plochy laterálního kondylu femuru uzavřen válcem beta-trikalcium fosfátu (ChronOs, SYNTHES) o průměru 3,5 mm a výšce 2 mm, který byl vykrojen z preformovaného bloku ChronOs pomocí 3,5 mm válcovým dlátem (Tubular Chisel) (ACUFEX – MosaicPlasty Precision, Smith+Nephew, USA). Celý výkon probíhal za přísně aseptických kautel, za použití jednorázového rouškovacího materiálu (obr. 23) a sterilizovaných nástrojů (obr. 24). Utracení zvířat bylo provedeno po 4 měsících od operace protokolárně, lege artis, vysokou dávkou Thiopentalu i.v. v dávce 1–3 mg/kg na zvíře podle hmotnosti. 24

Z původních 30 králíků přežilo do konce experimentu 24, z šesti uhynulých králíků čtyři uhynuli ihned po ustájení vzhledem ke kokcidiové infekci (chyba ze strany dodavatele), jeden uhynul peroperačně zřejmě následkem příliš hluboké anestézie a jeden v průběhu rekonvalescence – v časném pooperačním období si zlomil pravý femur a nadále nepřijímal potravu.

Skupiny B a D Ve skupině s označením B a D šlo o metodu ověření použití MSCs při léčbě vzniklého kostního můstku. Po vizuálním ověření průběhu růstové zóny byl bateriovou vrtačkou (Colibri system, SYNTHES) vytvořen defekt v laterální části distální RP femuru tak, aby rozsah poškození růstové zóny překračoval 9 % její plochy (Gál et al., 2002; Janarv et al., 1998). Z toho důvodu byl použit vrták o průměru 3,5 mm (ACUFEX – MosaicPlasty Precision, Smith+Nephew, USA), kterým byl z laterální plochy laterálního kondylu femuru těsně dorzolaterálně nad odstupem m.extensor digitorum longus vyvrtán (obr. 25) dorzomediálním směrem otvor hluboký 12 mm (tak aby byl poškozen laterální úsek distální RP femuru včetně přilehlé oblasti epifýzy a metafýzy). Vyvrtaný otvor byl rozšířen 3,5 mm dilatátorem (Dilatator – ACUFEX – MosaicPlasty Obr. 25: Vyvrtání defektu růstové zóny (zdroj: archív autora).

Precision, Smith+Nephew, USA) z mozaikoplastiky (obr. 26). Defekt jsme povrchově uzavřeli granulemi ChronOs (beta-trikalcium fosfát), pro usnadnění orientace při druhé operaci obarveným methylenovou modří. Králík byl dále ponechán 4 týdny ve výběhu. V druhé době jsme provedli odvrtání stejné části stehenní kosti stejným směrem vrtákem o průměru 4,5 mm vrtačkou SYNTHES Colibri system, identické umístění vrtáku zajišťovalo označení vstupního otvoru modře obarvenou biokeramikou. Bez-

Obr. 26: Dilatace vyvrtaného otvoru dilatátorem (zdroj: archív autora).

prostředně po odvrtání jsme ihned implantovali 25

v případě skupiny B autologní a v případě skupiny D allogenní MSCs ve skafoldu. Celý výkon probíhal za přísně aseptických kautel, za použití jednorázového rouškovacího materiálu a sterilizovaných nástrojů. Utracení zvířat bylo provedeno po 4 měsících od druhé operace protokolárně, lege artis, vysokou dávkou Thiopentalu i.v. v dávce 1–3 mg/kg na zvíře podle hmotnosti.

Izolace, kultivace, značení a diferenciace buněk Ze získané krve kostní dřeně byla centrifugací (400 g, 30 min) odstraněna krevní plazma (obr. 27) a odebrána opaleskující vrstvička mononukleárních buněk k další izolaci a kultivaci mezenchymových kmenových buněk (Mesenchymal stem cells, MSCs) kostní dřeně (obr. 28) v laboratorních podmínkách při 37 °C v prostředí 5 % CO2. Kultivačním mediem bylo Dulbecco´s Modified Eagles Medium (DMEM) (Gibco Laboratories, Life Technologies, Grand Island, NY) doplněné o 10 % FBS a gentamycin (50 mg/l, GENTAMYCIN, Sigma), kultivace probíhala v kultivačních miskách o průměru 0,75 cm2. Po 24 hodinách byly odstraněny neadherentní buňky oplachem kultivační láhve roztokem PBS. Kultivační medium se měnilo každé tři dny. První kolonie MSCs se objevily 4.–5. den kultivace a 80 % pokrytí kultivační misky bylo dosaženo po 10 dnech kultivace. MSCs byly

Obr. 27: Kostní dřeň po centrifugaci (zdroj: archív autora).

26

Obr. 28: Opaleskující vrstva mononukleárních buněk (zdroj: archív autora).

Obr. 29: Postupný růst kolonie MSCs (zdroj: archív autora). a) po 5 dnech kultivace b) po 10 dnech kultivace c) po 15 dnech kultivace d) po 21 dnech kultivace

promyty v roztoku 0,5 % Trypsinu a EDTA (Sigma) a rozvrstveny tak, aby byla dosažena koncentrace 5000–6000 buněk/cm2. Celkový počet izolovaných jaderných buněk se pohyboval v rozmezí 15–30 milionů jaderných buněk z jedné izolace. Kultivace všech vzorků MSCs probíhala přesně 21 dnů (obr. 29 a–d). Kultivované mezenchymové buňky kostní dřeně byly před jejich transplantací do cílové tkáně značeny dvojím způsobem. V první řadě bylo použito značení kontrastní látkou paramagnetických nanočástic oxidu železa (Resovist, 0,5 mmol Fe/ml, Shering). Tato látka byla přidána do kultivačního média k buňkám 3 dny před transplantací v koncentraci 1 µl/ml. V druhé řadě byly buňky značeny lipofilním fluorescenčním barvivem CM-DiI (Chloromethylbenzamido derivate of DiI, CellTracker™ CM-DiI, Invitrogena) v koncentraci 5 µl/2,5 ml PBS, které lze detekovat histologicky imunoflorescencí. Toto barvivo bylo přidáno k MSCs po jejich centrifugaci (700 g, 5 min) a inkubace probíhala 5 min ve 37 °C a dále 15 min ve 4 °C. Poté byly MSCs promyty v PBS. Buňky byly stimulovány k diferenciaci směrem k chondrocytům podle popsaného protokolu (Miura, 2002) po dobu 30 minut v a-MEM médiu s přídavkem 100 ng/ml lidského rekombinantního TGF-ß1 (R&D Systems), 1 % ITS (Insulin - Transferrin - Selenium, Gibco), 100 nM dexametazonu (DEXAMETAZON, Medochemie) a 50 mg/ml roztoku ascorbát-2-fosfátu (ACORBÁT-2-FOFSÁT, Sigma). Po skončení indukce byly buňky centrifugovány (700 g, 5 min) a připraveny k přenesení do skafoldu. 27

Příprava nosičů buněk – skafoldů Užitý skafold byl připravován při teplotě 4 °C smícháním 20,75 µl hyaluronidu sodného (10 mg/ml, 1500 kDa, SODIUM HYALURONAT, Contipro) s 31,1 µl 1 mg/ml roztoku kolagenu typu I v 0,1 molární kyselině octové (KYSELINA OCTOVÁ 99,8 %, Lach-ner s.r.o.). Kolagen typu I pocházel z telecí kůže v kyselém rozpouštědle neutralizovaný v 1 molárním KOH (HYDROXID DRASELNÝ, Penta). Poté bylo pipetou přidáno 36 µl suspenze MSCs (vždy 2×106 buněk). Do média obsahujícího 100 µg/ml ascorbát-2-fosfátu, 200 mM dexametazonu, 20 % FBS a ITS bylo přidáno 0,12 ml roztoku lidského proteinu pro Tissucol (Tissucol®Kit Baxter) v aprotininu (fibrinogen 70–110 mg/ml, aprotinin 3000 KIU/ml) a 0,12 ml roztoku trombinu (4 IU/ml) v CaCl2 (40 µmol/ml, Tissucol®Kit, Baxter). Gel se formoval v mikrotitrační destičce (96 jamek/300 ml/průměr jamky 0,628 cm) (TPT) při 37 °C. Následně bylo přidáno kultivační médium a celý skafold byl umístěn do inkubátoru s vlhkou atmosférou 5 % CO2 při 37 °C. Pipetou byly do skafoldu přeneseny připravené kmenové buňky. Tato směs nosiče a MSCs byla udržována v inkubátoru za popsaných podmínek do okamžiku implantace (1–6 hodin) danému zvířeti (obr. 30).

Průběh operace K zamezení předoperačních a postoperačních komplikací byla zvířatům 12 hodin před pokusem odejmuta potrava, voda byla odebrána až těsně před pokusem. Pro navození celkové anestézie byla použita kombinace látek Midazolam (1,00 mg/kg i.m, DORMICUM inj., Roche) + Fentanyl (0,02 mg/kg i.m., FENTANYL, Janssen) + Medetomidin (0,02 mg/kg i.m., DOMITOR inj. a.u.v., Pfizer), poté byla zvířata napojena na anesteziologický

Obr. 30: MSCs ve skafoldu připravené k implantaci (zdroj: archív autora).

28

inhalační přístroj (podávaná směs kyslík + rajský plyn (v poměru 2/3) + izofluran, FORANE, Abbott Laboratoires). Tato kombinace látek způsobuje u zvířat silnou respirační depresi, proto byla všechna zaintubována. Po uspání proběhla příprava operačního pole k aseptické operaci. Samotný operační výkon spočíval v zevní artrotomii a obnažení distální metafýzy femuru (obr. 31). Po vizuálním ověření průběhu růstové zóny jsme provedli odvrtání laterální poloviny stehenní kosti (obr. 32) uvedeným postupem dle pokusné skupiny. Rovněž implantace

Obr. 31: Obnažená distální epifýza femuru králíka (zdroj: archív autora).

Obr. 32: Provedení návrtu laterální části růstové zóny (zdroj: archív autora).

Obr. 33: Přenos MSCs z mikrotitrační destičky vodičem pro vrták (a) ve skafoldu do defektu vyvrtaném v distální epifýze femuru (b) (zdroj: archív autora).

29

MSCs (obr. 33 a, b) probíhala v závislosti na pokusné skupině. Sutura ran byla uzavřena po vrstvách vstřebatelným polyfilamentním vláknem (VICRYL©ETHICON). Stejným postupem byla vždy odvrtána i laterální část růstové zóny levého distálního femuru, která sloužila jako negativní kontrola. Pro zajištění termostability byly použity vodou vyhřívané podložky a po skončení zákroku bylo zvíře umístěno do termostabilního boxu nebo do blízkosti tepelného zářiče. Po operaci byla provedena antagonizace všech tří komponent anestezie kombinací látek naloxon (0,03 mg/kg (INTRENON Inj., Léčiva a.s.)) + flumazenil (0,1 mg/kg (ANEXATE, Hoffmann-La Roche Ltd.)) + atipamezol (1,0 mg/kg (ANTISEDAN Inj. Ad us. Vet., Pfizer Animal Health)) aplikovaných intramuskulárně.

Radiologické vyšetření Každý králík byl podroben rentgenovému vyšetření přístrojem Siemens. Rentgenové vyšetření bylo provedeno v den první operace a po utracení experimentálních zvířat. U skupin B a D bylo navíc toto vyšetření provedeno i po druhé operaci (v den transplantace MSCs). Hodnocení probíhalo na snímcích v předozadní projekci (obr. 34), na kterých byla měřena skutečná délka stehenní kosti, úhel valgózní deformity distálního femuru a jejich změny v průběhu experimentu. Měření probíhalo třemi nezávislými osobami a výslednou hodnotou byl aritmetický průměr všech tří hodnot. Každý králík byl podroben etapovému vyšetření magnetickou rezonancí (obr. 35) přístrojem Siemens 3 týdny po implantaci MSCs a v den utracení. Důvodem byla detekce paramagnetických nanočástic oxidu železa (Endorem) (obr. 36). V prvotní přípravě byly tyto částice endocytózou vpraveny do MSCs. V případě přežívání značených buněk v místě implantace se zobrazuje v oblasti laterálního kondylu tmavý artefakt (obr. 37, 38). V případě negativního nálezu není artefakt patrný (obr. 39, 40). Odstup vyšetření byl nutný, aby byl eliminován Obr. 34: Měření délky femuru (a) a úhel valgózní deformity (") z rentgenogramu (zdroj: rtg archív autora).

artefakt tvořený pooperačním hematomem. 30

Obr. 35: Laboratorní králík při vyšetření magnetickou rezonancí (C12) (zdroj: archív autora).

Obr. 36: MR obraz artefaktu v místě implantace MSCs označených železitým barvivem (D2) (zdroj: rtg archív autora).

Obr. 37: Paramagnetický kontrast ve vrtném kanálu laterálního kondylu distálního femuru – frontální řez (B5) (zdroj: rtg archív autora).

Obr. 39: Defekt laterálního kondylu distálního femuru – frontální řez (C13) (zdroj: rtg archív autora).

31

Obr. 38: Paramagnetický kontrast ve vrtném kanálu laterálního kondylu distálního femuru – sagitální řez (C8) (zdroj: rtg archív autora).

Obr. 40: Defekt laterálního kondylu distálního femuru – sagitální řez (C13) (zdroj: rtg archív autora).

Morfometrické měření obou stehenních kostí sloužilo jako kontrola měření radiologického. U všech kostí byl proměřen úhel valgózní deformity a stanovena přesná délka kosti. I zde byl dodržen postup tří nezávislých měření.

Histologické zpracování Po utracení králíků a vypreparování stehenních kostí byly resekáty distálního femuru přeneseny do roztoku 10 % pufrovaného formalínu a fixovány 72 hodin při pokojové teplotě. Takto zmenšené kosti byly uloženy samostatně do nádoby s nadbytkem formalínu, který byl vyměněn po 12 a pak po 24 hodinách. Po skončení fixace byly resekáty přeneseny do dekalcifikačního media (roztok kyseliny chlorovodíkové a chloridu železitého ve vodě) a v něm ponechány při pokojové teplotě. Medium bylo měněno každých 24 hodin. K dokonalému odvápnění došlo po 8–11 dnech. Následovalo řezání preparátů pomocí skalpelu středem původního návrtu ve stejném sklonu jako samotný návrt. Vznikly dvě části distálního femuru, které byly makroskopicky posouzeny a byly dále zpracovány standardní parafinovou histologickou technikou. Bloky byly řezány na saňovém mikrotomu, byly vytvořeny vždy dva řezy síly 4–6 mikrometrů z povrchu původního řezu skalpelem. Preparáty byly barveny hematoxylinem – eosinem, v další fázi Berlínskou modří (Pearlsova reakce) a jeden řez byl ponechán k imunofluorescenčnímu vyšetření. Pozorovány byly v mikroskopu Nikon Eclipse E 1000.

32

Statistické hodnocení

Wilcoxonův párový test (Wilcoxon matched pairs test) Jedná se o neparametrický párový test používaný pro analýzu párového experimentu, jehož data se neřídí normálním rozložením. Ze dvou výběrů párových dat se pro výpočet používají jejich diference, které již jsou jedním výběrem. Předpokládá se, že diference pocházejí ze spojitého rozdělení, které je symetrické okolo nějakého mediánu 2. Testuje se nulová hypotéza, že tento medián je rovný nule, tedy H0: 2 = 0. Diference párových hodnot di se v absolutní hodnotě seřadí do neklesající posloupnosti a přiřadí se jim pořadí, přičemž případy kdy di = 0 se vynechávají. Vytvoří se suma pořadí nezáporných prvků S+ a sumu pořadí záporných prvků S-. Při shodě pořadí se použije průměrné pořadí. Je-li menší číslo z dvojice S+ a Smenší nebo rovno tabelované hodnotě w (n, 0,05) nulová hypotéza se zamítá. Wilcoxonův párový test byl vypočten pomocí programu STATISTICA.

ROC analýza Provedení laboratorních testů v klinické praxi se dá matematicky popsat v termínech diagnostické přesnosti, nebo schopnosti testu korektně klasifikovat subjekty do klinicky relevantních skupin. Diagnostická přesnost totiž vypovídá o kvalitě testem stanovené informace. Každý diagnostický systém většinou „hledá“ nějaký konkrétní předem definovaný signál, a snaží se ignorovat nebo zamítnout ostatní „události“, nazývané šum. Diskriminace (teda správné zařazení pacienta do jedné z diagnostických skupin) nebývá perfektní, protože šum může být podobný signálu. Pozorovatel má pouze dvě možnosti: na základě vyšetření (testu) odpovědět ano nebo ne na diagnostickou otázku. Tyto odpovědi přitom samozřejmě buď odpovídají nebo neodpovídají skutečnosti. Událost, která ve skutečnosti nastává, i rozhodnutí na základě testu můžou nabývat dvou hodnot. Většinou hovoříme o pozitivitě a negativitě. V praxi pak nakonec nastávají 4 možné výsledky: – pozitivní událost je testem označená za pozitivní (pravdivá pozitivita; TP – true positive), – pozitivní událost je testem označená za negativní (FN – falešná negativita; false negative), – negativní událost je označená za pozitivní (falešná pozitivita; false positive), – negativní událost je označená za negativní (PN – pravdivá negativita; TN – true negative). 33

Výsledek testu + –

Skutečnost + – aTP bFP cFN dTN

Tab. 2: Kontingenční tabulka vyjadřující vztahy mezi diagnostickým rozhodnutím (výsledkem testu) a skutečností; a, b, c, d jsou počty jednotlivých výsledků, které nastaly.

Díky dvěma alternativním událostem, které můžou nastat, a dvěma korespondujícím diagnostickým rozhodnutím můžeme tyto výsledky zapsat do 2×2 kontingenční tabulky (tab. 2), kde a, b, c, d představují aktuální jednotlivé počty možných výsledků. 2×2 kontingenční tabulka je v ROC analýze nejpoužívanější metodou zápisu těchto vztahů.

Kdykoliv nastane pozitivní událost, diagnóza je buď pozitivní nebo negativní, a tedy falešně negativní proporce (FNP; anglicky FNF-false negative fraction) c/(a+c) je komplementem k pravdivě pozitivní proporci a/(a+c) (PPP; TPF – true positive fraction). Podobně kdykoliv nastane negativní událost, diagnóza je také buď pozitivní nebo negativní, a tak falešně pozitivní podíl (FPP; FPF – false positive fraction) b/(b+d) a pravdivě negativní podíl (PNP; TNF – true negative fraction ) d/(b+d) jsou taky komplementy.

Platí tedy: i) FNF + TPF = 1 » TPF = 1 - FNF ii)TNF + FPF = 1 » FPF = 1 - TNF

TPF se nazývá senzitivita a TNF specificita.

Dělící hranice Většina testů v praxi neodlišuje pozitivní a negativní případy se 100% přesností. To se projevuje v překrytí distribucí reálně pozitivních a reálně negativních případů (graf 1). Překrývající se plocha indikuje, kde test není schopný rozlišit negativní případ od pozitivního. Z toho důvodu se používá nějaká konkrétní dělící hranice, nazývaná cutpoint nebo cutoff level. Je to Graf 1: Ukázka překrytí distribucí reálně pozitivních a reálně negativních případů. Na ose x je hodnota testu, na ose y frekvence případů.

34

hranice, pomocí níž se diagnostik rozhoduje, které hodnoty označí za pozitivní

a které za negativní. Většinou všechny hodnoty, které „padnou“ pod určený cutoff level jsou označované za negativní a naopak. Pozice cutoff levelu podmiňuje počet falešně pozitivních a falešně negativních výsledků. Posunutím cutoff levelu doprava se sice sníží procento falešně pozitivních výsledků a zvýší se specificita (procento pravdivě negativních výsledků), zároveň se však zvýší i procento falešně negativních výsledků a sníží senzitivita (procento pravdivě pozitivních výsledků). Je tedy jasné, že s posouváním cutoff levelu se jednotlivé podíly mění a zvýšení kterékoliv pravdivé proporce zároveň přináší snížení té druhé. Zároveň snížení kterékoliv falešné proporce logicky vyústí do zvýšení frekvence druhé.

ROC křivka Jestli místo specificity vezmeme FPF, bude nám nová dvojice TPF a FPF růst a klesat společně. Pro každé rozhodovací kriterium teda existuje příslušná dvojice (FPF; TPF). Protože víme, že tyto dvě proporce určují všechny čtyři rozhodující podíly, stačí nám znát pouze tyto. Jestli změníme několikrát dělící hranici, zaznamenáme několik dvojic FPF a TPF. Jejich vynesením do grafu, kde osa x předGraf 2: Hypotetická ROC křivka vyjadřující závislost FPF a TPF. Diagonála představuje ROC křivku testu s diskriminační schopností rovnou náhodě (přesnost 0,5). Křivka nad ní je ROC křivka testu s přesností >> 0,5.

stavuje FPF a osa y TPF, dostaneme ROC křivku (Egan, 1975) (graf 2).

Pro ROC křivku platí:

• Obě osy grafu mají rozpětí od 0 do 1. • ROC ukazuje vztah mezi senzitivitou a specificitou. • Jestli test poskytuje nějakou informaci, prostřední body ROC křivky musí ležet v pravém horním rohu ROC prostoru. V opačné situaci by byl v případě reálné pozitivity pravděpodobnější negativní výsledek testu. 35

• Teoretický graf pro test s nulovou diskriminační schopností je diagonála vedoucí od levého dolního rohu do pravého horního rohu. Taková ROC křivka odpovídá testu, který zařazuje do jednotlivých skupin pouze náhodně. • Čím blíže je křivka k levému hornímu rohu ROC prostoru, tím je test přesnější. • Plocha pod křivkou je měřítkem přesnosti diagnostického testu.

Plocha pod ROC křivkou Plocha pod ROC křivkou, označovaná AUC (Area Under a Receiver Operating Characteristic Curve), je nejběžnějším kvantitativním indexem popisujícím ROC křivku a zároveň elegantním a jednoduchým nástrojem vyjadřujícím přesnost diagnostického systému. Nepoužívá žádné předpoklady o distribučních funkcích testovaných veličin. Index diskriminační přesnosti AUC se označuje A a jeho hodnota se pohybuje od 0,5 do 1. V případě, že test nemá žádnou diskriminační schopnost, ROC leží na hlavní diagonále a A = 0,5. Naopak, A = 1 označuje perfektní diskriminaci a je to případ, kdy ROC křivka kopíruje pravý horní roh ROC prostoru. AUC se nejčastěji definuje podle (Green and Swets, 1966), kteří ukázali, že plocha pod ROC křivkou koresponduje s pravděpodobností správného zařazení, který z dvou stimulů je šum, a který signál.

Jestli máme k dispozici několik testů, které poskytují závěr o té samé diagnostické úloze, porovnání jejich příslušných ROC křivek ukáže, který z nich je výhodnější nebo jinak přesnější. ROC křivky se tedy používají i pro porovnání jednotlivých testů.

ROC analýza byla provedena v software MedCalc.

Binomický test Úspěšnost zavedení kmenových buněk byla testována pomocí binomického testu s alternativní hypotézou: pravděpodobnost úspěchu je menší než očekávaná pravděpodobnost úspěchu. Očekávaná úspěšnost zavedení byla 75 %. Binomický test se používá na testování nulové statistické hypotézy, která tvrdí, že podíl určité hodnoty proměnné v základním souboru je rovný dané konstantě. Test teda zodpovídá otázku, jestli je možno na základě vzorku tvrdit, že podíl v základním souboru je rovný určitému číslu (příp. je větší nebo menší než zadané číslo). 36

Je-li p-hodnota nižší než zvolená hladina významnosti (tradičně 5 % = 0,05), nulová hypotéza se zamítá a přijímá se alternativní. Znamená to, že rozdíl mezi zadanou konstantou a podílem vypočteným ze vzorku je příliš velký na to, aby mohl být pouze důsledkem náhodného výběru, je teda statisticky významný. Je-li p-hodnota rovná nebo vyšší než zvolená hladina významnosti, nulovou hypotézu není možné zamítnout. Znamená to, že rozdíl mezi zadanou konstantou a podílem vypočteným ze vzorku může být pouze důsledkem náhodného výběru, není teda statisticky významný. P-hodnota testu se počítá z binomického rozdělení pro parametry p = očekávaný podíl základního souboru, n = velikost vzorku, k = četnost zkoumaného znaku vzorku. Více informací než samotný test, poskytuje intervalový odhad podílu, protože určuje hranice, ve kterých se s danou pravděpodobností (nejčastěji 95 %) vyskytuje podíl základního souboru. Binomický test a výpočet intervalu spolehlivosti byl proveden pomocí programu R.

POSTUP PŘI EXPERIMENTU BYL ZCELA V SOULADU S ETICKÝMI NORMAMI POKUSŮ NA ZVÍŘATECH.

37

VÝSLEDKY

Skupina A – Prevence vzniku kostního můstku – autologní transplantace

Velikost souboru: n = 10 králíků. Růst a deformaci stehenních kostí u ošetřených a neošetřených nožek králíků graficky znázorňuje graf 3. Číslo Rozdíl v délce Rozdíl valgózní Potvrzení přítomnosti MSCs Potvrzení Potvrzení králíka operovaného deformity magnetickou rezonancí přítomnosti přítomnosti a neoperova- operovaného (P) MSCs imunoMSCs ného femuru a neoper. (L) fluorescencí Pearlsovou 3 týdny 4 měsíce (cm) femuru reakcí po implantaci po implantaci P L

Potvrzení přítomnosti MSCs histologickým vyšetřením

A1

0,40

1

4

+

+

+

+

++

A2

0,20

1

5

+

+

+

+

+++

A3

0,10

0

0

+

+

+

+

++

A4

0,20

1

5

+

+

+

+

++

A5

0,40

0

2

+

+

+

+

+

A6

0,10

1

6

+

+

+

+

+++

A7

0,40

1

4

+

+

+

+

+

A8

0,40

4

11

+

+

+

+

++

A9

0,20

1

11

+

+

-

-

-

A10

0,00

2

6

+

+

+

+

++

Tab. 3: Výsledky implantace MSCs do defektu růstové zóny pravého distálního femuru.

Uvedené výsledky (tab. 3) ukazují, že operovaný femur se prodloužil více do délky než femur neoperovaný, rovněž valgózní deformita byla výraznější u neoperovaného femuru. Vyšetření magnetickou rezonancí nám v obou časových odstupech prokázalo přítomnost železitého barviva zobrazením artefaktu v místě implantace značených MSCs. Bylo nutné prokázat, zda se jedná pouze o barvivo, nebo skutečně o viabilní buňky s inkorporovaným uvedeným barvivem. Tento průkaz byl nadále prováděn histologickým vyšetřením. V klasickém barvení H-E jsme popsali přítomnost chondrocytů ve vytvořeném defektu ve třech úrovních (obr. 41a) – fokusy chrupavky (+), vyplnění hyalinní chrupavkou bez naznačené 38

Obr. 41: Histologické vyšetření, barvení HE, zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem). 41a: Šipky ukazují ojedinělé ostrůvky chrupavky v defektu růstové chrupavky (A5). 41b: Červená šipka ukazuje průběh růstové zóny, černá šipka hyalinní novotvořenou chrupavku ve vytvořeném defektu (A4). 41c: Červená šipka ukazuje průběh růstové zóny, černá šipka místo původního defektu, vyplněné novotvořenou chrupavkou a naznačenou sloupcovitou formací (A6).

sloupcovité formace (obr. 41b) (++) a vyplnění hyalinní chrupavkou s naznačenou sloupcovitou formací (obr. 41c) (+++). Definitivní potvrzení, že se jedná skutečně o námi implantované buňky proběhlo Pearlsovou reakcí, kdy se obarvením zobrazila granula původně do MSCs implantovaného železitého barviva Endorem (obr. 42), a imunofluorescencí, kdy došlo k obarvení části membrán chondrocytů (obr. 43). Imunofluorescenční barvivo podléhá poměrně rychlému vydělování, proto došlo k obarvení jen některých buněk, a to ještě jen části jejich stěny, což potvrzuje aktivní dělení a další přežívání původních buněk. Histologické vyšetření levého distálního femuru dávalo v naprosté většině obraz kostního můstku (obr. 44).

Statistické hodnocení skupiny A Na hladině významnosti 5 % se podařilo prokázat významný rozdíl v růstu stehenní kosti mezi ošetřenými a neošetřenými nožkami (p = 0,018), ošetřené nožky rostou významně více než 39

Obr. 42: Granula Resovistu v cytoplazmě chondrocytů (A4) diferencovaných z MSCs – Pearlsova reakce – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 43: Imunofluorescenční barvivo DiI na membránách chondrocytů (A8) diferencovaných z MSCs – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 44: Kostní můstek v oblasti růstové zóny levého distálního femuru (A10) – zvětšení 20× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

40

Graf 3: Porovnání růstu (A) a deformace (B) stehenní kosti u levé neošetřené (0) a pravé ošetřené (1) nožky, n = 10.

Graf 4: Úspěšnost zavedení kmenových buněk. Zavedení bylo úspěšné v 80 % případů (95% Interval spolehlivosti: 49–94 %).

Graf 5: ROC křivky pro porovnání 3 vyšetření.

41

Metoda

Plocha pod ROC křivkou Senzitivita Specificita (Interval spolehlivosti)

Magnetická 0,854 (IS: 0,625; 0,968) 89 % rezonance Imunobarve0,899 (IS: 0,681; 0,984) 89 % ní Pearlsova 0,899 (IS: 0,681; 0,984) 89 % metoda

neošetřené. Na hladině významnosti 5 % se také podařilo prokázat rozdíl

82 %

v deformitě mezi ošetřenými a neošet-

91 %

řeným nožkami (p = 0,018) (graf 3B).

91 %

Ošetřené nožky jsou výrazně méně de-

Tab. 4: Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs.

formované než neošetřené.

Analýza úspěšnosti zavedení kmenových buněk Na hladině významnosti 5 % se nepodařilo zamítnout nulovou hypotézu, můžeme proto říct, že dosažená úspěšnost 80 % je větší nebo rovna očekávané úspěšnosti (p = 0,756). Interval spolehlivosti pro dosaženou úspěšnost je 49–94 %. IS vymezuje rozsah hodnot, kterých můžeme nabýt při opakování pokusu za stejných podmínek a při stejném n.

Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs Plocha pod ROC křivkou určuje přesnost metody, z čehož vyplývá, že Pearlsova metoda a Imunobarvení se zdají být přesnější než magnetická rezonance, avšak tyto rozdíly jsou nevýznamné (p = 0,425 pro porovnání MR a imunobarvení a MR a Pearlsovy metody; p = 1 pro porovnání Pearlsovy metody a imunobarvení). Výsledky viz tab. 4 a graf 5.

42

Skupina B – Léčba kostního můstku – autologní transplantace

Velikost souboru: n = 8 králíků. Růst a deformaci stehenních kostí u ošetřených a neošetřených nožek králíků graficky znázorňuje graf 6. Číslo Rozdíl v délce Rozdíl valgózní Potvrzení přítomnosti MSCs Potvrzení Potvrzení králíka operovaného deformity operomagnetickou rezonancí přítomnosti přítomnosti a neoperova- vaného (P) a neMSCs imunoMSCs ného femuru operovaného (L) fluorescencí Pearlsovou (cm) femuru reakcí 3 týdny 4 měsíce po implantaci po implantaci P L


B1

0,30

0

8

+

+

+

+

++

B2

0,10

0

2

+

+

+

+

+

B3

0,10

0

6

+

+

+

+

++

B4

0,50

1

1

+

+

+

+

+

B5

-0,10

0

1

+

+

+

+

+

B6

0,20

1

2

+

+

+

+

+++

B7

0,80

1

2

+

+

+

+

+

B8

0,00

3

12

+

+

+

+

++


Uvedené výsledky (tab. 5) ukazují, že operovaný femur se prodloužil více do délky než femur neoperovaný, rovněž valgózní deformita byla výraznější u neoperovaného femuru. Vyšetření magnetickou rezonancí nám v obou časových odstupech prokázalo přítomnost železitého barviva zobrazením artefaktu v místě implantace značených MSCs. Bylo nutné prokázat, zda se jedná pouze o barvivo, nebo skutečně o viabilní buňky s inkorporovaným uvedeným barvivem. Tento průkaz byl nadále prováděn histologickým vyšetřením. V klasickém barvení H-E jsme popsali přítomnost chondrocytů ve vytvořeném defektu podobně jako ve skupině A ve třech úrovních – fokusy chrupavky (+), vyplnění hyalinní chrupavkou bez naznačené sloupcovité formace (++) (obr. 45) a vyplnění hyalinní chrupavkou s naznačenou sloupcovitou formací (+++) (obr. 46). Definitivní potvrzení, že se jedná skutečně o námi implantované buňky proběhlo Pearlsovou reakcí, kdy se obarvením zobrazila granula původně do MSCs implantovaného železitého barviva (Endorem), a imunofluorescencí, kdy došlo k obarvení části membrán chondrocytů. 43

Obr. 45: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu (B3) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 46: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu a náznak organizace do struktury růstové zóny (B6) – zvětšení 100× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 47: Kostní můstek v oblasti růstové zóny levého distálního femuru (B2) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

44


Graf 7: Úspěšnost zavedení kmenových buněk. Zavedení bylo úspěšné v 87,5 % případů (95% Interval spolehlivosti: 53–99 %).

Graf 8: ROC křivky pro porovnání 3 vyšetření.

45

Imunofluorescenční barvivo podléhá poměrně rychlému vydělování, proto došlo k obarvení jen některých buněk a to ještě jen části jejich stěny, což potvrzuje aktivní dělení a další přežívání původních buněk. Histologické vyšetření levého distálního femuru dávalo v naprosté většině obraz kostního můstku (obr. 47).

Statistické hodnocení skupiny B I když z grafu je patrný jistý rozdíl v růstu stehenní kosti mezi ošetřenými a neošetřenými nožkami, na hladině významnosti 5 % se tento rozdíl prokázat nepodařilo (p = 0,059) (graf 6A). Na hladině významnosti 5 % se naopak podařilo prokázat rozdíl v deformitě mezi ošetřenými a neošetřeným nožkami (p = 0,028). Nožky po ošetření jsou méně zdeformované než nožky bez léčby (graf 6B).

Analýza úspěšnosti zavedení kmenových buněk Metoda


Magnetická rezonance

0,817 (IS: 0,549; 0,960)

78 %

86 %

Imunobarvení 0,817 (IS: 0,549; 0,960)

78 %

86 %

Pearlsova metoda

78 %

86 %

0,817 (IS: 0,549; 0,960)


Na hladině významnosti 5 % se nepodařilo zamítnout nulovou hypotézu, můžeme proto říct, že dosažená úspěšnost 87,5 % je větší nebo rovna očekávané úspěšnosti (p = 0,8999). Interval spolehlivosti pro dosaženou úspěšnost je 53–99 %. IS vymezuje

rozsah hodnot, kterých můžeme nabýt při opakování pokusu za stejných podmínek a při stejném n.

Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs Plocha pod ROC křivkou určuje přesnost metody, z čehož plyne, že mezi metodami není rozdíl (p = 1). Výsledky viz tab. 6 a graf 8.

46

Skupina C – Prevence vzniku kostního můstku – allogenní transplantace

Velikost souboru: n = 14 králíků. Růst a deformaci stehenních kostí u ošetřených a neošetřených nožek králíků graficky znázorňuje graf 9. Číslo Rozdíl v délce Rozdíl valgózní Potvrzení přítomnosti MSCs Potvrzení Potvrzení králíka operovaného deformity operomagnetickou rezonancí přítomnosti přítomnosti a neoperova- vaného (P) a neMSCs imunoMSCs ného femuru operovaného (L) fluorescencí Pearlsovou 3 týdny 4 měsíce (cm) femuru reakcí po implantaci po implantaci P L


C1

0,10

2

3

+

+

+

+

++

C2

0,30

0

11

+

+

+

+

++

C3

0,00

-1

6

+

+

+

+

++

C4

0,20

1

4

+

+

+

+

+

C5

0,30

5

5

+

+

+

+

+

C6

-0,20

-2

2

+

+

+

+

++

C7

0,40

9

11

+

+

+

+

+++

C8

0,20

7

2

+

+

+

+

++

C9

0,30

3

1

+

+

-

+

+++

C10

0,10

10

6

+

+

+

+

++

C11

0,10

12

11

+

+

+

+

+++

C12

0,20

0

2

+

+

+

-

-

C13

0,00

0

1

+

+

+

+

+

C14

-0,10

-3

15

+

+

+

+

++

Tab.7: Výsledky implantace MSCs do defektu růstové zóny pravého distálního femuru.

Uvedené výsledky (tab. 7) ukazují, že léčený femur se prodloužil většinou více do délky než femur neoperovaný, rovněž valgózní deformita byla většinou výraznější u neoperovaného femuru. Vyšetření magnetickou rezonancí nám v obou časových odstupech prokázalo přítomnost železitého barviva zobrazením artefaktu v místě implantace značených MSCs. Bylo nutné prokázat, zda se jedná pouze o barvivo, nebo skutečně o viabilní buňky s inkorporovaným uvedeným barvivem. Tento průkaz byl nadále prováděn histologickým vyšetřením. V klasickém barvení H-E jsme popsali přítomnost chondrocytů ve vytvořeném defektu ve třech úrovních – fokusy chrupavky (+) (obr. 48), vyplnění hyalinní chrupavkou 47

Obr. 48: Fokusy novotvořené chrupavky ve vrtném defektu (C4) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 49: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu (C1) – zvětšení 20× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 50: Prorůstání novotvořené chupavky defektem růstové zóny (C10) – zvětšení – 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

48



Graf 11: Graf ROC křivek pro porovnání 3 vyšetření.

49

bez naznačené sloupcovité formace (++) (obr. 49, 50) a vyplnění hyalinní chrupavkou s naznačenou sloupcovitou formací (+++). Definitivní potvrzení, že se jedná skutečně o námi implantované buňky proběhlo Pearlsovou reakcí, kdy se obarvením zobrazila granula původně do MSCs implantovaného železitého barviva (Endorem), a imunofluorescencí, kdy došlo k obarvení části membrán chondrocytů. Imunofluorescenční barvivo podléhá poměrně rychlému vydělování, proto došlo k obarvení jen některých buněk, a to ještě jen části jejich stěny, což potvrzuje aktivní dělení a další přežívání původních buněk. V jednom případě (C9) i přes pozitivní nález v klasickém histologickém obraze nebyla potvrzena přítomnost imunofluorescenčního barviva CM-DiI. Vysvětlením může být skutečnost, že se barvivo velmi rychle vyděluje a podléhá rychlému rozpadu. Z tohoto důvodu nemusí být vždy v preparátu po čtyřech měsících zachyceno. V jednom případě nebyly nalezeny v klasickém histologickém obraze žádné chondrocyty (C12) a falešná pozitivita ostatních vyšetření (IFS, MR) byla pravděpodobně způsobena zbytky barviva v okolní tkáni. Je třeba uvést, že žádnému z králíků nebyla aplikována žádná forma imunosuprese. Přesto nedošlo ani k jednomu případu akutní nebo chronické rejekce transplantátu makroskopicky ani histologicky – sledováno histologické propojení tkáně a event. přítomnost lymfocytárního infiltrátu. Histologické vyšetření levého distálního femuru dávalo v naprosté většině obraz kostního můstku.

Statistické hodnocení Skupina C Na hladině významnosti 5 % se podařilo prokázat rozdíl v růstu stehenní kosti mezi ošetřenými a neošetřenými nožkami (p = 0,041) (graf 9A). Na hladině významnosti 5 % se rovněž podařilo prokázat rozdíl v deformitě mezi ošetřenými a neošetřeným nožkami (p = 0,018) (graf 9B).

Analýza úspěšnosti zavedení kmenových buněk Na hladině významnosti 5 % se nepodařilo zamítnout nulovou hypotézu, můžeme proto říct, že dosažená úspěšnost 86 % je větší nebo rovna očekávané úspěšnosti (p = 0,899). Interval spolehlivosti pro dosaženou úspěšnost je 60–95 %. IS vymezuje rozsah hodnot, kterých můžeme nabýt při opakování pokusu za stejných podmínek a při stejném n. 50

Metoda

Plocha pod ROC křivkou (Interval spolehlivosti)

Senzitivita

Specificita


0,937 (IS: 0,777; 0,991)

100 %

87,5 %

Imunobarvení

0,896 (IS: 0,721; 0,977)

92 %

87,5 %

Pearlsova metoda

0,969 (IS: 0,823; 0,994)

100 %

94 %


Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs Pearlsova metoda se zdá být nejpřesnější, následována magnetickou rezonancí. Poslední je metoda imunobarvení, avšak tyto rozdíly se ukázaly být jako nevýznamné (p = 0,530 pro porovnání MR a imunobarvení; p = 0,582 pro porovnání MR a Pearlsovy metody; p = 0,282 pro porovnání Pearlsovy metody a imunobarvení). Výsledky viz tab. 8 a graf 11.

51

Skupina D – Léčba kostního můstku – alogenní transplantace

Velikost souboru: n = 18 králíků. Růst a deformaci stehenních kostí u ošetřených a neošetřených nožek králíků graficky znázorňuje graf 12. Číslo Rozdíl v délce Rozdíl valgózní Potvrzení přítomnosti MSCs Potvrzení Potvrzení králíka operovaného deformity operomagnetickou rezonancí přítomnosti přítomnosti a neoperova- vaného (P) a neMSCs imunoMSCs ného femuru operovaného (L) fluorescencí Pearlsovou 3 týdny 4 měsíce (cm) femuru reakcí po implantaci po implantaci P L


D1

-0,10

0

1

+

+

+

+

++

D2

0,50

0

3

+

-

-

-

-

D3

0,00

1

8

+

+

+

+

++

D4

0,40

1

-2

+

+

+

+

+

D5

0,40

0

12

+

+

+

+

+

D6

0,30

1

17

+

+

+

+

++

D7

-0,10

0

17

+

+

+

+

+++

D8

-0,20

0

10

+

+

+

+

++

D9

-0,50

0

5

+

+

-

+

+++

D10

0,40

1

2

+

+

+

+

++

D11

0,10

0

17

+

-

-

-

D12

-0,60

1

23

+

+

+

-

+

D13

-0,60

0

-1

+

+

+

+

++

D14

-0,20

2

8

+

+

+

+

++

D15

0,50

1

12

+

+

+

+

+

D16

0,80

0

18

+

-

+

+

-

D17

0,10

0

14

-

+

+

+

++

D18

-0,30

1

15

+

-

+

+

-


Uvedené výsledky (tab. 9) ukazují, že léčený femur se neprodloužil přesvědčivě více do délky než femur neoperovaný, valgózní deformita naopak byla většinou výraznější u neoperovaného femuru. Vyšetření magnetickou rezonancí nám v obou časových odstupech prokázalo přítomnost železitého barviva zobrazením artefaktu v místě implantace značených MSCs. Bylo nutné prokázat, zda se jedná pouze o barvivo, nebo skutečně o viabilní buňky s inkorporovaným uvedeným barvivem. Tento průkaz byl nadále prováděn histologickým vyšetřením. V klasickém barvení H-E jsme popsali přítomnost 52

Obr. 51: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu (D14) – zvětšení 100× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 52: Granula Resovistu v cytoplazmě chondrocytů (D13) diferencovaných z MSCs – Pearlsova reakce – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

Obr. 53: Imunofluorescenční barvivo DiI na membránách chondrocytů (D5) diferencovaných z MSCs – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem).

53



Graf 14: Graf ROC křivek pro porovnání 3 vyšetření.

54

chondrocytů ve vytvořeném defektu ve třech úrovních – fokusy chrupavky (+), vyplnění hyalinní chrupavkou bez naznačené sloupcovité formace (obr. 51) (++) a vyplnění hyalinní chrupavkou s naznačenou sloupcovitou formací (+++). Definitivní potvrzení, že se jedná skutečně o námi implantované buňky proběhlo Pearlsovou reakcí, kdy se obarvením zobrazila granula původně do MSCs implantovaného železitého barviva (Endorem) (obr. 52), a imunofluorescencí, kdy došlo k obarvení části membrán chondrocytů (obr. 53). Imunofluorescenční barvivo podléhá poměrně rychlému vydělování, proto došlo k obarvení jen některých buněk, a to ještě jen části jejich stěny, což potvrzuje aktivní dělení a další přežívání původních buněk. V jednom případě (D9) i přes pozitivní nález v klasickém histologickém obraze nebyla potvrzena přítomnost imunofluorescenčního barviva CM-DiI. Vysvětlením může být skutečnost, že barvivo se velmi rychle vyděluje a podléhá rychlému rozpadu. Z tohoto důvodu nemusí být vždy v preparátu po čtyřech měsících zachyceno. Je třeba uvést, že žádnému z králíků nebyla aplikována žádná forma imunosuprese. Přesto nedošlo ani v jednom případě k akutní nebo chronické rejekci transplantátu makroskopicky ani histologicky – sledováno histologické propojení tkáně a event. přítomnost lymfocytárního infiltrátu. Histologické vyšetření levého distálního femuru dávalo v naprosté většině obraz kostního můstku.

Statistické hodnocení skupiny D Na hladině významnosti 5 % se nepodařilo prokázat rozdíl v růstu stehenní kosti mezi ošetřenými a neošetřenými nožkami (p = 0,91) (graf 12A). Na hladině významnosti 5 % se naopak podařilo prokázat rozdíl v deformitě mezi ošetřenými a neošetřeným nožkami (p = 0,001) (graf 12B).

Analýza úspěšnosti zavedení kmenových buněk Na hladině významnosti 5 % se nepodařilo zamítnout nulovou hypotézu, můžeme proto říct, že dosažená úspěšnost 87 % je větší nebo rovna očekávané úspěšnosti (p = 0,96). Interval spolehlivosti pro dosaženou úspěšnost je 67–97 %. IS vymezuje rozsah hodnot, kterých můžeme nabýt při opakování pokusu za stejných podmínek a při stejném n. 55

Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs Pearlsova metoda se zdá být nejpřes-

Metoda



0,917 (IS: 0,775; 0,982) 89 %

95 %

Imunobarvení 0,833 (IS: 0,672; 0,936) 78 %

89 %

barvení, avšak tyto rozdíly se ukázaly

Pearlsova metoda

89 %

být jako nevýznamné (p = 0,135

0,833 (IS: 0,672; 0,936) 78 %

nější, následována magnetickou rezonancí. Poslední je metoda imuno-

pro porovnání MR a imunobarvení;

Tab.10: Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs.

p = 0,135 pro porovnání MR a Pearlsovy metody; p = 1 pro porovnání Pearlsovy metody a imunobarvení). Výsledky viz tab. 10 a graf 14. Sledujeme vysokou pozitivitu průkazu přítomnosti implantovaných MSCs metodou magnetické rezonance ve všech pokusných skupinách v obou časových intervalech. Pozitivním výsledkem testu se rozumí přítomnost typického artefaktu tvořeného nanočásticemi železa v distálním femuru, kam byly implantované MSCs značené Resovistem a naopak nepřítomnost artefaktu v levém, neimplantovaném distálním femuru. Rovněž sledujeme vysokou pozitivitu průkazu přítomnosti implantovaných MSCs Pearlsovou reakcí ve všech pokusných skupinách v obou časových intervalech. Pozitivním výsledkem testu se rozumí přítomnost typických modrých granulí v cytoplazmě chondrocytů v preparátech distálního femuru, kam byly implantované MSCs značené Resovistem a naopak nepřítomnost Pearlsovy reakce v levém, neimplantovaném distálním femuru. Chrupavka organizující % se v růstovou % zónu

Celkem

Fokusy chrupavky

%

Velké plochy chrupavky

Kostní můstek

%

Pozitivita pokusu celkem

%

A

10

2

20

5

50

2

20

1

10

9

90

B

8

2

25

3

36

1

12

2

25

6

75

C

14

2

14

7

50

3

21

2

14

12

86

D

18

4

22

8

44

2

11

4

22

14

78

Kostní můstek

%

Pozitivita pokusu celkem

%

Tab. 11: Podrobné výsledky histologie u jednotlivých skupin – pravý femur.

Chrupavka organizující % se v růstovou % zónu

Celkem

Fokusy chrupavky

%

Velké plochy chrupavky

A

10

2

20

0

0

0

0

8

80

8

80

B

8

1

13

0

0

0

0

7

87

7

87

C

14

0

0

0

0

0

0

14

100

14

100

D

18

1

6

0

0

0

0

17

94

17

94

Tab. 12: Podrobné výsledky histologie u jednotlivých skupin – levý femur.

56

Do třetice sledujeme vysokou pozitivitu průkazu přítomnosti implantovaných MSCs imunofluorescencí ve všech pokusných skupinách v obou časových intervalech. Pozitivním výsledkem testu se rozumí přítomnost imunofluorescenčního barviva na membránách chondrocytů v preparátech distálního femuru, kam byly implantované MSCs značené barvivem DiI a naopak nepřítomnost imunofluorescenčního barviva v levém, neimplantovaném distálním femuru. Výsledky histologie přehledněji shrnují následující tabulky 11 a 12. Obě detailněji rozdělují nález histologický, kdy „nejhorším“ pozitivním nálezem byl nález izolovaných fokusů chrupavky v místě vytvořeného defektu při současném pozitivním testu alespoň dvou z uvedených tří průkazních metod (IFS, MR nebo Pearlsova reakce). V defektu levé stehenní kosti jsme neočekávali žádnou novotvorbu chrupavčité tkáně, v ojedinělých případech byly zaznamenány separované chondrocyty, spíše jako součást hojivé reakce okolních tkání.

57

Statistické shrnutí

Metoda



0,890 (IS: 0,812; 0,944) 89,5 %

88,5 %

Imunobarvení 0,859 (IS: 0,775; 0,920) 83 %

88,5 %

Pearlsova metoda

90 %

0,879 (IS: 0,799; 0,936) 85 %

Tab. 13: Porovnání jednotlivých metod pro potvrzení přítomnosti MSCs – celá studie.

Provedli jsme ROC analýzu na sloučených datech jednotlivých metod ze všech experimentů. Magnetická rezonance se zdá být nejpřesnější, následována Pearlsovou metodou. Poslední je metoda imunobarvení, avšak tyto rozdíly se uká-

Experiment

N

Růst

Deformace

zaly být jako nevýznamné (p = 0,248

prevence auto

8

p = 0,018

p = 0,018

pro porovnání MR a imunobarvení;

léčba auto

7

p = 0,059

p = 0,028

prevence allo

12

p = 0,041

p = 0,018

léčba allo

16

p = 0,910

p = 0,001

Tab. 14: Tabulka p-hodnot pro porovnání růstu a deformace stehenních kostí mezi ošetřenými a neošetřenými nožkami u všech experimentů.

p = 0,679 pro porovnání MR a Pearlsovy metody; p = 0,490 pro porovnání Pearlsovy metody a imunobarvení). Výsledky viz tab. 13 a graf 15.

Jak je vidět z tab. 14, na hladině významnosti 5 % se podařilo prokázat významný rozdíl v růstu stehenní kosti mezi ošetřenými a neošetřenými nožkami u obou (allogenní i autogenní transplantace) preventivních zákroků (p = 0,018 pro auto, p = 0,045 pro allo). Naopak ani u jednoho léčebného zákroku se nepodařilo prokázat rozdíl v růstu nožek. Rozdíl v deformaci se podařilo prokázat u obou léčebných zákroků (p = 0,028 pro auto, p = 0,001 pro allo) i u obou autotransplantačních zákroků (p = 0,018, p = 0,018).

Graf 15: Graf ROC křivek pro porovnání 3 vyšetření, data ze všech experimentů.

58

Mohlo by se z toho vyvozovat, že na růst kosti má pozitivní vliv pouze preventivní zákrok. Kostní deformita je naopak průkazně pozitivně ovlivněna jak zákrokem léčebným, tak preventivním (obr. 54, 55). Úspěšnost implantace (obr. 56, 57, 58) byla u všech experimentů větší nebo rovna očekávané úspěšnosti implantace (75 %). Nulovou hypotézu se nám nepodařilo zamítnout ani v jednom experimentu (tab. 15). Co se týče přesnosti metod, ani v jednom z experimentů nebyla prokázána významná odchylka v přesnosti mezi Obr. 54: Patrná valgózní deformace distální epifýzy levého femuru králíka (zdroj: rtg archív autora).

metodami.

Obr. 55: Patrná valgózní deformace distální epifýzy levých femurů králíků (zdroj: rg archív autora).

Experiment

N

Úspěšnost implantace MSCs

p-hodnota

prevence auto

8

80 % (49–94 %)

0,756

léčba auto

7

87,5 % (53–99 %)

0,8999

prevence allo

12

86 % (60–95 %)

0,899

léčba allo

16

87 % (67–97 %)

0,96

Tab. 15: Tabulka úspěšnosti implantace kmenových buněk u všech experimentů.

59

Obr. 56: Záplava úspěšně novotvořené chrupavky z transplantovaných MSCs (A1) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno – se souhlasem).

Obr. 57: Záplava úspěšně novotvořené chrupavky z transplantovaných MSCs v mezibuněčné hmotě (B6) – zvětšení – 100× (zdroj: PAÚ FN Brno – se souhlasem).

Obr. 58: Úspěšně novotvořené chondrocyty z MSCs (C4) – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno – se souhlasem).

60

Diskuse

Obecně platí, že defekty v růstové ploténce mohou mít za následek kostní můstek a omezení růstu a deformaci končetin. Podle statistických analýz rozsáhlých souborů činí průměrná incidence poranění v oblasti růstové ploténky 18 %, s častější lokalizací na horní končetině. Nejčastěji postiženou oblastí je distální femur a proximální tibie. Následky bývají většinou ve formě zkrácení, nebo angulace kosti (Mizuta, 1987). Fraktury v oblasti růstové zóny (physeal fractures) patří mezi závažná a relativně častá poranění kostí u dětí i u rostoucích zvířat. U dětí představují poranění RP 20 % všech případů zlomenin (Rogers, 1970) s tím, že četnost poranění jednotlivých lokalizací se liší. Epifyzeolýza distálního radia tvoří asi 20 %, traumata proximální růstové zóny humeru, epifyzeolýzy distální tibie a fibuly, humeru a femuru 2–10 % všech poranění kostí (Ashcraft, 2005). U psů bývá růstová ploténka postižena přibližně ve čtvrtině až třetině případů fraktur dlouhých kostí končetin, přičemž predominuje poranění typu Salter-Harris II (Dvořák et al., 2000; Maretta and Schrader, 1983; Salter and Harris, 1963). Nejčastější jsou u psů epifyzeolýzy distálního femuru, co do četnosti poranění růstových zón pak následují epfyzeolýzy distálního humeru, proximálního femuru, distální ulny a proximální a distální tibie (Maretta and Schrader, 1983). V diagnostice kromě klinického a rutinního morfometrického vyšetření jednoznačně přebírá klíčovou roli magnetická rezonance. Dnes je toto vyšetření zcela suverénní diagnostickou metodou při tomto typu poranění. Je výhodné provádět toto vyšetření již v akutní fázi úrazu a poté opakovaně v celém průběhu léčby (Futami, 2000). Magnetická rezonance by se tak vzhledem k výtěžnosti metody měla stát rutinním postupem nejen při poranění v oblasti růstové ploténky a při diagnostice kostního můstku, ale i při osteochondrálních poraněních, avulzních poraněních, stresových zlomeninách a závažných poraněních měkkých tkání (Ecklund, 2002). Jako prevence vzniku kostního můstku po poranění růstové ploténky bylo použito již mnoho materiálů jako interpositum po resekci můstku. Autologní tuk (Langeskiöld, 1967; Österman, 1972), sval (Martiana et al., 1996), polymerní silikon (Cambell et al., 1959; Bright, 1974; Macksout and Bright, 1989; Lee et al. 1993), kostní vosk (Broughton, 1989) a kostní cement (Klassen, 1982). Nejčastěji je asi používán autologní tuk, 61

i když metoda je velmi komplikovaná a ne vždy přináší výborné léčebné výsledky. Hasler (2002) uvádí z celkového počtu 24 pacientů u 14 dosažení špatných výsledků. Magnetická rezonance ukázala jak nekompletní resekci můstku, tak nekompletní obnovení. Metody léčby kostního můstku jsou v podstatě dvě. První z nich řeší ortopedickou cestou deformity končetin, jak již bylo zmíněno v úvodu. Další cestou je krátkodobá zástava růstu na nepostižené straně k vyrovnání délky končetin. Lze ji provádět i perkutánní metodou, která je zcela bezpečná bez komplikací neurovaskulárních a bez následných zlomenin. Svoje zkušenosti s léčbou 42 pacientů uvádí (Horton, 1996). Experimentální práce se zabývaly i implantací chrupavčité a periostální tkáně do defektů v růstové ploténce tibie u ovce. Při srovnání obou materiálů lépe vyhovovala tkáň chrupavky, při užití periostu se rychle vytvořila kostní formace (Wirth, 1994). Využití transplantace chondrocytárních graftů má svoje počátky v léčbě osteochondrálních lézí, a to především ve formě mozaikové artroplastiky. Metoda, která byla dříve označována za vysoce perspektivní se postupně stala zcela rutinní (Peterson, 2002; Makino, 2001; Ochi, 2002). Kromě oblasti kolenního kloubu se tato technika postupně rozšířila i do oblasti hlezenního kloubu (Mendicino, 2001) a talu (Kish, 1999). Metodu transplantace chondrocytů do defektu v růstové ploténce popsal patrně jako první Foster et al. v roce 1990. V experimentální práci autoři na ovcích testovali možnost výplně defektu růstové ploténky transplantací autologních chondrocytů na kolagenovém nosiči. Postupně bylo zjištěno, že chondrocytární kultura pokračuje v proliferaci, udržuje si strukturu chrupavky a obnovuje architektoniku růstové zóny. V dalších studiích byly postupně vyzkoušeny jiné nosiče autologních chondrocytů – agaroza (Lee, 1993), atelocollagen gel (Tobita et al., 2002). Výsledky v této studii naznačují možnost preventivního a léčebného použití autogenních MSCs jejich implantací do defektu poškozené růstové chrupavky u králíka, a to před vytvořením kostního můstku, která může být příčinou zkrácení kosti a její angulární deformity. Novozélandský bílý králík je vhodným a běžně používaným experimentálním modelem pro tento typ studie (Fen Chen et al., 2003; Steven et al., 2003; Lee et al., 2004). Separace MSCs probíhala z krve kostní dřeně odebrané z kyčelní kosti, což je vhodné a nejčastější místo odběru a současně nejběžnější způsob jejího získávání (Quintavalla et al., 2002; Wang et al., 2006; Juncova-Melvin et al., 2006). Další publikovanou metodou 62

získávání MSCs je jejich izolace z periostálních bloků (Fen Chen et al., 2003; Caplan, 2005), nebo odběr z podkožního tuku břišní stěny (Hui et al., 2005). Kultivované MSCs byly stimulovány k diferenciaci směrem k chondrocytům podle popsaného protokolu (Miura, 2002) v a-MEM médiu s přídavkem lidského rekombinantního TGF-ß1. Kultivační médium bylo rovněž obohaceno o 1 % ITS, dexametazon a ascorbát-2-fosfát. Jedná se o všeobecně používanou součást kultivačního a diferenciačního media (Li et al., 2005; Lisignoli et al., 2005; Indrawattana et al., 2004; Quintavalla et al., 2002). V některých pracích byl k diferenciaci MSCs s dobrými výsledky použit rovněž TGF-ß3 (Lee et al., 2004; Chen et al., 2004), popřípadě i v kombinaci s BMP-6 nebo IGF-1 (Indrawattana et al., 2004). V naší studii jsme s ohledem na dosud možné nejasnosti v roli těchto faktorů a načasování okamžiku jejich použití k ovlivnění diferenciace MSCs zvolili samotný TGF-ß1, jehož použití je obecně uznávanou metodou ovlivnění diferenciace mesenchymálních kmenových buněk v chondrocyty (Lisignoli et al., 2005; Li et al., 2005; Hui et al., 2005). Zvolili jsme přitom koncentraci 100 ng/nl TGF-ß1 s dobou působení na MSCs v médiu 30 minut (Miura, 2002). Tyto vyšší koncentrace uvedeného faktoru (TGF-ß1) jsou v současné době doporučovány (Lisignoli et al., 2005; navíc Hui et al., 2005 použil i 1000 ng/ml). Obecně je velkým problémem správné načasování přidávání jednotlivých růstových a diferenciačních faktorů. Dnes je již podrobně popsáno, které z nich startují proces diferencicace směrem k chondrocytární linii a které působí v dalších fázích celého procesu. Předmětem studia je nyní právě správná časová posloupnost při in vitro diferenciaci tak, aby se vytvářené podmínky co nejvíce blížily skutečným podmínkám in vivo. Řešením by možná mohla být kombinovaná implantace chondrocytů společně s MSCs. Jako nosič mesenchymových kmenových buněk a médium dávající předpoklady pro jejich uchycení v poškozené tkáni (růstové ploténce) byl vytvořen skafold, jehož základem byl hyaluronid sodný, kolagen typu I, ITS a Tissucol. Jde o trojsložkový skafold, který je vhodnější než dvousložkový, protože se více blíží složení mezibuněčné hmoty chrupavčité tkáně, navíc je biokompatibilní, netoxický a biodegradabilní, vstřebává se do 6 týdnů (Filova et al. 2006, personal communication). Skafold slouží transplantovaným buňkám jako adhezívní plocha, zabezpečuje jejich výživu v počáteční fázi transplantace příjemci, a poskytuje transformační faktory k vývoji MSCs do požadovaného buněčného typu. Vyvinutý nosič byl vůči použitým buňkám netoxický a kmenové buňky v něm byly vitální až do doby jeho resorpce (6 týdnů). Studie věnující se zkoumání vlastností jiných skafoldů 63

předkládají strukturálně a kvalitativně odlišné možnosti. Nejčastěji je využívána kombinace PGA-PLA (Polyglycolic acid-Polyactic acid) ve skafoldu v různých poměrech. Zkušenosti s implantací tohoto nosiče v kombinaci s MSCs jsou dobré, hlavní oblastí použití je kloubní povrch (Cohen et al., 2003; Chen et al., 2004; Uematsu et al., 2005). Námi použitý skafold byl výhodnější pro použití pro prostředí růstové chrupavky. Prostředí RP je na rozdíl od chrupavky na kloubním povrchu specifické v tom, že ze všech stran kolem je kost, a otvor lze na povrchu kosti uzavřít biokeramikou. Při experimentech na kloubním povrchu byl jako základ pro skafold rovněž použit kolagen typu II (Nehrer et al., 1998), tento však zatím nebyl použit s indikací pro transplantaci MSCs do RP. Strukturálně odlišnou variantou jsou fibrózní skafoldy na bázi nanovláken (průměr vlákna 700 nm) z poly-g-caprolactonu (PCL), u kterého je při implantaci s MSCs a TGFß1 rovněž popsána dobrá rekonstrukce chrupavčité tkáně. Značení buněk v našem experimentu směřovalo k průkazu toho, zda je novotvořená tkáň produktem námi implantovaných autogenních MCSs, nebo zda se defekt vyplňuje jinými buňkami (hojivá reakce z okolí). Průkaz implantovaných buněk in vivo umožňovala detekce paramagnetických částic oxidu železa (Resovist) při vyšetření magnetickou rezonancí T1 a T2 váženými časy se sekvencí upravenou na zvýraznění hyposignálu oxidem železa značených MSCs. Charakter novotvořené chrupavčité tkáně a ověření, zda se jedná o hyalinní chrupavku strukturálně podobnou chrupavce růstové ploténky bylo založeno na histologickém vyšetřením. Diferenciaci buněčných populací při pokusech in vitro lze sledovat více metodami. Často používaná PCR je založena na průkazu exprese genů pro kolagen II. typu a genů pro aggrecan (Chen et al., 2004; Lisignoli et al., 2005), výjimečně i na průkaz exprese genů pro kolagen IX. typu (Lisignoli et al., 2005). Další metodou průkazu MSCs je barvení Safraninem O nebo Toluidinovou modří (Chen et al., 2004; Ležet al., 2004) pro průkaz kolagenu II. typu. Mezi metody identifikace MSCs patří i imunohistochemie – průkaz protilátek proti kolagenu typu II a anti-proteoglykanových protilátek (Chen et al., 2004; Lisignoli et al., 2005; Lee et al., 2004). S ohledem na převážně klinickou orientaci specifika našeho experimentu jsme výše uvedené metody nepoužili, nehledě na vysokou cenu těchto průkazů. Základní význam pro ověření účinnosti implantace autogenních MSCs do defektu růstové chrupavky má klinické hodnocení růstu a valgózní deformace distální epifýzy stehenní kosti. Očekávali jsme, že pravý femur s defektem růstové ploténky a transplantovanými 64

MSCs do defektu RP bude delší a méně deformovaný (popřípadě bez deformace), než levý femur s defektem RP bez transplantace MSCs. K podobným výsledkům dospěli i jiní autoři (Fen Chen et al., 2003; Ahn et al., 2004; Hui et al., 2005), kteří ovšem pracovali s proximální růstovou zónou tibie. Histologické vyšetření probíhalo po utracení experimentálních zvířat a zpracování histologických bloků obou distálních femurů. V levé distální růstové zóně femuru jsme očekávali novotvořené kostní trámce jako základ kostního můstku, který nahradil původní tkáň růstové chrupavky. Zde nebyla transplantována směs nosiče a MSCs. V pravé distální růstové zóně femuru jsem očekávali vyplnění defektu co největším množstvím chondrocytů, v lepším případě naznačení organizace k obnovení růstové zóny nebo již částečně restaurovanou růstovou zónu. Imunofluorescenční barvivo CM-DiI bylo viditelné v imunofluorescenčním mikroskopu, barvivo Resovist reaguje s Berlínskou modří Pearlsovou reakcí. Jejich přítomnost v místě defektu jasně dokazuje původ buněk z implantovaných MSCs. Imunofluorescenční barvivo podléhá poměrně rychlému vydělování, proto došlo k obarvení jen některých buněk, a to ještě jen části jejich stěny, což potvrzuje aktivní dělení a další přežívání původních buněk. Výsledky naší práce naznačují, že transplantace autogenních mesenchymálních kmenových buněk do místa iatrogenního porušení RP brání vzniku kostního můstku. Na rozdíl od původně užitých kultivovaných autologních chondrocytů (Gál et al., 2002) odpadá odběr štěpu z vlastní nezátěžové plochy kloubu a je nahrazen prostým odběrem krve kostní dřeně. Další možnosti terapie parciálních defektů růstové zóny dnes nabízí i bioengeniering (Lee et al., 2003). Mesenchymální kmenové buňky jsou dnes žhavou aktualitou výzkumu a probíhající experimenty využívají jejich pluripotence k léčbě všech mezodermálních tkání – kloubní povrchy, kosti, myokard apod. V průběhu experimentů se všeobecně obrací pozornost od autogenních k allogenním transplantacím MSCs. Naprostá většina studií potvrzuje naše výsledky, že allogenní transplantace mesenchymálních kmenových buněk nevyžaduje žádnou formu imunosupresivní léčby (Plumas et al., 2005; Frank et al., 2004; Liechty et al., 2000). Naopak popisují imunomodulační efekt MSCs, který sám o sobě vede k imunosupresi inaktivací CD4+ T lymfocytů nebo indukci apoptózy aktivovaných T lymfocytů (Plumas et al., 2005). Uvedená imunomodulační schopnost MSCs je v další studii (Frank et al., 2004) posunuta ještě o krok dál, kdy se této vlastnosti úspěšně použilo při léčbě 65

systémového onemocnění (scleroderma, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis and systemic lupus erythematosus). Implantované allogenní MSCs indukovaly určitý druh imunosuprese využitý v léčbě těchto autoimunitních chorob (Laar et al., 2006). Imunotolerance mesenchymálních kmenových buněk byla rovněž popsána i u xenotransplantací. Již v roce 2000 provedli úspěšnou transplantaci lidských MSCs do ovčího fetu in utero (Leichty et al., 2000). Šlo o originální myšlenku vystavit nevyvinutý imunitní systém ovčího plodu účinkům xenotransplantátu. Další studie popisují xenotransplantaci lidských buněk do kostí laboratorních krys nebo transplantaci myších MSCs do tkáně dospělých plně imunokompetentních krys (Saito et al., 2002). Ani zde nebyla popsána žádná rejekce transplantátu. Uvedené výsledky mohou být návodem ke scénáři, kdy bude možné allogenní nebo xenologní mesenchymální kmenové buňky získávat, in vitro množit a kryokonzervovat pro potřeby okamžitého použití, a to vše bez potřebné imunosuprese. Absence imunosuprese může být do budoucna důležitou vlastností této léčby, která tak bude moci být aplikována nejen ve specializovaných transplantačních centrech, ale i v zařízeních primární péče. I přes tyto pozitivní výsledky zůstává nezodpovězena spousta otázek. Jednak bude třeba další studie s ověřením u jiných, větších zvířecích druhů před klinickou aplikací. Rovněž bude nutné prověřit jiné nosiče pro stejnou nebo lepší integraci MSCs do cílových tkání. V neposlední řadě je potřeba provést dlouhodobější sledování zvířat s implantovanými MSCs z hlediska možných nežádoucích komplikací kmenových buněk. Naše studie je svým rozsahem daným počtem experimentálních operací, způsobem provedení a zvoleným materiálem ojedinělá. Její klinický význam je umocněn tím, že je příslibem obdobných výsledků u větších zvířat (sele, miniprase) a úspěšně tak směřuje ke klinické aplikaci v humánní medicíně.

66

Závěr

Preventivní i léčebná autologní i allogenní transplantace MSCs do parciálního defektu růstové zóny statisticky významně zamezuje vzniku kostních deformit a preventivní zákrok rovněž eliminuje omezení růstu kosti. Histologicky lze jasně prokázat uchycení transplantátu MSCs, diferenciaci v hyalinní chrupavku a vyplnění defektu růstové zóny. V ojedinělých případech došlo k restauraci růstové ploténky. I přes velmi příznivé výsledky je třeba pokračovat v ověření metody u jiných zvířecích druhů před klinickou aplikací. V neposlední řadě je potřeba provést dlouhodobější sledování zvířat s implantovanými MSCs z hlediska možných nežádoucích komplikací kmenových buněk. Jako velmi vhodné se jeví prověřit možnost použití jiných skafoldů. Souhrn výsledků získaných řešením tohoto experimentálního úkolu by měl odpovědět na otázky, které byly stanovany jako cíle práce. Výsledky studie potvrzují alternativní pracovní hypotézu a jasně prokazují, že MSCs jsou schopné in vivo diferenciace v chrupavčité buňky růstové zóny, produkce mezibuněčné hmoty a zamezí tak vzniku růstových deformit dlouhých kostí u dětí.

1. Vypracování metodiky experimentálního operačního postupu Metodika operačního postupu byla detailně propracována a výše popsána, úspěšnost se po celkové analýze výsledků blíží 100 %.

2. Specifikace zdroje a dalšího zpracování kmenových buněk včetně značení Jako zdroj kmenových buněk byla velmi úspěšně zvolena kostní dřeň, která se jeví jako ideální i pro další experimenty a klinickou aplikaci. Pro zpracování kmenových buněk včetně jejich značení byl zvolen osvědčený a výše popsaný postup používaný v Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV. Postupy se jeví velmi úspěšné vzhledem k prezentovaným výsledkům a pro laboratoře odpovídající úrovně pohodlně zvládnutelné. Rovněž cenová dostupnost je vyhovující. 67

3. Vyhodnocení léčebných výsledků metody s využitím různých druhů verifikace (radiologická, morfometrická, klinická, histologická) Vyhodnocení proběhlo všemi uvedenými metodami a analýza výsledků je předmětem předkládané disertační práce.

4. Doporučení dalších kroků aplikace závěru experimentu do klinické humánní praxe Vzhledem k povzbudivým výsledkům doporučujeme provést identický experiment na modelu prasete před započetím klinických studií. Jako velmi vhodné se jeví prověřit možnost použití jiných skafoldů.

Konečný cíl PROPRACOVÁNÍ EXPERIMENTÁLNÍ TECHNIKY TRANSPLANTACE MESENCHYMÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK DO DEFEKTŮ V OBLASTI RŮSTOVÉ PLOTÉNKY TAK, ABY MOHLA BÝT PŘEVEDENA DO DALŠÍ ČÁSTI KLINICKÝCH STUDIÍ BYLO PODLE NÁZORU AUTORA SPLNĚNO. BYL NALEZEN OPTIMÁLNÍ ZDROJ KMENOVÝCH BUNĚK, OPERAČNÍ TECHNIKA VEDLA K VELMI PŘESVĚDČIVÝM VÝSLEDKŮM OVĚŘENÝCH SOUBOREM LABORATORNÍCH METOD A KLINICKÝCH HODNOCENÍ.

68

Literatura

1. Ahn JI, Canale TS, Butler SD, Hasty KA 2004: Stem cell repair of physeal cartilage. Journal of Orthopaedic Research 22: 1215-1221

2. Alsberg E, Anderson KW, Albeiruti A, Rowley LA, Mooney DL 2002: Engineering growing tissues. Proc N atl Acad Sci, 19: 12025-12030

3. Anderer U, Libera L 2002: In vitro engineering of human autogenous cartilage. Bone Miner Res, 8: 1420-1429

4. Arnold I. Caplan 2005: Review: Mesenchymal Stem Cells: Cell-Based Reconstructive Therapy in Orthopedics. Tissue Engineering 11: 1198

5. Ashcraft KW 2005: Pediatric Surgery. 4th ed. Elsevier Saunders, Philadelphia, pp 229-231

6. Bagatur AE, Dogan A, Zorer G 2002: Correction of deformities and length discrepancies of the forearm in children by distraction osteogenesis. Acta Orthop Traumatol Turc, 36 (2): 111-116

7. Bak K, Boeckstyns M 1997: Epiphysiodesis for bilateral irregular closure of the distal radial physis in a gymnast. Scand. Med. Sci Sports, 7: 363-66.

8. Bright RW 1974: Operative correction of partial epiphyseal plate c10sure by osseousbridge resection and silicone-rubber implant. An experimental study in dogs. Bone loint Surg (Am), 56: 655-664

9. Brighton CP, Hunt RM 1991: Early histological and ultraslructural changes in medullary Fracture callus. Bone Joint Surg, 73: 832-47

69

10. Broughton NS, Dickens ORV, Cole WG, Menelaus MB 1989: Epiphysiolysis for partial growth plate arrest. Bone loint Surg (Br), 71: 13-16

11. Byers S, Rooden LC, Foster SK 1997: Structural changes in the large proteoglycan, aggrecan, in different zones of the ovine growth plate. CalcifTissue Int, 60 (1): 71-8

12. Cambell CL, Grisolia A, Zanconato G 1959: The effects produced in the cartilafinous epiphyseal plate of immature dogs by experimental surgical trauma. Bone loint Surg (Am), 41: 1221-1242.

13. Caparrelli DJ, Cattaneo B, Shake JG 2001: Cellular cardiomyoplasty with al1ogeneic mesenchymal stem cells resuita in improved cardiac performance in a mne model of myocardial infarction. Circulation, 104: 11-599.

14. CaplanAI 1987: Bone development and repair. Bioessays; 6: 171-5

15. Carrig CB ET AL. 1975: Effects of asynchronous growth of the radius and ulna on the canine elbow joint following experimental retardation of longitudinal growth of the ulna. J Am Anim Hosp Assoc 77: 560

16. Chen F, Chao Y, Shang Q 1998: Advances in the research on repairing cartilaginous defects of synovial joint. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,12 (5): 297-300

17. Chen G, Liu D, Tadokoro M, Hirochika R, Ohgushi H, Tateishi T, Tanaka J 2004: Chondrogenic diferentiation of human mesenchymal stem cells cultured in cobweb-like biodegradable scaffold. Biochemical and Biophysical Research Communications, 322: 50-55

18. Chen MB, James BS, Hui HP, Chan WK, Lee EH 2003: Cultured mesenchymal stem cell transfers in the treatment of partial growth arrest. Journal of Pediatric Orthopaedics, Philadelphia, 23: 425-429

70

19. Cohen SB, Meirisch CM, Wilson HA, Diduch DR 2003: The use of absorbable co-polymer pads with alginate and cells for articular cartilage repair in rabbits. Biomaterials 24: 2653-2660

20. Cook L, WilIiams N, Kreeger M, Peacock T, Tomlinson L 2003: Biocompatibility of three-dímensional chondrocyte grafts in large tibial defects of rabbits. Am 1 Vet Res, 64 (I): 12-20

21. Cool WP, Carter SR, Grimer R, TilIman RM, Walker PS 1997: Growth after extendible endoprosthetic replacementof the distal femur. Bone Joint Surg Br, 79 (6): 938-942

22. Cooper AP 1832: A treatise on dislocations and fractures of the joints. Boston, Lilly, Wait, Carter & Hendee, 1832.

23. Cottalorda J, Jouvc JL, Bollini G, Panuel M, Guisiano B, Jimeno MT 1996: Epiphyseal distraction and centrally located bone bar: an experimental study in the rabbit. J Pediatr Orthop., 16: 664-8

24. Desault P: A treatise on fractures, luxations, and other affections of the bones. Philadelphia, Kimber & Konrad, 1811.

25. Dupuytren BG. On the injuries and diseases of bon es. London, Sydenham Society, 1847.

26. Dvořák M, Nečas A, Zatloukal J 2000: Complications of long bone fracture healing in dogs: functional and radiological criteria for their assessment. Acta vet. Brno 69: 107-114

27. Ecklund K 2002: Magnetic resonance imaging ofpediatric musculoskeletal trauma. Top Magn Reson lmaging,13 (4): 203-217

28. Ferguson D, Alpern E, Miclau T, Helms JA 1999: Does adult fracture repair recapitulate embryonic skeletal formation. Mech. Dev., 87: 57-66

71

29. Foster BK, Johnstonc EW 2000a: Management oF growth plate injuries. In: Benson M, Fixsen J, MaCnicol M, Parsch K, editors. Paedialric orthopaedics and Fractures. London: Harcourt Publishers

30. Foster BK, Hansen AL, Gibson G, Hopwood L, Binns GF, Wiebkin OW 1990: Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep. Orthop Res, 8: 554-64.

31. Foster BK, Lohn B, Hasler C 2000b: Free fat interpositional graft in acute physeal injuries: the antícipatory langenskiold procedure. Pediatr Orthop, 20 (3): 282-285

32. Ford LT, Key JA 1956: A study of experimental trauma to the distal femoral epiphysis in rabbits. Bone Joint Surg [Am], 38: 84-92

33. Fortier LA, Nixon AJ, WilIiams L, Cable CS 1998a: Isolatíon and chondrocytic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Am Vet Res, 59(9): 1182-1187

34. Fortier LA, Brofman Pl, Nixon AJ, Mohammed HO 1998b: Disparate chondrocyte metabolism in three-dimensional fibrin cultures derived from autogenous or commercially manufactured fibrinogen. Am Vet Res, 59 (4): 514-520

35. Fox SM 1984: Premature closure of distal radial and ulnar physes in the dog. Part I. Pathogenesis and diagnosis. Compend Contin Educ, Pract Vet 6: 128

36. Frank MH, Sayegh MH 2004: Adult stem cells in the treatment of autoimmune diseases. The Lancet, 363: 1411-1412

37. Futami T, Foster BK, Morris LL, LeQuesne GW 2000: Magnetic resonance imaging of growth plate injuries: the efficacy and indications for surgical procedures. Arch Orthop Trauma Surg, 120(7-8): 390-396

72

38. Gál P, Macháček R 1999a: Miniinvazivní osteosyntéza při poranění dolní končetiny u dětí. Lék obz, 48: 99-102

39. Gál P, Macháček R 1999b: Miniinvazivní osteosyntéza zlomenin horní končetiny u dětí. Acta chirurgicae orthopedicae et traumat., 66, 165-170

40. Gál P, Nečas A, Adler J, Teyschl O, Fabián P, Bibrová Š 2002: Transplantation of the Autogenous Chondrocyte Graft to Physeal Defects: An Experimental Study in Pigs. Acta Vet Brno 71: 327-332

41. Gál P, Teyschl O, Kecová H, Fabián P, Bibrová Š 2002: Influence of Transphyseal Pin Placement on Bone Growth: An Experimental Study in Pigs. Acta Vet Brno, 71: 319-325

42. Gál P, Nečas A 1993: Miniinvazivní osteosyntéza při poranění laterální fýzy kondylu u dětí. Lék obz, 48: 145-148

43. Gál P, Tecl F, Macháček R 1999c: Srovnání výsledků léčby miniinvazivní a otevřené osteosyntézy při poranění proximálního radia v dětském věku. Rozhl.Chir., 78: 500-504.

44. Gál P, Tecl F 1999d: Injury to the lateral clavicle in children and adolescents. Surg Childh Intern, VII: 17-21

45. Gál P, Tecl F, Skotáková J 1999e: Zlomeniny a fyzární poranění proximálního konce humeru u dětí. Acta Chir Orthop Traum Čech, 66: 95-100

46. Gál P 1999f: Poranění ínterkondylické eminence u dětí. Lék. Obz., 48: 87-90

47. Gál P 1999g: Úskalí, selhání a komplikace miniinvazivní osteosyntézy v dětské traumatologii Zpr. Úraz. Chir., 7: 1-8.

48. Gál P, Ondrus S, Planka L, Straka M, Fialova D 2006: Synthetic biocompatible and bioresorbable materials in juvenile bone cysta treatment. European Journal of Trauma 32 73

49. Garces GL, Garay M, Coviella LGN, Guerado E 1994: Growth-plate modifications after drilling. J Pediatr Orthop, 14: 225-8.

50. Gibson G, Lin DL, Francki K, Caterson B, Foster B 1996: Type X collagen is colocalized with a proteoglycan epitope to form distinct morphological structures in bovine growth cartilage. Bone, 19: 307 15.

51. Gomes LSM, Volpon JB, Goncalvcs RP 1988: Traumatic separation of epiphyses. An experimental study in rats. Clin Orthop, 236: 286-95.

52. Goodman SB, Bauer TW, Carter D, Casteleyn PP, Goldstein SA, Kyle RF, Larsson S, Stankewich CJ, Swiontkowski MF, Tencer AF, Yetkinler DN, Poser RD 1998: Norian SRS Cement Augmentation in Hip Fracture Treatment. Laboratory and Initial Clinical Results. Clin Orthop 348: 42-50

53. Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert C, Sittinger M 2002: A tissue-engineering model for the manufacture of auricularshaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol, 259 (6): 316-321

54. Hansen AL, Foster BK, Gibbon GJ 1990: Growth - plate chondrocyte cultures for reimplntation into growth-plate defects in Wheel: characterisation of culture. Clin Ortho., 256: 286-298

55. Hasler CC, Foster BK 2002: Secondary tethers after physeal bar resectíon: a common source of failure. Clin Orthop 2002, 405: 242-9

56. Havránek P. Dětské zlomeniny. Corvus, Praha, 1991

57. Henney LH, Gambardella PC 1989: Premature closure of the ulnar physis in the dog: A retrospective clinical study. J Am Anim Hosp 25: 573

74

58. Horas U, Schnettler R, Pelinkovic D, Herr G, AignerT 2000: Osteochondral transplantation versus autogenous chondrocyte transplantatíon. A prospective comparatíve c1inical study. Chírurg, 71 (9): 1090-1097

59. Horton GL, Olney BW 1996: Epiphysiodesis of the lower extremity: results of the percutaneous technique. J Pediatr Orthop, 16 (2): 180-182

60. Houle JB, Letts M, Yang J 2001: Effects of a tensíoned tendon graft in a bone tunnel across the rabbit physis. Clin Orthop., 391: 275-281

61. Hove LM, Engesaeter LB 1997: Corrective osteotomies after injuries of the distal radial physis in children. J. Hand. Surg.[Br], 22: 699-704

62. Hui JHP, Li L, Teo YH, Ouyang HW, Lee EH 2005: Comparative study of the ability of mesenchymal stem cells derived from bone marrow, periosteum, and adipose tissue in treatment of partial growth arrest in rabbit. Tissue engineering 11: 904-912

63. Indrawattana N, Chen G, Tadokoro M, Shann LH, Ohgushi H, Tateishi T, Tanaka J, Bunyaratvej A 2004: Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell. Biochemical and Biophysical Research Communications 320: 914-919

64. Janarv PM, Wikström B, Hirsch G 1998: The influence of transphyseal drilling and tendon grafting on bone growth: an experimental study in the rabbit. J PediatrOrthop, 18 (2): 149-154

65. Johnstone EW, Lea PB, Byers S, Hopwood JJ, Foster BK 2000: Metaphyseal factors promote calcium incorporation in physeal chondrocyte cultures. J Orthop Sci, 5 (6): 593-599

66. Johnstone EW, McArthur M, Solly PB, Higginson K, Byers S, Foster BK 2002: The effect of osteogenic protein-l in an in vivo physeal injury model. Clin Orthop, 395: 234-240

75

67. Jouve JL, Cottalorda J, Mottet V, Frayssinet P, Petit P, Bollini G 1998: Reimplantation of growth plate chondrocyte cultures in central growth plate defects: Part II. Surgical experimentation in rabbits. J Pediatr Orthop, 7(2): 174-178

68. Jouve JL, Mottet V, Cottalorda J, Frayssinet P, Bollini G 1998: Reimplantation of growth plate chondrocyte cultures in central growth pl.ate defects: Part I. Characterization of cultures. J Pediatr Orthop B, 7 (2): 167-173

69. Key JA, Ford LT 1958: A study of experimental trauma to the distal femoral epiphysis in rabbits-II. J Bone Joint Surg [Am] 40: 887-896.

70. Kish G, Modis L, Hangody L 1999: Osteochondral mosaicplasty for the treatment of focal osteochondral lesions of the knee and talus in the athlete. Rationale, indications, techniques, and results. Clin Sports Med, 18 (1): 45-66

71. Klassen RA, Peterson MA 1982: Excision of physeal bars: The Mayo Clinicexperience 1968-1978. OrthopTrnns, 2: 65

72. Kleinman PK, Marks SC Jr 1998: A regional approach to the classie metaphyseal lesion in abused infants: the distal femur. AJRAm J Roentgenol, 170 (1): 43-47

73. Kopylov P, Runnqvist K, Jonsson K, Aspenberg P 1999: Norian SRS Versus External Fixation in Redisplaced Distal Radial Fractures. A Randomized Study in 40 Patients. Acta Orthop Scand 70(1):1-5

74. Laar JM, Tyndall A 2006: Reparative Osteogenesis during Transplantation of Mesenchymal Stem Cells. Rheumatology, 45: 1187

75. Laervon L 1984: Skelet traumata im Wachstumsalter. Hefte Unfalheilk. Spinger, Berlin-Heidelberg

76

76. Langenskiold A 1981: Surgical treatment ofpartial closure of the growth plate. J. Pediatr. Orth, 11: 3-11.

77. Langenskiold A 1975: An operation for partial closure of an apophyseal plate in children, and its experimental basis. Bone Joint Surg. [Br], 57: 325-330

78. Langenskiold A 1967: The possibilities of eliminating premature partial closure of an epiphyseal plate caused by trauma or disease. Acta Orthop Scand, 38: 267-279

79. Lee EH, Gao GX, Bose K 1993: Management of partial growth arrest: physis, fat, or silasties J Pediatr Orthop, 13: 368-72

80. Lee EH, Chen F, Chan J, Bose K 1998: Treatment of growth arrest by transfer of cultured chondrocytes into physeal defects. J PediatrOrthop, 18: 155-60

81. Lee EH, Hui JHP 2006: Bone-Marrow Stem Cells as a Source for Cell Therapy. Journal of Bone and Joint Surgery. (British volume), 88: 841

82. Lee JW, Kim YH, Kim SH, Han SH, Hahn SB, Yonsei 2004: Chondrogenic Differentiation of Mesenchymal Stem cells and its clinical applications, Medical Journal 45: 41-47

83. Lee KM, Lok AS Cheng, Cheung WH, Lui PPY, Ooi V, Fung KP, Leung PC, Leung KS 2003: Bioengineering and Characterization of Physeal Transplant with Physeal Reconstruction Potential. Tissue engineering 9: 703-711

84. Lennox DW, Goldner RD, Sussman MD 1983: Cartilage as an interposition material to prevent transphyseal bone bridge formation: an experimental model. J Pediatr Orthop 3: 207-10.

85. Li WJ, Tuli R, Okafor C, Derfoul A, Danielson KG, Hall DJ, Tuan RS 2005: A threedimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials 26: 599-609 77

86. Liechty KW, MacKenzie TC, Shaaban AF 2000: Human mesenchyma1 stem cells engraft and demonstrate sitaspecific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med, 11: 1282-1286.

87. Lisignoli G, Cristino S, Piacentini A, Toneguzzi S, Grossi F, Cavallo C, Zini N, Solimando L, Naraldi NM, Ficchini A 2005: Cellular et molecular events dutiny chondrogenesis of human mesenchymalstromal cells grown in three-dimensional hyaluronan based scaffold. Biomaterials 26: 5677-5686.

88. Lo IK, Kirkley A, Fowler PJ, Miniaci A 1997: The outcome of operatively treated anterior cruciate ligament disruptions in the skeletally immature child. Arthroscopy, 5: 627-634

89. MacKenzie TC, Flake AW 2002: Human mesenchymal stem cells: insights from a surrogate in vivo assay system. Cells Tissues Organs, 171 (1): 90-95

90. Macksoud WS, Bright R 1989: Bar resection and siIastic interposition in distal radial physeal arrest. Orthop Trans, 13: 1-2.

100. Makino T, Fujioka H, Kurosaka M, Matsui N, Yoshihara H, Tsunoda M, Mizuno K 2001: Histologie analysis of the implanted cartilage in an exact-fit osteochondral transplantation model. Arthroscopy, 17 (7): 747-51

101. Manfra-Maretta SM, Schrader SC 1983: Physeal injuries in the dog: A review of 135 cases. J Am Vet Med Assoc 182: 708-710

102. Mann DC, Rajmaira S 1990: Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2650 long-bone fractures in children aged 0~ 16 years. J Pediatr Orthop, 10: 713

103. Martiana K, Low CK, Tan SK, Pang MW 1996: Comparison of various interpositional materials in the prevention of transfyseal bone bridge formation. Clin. Orthop., 325: 218-24.

78

104. Mehls O, Himmele R, Kiepe O, Klaus G 2001: The interaction of glucocorticoids with the growth hormone-insulin-like growth factor and its effects on growth plate chondrocytes and bone cells. J Pediatr Endocrinol Metab, 14 Suppl 6: 1475-82

105. Mendicino RW, Catanzariti AR, Hallivis R 2001: Mosaicplasty for the treatment of osteochondral defects of the ankle joint. Clin Pediatr Med Surg, 18(3): 495-513

106. Métaizeau JP 1983: L 'ostéosznthese chey r enfant: techniques et indications. Rev. chir. ortop., 69: 495-511.

107. Metaizeau JP, Prevot J, Schmitt M 1980: Reduction et fixation des fractures et decollements epiphyssaires de la tete radial par broche centromedullaire. Rev. Chir. Ortop., 66: 47-49

108. Miura Z., Parvizi J., Fitzsimmons JS et al. 2002: Brief exposure to high-dose transforming growth factor-beta1 enhances periosteal chondrogenesis in vitro: a preliminary report. J Bone Joint Surg. 84-A (5): 793-799

109. Mizuta T, Benson WM, Foster BK, Paterson DC, Morris LL 1987: Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. J Pediatr Orthop, 7 (5): 518-523

110. Motoki OS, Mulliken JB 1990: The healing of bone and cartilage. Clin Plast Surg, 17 (3): 527-44

111. Natalia Juncosa-Melvin, Gregory P. Boivin, Marc T. Galloway, Cindi Gooch et al 2006: Effects of Cell-to-Collagen Ratio in Stem Cell-Seeded Constructs for Achilles Tendon Repair. Tissue Engineering 12: 681

112. Nehrer S, Breinan HA, Ramappa A, Hsu HP, Minas T, Shortkroff S, Sledge CB, Yannas IV, Spector M 1998: Chondrocyte seeded collagen matrices implanted in chondral defectin a canine model. Biomaterials 19: 2313-2328

79

113. Nečas A, Dvořák M 2003: Surgical treatment of a saggital intraarticular femoral head fracture with coxofemoral dislocation in two mature dogs. Acta Vet. Brno 72: 261-265

114. Nwakama AC, Peterson HA, Shaughnessy WJ: 2000: Fishtail deformity following frncture of the distal humerus in children: historical review, case presentations, discussioll of etiology, and thoughts on treatment. J Pediatr Orthop B. 9 (4): 309-18

115. Ochi M, Uchio Y, Kawasaki K, Wakitani S, Iwasa L 2002: Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment of cartilage defects of the knee. J Bone Joint Surg Br, 84 (4): 571-578

116. Osterman K 1972: Operative elimination of partial premature eiphyseal c1osure. An exmperimental study. Acta Orthop Scand, Suppl 147: 3-79.

117. Pare A 1634: The workers of that famous chirurgion ambroise pare. Translated by Johnson T. 1 st English ed., London, Thomas Coates & R. Young

118. Park. JS, Ahn JI, Oh DI 1994: Chondrocyte allograft transplantation for damaged growth plate reconstruction. Yonsei Med., 5: 567-572

119. Parsch KD 1997: Modern trends in internal fixation of femoral shaft fractures in children. A critical review. J Pediatr Orthop B, 6 (2): 117-125

120. Passaretti D, Silverman RP, Huang W, Kirchhoff CH, Ashiku S, Randolph MA, Yaremchuk MJ 2001: Cultured chondrocytes produce injectable tissue-engineered cartilage in hydrogel polymer. Tissue Eng, 7(6): 805-815

121. Pelinkovic D, Horas U, Engelhard M, Lee LY, Huard J, Fu FH 2002: Gene therapy for cartilage repair. Z Orthop lhre Grenzgeb, 140(2): 153-159

122. Pešl T, Havránek P 1995: Poranění distální fýzy femuru u dětí. Zp. Úraz. chir., 3: 12-15

80

123. Peterson L, Brittberg M, Kiviranta I, Akerlund EL, Lindahl A 2002: Autologous chondrocyte transplantation. Biomechanics and long-term durability. Am J Sports Med, 30 (1): 2-12

124. Petit P, Panuel M, Faure F, Jouve JL, Bourliere-Najean B, Bollini G, Devred P 1996: Acute fracture of the distal tibial physis: role of gradient-echo MR imaging versus plain film examination. Am J Roentgenol, 166 (5): 1203-6

125. Piermattei DL, Flo GL 1990: Brinker, Piermattei, and Flo´s Handbook of Small Animal Orthopaedics and Fracture Treatment. 3rd ed., Philadelphia, W. B. Saunders, pp. 681-682

126. Plumas J, Chaperot L, Richard MJ, Molens JP 2005: Immunomodulatory functions of mesenchymal stem cells. Leukemia 19: 1597

127. Poland J 1898: Traumatic Separation of the Epiphyses. 1st ed. Smith, Elder & Co., London

128. Pott P 1769: Some Few General Remarks on Fractures and Dislocations. London, L. Hawes, W. Clarke and Collins

129. Puspa B, Padmini S, Antoniw JW 2006: Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Larchmont, 12: 2263

130. Quintavalla J, Uziel-Fusi S, Yin J, Boehnlein E, Pastor G, Blancuzzi Singh HN, Kraus KH, O´Byrne E., Pellas TC 2002: Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials 23:109-119

131. Ray C.-J. Chiu 2003: Human Mesenchymal Stem Cells Induce T Cell Anergy and Downregulate T Cell Allo-Responses via the TH2 Pathway: Relevance to Tissue Engineering Human Heart Valves Heart Failure. Reviews. Norwell 8: 247

81

132. Rockwood CA, Wilkins KE, King RE. Fractures in children 1984: Lippincott, Philadelphia

133. Rogers LF 1970: The radiology of epiphyseat injuries. Radiology, 96: 289-299

134. Saito T, Kuang JQ, Bittim B, Al-Khaldi A, Chiu RCJ 2002: Xenotransplant cardiac chimera: Immune tolerance of aduIt stem cells. Ann Thorac Surg, 74: 19-24.

135. Salter RB, Harris WR 1963: lnjuries involving the epiphyseal plate. J. Bone Joint Surg., 45: 587-622.

136. Schulze TG, de Souza P, Castrejon VH, John T, Merker HJ, Scheid A, Shakibaei M 2002: Redifferentiation of dedifferentiated human chondrocytes in high-density cultures. Cell Tissue Res, 308 (3): 371-379

137. Sims CD, Butler PE, Cao YL, Casanova R, Randolph MA, Black A, Vacanti CA, Yaremchuk MJ 1989: Tissue engineered neocartilage using plasma derived polymer substrates and chondrocytes. Plast Reconstr Surg, 101 (6): 1580-1585

138. Slongo T, Joeris A 2006: ChronOSTMInject in Children with Bone Cysts Resistant to Conventional Treatment. European Cells and Materials 11

139. Smoot EC 3rd, Bergman B, Lyons S 1995: Effect of the carbon dioxide laser on viability of ear cartilage in a rabbit model. J Craniofac Surg, 6 (2): 147-150

140. Sýkora I, Dynterová A, Holda J, Marhan O 1983: Chov laboratorních zvířat. Institut výchovy a vzdělávání MZVž Praha.

141. Ting V, Sims CD, Brecht LE, McCarthy JG, Kasabian AK, Connelly PR, Elisseeff J, Gittes GK, Longaker MT 1998: In vitro prefabrication of human cartilage shapes using fibrin glue and human chondrocytes. Ann Plast Surg, 40 (4): 413-420

82

142. Tobita M, Ochi M, Uchio Y, Mori R, Iwasa J, Katsube K, Motomura T 2002: Treatment of growth plate injurywith autogenous chondrocytes: a study in rabbits. Acta Orthop Scand, 73 (3): 352-358

143. Thomas BJ, Byers S, Johnstone EW, Foster BK 2005: The effect of recombinant human osteogenic protein-1 on growth plate repair in a sheep model. Journal of Orthopaedic Research, 23: 1336-1339

144. Toupin JM, Lechevallier J 1997: Post-traumatic epiphysiodesis of the distal end of the tibia in children. Rev Chir Orthop Reparatrice Appar Mot, 83 (2): 112-22

145. Uematsu K, Hattori K, Ishimoto Y, Yamauchi J, Habata T, Takakura Y, Ohgushi H, Fukuchi T, Sato M 2005: Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and threedimensional poly-lactic-glycolic acid (PLGA) scaffold. Biomaterials 26: 4273-4279

146. Wakitani S, Yamamoto T 2002: Response of the donor and recipient cells in mesenchymal cel! transplantation to cartilage defect. Microsc Res Tech, 58(1): 14-18

147. Wang Z, Goh J, Das De S, Ge Z et al. 2006: Efficacy of bone marrow-derived stem cells in strengthening osteoporotic bone in a rabbit model. Tissue Engineering 12: 1753

148. Williamson RV, Staheli LT 1990: Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. J Pediatr Orthop.10: 769-776.

159. Wirth T, Byers S, Byard RW, Hopwood JJ, Foster BK 1994: The implantation of cartilaginous and periosteal tissue into growth plate defects.lnt Orthop, 18 (4): 220-228

160. Xia W, Shang Q, Cui L, Xu R, Ding X, Cao Y 2002: In vitro chondrogenic phenotype differentiation of bone marrow stem cells. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi, 18 (1): 12-4

83

Seznam vyobrazení

Obr. 1:

Proximální zajištěný nitrodřeňový hřeb femuru (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem)

Obr. 2:

AO manuál, základní principy léčení zlomenin (zdroj: archív autora)

Obr. 3:

Spontánní remodelace po zlomenině distálního radia (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem)

Obr. 4:

Bryantova trakce pro konzervativní léčbu zlomeniny dlouhé kosti v dětském věku (zdroj: P. Gál., Miniinvazívní osteosyntéza zlomenin horní končetiny u dětí – se souhlasem autora)

Obr. 5:

Perkutánní fixace zlomeniny vnitřního kotníku (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem)

Obr. 6:

Suprakondylická zlomenina distálního humeru ošetřená technikou miniinvazivní osteosyntézy (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem)

Obr. 7:

Epifyzeolýza SH II proximálního humeru ošetřená technikou miniinvazivní osteosyntézy (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem)

Obr. 8:

Průběh elastického stabilního nitrodřeňového hřebování (ESIN) při zlomenině diafýzy femuru (zdroj: archív autora)

Obr. 9:

Průběh elastického stabilního nitrodřeňového hřebování (ESIN) při zlomenině diafýzy femuru znázorněný rentgenogramy (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem)

Obr. 10: Zlomenina diafýzy stehenní kosti ošetřena technikou ESIN (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem) Obr. 11: Anatomie dětské kosti a rentgenogram dětského kolene se znázorněním růstových zón (zdroj: Thomson Gale, a part of the Thomson Corporation, www.humanillnesses.com) Obr. 12: Normální histologická stavba růstové chrupavky (zdroj: http://www.gla.ac.uk/ibls/fab/tutorial/generic/bone5.html) Obr. 13: Klasifikace epifyzeolýz dle Saltera - Harrise (zdroj: Jon C. Thompson, Netter's Concise Atlas of Orthopaedic Anatomy) Obr. 14: Průchod kovového implantátu růstovou chrupavkou distálního radia (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem) 84

Obr. 15: Stabilizace zlomeniny distálního femuru dvěma Kirschnerovými dráty procházejícími růstovou ploténkou (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem) Obr. 16: Epifyzeolýza SH II distálního radia (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem) Obr. 17: Epifyzeolýza SH II proximálního humeru (zdroj: KDR FN Brno – se souhlasem) Obr. 18: Mesenchymální kmenová buňka (zdroj: International Society for Stem Cell Research) Obr. 19: Novozélandský bílý králík (zdroj: archív autora) Obr. 20: Odběr kostní dřeně u králíka (zdroj: archív autora) Obr. 21: Odebrané vzorky kostní dřeně (zdroj: archív autora) Obr. 22: ACUFEX – MosaicPlasty Precision, Smith+Nephew, USA (zdroj: archív autora) Obr. 23: Připravené operační pole (zdroj: archív autora) Obr. 24

Operační pole a nástroje (zdroj: archív autora)

Obr. 25: Vyvrtání defektu růstové zóny (zdroj: archív autora) Obr. 26: Dilatace vyvrtaného otvoru dilatátorem (zdroj: archív autora) Obr. 27: Kostní dřeň po centrifugaci (zdroj: archív autora) Obr. 28: Opaleskující vrstva mononukleárních buněk (zdroj: archív autora) Obr. 29: Postupný růst kolonie MSCs (zdroj: archív autora) Obr. 30: MSCs ve skafoldu připravené k implantaci (zdroj: archív autora) Obr. 31: Obnažená distální epifýza femuru králíka (zdroj: archív autora) Obr. 32: Provedení návrtu laterální části růstové zóny (zdroj: archív autora) Obr. 33: Přenos MSCs z mikrotitrační destičky vodičem pro vrták (a) ve skafoldu do defektu vyvrtaném v distální epifýze femuru (b) (zdroj: archív autora) Obr. 34: Měření délky femuru (a) a úhel valgózní deformity (") z rentgenogramu (zdroj: rtg archív autora) Obr. 35: Laboratorní králík při vyšetření magnetickou rezonancí (zdroj: archív autora) Obr. 36: MR obraz artefaktu v místě implantace MSCs označených železitým barvivem (zdroj: rtg archív autora) Obr. 37: Paramagnetický kontrast ve vrtném kanálu laterálního kondylu distálního femuru – frontální řez (zdroj: rtg archív autora) Obr. 38: Paramagnetický kontrast ve vrtném kanálu laterálního kondylu distálního femuru – sagitální řez (zdroj: rtg archív autora) 85

Obr. 39: Defekt laterálního kondylu distálního femuru – frontální řez (zdroj: rtg archív autora) Obr. 40: Defekt laterálního kondylu distální femuru – sagitální řez (zdroj: rtg archív autora) Obr. 41: Histologické vyšetření, barvení HE, zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 42: Granula Resovistu v cytoplazmě chondrocytů (A4) diferencovaných z MSCs – Pearlsova reakce – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 43: Imunofluorescenční barvivo DiI na membránách chondrocytů (A8) diferencovaných z MSCs – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 44: Kostní můstek v oblasti růstové zóny levého distálního femuru (A10) – zvětšení 20× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 45: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu (B3) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 46: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu a náznak organizace do struktury růstové zóny (B6) – zvětšení 100× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 47: Kostní můstek v oblasti růstové zóny levého distálního femuru (B2) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 48: Fokusy novotvořené chrupavky ve vrtném defektu (C4) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 49: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu (C1) – zvětšení 20× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 50: Prorůstání novotvořené chupavky defektem růstové zóny (skupina C10) – zvětšení – 40× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 51: Prorůstání novotvořené chrupavky do defektu (D14) – zvětšení 100× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 52: Granula Resovistu v cytoplazmě chondrocytů (D13) diferencovaných z MSCs – Pearlsova reakce – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 53: Imunofluorescenční barvivo DiI na membránách chondrocytů (D5) diferencovaných z MSCs – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno, se souhlasem) Obr. 54: Patrná valgózní deformace distální epifýzy levého femuru králíka (zdroj: rtg archív autora) 86

Obr. 55: Patrná valgózní deformace distální epifýzy levých femurů králíků (zdroj: rtg archív autora) Obr. 56

Záplava úspěšně novotvořené chrupavky z transplantovaných MSCs (A1) – zvětšení 40× (zdroj: PAÚ FN Brno – se souhlasem)

Obr. 57: Záplava úspěšně novotvořené chrupavky z transplantovaných MSCs v mezibuněčné hmotě (B6) – zvětšení – 100× (zdroj: PAÚ FN Brno – se souhlasem) Obr. 58

Úspěšně novotvořené chondrocyty z MSCs (C14) – zvětšení 400× (zdroj: PAÚ FN Brno – se souhlasem)

Seznam použitých zkratek ESIN

– Elastic stabel intramedullary nailing

KDR

– Klinika dětské radiologie

FN Brno – Fakultní nemocnice Brno MR

– Magnetická rezonance

HA

– Hydroxyapatit

MSCs

– Mesenchymal stem cells

H-E

– Hematoxylin - eosin

IFS

– imunofluorescence

PAÚ

– patologicko-antomický ústav

RP

– růstová ploténka

AV

– akademie věd

87

Příloha 1

PUBLIKACE VÝSLEDKŮ

SEZNAM PUBLIKACÍ VYDANÝCH V ČASOPISE S IMPAKT FAKTOREM PŘÍMO PODPOROVANÝCH GRANTEM IGA 8483-2, KTERÁ JE UVEDENA V PUBLIKACI:

Plánka L., A. Nečas, P. Gál, H. Kecová, E. Filová, L. Křen, P. Krupa: Prevention of bone bridge formation using transplantation of the autogenous mesenchymal stem cells to physeal defects: An experimental study in rabbits. Acta Vet. Brno 2007, 76. Impact factor: 0,449

P. Gál, A. Nečas, Plánka L., H. Kecová, L. Křen, P. Krupa, J. Hlučilová, D. Usvald: Chondrocytic potential of allogenic mesenchymal stem cells transplanted without immunosuppression to regenerate physeal defect in rabbits. Acta Vet. Brno 2007, 76. Impact factor: 0,449

PREZENTACE NA ODBORNÝCH SJEZDECH:

P. Gál, L. Plánka, Nečas A., Kecová H., Křen L.: Využití kmenových buněk v léčbě poranění růstové chrupavky – experimentální studie, předneseno na kongresu Trauma v dětském věku, 22.–23. 6. 2006, Senec

Gal P., Planka L., Nečas A., Kecova H.: The use of stem cells in the treatment of growth plate injuries - experimantal study - preliminary results, Fourth Annual International Conference, SICOT/SIROT 2006, Buenos Aires, August 2006

88

Příloha 2

POTVRZENÍ O ROZHODNUTÍ KOMISE PRO OCHRANU ZVÍŘAT

(opis)

93

VYUŽITÍ KMENOVÝCH BUNĚK K LÉČBĚ PORANĚNÉ RŮSTOVÉ PLOTÉNKY Experimentální studie

Recommend Documents