Využití FT NIR spektrometrie ke kontrole kvality potravin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Využití FT NIR spektrometrie ke kontrole kvality potravin Disertační práce

Vedoucí práce:

Vypracoval:

doc. Ing. Květoslava Šustová

Ing. Táňa Lužová

Brno 2011

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma „Využití FT NIR spektrometrie ke kontrole kvality potravin“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

V Brně dne Podpis doktoranda

22.2.2011 Lužová

Mé poděkování patří školitelce paní doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení mého doktorandského studia, cenné rady a připomínky při měření vzorků, jejich zpracování a při tvorbě této disertační práce. Velmi si jí vážím nejen jako odborníka, ale také jako člověka a přítele, Ing. Janě Růžičkové a Ing. Jiřímu Mlčkovi za předání zkušeností s prací na spektrofotometru FT NIR Antaris, drůbežárně v Pohořelicích, masokombinátu Promt s.r.o. a mlékárnám Olma Olomouc, Madeta, v Jihlavě, Jaroměřicích, Pelhřimově za poskytnutí vzorků k měření, paní Ing. Světle Lázníčkové, Laďce Pospíškové, Ing. Marcele Králíkové, Ing. Daniele Krupkové, Ing. Monice Kozelkové, Ing. Haně Konečné, Ing. Doubravce Rožnovské, Ph.D., ostatním spolupracovníkům na Ústavu technologie potravin a také svým diplomantům za spolupráci a výpomoc při analýzách vzorků. Také děkuji rodině, příteli a svým přátelům za povzbuzení a podporu během celého doktorandského studia.

ABSTRAKT Cílem disertační práce bylo zhodnotit možnosti použití NIR spektroskopie v analýze mléčných, masných i rostlinných výrobků. Při zjišťování schopností spektroskopie v blízké infračervené oblasti jsme se zaměřili na oblast kvantitativní při tvorbě kalibračních

modelů

obsahových složek

tekutých

vaječných

obsahů,

pomazánkových másel, kozích sýrů, nivy, kuřecích šunek a obilniny triticale. V chemické laboratoři byly stanovovány základní majoritní složky jako je obsah sušiny nebo vlhkosti s ohledem na charakter výrobku, tuku, bílkovin a také fyzikální vlastnosti jako je pH nebo titrační kyselost. Poté byly vzorky jednotlivých potravinových výrobků měřeny na spektrofotometru FT NIR Antaris v režimu reflektance v celém rozsahu spektra (10 000 – 4 000 cm-1). Kalibrační modely pro sledované složky jednotlivých potravin byly vytvořeny pomocí algoritmu PLS. Téměř u všech kalibrací byly získány velmi dobré výsledky s hodnotami kalibračních korelačních koeficientů v rozmezí 0,810 - 0,998. Tyto výsledky potvrzují vhodnost NIR spektroskopie pro využití v praxi. Metoda je nejen dostatečně přesná, ale také rychlá, při jednom měření lze zjistit současně několik parametrů najednou, lze ji využít i pro on-line monitoring přímo ve výrobě, bez znehodnocení vzorku. Schopnost NIR spektrofotometru byla prověřena i v kvalitativní oblasti. Byly zde analyzovány různé skupiny potravin, jako jogurty, eidamy, analogy sýrů, brambory. Cílem bylo prozkoumat, zda NIR analyzátor rozdělí předdefinované skupiny dle jejich vlastností. U jogurtů by posuzován vliv teploty, síly sáčku určeného k měření vzorků a také vliv příchutí; u eidamů vliv originality sýrů od různých výrobců; u brambor jednotlivé odrůdy; u analogů se prověřovala schopnost spektrofotometru rozlišit sýry od jejich imitací obsahující rostlinný tuk. K rozlišování jednotlivých skupin byla použita metoda diskriminační analýzy. Bylo potvrzeno, že metoda blízké infračervené spektroskopie může být významným nástrojem určování originality jednotlivých potravin a také v boji proti falšování potravin a ochraně spotřebitelů. Klíčová slova: blízká infračervená spektroskopie, kvantitativní analýza, kvalitativní analýza

ABSTRACT The aim of this thesis was to evaluate the possibility of using NIR spectroscopy in the analysis of milk, meat and plant products. The ability to detect near-infrared spectroscopy in the field, we focused on the area of quantitative calibration models for content creation components for liquid egg contents, butter spreads, goat cheese, blue cheese, chicken ham and cereals triticale. In the chemical laboratory were determined major componetns such as moisture content or dry because of the nature of the product, fat, protein, and physical properties such as pH or titratable acidity. Then the samples were measured on the spectrophotometer FT NIR Antaris in reflectance mode in the entire spectrum (10 000 - 4000 cm-1). Calibration models for each component were created using PLS algorithm. Almost all the calibrations were obtained very good results with the calibration correlation coefficients from 0.810 to 0.998. These results confirm the suitability of NIR spectroscopy for use in practice. The method is not sufficiently accurate but also fast, in one measurement can simultaneously determine several parameters at once, can also be used for on-line monitoring in process, without damaging the sample. The ability of the NIR spectrophotometer was proven in the field of quality. Different groups of foods such as yogurt, cheese, cheese analogues, potatoes were analyzed. The aim was to investigate whether the NIR analyzer built-in groups divided according to their properties. The yogurt should be assessed the effects of temperature, strength bag for measurement of samples and the influence of taste, the originality of the influence of Edam cheeses from different producers, different varieties of potatoes, the analogs examined the ability of a spectrophotometer to distinguish them from the cheese analogs containing vegetable fat. The distinction between the groups was the method of discriminant analysis. It was confirmed that the method of near infrared spectroscopy can be an important tool for determining the originality of food and also in the fight against food adulteration and consumer protection. Key words: near infrared spectroscopy, quantitative analysis, qualitative analysis

OBSAH 1 ÚVOD............................................................................................................................ 9 2 CÍL PRÁCE................................................................................................................ 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 12 3.1 Historie infračervené spektroskopie................................................................................................. 12 3.2 Infračervená spektroskopie............................................................................................................... 14 3.2.1 Vznik spekter ............................................................................................................................... 15 3.2.2 Molekulové vibrace...................................................................................................................... 15 3.2.3 Popis vibračních spekter .............................................................................................................. 19 3.2.4 Infračervené spektrofotometry ..................................................................................................... 19 3.2.5 Příprava vzorků pro infračervenou spektroskopii ........................................................................ 22 3.3 NIR spektroskopie ............................................................................................................................. 24 3.3.1 NIR spektra .................................................................................................................................. 26 3.3.1.1 Měření NIR spekter .............................................................................................................. 27 3.3.2 NIR spektrofotometry .................................................................................................................. 27 3.3.3 FT NIR Ataris .............................................................................................................................. 29 3.3.4 Výhody a nevýhody NIR spektroskopie ...................................................................................... 33 3.3.5 Využití NIR spektroskopie........................................................................................................... 34 3.3.5.1 Kvalitativní analýza.............................................................................................................. 34 3.3.5.2 Kvantitativní analýza............................................................................................................ 36 3.3.6 Aplikace NIR spektroskopie v průmyslu ..................................................................................... 36 3.3.6.1 Chemický a farmaceutický průmysl...................................................................................... 37 3.3.6.2 Potravinářský průmysl ......................................................................................................... 38 3.4 Chemometrie ...................................................................................................................................... 47 3.4.1 Chemometrie v NIR spektroskopii............................................................................................... 52

4 MATERIÁL A METODIKA.................................................................................... 56 4.1 Materiál .............................................................................................................................................. 56 4.1.1 Slepičí vejce ................................................................................................................................. 56 4.1.2 Pomazánkové máslo..................................................................................................................... 57 4.1.3 Kozí sýry ...................................................................................................................................... 57 4.1.4 Niva.............................................................................................................................................. 58

4.1.5 Kuřecí šunka ................................................................................................................................ 58 4.1.6 Triticale ........................................................................................................................................ 59 4.1.7 Jogurty.......................................................................................................................................... 59 4.1.8 Eidamy ......................................................................................................................................... 59 4.1.9 Analogy sýrů ................................................................................................................................ 60 4.1.10 Brambory ................................................................................................................................... 60 4.2 Metody ................................................................................................................................................ 60 4.2.1 Referenční analytické metody...................................................................................................... 60 4.2.1.1 Vejce..................................................................................................................................... 60 4.2.1.2 Pomazánkové máslo ............................................................................................................. 61 4.2.1.3 Niva, kozí sýry ...................................................................................................................... 61 4.2.1.4 Kuřecí šunka......................................................................................................................... 61 4.2.1.5 Triticale ................................................................................................................................ 62 4.2.4.6 Jogurty, Eidamy, Analogy sýrů, Brambory .......................................................................... 62 4.2.2 NIR spektrofotometrické metody................................................................................................. 62 4.2.2.1 Slepičí vejce.......................................................................................................................... 62 4.2.2.2 Pomazánkové máslo ............................................................................................................. 63 4.2.2.3 Niva ...................................................................................................................................... 63 4.2.2.4 Kozí sýry............................................................................................................................... 63 4.2.2.5 Kuřecí šunka......................................................................................................................... 64 4.2.2.6 Triticale ................................................................................................................................ 64 4.2.2.7 Jogurty.................................................................................................................................. 64 4.2.2.8 Eidamy.................................................................................................................................. 65 4.2.2.9 Analogy sýrů......................................................................................................................... 65 4.2.2.10 Brambory............................................................................................................................ 65

VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................... 66 5.1 Slepičí vejce ........................................................................................................................................ 66 5.2 Pomazánkové máslo........................................................................................................................... 72 5.3 Kozí sýr ............................................................................................................................................... 76 5.4 Niva ..................................................................................................................................................... 82 5.5 Kuřecí šunka ...................................................................................................................................... 88 5.6 Triticale............................................................................................................................................... 95 5.7 Jogurty ................................................................................................................................................ 97

5.8 Eidamy .............................................................................................................................................. 107 5.9 Analogy sýrů..................................................................................................................................... 111 5.10 Brambory........................................................................................................................................ 122

6 ZÁVĚR ..................................................................................................................... 128 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ................................................................. 132 8 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ.................................................................... 140 9 SEZNAM POUŽITÝCH TABULEK..................................................................... 143 10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .................................................................. 145 11 PŘÍLOHY............................................................................................................... 149

Úvod

1 ÚVOD Stále větší energie je vynakládána na zabezpečení kvality a jakosti potravin a surovin z nich vyráběných. Podstatná je také rychlost a kvalita kontroly nejen finálních výrobků, ale i jednotlivých meziproduktů během celého procesu výroby. Doba klasických referenčních metod je pro její časovou i manuální náročnost v běžné potravinářské praxi překonána. I když nelze opomenout jejich důležitost v úloze standardizace správnosti výsledků přístrojových analýz. Techniky

IR

spektroskopie

jsou

analytiky

považovány

za

atraktivní

a perspektivní nástroje pro analýzy prováděné v oblasti výzkumu, v kontrolních nebo průmyslových laboratoří. Denně jsou předváděny a publikovány nové aplikace spektroskopických

technik

oblasti

chemie,

drogové

analýzy,

zemědělsko-

potravinářského sektoru, vědy a ekologických analýz. Ačkoliv bylo infračervené světlo objeveno Hershelem již v roce 1800, nestala se technika NIR nikterak populární. Teprve od 50. let minulého století začala stoupat její obliba, a jediný obor, který trvale využívá od této doby metodu infračervené spektroskopie, je potravinářský. Do mnoha oblastí potravinářského odvětví se NIR spektroskopie rozšířila jako rutinní technika. Infračervená spektroskopie blízké oblasti patří do skupiny nedestruktivních analytických metod. Vzorek plně poskytuje informaci o svém složení, přestože není analýzou poškozen. Prakticky je využívána v oblasti 4 000 – 12 500 cm-1 (vlnových délek 2,5 – 0,8 μm). Principem metody je pohlcování, nebo odraz různých vlnových délek dopadajícího záření, které závisí na chemickém složení analyzovaného vzorku. S použitím vhodného softwaru je spektrum vzorku převedeno do kalibrační rovnice, ze které se statickými postupy vyhodnotí žádané parametry. Pokud jsou získané parametry kalibračního modelu spolehlivé, lze jej použít k analýze neznámých vzorků. Technika NIR může přinášet užitečné informace nejen ve všech stupních kontroly jakosti, nákupu potravinářských surovin a výrobků, ale také ve sféře obchodu k objektivizaci ceny ve vazbě na kvalitu. Disertační práce byla zaměřena na využití blízké infračervené oblasti při hodnocení mlékárenských výrobků (kozí sýry, Niva, pomazánkové máslo, eidamy, jogurty, analogy sýrů), vajec, šunky, triticale a brambor. Práce by měla přispět k potvrzení a dalšímu rozšíření názoru, že NIR spektroskopie je vhodnou analytickou 9

Úvod

technikou v analýze surovin, meziproduktů a produktů pro stanovení základních složek a je jí možno využít v případě rozlišování originality i falšování potravin.

10

Cíl práce

2 CÍL PRÁCE Cílem disertační práce bylo zhodnotit možnosti použití NIR spektroskopie v analýze mléčných, masných i rostlinných materiálů a výrobků. Na základě porovnání spektrálních dat a referenčních metod vytvořit kalibrační metody, jejich funkčnost následně ověřit křížovou validací. S použitím metody diskriminační analýzy vyzkoušet citlivost NIR přístroje při rozlišování předem definovaných skupin. Základní cíle: 

Prostudovat

dostupnou

odbornou

literaturu

zabývající

se

studiem

NIR

spektroskopie. 

Analyzovat

vybrané

vzorky

v

chemické

laboratoři,

následně

na

NIR

spektrofotometru. 

Vyzkoušet nové možnosti aplikace NIR spektroskopie při detekci falšování sýrů, ověřování vlivu měřících materiálů, teplot.



Vytvořit funkční kalibrační metody.



Ověřit funkčnost kalibračních modelů křížovou validací.



Statisticky vyhodnotit výsledky, porovnat chyby stanovení.



Pro dané vzorky vytvořit pomocí diskriminační analýzy kalibrační modely a jejich funkčnost ověřit na neznámých vzorcích.



Pomocí grafů vyhodnotit vytvořené kalibrační modely kvalitativní analýzy.



Zhodnotit vhodnost využití metod v praxi.

11

Literární přehled

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie infračervené spektroskopie První hypotéza o elektromagnetické radiaci byla vyslovena a popsána v teorii Jamese Maxwella v roce 1864. Autor přesně popisuje dlouhé vlny elektromagnetického záření.

Jeho teorie byly poprvé prozkoumány v roce 1886 Heinrichem Hertzem.

Moderní chápání vln a částí přirozeného světla bylo popsáno v publikacích vědců: William Rowan Hamilton odvodil systém používaný k popisu kinetické a potenciální energie molekul; Luis de Broglie přišel s myšlenkou, že by se látka mohla chovat jako vlna, pakliže by se světlo chovalo jako částice. V dalším studiu Erwin Schrödinger popsal vlnovou rovnici pro látku, na kterou roku 1925 navázal s relativistickou vlnovou rovnicí Paul Dirac (WORKMAN et SHENK, 2004) Historie NIR spektroskopie začíná v letech 1800 v Anglii, pokusy muzikanta a astronoma Frederika Williama Herschla (BARTON, 2002). Díky jeho pokusům při zkoumání účinků slunečního záření, rozloženého pomocí hranolu na spektrum, byl podán první záznam o existenci části elektromagnetického spektra. Za hranicí viditelné oblasti, za červenou složkou světla, naměřil nejvyšší teplotu. Objevil tedy novou oblast (obrázek 1), která byla nazvána infračervená (PASQUINI, 2003; BARTON 2002).

Obr. 1: Herschlův experiment (DAVIES, 1998) Ačkoliv bylo NIR záření objeveno podstatně dříve než MIR záření, druhý jmenovaný spektrální region získal široký ohlas a využití po zveřejnění práce Coblentze 12


v roce 1900. Coblentz byl první vědec, který určil absorbanční spektrum čisté látky a ověřil užitečnost absorbance pro identifikaci funkčních skupin organických látek (PASQUINI, 2003). Průkopnické práce v oblasti NIR spektroskopie se vyvíjely od roku 1938, kdy bylo popsáno stanovení vody v želatině. Barchewitz jako první aplikoval blízkou infračervenou spektroskopii ke stanovení složení pohonných hmot. Práce o difúzní reflektanci Kubelky a Munka byly publikovány dříve než se začly provádět jakékoliv praktické aplikace NIR spektroskopie. Dlouhou dobu tato instrumentální metoda míjela nepovšimnuta analytickým výzkumníkům (PASQUINI, 2003). Nejvýznamnější osobou historie NIR spektroskopie je bezpochyby Karl Norris. Při hledání nových analytických metod stanovení obsahu vody v zemědělských produktech prozkoumával možnosti využití NIR spektroskopie.

První výsledky

Norrisovy práce byly publikovány v roce 1965. Studie opětovně vyšla ve speciálním vydání the Journal of Near Inrared Spectroscopy v roce 1996. O rozšiřování NIR spektroskopie v polovině 20. století ve vědecké oblasti se mimo Norrise svými publikacemi zasloužili Williams, McClure a Schenk (PASQUINI, 2003; DAVIES, 1998). Od roku 1983 byly dodávány komerční filtrové přístroje se softwarem. Pro další rozvoj techniky NIR měl mimořádný význam technický pokrok ve vývoji přístrojů a též optických vláken, dovolující delokalizaci měření (pomocí optické sondy) v pevných i kapalných materiálech. Vedle toho pro další rozvoj techniky NIR měl velký význam též pokrok v počítačích a vývoj nových matematických metod dovolujících globální zpracování obrovských datových souborů (MÍKA et al., 2008). Od roku 1930 do roku 1980 celkový počet publikací z oblasti NIR spektroskopie čítal 255 prací; zatímco nynější období zaznamenává počty větší než 15 000. Produkce značného množství odborných publikací vedla v roce 1993 k založení prvního odborného časopisu the Journal of Near Infrared Spectroscopy (PASQUINI, 2003). Jak říká McCLURE (2003) ve své publikaci: “ Infračervená spektroskopie dosáhla své zletilosti!“

13


3.2 Infračervená spektroskopie Spektrometrie může být obecně definována jako obor, zabývající se měřením a vyhodnocováním elektromagnetického záření, emitované hmotou nebo interagujícího s hmotou (NĚMCOVÁ et al., 2004). U elektromagnetického záření je pokládána duální podstata, tj. vlnově – korpuskulární charakter záření. Podle této teorie má záření jednak vlastnosti vlnové, tj. ohýbá se, odráží, láme atd. a zároveň se chová jako proud elementárních kvant energie, fotonů, které se pohybují jako částice. Každé elektromagnetické záření lze charakterizovat několika základními veličinami: 

frekvence neboli kmitočet, ν, udávající počet kmitů za sekundu. Jednotkou kmitočtu je 1 hertz (Hz), který označuje 1 kmit za sekundu. Většinou se používá násobků této jednotky, např. kHz, Mhz;



vlnová délka, λ, je dráha, o kterou postoupí vlna za dobu jednoho kmitu. Nejčastěji používanými jednotkami vlnové délky ve spektrálních metodách jsou µm (10-6 m) a nm (10-9 m);



vlnočet, σ, je odvozen od vlnové délky (σ = 1/ λ) a označuje počet vln připadajících na dráhu 1 cm; jednotka vlnočtu je cm-1;



rychlost záření, ‫ں‬, je vzdálenost, o kterou postoupí vlna za sekundu. Je dána vztahem ‫ = ں‬ν * λ. Ve vakuu má elektromagnetické záření rychlost rovnou 2,9979 * 108 m.s-1, v ostatních prostředích je rychlost záření poněkud menší. V běžné praxi však tyto rozdíly v rychlosti neuvažujeme (OPEKAR et al, 2002). Infračervená spektrometrie se zabývá měřením a vyhodnocováním absorpčních

spekter molekul, které absorbovaly záření o vlnových délkách 800 nm – 100 μm, tj. vlnočtu 12 000 – 10 cm-1. Při absorpci tohoto záření dochází ke změně vibračních a rotačních stavů molekuly. Infračervená spektroskopie studuje přechody mezi těmito stavy v elektronovém stavu. Rozdíly energie mezi jednotlivými vibračními (případně rotačními) stavy vzhledem k rozdílům mezi elektronovými jsou velmi malé a k vyvolání absorpce tedy postačí záření o nízké energii a větších délkách vlny, tj. infračervené (ČERMÁKOVÁ et al., 1987; HORÁK et al., 1976)

14


Frekvence, která odpovídá přechodům mezi rotačními hladinami v daném vibračním stavu je zpravidla menší než 250 cm-1 a vytvářejí rotační spektrum molekuly ve vzdálené infračervené oblasti. V řadě případů náleží frekvence rotačních přechodů k mikrovlnné části spektra (ν < 10 cm-1), (HORÁK et al., 1976). Infračervená spektra látek lze měřit v jejich pevném, kapalném i plynném stavu jako absorpční i emisní spektra, v chemických aplikacích infračervené spektroskopie se většinou měří absorbce infračerveného záření (HORÁK et al., 1976). Podle ŠULCOVÉ et al. (2008) dělíme infračervené záření na: 

blízké (0,78 až 2,5 μm, resp. 12 800 až 4 000 cm-1)



střední (2,5 až 50 μm, resp. 4 000 až 200 cm-1)



daleké (50 až 1000 μm, resp. 200 až 10 cm-1)

3.2.1 Vznik spekter Fotony infračerveného záření nemají takovou energii jako fotony záření v oblasti UV – VIS, a proto nevyvolávají energetické přechody elektronů, ale mění „pouze“ energie vibrací a molekul. Z hlediska klasické mechaniky můžeme pohlížet na molekulu jako na soubor N hmotných bodů (atomových jader), vzájemně spojených nehmotnými pružinami (PRAUS et al., 2001; HORÁK et al., 1980). Podstatou vzniku spektra je interakce mezi elektromagnetickým zářením a částicemi hmoty – molekulami a atomy. Emisní spektrum vznikne při přeměně energie hmotné částice v energii záření, kdežto absorpční spektrum vzniká při opačném pochodu. Tyto přeměny jsou závislé na struktuře látky, v níž k interakci dochází, a lze jich tedy použít k průkazu přítomnosti chemických složek, z kterých se látka skládá (KÖSSLER, 1960). 3.2.2 Molekulové vibrace Jak již bylo uvedeno, způsobuje infračervené záření při interakci s molekulou pouze změnu v rotačních a vibračních stavech, nikoliv ve stavech elektronových (KÖSSLER, 1960). Vibrací biatomické molekuly chápeme periodickou změnu mezijaderné vzdálenosti. Při klasickém popisu jde o oscilátor tvořený dvěma hmotnými body na pružině (obr. č 2) 15


Obr. 2: Rotace a vibrace dvouatomové molekuly (KLOUDA, 2003) Pro jeho frekvenci platí: ν = 1/2π x  k/µ Kde µ je redukovaná hmotnost: µ = (mA x mB) / (mA + mB) Při kvantově mechanickém popisu v aproximaci harmonického oscilátoru je jeho energie kvantována a nabývá hodnot: E = h ν ( n + ½) ν … frekvence oscilátoru, n … vibrační kvantové číslo. Pro rozdíl energetických hladin harmonického oscilátoru platí: ΔE = h ν V aproximaci harmonického oscilátoru jsou možné pouze vibrační přechody, při nichž se vibrační kvantové číslo n mnění o jedničku (obr. 1, přílohy). Důsledkem anharmonicity vibrací reálné molekuly je existence přechodů Δn = 2, 3,… Přechod Δn = 1 se nazývá základní, neboli fundamentální, přechody s Δn = 2, 3,… se označují jako vyšší harmonické (TRCHOVÁ, 1999) Podle KALINY et al. (2004) lze vibrace mnohoatomových molekul studovat prostřednictvím přechodů mezi vibračními energetickými hladinami, které jsou aktivní v IČ absorpčních spektrech nebo spektrech Ramanova rozptylu. Molekula o N atomech má 3N – 6 vnitřních stupňů volnosti, a tedy i 3N – 6 normálních vibračních modů. Každý mód má vlastní systém stacionárních stavů; celkový vibrační stav molekuly je pak souhrnem stavů, ve kterých jsou jednotlivé mody. Možných vibračních stavů má tedy mnohoatomová molekula obrovské množství a pro správnou interpretaci vibračních spekter je proto v prvé řadě nezbytné vědět, které přechody lze v daném

16


spektru očekávat a proč. Počet souřadnic, který je nezbytný pro popis každého ze tří pohybů je: Pohyb

počet stupňů volnosti

translační (kolem těžiště)

3

rotační (kolem těžiště)

2 (lineární molekuly) 3 (nelineární molekuly)

vibrační

3N – 5 (lineární molekuly) 3N – 6 (nelineární molekuly)

V polyatomické molekule dochází k valenčním (ν) a deformačním (δ) vibracím. Valenčními vibracemi vibrují atomy ve směru svých vazeb tak, že se mění jen délka vazby. Při deformačních vibracích se mění vazebný úhel a délka vazby zůstává konstantní. Valenční vibrace (stretching) se dále dělí na symetrické (νs) a asymetrické (νas). Pásy asymetrických vibrací se vždy nacházejí při vyšších vlnočtech než symetrické. Deformační vibrace (bending) se dělí na rovinné (in plane) nůžkové (scissoring) a kolébavé (rocking), a na mimorovinné (out of plane) kývavé (wagging) a kroutivé (twisting) (PRAUS et al., 2001). Obrázek 3 znázorňuje různé druhy vibrací skupiny – CH2 –.

Obr. 3: Různé druhy vibrací skupiny – CH2 – (ŠULCOVÁ et al., 2008) Rovinné vibrace: 1- valenční symetrická; 2 - valenční asymetrická; 3 – deformační nůžková; 4 – deformační kolébavá; Mimorovinné vibrace: 5 – deformační kývavá; 6 – deformační kroutivá

17


Porovnáme-li polohu pásů valenčních a deformačních vibrací pro tutéž skupinu atomů, zjistíme, že vlnočty u valenčních vibrací jsou vyšší než u deformačních. Infračervené spektrum rozdělujeme na dvě oblasti. 

Oblast skupinových vibrací (charakteristických vibrací). Mezi vlnočty 4 000 až 1 500 cm-1 nacházíme absorpční pásy vibrací různých funkčních skupin, pro tuto oblast využíváme pro identifikaci těchto skupin v molekule organické látky. Hodnoty těchto vibrací jsou ovlivněny strukturním okolím dané skupiny, např. přítomností konjugovaných násobných vazeb, pnutím cyklických systémů, přítomností jiných vibrujících skupin na stejném atomu, interakcemi typu vodíkových vazeb apod. Hojné jsou v organických látkách aromatické systémy. U benzenového jádra najdeme valenční vibrace mezi uhlíky od 1 450 do 1 600 cm-1 často ve 4 pásech (1 450, 1 500, 1 580 a 1 600 cm-1).



Oblast otisku prstů. Mezi vlnočty 1 500 až 670 cm-1 nacházíme pásy deformačních vibrací skupin, které jsou velmi silně ovlivněny okolními vazbami a celkovou strukturou molekuly. Protože jsou tyto vibrace určeny vibračním chováním celého skeletu molekuly, nenajdeme dvě látky, které by měly svá spektra

v oblasti

otisku

prstů

shodná.

Počítačovým

srovnání

spektra

s elektronickou knihovnou spekter je možno identifikovat organickou látku (je-li obsažena v knihovně spekter), (ŠULCOVÁ, BENEŠ, 2008). Na hodnoty charakteristických vibrací mají vliv rovněž skupenství vzorku a přítomné rozpouštědlo. V kondenzovaném prostředí dochází oproti plynnému stavu k zesílení vzájemných interakcí molekul v důsledku malých mezimolekulových vzdáleností, což neprojeví změnami v optických spektrech. U tuhých krystalických látek v porovnání s kapalným nebo plynným skupenstvím je pohyblivost molekul omezená a ve spektrech se mohou vyskytovat pásy, které by se v jiných skupenstvích nenacházely a naopak některé mohou zcela chybět. V případě polárních rozpouštědel je pozorovatelný slabý vliv rozpouštědla, kdy v důsledku spřažení vibrace molekuly s polarizační odezvou okolí dochází ke snížení frekvence vibrací – vlnočtu – zpravidla o několik cm-1 (u vysoce polárních molekul až o několik desítek cm-1), (KALINA et al., 2004; PRAUS et al., 2001). Výrazný vliv na polohy vibračních linií mají tzv. specifické interakce, spočívají v tvorbě komplexů, které jsou spojeny se změnami konfirmace nebo sekundární 18


struktury, s deformací geometrie, se vznikem vodíkových můstků nebo s úplným přenosem protonů apod. Pás vibrace, která zahrnuje jádra zúčastněná na tvorbě komplexu, se kromě značného rozšíření posouvá o desítky cm-1 k nižšímu (u valenčních vibrací) nebo vyšším (u deformačních vibrací) vlnočtům (KALINA et al., 2004). 3.2.3 Popis vibračních spekter Vibrační spektrum je spojitá funkce, vyjadřující závislost vhodně zvolené veličiny (intenzita absorpčního pásu, Ramanovy linie) a vlnočtu. Touto veličinou může být obecně spektrální hustota zářivého toku Φν, transmitance τ nebo absorbance D. Absorbance je mírou pravděpodobnosti absorpce fotonu molekulou (nebo přesněji rezonujícím oscilátorem), a to po celé délce optické dráhy paprsku v absorbujícím prostředí. V prvém přiblížení jsou příspěvky pravděpodobnosti absorpce jednotlivých oscilátorů navzájem nezávislé a aditivní. Proto má absorbance mezi veličinami, používanými při popisu spektra, zvláštní postavení (HORÁK et al., 1980). 3.2.4 Infračervené spektrofotometry Infračervené spektrofotometry dělíme na jednopaprskové a dvoupaprskové podle toho, měří-li se na nich buď jeden vzorek (kyveta se studovanou látkou rozpuštěnou ve vhodném rozpouštědle) nebo referenční vzorek (kyveta s rozpouštědlem) nebo oba (vzorek i reference) současně. U jednopaprskových spektrofotomertů se nejčastěji používá technika měření „bod po bodu“, kde se při jedné vlnové délce proměří propustnost vzorku a pak reference. Měření na takovýchto přístrojích je značně zdlouhavé a prakticky nelze použít pro měření složitých spekter organických molekul. Použití jednopaprskových spektrofotometrů pro měření spekter organických molekul umožnila teprve technika nedisperzní FT-IR spektroskopie (Fourierova transformace) a to díky svému principu, rychlosti měření a počítačovému zpracování (KALINA et al., 2004). Fourierova transformace je vyjádření časově závislého signálu pomocí harmonických signálů, tj. funkcí sin a cos, obecně tedy funkce komplexní exponenciály. Slouží pro převod signálů z časové oblasti do oblasti frekvenční. Signál může být buď ve spojitém či diskrétním čase.

19


Infračervený spektrometr je přístroj umožňující měřit závislost absorpčních vlastností vzorku na vlnočtu v oblasti IR záření. Zdrojem záření je keramická tyčinka, která při zahřátí na 1 000°C emituje spojité záření v infračervené oblasti. Výsledkem je infračervené spektrum látky, tj. závislost procentické propustnosti (tj. transmitance) nebo absorbance na vlnočtu nebo vlnové délce. Oblasti spekter označujeme jako absorpční pásy. Obvykle je charakterizujeme polohou maxima a relativní intenzitou (PERTILE, ČABLÍK, 2006). Měření infračervených spekter se provádí na třech základních typech přístrojů: disperzních (klasických), nedisperzních a interferometrických (fourierovských) (KANIA,

2007).

První

generace

MIR

spektrofotometrů

používala

difrakční

monochromátor s velkým rozlišením a využívala je v kvalitativní analýze k identifikaci chemického složení. Kvantitativní aplikace těchto přístrojů však byly značně omezené. Nevýhodou disperzních přístrojů je, že se dopadající světlo rozdělí na několik spektrálních částí. Proto je intenzita dopadajícího světla na detektor malá, poměr signálu k šumu mnohem horší než u FT IR spektrometrů. Počátkem roku 1970 MIR přístroje prodělaly důležitou revoluci, vyvinuly se komerční spektrofotometry, které využívaly interferometrickou technologii (BAETEN et al., 2002; BARTH, 2007). Zdrojem záření je u disperzního spektrofotometru nečastěji keramická tyčinka, na jejímž povrchu nebo uvnitř je navinut odporový drát žhavený na teplotu 1 000 až 1 400 °C. Toto rozžhavené těleso je imitací černého tělesa a emituje záření v oblasti infračerveného spektra. Záření prochází vzorkem, který je umístěn v pro infračervené záření transparentní kyvetě (halogenidy kovů, především alkalyckých: NaCl, KBr, CsI, CaF2, TlI, TlBr). Proto je třeba okénka chránit před vlhkostí a polárními rozpouštědly. Kyvety bývají rozebíratelné. Plní se injekčními stříkačkami. Funkcí monochromátoru je rozklad neboli disperze infračerveného záření na difrakční mřížce, která tvoří spolu se vstupní a výstupní štěrbinou a kolimačními zrcadly monochromátor. Monochromátory obsahují buď hranol nebo mřížku. Hranolové monochromátory mají Littrowovovo uspořádání. Mřížkové monochromátory (uspořádání Turner – Czerny) nejsou omezeny optickou propustností, disperze je v celém rozsahu spektra konstantní. U kvalitních spektrometrů bývá několik hranolů nebo kombinace hranolu a mřížky (KANIA, 2007; PERTILE et al., 2006; PRAUS et al., 2001). Jako detektory se používají termočlánky, bolometry (změna odporu s teplotou), fotoelektrické detektory využívající fotoelektrického jevu (na bázi PbS, PbSe a Sb2S3) a 20


pneumatické detektory. Pneumatickým detektorem je tzv. Golayův článek. Tento typ detektoru využívá tepelné roztažnosti plynu, kterým je naplněn. Rozpínáním se pohybuje membrána, ke které je připevněno zrcátko. Zrcátko se vychyluje a odráží dopadající paprsek, který detekuje. Změna objemu náplně je závislá na energii dopadajícího záření (PRAUS et al., 2001). Nedisperzní spektrometr má v podstatě stejnou konstrukci jako disperzní typ, ale neobsahuje žádný disperzní prvek. Monochromatičnost je zajištěna již samotnou povahou zdrojů infračerveného záření. Jako zdroje záření se používají vysoce monochromatické lasery, ať již plynové nebo v posledních letech čím dál častěji používané pevnolátkové lasery – laserové diody (KANIA, 2007). Spektrometry FTIR používají místo monochromátoru Michelsonův interferometr zkonstruovaný již v roce 1881 a použitý k měření rychlosti světla. Na principu interference zesiluje, respektive zeslabuje záření z polychromatického zdroje. Zdrojem záření v interferometrických spektrometrech je stejně jako v disperzním přístroji keramická tyčinka, která při zahřátí emituje spojité záření v infračervené oblasti. Hlavními součástmi Michelsonova interferometru jsou dělič paprsků, pohyblivé a pevné zrcadlo (obr. 2, přílohy). Pro střední infračervenou oblast se používá jako dělič paprsků polopropustné zrcadlo, které je vyrobeno depozicí tenké germaniové vrstvy na destičku z bromidu draselného. Záření přichází ze zdroje a na děliči paprsků se rozdělí na dva paprsky. Jeden paprsek dopadá na pevné zrcadlo a odráží se zpět k děliči paprsků. Obdobně se odráží i druhý paprsek od pohyblivého zrcadla s tím rozdílem, že pohyblivé zrcadlo se konstantní rychlostí přibližuje a vzdaluje od děliče. Na polopropustném děliči se oba odražené paprsky skládají a vytvářejí spektrum IČ záření ve formě interferogramu, který představuje závislost intenzity záření na dráhovém rozdílu obou paprsků. Z jednoho pohybu zrcadla je získán jeden interferogram, který se Fourierovou transformací převádí z časové škály do frekvenční nebo vlnočtové na spektrum odpovídající jednomu skenu. S opakovaným pohybem zrcadla jsou zaznamenávány další interferogramy, z nichž je pak spočítán průměrný interferogram, který se Fourierovou transformací převede na spektrum, které má na ose x vlnočtovou stupnici. Přístroj pracuje jako jednopaprskový, tzn., že pro zjištění transmitance musíme nejdříve získat vlnočtovou závislost detekovaného signálu pro tok záření dopadající na vzorek (tzv. pozadí, angl. Backround), poté stejnou závislost pro tok prošlý zkoumaným vzorkem. Poměr těchto hodnot teprve vede ke spektru, tj. vlnočtové závislosti 21


transmitance, resp. absorbance, které má pro analytického chemika vypovídající schopnost (KANIA, 2007; PRAUS et al., 2001; PERTILE et al., 2006). Nejběžněji používaný detektor je označován zkratkou DTGS (obr. 3, přílohy) (deuterovaný triglycinsulfát). Tento detektor využívá pyroelektrického jevu. Poskytuje dobrou odezvu v rozsahu 7 500 až 200 cm-1. Absorpcí záření se změní teplota pyroelektrického materiálu, tím se změní stupeň orientace polárních molekul. To vyvolá elektrický náboj – napětí na kontaktech krystalu. Výsledkem je měřitelný elektrický proud. Dopadající záření je nutno přerušovat. MTC detektory (mercury – cadmium – telluride) jsou citlivější pyroelektrické detektory než DTGS a mají rychlejší odezvu. Jsou však drahé a pracují za chlazení kapalným dusíkem (KANIA, 2007; ŠULCOVÁ et al., 2006; KLÍČ et al., 2002). 3.2.5 Příprava vzorků pro infračervenou spektroskopii Vzorek se měří v plynném, kapalném a tuhém stavu (PRAUS et al., 2001). Přípravy vzorků zahrnují techniky fixace optických látek do transmisních cel, tvorbu vrstvených filmů na okénka, KBr tablety, filmy vytvořené za tlaku a tepla (BEATEN et al., 2002). Plynné vzorky, nebo látky s vysokou tenzí par se měří ve skleněných nebo kovových válečcích, opatřených na obou koncích transparentními okénky (NaCl, KBr), při běžné tloušťce vrstvy cca 10cm. Kyvety pro měření plynů mohou být vybaveny zrcadly, tak aby se opakovanými odrazy prodloužila dráha paprsku až na několik metrů (POSPÍŠIL, 2003; PRAUS et al., 2001). Měření spekter plynů je z technického hlediska poměrně jednoduché. Agresivních plynů, atakujících materiály pláště či okének kyvet, je velmi málo a jsou obecně známy. A tak jen měření spekter par málo těkavých sloučenin je poněkud složitější úlohou; je-li však k dispozici komerční vyhřívaná kyveta anebo multireflexní, jde i v tomto případě o rutinní záležitost (HORÁK et al., 1980). Ve srovnání s vlastnostmi plynu jsou vlastnosti kapalin variabilnější (polarita, viskozita, rozpouštěcí schopnosti apod.). Velmi jednoduchá je práce s kapalinami, které jsou vazké a mají malou tenzi par. Jejich vzorky lze k měření infračervených spekter upravit v podobě tenkých filmů mezi povrchy dvou transparentích destiček. Vzorek sloučeniny se na jednu z nich nakápne a film se vytvoří jemných přitlačením druhé destičky (HORÁK et al., 1980). Dále se pro měření kapalin používají křemenné kyvety 22


(1-10 cm) v omezeném rozsahu do 2 800 cm-1. Mnohem častěji se používají rozebíratelné kyvety z NaCl nebo KBr. Značnou nevýhodou těchto materiálů je jejich citlivost na vlhkost. V IČ spektrometrii nelze používat vodné roztoky v důsledku silné absorpce O-H vazeb, a proto se používají organická rozpouštědla CCl4, CHCl3, CS2 pro jednotlivé oblasti spektra, v kterých nevykazují vlastní absorpční pásy (ANONYMb, 2006; PRAUS et al., 2001). Pro měření koncentračních závislostí jsou vhodné kyvety s variabilní tloušťkou vrstvy, kterou lze nastavit mikroskopickým šroubem. K měření mikrogramových množství slouží mikrokyvety (tloušťka vrstvy 0,01 – 0,1 mm) a mikroiluminátory, využívající fokustace záření ze zdroje pomocí zrcadel na vzorek, nebo infračervený mikroskop pro jednotlivé mikroobjekty (krystaly, vlákna apod.) (POSPÍŠIL, 2003). Nerozpustné tuhé látky se měří ve formě tenkých vrstev (filmů) na skle nebo na hladině rtuti po odpaření rozpouštědla, případně přímo v kompaktní tuhé fázi. Pevné vzorky se nejčastěji měří technikou KBr tablet, která spočívá ve smísení malého množství vzorku se 100násobným množstvím jemně rozetřeného KBr (POSPÍŠIL, 2003; PRAUS et al., 2001). Ve speciálním lisu se potom za sníženého tlaku vnější atmosféry (kvůli evakuaci atmosférické vody) lisuje vysokým tlakem (asi 2GPa) samonosná tableta. Kvalitu tablety podle TRCHOVÉ (1999) ovlivňuje řada faktorů: technické vady: sešikmení, neprůhledné tablety, nedostatečná evakuace, zalisovaný vzduch vznik falešných pásů, u nichž rozhoduje: 

kvalita výchozího materiálu (možné příměsi)



pásy vlhkosti u 1 633 a 3 451 cm-1 (vysoušet KBr, uchovávat v exsikátoru)



pás CO2 u 2 360 cm-1



pásy C-H u 2 923 cm-1 (z výroby)



kontaminace lisu na tablety



pásy křemičitanů SiO2



pásy uhličitanů pod 1 000 cm-1



pásy dusičnanů u 1 384 cm-1



změna vzorku s časem (oxidace, degradace)



reakce látek s KBr (iontová výměna, redoxní procesy)



vliv mletí na strukturu (deformace vazeb, změny v nadmolekulární struktuře) 23


Jinou technikou je příprava olejové suspenze ve speciálním parafínovém oleji – nijolu. Nevýhodou je přítomnost C-H pásů nijolu. Rozšířená je i technika měření odraženého záření od reflexní vrstvy, na kterou je nenanesen vzorek, např. olej, vrstva barvy apod. Záření prochází vrstvou vzorku, dopadá na reflexní plochu, od které se úplně odráží, opět prochází vzorkem a dopadá do detektoru. Průchodem absorpční vrstvou se záření zeslabuje. Tato metoda se nazývá technika zeslabeného úplného odrazu (Atennuated Total Reflexion – ATR). Na principu reflexe je založena i metoda násobného odrazu FMIR, kdy vzorek je umístěn na protilehlé povrchy krystalu (AgCl). Záření dopadá na rozhraní vzorku a krystalu, totálně se odráží (záření dopadá pod takovým úhlem, aby došlo k totálnímu odrazu) zpět přes krystal k protilehlému povrchu atd. Výsledkem opakované reflexe je opět absorpce záření látkou nanesenou na povrch krystalu (PRAUS et al., 2001). Dnes se již běžně v laboratořích používají nedisperzní přístroje s tzv. Fourierovou transformací.

3.3 NIR spektroskopie Spektrometrie

v blízké

infračervené

oblasti

je

metodou

molekulové

spektroskopie (near infrared spectroscopy – NIR spectrometry), která využívá spektrální oblast blízkého infračerveného záření, prakticky v rozsahu vlnočtů 4 000 – 12 500 cm-1 (vlnových délek 2,5 – 0,78 μm; využívá energii fotonů v rozmezí od 2,65x10-19 do 7,96x10-20 J). NIR oblast tak z jedné strany navazuje na viditelnou, z druhé pak na střední infračervenou. Hranice nejsou zcela ostré a fluktulují podle různých zdrojů informací v závislosti na tom, zda se tyto hranice vyvozují z možnosti spektrometrů pokrýt danou oblast, nebo z typu elektromagnetických přechodů, které se v dané oblasti pozorují (MATĚJKA, 2006; PASQUINI, 2003; ŠIKOLA, 2002).

24


Obr. 4: Infračervené spektrum (ANONYMa, 2008) Spektroskopie v oblasti NIR pracuje s absorpčními pásy, které přísluší kombinovaným frekvencím a svrchním tónům se změnou vibračního kvantového čísla o dvě a více jednotek, které jsou sice z hlediska modelu harmonického oscilátoru zakázané,

ale

v reálném

spektru

je

můžeme

pozorovat

v důsledku

jejich

anharmonického chování. Pásy však vykazují zhruba 20-50x nižší intenzitu na každé vibrační kvantové číslo, než odpovídá jejich fundamentálním vibracím, kde se vibrační kvantové číslo mění o jednotku. Pro aktivitu příslušné vinrace tak platí stejný požadavek změny dipólového momentu během vibrace jako v MIR, avšak přistupuje další nenulové kriterium, anharmonicita. Ve spektrech NIR tedy dominují pásy lehkých atomů, jejichž vazby vibrují s vysokou frekvencí, tedy vazby, které přísluší vibracím vazeb C-H, N-H, O-H a v případě molekul obsahujících síru i vazeb S-H. Spektra v této oblasti jsou spektra vibrační, která poskytují informaci o struktuře a vazebných poměrech molekuly stejně dobře, jako je tomu v případě spekter v oblasti MIR. Rozdíl je jen v tom, že NIR spektra jsou daleko komplikovanější a nemohou být interpretována tak jednoduše jako je tomu v případě ostrých a dobře rozlišených pásů, které většinou odpovídají fundamentálním vibracím v MIR spektrech (ŠIKOLA, 2002). Intenzita absorpce v NIR je obecně mnohem nižší než v IR. Z toho vyplývá nutnost (ale i možnost) analyzovat koncentrovanější vzorky. Dalším rozdílem v charakteru NIR a IR spekter je šířka absorpčních pásů. Jelikož v NIR spektru jsou pásy mnohem širší než v IR, není možná přímá identifikace látek na základě přiřazení pásů jednotlivým funkčním skupinám. Z důvodu absence selektivních vlnových délek 25


se při vyhodnocování spekter využívá tzv. celo-spektrálních chemometrických metod (CENTER, 1999). Lze vymezit oblast, kde jsou dominantní pásy kombinačních přechodů (cca 4 000 – 5 300 cm-1), první overtony (cca 4 600 – 7 300 cm-1), druhé overtony (cca 6 000 – 10 000 cm-1) a třetí overtony (cca 8 800 – 14 500 cm-1). Z hlediska kvalitativní informace je možné srovnávat měřená spektra čistých látek s knihovnami spekter, a tak provádět identifikaci látek. K dispozici jsou například knihovny spekter polymerů či farmaceuticky důležitých chemikálií. Často se NIR spektra třídí a klasifikují s využitím chemometrických metod. Významnou měrou se NIR spektra využívají pro kvantitativní analýzu, a to i složitých vzorků v řadě odvětví jako je například petrochemie, farmaceutický, papírenský či potravinářský průmysl (MATĚJKA, 2006). 3.3.1 NIR spektra Molekula je schopna absorbovat elektromagnetické záření tím, že mění stav svého elektronového obalu vibračními pohyby atomů a svojí rotací jako celku. Tomu odpovídají tři druhy energetických přechodů: elektronový, vibrační, rotační (obr. 4, přílohy). Vibrace a rotace se řídí zákony kvantové mechaniky (MÍKA et al., 2008). Nejmenší energetické změny při změnách rotačních stavů (rotačně energetické podhladiny) jsou absorpce v MIR a vzdálené IR oblasti. Absorpcí ve velmi úzkém energetickém intervalu vznikají rotační přechody, na jejichž základě se vytvářejí čárová spektra. Pro molekulové vibrace je zapotřebí větší energie (absorpce v IR oblasti). Molekuly v určitém vibračním stavu (vibrační energetické podhladiny) se nachází v různých rotačních stavech, při vibračním přechodu dochází současně k předchodům mezi různými rotačními podhladinami obou vibračních stavů. Dochází k vibračněrotačním přechodům a ve spektrech vznikají pásy splynutím vzájemně překrývajících se rotačních čar. Přechody valenčních elektronů mezi energetickými hladinami (absorpce v UV/VIS oblasti). Elektronové přechody jsou doprovázeny vibračními. Přechody se někdy nazývají vibronické, ve spektrech je malý počet širokých pásů (MILDE, 2008). Mezi nejčastější způsoby předúpravy spekter před kalibrací patří derivace spekter. Ke zlepšení vypovídací schopnosti (potlačení rušivých momentů, dát přednost užitečným informacím) lze spektra derivovat matematickými postupy (MÍKA et al., 2008). Derivované spektrum je vyjádřením derivovaných hodnot dn A / dλn (n = 1, 26


2,…), spektra A (λ) jako funkce vlnové délky (λ). Častěji je používaná druhá derivace d2 A / d λ2. Po použití druhé derivace se původní peak zobrazí separovaně, zřetelněji, směřující směrem dolů. Další důležitá vlastnost druhé derivace spočívá v odstranění dalších násobných variací základní linie u původního spektra. Na druhou stranu, nevýhodou derivací bývá zhoršení signálu šumu po každém rozlišování spektra (OZAKI et al., 2007).

3.3.1.1 Měření NIR spekter

Snímání NIR spekter dle MÍKY (1997) má předcházet každodenní kontrola monochromátoru (diagnostika) před měřením, abychom si byli jisti, že přesnost nastavení vlnových délek je ± 0,3 nm, opakovatelnosti ± 0,2 a charakteristiky pozadí jsou 20 μ‫׀‬OD, RMS, což odpovídá specifikacím od výrobce. Laboratorní teplota a vlhkost by během měření neměly podstatně kolísat, naprosto nevhodný je průvan. Rovněž zacházení se vzorky a postup vlastního měření by měl být metodicky spíše pomalejší, aby se tím zajistilo, že hodnoty nebudou kvůli tomu vybočovat z řady. Duplicitní (paralelní) plnění materiálu do kyvet a jedno měření je rozhodně vhodnější než dvojí měření jedné naplněné kyvety. Duplicitní snímání spekter (měření) je sice instruktivní, ale ne striktně nezbytné. Na konci měření je vhodné zopakovat „diagnostiku“, abychom se přesvědčili o stabilitě přístroje. Spektra je vhodné zálohovat. Při prohlížení spekter na obrazovce je třeba kriticky posoudit každou abnormalitu. 3.3.2 NIR spektrofotometry Pro NIR

spektrometrii se používají jak disperzní, které obvykle zároveň

pokrývají oblast viditelnou, případně i ultrafialovou, tak spektrometry s Fourierovou transformací (FT), které mnohdy umožňují měřit také ve střední (MIR) případně vzdálené (FIR) infračervené oblasti. NIR spektrometry se podle McCLUREHO et al. (2007) dělí podle způsobu izolace vlnových délek na dvě skupiny: 

přístroje s nespojitým spektrem

27




celospektrální přístroje produkující spektra s rovnoměrně rozloženými daty v rozsahu od 780 do 2 500 nm.

Typy diod (McCLURE et al., 2007): 

soubor emitujících diod (EDA - Emitting Diode Arrays): několik světloemitujících diod komerčně sestavených do mnohokanálového zařízení. Takovýto přístroj může být využíván v mnoha analýzách potravinářského průmyslu. Pásmo propustnosti jednotlivých diod může být omezeno přídavkem filtru s úzkým rozsahem interference. Aby bylo dosaženo uniformního osvětlení od všech diod, vkládá se mezi vzorek a matrici diod difuzér.



další přístroje s emitujícími diodami: McClure a jeho společnost vyrábějí kapesní NIR spektrofotometr s využitím 3 diod pro analýzu chlorofylu a vlhkosti.



Detektor

s fotodiodovou

maticí

(PDA

–

photodiode

detector

arrays)

s technologií nepohyblivých částí. Je určen pro analýzu v oblasti spektra od 200 do 1 000 nm, i když nejsilnější je signál v oblasti od 450 do 900 nm. Filtry: 

Fixní filtry (FF): první typy NIR přístrojů byly sestaveny s těmito filtry. Byly využívány v obilných silech, kde nebyl dostatek času k využití chemických rozborů mokrou cestou. V dnešní době vyrábí několik firem několikanásobné FF přístroje.



Klínové interferenční filtry (WIF – wedge-interference filtres): konstruovány podobně jako FF filtry, s jedinou výjimkou – optické dielektrikum je mezi pásy vytvarován do podoby klínu. Toto tvarování má za následek tvorbu od dlouhých po krátké vlnové délky.



Sklopný filtr. Přístroje s tímto typem filtrů mají 3 zásadní problémy. Za prvé, vztah mezi úhlem filtru a vlnovou délkou je nelineární. Za druhé, pásmo propustnosti filtrů se zvyšuje současně se zvětšováním úhlu filtru od normální hladiny paprsku. Za třetí, transmise peaku se snižuje současně se zvětšováním úhlu filtru od normální hladiny paprsku (McCLURE et al., 2007).

28




Akusticko-opticky laditelné filtry (AOTF – acousto-optical tunable filtres) lze ladit pomocí rádiové frekvence (RF) a dovolují jen specifickým vlnovým délkám projít přes tyto frekvence (WORKMANN, 2004).

Optická mřížka: Světlo ze zdroje záření dopadá na difrakční optickou mřížku, je rozloženo na jednotlivé komponenty vlnových délek pod různým úhlem. Je možno počítat úhly difrakce, účinnost mřížky, intenzitu distribuce a rozlišení (WORKMANN, 2004). Hranoly: Hranol rozkládá světlo na jednotlivá spektra. Disperzní vlastnosti hranolů jsou známé již od sedmnáctého století. Existují tři formy hranolů: disperzní, reflektanční, polarizační. Disperzní (transmisní) hranol byl populární v raném období užívání NIR spektrometrů. Reflektanční hranol byl vyvinut s cílem změnit orientaci směru paprsku. Polarizační hranol je z takového materiálu, který umožní určit druh polarizace (WORKMANN, 2004; McCLURE et al., 2007). FT NIR spektrometry jsou užívány posledních 20 let. Pro vytváření spekter používají zcela jinou metodu. Díky interakci mezi vzorkem, referencí a pohyblivými zrcadly (nebo jinými optickými komponenty) jsou nastaveny energetické modely, vyvolávají interferogramy, které jsou použity k výpočtu absorbance vzorku (McCLURE et al., 2007). Složení NIR spektrometru je podobné přístrojům na měření spekter v MIR oblasti. Obsahuje většinou zdroj záření, dělič paprsků, detektor vzorku, optický detektor, procesor zpracovávající data (CEN et HE, 2007). 3.3.3 FT NIR Ataris Spektrofotometr FT NIR Antaris, přístroj s Fourierovou transformací, která slouží k převodu detektorem zaznamenaného interferogramu na infračervené spektrum. Zdroj záření má výbornou propustnost a trvanlivost. Emituje paprsek bílého světla, který prochází přístrojem a je selektivně absorbován nebo odrážen vzorkem. Spektrofotometr Antaris využívá detektorů zhotovených z India, Gallia, Arsenidu (InGaAs). Tento typ detektoru poskytuje použitelná data v rozsahu 12 000 – 3 800 cm-1 29


(833 – 2 630 nm). Helium/neonový (HeNe) laser je vybaven filtrem, pro redukci síly a reflexe. Detektory instalované v spektrometru Antaris jsou velmi citlivé a mohou se nasytit nebo produkovat zkreslený signál, snímá-li detektor příliš mnoho světla. Zeslabovací kolo v přístroji slouží jako dva screeny pro limitování energie vysílané na vzorek. Počítač napojený na NIR spektrofotometr je vybaven softwarem zpracovávající změřená spektra. Měřit na FT NIR Antaris lze s využitím těchto měřících modulů: 

Integrační sféra – pro difúzně – reflektanční měření tuhých látek a sypkých vzorků



Transmisní modul – pro transmisi tekutých a transparentních vzorků, filmů



Optická sonda – pro vzdálené (méně přístupné) tuhé a práškové vzorky



Zvláštní tabletový analyzér – rovněž dostupný

3.3.3.1 Programové vybavení FTIR spektrofotometru Antaris Software Omnic umožňuje nastavení parametrů spektrofotometru, řídí vlastní měření a provádí různé následné operace se spektry (NICOLET CZ, 2003). Software Result Integration slouží k měření a základnímu zpracování naměřených spekter. Sofistikovaný, snadno ovladatelný balíček pro kontrolu rutinních analýz vzorků v provozu. Umožňuje integrovat kvalitativní i kvantitativní spektrální metody měření s jednoduchými soubory dat, archivaci a tvorbu uživatelských analytických podprogramů bez použití složitého programování nebo makro kódování (NICOLET CZ, 2006a). Program TQ Analyst je důmyslný, snadno použitelný pro vývoj kvantitativních i kvalitativních metod infračervené spektroskopie a analýzu vzorků. Použité algoritmy umožňují výpočet koncentrace komponent nebo klasifikaci neznámých látek za použtí souboru kalibračních standardů. Za jeho pomoci lze také pouze měřit a zaznamenávat pouze výšku a plochu zvoleného pásu (NICOLET CZ, 2006b). Pro kvantitativní analýzy nabízí TQ analyst následující techniky: jednoduchý Beerův zákon, CLS (Classical Least Squares – klasické nejmenší čtverce), SMLR (Stepwise Multiple Linear Regression – postupná vícenásobná regrese), PLS (Partial Least Squares – částečně nejmenší čtverce), PCR (Principle Component Regression – komponentní regrese), (NICOLET CZ, 2006b).

30


Jednoduchý Beerův zákon: tato technika využívá k vytvoření klasického Beerova - Lambertova – Bougherova zákona (absorbance se u zvoleného spektrálního pásu zvyšuje úměrně s koncentrací). Použití této metody vyžaduje měření výšky nebo plochy jediného pásu pro každou komponentu, přičemž každá komponenta musí mít nejméně dvě koncentrační hodnoty. Pro každou komponentu je vytvářena samostatná kalibrační závislost. Tímto způsobem je možno řešit jednoduché analytické problémy (NICOLET CZ, 2006b). CLS: algoritmus CLS je podobný algoritmu pro výpočet podle Beerova zákona, řeší však alternativu překrývajících se pásů jednotlivých komponent. Kalibrační model může být založen na výšce nebo ploše spektrálního pásu, může však také použít soubor mnoha bodů ve spektrálním rozsahu širším než je izolovaný pás. Metoda může používat data s překrývajícími se pásy komponent, protože kalibrační model vyjadřuje posuzované křivky jako lineární kombinaci absorbancí každé s přispívajících komponent (NICOLET CZ, 2006b). SMLR: je metoda, která vyjadřuje koncentraci jako funkci absorbance (na rozdíl od CLS, která postupuje opačně). Kalibrační model SMLR může být založen buď na výškách spektrálních pásů, nebo na průměrné výšce v regionu. Pro každou komponentu je voleno více pásů nebo regionů, standardně 3. S každým regionem může být asociováno i více komponent. Software automaticky postupně vyhledá regiony pro první komponentu a teprve pak postupuje k další. Vybrané regiony není možné editovat, lze však vymezit, v jaké oblasti mají být vyhledávány, omezit nebo zvýšit jejich počet a určit minimální šířku a minimální vzdálenost mezi regiony (NICOLET CZ, 2006b). PLS: tato metoda je založena na statistickém pojetí kvantitativní analýzy. Algoritmus PLS zkoumá zadanou část nebo části spektra komplexně a využívá oblasti, které jsou statisticky proměnlivé jako funkce koncentrace dané komponenty. Kalibrační model je vyvinut v jednom kroku při využití spektrálních a koncentračních informací v tabulce standardů. Úspěch při vývoji kalibračního modelu je následující: 

Počet kalibračních standardů je minimálně trojnásobkem počtu stanovovaných komponent



Všechny standardy by měly obsahovat všechny stanovované komponenty



Koncentrace komponent ve standardech se musí měnit nezávisle (nevhodné je generování kalibračních standardů ředěním základního roztoku) 31


PCR: je další statistickou kvantitativní technikou, která zkoumá vybranou oblast nebo oblasti měřených spekter. Je podobná PLS, probíhá však ve dvou krocích. Nejprve jsou spektrální informace využity k výpočtu PC (principal components). Kalibrační model je vytvořen v dalším kroku jako závislost PC na koncentraci stanovovaných složek (NICOLET CZ, 2006b). Pro definování vhodného experimentálního postupu při kvalitativní klasifikaci vzorků musíme nejprve posoudit několik faktorů. Nejdůležitější je počet materiálů, které musí zvolený algoritmus rozlišit, počet standardů dostupných pro definici každého známého materiálu a kvalita spektrální informace dostupná pro neznámé vzorky a standardy. TQ Analyst nabízí následující techniky: similarity match (test podobnosti), distance match (test odlehlosti), discriminant analysis (rozlišovací analýza), search standards (vyhledávání standarů v knihovně), QC compare search (srovnávání s třídami standardů). TEST PODOBNOSTI je spektrální klasifikační technika, která indikuje, jak přesně se neznámý materiál shoduje s materiálem známým. Definována je jedna třída za použití více standardů. Srovnání může být současně prováděno ve více regionech. Výsledkem je tzv. match value (hodnota ztotožnění), která může být buď ve formátu 0100, kde 100 je perfektní shoda anebo 100-0, kde je perfektní shodou 0. Pro výstup lze určit limitní hodnoty, a tak označovat vzorky, které jsou pod (nebo nad) limitní hodnotou. TEST ODLEHLOSTI stanovuje, jak přesně se zkoumaný vzorek shoduje s jednou ze dvou či více tříd známých materiálů. Doporučuje se použít minimálně 5 standardů pro každou třídu. Spektra standardů by měla být velice podobná a měla by se lišit jen v intenzitách pásů v několika klíčových oblastech. Příkladem použití je kontrola obsahu aktivní substance v tabletách, které mají několik různých úrovní „síly“. Spektrum neznámého vzorku se porovnává s průměrným spektrem tříd a sleduje se, zda se neodchyluje více než jednotlivé standardy. Výsledkem je opět match value v intervalu 100-0, kde perfektní shodou je 0 (tj. 0% frekvencí nepřesahujících práh daný směrodatnou odchylkou standardů). ROZLIŠOVACÍ ANALÝZA určuje třídu (nebo třídy), které jsou nejpodobnější neznámému materiálu. V kalibračním modelu je specifïkováno více tříd, přičemž každá třída je popsána libovolným počtem standardů. Pro analýzu může být použito i několik 32


oblastí posuzovaného spektra. Výsledkem je jméno třídy (nebo tříd), které jsou nejpodobnější

posuzovanému

vzorku.

Součástí

výsledku

může

být

i

tzv.

Mahalanobisova vzdálenost, tj. vzdálenost hodnoceného spektra od těžiště každé třídy. Takto lze elegantním způsobem „kvantifikovat“ kvalitu neznámého materiálu. VYHLEDÁVÁNÍ STANDARDŮ V KNIHOVNĚ určuje, který ze známých materiálů je nejpodobnější neznámému vzorku. Pro definici známých látek je použit vždy jeden standard. Nelze zde slučovat knihovny do skupin, pro vyhledávání však může být v programu TQ Analyst použito několik regionů spektra. Výsledkem je název nejpodobnějšího standardu, jeho index a hodnota je 0-1000, kde 100 je perfektní shoda. SROVNÁNÍ S TŘÍDAMI STANDARDŮ vyhledá třídu standardů nejpodobnější analyzovanému vzorku. Musí být definovány nejméně 2 třídy, každá může obsahovat několik standardů. Pro analýzu může být použito i více vybraných regionů spektra. Výsledkem je jedna nebo více nejpodobnějších tříd a match value, což je vlastně procento shody v definovaném regionu s nejpodobnějším standardem ve třídě. Ideální shoda je 100% (NICOLET, 2006b). 3.3.4 Výhody a nevýhody NIR spektroskopie Spektrometrie v blízké infračervené oblasti je instrumentální metoda, která zachytává spektra potravin a ostatních materiálů. Získaná spektra jsou využívaná jak v kvalitativní, tak kvantitativní analýze. NIR spektrometrie je velmi populární z mnoha důvodů: 

rychlost (spektrum lze naměřit během desetin sekund),



malá nebo žádná příprava vzorků (pokud se vzorek upravuje, jedná se o velmi jednoduchou úpravu),



mnohonásobná analýza za použití jednoho spektra



nedestruktivnost (McCLURE, TSUCHIKAWA, 2007).



snadná obsluha platí zejména při použití řádně vyvinuté, nejlépe validované metody



na rozdíl od IR, NIR umožňuje měření přes sklo, což otvírá možnosti jeho využití při on-line monitorování a kontrole procesů



ideálně se hodí k analýze vzorků s vysokým obsahem vody (CENTER, 1999) 33




vysoká spolehlivost (ŠIKOLA, 2002) V souvislosti s výhodami je třeba zároveň uvést některá omezení NIR analýzy,

která vzhledem k nízké intensitě vibračních pásů většinou neumožňuje použití ve stopové analýze a vyžaduje vyšší náklady na vytvoření kalibračního modelu, neboť pro získání kalibrační závislosti je třeba použít asi 4-5x více kalibračních vzorků. Při použití regresních NIR-modelů by měl NIR přístroj atypické vzorky bezpodmínečně ihned identifikovat, aby varoval uživatele před extraportací mimo oblast platnosti modelu. Proto přímá kalibrace na hodnoty z malého počtu referenčních vzorků bývá značně riskantní. Na druhé straně jsou vyšší náklady na kalibraci vyváženy skutečností, že takový model přináší dostatečnou informaci pro identifikaci odlehlých výsledků a zjištění interferujících látek ve vzorcích (ŠIKOLA, 2002; MÍKA, 1996). Další nevýhody NIR spektroskopie podle CENTERA (1999): 

naměřená spektra jsou těžko interpretovatelná a jejich vyhodnocení vyžaduje použití počítače vybaveného náležitým chemometrickým softwarem



věrohodnost kvantitativních výsledků dosažených s NIR závisí na přesnosti použité referenční metody, protože ta ovlivňuje kvalitu vytvořeného kalibračního modelu Nelze si dost dobře představit, že by se pomocí NIRS dosáhlo vyšší přesnosti

měření, než mají výchozí nejlepší tradiční metody, nanež byla NIRS kalibrována. Metody mokré chemie, in vivo -

pokusy či degustace zůstanou tedy rozhodčím

kritériem při posuzování přesnosti měření pomocí NIRS (MÍKA, 1996).

3.3.5 Využití NIR spektroskopie

3.3.5.1 Kvalitativní analýza Použití NIR spektroskopie při kontrole kvality v potravinářském a dalším průmyslu si vyžádala vyvinutí predikčních modelů, které by vzorky přiřazovaly do různých kvalitativních skupin nebo tříd. K takovým způsobům predikce může sloužit metoda diskriminační analýzy (KAROUI et al., 2003). 34


Diskriminační analýza se zabývá závislostí na jedné kvalitativní proměnné na několika kvantitativně proměnných. Objekty jsou charakterizovány sérií deskriptorů (parametrů). Tyto parametry musí být kvantitativní. Dále je známá příslušnost všech objektů do jedné ze skupin. Diskriminační analýza se používá k určení parametrů, které jsou diskriminující mezi dvěma nebo více skupinami (ANONYMb, 2006). Z matematického hlediska je nutno vyvinout model, který definuje průměr a směrodatnou odchylku pro každý vzorek multidimenzionálního prostoru a poté otestovat do které skupiny náleží neznámý vzorek. Tento test je založen na měření vzdálenosti, Mahalanobisově vzdálenosti (OSBORNE, 2000). Mahalanobisova vzdálenost měří vzdálenost daného vektoru pozorování od výběrového centroidu, tzn. od průměru vícerozměrných hodnot v daném výběru (KÁBA et al., 1998). Aplikaci diskriminační analýzy můžeme rozdělit do čtyř obecných kroků. V prvním kroku určujeme základní objekty, na kterých budeme diskriminační analýzu provádět. Druhým krokem je přiřazení jednotlivých objektů k vybraným skupinám. Tyto skupiny jsou vlastně nezávislé proměnné a musejí být přesně definovány před samotnou aplikací diskriminační analýzy. Třetím krokem je určení charakteristických rysů společných pro všechny objekty, tzv. nezávislých proměnných, tak, aby co nejlépe určovaly prvky (objekty) v dané skupině. Čtvrtým a posledním krokem je pak, jak už bylo řečeno výše, najít a analyticky vyjádřit takovou funkci, která by co nejlépe obě skupiny oddělovala (GURNÝ et GURNÝ, 2009). Častým cílem je diskriminovat již známé skupiny objektů na základě skupiny kvantitativních parametrů (deskriptorů). Důvodem pro to může být přiřazení nového objektu do jedné ze skupin (identifikace) nebo jednoduše určení vlastností zástupců jednotlivých skupin (diskriminace), (ANONYMb, 2006). Kvalitativní analýza slouží ke klasifikaci vzorků podle jejich NIR spekter, např. identifikaci a kvalifikaci surovin i konečných produktů. K vizualizaci dat automaticky probíhajících klasifikačních metod lze použít např. metodu hlavních komponent (PCA) s cílem snížit počet proměnných (scores) a vzorky zobrazit v malorozměrovém grafu (obvykle oktaedru). Automaticky neprobíhající klasifikační metody jsou založené buď na korelacích nebo na měření vzdáleností (distanční), lineární diskriminační analýza (LDA), dále na ty, které kladou více důrazu na podobnost vzorků uvnitř třídy, (např.

35


SIMCA), diskriminanční analýza částečných nejmenších čtverců (PLS –DA) a umělých neuronových sítí (ANN) (MÍKA et al., 2008). ANN je nejmodernější metoda diskriminace, jejíž algoritmy se dále vyvíjejí. Ze všech predikčních metod poskytuje nejlepší výsledky, avšak pro svou správnou funkci se ke kalibraci požaduje více jak 500 vzorků. Přední světoví výrobci NIR analyzátorů dodávají s přístrojem též kalibrační rovnice, vypracované z pečlivě vyselektovaných více než 6 000 vzorků pro jeden hodnocený znak (MÍKA et al., 2008).

3.3.5.2 Kvantitativní analýza NIR spektrometrie se dle MATĚJKY (2008) výrazně uplatňuje v kvantitativní analýze. V rámci transmisních měření se obecně ve spektroskopii vychází z platnosti Lambertova – Beerova zákona, kdy pro každou jednotlivou složku i směsného vzorku platí následující vztah: A λ,i = ε λ,i b ci Kde A

λ,i

je příspěvek i-té složky k celkové absorbanci při Aλ dané vlnové délce λ,

ελ

je molární absorpční koeficient i-té složky při dané vlnové délce λ

b

je optická tloušťka absorbujícího prostředí

ci

je je koncentrace i-té složky ve směsi Celková absorbance Aλ dané vlnové délce λ je pak součtem příspěvků od všech

m nezávislých složek zkoumaného systému:

3.3.6 Aplikace NIR spektroskopie v průmyslu

Spektroskopie v NIR oblasti se v potravinářství a zemědělství uplatňuje už od 60. let (stanovení vody, proteinů, olejů, tuků, sacharidů). Další uplatnění našla ve farmacii, petrochemii, medicíně a při sledování životního prostředí (ČURDA et al., 2002).

36


3.3.6.1 Chemický a farmaceutický průmysl

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti je hojně využíváná v analýzách chemického i farmaceutického průmyslu. Pomocí NIR spektroskopie a umělých neuronových sítí (ANN´S) DOU et al. (2005) stanovovali dvě základní složky (paracetamol a amantadin hydrochlorid) v tabletách a prášku, které obsahovaly kombinaci těchto dvou složek. Autoři potvrdili vhodnost použití metod ANN a NIR spektroskopie při analýze pevných farmaceutických vzorků. Cílem studie TABASIHO et al. (2009) bylo zjistit, zda je NIR přístroj natolik citlivý, aby byl schopen zaznamenat uvolňování theofylinu z matrix tablet při rozpouštění. Výsledky této studie jasně ukazují, že NIR spektroskopie spolu s multivariační tvorbou modelů dokáže úspěšně rozlišit různá množství Eudragitu NE 30D v lékové formě tablet a korelovat vliv rozpustnosti každé šarže odpovídající složení tablety. Rostoucí zájem farmaceutického průmyslu o NIR – CI spektroskopii (Near Infrared Chemical Imaging = chemická zobrazovací technika za pomoci NIR spektroskopie) je značný. Tato metoda je plně schopna poskytovat analytické výsledky i v oblastech průmyslu, kde je kladen důraz na vysokou jakost. Může sloužit jako univerzální doplněk konvenční NIR spektroskopie v mnoha odvětvích. Přímá analýza vzorků pomocí hyperspektrální zobrazovací techniky poskytuje NIR spektra v každém pixelu obrazu, generuje značné množství informací z jednoho vzorku. V práci autorů CRUZE et al. (2009) byla NIR – CI spektroskopie použita pro kvantitativní analýzu různých komerčně vyráběných acetylsalicylových tablet. Techniku NIR-CI spektroskopie využili také vědci PUCHERT et al. (2010). Cílem práce bylo vyvinout koncept s cílem spolehlivě identifikovat padělané tablety, které jsou velmi podobné pravým. Dříve publikované NIR–CI studie používají homogenitu jako klíčový ukazatel pro identifikaci padělků. S ohledem na to, PUCHERT et al. (2010) vyvinuli novou metodu s možností využití mnohem více prostorových informaci pro odhad homogenity. Celulóza a laktóza jsou nejčastěji používané látky při nedovolené výrobě extáze. V práci BAERA et al. (2007) bylo využít blízké infračervené spektroskopie pro stanovení různých chemických forem těchto dvou látek, stejně jako rozlišení jejich 37


původu (výrobce). Identifikace pomocných látek nebyla vždy zřejmá, zejména byla-li přítomna více než jedna pomocná látka. Při srovnávání se nicméně objevily skupiny podobných tablet. Mimo farmaceutický průmysl je NIR spektroskopie často využívána ostatními odvětvími chemického průmyslu, např. petrochemickým. MACHO A LARRECHI (2002) v úvodu své studie citují mnohé autory, kteří se zabývali již v 80. letech 20 století např. stanovením oktanového čísla v benzínu, rozpoznávání různých derivátů nafty apod.

3.3.6.2 Potravinářský průmysl

Brambory a výrobky z brambor Fyzikálně chemické vlastnosti škrobu brambor s použitím NIR techniky vyzkoušeli GUOQUAN et al. (2006). Vzorky škrobu byly naměřeny na NIR spektrofotometru a následně byly spektra použita ke kalibraci obsahu amylosy, procentu amylosy, celkovému obsahu škrobu, obsahu bílkovin, fosforu, rozpustnosti, bobtnavosti, procenta granulace a schopnosti krystalizace, viskozity a další. Korelační koeficienty kalibrace dosáhly hodnot mezi 0,85 – 0,92 a relativně malých standardních chyb predikce. Díky těmto výsledkům lze doporučit využití NIR spektroskopie při analýze škrobu v bramborách. SHIROMA et al. (2009) zkoušeli možnost NIR spektroskopie při kontrole jakosti bramborových lupínků. K pokusu použili 15 komerčních druhů bramborových chipsů. Měřeny byly v režimu reflektance. Olej z chipsů byl lisován a spektra změřena na ATR přístroji s kontrolou teploty. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS metody. Přičemž byly tvořeny kalibrace pro obsah tuku a vlhkosti. Korelační koeficient pro model vlhkosti byl 0,97 a směrodatná odchylka validace (SECV) < 0,3% jak u NIR, tak MIR techniky. U kalibračního modelu pro obsah tuku pak korelační koeficient 0,96 a SECV < 1,6%.

38


Mléko a mléčné výrobky Nejvíce využívaná spektroskopická metoda v mlékárenském průmyslu je infračervená spektroskopie ve střední (MIR) a blízké oblasti (NIR) elektromagnetického záření (WÜST et al., 2003). Ve výzkumu mléka a mlékárenských výrobků se NIR spektroskopie hojně využívá. Mnohé výsledky jsou pak převedeny do praxe.

V roce 2000 se

SCHMILOVITCH et al. zabývali stanovením obsahu tuku u nehomogenizovaného mléka. 120 vzorků mléka bylo měřeno v rozsahu 600 - 1 200 nm, paralelně s tímto měřením probíhalo také měření stejných vzorků na Milkoscanu. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí softwaru Spectra Metrix. V případě monotonních výchylek koncentrace měřené složky (tuku) bylo výsledné spektrum měření velmi podobné spektru v homogenním stavu. Celou řadou prací týkajících se rozborů složení syrového nehomogenizovaného mléka a obsahem somatických buňek se dle ČURDY et al. (2002) zabývala Tschenková s kolektivem. Pomocí transmitančních spekter nehomogenizovaného syrového mléka je možné rozeznat mléko od dojnice se zánětem vemene (mastitidou). V oblasti analýz sýrů bylo cílem práce DRAČKOVÉ et al. (2009) vytvořit kalibrační modely pro stanovení obsahů polyaminů ve tvarůžcích pomocí FT-NIR spektrometrie. Vzorky dovezené přímo od výrobce byly skladovány po dobu 7 týdnů a byly skladovány při dvou různých teplotách (5°C, 20°C). Obsah polyaminů byl u vzorků stanovován 1krát (5°C) a 2krát (20°C) týdně metodou HPLC s předkolonovou derivatizací dansylchloridem. Pro měření na FT-NIR spektrometru byly vzorky homogenizovány mletím a následně analyzovány ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. Spektra byla měřena na integrační sféře v režimu reflektance s kompresní kyvetou. Kalibrace pro obsah putrescinu, spermidinu, sperminu (mg.kg-1) byly zhodnoceny na základě výsledků kalibračních koeficientů (R2KAL) a směrodatných odchylek validace (SECV): 0,666 (SECV = 142,0); 0,755 (SECV = 2,29); 0,627 (SECV = 7,07) pro vzorky skladované při 20°C; 0,8222 (SECV = 46,4); 0,833 (SECV = 1,31) a 0,679 (SECV = 2,48) pro vzorky skladované při 5°C . Nebyly zjištěny statisticky průkazné rozdíly (p = 0,05) mezi hodnotami zjištěnými pomocí FT-NIR spektroskopie a referenčními metodami. Studie ukázala, že použití NIR spektroskopie pro stanovení

39


minoritních složek je komplikované, protože IR spektra se liší v důsledku různého fyzikálně-chemického složení. ANDERSEN et al. (2010) vyrobili smetanové sýry o různé hodnotě pH (4,4; 4,7; 5,0), obsahu soli (0,4; 0,65; 0,9 %) a tuku (0; 3; 6; 9%). Následně byly zhotovené sýry proměřeny 4 spektroskopickými metodami – flourescenční spektroskopií, spektroskopií v blízké infračervené oblasti (NIR), fourierovou transformační spektroskopií (FT-IR) a nukleárně resonanční relaxometrií (LF-NMR). Všechny metody poskytly určitý druh informací o sýrech podle své spektrofotometrické příslušnosti. Pouze metoda LF NMR, která měřila mobilitu vody a tuku, byla ovlivněna všemi třemi vytvořenými parametry. Nejlepší metoda v predikci krémové textury s využitím chemometrie byla NIR a FT-IR spektroskopie. Dalším zkoumáním schopností NIR spektrometru se věnovali ŠUSTOVÁ a MLČEK (2006a). Ve své práci se zabývali využitím senzorických a přístrojových metod k hodnocení kvality eidamských sýrů v průběhu zrání. Přístroj NIR Nicolet Antaris byl kalibrován výsledky ze senzorického hodnocení a výsledky z přístroje na měření mechanických vlastností materiálů, TIRA test 27025. Jednalo se o stanovení tvrdosti v průběhu 4 měsíců zrání eidamských sýrů. Výsledky tvrdosti stanovované senzoricky vykazovaly značné rozdíly po měsíčním stanovování. Výsledky z přístroje TIRA test měly již určitý průběh, přesto byla kalibrace FT NIR přístroje velmi obtížná a přinesla i díky většímu rozpětí maximální a minimální hodnoty oproti senzorické analýze horší výsledky. Při konfrontaci obou způsobů stanovení tvrdosti (senzorická analýza vs. TIRA test) autoři jednoznačně doporučují použití přístrojové techniky i přes její zdlouhavou a náročnou analýzu. KAROUI et al. (2006) využili NIR techniku ke stanovení chemických parametrů sýrů ementálského typu z různých geografických území Evropy. Celkem bylo analyzováno 91 sýrů vyráběných v Rakousku, Finsku, Německu, Francii a Švýcarsku. Pomocí referenčních metod byl stanoven tuk, celkový dusík, ve vodě rozpustný dusík, nebílkovinný dusík, sůl a pH. Spektra byla naměřena pomocí spektrofotometru Büchi NIRLab N-200. Po vytvoření kalibračního modelu, byly vypočteny následující kalibrační koeficienty: pro tuk (R2) 0,92; sůl 0,39; celkový dusík 0,82; ve vodě rozpustný dusík 0,77; bílkovinný dusík 0,80; pH 0,43. Z výsledků autorům vyplynulo, že je možné NIR spektroskopii využívat ke stanovení tuku, dusíku, ve vodě rozpustného 40


dusíku i nebílkovinného dusíku. Avšak metody pro stanovení pH a soli nejsou příliš funkční. Z mléka různých plemen ovcí (Castellana, Churra a Assaf) o různém počtu somatických buněk (pod 500 000, mezi 1 000 000 a 1 500 000 a nad 2 500 000) byly vyrobeny zrající sýry. Syrové nestandardizované mléko bylo při 30 °C zakysáno kulturou, která obsahovala mikroorganismy Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetillactis. Teplota byla následně ještě navýšena na 32 °C a při této teplotě mléko prokysávalo po dobu 30ti minut do dosažení pH 6,5 - 6,6. V této fázi bylo do mléka přidáno syřidlo (kombinované s 90 % chymosinu a 10 % pepsinu). Čas koagulace byl různý, od 40 do 70 minut. Po zasýření byla syrovátka zpracovávána krájením, přetahováním, dohříváním, následně formována do příslušného tvaru a lisována. Sýry byly soleny v solných lázních. Zrání probíhalo 12 měsíců, po první 3 měsíce se vlhkost postupně snižovala. Pro stanovení texturních vlastností byly ze středu bochníků sýrů vykrajovány špalíčky o velikosti 1x1 cm silné a 3 cm dlouhé. Textura byla měřena instrumentálně na přístroji TX-T2iplus s Warner-Bratzlerovou sondou. Měření v infračervené oblasti probíhalo na přístroji NIRSystem 5000 firmy Foss pomocí optické sondy v režimu reflektance. Bylo měřeno celkem 96 vzorků. Z toho bylo 76 použito k tvorbě kalibrace a 20 k externí validaci. Kalibrační model byl vytvořen pomocí algoritmu PLS. Výsledný kalibrační koeficient kalibrace dosáhl hodnoty 0,961, směrodatná odchylka 2,1. Metoda byla ověřena i na neznámých vzorcích a prokázala se jako funkční pro měření tvrdosti sýrů (REVILLA et al., 2009). V oblasti fermentovaných mléčných výrobků, stejně jako u ostatních mlékárenských produktů, převažuje při kontrole suroviny, meziproduktu i finálního výrobku střední IR oblast. Obsah vody v bílých jogurtech byl zjišťován pomocí různých technik: KarlFischerovou volumetrickou titrací (KF), v blízké (NIR) a střední infračervené oblasti (MIR), sušením v sušárně a pomocí analyzátoru vlhkosti. Výsledky stanovené v sušárně byly použity jako referenční. Problém však je, že tato referenční metoda sušení vzorku v sušárně je časově náročná. Analyzátor vlhkosti by zdlouhavou metodu mohl nahradit, avšak výsledky stanovené jeho pomocí byly řádově o jedno procento nižší, než výsledky stanovené sušením. Další metody (NIR, MIR A KF titrace) musely být před stanovení optimalizovány. Pro KF titraci byl použit jako rozpouštědlo metanol. Vzorky 41


se titrovaly při pokojové teplotě. Pro FTIR metodu byl použit sokratický acetonitrill jako rozpouštědlo. Následně byly stanoveny příslušné píky pro obsah vody v jogurtech, v 1 640 cm-1 3 310 cm-1 pro MIR oblast a 10 270 cm-1 6 530 cm-1 pro NIR oblast. Pro techniku MIR byla použita metoda ATR. Vzorky pro NIR analýzu byly umístěny do kyvet. Nejlepších výsledků bylo dosaženo pomocí sušení, avšak po optimalizaci metody byla jako výborná alternativa určena NIR spektrometrie a to v oblasti 10 270 cm-1. Navíc je metoda rychlá a jednoduchá (ADAM et al., 2009). Cílem práce RŮŽIČKOVÉ et al. (2004) bylo posoudit možnost aplikace FT NIR spektroskopie ke kontrole složení a kvality jogurtů. Vzorky byly měřeny referenčními metodami a na FT NIR spektrometru v režimu reflektance ve spektrálním rozsahu vlnočtů 10 000 až 4000 cm-1 se 100 scany s časem snímání cca. 1,5 min. Spektra vzorků byla měřena třikrát a pro kalibraci bylo použito průměrné spektrum. Byly zjištěny vysoké korelační koeficienty kalibrace pro sušinu (0,928) a tuk (0,961). Maso V průběhu minulých tří dekád se NIR spektroskopie stala velmi populární v oblasti určování základní charakteristiky masa a masných výrobků. V mnoha vyspělých zemích patří maso a masné výrobky mezi hlavní potraviny. Složení masa je velmi heterogenní, chemické, technologické i senzorické atributy jsou určovány mnoha faktory. Ať již se jedná o druh zvířete, plemeno, věk zvířete, pohlaví nebo ostatní faktory spojené s post - mortem jako je teplota nebo doba skladování. Pro všechny tyto důvody je nutné pečlivě sledovat kvalitu masa i masných výrobků (PRIETO et al., 2009). Autoři SINELLI et al. (2010a) studovali čerstvost masa pomocí infračervené spektroskopie. Tuto metodu si vybrali především z důvodu její rychlosti a dobré schopnosti začlenit ji do automatických procesů ve výrobě. K analýze bylo použito mleté vepřové maso balené v modifikované ochranné atmosféře, které bylo skladováno při třech různých teplotách. Spektra byla naměřena pomocí FT NIR a FT IR spektrofotometrů. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí metody PCA. Bezpečně se podařilo rozlišit jednotlivé skupiny vzorků skladovaných při různých teplotách a rovněž byly zaznamenány rozdíly mezi jednotlivými časy uskladnění. Možnost použití NIR spektroskopie při kontrole kvality typických španělských salámů vyzkoušeli autoři GAITÁN-JURADOA et al. (2008). K analýze obsahu tuku, 42


vlhkosti a proteinu byl použit diode array spektrofotometr. Vzorky salámů byly měřeny v neporušeném stavu, v celku a také po homogenizaci. Výsledné hodnoty kalibračních koeficientů poukázali na vhodnost NIR spektrometrie při kontrole jakosti salámů. Přičemž jako vhodnější se ukázala kalibrace salámů v homogenizovaném stavu. Integrovaný systém, který obsahoval spektroskopický subsystém VIS/NIR a zesilovač spektrálního zobrazování byl použit při testování separace jatečných těl drůbeže. Do skupiny pokusných JOT byla zařazena těla zdravých i nemocných zvířat. Při testování se prokázala schopnost integrovaného systému správně rozřadit zdravá a abnormální těla jatečné drůbeže. Při klasifikaci individuálních systémů byla chyba spektrofotometrické sekce 2,6 %, sekce zobrazovací pak 3,9 %. Proto lze výhodně využít integrovaný systém v praxi pro separaci těl zdravotně závadné drůbeže od zdravotně nezávadných (PARK et al., 1996). Potenciál VIS a NIR spektroskopie byl prověřen v souvislosti s rozpoznáváním textury a barvy vzorků sušených šunek. Senzorická analýza byla provedena na 117 sušených šunkách s kostí. Byly nařezány 4 cm tlusté plátky, které byly vakuově zabaleny a zmraženy a v tomto stavu ponechány do doby spektrofotometrické analýzy. Vzorky byly změřeny v rozsahu 400 – 2 200 nm pomocí optické sondy. K rozdělení šunek podle vzhledu byla použita metoda PCA. Celková přesnost metody pro analýzu textury byla 88,5%; pokud se jednalo o barvu 79,7%. Pro vyhodnocení textury i barvy byl dále využit algoritmus PLS. Korelační koeficienty kalibrace dosáhly hodnot 0,97 pro texturu a 0,82; korelační koeficienty validace pak 0,86 a 0,69. Koeficienty kalibrace i validace, stejně jako chyby měření potvrdili možnost využití NIR spektrometrie při zjišťování textury i barevnosti sušených šunek (GARCÍA-REYA et al., 2005). Další možností jak využít FT NIR spektroskopii zjišťovali FERNÁNDEZCABANÁSA et al. (2011). Ve svém výzkumu se zabývali zjišťováním nutriční hodnoty masných kyselin v pyrenejských sušených uzeninách. V celkem 86 vzorcích sušených uzenin byl chemickou cestou zjišťován obsah jednotlivých kyselin SFA (nasycené MK), MUFA (mononenasycené MK) a PUFA (polynenasycené MK). K tvorbě kalibračních modelů byl použit algoritmus PLS. Vybrané modely pro obsah hlavní MK (C14:0, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 a C18:2) dosáhly hodnot korelačních koeficientů křížové validace mezi 0,41 a 0,84 se standardní chybou validace mezi 0,07 % a 1,51 %. Kalibrace vytvořená pro SFA, MUFA a PUFA dosáhly hodnot korelačních koeficientů validace 0,86; 0,53 a 0,61 a standardní chyby 0,98 %; 1,47 % a 0,88 %. Získané 43


výsledky naznačují schopnost NIR spektroskopie poskytnout účinnou kontrolu kvality sušených uzenin, neboť umožňuje odhad hlavních složek a / nebo klasifikaci na základě jejich profilů mastných kyselin rychle a účinně. Tyto informace by mohly být použity pro odhad trvanlivosti výrobků. Analýzou masa s pomocí NIR spektroskopie se zabýval také MLČEK et al. (2006b). Jejich práce se zabývala stanovením základních složek vepřového a hovězího masa (obsah tuku, bílkoviny a vody) pomocí FT NIR spektroskopie. Vzorky byly analyzovány na přístroji FT NIR Nicolet Antaris v režimu reflektance. Ke kalibraci přístroje byly použity referenční výsledky z klasických analýz. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí PLS algoritmu (metoda minimálních čtverců) a ověřeny křížovou validací. Bylo dosaženo vysokých korelačních koeficientů (R) kalibrace (tuk 0,998; bílkoviny 0,976; voda 0,994), následně i validace (tuk 0,997; bílkoviny 0,970; voda 0,993) a velmi nízkých směrodatných odchylek kalibrace i validace (SEC, SEP). Ztestem nebyly zjištěny statisticky průkazné rozdíly mezi referenčními a predikovanými hodnotami stanovení. Metoda NIRS se dle uveřejněných výsledků prokázala jako vhodná pro nahrazení za drahou a časově náročnou chemickou analýzu složení masa. V roce 2009 MLČEK et al. pokračovali v pokusech zaměřených na analýzu vepřového masa s využitím NIR spektroskopie. Z masokombinátu byly odebírány vzorky masa 10 dnů po porážce. Jednalo se o vzorky zchlazeného vepřového masa (výsekové a výrobní) s různým podílem tuku, bílkovin a sušiny. Vzorky byly získány z různých částí jatečně opracovaných těl a také z ořezu, aby se docílila různá škála hodnot tuku, bílkovin a sušiny potřebná na vytvoření kalibračních modelů FT NIR spektrofotometru. Následně byly vzorky najemno pomlety. Referenční analýzy na obsah tuku, bílkovin a sušiny byly použity ke kalibracím FT NIR spektrometru. Vzorky vepřového masa byly následně zmraženy a po 1,5 měsíci byl proveden kalibrační model pro jednotlivé složky a byly porovnány změny oproti čerstvému masu. U kalibračního modelu vepřového masa bylo dosaženo velmi spolehlivých kalibračních modelů pro sušinu, tuk i bílkoviny. Vejce Jak ukazuje práce ZOTTE et al. (2006) NIR aplikace mohou být použity k rozpoznání lyofilizovaných žloutků hus krmených 4 odlišnými krmnými dávkami, rovněž ke stanovení chemických parametrů žloutků husích vajec. Nosnice byly krmeny 44


dusíkatými dietami od dosažení věku 24 týdnů, takto byly následně krmeny 60 dnů. První skupina byla krmena standardní krmnou dávkou a byla tudíž skupinou kontrolní. Dieta dalších skupin byla obohacena o extrudované nebo mleté lněné semínko či jinými produkty bohatými na n-3 masné kyseliny. Kalibrační výsledky prokázaly možnost použití NIR spektrofotometru při analýze chemického složení, rovněž schopnost přístroje rozlišit žloutky od nosnic krmených různou dietou. Další možnosti využití NIR spektroskopie vyzkoušel ZARDETTO (2005) při sledování změn u vařených vaječných těstovin. Byly vyrobeny vaječné těstoviny z pšenice tvrdé a následně sušeny v sušárně při dvou různých teplotách (88°C, 98°C), poté byly změřeny na spektrofotometru. Následně byly vytvořeny kalibrace, které potvrdily schopnost techniky k rychlému zjišťování F1070 hodnot. Monitorování tohoto parametru je jedním z nejdůležitějších kritických kontrolních bodů v procesu výroby těstovin a zaručuje bezpečnost a kvalitu produktu. Rostoucí zájem konzumentů o kvalitní, minimálně technologicky opracované, mikrobiologicky bezpečné potraviny bez přídavků aditiv vede k vyvíjení nových technologií zpracování potravin (použití vysokého tlaku a gama radiace…). S cílem získat představu, zda je proveditelná netepelná pasterace vaječných obsahů, zkoumali autoři SEREGÉLY et al. (2006) účinky ultra vysokého tlaku (UHP) a také možnosti ošetření vajec gama zářením. Tekuté vaječné bílky byly podrobeny ultra vysokému tlaku (400 MPa) po dobu 15 min při teplotě 4 °C a gama záření (3 kGy). Za účelem sledování změn mezi ošetřenými a neošetřenými vaječnými bílky byla použita metoda blízké infračervené spektrometrie a měření na přístroji elektronický nos. Na základě jejich výsledků (porovnání jednotlivých skupin pomocí NIR spektrometrie: skupina ošetřena radiací, tlakem, kontrolní skupina) lze konstatovat, že ozařování (3 kGy) způsobí více drastických změn než metoda UHP. Gama záření vedlo k významným změnám fyzikálních vlastností a chuti vaječných bílků. Navzdory těmto zjištěním bylo rovněž prokázáno, že důležité funkční vlastnosti vaječných bílků nebyly radiačním zářením negativně poškozeny. GIUNCHIA et al. (2008) použili NIR spektrofotometr při sledování čerstvosti vajec. Byly sledovány parametry jako výška vzduchové bubliny, výška bílku a Haughova jednotka. Pro tvorbu modelů byly použity metody PCA, PLS a PLS-DA. Výsledky koleračních koeficientů dosáhla hodnot 0,8497; 0,8883; 0,8222 pro výšku 45


vzduchové bubliny, výšku bílku a Haughovy jednotky. Pomocí NIR spektrometru se podařilo bezpečně rozdělit vejce dle dnů skladování. Čerstvost vajec pomocí NIR spektroskopie sledovali také ZHAO et al. (2010). Byl vyvinut nový algoritmus SVDD (support vector data description – podporovaný vektorový popis dat) ve snaze vyrovnat nerovnováhu počtu zkušebních vzorů. Původní vzorky vajec byly naměřeny v rozsahu spektra 10 000 – 4 000 cm−1. Současně s novým algoritmem SVDD byly použity i jiné metody (např. PLS-DA, ANN aj.) pro tvorbu diskriminačního modelu. V porovnání s ostatními metodami dosáhl algoritmus SVDD lepších výsledků. Identifikace čerstvých i nečerstvých vajec se povedla s přesností 93,3 %. Práce potvrdila možost použití NIR spektroskopie v analýze čerstvosti vajec a metodu SVDD jako vhodnou při nevyváženém počtu zkušebních vzorků.

Obilniny a mlýnské produkty NIR spektroskopie hrála a stále hraje velkou roli ve zjišťování složení a kondice obilnin, produktů v mlýnech i při jejich dalším zpracování. NIR filtrové spektrofotometry byly ke komerčnímu použití přístupné od poloviny 70tých let. Počátkem 80tých let našly široké uplatnění v Evropě a severní Americe, primárně k zjišťování obsahu bílkovin, vlhkosti v mouce. V UK je měřeno NIR spektroskopií přes 90 % mletých mouk právě na uvedený obsah vlhkosti a bílkovin (SCOOTER et MILLAR, 2004). JIRSA et al. (2008) využili NIR spektrometrii k hodnocení vlastností pšeničného těsta mouky. V práci bylo použito 281 vzorků pšeničných mouk. Mouky byly připraveny pokusným mletím na laboratorním mlýnu Chopin CD1 – auto při dosahované výtěžnosti 60 až 70 %. Reflektanční infračervená spektra v rozsahu vlnových délek 400 - 2 500 nm s rozlišením 2 byla získána na přístroji NIRSystem 6500. Vzorky mouk byly proměřovány v malých kruhových kyvetách, které jsou opatřeny křemenným sklíčkem propustným pro NIR záření. Spektra v NIR spektrální oblasti v rozsahu vlnočtů 14 500 – 4 000 cm-1 byla získávána na FT-IR spektrofotometru Bruker IFS 66v/S. Při predikci se ukázalo, že její přesnost byla významně ovlivněna ročníkem sklizně pšenice, z čehož vyplývá vhodnost nastavení kalibračních rovnic pro konkrétní ročník. Pro řadu rovnic souvisejících s pekařskou kvalitou byly vyvinuty dobré NIR 46


kalibrace. Kromě hodnocení analytických ukazatelů (obsah bílkovin, Zelenyho sedimentace) metoda umožnila screeningově hodnotit i některé funkční vlastnosti pšeničné bílkoviny hodnocené reologickými přístroji (alveograf) a v omezené míře i vlastnost kynutého těsta.

Aplikace v zemědělství Míka et al. (2008) vytvořili v první fázi pokusu predikce botanického složení porostu knihovnu spekter lučních rostlin. S použitím diskriminační analýzy predikovali hmotnostní podíl (v sušině) agrobotanických skupin (trávy, jeteloviny, byliny) v dvoukomponentních

(vojtěškotrávy)

a

trojkomponentních

směsích

(vzorky

z dočasných a trvalých travních porostů). Stanovení podílu listů mechanickou separací od stébel a květenství je rovněž časově náročná práce, jeho výsledek je zatížen chybou až 30% v důsledku ztrát při manipulaci i vysýcháním zelené hmoty v průběhu separace. Proto se šlechtitel často spokojí s vizuálním hodnocením (bodově, stupnice 9-1) na vegetující rostlině. Hmotnostní podílu listů ve sklízené píci lze stanovit pomocí NIR spektroskopie následujícím způsobem: nejdříve se vytvoří knihovna spekter měřených frakcí, tj. listy (čepele s nebo bez pochev či řapíků), zbylé části rostliny, celá rostlina. Dále se proměří jednotlivé vzorky. Konečně s použitím diskriminační analýzy se stanoví velice rychle a přesně olistění v % (MÍKA et al., 2008).

3.4 Chemometrie Chemometrie, tj. chemická disciplína, která používá matematické metody s cílem navrhovat optimální experimentální postupy a získat maximum relevantních informací z pokusných výsledků, je dnes významným a vědecky dobře fundovaným prostředkem intensifikace a zvyšování efektivity výzkumu a vývoje, řízení výroby, zejména pokud jde o jakost výrobků. Uplatňuje se při získávání ekologických informací, v klinické biochemii a jiných mezioborových praktických problémech (ECKSCHLAGER, 1991).

47


Regresní analýza Regrese je technika používaná ke studiu vztahů mezi dvěmi proměnnými nebo bloky proměnných. Souvislost můžeme charakterizovat určitou hodnotou (pak se jedná o korelační analýzu) nebo ji můžeme popsat vhodnou funkcí (pak se jedná o regresní anlýzu). Pole působnosti této aplikace jsou nezměrné. Cílem regresní analýzy je nalezení vhodného modelu studované závislosti tak, že se snažíme nahradit každou měřenou (experimentální) hodnotu závisle proměnné yexp hodnotou vypočtenou (predikovanou) yvyp čili hodnotou ležící na spojité funkci (modelu) nezávisle proměnné x (FORINA et al., 2004; KOSCHNI et al., 1992; MELOUN, 2007).

Obr. 5: Grafické znázornění podstaty regresní analýzy (MELOUN, 2007)

Lineární regrese je založena na minimalizaci sumy nejmenších čtverců, obvykle využívaná při klasické kalibraci v analytické chemii. Je to základní technika, pod podmínkou, že je použit dostatek statistických parametrů, interval spolehlivosti, chyby predikce apod. Více je regresní technika využívána při vícerozměrné kalibraci (např. u NIR spektroskopie nebo elektronického nosu), ve výzkum vztahů molekulárních struktur apod. (FORINA et al., 2004). Bylo vyvinuto mnoho technik pro metodu regrese: 

OLS – běžné nejmenší čtverce, MLR – mnohonásobná lineární regrese



PCR – regrese hlavních komponent



PLS – metoda nejmenších čtverců 48




ACE – metoda střídavého podmíněného očekávání



Robustní metody



Jiné (nelineární PLS, trojcestná PLS aj.)

Analýza rozptylu, označovaná jako ANOVA (Analysis of Variance) se v chemometrické praxi využívá buď jako samostatná technika nebo jako postup umožňující analýzu zdrojů variability u lineárních statistických modelů. Ze statistického hlediska lze analýzu rozptylu chápat jako speciální příklad regresní analýzy, kde vysvětlující proměnné mají pouze binární charakter a mohou nabývat pouze hodnot 0 a 1. V chemometrické praxi se ANOVA uplatňuje v úlohách: 

Určení významnosti způsobu přípravy vzorků na výsledek chemické analýzy



Určení vlivu typu přístroje, lidského faktoru a obsluhy na výsledek chemické analýzy



Zpracování různých mezilaboratorních experimentů a určení významnosti rozdílů mezi laboratořemi na výsledek chemických analýz



Zpracování plánovaných experimentů, u kterých se systematicky sleduje vliv rozličných faktorů (teploty, času, koncentrace a dalších na výsledek reakce či chemické analýzy (MELOUN a MILITKÝ, 1991).

Shlukování (clustering) Shlukování (clustering), technika průzkumné analýza dat, používá metody na vyhledávání skupin podobných objektů nebo proměnných. PCA metoda (analýza hlavních komponent) a PP (jsou vizuální techniky shlukování). Tyto postupy slouží k posouzení míry shody neznámého vzorku se standardem nebo jeho zařazení do charakterově nejbližší třídy (ČURDA et al., 2002).

Klasifikace a modelování tříd Techniky týkající se klasifikací a modelování tříd bývají maximálně využity zejména

v problematice

chemicko-potravinářské

oblasti

technologické kategorie, původ atd.). Do této skupiny řadíme: 

Diskriminační analýzu 49

(kultivační

kategorie,




Kvadratickou diskriminační analýzu (QDA), modelová verze QDA (UNEQ)



Metodu K-nejbližších sousedů (KNN)



Metodu nezávislého modelování tříd analogů (SIMCA)



Metodu umělých neuronových sítí (ANN)

Validace Pro zjišťování schopnosti funkčnosti modelů byla vyvinuta validace. Některé z procedur validace jsou velmi jednoduché, některé naopak velmi komplexní, v závislosti na možnostech techniky,

počtu

faktorů pro vytvoření

modelu.

Nejjednodušší a také nejrychlejší metodou validace je jednoduchý vývojový set (SES). Používá se k seznámení s některými částicemi základní terminologie. Ve vícerozměrné inverzní kalibraci se pod pojem validace chápe jednak stanovení optimálního počtu proměnných k, jež mají být zahrnuty v modelu a jednak odhad predikční schopnosti modelu. Cílem optimalizace počtu proměnných je nalézt vhodný kompromis mezi příliš těsným (over - fitting) a nedostatečným (under - fitting) proložením kalibračních dat. Nedostatečným proložením je míněna situace, kdy významná část koncentrace c není popsána modelem, protože počet latentních proměnných uvažovaný v modelu je příliš malý. Na druhé straně, příliš těsné proložení znamená, že je modelován i nesystematický rozptyl v datech (tj. šum), a to z důvodu zahrnutí příliš mnoha komponent do modelu. Následkem toho je zhoršená věrohodnost predikované koncentrace. Obě uvedené situace i hledaný kompromis, nazvaný optimum, jsou na obrázku 6 (ANONYMc, 2007).

50


Obr. 6: Predikční chyba versus počet latentních proměnných v modelu (ANONYMc, 2007)

Pro stanovení optimálního počtu latentních proměnných se v praxi využívá dvou postupů: 

Metoda příčné (křížové) validace (cross – validation, CV), je založena na simulaci predikční fáze při skutečné kalibraci. Kalibrační data jsou nejprve rozdělena na určitý počet skupin (gr). V extrémním případě je gr = n a metoda se nazývá "odlož-jeden-mimo" příčná validace (leave-one-out validation). V prvním kroku je sestrojen kalibrační model na základě všech dat kromě první skupiny. Tento model je použit na stanovení koncentrace vzorků první skupiny. Konstrukce modelu a predikce se poté opakuje gr-krát, takže koncentrace každého vzorku je stanovena právě jednou. Srovnání stanovených a referenčních koncentrací kalibračních vzorků poskytuje odhad očekávané chyby koncentrace pro neznámé vzorky v budoucnu, střední kvadratickou chybu RMSECV (SEC)



Metoda predikčního testování externí validace (EV). Externí validace je postavena na použití tzv. tréninkového a monitorovacího souboru, které vznikají rozdělením původních dat. Nevýhodou tohoto postupu je právě zmíněné dělení

51


kalibračního postupu. To musí být provedeno tak, aby vznikly dva reprezentativní soubory o velkém počtu kalibračních vzorků 3.4.1 Chemometrie v NIR spektroskopii Pro stanovovanou složku musí být provedena kalibrace příslušného NIR spektrometru pomocí vhodného souboru kalibračních standardů (min 30 vzorků) o známém složení, které je určeno nezávislou analytickou metodou. Kalibrační vzorky by měly charakterizovat v maximální míře vlastnosti analyzovaných vzorků a měly by pokrývat celý koncentrační rozsah. Úzké koncentrační rozpětí kalibračních vzorků lze řešit přípravou modelových vzorků. Typická NIR spektra jsou charakterizována lineárním rostoucím trendem od kratších k delším vlnovým délkám, což je způsobeno rozptylem, který závisí na velikosti pevných částic vzorku a vlnové délce dopadajícího záření. Lineární trend lze odstranit 1. derivací spektra, lze použít i derivace vyšší. K častým úpravám patří vícenásobná korekce rozptylu (MSC – multiplicative scatter correction) a posun základní linie spekter (baseline shift). Principem kalibrace je získání závislosti mezi spektrální informací a složením vzorku. Zpočátku byla pro kalibraci využívána metoda vícenásobné regrese. Tento kalibrační model nemusí být dostatečně robusní. Regrese hlavních komponent (PCR) a metoda částečných nejmenších čtverců (PLS) pracují s celým spektrem a jsou založeny na zhuštění spektrální informace do nových proměnných. Tím je odstraněn problém s multikolinearitou. Metoda nejmenších čtverců (PLS metoda) byla již dříve úspěšně aplikovaná na data získaná měřením v UV nebo IR oblasti, dále na chromatografická nebo elektrochemická data. Při přípravě kalibračních vztahů dochází k redukci matice dat dimenze (n,N), kde n je počet bodů a N počet kalibračních směsí na matici dimenze (nf, N), kde nf udává počet faktorů. Faktorem rozumíme kombinaci spektrálních charakteristik. S touto redukcí je spojena i redukce matice koeficientů (analogie lineárních absorpčních koeficientů v klasických metodách analýzy) z rozměru (n, ns) na rozměr (nf, ns), kde ns je počet nezávisle absorbujících složek. Zpíše – li se maticově: Před redukcí

A (n,N) = k (n, ns). C (ns, N) + e (n, N),

Po redukci

A (nf,N) = k (nf, ns). C (ns, N) + e (nf, N),

52


a… matice dat (N spekter o n bodech) k… matice koeficientů (n koeficientů pro ns složek) c… maticekoncentrací složek (ns složek v N směsích) e… matice odchylek (pro n bodů v N spektrech), (HAALAND et THOMAS, 1988a; NICODOM, 1997; MATĚJKA, 2006). Odlehlé standardy (spektra) při měření na FT NIR spektrofortometru se odstraňují pomocí diagnostiky Outlier. Tato diagnostika počítá Mahalanobisovu vzdálenost od průměrného spektra pro spektrum každého kalibračního standardu aktivní metody, hledá spektra, která jsou nejvíce odlišná od ostatních standardů a používá Dixonův nebo Chauvenetův test k posouzení, zda je odlišnost signifikantní. K identifikaci odlehlých standardů pomáhá diagnostika Leverage, která poskytuje informace o vlivu každého ze standardů na kalibrační model a udává, jak přesně kalibrační model popisuje každý standard. Důležitým diagnostickým nástrojem pro vývoj kalibračního modelu je závislost PRESS (predicted residua sum of squares) na počtu PC (principal component) nebo PLS faktorů použitých při kalibraci. Funkce PRESS je dle HAALANDA et THOMASE (1988b) definována jako:

m…celkový počet kalibrovaných vzorků ĉi…odhadovaná koncentrace ci…referenční koncentrace i – tého vzorku vynechaného z kalibrace při křížové validaci Optimální počet PLS faktorů se volí v minimu funkce PRESS. Vysoký počet PLS faktorů snižuje schopnost predikce, protože PRESS zahrnuje i spektrální šum. Popisuje tak stále „dokonaleji“ kalibrační data včetně všech chyb a nahodilých jevů v nich obsažených. Nevhodný je pak i model s malým počtem PC/PLS faktorů, kdy dostatečně nevyužíváme veškeré relevantní informace. Počet použitelných PC/PLS faktorů je ovlivněn i počtem kalibračních měření. Čím větší je počet kalibračních vzorků, tím vyšší počet PC/PLS faktorů můžeme principiálně využít (ČURDA et al., 2002; DRAČKOVÁ, 2009; MATĚJKA, 2006).

53


Při tvorbě kalibračních modelů se využívá i nelineární regrese. Např. metoda umělých neuronových sítí ANN (artificial neural network), vyžaduje velké množství vzorků (500 i víc), ale odchylka stanovení by měla být nižší (ČURDA et al., 2002). Korelační koeficient je mírou pouze lineární závislosti mezi dvěmi sadami dat. Může se pohybovat v rozmezí od –1 (dokonalá negativní závislost) do +1 (dokonalá pozitivní závislost). Nula znamená žádnou závislost. Korelační koeficient blízký jedničce je nutnou nikoliv však postačující podmínkou dobré lineární závislosti (DOHNAL, 1999). K posouzení spolehlivosti získaného kalibračního modelu slouží validace. Jednou z možností je validace pomocí nezávislého souboru vzorků o známém složení, které nebyly zahrnuty v kalibračním souboru. S referenčními hodnotami složek zjištěnými nezávislými metodami se porovnávají koncentrace složek předpovězené prostřednictvím kalibračních modelů. Jestliže není k dispozici nezávislý soubor vzorků, používá se k ověření správnosti kalibračního modelu křížová validace. Kontrola spočívá ve vyloučení určitého vzorku nebo skupiny vzorků z kalibračního souboru, ostatní vzorky se používají jako kalibrační a validační vzorek nebo skupiny vzorků se vyhodnotí, postup se opakuje se všemi vzorky (ČURDA et al., 2002). Kvalitu kalibračního modelu lze posoudit podle směrodatné odchylky kalibrace SEC (standard error of calibration) definované vztahem:

Kde yNIR je hodnota předpovězená z NIR spektra, xi referenční laboratorní hodnota i-tého kalibračního vzorku, N je počet kalibračních vzorků. Při validaci se používá směrodatná odchylka predikce SEP (standard error of prediction). Je kladen důraz na minimální SEP, protože se jedná o odchylku, která je očekávána v budoucích předpovědích. SEP spolehlivé kalibrace není obvykle o mnoho větší než SEC, oproti směrodatné odchylce při laboratorním stanovení bývá SEP úspěšné NIR kalibrace přibližně dvojnásobně větší. Pro porovnání spolehlivosti kalibrace pro různé složky lze vypočítat kalibrační variační koeficient CCV (calibration coefficient of variation), který vyjadřuje SEC v procentech průměrné laboratorní hodnoty. Analogicky jako lze 54


vypočítat na základě SEP i predikční variační koeficient PCV (prediction coefficient of variation). Výhodou CCV oproti SEC je nezávislost na použitých jednotkách. Dobrá kalibrace má CCV do 5 % (PCV do 10 %), do 10 % CCV je model ještě použitelný (ČURDA et al., 2002; MÍKA, 1997). Referenční a predikované hodnoty by v ideálním případě měly vykazovat lineární závislost jdoucí počátkem a se směrnicí rovnou 1. Kvalitu modelu lze proto posoudit na základě korelačního koeficientu R, testováním koeficientů lineární závislosti, dále lze využít např. t-test. Tento test patří k nejzákladnějším statistickým technikám. T-test je založen na skutečnosti, že výběrový průměr z normálního rozdělení, od něhož se odečte střední hodnota tohoto rozdělení a rozdíl se vydělí výběrovou směrodatnou odchylkou, má T rozdělení. Dvouvýběrový párový Studentův ttest pro zjištění, zda střední hodnoty dvou souborů jsou různé (nepředpokládá se shodnost rozptylů dvou souborů). Hladina významnosti se uvažuje implicitně 0,05, je možné ji upravit. Zadává se také předpokládaný (hypotetický) rozdíl středních hodnot (ANDĚL, 1985; ČURDA et al., 2002; OCKERMAN et GOLDSMAN, 1999).

55

Výsledky a diskuze

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál 4.1.1 Slepičí vejce K měření byla použita slepičí vejce z drůbežárny v Pohořelicích, která byla skladovaná při dvou různých teplotách po dobu 4 měsíců. Vejce byla pečlivě rozdělena na jednotlivé vaječné obsahy (bílek, žloutek). Smísením žloutku s bílkem byla následně připravena směs, tzv. melanž. První skupina byla skladována při 5 °C, druhá při 18 °C. Skupina vajec skladovaných při 5 °C byla sledovaná po celou dobu pokusu (4 měsíce). Bílek a žloutek u skupiny vajec skladovaných při 18 °C po dvou měsících nebylo snadné oddělit, proto se po této době sledovala sušina jen u melanže. U veškerých vaječných obsahů byla referenční metodou v laboratoři na Ústavu technologie potravin stanovena sušina. Bílek svou složitou strukturou, 4 odlišné vrstvy, se ukázal jako materiál málo vhodný pro měření na NIR spektrometru. Při homogenizaci docházelo k tvorbě stabilní pěny, která znehodnocovala měřená spektra a následně neumožňovala tvorbu kalibračních modelů. Tab. 1: Referenční hodnoty sušiny (%) vaječných obsahů skladovaných při 5 °C

5°C žloutek bílek melanž

N 33,00 28,00 30,00

xp 49,55 12,30 25,29

sx 2,16 0,61 2,79

Max 52,54 13,69 38,55

Min 40,81 11,69 22,76

N – počet vzorků, xp – průměr, sx – směrodatná odchylka, max – maximální hodnota, min – minimální hodnota

Tab. 2: Referenční hodnoty sušiny (%) vaječných obsahů skladovaných při 18 °C

18°C žloutek bílek melanž

N 20,00 20,00 33,00

xp 50,89 11,74 25,40

sx 2,00 0,65 2,06

Max 53,89 12,92 30,05

Min 48,31 10,45 22,59


56

Výsledky a diskuze

4.1.2 Pomazánkové máslo Pro analytické stanovení obsahu sušiny, tuku, soli, pH a titrační kyselosti byly použity vzorky pomazánkových másel dostupných z tržní sítě, bez příchuti, pouze s obsahem soli. Vzorky byly analyzovány v laboratořích Mendelovy univerzity v Brně na Ústavu technologie potravin. Bylo použito celkem 30 vzorků, z toho 5 vzorků obsahovalo směs rostlinného a živočišného tuku. Tab. 3: Referenční hodnoty sušiny, tuku, pH pomazánkových másel Sušina (%) Tuk (%) pH

N 31,00 31,00 31,00

xp

sx

41,99 31,07 4,53

0,92 1,70 0,16

Max 43,39 34,00 4,27

Min 40,45 26,00 4,12


4.1.3 Kozí sýry Pro vytvoření kalibračního modelu byly použity vzorky čerstvých kozích sýrů. Sýry byly vyráběny každé dva týdny na farmách v průběhu laktace koz. Vzorky byly vakuově zabaleny a vychlazeny na 4°C. V takové úpravě byly poté dopraveny na Ústav technologie potravin (ÚTP). U všech vzorků bylo provedeno stanovení sušiny, tuku, titrační kyselosti, pH a obsahu soli pomocí referenčních metod v laboratoři na zmiňovaném ústavu.

Tab. 4: Referenční hodnoty sušiny, tuku, NaCl, pH, titrační kyselosti (TK) čerstvých kozích sýrů Sušina (%) Tuk (%) NaCl (%) pH TK (°SH)

N 30,00 30,00 30,00 30,00 30,00

xp

sx

46,25 23,23 1,21 4,77 109,39

2,10 1,86 0,28 0,08 3,70

Max 52,21 27,50 1,88 4,96 120,80

Min 42,89 18,50 0,80 4,63 104,44


57

Výsledky a diskuze

4.1.4 Niva K analýze obsahu sušiny, tuku, NaCl a pH na přístroji FT NIR Antaris bylo použito celkem 71 vzorků sýrů Niva dodávaných z mlékárny. Vzorky byly analyzovány na Ústavu technologie potravin po dobu 3 měsíců každých 14 dní. V chemické laboratoři bylo provedeno stanovení sledovaných složek a následně byly vzorky proměřeny na infračerveném spektrometru. Tab. 5: Referenční hodnoty sušiny, tuku, NaCl, pH sýrů Niva Sušina (%) Tuk (%) NaCl (%) pH

N 71,00 71,00 71,00 71,00

xp

sx

57,60 31,17 4,00 6,78

1,07 1,26 0,76 0,84

Max 60,26 34,25 5,27 9,96

Min 55,87 28,50 2,07 5,19


4.1.5 Kuřecí šunka K analýzám byly použity vzorky z masokombinátu Promt s.r.o. Rozborovány byly kuřecí šunky z prsních i stehenních řízků, lázeňský kuřecí salám, kuřecí šunkový salám výběrový, kuřecí salám s ham flavor, kuřecí šunka s přídavkem krůtí bílkoviny. Všechny vzorky byly homogenizovány na laboratorním mixéru a následně u nich byl stanoven obsah sušiny, tuku, svalových bílkovin a dusíkatých látek (Nlátek). Tab. 6: Referenční hodnoty obsahu sušiny, tuku, svalových bílkovin a dusíkatých (Nlátek) látek v kuřecích šunkách Sušina (%) Tuk (%) Sv. bílkovina (%) Nlátky (%)

N 40,00 40,00 40,00 40,00

xp

sx

23,20 2,56 13,55 69,58

1,47 0,98 2,55 8,30

Max 26,22 4,77 18,93 83,97

Min 20,09 1,00 9,26 52,43


58

Výsledky a diskuze

4.1.6 Triticale K analýze bylo použito celkem 40 vzorků pošrotovaného triticale (mezidruhový kříženec pšenice obecné a žita setého). Na Ústavu technologie potravin v rostlinné sekci bylo u vzorků stanoveno HTZ (hmotnost tisíce zrn), obsah vody, škrobu. Následně byly vytvořeny kalibrační modely. Funkčnost se prokázala pouze u modelu pro stanovení obsahu vlhkosti. Proto je nadále uváděno pouze stanovení obsahu vlhkosti. Tab. 7: Referenční hodnoty obsahu vlhkosti (%) ve šrotu triticale Vlhkost (%) HTZ (g) Škrob (%)

N 40,00 40,00 40,00

xp

sx

9,90 50,77 71,35

0,48 50,77 71,35

Max 11,20 59,10 72,00

Min 9,10 43,00 64,24


4.1.7 Jogurty Pro tvorbu kalibračních modelů pomocí diskriminační analýzy byly použity jogurty dodané z mlékárny Olma Olomouc. Pro zjišťování rozdílů tloušťky sáčků, určených pro měření na NIR spektrofotometru, byly použity bílé jogurty Revital, Silueta, Klasik, Bio jogurt. U těchto bílých jogurtů byl rovněž posuzován vliv teploty při měření. U ochucených jogurtů (bio jogurt malina-ostružina, s banáno-broskvovou příchutí a vlákninou; Florian smetanové pokušení s borůvkou, lískovým oříškem, stracciatelou, čokoládo-kokosovou příchutí, chocoballs, vaječným likérem, jahodou) byla použita metoda diskriminační analýzy k schopnosti rozeznat rozdíly mezi použitými druhy příchutí. Od každého typu jogurtu bylo mlékárnou dodáno 5 vzorků. Přičemž byl odebrán z každého kelímku na přeměření vzorek čtyřikrát. 4.1.8 Eidamy K analýze rozdílu mezi jednotlivými výrobci byly použity eidamské sýry s obsahem 45% tuku v sušině. Bylo použito celkem 84 vzorků sýrů z mlékáren: Moravia Lacto Jihlava (21 vzorků), Jaromeřice (21 vzorků), Madeta (21 vzorků) a Pelhřimov (22 vzorků). 59

Výsledky a diskuze

4.1.9 Analogy sýrů Měření bylo zaměřeno na schopnosti NIR spektrofotometru rozlišit rozdíl mezi sýry a jejich analogy. U těchto analogů sýrů byl použit rostlinný tuk jako náhrada tuku mléčného. Jednalo se o analogy určené k zapékání, smažení a také analogy tavených sýrů. K analýze byly použity následující vzorky z tržní sítě: Analogy eidamských sýrů: Lidový smažák, Edina, Dorfdamer, porovnávány s eidamy s obsahem 30% TVS (tuku v sušině) dodaných z mlékárny Moravia lacto a. s., Jihlava; Analogy tavených sýrů, tavené sýry: Javor, Javor plátkový, Goatauer, Hit, Rodinka, Veselá kráva, Slices plátky se sýrem, Apetito s uzeným sýrem, Apetito s ementálem, Apetito linie plátky, Clever plátky, Maratonec plátky; Analogy pařených sýrů: Mistr Pizza, Pizzarella na zapékání. Ke sledování možného rozdílu byla použita mozzarella bez obsahu rostlinného tuku z běžné tržní sítě. 4.1.10 Brambory 50 vzorků odrůd brambor Solanum tuberosum L. bylo použito k analýze na NIR spektrofotometru. Od každé odrůdy (Jitka, Judita, Karin, Magda, Princess, redAnna, Rohlíčci, Rosara, Valfi, Velox) bylo změřeno 5 hlíz. U naměřených spekter hlíz byla posuzována schopnost přístroje zaznamenat rozdíl mezi jednotlivými odrůdami.

4.2 Metody 4.2.1 Referenční analytické metody

4.2.1.1 Vejce

Pro stanovení obsahu sušiny byla použita referenční metoda dle ČSN 57 2301, kdy se navážilo 5g vzorku bílku a žloutku, 6g melanže, které se v sušárně vysušovaly při 105 °C do konstantní hmotnosti.

60

Výsledky a diskuze

4.2.1.2 Pomazánkové máslo Obsah tuku v pomazánkovém másle se stanovoval pomocí acidobutyrometrické metody dle ČSN 57 0107. Obsah sušiny byl stanovován pomocí vážkové metody vysušováním do konstantní hmotnosti dle ČSN 57 0107. Množství chloridu sodného ve vzorku dle normy ČSN 57 0107 byl stanoven přímou titrací roztokem dusičnanu stříbrného. pH bylo stanoveno potenciometricky na pH metru WTW pH 95 dle ČSN 57 0107. Titrační kyselost se stanovovala titračně dle ČSN 57 0107 titrací 10g vzorků 0,25 mol roztokem hydroxidu sodného na indikátor fenolftalein.

4.2.1.3 Niva, kozí sýry Obsah tuku v sýrech byl stanoven pomocí acidobutyrometrické metody dle ČSN 57 0107. Jednalo se o acidobutyrometrickou metodu dle van Gulika. Množství chloridu sodného ve vzorku dle normy ČSN 57 0107 byl stanoven přímou titrací roztokem dusičnanu stříbrného. pH bylo stanoveno potenciometricky na pH metru WTW pH 95 dle ČSN 57 0107. Obsah sušiny v kozích sýrech se stanovil pomocí vážkové metody vysušováním do konstantní hmotnosti dle ČSN 57 0107. Titrační kyselost kozích sýrů se stanovovala titračně dle ČSN 57 0107 titrací 10g vzorků 0,25 mol roztokem hydroxidu sodného na indikátor fenolftalein.

4.2.1.4 Kuřecí šunka Obsah sušiny, dusíkatý látek, svalových bílkovin a tuku byl stanovován referenčními metodami v akreditované laboratoři – laboratoř pro vyšetřování potravin v Brně.

61

Výsledky a diskuze

4.2.1.5 Triticale

Vlhkost se stanovila sušením při 130°C ± 3°C po dobu 120 minut dle ČSN ISO 712 na Ústavu technologie potravin. Byly použity i výsledky ze stanovení škrobu, HTZ (hmotnost tisíce zrn). Bohužel kalibrace těchto složek na NIR spektrofotometru nebyla funkční, další pokus o rozšíření a vylepšení modelů se zatím neprovedl.

4.2.4.6 Jogurty, Eidamy, Analogy sýrů, Brambory Tyto vzorky nebyly podrobeny žádné chemické analýze. Byly použity výhradně pro NIR spektroskopii a jejich spektra následně zpracována pomocí metody diskriminační analýzy. 4.2.2 NIR spektrofotometrické metody Měření veškerých výše zmiňovaných vzorků probíhalo na spektrofotometru FTNIR Antaris v selém rozsahu spektra (10 000 – 4 000 cm-1) v režimu reflektance pomocí programu Result Integration. K následnému zpracování kalibračních modelů byl použit program TQ Analyst. Stejně jako u DRAČKOVÉ et al. (2009) byly odlehlé standardy, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila spektrální odchylka ve změřeném spektru, odstraněny pomocí diagnostiky Spectrum Outlier. Diagnostiky bylo použito u všech kalibračních modelů v kvantitativní analýze. Tato diagnostika počítá Mahalanobisovu vzdálenost od průměrného spektra pro spektrum každého kalibračního standardu aktivní metody, hledá spektra, která jsou nejvíce odlišná od ostatních standardů a používá Chauvernetův test k posouzení, zda odlišnost je signifikantní. Následné operace s modely jsou rozepsány u jednotlivých kapitol.

4.2.2.1 Slepičí vejce Vaječné obsahy byly důkladně, ale opatrně homogenizovány, poté měřeny v laboratorních kádinkách na FT NIR přístroji režimu reflektance s použitím ponorné sondy (obr. 5, přílohy). Každý vzorek byl třikrát proměřen 100 scany při rozlišení 8. 62

Výsledky a diskuze

K vyhodnocení bylo použito průměrných spekter. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí algoritmu PLS. Vytvořené modely byly následně ověřeny křížovou validací.

4.2.2.2 Pomazánkové máslo Vzorky pomazánkových másel se měřily při pokojové teplotě na integrační sféře v režimu reflektance s rozlišením 4 a počtem scanů 80 (obr. 6, přílohy). Vzorek pomazánkového másla byl nanesen na petriho misku a překryt hliníkovou fólií. Každý vzorek byl proměřen dvakrát. K vyhodnocení byla použita průměrná spektra. Na základě získané závislosti mezi spektrální informací a složením vzorku byly vytvořeny kalibrační modely pomocí algoritmu PSL. Kalibrační modely byly ověřeny křížovou validací.

4.2.2.3 Niva Vzorky byly nastrouhány na laboratorním struhadle, aby se docílilo homogenity vzorku vzhledem k různě prorostlé plísni dle stádia zrání, vloženy do kyvety a měřeny pomocí mechanicky otočného spinneru v režimu reflektance při 100 scanech, s rozlišením 8 (obr. 7 a 8, přílohy). Každý vzorek byl proměřen dvakrát. K vyhodnocení bylo použito spektrum průměrné. Pomocí algoritmu PLS byly vytvořeny kalibrační modely pro stanovení obsahu sušiny, tuku, NaCl a pH. Funkčnost modelů byla následně ověřena křížovou validací. Vše s použitím programu TQ Analyst.

4.2.2.4 Kozí sýry Vzorky čerstvých kozích sýrů byly analyzovány na přístroji FT NIR v režimu reflektance s počtem scanů 100, rozlišením 8. Sýry byly nastrouhány na struhadle a vloženy do kyvety (obr. 7 a 8, přílohy). Kyveta byla umístěna do otočného zařízení (spinneru), který je součástí NIR spektrofotometru Antaris. Každý vzorek byl proměřen třikrát, pro tvorbu kalibračního modelu bylo použito průměrné spektrum. Na základě získané spektrální informace a referenčních hodnot byly vytvořeny kalibrační modely.

63

Výsledky a diskuze

K jejich vytvoření byla použita metoda PLS. Kalibrační modely byly následně ověřeny křížovou validací.

4.2.2.5 Kuřecí šunka Vzorky salámů byly homogenizovány na kompaktní hmotu, vloženy do kyvety otočného spinneru a změřeny na NIR spektrometru v režimu reflektance při rozlišení 8 s počtem scanů 100. Každý vzorek byl změřen dvakrát a k následnému zpracování bylo použito průměrné spektrum. V programu TQ Analyst byl zvolen algoritmus PLS, jehož pomocí byly vytvořeny kalibrační modely. Ověřeny byly křížovou validací.

4.2.2.6 Triticale Vzorky pošrotovaného triticale byly analyzovány na NIR spektrofotometru s počtem 100 scanů, rozlišením 8 pomocí optické sondy. Sonda byla umístěna do stojanu, aby se zabránilo otřesům. Každý vzorek byl vložen do laboratorní kádinky, přístrojem analyzován dvakrát (obr. 9, přílohy). Pro vyhodnocení bylo použito průměrných spekter. Pomocí algoritmu PLS v programu TQ Analyst byl vytvořen kalibrační model pro stanovení obsahu vlhkosti. Následně byl model ověřen křížovou validací.

4.2.2.7 Jogurty Při sledování vlivu tloušťky sáčku určeného k měření byl vzorek jogurtu umístěn na výřez sáčku dané tloušťky a měřen na integrační sféře. Pro sledování ostatních deskriptorů (vliv příchutě, vliv teploty…) byl vzorek jogurtu vpraven do laboratorní kádinky a taktéž měřen na integrační sféře v režimu reflektance při 100 scanech s rozlišením 8 (obr. 10, přílohy). Každý vzorek byl proměřen dvakrát. Pro tvorbu kalibračních modelů pomocí metody diskriminační analýzy bylo použito průměrné spektrum. Kalibrační model byl tvořen s využitím programu TQ Analyst. Diskriminační analýza rozděluje jednotlivé vzorky do definovaných skupin dle podobnosti. Jednotlivé skupiny jsou popsány standardy, jež tvoří shluk (cluster) kolem těžiště třídy. Počet tříd 64

Výsledky a diskuze

odpovídá počtu měření. Přítomnost diskriminačního kříže ukazuje na velkou odlišnost pozorovaných vzorků.

4.2.2.8 Eidamy Vzorky eidamských sýrů různých výrobců byly proměřeny pomocí optické sondy (obr. 11, přílohy). Zvlášť se změřil okraj a střed sýrů, od každého vzorku dvakrát. Měření probíhalo v režimu reflektance při 80 scanech, s rozlišením 4. Pro zjišťování rozdílů výrobců jsme spektra zprůměrovali, včetně naměřených spekter okrajů a středů. K vyhodnocování byla použita metoda diskriminační analýzy programu TQ Analyst.

4.2.2.9 Analogy sýrů Analogy sýrů i sýry samotné byly měřeny při 80 scanech a rozlišením 4. Sýry byl postrouhány, naplněny do kyvety a následně proměřeny pomocí otočného spinneru. Každý vzorek byl proměřen třikrát. Vyhodnocování probíhalo u průměrných spekter pomocí programu TQ Analyst s využitím metody diskriminační analýzy.

4.2.2.10 Brambory Hlízy byly měřeny v režimu reflektance (odrazu) s rozlišením 8 a počtem scanů 100. Z každé odrůdy bylo měřeno 5 hlíz v syrovém stavu a uvařené. Vařené hlízy byly vychlazeny na 23 ± 3°C. Před vlastním měřením byly vzorky rozpůleny a měřeny NIR spektrometrem na integrační sféře (obr. 12, přílohy). Každá půlka bramborové hlízy byla změřena jednou. Ze spekter obou půlek hlízy bylo pro kvalitativní analýzu použito průměrné spektrum. K vyhodnocení spekter se použila metoda diskriminační analýzy. Kalibrační modely byly vytvořeny pro všechny odrůdy ve stavu vařeném i syrovém. Účelem bylo zjistit, zda je přístroj FT NIR Antaris schopen rozlišit jednotlivé odrůdy.

65

Výsledky a diskuze

VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Slepičí vejce

Tato kapitola se zabývá popisem stanovení sušiny u jednotlivých tekutých obsahů slepičích vajec v průběhu jejich skladování při teplotách 5°C a 18°C. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí metody nejmenších čtverců, model pro stanovení sušiny melanže skladovaný při 5°C byl upraven první derivací. Již u samotných spekter vaječných obsahů (obrázek 7) si lze povšimnout výrazného rozdílu spektra bílku. Bílek svou složitou strukturou, 4 odlišné vrstvy, se ukázal jako materiál málo vhodný pro měření na NIR spektrometru. Při homogenizaci docházelo k tvorbě stabilní pěny, která znehodnocovala měřená spektra a následně neumožňovala tvorbu kalibračních modelů.

Obr. 7: Spektra tekutých vaječných obsahů (bílek, melanž, žloutek) Vzhledem k výše uvedeným důvodům byla nadále zpracovávána pouze spektra žloutků a melanže. Počet vzorků použitý ke kalibraci uvádí tabulka 1 v kapitole 4.1.1. Kalibrační modely byly hodnoceny podle více hledisek. V první řadě se hodnotil průběh funkce PRESS. Její optimální průběh by měl mít prudký pokles, další průběh klesání je již pozvolný. Hodnota PRESS indikuje odchylku kalibrace při použití metody 66

Výsledky a diskuze

PLS. Jak bylo uvedeno v kapitole 3.4.1, vysoký počet PLS faktorů snižuje schopnost predikce, protože PRESS zahrnuje i spektrální šum. U kalibračních modelů pro stanovení sušiny vaječných obsahů bylo dosaženo počtů PLS faktorů 6-9 (tabulka 8 i 9). Největší počet PLS faktorů (9) má kalibrační model pro stanovení sušiny melanže, při skladovací teplotě 18°C. Nejnižší (6) model melanže, skladovaný při 5°C. U všech modelů měla funkce PRESS typicky sestupnou tendenci. Tento průběh vypovídá o jejich robustnosti a vhodnosti NIR spektroskopie pro její využití v případě stanovování obsahu sušiny u tekutých žloutků a melanže. Pro příklad je uveden průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny melanže skladovaného při 18°C. (obr. 8).

Obr. 8: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny melanže (18°C)

Kalibrační koeficienty (R) a směrodatné odchylky (SEC) pro jednotlivé modely se pohybovaly v rozmezí 0,905 až 0,998 a 0,143 % až 0,587 % (tab. 8). Nejlepší výsledek kalibračního koeficientu 0,998 při nejnižší směrodatné odchylce 0,143 % dosáhl model melanže, jež byl skladován při teplotě 18°C. Kalibrační koeficient modelu žloutku skladovaného při 5°C byl 0,963, při 18°C pak 0,957. Nejnižší hodnotu korelačního koeficientu dosáhl kalibrační model pro stanovení obsahu sušiny v melanži u vajec skladovaných při 5 °C (R = 0,905). Hodnota z vytvořených kalibračních modelů je sice nejnižší, přesto se jedná o dosti silnou závislost mezi hodnotami předpověděným NIR spektrofotometrem a hodnotami referenčními.

67

Výsledky a diskuze

Tab. 8: Kalibrační výsledky obsahu sušiny vaječných obsahů (%) při různých skladovacích teplotách (Nžl.5°C = 33, Nžl.18°C = 20, Nmel.5°C = 33, Nmel.18°C = 33) sušina žloutek (5°C) žloutek (18°C) melanž (5°C) melanž (18°C)

R SEC (%) PLS faktory CCV (%) 0,963 0,475 8 0,93 0,957 0,587 7 1,15 0,905 0,527 6 2,19 0,998 0,143 9 0,56

LR y = 0,927x + 3,6978 y = 0,9147x + 4,3481 y = 0,8191x + 4,428 y = 0,9945x + 0,1397

derivace 0 0 1 0

R – korelační koeficient, SEC – směrodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibrační variační koeficient, LR – lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody, y = bx + a  regresní přímka

Pro ověření kalibračních modelů pomocí metody křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako pro kalibraci. Validace je charakterizována směrodatnou odchylkou validace (SEP). Hodnota pro sušinu melanže byla 0,403 % (18 °C) a 0,842 % (5 °C). Pro sušinu žloutků 1,150 % (18 °C) a 0,803 % (5 °C). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9. Tab. 9: Validační výsledky obsahu sušiny (%) vaječných obsahů při různých skladovacích teplotách (Nžl.5°C = 33, Nžl.18°C = 20, Nmel.5°C = 33, Nmel.18°C = 33) sušina žloutek (5°C) žloutek (18°C) melanž (5°C) melanž (18°C)

R 0,893 0,844 0,759 0,981

SEP (%) PLS faktory PCV (%) 0,803 8 1,59 1,150 7 2,26 0,842 6 3,49 0,403 9 1,59

LR y = 0,8604x + 7,0697 y = 0,8701x + 6,5341 y = 0,7241x + 6,7953 y = 0,9764x + 0,6207

derivace 0 0 1 0

R – korelační koeficient, SEP – směrodatná odchylka validace, PCV – predikční variační koeficient, LR – lineárně regresní závislost výsledků NIR metody na výsledcích referenční metody, y = bx + a  regresní přímka

Na obrázcích 9 až 12 jsou znázorněny graficky výsledky kalibrací a křížových validací pro sušinu žloutků a melanže skladovaných při teplotě 5 °C a 18 °C.

68

Výsledky a diskuze

žloutek 5°C 55 y = 0,927x + 3,6978 R = 0,963

obsah sušiny (%), NIR

54 53 52 51 50

y = 0,8604x + 7,0697 R = 0,893

49 48 47 47

48

49

50

51

52

53

54

55

obsah sušiny (% ), chemicky stanoveno kalibrace

validace

Lineární (kalibrace)

Lineární (validace)

Obr. 9 : Kalibrační a validační výsledky pro sušinu žloutku skladovaného při 5 °C


žloutek 18°C 56

y = 0,9147x + 4,3481 R = 0,957

54 52 50

y = 0,8701x + 6,5341 R = 0,844

48 46 48

49

50

51

52

53

54

55

obsah sušiny (% ), stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 10: Kalibrační a validační výsledky pro sušinu žloutku skladovaného při 18 °C

69

Výsledky a diskuze

obsah sušiny, NIR (%)

melanž 5°C 28

y = 0,8191x + 4,428 R = 0,905

27 26 25 24 23

y = 0,7241x + 6,7953 R = 0,759

22 22

23

24

25

26

27

28

obsah sušiny, stanoveno chemicky (% ) kalibrace

validace



Obr. 11: Kalibrační a validační výsledky pro sušinu melanže skladovaného při 5 °C

obsah sušiny, NIR (%)

melanž 18°C 30

y = 0,9945x + 0,1397 R = 0,998

28 26

y = 0,9764x + 0,6207 R = 0,981

24 22 22

23

24

25

26

27

28

29

30

obsah sušiny, chemicky stanoveno (% ) kalibrace

validace



Obr. 12 : Kalibrační a validační výsledky pro sušinu melanže skladovaného při 18 °C U všech kalibračních modelů se jedná o pevnou závislost mezi hodnotami predikovanými (NIR hodnoty) a referenčními. Nejrobustnějšího modelu bylo dosaženo v případě obsahu sušiny melanže skladovaného při 18 °C. U tohoto modelu si můžeme všimnout překrytí přímek kalibrace a validace, velmi malého rozdílu mezi korelačními

70

Výsledky a diskuze

koeficienty kalibrace a validace, SEC a SEP, nízkého kalibračního a predikčního variačního koeficient (CCV, PCV). Limitní hodnoty pro kalibrační (CCV) a predikční (PCV) variační koeficient jsou 5 % a 10%. Pokud jsou dosaženy výsledky CCV a PCV do těchto limitních hodnot, lze kalibrační model pokládat za spolehlivý. V případě kalibračních modelů sušiny vaječných obsahů se hodnoty CCV pohybovaly v rozmezí 0,56 (melanž, 18 °C) až 2,19 (melanž, 5 °C), hodnoty PCV 1,59 (pro žloutek skladovaný při 5°C a melanž při 18 °C) až 3,49 (melanž, 5 °C). Díky velmi dobrým výsledkům CCV i PCV, lze modely pro obsahy sušiny vaječných obsahů pokládat za spolehlivé. Obrázek srovnávající hodnoty CCV a PCV jsou umístěny v kapitole přílohy (obrázek 14). Na základě porovnání směrodatných odchylek kalibrace a validace (SEC, SEP) a porovnání korelace mezi hodnotami vypočtenými z kalibračních rovnic a hodnotami referenčními bylo provedeno zhodnocení výsledků. Nulová hypotéza HO: μd = 0 na hladině významnosti α = 0,05 byla testována pomocí dvouvýběrového párového t-testu na střední hodnotu. Z vypočtených statistických výsledků (tab. 10) vyplývá, že mezi referenčními hodnotami (xREF) a hodnotami predikovanými (xNIR) je statisticky neprůkazný rozdíl u všech stanovovaných vaječných obsahů skladovaných při dvou různých teplotách na hladině významnosti α = 0,05, kde platí vztah t stat.‹ tkrit. Tab. 10 : Statistické vyhodnocení stanovení sušiny vaječných obsahů párovým t-testem xREF (%) sušina žloutek (5°C) 50,67 50,99 žloutek (18°C) 24,49 melanž (5°C) 26,20 melanž (18°C)

xNIR (%)

SD

50,67 50,99 24,52 26,20

0,311 0,461 0,266 0,368

t stat -0,017 -0,008 0,007 -0,016

t1 (krit) 1,694 1,734 1,699 1,697

t2 (krit) 2,037 2,101 2,045 2,042

xREF- hodnoty referenční, xNIR-hodnoty predikované, SD-směrodatná odchylka diference, tstat. – t-test, t1(krit) – tabulková hodnota při α = 0,05, t2(krit) – tabulková hodnota při α = 0,01

Nejvíce spolehlivý model byl získán pro obsah sušiny melanže, při skladovací teplotě 18 °C. Díky vysokým korelačním koeficientům, nízkým směrodatným odchylkám kalibrace i validace, CCV, PCV můžeme i ostatní kalibrační modely považovat za spolehlivé. S využitím metody diskriminační analýzy byl prokázán vliv rozdílných teplot skladování na kalibrační modely (obr. 15 a 16, přílohy). Pro dosažení přesných

71

Výsledky a diskuze

výsledků obsahu sušiny ve vzorcích vajec skladovaných různým způsobem je třeba použít správný kalibrační model. Podobnou problematikou, stanovení sušiny tekutých vajec pomocí NIR spektroskopie při sledování proměnlivostí přebalování vzorků a efekty na analytické výsledky se ve své práci zabývali autoři MARK et al. (1986). Ve výsledcích jejich práce nelze bohužel zjistit, při jakých teplotách byly zkoušené vzorky skladovány. Nicméně hodnota SEC melanže z jejich výsledků dosáhla hodnoty 0,536 %, což je hodnota o málo vyšší než hodnota námi stanovená pro mělanž skladovaný při teplotě 5°C (0,527 %). Také MLČEK (2008) se ve své práci zabýval stanovením sušiny ve žloutku slepičích vajec, avšak nesledoval žádný vliv skladovacích teplot. Kalibrační koeficient pro model stanovení sušiny žloutku dosáhl hodnoty 0,993. Sušinu stanovoval u 36 vzorků čerstvých vajec. Výsledky se pohybují v podobných hodnotách jako v naší práci. Také autoři MAKR a WORKMANN (1986) vytvářeli kalibrační modely pro tekutý vaječný obsah, avšak s využitím infraanalyzéru Technicon, model 400. Tekutá vejce byla proměřována v kyvetě určené k měření tekutých vzorků. Kalibrační modely byly poté vytvořeny pro vzorky komprimované podle průměru a nekomprimované. V prvém případě dosáhla směrodatná odchylka validace (SEP) hodnoty 0,521 %, v druhém případě 0,564 %. V porovnání s výsledky uvedené v naší práci, se nám SEP podařilo vylepšit u validačního modelu pro stanovení sušiny v melanži skladovaného při 18 °C (0,403 %). Výsledky kalibrací tekutých vaječných obsah, které byly skladováný při různých teplotách, byly prezentovány a publikovány v rámci mezinárodní konference posluchačů postgraduálního doktorského studia MendelNet'06 Agro (2006).

5.2 Pomazánkové máslo Pro stanovení základních složek pomazánkových másel bylo použito celkem 31 vzorků. Referenční metody použité pro stanovení referenčních vzorků jsou popsány v kapitole 4.2.2. U každé stanovované složky byl použit k tvorbě modelů celý region spektra (10 000 – 4 000 cm-1), bez úpravy spektra derivací.

72

Výsledky a diskuze

Počet PLS faktorů (tab. 11) byl 5 pro obsah tuku a pH, 3 pro obsah sušiny. Na obrázku č. 13 je znázorněn průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny v pomazánkových máslech. Lze si povšimnout vzorového průběhu funkce s prudkým poklesem. Hodnoty korelačních koeficientů a směrodatných odchylek kalibrace (tab. 11) se pohybovaly v rozmezí od 0,938 až 0,968 a 0,040 až 0,553 %. Nejvyšší kalibrační koeficient byl stanoven pro pH v pomazánkových máslech (0,968) při nejnižší hodnotě směrodatné odchylky (0,040).

Obr. 13: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny v pomazánkovém másle Tab. 11: Kalibrační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (tuk, sušina, pH) u pomazánkových másel (N = 31) tuk (%) sušina (%) pH

R 0,946 0,938 0,968

SEC 0,553 0,318 0,040

PLS faktory CCV (%) LR derivace 5 1,78 y = 0,8944x + 3,2815 0 3 0,76 y = 0,8803x + 5,0277 0 5 0,89 y = 0,929x + 0,316 0


Kalibrační koeficienty validace a jejich směrodatné odchylky se rozprostírají mezi krajními hodnotami 0,851 až 0,912 a 0,075 až 0,913 % (tab. 12). Největší těsnosti dosáhl kalibrační model pro stanovení obsahu sušiny, kde kalibrační koeficient kalibrace a validace leží těsně u sebe (hodnoty 0,938 a 0,912) s velmi těsnými směrodatnými odchylkami kalibrace (0,318 a 0,376). Avšak přesto lze pokládat všechny modely za velmi spolehlivé, neboť jejich kalibrační i predikční variační koeficient 73

Výsledky a diskuze

nepřesáhl v prvním případě limitní hranici 5 %, v druhém 10%. Nejvyšší hodnotu CCV a také PCV má kalibrační model pro stanovení tučnosti (1,78 % a 2,94 %). Graf zobrazující srovnání hodnoty CCV a PCV je umístěn v přílohách (obrázek 17). Tab. 12: Validační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (tuk, sušina, pH) u pomazánkových másel (N = 31) tuk (%) sušina (%) pH

R 0,851 0,912 0,882

SEP 0,913 0,376 0,075

PLS faktory PCV (%) LR derivace 5 2,94 y = 0,8083x + 6,0095 0 3 0,90 y = 0,8357x + 6,8876 0 5 1,66 y = 0,796x + 0,922 0


Na obrázcích 14 až 16 jsou graficky znázorněny výsledky kalibračních modelů pro jednotlivé složky stanovované u pomazánkových másel. Kalibrační model pro stanovení obsah sušiny v pomazánkových máslech vyšel jako nejvíce přesný. Přímka kalibrace i validace na sebe velmi těsně naléhají, při kontrole korelačních koeficientů kalibrace i validace si lze povšimnout minimálních rozdílů mezi koeficienty. Modely kalibrace pro pH a tučnost můžeme také pokládat z tohoto hlediska za spolehlivé.

tuk

tuk (%). NIR

35 y = 0,8083x + 6,0095 R = 0,851

33 31 29

y = 0,8944x + 3,2815 R = 0,946

27 25 24

26

28

30

32

34

tuk (% ), stanoveno laboratorně Kalibrace

Validace

Lineární (Kalibrace)

Lineární (Validace)

Obr. 14: Kalibrační a validační výsledky tučnosti pomazánkových másel

74

36

Výsledky a diskuze

sušina

sušina (%), NIR

44

y = 0,8357x + 6,8876 R = 0,912

43 42

y = 0,8803x + 5,0277 R = 0,938

41 40 40

41

42

43

44

sušina (% ), stanoveno laboratorně kalibrace

validace



Obr. 15: Kalibrační a validační výsledky pro sušinu pomazánkových másel

pH

pH, dle NIR

4,8

y = 0,7962x + 0,9226 R = 0,885

4,6 4,4 4,2

y = 0,9298x + 0,3168 R = 0,968

4 4

4,2

4,4

4,6

4,8

pH, stanoveno laboratorně kalibrace

validace



Obr. 16: Kalibrační a validační výsledky pro pH pomazánkových másel Při statistickém hodnocení mezi porovnávanými parametry přístrojového a laboratorního stanovení jsme nenašli průkazný rozdíl. Výsledky párového t-testu pro střední hodnotu jsou uvedeny v tab. 13. 75

Výsledky a diskuze

Tab. 13: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek pomazánkových másel párovým t-testem složky

xREF

xNIR

SD

t-test

tuk (%) sušina (%) pH

31,07 41,99 4,53

31,07 41,99 4,53

0,310 0,170 0,020

0,000 0,000 0,100

t1 (krit) 1,720 1,730 1,720

t2 (krit) 2,090 2,100 2,080


Nejspolehlivější model podle zhodnocení všech parametrů (rozdíl kalibračních a validačních koeficientů, jejich směrodatných odchylek, hodnot CCV a PCV, porovnáním grafů) byl vytvořen pro stanovení obsahu sušiny. Avšak i ostatní modely byly vyhodnoceny jako spolehlivé a využitelné pro praxi. Také HERMIDA et al. (2001) pomocí NIR spektrometru stanovovali u 102 vzorků másla obsah tuku, vody a netuky. Kalibrační modely vytvářeli pomocí PLS algoritmu. Korelační koeficienty kalibrace R byly pro 0,970; 0,964 a 0,949 pro tuk, tukuprostou sušinu a pro obsah vody v másle. Při porovnání funkčnosti kalibračních modelů křížovou validací byly hodnoty korelačního koeficientu 0,911; 0,970 a 0,847. Kalibrační modely pomazánkových másel se pohybují zhruba na stejné úrovni. Model vytvořený pro obsah tuku v pomazánkových máslech má vyšší hodnotu validačního kalibračního koeficientu (0,851). Oproti tomuto výsledku však kalibrační model netuků másel stanovených HERMIDOU et al. (2001) dosáhl celkově lepších výsledků než kalibrační model sušiny pomazánkových másel. Výsledky analýz pomazánkových másel byly také publikovány v závěrečné práci ŽÁKOVSKÉ (2010).

5.3 Kozí sýr Tato kapitola popisuje stanovení jakostních ukazatelů čerstvých kozích sýrů poskytovaných farmami z jižní Moravy v průběhu laktace koz. Chemickým rozborům bylo podrobeno celkem 30 vzorků. Provedlo se stanovení sušiny, tuku, titrační kyselosti, pH a obsahu soli pomocí referenčních metod dle jednotlivých ČSN. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí metody nejmenších čtverců, shodně s předchozími kapitolami. Vytvořené kalibrace byly ověřeny křížovou validací a 76

Výsledky a diskuze

statisticky zhodnoceny t-testem. Hodnoceny byly vzorky v celém rozsahu spektra (10 000 až 4 000 cm-1), kalibrační modely pro tuk, pH i titrační kyselost pak byly upraveny pomocí první derivace. V tabulce 14 a 15 jsou uvedeny výsledky kalibrace i validačního ověření kalibrace. Tab. 14 : Kalibrační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (obsah tuku, sušiny, pH, titrační kyselost, obsah soli) v kozích sýrech (N = 30) tuk (%) sušina (%) pH titrační kyselost (°SH) NaCl (%)

R 0,825 0,810 0,988 0,953 0,964

SEC 0,786 1,230 0,013 0,849 0,070

PLS faktory CCV (%) 4 3,40 5 2,66 7 0,78 6 5,79 10 3,40

LR derivace y = 0,6800x + 7,3997 1 y = 0,6563x + 15,896 0 y = 0,9669x + 0,1575 1 y = 0,9072x + 10,146 1 y = 0,9278x + 0,0883 0


Při porovnání výsledků kalibrace kozích sýrů se jako nejspolehlivější model ukázal kalibrační model pro stanovení titrační kyselosti. Dosáhl hodnoty kalibračního koeficientu 0,953, validačního kalibračního koeficientu pak 0,901. Chyby kalibrace a validace pak 0,849 %; 1,12 %. Korelační koeficient vypovídá o závislosti mezi hodnotami předpověděným NIR spektrofotometrem a hodnotami referenčními. Při dosažení korelačního koeficientu 0,95-0,99 hovoříme o velmi silné závislosti, 0,80-0,94 o dosti silné závislosti, při hodnotách 0,50-79 o středně silné závislosti (TRILČOVÁ et al., 2005; DRAČKOVÁ et al., 2009). Kalibrační modely titrační kyselosti, obsahu soli v čerstvých kozích sýrech vypovídají o velmi silné závislosti. Jejich kalibrační korelační koeficienty mají hodnoty 0,953 a 0,964. Validační korelační koeficienty pak 0,901 a 0,867. Ostatní modely (obsah sušiny, tuku a pH) dosáhly hodnot v rozmezí středně silné závislosti (tabulka 14).

77

Výsledky a diskuze

Tab. 15 : Validační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (obsah tuku, sušiny, pH, titrační kyselost, obsah soli) v kozích sýrech (N = 30) tuk (%) sušina (%) pH titrační kyselost (°SH) NaCl (%)

R 0,669 0,671 0,712 0,901 0,867

SEP PLS faktory PCV (%) 1,060 4 4,59 1,600 5 3,46 0,057 7 1,20 1,120 6 1,02 0,135 10 11,15

LR derivace y = 0,5619x + 10,080 1 y = 0,5656x + 20,083 0 y = 0,5396x + 2,1999 1 y = 0,8550x + 15,768 1 y = 0,8531x + 0,1830 0


Významným indikátorem kalibrace jsou hodnoty funkce PRESS (PLS faktory). Dobře fungující model by neměl mít více jak 15 PLS faktorů pro stanovení na NIR spektrometru. Největší počet PLS faktorů byl dosažen u kalibračního modelu pro stanovení obsahu NaCl (10). Počet PLS faktorů u ostatních metod se pohybuje v rozmezí 4-7. Ukázka průběhu funkce PRESS pro pH v kozích sýrech je zobrazena na obrázku 17.

Obr. 17: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model pH kozích sýrů Velmi spolehlivé modely z hlediska porovnání hodnot CCV a PCV (přílohy, obrázek 18) jsme zjistili u kalibrací obsahu tuku, sušiny a stanovení titrační kyselosti a pH. V těchto případech nedošlo k překročení limitní hranice 5 % u CCV a 10 % u PCV. U kalibračního modelu pro stanovení obsahu NaCl byl překročen limit hodnoty PCV (11,15 %), přesto je však model spolehlivý, protože hodnoty CCV limit nepřekročila (3,40 %).

78

Výsledky a diskuze

Výsledky v grafické podobě jsou znázorněny na obr. 18 až 20. Nejtěsněji přiléhají přímky kalibrace i validace v případě stanovení titrační kyselosti v kozích sýrech. Tento model je pokládán za nejspolehlivější, vzdálenost hodnot R kalibrace i validace jsou si velmi blízko. Naopak u modelu pH se přímky rozcházejí, vzdálenost mezi korelačním koeficientem kalibrace a validace je zatížena vetší chybou. Kalibrační model není tolik přesný jako v případě titrační kyselosti. Grafické znázornění kalibračního modelu pro stanovení obsahu NaCl v čerstvých kozích sýrech je příkladem těsnější závislosti obou korelačních koeficientů (obr. 18). Titrační kyselost

titrační kyselost (°SH), NIR

116 y = 0,9072x + 10,146 R = 0,953

114 112 110 108

y = 0,855x + 15,768 R = 0,901

106 104 102

104

106

108

110

112

114

116

titrační kyselost (°SH), stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 18: Kalibrační a validační výsledky pro titrační kyselost čerstvých kozích sýrů NaCl

Obsah NaCl (%), NIR

1,8 y = 0,9278x + 0,0883 R = 0,964

1,6 1,4 1,2 1 0,8

y = 0,8531x + 0,183 R = 0,868

0,6 0,4 0,7

0,8

0,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

Obsah NaCl (% ), stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 19: Kalibrační a validační výsledky pro obsah NaCl v čerstvých kozích sýrech 79

1,7

Výsledky a diskuze

pH 5 y = 0,9669x + 0,1575 R = 0,988

4,95

pH, NIR

4,9 4,85 4,8 4,75 4,7

y = 0,5396x + 2,1999 R = 0,712

4,65 4,6 4,6

4,65

4,7

4,75

4,8

4,85

4,9

4,95

5

pH, stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 20: Kalibrační a validační výsledky pro pH v čerstvých kozích sýrech

tuk 28 y = 0,680x + 7,3997 R = 0,825

tuk, NIR (%)

26 24 22

y = 0,5619x + 10,080 R = 0,669

20 18 18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

tuk, stanoveno chemicky (%) kalibrace

validace



Obr. 21: Kalibrační a validační výsledky pro obsah tuku v čerstvých kozích sýrech

80

28

Výsledky a diskuze


Sušina 52 50 48 46 44 42 40

y = 0,6563x + 15,896 R = 0,810

y = 0,5656x + 20,083 R = 0,671 40

42

44

46

48

50

52

54


validace



Obr. 22: Kalibrační a validační výsledky pro obsah sušiny v čerstvých kozích sýrech Při porovnání referenčních hodnot (xREF) a hodnot predikovaných (xNIR), tabulka 16, nebyly zjištěny statisticky průkazné rozdíly. K statistické analýze byl použit studentův t-test pro testování rozdílu středních hodnot na hladině α = 0,05. Jako nejspolehlivější model v případě testování jakostních ukazatelů čerstvých kozích sýrů byl vyhodnocen model kalibrace titrační kyselosti. Hodnoty kalibračních a validačních koeficientů (0,953; 0,901) leží těsně u sebe, směrodatné odchylky jsou relativně nízké, počet PLS faktorů je 6. Tab. 16: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek čerstvých kozích sýrů párovým t-testem složky tuk (%) sušina (%) pH titrační kyselost (°SH) NaCl (%)

xREF 23,12 46,25 4,77 109,39 1,21

xNIR 23,12 46,25 4,77 109,39 1,21

SD 0,273 0,397 0,015 0,595 0,051

t stat 0,500 0,003 0,140 0,000 -0,050

t1 (krit) 1,706 0,701 1,700 1,720 1,710

t2 (krit) 2,056 2,048 2,050 2,070 2,060


Také DRAČKOVÁ et al. (2008) stanovovali pomocí NIR spektrofotometru obsah tuku, sušiny, tuku v sušině, soli, titrační kyselosti a pH v 81 vzorcích nezrajících kozích sýrech. Korelační koeficienty pro kalibraci obsahu tuku (0,773), sušiny (0,751), titrační kyselosti (0,821), pH (0,959), obsahu NaCl (0,879) dosahovaly nižších hodnot ve všech případech než při stanovení v naší práci. 81

Výsledky a diskuze

Analýzou kravských, ovčích i kozích sýrů během 6 měsíčního zrání se zabývali GONZÁLES-MATÍN et al. (2009). Pomocí optické sondy NIR spektrofotometru analyzovali celkem 112 vzorků. Kalibrační modely pro obsah peptidů v sýrech vytvořili pomocí PLS algoritmu. Korelační koeficient pro hydrofilní peptidy byl R = 0,879 se směrodatnou odchylkou kalibrace SEC = 1,94 %; pro hydrofobní peptidy R = 0,890 a SEC = 1,94 %. Korelační koeficienty pro peptidy dosáhly vyšších hodnot než u stanovení obsahu tuku a sušiny v čerstvých kozích sýrech (R = 0,810 – 0,825), avšak nižších hodnot než u kalibračních modelů pro stanovení obsahu NaCl, pH, titrační kyselosti (R = 0,998 – 0,953). Analýzou sýrů pomocí NIR spektroskopie se v neposlední řadě zabývali také ČURDA a KUKAČKOVÁ (2004). Tuto instrumentální techniku využili při tvorbě kalibračních modelů pro obsah tuku, sušiny, proteinu, pH ve tvrdých a polotvrdých sýrech a penetraci. Nejnižší počet PLS faktorů dosáhl model pro stanovení obsahu tuku, stejně jako u modelu pro stanovení tuku v kozích sýrech v naší práci. Výsledky kalibrací čerstvých kozích sýrů pomocí NIR spektroskopie byly zveřejněny v diplomové práci STÁVKOVÉ (2010).

5.4 Niva V následující kapitole budou popsány kalibrační modely, které byly vytvořeny pro stanovení obsahu tuku, soli a pH v sýrech s modrou plísní, sýrech Niva. Na Ústavu technologie potravin Mendlovy univerzity v Brně bylo podrobeno chemickým rozborům celkem 71 vzorků. Sýry byly sledovány od vyrobení po celou jejich dobu skladování. Skladovány byly ve zracích sklepech mlékárny za optimálních podmínek a dováženy každých 14 dní na Mendelovu univerzitu. Spektrum sýru Niva je vyobrazeno na obrázku 23, součástí tohoto obrázku jsou i spektra kozího sýru a pomazánkového másla pro porovnání odlišností, popř. podobností, mezi nimi. Pro zajímavost je připojen také obrázek 24 zobrazující spektra nivy na začátku a konci doby zrání.

82

Výsledky a diskuze

Obr. 23 : Spektra sýru Niva, čerstvého kozího sýru a pomazánkového másla.

Obr. 24 : Spektra sýru Niva na začátku a konci doby zrání Z obrázku 25 je patrný prudce klesající trend funkce PRESS pH sýru, což vypovídá o spolehlivosti modelu. Minimální chyba je stanovena v 5. bodě. Kalibrační model s takovýmto průběhem bývá obvykle charakterizován vysokými korelačními koeficienty a nízkými směrodatnými chybami. 83

Výsledky a diskuze

Obr. 25: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model pH sýrů Niva Stejně jako v případě kalibračního modelu pro pH v sýrech Niva dosahují i modely tuku a NaCl shodně 5 PLS faktorů. Spektra byla při vytváření kalibračních modelů upravena 1. derivací (tabulka 17). Nejvyššího kalibračního koeficientu (R) po vytvoření kalibračních modelů pro jednotlivé složky bylo dosaženo u modelu pro stanovení pH 0,966 se směrodatnou odchylkou SEC = 0,197 %. Nejmenší závislosti bylo dosaženo u modelu pro stanovení obsahu soli, kde R = 0,898, směrodatná chyba tohoto modelu SEC = 0,321 %. Vyšší hodnoty SEC dosáhl kalibrační model pro stanovení obsahu tuku 0,369%. Tab. 17: Kalibrační výsledky obsahu tuku, NaCl a pH sýrů Niva (N = 71) tuk (%) NaCl (%) pH

R 0,938 0,898 0,966

SEC 0,369 0,321 0,197

PLS faktory CCV (%) LR derivace 5 1,19 y = 0,8793x + 3,7494 1 5 8,06 y = 0,8071x + 0,7685 1 5 2,94 y = 0,9334x + 0,4466 1


Stejná sada vzorků byla použita i pro ověření funkčnosti kalibrace pomocí křížové validace. Nejvyššího korelačního koeficientu validace (tabulka 18) bylo dosaženo opět u modelu pro stanovení pH v sýrech Niva. Korelační koeficient validace R = 0,944 a SEP = 0,252 %. Nejnižších hodnot bylo dosaženo pro druhé dva modely – stanovení obsahu soli a tuku (R = 0,871), přičemž větší směrodatnou odchylku dosáhl model kalibrace pro stanovení tučnosti (SEP = 0,613 %). 84

Výsledky a diskuze

Tab. 18: Validační výsledky obsahu tuku, NaCl a pH sýrů Niva (N = 71) tuk (%) NaCl (%) pH

R 0,817 0,817 0,944

SEP 0,613 0,424 0,252

PLS faktory PCV (%) LR derivace 5 1,97 y = 0,7076x + 9,089 1 5 10,65 y = 0,7135x + 1,1518 1 5 3,76 y = 0,9015x + 0,6657 1


Za velmi spolehlivé, podle kalibračních (CCV) a predikčních (PCV) variačních koeficientů, můžeme označit kalibrační modely pro stanovení pH a obsahu tuku v sýrech. Hodnoty nepřekračují limitní hranici pěti procent u variačních koeficientů kalibrace a hranici deseti procent u predikčních variačních koeficientů. V případě kalibračního modelu pro stanovení obsahu soli došlo k mírnému navýšení hodnot CCV a PCV oproti limitům a z tohoto hlediska lze model hodnotit jako méně spolehlivý. Graf zobrazující srovnání hodnoty CCV a PCV je umístěn v přílohách (obrázek 19). U kalibračních modelů pro stanovení osahu soli a pH se jedná o pevnou závislost mezi referenčními hodnotami a hodnotami predikovanými. Průběh závislostí je znázorněn na obrázcích 26 až 28. Nejpřesnější model byl získán pro stanovení pH, dochází k téměř úplnému překrytí přímek validace a kalibrace, rovněž korelační koeficienty kalibrace i validace jsou si svými hodnotami velmi blízké. Kvalitního kalibračního modelu pro stanovení pH se podařilo dosáhnout především díky pravidelnému čtrnáctidennímu stanovování pH v sýrech a měření na FT NIR spektrometru. Podařila se tak zachytit široká škála pH po celou dobu zrání sýru od v podstatě tvarohové hmoty do zralého („starého“) sýru.

85

Výsledky a diskuze

Tuk 34

y = 0,8793x + 3,7494 R = 0,938

33

% tuku, NIR

32 31 30 29

y = 0,7076x + 9,089 R = 0,817

28 28

29

30

31

32

33

34

% tuku, stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 26: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu tuku v sýrech Niva pH 8

y = 0,9334x + 0,4466 R = 0,966

7,5

pH, NIR

7 6,5 6 5,5

y = 0,9015x + 0,6657 R = 0,944

5 5

5,5

6

6,5

7

7,5

pH, stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 27: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení pH v sýrech Niva

86

8

Výsledky a diskuze

NaCl 5,5

y = 0,8071x + 0,7685 R = 0,898

5

% NaCl, NIR

4,5 4 3,5 3

y = 0,7135x + 1,1518 R = 0,817

2,5 2 2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

% NaCl, stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 28: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu NaCl v sýrech Niva Z výsledků porovnání hodnot referenčních a vypočtených z kalibračních rovnic pomocí dvouvýběrového párového t-testu na střední hodnotu vyplývá, že mezi sledovanými hodnotami je statisticky neprůkazný rozdíl (tabulka 19). Tab. 19: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek sýrů Niva párovým t-testem tuk (%) NaCl (%) pH

xREF 31,06 3,98 6,71

xNIR 31,06 3,98 6,71

SD 0,13 0,09 0,09

tstat 0,014 0,004 0,007

t1(krit) 1,672 1,669 1,672

t2(krit) 2,002 1,998 2,002


Nejvíce spolehlivý model byl získán pro stanovení pH, kde jsme při porovnání zjistili minimální rozdíl mezi korelačním koeficientem kalibrace a korelačním koeficientem validace, při současně nejnižších hodnotách směrodatných odchylek. Nejméně spolehlivý model pro stanovení obsahu soli v sýrech Niva, dosáhl nejnižšího korelačního koeficientu kalibrace, hodnoty CCV a PCV překračují limit 5 a 10 %. Podobnými rozbory se zabývali MARTÍN-DEL-CAMPO et al. (2007a). Stanovovali chemické parametry u sýrů camembértského typu, avšak s využitím MIR 87

Výsledky a diskuze

spektroskopie. Pomocí algoritmu PLS vytvořili velmi dobré kalibrační modely pro stanovení obsahu sušinu, laktózy, kyseliny mléčné, nebílkovinného dusíku, dusíku, NH4+ a pH. Vytvořené modely se prokázaly jako velmi účinné, až na model pro stanovení aktivní kyselosti (pH). V další práci pomocí PCA analýzy zjišťovali stejní autoři (MARTÍN-DELCAMPO et al., 2007b), zda je možno MIR spektroskopii využít i při rozlišování stádia zrání sýrů camembért. Sýry byly proměřeny na okraji, ve středu. Poté byly rozpracovány na menší specifičtější části a znovu proměřeny. Při porovnávání setů spekter byly zjištěny významné rozdíly především u skupin alkoholů a amidů. Použití PCA metody u setů spekter camembérských sýrů umožnilo určit stádium zrání s chybou ve stanovení 1 den. Rozdělení sýrů na jednotlivé specifické části neposkytlo žádné informace navíc.

5.5 Kuřecí šunka Následující kapitola je věnována využití NIR spektrofotometru při sledování jakosti kuřecích šunek. V chemické laboratoři bylo rozborováno celkem 40 druhů kuřecích šunek. Metodami popsanými v kapitole 4.2.1.5 byl u těchto vzorků stanoven obsah sušiny, tuku, dusíkatých látek a % svalových bílkovin. Odlehlá spektra byla před vlastní kalibrací odstraněna pomocí diagnostiky outlier. Kalibrační modely byly vytvořeny s pomocí algoritmu nejmenších čtverců. Kalibrační model pro obsah tuku byl vytvořen s celkem 35 vzorky a byl upraven 1. derivací spekter. Pro vytvoření kalibračního modelu pro obsah sušiny se použilo celkem 34 vzorků, pro model dusíkatých látek (N látek) 32 vzorků a pro obsah svalových bílkovin 39 vzorků. Poslední tři zmíněné kalibrační modely nevyžadovaly žádnou úpravu spekter derivací. Následně byly kalibrační modely ověřeny křížovou validací a statisticky zhodnoceny. Jako u předchozích skupin potravin bylo v prvé řadě posuzováno hledisko funkce PRESS. Nejnižší počet PLS faktorů jsme zaznamenali u kalibračního modelu pro stanovení obsahu tuku, minima bylo dosaženo v hodnotě 4 (tabulka 20). Počet PLS faktorů ostatních modelů je shodný (PLS = 7). Sestupná tendence a poměrně nízký počet PLS faktorů vypovídá jejich robustnosti a použitelnosti kalibračních modelů při

88

Výsledky a diskuze

zjišťování daných složek v běžné praxi. Průběh funkce PRESS pro tuk v kuřecích šunkách je zobrazen na obrázku 29.

Obr. 29: Funkce PRESS kalibračního modelu pro stanovení obsahu tuku v kuřecích šunkách U všech kalibračních modelů (tabulka 20) bylo dosaženo velmi vysokých korelačních koeficientů (0,946 – 0,979), při relativně nízkých směrodatných odchylkách (0,200 – 0,828 %). Již bylo řečeno, že korelační koeficient vypovídá o závislosti mezi hodnotami předpověděným NIR spektrofotometrem a hodnotami referenčními. V případě vytvořených kalibračních modelů kuřecích šunek můžeme hovořit o velmi silné závislosti mezi predikovanými a referenčními hodnotami. Nejvyšší korelační koeficient má kalibrační model pro stanovení obsahu tuku R = 0,979 při směrodatné odchylce SEC = 0,200 %. Nejnižší pak kalibrační model stanovení obsahu svalových bílkovin R = 0,946 se směrodatnou odchylkou SEC = 0,828 %.

89

Výsledky a diskuze

Tab. 20: Kalibrační výsledky obsahu tuku, sušiny, dusíkatých látek (Nlátky) a svalových bílkovin (%) v kuřecích šunkách (Ntuk = 35, Nsušina = 34, NNL = 32, Nsv.B = 39) tuk (%) sušina (%) Nlátky (%) sv.bílkovina (%)

R 0,979 0,959 0,963 0,946

SEC 0,200 0,417 0,240 0,828

PLS faktory CCV (%) 4 7,81 7 1,98 7 3,22 7 6,11

LR derivace y = 0,9587x + 0,1057 1 y = 0,9192x + 1,8752 0 y = 0,9271x + 5,0772 0 y = 0,8952x + 1,4194 0


Při následném ověřování funkčností kalibračního modelu bylo použito metody křížové validace. K validaci bylo použito stejného setu vzorků jako ke kalibraci. Výsledky validačního posouzení jsou zapsány v tabulce 21. Kalibrační validační koeficienty se pohybují v rozmezí hodnot 0,775 až 0,939 při směrodatných odchylkách validace 0,338 až 5,360 %. Nejlepšího výsledku kalibračního koeficientu validace bylo dosaženo pro stanovení obsahu tuku (R = 0,939). Nejslabší výsledek křížové validace byl dosažen pro model dusíkatých látek (R= 0,775 a SEP = 5,360 %). Tento model by bylo třeba rozšířit o další analyzované vzorky a pokusit se jej vylepšit. Tab. 21: Validační výsledky obsahu tuku, sušiny, dusíkatých látek (Nlátky) a svalových bílkovin (%) v kuřecích šunkách (Ntuk = 35, Nsušina = 34, NNL = 32, Nsv.B = 39) tuk (%) sušina (%) Nlátky (%) sv.bílkovina (%)

R 0,939 0,916 0,775 0,901

SEP 0,338 0,591 5,360 1,110

PLS faktory PCV (%) 4 13,20 7 2,55 7 7,70 7 8,19

LR derivace y = 0,8904x + 0,2744 1 y = 0,8513x + 3,4203 0 y = 0,6993x + 21,246 0 y = 0,8386x + 2,1519 0


Kalibrační variační koeficient CCV u modelu stanovení sušiny a dusíkatých látek nepřesáhl hranici 5 %. U kalibrací tučnosti a obsahu svalových bílkovin došlo k navýšení koeficientu, avšak modely je stále možno považovat za spolehlivé vzhledem k dosažení vysokých korelačních koeficientů kalibrace i validace a příslušných nízkých směrodatných odchylek. Pokud se podíváme na predikční variační koeficienty, navýšení oproti limitu (10 %) je pouze u kalibračního modelu tuku. Graf zobrazující srovnání hodnoty CCV a PCV je umístěn v přílohách (obrázek 20).

90

Výsledky a diskuze

svalová bílkovina 20

y = 0.8952x + 1.4194 R = 0.946

obsah sv. bílkovi (%), NIR

18 16 14 12 10

y = 0.8386x + 2.1519 R = 0.901

8 8

10

12

14

16

18

20

obsah sv. bílkovi (% ), stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 30: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu svalových bílkovin v kuřecích šunkách U všech modelů lze pozorovat pevnou závislost. Nejspolehlivější modely byly získány pro stanovení obsahu tuku, sušiny a svalových bílkovin (obrázek 30 až 34). Přímky kalibrace i validace těsně přiléhají (příklad je uveden na obrázku 30). Přímky kalibračního modelu obsahu dusíkatých látek nenaléhají k sobě tak těsně, avšak i tento model byl vyhodnocen jako dostatečně spolehlivý (obrázek 31).

91

Výsledky a diskuze

dusíkaté látky (Nlátky) 90

y = 0.9271x + 5.0772 R = 0.963

obsah N látek (%), NIR

85 80 75 70 65 60

y = 0.6993x + 21.246 R = 0.775

55 50 50

55

60

65

70

75

80

85

90

obsah N látek (% ), stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 31: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu dusíkatých látek (N látek) v kuřecích šunkách tuk 5,5 y = 0.9587x + 0.1057 R = 0.979

5

obsah tuku (%), NIR

4,5 4 3,5 3 2,5 2 y = 0.8903x + 0.2744 R = 0.939

1,5 1 1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

obsah tuku (% ), stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 32: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu tuku v kuřecích šunkách

92

Výsledky a diskuze

sušina 27

y = 0.9192x + 1.8752 R = 0.959


26 25 24 23 22

y = 0.8513x + 3.4203 R = 0.917

21 20 20

21

22

23

24

25

26

27


validace



Obr. 33: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu sušiny v kuřecích šunkách Také kalibrační modely kuřecích šunek byly podrobeny statistickému zkoušení pomocí párového t testu na střední hodnotu. Byla testována hypotéza μd = 0 na hladině významnosti α = 0,05. Na základě statistické analýzy z výsledků vyplývá, že je mezi hodnotami referenčními a hodnotami získanými z NIR spektrofotometru statisticky neprůkazný rozdíl (tabulka 22). Tab. 22: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek kuřecích šunek párovým t-testem

xREF 2,557 tuk (%) 23,200 sušina (%) 69,579 Nlátky (%) sv.bílkovina (%) 13,548

xNIR 2,557 23,200 69,586 13,548

SD 0,166 0,252 1,497 0,408

t-test 0,000 0,000 0,000 -0,016

t1 (krit) 1,690 1,691 1,685 1,694

t2 (krit) 2,030 2,032 2,023 2,037


PROCHÁZKOVÁ et al. (2010) ve své práci vyzkoušeli schopnost NIR spektrofotometru při kontrole základních fyzikálních a chemických vlastností v 93

Výsledky a diskuze

salámech typu Vysočina. Korelační koeficient pro kalibrační model sušiny a tuku zjistili 0,995 a 0,996 při SEC 0,970 % a 0,559 %, tedy vyšší než u našich kalibračních modelů (0,959; 0,979) avšak směrodatné odchylky našich analýz dosáhly nižší hodnoty (0,417 %; 0,200 %). GAITÁN-JURADO et al. (2008) využili NIR spektroskopii při analýze obsahu tuku a bílkovin v salámech. Kalibrační modely vytvořili jak pro salámy homogenizované, tak pro salámy neupravované. V obou případech bylo dosaženo vysokých koeficientů kalibrace pro tuk 0,989 a 0,995, pro bílkoviny 0,985 jak u homogenizovaných tak neupravených vzorcích salámů. V porovnání s našimi výsledky dosáhli GAITÁN-JURADO et al. nepatrně vyšších hodnot kalibračních koeficientů, pravděpodobně díky většímu množství použitých vzorků (N = 80). Difúzní reflektanční spektroskopii při zjišťování obsahu soli v konzervovaných šunkách využili také BEGLEY et al. (1984). Ke kalibraci bylo použito 20 vzorků, dosáhlo se poměrně vysokého kalibračního koeficientu (R = 0,96) mezi hodnotami stanovenými chemickou a spektrofotometrickou cestou. Na tuto práci nepřímo navázali ELLEKJÆR et al. (1993), kdy ve svém pokusu zkoumali jak reflektační tak transmitanční metody NIR spektrofotometru při determinaci NaCl v salámech. Ve výsledcích potvrzují schopnost obou použitých metod determinovat obsah soli v salámech s predikční chybou 0,04% pro reflektanční metodu a 0,07% pro transmisní metodu. Obě dvě metody mohou být tedy použity při zjišťování obsahu soli ve vzorcích salámů v praxi. V neposlední řadě se testováním schopnosti NIR spektroskopie v případě salámů zabývali také COLLELL et al. (2010). Předmětem jejich zkoumání bylo zjišťování parametrů související s kvalitativním hodnocením fermentovaných salámů během sušení. Celkem 207 vzorků bylo analyzováno NIR spektrofotometrem v reflektančním módu. Pomocí metody nejmenších čtverců byly vytvořeny kalibrační modely pro stanovení aktivity vody, vlhkosti a obsahu NaCl. Kalibrační koeficienty vytvořených modelů dosáhly hodnot v rozmezí 0,987 až 0,998, tedy velmi těsné závislosti, podobně jako u našich kalibračních modelů (0,946 – 0,979) a lze je použít v technologiích spjatých s kontrolou masných výrobků. Výsledky kalibrací kuřecích šunek budou také publikovány v disertační práci Petra Komrsky.

94

Výsledky a diskuze

5.6 Triticale Reflektanční NIR spektroskopie byla využita ke stanovení obsahu vlhkosti ve vzorcích Triticale. Laboratorní analýze bylo podrobeno celkem 40 vzorků pošrotovaného triticale. Spektra vzorků byla měřena pomocí optické sondy. K tvorbě kalibračních modelů bylo využito metody nejmenších čtverců, spektra byla upravena 1. derivací. Na obrázku 34 jsou zobrazena spektra pšenice, žita a jejich mezidruhového křížence triticale. Obrázek spekter jakoby potvrzoval onu mezidruhovou příslušnost triticale, protože jeho spektrum se nachází přesně mezi spektrem pšenice a žita.

Obr. 34: Spektra žita, pšenice a triticale Jako optimum byly získány 2 PLS faktory s klesající tendencí (tab. 23). Bylo dosaženo poměrně vysokých korelačních koeficientů kalibrace (R = 0,904) s relativně těsným korelačním koeficientem validace (R = 0,847), při směrodatných odchylkách 0,203 a 0,255 %. Jedná se tedy o model spolehlivý s pevnou závislostí mezi hodnotami predikčními a referenčními.

95

Výsledky a diskuze

Tab. 23: Kalibrační výsledky obsahu vlhkosti v obilnině Triticale vlhkost (%)

R 0,904

SEC 0,203

PLS faktory 2

CCV (%) LR 2,05 y = 0,8152x + 1,8299

derivace 1


Hodnota CCV nepřesahuje 5 %, hodnota PCV nepřesahuje 10 %. U modelu dochází k těsnému přiléhání přímek kalibrace a validace. Tab. 24 : Validační výsledky obsahu vlhkosti v obilnině Triticale vlhkost (%)

R 0,847

SEP 0,255

PLS faktory 2

PCV (%) LR 2,58 y = 0,6694x + 3,2547

derivace 1


Obrázek 35 znázorňuje srovnání kalibrace a validace pomocí grafické metody. Při statistickém hodnocení (tabulka 25) nebyly prokázány statisticky průkazné rozdíly mezi hodnotami referenčními a hodnotami predikovanými NIR spektrofotometrem.

vlhkost 11,5

y = 0,8152x + 1,8299 R = 0,904

% vlhkosti, NIR

11 10,5 10

y = 0,6694x + 3,2547 R = 0,847

9,5 9 9

9,5

10

10,5

11

11,5

% vlhkosti, stanoveno chemicky kalibrace

validace



Obr. 35: Kalibrační a validační výsledky pro obsah vlhkosti v obilnině Triticale Tab. 25: Statistické vyhodnocení obsahu vlhkosti v obilnině Triticale vlhkost (%)

xREF 9,9

xNIR 9,9

SD 1,48

t-test 1,334

t1 (krit) 1,691

t2 (krit) 2,032


96

Výsledky a diskuze

K analýze travin a obilovin využili NIR spektroskopii také autoři MÍKA et al. (2008). První aplikací bylo určení obsahu vody. SEC pro obsah vody v obilovinách a výrobcích z nich, olejninách, chmelu, sladu, bramborových lupíncích, chlebu, sušeném mléce atd. v rozsahu 0,1 –0,4 %. Do tohoto rozmezí spadá i výsledek naší kalibrace se svými 0,203 %. Jinou analýzu, při snaze kalibrovat hmotnost zrna, hnědou rýži i obsah amylosy pomocí NIR spektrometrie zkusili WU et SHI (2004). Na infračerveném přístroji změřili celkem 474 jednotlivých zrn rýže. U nečištěné hnědé rýže dosáhli v případě určování hmotnosti zrn kalibračního koeficient 0,819, v případě čištěného zrna 0,843. Nejlepšího výsledku pak u stanovení obsahu amylosy v zrnech (R = 0,922). Dosáhli tedy nepatrně lepších výsledku kalibračního koeficientupři srovnání s našimi výsledky. Laboratoř NIR spektroskopie v rámci všech pracovišť ÚKZÚZ provádí analýzy pro odbor odrůdové zkušebnictví. Výsledky rozborů slouží jako podklady pro administrativní rozhodnutí pro registraci odrůd v České republice. Kvalitativní parametry vytvořených kalibračních rovnic jsou: pro dusíkaté látky u pšenice jarní (r = 0,954 a SEC 0,3 %), pro tuk u řepky olejky (R = 0,985 a SEC = 0,5 %) dusíkaté látky (0,990 a 0,4 %), dusíkaté látky pro kukuřici zrnovou 0,85 a 0,2% (SEIFERTOVÁ, 2005).

5.7 Jogurty Podnět k analýzám vyšel z mlékárny Olma Olomouc, s níž naše pracoviště dlouhodobě spolupracuje. V mlékárně používají FT NIR spektrofotometr při běžných kontrolách kvality mlékárenských výrobků. Často měří vzorky jogurtů v různých fázích výroby – rovnou po výrobě či po zchlazení, čili při různých teplotách. Po měření takto rozdílných vzorků vycházely některé výsledky s většími chybami. Zaměřili jsme se tedy v první fázi zkoumání na vliv teploty při měření vzorků jogurtů. K měření vzorků na NIR spektrometrech se v dřívější době používaly skleněné kyvety.

Nové

firmy

na

spektrogfotometrickém

trhu

začly

prodávat

NIR

spektrofotometry s hotovými kalibracemi. Kalibrační modely byly vytvořeny měřením vzorků na/v speciálních sáčcích. Avšak cena těchto sáčků je značná. Protiargumentem příslušných firem je, že k měření není již třeba využívat speciálním sáčků, ale lze 97

Výsledky a diskuze

v podstatě měřit na jakémkoliv jiném, levnějším materiálu. Zajímal nás tedy fakt, zda je tento argument oprávněný a ve druhé fázi našeho pokusu jsme se zaměřili na zkoumání vlivu síly použitých sáčků na spolehlivost při analýze na FT NIR spektrometru. V poslední fázi analýz jsme hodnotili vliv příchutí jogurtů. Při měření jogurtů s různými příchutěmi v nehomogenní formě může docházet při měření spekter ke snímání přidané složky (ovoce aj.). Zajímalo nás tedy, zda i homogennost jogurtů s příchutěmi ovlivňuje výsledky měření. Po změření vzorků na FT NIR spektrometru byla k vyhodnocování vlivů použita metoda diskriminační analýzy. Jak uvádí MELOUN et FREISLEBEN (2008), klasická klasifikační diskriminační analýza, zavedená Ronaldem Fisherem v roce 1936, patří mezi metody zkoumání vztahu mezi skupinou p nezávislých znaků, zvaných diskriminátory (sloupců zdrojové matice), a jednou kvalitativní závisle proměnnou – výstupem. Výstupem je v nejjednodušším případě binární proměnná y, nabývající hodnotu 0 pro případ, že objekt je v první třídě, respektive hodnotu 1 pro případ, že objekt je ve druhé třídě. O třídách je známé, že jsou zřetelně odlišené a každý objekt patří do jedné z nich. Účelem může být také identifikace, které znaky přispívají do procesu klasifikace. Ve vstupních datech trénovací skupiny jsou svými hodnotami diskriminátorů a výstupů všechny objekty zařazené do tříd. Účelem je nalézt predikční model umožňující zařadit nové objekty do tříd. Vliv teplot Na obrázku 31 jsou vyobrazena spektra jogurtů, které byly měřeny při různých teplotách (10°C, 17°C, 25°C, 35°C). Tyto teploty byly voleny s ohledem na výrobní proces jogurtů. Teplota 10°C pro vzorky jogurtů, které před analýzou byly vytaženy z chladícího zařízení. Teplota 35°C pro jogurty, které byly hodnoceny po ukončení výroby. Ostatní teploty pak byly zvoleny mezi těmito dvěma krajními náhodně, pro porovnání. Již na samotném vyobrazení je mezi jednotlivými spektry viditelný rozdíl (obrázek 36). Nejvíce podobná jsou spektra jogurtů naměřených při 25 a 35°C.

98

Výsledky a diskuze

Obr. 36: Spektra bílých jogurtů měřených při různých teplotách (10°C, 17°C, 25°C, 35°C) Po rozřazení jednotlivých spekter do skupin dle příslušné teploty, byly skupiny mezi sebou porovnávány pomocí diskriminační analýzy. Na obrázcích 37 až 41 je znázorněn výsledek, který jednoznačně prokázal rozdíly mezi jednotlivými skupinami. Rozdíl je patrný již u jogurtů měřených při 10°C a 17°C (obrázek č 37), což potvrzuje rozdělení

spekter

do

jednotlivých

clusterů,

které

jsou

vzájemně

odděleny

diskriminačním křížem. Přítomnost diskriminačního kříže ukazuje na velkou odlišnost porovnávaných vzorků.

99

Výsledky a diskuze

Obr. 37: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 10°C (□) a 17°C (∆) Také s dalším navyšováním rozdílu teplot (10°C vs 25°C, 10°C vs 35°C), dochází k bezpečnému rozdělení spekter do clusterů (obrázek 38 a 39). Vlivy teploty měření byly sledovány z důvodu dotazů ze strany mlékárny, zda je nutné kalibrace NIR spektrofotometru provádět pro různé teploty zvlášť nebo je-li možné měřit jogurty v jakékoliv fázi výroby na jednom vytvořeném kalibračním modelu. Naše zjištění potvrdilo, že je nutné vytvořit kalibrační metody pro jogurty o různých teplotách zvlášť. Především pak pro jogurty měřené vzápětí po ukončení fermentačního procesu a jogurty měřené po vytažení z chladničky.

Obr. 38: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 10°C (□) a 35°C (∆) 100

Výsledky a diskuze

Obr. 39: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 10°C (□) a 25°C (∆) Při porovnávání rozdílů mezi spektry jogurtů naměřenými při námi zvolenými středními teplotami (17°C, 25°C) můžeme pozorovat (obrázek 40) stále stejný trend. Jednotlivé vzorky NIR spektrofotometr bezpečně rozdělil do příslušných klastrů dle jednotlivých tříd. Spolehlivost rozdělení vzorků do skupin potvrzuje také přítomnost diskriminačního kříže. Stejný průběh má také kalibrační model (obrázek 41) pro dvě nejvyšší teploty (25 a 35°C).

Obr. 40: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 17°C (čtverec) a 25°C (trojúhelník)

101

Výsledky a diskuze

Obr. 41: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 35°C (□) a 25°C (∆) Vlivem rozdílných teplot vzorků, avšak u mléka, na výsledky měření složení mléka pomocí FT NIR spektrometru se v roce 2007 zabývala ŠUSTOVÁ. Vzorky kravského mléka byly získány ze statku v Žabčicích pomocí Tru-testu, jež umožňuje získat průměrný směsný vzorek od jednotlivých dojnic zvlášť. Vzorky byly následně zchlazeny na 6 °C a do 12 hodin analyzovány (obsah sušiny, bílkovin, tuku, laktózy) v laboratoři na Ústavu technologie potravin v Brně. Vzorky mléka byly následně snímány spektrofotometrem FT NIR Antaris v rezimu reflektance. Každý vzorek byl nejprve zahřátý na 40 °C a zchlazen na teplotu měření (20 °C, 21 °C, 23 °C a 25 °C). Prto zjišťování rozdílnosti mezi teplotami vzorků byla použita metoda diskriminační analýzy. Vzorky temperované na teploty 21 °C a 23 °C mezi sebou vykazovali vysoce průkazný rozdíl. Největší rozdíl byl zaznamenán mezi vzorky s teplotou 20 °C a 25 °C. Z výsledků autorky výplývá sdělení, shodné se sdělením z naší práce, že je nutné důsledně dodržovat teplotu vzorku s teplotou, na níž je kalibrován model FT NIR spektrofotometru. Případně vytvořit kalibrační modely pro jednotlivé teploty vzorků. Analýzou jogurtů, také s využitím NIR spektroskopie, se zabývali autoři ČURDA et al. (2002). Základní složení jogurtů (tuk, sušina, bílkoviny) bylo stanovováno pomocí přístrojů NIRSystem 6500 a FT Nicolet Protégé 460NIR. Při porovnávání hodnot získaných těmito dvěma různými technikami nebyly zjištěny významnější rozdíly. Autoři se nezabývali vlivem teploty.

102

Výsledky a diskuze

Vliv síly sáčků určených k měření vzorků Další faktor, který byl pomocí metody diskriminační analýzy u jogurtů sledován, byl faktor síly obalu, určeného pro měření vzorků. Zajímali jsme se, je-li nutné používat dražší obal zakoupený s již kalibrovaným přístrojem nebo lze-li zvolit jinou levnější náhradu. Sáčky pro měření vzorků pro pokus byly zakoupeny v tržní síti, nastříhány na velikost 5 x 5 cm. Jednotlivé síly byly 0,008 mm; 0,012 mm a 0,017 mm. Spektra jogurtů měřených na sáčcích o různé síle je znázorněn na obrázku 42.

Obr. 42: Spektra bílých jogurtů měřených na obalech o různé síle (0,008 mm; 0,012 mm; 0,017 mm) Výsledky porovnání sil sáčků určených k měření spekter jogurtů jsou zobrazeny na obrázcích 43 a 44. Jak je patrné NIR spektrofotometr zaznamenal rozdíl již u sáčku nejméně silného a středně silného. Rozdělil jednotlivá spektra do samostatných clusterů. Rozdíl mezi sáčky je pak více patrný u sáčku nejméně silného a nejsilnějšího. Rozdíl mezi těmito skupinami je podtržen přítomností diskriminačního kříže. Vliv síly měřícího sáčku u jogurtů je značný. Je tedy nutno měření provádět na obalech, na kterých byl kalibrační model vytvořen, jinak lez očekávat, že analýzy jsou méně přesné. Přestože mnoho autorů ve vědeckých publikacích (CENTER, 1999; ŠIKOLA, 2002,

103

Výsledky a diskuze

ČURDA et al., 2002) uvádí, že lze měřit přes transparentní materiály, aniž by měly vliv na měření vzorku.

Obr. 43: Rozdíl mezi jogurty měřenými na obalu středně silným (∆) a nejméně silným (□)

Obr. 44: Rozdíl mezi jogurty měřenými na obalu nejsilnějším (∆) a nejméně silným (□)

104

Výsledky a diskuze

Vliv homogenizace příchutí jogurtů V neposlední řadě byl NIR spektrofotometr podroben testu, zda je schopen rozlišovat jogurty jednoho druhu s různými příchutěmi. Měřeny byly jogurty v neupraveném stavu a také ve stavu rozmixovaném, kdy se případně větší kousky ovoce či jiných ochucujících složek homogenizovaly. Ukázky spekter jogurtů s vybranými příchutěmi jsou na obrázku 45.

Obr. 45: Spektra homogenizovaných a nehomogenizovaných jogurtů s příchutěmi Zřejmý rozdíl mezi měřením homogenních a nehomogenních jogurtů znázorňuje obrázek 46. Proto byly následující vliv, ochucující složka, zkoumán vždy jen u skupiny jogurtů homogenizovaných.

105

Výsledky a diskuze

Obr.

46:

Rozdíl

mezi

jogurty

s příchutěmi

nehomogenizovanými

(∆)

a

homogenizovanými (□)

Obr. 47: Rozdíl mezi jogurty s příchutí borůvkovou (∆) a jahodovou (□) Také v tomto případě se schopnost NIR spektrofotometru osvědčila. Dokázal bezpečně rozdělit jogurty různých příchutí. Na obrázku 47 vidíme rozdělení jogurtů s příchutí borůvkovou a jahodovou. Jednotlivá spektra jsou v příslušných clusterech, rozdíl mezi vzorky je zvýrazněn přítomností kříže diskriminace. Takový výsledek poskytly téměř všechny jogurty s rozdílnými příchutěmi. Analýzou fermentovaných mléčných výrobků pomocí NIR spektroskopie se také, v roce 1996, zabývali RODRIGUÉZ-OTERO et HERMIDA. Ve svém výzkumu 106

Výsledky a diskuze

se zaměřili na oblast kvantitativní s využitím přístroje NIRSystem Model 6500. U setu 107 vzorků referenčními metodami stanovili obsah tuku, bílkovin a celkové sušiny. Stejný soubor fermentovaných mléčných výrobků poté změřili na přístroji v rozsahu 400 – 2498 nm. U příslušných modelů bylo dosaženo korelačních koeficientů 0,999 pro tuk; 0,991 pro bílkoviny a 1,000 pro celkovou sušinu. Ve všech případech kalibrovaných složek dosáhl velmi těsné závislosti a velké robustnosti modelů. Podobnému pokusu se věnovali ŠUSTOVÁ et al. (2002), avšak na přístroji FT NIR Antaris. Zaměřili se na stanovení titrační kyselosti a tuku u jogurtů. Korelační koeficient (R) pro titrační kyselost je 0,9349 a pro tuk 0,9971. Směrodatné odchylky kalibrace (SEC) jsou 7,39 % a 0,15 %. Pro vytvoření validačního modelu metodou křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako pro kalibraci. Hodnota směrodatné odchylky validace (SEP) je 8,73 a 0,76 %. Kalibrační modely a jejich posouzení bylo rovněž zpracováno v diplomové práci BARTOŠÍKOVÁ (2008).

5.8 Eidamy Ke zjištění možného rozdílu mezi 4 různými výrobci eidamských sýrů (Madeta, Jihlava, Jaroměřice, Pelhřimov). Byly použity vzorky sýrů o 45% tučnosti ve shodném stupni zralosti. Každý vzorek byl změřen čtyřikrát a k vytvoření kalibračních modelů byla použita spektra průměrná. Byla použita metoda diskriminační analýzy. Obrázek 48 je příkladem spekter sýrů jednotlivých výrobců.

107

Výsledky a diskuze

Obr. 48: Spektra eidamských sýrů z mlékáren Madeta, Jaroměřice, Jihlava a Pelhřimov

Na následujících obrázcích (49 až 52) jsou zaznamenány rozdíly vzorky eidamských sýrů od jednotlivých výrobců.

Obr. 49: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Madety (□) a z Jaroměřic (∆)

108

Výsledky a diskuze

Obr. 50: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Madety A (□) a z Jihlavy (∆) Při porovnání eidamských sýrů od různých výrobců s využitím NIR spektrometru se podařilo od sebe bezpečně rozeznat všechny výrobce. Sýry od jednotlivých výrobců v kalibračním modelu vytvořily clustery dle druhové příslušnosti. Rozdíly mezi skupinami byly zvýrazněny přítomností diskriminačního kříže. Pouze v jednom případě (obrázek 52) se diskriminační kříž v modelu nezobrazil. Rozdíl mezi skupinami těchto sýrů byl zaznamenán, ne však tak markantní. Jednalo se o sýry vyrobené v Jihlavě a v Pelhřimově. Metodu diskriminační analýzy ve spojitosti s měřením v blízké infračervené oblasti je tedy pravděpodobně možno použít při charakterizaci eidamských sýrů podle původu výroby. Bylo by dobré kalibrační modely v budoucích pokusech rozšířit o větší škálu vzorků v různém stupni zralosti.

109

Výsledky a diskuze

Obr. 51: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Madety (□) a z Pelhřimova (∆)

Obr. 52: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Pelhřimova (□) a z Jihlavy (∆) V oblasti rozlišování autenticity a původu potravin je zpracována řada odborných textů. Rozpoznáváním geografického původu zeleného čaje Camellia sinensis L. ze 4 různých čínských provincií s využitím FT NIR spektroskopie se zabývali CHEN et al. (2009). Ke tvorbě kalibračních modelů byly použity založené 4 různé metody (LDA – lineární diskriminační analýza, KNN – k nejbližší soused, ANN – umělé neuronové sítě, SVM – podporné vektorové zpracování). Všechny metody 110

Výsledky a diskuze

založené na změření vzorků pomocí NIR spektrofotometru se v tomto případě prokázali svojí účinností. Nejlépe hodnocena byla metoda SVM. Další výzkum, v oblasti rozpoznávání původu ementálských sýrů, byl společně vykonáván v laboratořích ve Francii a Švýcarsku. Celkem 91 vzorků ementálských sýrů ze zemí Rakouska, Finska, Německa, Francie a Švýcarska bylo měřeno pomocí NIR, MIR a čelní fluorescence v kombinaci s chemometrickými metodami. Pro všechny použité metody byly vzorky zpracovávány do modelů pomocí faktoriální diskriminační analýzy. Z výsledků autorů vyplývá shodný závěr s naší prací, že velmi dobrou metodou pro rozlišování původu ementálských sýrů z různých zemí je FT NIR spektroskopie, nejméně přesnou metodou pak čelní fluorescence KAROUI et al. (2005).

5.9 Analogy sýrů Tato kapitola je zaměřena na využití NIR spektrometrie při kontrole falšování sýrů rostlinnými tuky. Použité vzorky jsou shrnuty v kapitole 4.1.9. Jednalo se o analogy dostupné v běžné tržní síti, určené k zapékání, smažení a také analogy tavených sýrů. Jednotlivé vzorky byly homogenizovány na struhadle, umístěny do kyvety pro otočný spinner NIR spektrofotometru a proměřeny pomocí difúzní reflektance (metoda částečného odrazu paprsku). Ukázky spekter eidamského sýrů a jeho analogů jsou vyobrazeny na následujícím obrázku.

111

Výsledky a diskuze

Obr. 53: Spektra eidamského sýrů, analogů Edina a bloček Analogy eidamských sýrů V této skupině byly porovnávány analogy eidamských sýrů versus eidamské sýry. Cílem bylo zjistit, zda je NIR spektrofotometrie vhodnou metodou při rozlišování sýrů a jejich analogů a jejich případnému falšování. Na obrázku 54 vidíme vyhodnocení porovnání eidamského sýru, znázorněny čtverečkem, s analogem Edina (trojúhelník). Vzorky jsou seskupeny do příslušných skupin, tzv. clusterů. Rozpoznatelně jsou od sebe odděleny a jejich odlišnost je potvrzena přítomností diskriminačního kříže. NIR spektrofotometr dokázal rozpoznat mezi těmito skupinami rozdíl, i když pouhým okem patrný nebyl.

112

Výsledky a diskuze

Obr. 54: Diskriminační analýza sýrů eidamského typu (Δ) a analogů sýrů Edina (□) Na obrázku 55 dochází rovněž k odlišení skupiny sýrů eidamských (Δ), v pravém dolním rohu, a analogů eidamského sýru určeného ke smažení (□), nacházející se v levém horním rohu.

Obr. 55: Diskriminační analýza sýrů eidamského typu (Δ) a analogů sýrů ke smažení (□) Také v případě analogu Dorfdamer s eidamskými sýry (obrázek 56) dochází k úplnému rozlišení skupin pomocí diskriminační analýzy. Odlišnost je vymezena diskriminačním křížem, který potvrzuje přesnost NIR spektrofotometru rozeznat 113

Výsledky a diskuze

eidamské sýry od analogů. Metoda je tedy jednak určitým nástrojem proti padělatelům eidamských sýrů a zároveň ochranou spotřebitele.

Obr. 56: Diskriminační analýza sýrů eidamského typu (Δ) a analogů Dorfdamer (□) Na následujícím obrázku můžeme vidět dvě skupiny analogů (Edina, sýr ke smažení). Část mléčného tuku u vzorků z obou skupin je nahrazena rostlinným tukem, NIR spektrofotometr je oddělil do dvou různých klastrů. Ačkoliv nám nebyla známa povaha použitých rostlinných tuků, lze z výsledků usoudit, že výrobci použili tuky různé povahy. Tuto rozlišnost přístroj bezpečně poznal. Rozdílnost jednotlivých vzorků analogů je potvrzena přítomným křížem diskriminace také na obrázku 58, v případě srovnání Dorfdameru a Ediny.

114

Výsledky a diskuze

Obr. 57: Diskriminační analýza analogů sýrů Edina (Δ) a analogů sýrů ke smažení (□)

Obr. 58: Diskriminační analýza analogů sýrů Edina (Δ) a analogů sýrů ke smažení (□) Diskriminační analýzou s pomocí NIR a ale také MIR spektrometrů se zabývali SINELLI et al. (2010b). 112 vzorků panenského olivového oleje rozdělili dle základních čichových atributů na defektní a nedefektní. Druhou zmiňovanou skupinu poté dle aromatické intenzity rozřadili do skupin málo, středně a hodně aromatické. Všechny vzorky byly zároveň proměřeny na MIR a NIR spektrofotometrech. Kalibrační modely byly vytvořeny pomocí metody LDA (lineární diskriminační analýza) a SIMCA (měkké nezávislé modelování tříd analogů). Výsledky prokázaly, že spektrometrie v 115

Výsledky a diskuze

kombinaci se statistickými metodami mohou být využity v rozpoznávání základních senzorických vlastností olivových olejů. Analogy tavených sýrů Ukázky spekter jednotlivých vybraných tavených sýrů a jejich analogů je znázorněn na obrázku 59. U tohoto typu sýrů byl nejdříve posuzován rozdíl mezi taveným sýrem a analogem a poté mezi jednotlivými druhy analogů tavených sýrů. První zmiňovaná analýza je vyhodnocena na obrázku 60. Zřetelně jsou rozděleny clustery tavených sýrů, v pravém dolním rohu obrázku a clustery analogů, v levé horní části. Diskriminační kříž oddělující skupiny a potvrzující odlišnost skupin je na obrázku rovněž přítomen.

Obr. 59: Spektra taveného sýru a analogu taveného sýru

116

Výsledky a diskuze

Obr. 60: Diskriminační analýza tavených sýrů (∆) a analogů tavených sýrů (□) Obrázky 61 a 62 porovnávají vybrané analogy tavených sýrů navzájem. V obou případech můžeme z přítomnosti diskriminačního kříže a rozdělení vzorků do jednotlivých tříd usuzovat, že existuje rozdíl i mezi analogy v závislosti na výrobci.

Obr. 61: Diskriminační analýza tavených sýrů (∆) a analogů tavených sýrů javor (□)

117

Výsledky a diskuze

Obr. 62: Diskriminační analýza analogu tavených sýrů výrobce A (∆) a analogů tavených sýrů výrobce B (□) Posuzován byl i rozdíl mezi analogy od téhož výrobce, s různým provedením formy – plátky vs. klasická forma. Toto porovnání se ukázalo jako velmi zajímavé. Vyobrazený diskriminační kříž jednoznačně prokazuje rozdíl mezi vybranými analogy. Na obrázku 63 tak můžeme vidět průkazný rozdíl mezi analogy, ač se jedná o téhož výrobce. V levém horním obdélníku se nachází analog Javor (klasická forma), v pravém dolním pak analog Javor (plátky).

Obr. 63: Diskriminační analýza analogů javor (∆) a analogů javor v plátcích (□)

118

Výsledky a diskuze

NIR spektroskopickou techniku s využitím metody diskriminační analýzy pro detekci rostlinných tuků v mléčných výrobcích také prováděli SATO et al. (1990). K analýze byly použity vzorky másel, margarínů, směsí těchto tuků a také směsi mléka kravského a sójového. Ze závěru práce vyplývá, stejně jako v naší práci, že NIR spektroskopii je možno použít pro detekci rostlinných tuků v mlékárenských výrobcích v obsahu do 3 % bezpečně, rychle a bez potřeby destrukce vzorků. Při

analýze

tavených

sýrů

s využitím

NIR

spektroskopie

analyzovali

KUKAČKOVÁ et al. (1999) 54 vzorků tavených sýrů bez přísad. Tyto vzorky byly získány v rámci Celostátních přehlídek tavených sýrů. Referenčními metodami byl získán obsah tuku, sušiny a bílkovin. Vzorky byly současně měřeny na spektrofotometru NIRS 6500 vybaveným vláknovou optikou. Pro kalibraci byla použita metoda MPLS. Nejlepších výsledků dosáhli s 1. derivací spekter – pro sušinu byl zjištěn korelační koeficient 0,995; pro tuk 0,995 a pro bílkoviny 0,989. Také JANKOVSKÁ (2004) ve své disertační práci uvedla výsledky kalibrací tavených sýrů. FT NIR Antaris byl kalibrován na obsah tuku, sušiny a byl sledován vliv teplot při skladování tavených sýrů. Na základě porovnání referenčních hodnot se spektry byly vytvořeny kalibrační modely. Podle hodnot variačních koeficientů se jedná o velmi spolehlivé modely. Také ŠUSTOVÁ et al. (2002) využila diskriminační analýzu pro porovnání spekter naměřených na přístorji FT NIR Antaris. Touto technikou byl sledován vliv podmínek chlazení na reologické vlastnosti tavených sýrů a také změny NIR spekter v závislosti na různých teplotách, při kterých byly tavené sýry ukládány do chladírny. Na FT NIR spektrofotometru by proměřena spektra 23 tavených sýrů. Diskriminační analýzou byly prokázány rozdíly mezi spektry tavených sýrů chlazených ihned (při teplotě 60 °C) a tavených sýrů chlazených po 24 hodinách (při teplotě pod 60 °C). Pařené sýry Velmi často se setkáváme s imitacemi pařených sýrů, konkrétně u sýrů typu mozzarella. Jedním příkladem imitace mozzarella sýru je „sýr“ na zapékání pizzarella. Ukázky spekter obou druhů, sýru i jeho analogu, jsou pro ilustraci ukázány na obrázku 64. Vzorky jsme po změření podrobili diskriminační analýze s využitím programu TQ 119

Výsledky a diskuze

Analyst. Stejně jako v předchozích rozborech byl NIR přístroj schopen rozpoznat mezi sýrem a jeho analogem rozdíl.

Obr. 64: Spektra pařeného sýru mozzarella a jeho analogu pizzarella Skupina sýrů mozzarella je na obrázku 65 v levé horní části, protilehle leží skupina analogů pizzarella. Středu dominuje diskriminační kříž, jakožto potvrzení významného rozdílu mezi skupinami.

Obr. 65: Diskriminační analýza sýrů mozzarella (□) a analogů pizzarella (∆)

120

Výsledky a diskuze

Na závěr jsme porovnali veškeré analogy sýrů s pravými sýry, vyjma tavených sýrů, které jsou jiného charakteru. Také v tomto případě jsme využili metodu diskriminační asnalýzy. Do jedné skupiny byly zahrnuty vzorky eidamských sýrů a mozzarella, do druhé skupiny analogy eidamských sýrů a pizzarella s přídavkem rostlinného tuku. Výsledek je znázorněn na obrázku 66. Došlo k rozdělení skupin analogů a sýrů, rozdíl je podtržen přítomností diskriminačního kříže. Je zřejmé, že NIR spektrofotometr je schopen zaznamenat rozdíl díky přítomnosti rostlinného tuku bez ohledu na druh sýru.

Obr. 66: Diskriminační analýza analogů (□) a sýrů (∆) Řada autorů publikovala práce na zjišťování imitací mléka a sýrů rozlišnými metodami. HURLEY et al. (2006) detekovali kravské mléko, jako levnější zdroj při výrobě sýrů z kozího, ovčího a buvolího mléka pomocí nepřímé sendvičové ELISA metody. Metodu komerčních testů ELISA k podobné analýze využili také COSTA et al. (2008). Další způsob detekce procentického zastoupení kozího, kravského a ovčího mléka v sýrech kamembértského typu využili MAYER et al. (1997). Analýzu prováděli s pomocí izoelektrického zaostřování a subsekventím denzinometrickým stanovením γ kaseinu. Procento zastoupení jednotlivých druhů mlék určili díky HPLC metodě. Kapalnou chromatografii a hmotnostní spektrometrie v roce 1996 aplikovali při zjišťování falšování buvolího mléka a pravé mozzarelly kravským mlékem ve své práci autoři MOLINA et al. U osumnácti testovaných vzorků pravé mozzarelly z výhradně buvolího mléka pak zjistili výskyt 3 vzorků falšovaných mlékem kravským. Další 121

Výsledky a diskuze

metody, které v této oblasti byly použity, jsou například PCR metoda nebo gelová polyakryamidová elekrtoforéza. Schopnost první jmenované k odhalení falšování buvolího mléka a sýrů mlékem kravským v roce 2011 vyzkoušeli vědci DE et al. Druhou zmiňovanou metodu PESIC et al. (2010) aplikovali při rozlišování falšování kozích a ovčích sýrů kravským mlékem. Všechny popsané metody byly velmi účinné v detekci falšování, avšak nutno zmínit jejich nevýhody, jako jsou časová náročnost nebo nutnost přípravy vzorků k analýzám. Oproti tomu vzorky při analýze na NIR spektrofotometru není nutno předem složitě připravovat, časová náročnost je minimální a jak dokázaly naše výsledky, je NIR spektroskopická metoda velmi dobře schopna rozlišovat sýry a jejich imitace.

5.10 Brambory V této kapitole jsme se zaměřili na porovnávání 10 odrůd brambor (viz kapitola 4.1.10) pomocí NIR spektrofotometru. Vzorky brambor v syrovém i vařeném stavu byly proměřeny na přístroji a následně kalibrovány pomocí metody diskriminační analýzy. Hlízy byly měřeny NIR spektrometrem na integrační sféře v režimu reflektance, s rozlišením 8 a počtem scanů 100. Z každé odrůdy bylo měřeno 5 hlíz. Před vlastním měřením byly vzorky rozpůleny a měřeny. Ukázky spekter některých odrůd znázorňuje obrázek 67.

122

Výsledky a diskuze

Obr. 67: Spektra odrůd brambor Jitka, Judita, Rohlíčci, Princess, Magda a Karin Při hodnocení výsledků kalibrací vyšlo najevo, že NIR spektrometrie je metoda, která je schopná rozlišit jednotlivé odrůdy. I když u některých odrůd s menší přesností. Na následujících obrázcích budou uvedeny některé příklady velmi dobrého rozlišení odrůd od sebe, ale i méně přesné rozlišení. Syrové brambory Při porovnání rozdílů mezi jednotlivými odrůdami se jako nejlépe rozpoznatelné od všech ukázaly odrůdy Magda a Judita. Diskriminační analýza rozlišila ostatních 9 odrůd do jednotlivých clusterů, v sedmi případech pak příslušnost k jednotlivým navolených skupin potvrdila přítomnost diskriminačního kříže. Diskriminační kříž úplně rozděluje clustery a nedochází tak k prolínání jednotlivých spekter. Příklad je uveden na obr. 68, kde vidíme diskriminační analýzu pro odrůdu Magda a Judita. Ve dvou případech rozlišování rozdílností od odrůdy Magda diskriminační analýza rozpoznala a rozdělila odrůdy (Jitka, RedAnna) do jednotlivých skupin, avšak diskriminační kříž chyběl. Stejně jako v případě odrůdy Judita, menší rozlišení bylo zaznamenáno u odrůd Velox a Princess.

123

Výsledky a diskuze

Obr. 68: Diskriminační analýza mezi odrůdami Judita (□) a Magda (∆) Další odrůdy brambor se také vzájemně odlišovaly, přítomnost diskriminačního kříže byla zaznamenána v počtu šesti mezi jednotlivými odrůdami a odrůdami Rosara, Valfi, Jitka, Karin; v počtu pěti v odlišení odrůd od odrůdy Jitka a Rohlíčci, v počtu čtyř u odrůdy Velox. Odrůda RedAnna byla NIR spektrometrem od zbylých odrůd odlišena s nejmenší přesností. Na obrázcích jsou uvedeny příklady přesného rozdělení odrůd pomocí DA (obrázek 69) a rozdělení s menší přesností (obrázek 70).

Obr. 69: Diskriminační analýza odrůdy brambor Rosara (□) a Valfi (∆)

124

Výsledky a diskuze

Obr. 70: Diskriminační analýza odrůdy brambor RedAnna (□) a Princess (∆) V roce 2009 také BONIERBALE et al. využili NIR spektroskopii v souvislosti s výzkumem brambor. Za její pomoci bylo zjišťováno množství celkových i individuálních karotenoidů. Vzorky brambor Solanum phureja byla měřeny v blízké infračervené oblasti, kalibrovány. Funkčnost kalibrace byla ověřena křížovou, externí i nezávislou validací. Detekce karotenoidů byla touto metodou prokázána jako vysoce účinná. Brambory vařené Stejné analýze byly podrobeny také brambory vařené. Hlízy brambor byly uvařeny do měkka, zchlazeny na pokojovou teplotu (23 ± 3 °C) a poté měřeny na FT NIR spektrofotometru. K vyhodnocení byla použita metoda diskriminační analýzy. Mezi jednotlivými odrůdami byl zaznamenán rozdíl, v některých případech potvrzen výskytem diskriminačního kříže. V případě porovnávání brambor vařených odrůd diskriminační analýza určila jako nejsnáze rozpoznatelnou odrůdu Judita. Schopnost rozpoznat odrůdu Judita od ostatních odrůd se zlepšila oproti použití diskriminační analýzy u hlíz syrových. Kalibrační model diskriminační analýzy ukazuje obrázek 71. Obrázku dominuje diskriminační kříž, který rozděluje skupinu hlíz odrůdy Judita (∆), v pravém dolním rohu a odrůdy Princess (□) v rohu protilehlém.

125

Výsledky a diskuze

Obr. 71: Diskriminační analýza odrůdy brambor Judita (□) a Princess (∆) Značné zlepšení oproti srovnání hlíz jsme zaznamenali také u odrůdy RedAnna. Ve všech srovnávání se podařilo RedAnnu rozpoznat a v šesti případech byl rozdíl podtrhnut výskytem kříže diskriminace. U hodnocení syrových hlíz v žádném z případů odlišnost DA RedAnny nebyla vyzdvižena křížem diskriminace. Příklad úspěšného rozřazení do tříd ukazuje obrázek 72.

Obr. 72: Diskriminační analýza odrůdy brambor Judita (□) a RedAnna (∆)

126

Výsledky a diskuze

Odrůda Rohlíčči byla DA v obou případech, jak u syrových, tak vařených hlíz rozeznána a diskriminačním křížem oddělena u stejného počtu odrůd (5), avšak jen u 3 shodně (Rosara, Princess, Magda). U zbylých odrůd bylo zaznamenáno zhoršení ve schopnosti NIR spektrometru odlišovat přesně odrůdy od sebe.

Sestupně byly

rozpoznány 4 odrůdy od Rosary a Magdy; 3 od Jitky a Princess; 2 od Valfi a Velox; 1 od Karin. Je zajímavé, že lepších výsledků bylo dosaženo u syrových odrůd. V případě zavedení metody do praxe je dobré, že není nutné brambory předem připravovat tepelnou úpravou. Jen by bylo třeba některé odrůdy optimalizovat rozšířením kalibračních modelů o další měření a tím zlepšit jejich funkčnost.

Obr. 73: Diskriminační analýza odrůdy brambor Rosara (□) a Valfi (∆) Také PEDRESCHI et al. v roce 2010 využili k analýze bramborových lupínků NIR spektroskopii. Byla publikována práce, která popisuje sledování nejdůležitějších parametrů kvality bramborových lupínků, obsahu sušiny, olejů a akrylamidu, pomocí online VIS/NIR spektrometrie. 60 vzorků brambůrků z tržní sítě bylo podrobeno chemickým i spektrofotometrickým analýzám. Následovala tvorba kalibračních modelů pomocí metody nejmenších čtverců. Díky korelačním koeficientům kalibrace 0,99 pro tuk a 0,97 lze metody používat v kontrole jakosti bramborových lupínků. Co se týče akrylamidu, kalibrační metoda není tak přesná a pro využití v rutinních analýzách je ji třeba zlepšit.

127

Závěr

6 ZÁVĚR Disertační práce se zabývala využitím blízké infračervené spektroskopie při hodnocení vybraných mléčných produktů, vajec, kuřecích šunek, triticale a brambor. Kvantitativní analýza  Slepičí vejce V této kapitole jsme se zabývali sledováním obsahu sušiny tekutých obsahů slepičích vajec při dvou rozdílných skladovacích teplotách (5 °C, 18 °C). U vzorků byla referenční metodou stanovena sušina, poté byla snímána pomocí optické sondy spektra vaječných obsahů. Na základě informací spektrálních i referenčních byly vytvořeny náležité kalibrační metody. Pro stanovení obsahu sušiny ve žloutku a melanži vajec byly získány velmi spolehlivé kalibrační modely. Lze je tedy aplikovat a využívat běžně v praxi pro urychlení stanovení sušiny vajec. Byl prokázán vliv rozdílných teplot skladování na kalibrační modely. Pro dosažení přesných výsledků obsahu sušiny ve vzorcích vajec skladovaných různým způsobem je třeba použít správný kalibrační model. Nutno zmínit, že jsme se pokoušeli stanovat sušinu ve vaječném bílku. Tento materiál se však ukázal jako nevhodný pro reflexní měření NIR spektrometrem pomocí optické sondy.  Pomazánkové máslo U 31 vzorků pomazánkového másla se v chemické laboratoři stanovoval obsah sušiny, tuku a pH pomocí referenčních metod. Vzorky byly umístěny do petriho misky a změřeny na integrační sféře. Ze vzešlých výsledků byly pomocí softwaru vytvořeny kalibrační modely. Byly získány velmi spolehlivé modely pro stanovení obsahu sušiny, tuku a pH pomazánkových másel. Lze je tedy využít v běžné praxi pro urychlení rutinních analýz.  Kozí sýry V této oblasti jsme se zabývali sledováním jakostních znaků kozích sýrů. Sýry byly nastrouhány na laboratorním struhadle a umístěny do kyvety. Po proměření spekter kozích sýrů na otočném spinneru byly vytvořeny, na základě referenčních hodnot, 128

Závěr

kalibrační modely pro stanovení obsahu sušiny, tuku, NaCl, pH a titrační kyselost vyjádřenou ve stupních Soxhlet Henkela (SH). Byly získány velmi spolehlivé metody pro stanovení obsahu tuku, sušiny, pH a titrační kyselosti (SH). Kalibrační model pro stanovení obsahu soli byl vyhodnocen jako spolehlivý, hodnota PCV překročila limitní hranici 10 %. Přesto jej lze využít, stejně jako kalibrační modely pro stanovení obsahu tuku, sušiny a pH, při kvantitativní analýze v běžné praxi.  Niva Také u sýrů Niva jsme sledovali schopnost NIR spektrofotometru stanovit základní jakostní složky. Chemickou analýzou se stanovil obsah tuku, soli a také pH. Postrouhané vzorky sýrů niva byly naměřeny na spektrometru v kyvetě umístěné do otočného spinneru. Výsledky chemické analýzy byly přiřazeny ke spektrům sýrů. Na základě matematicko-statistického propočtu byly získány kalibrační modely. Byly získány velmi spolehlivé modely pro stanovení obsahu tuku a pH. Lze je bez problémů používat v mlékárenské praxi při rutinních analýzách. Kalibrační model pro stanovení NaCl překročil hranici 5 % u koeficientu CCV a 10 % u koeficientu PCV, model je méně spolehlivý a pro využití v praxi je nutno jej optimalizovat.  Kuřecí šunky V kapitole zaměřené na kuřecí šunky byly vzorky podrobeny chemické a spektrofotometrické analýze. Vzorky salámů byly homogenizovány na kompaktní hmotu, vloženy do kyvety otočného spinneru a změřeny v režimu reflektance. Na základě porovnání referenčních a predikovaných hodnot byly vytvořeny kalibrační modely pro stanovení obsahu sušiny, tuku, svalových bílkovin a dusíkatých látek (Nlátky). Velmi spolehlivé modely, využitelné pro běžné analýzy v masném průmyslu, byly získány pro stanovení obsahu sušiny, dusíkatých látek, svalových bílkovin. PCV koeficient u kalibračního modelu pro stanovení obsahu tuku překročil limit 10 %, stále je to však model spolehlivý.  Triticale Po proměření spekter obilniny pomocí měrné sondy byl vytvořen, na základě referenčních hodnot, kalibrační model pro stanovení obsahu vlhkosti. Na základě kalibračních a variačních koeficientů (CCV, PCV) byl model vyhodnocen jako velmi 129

Závěr

spolehlivý, neboť ani jedna hodnota nepřekročila limit spolehlivosti. Model je schopen plného využití v běžné praxi. Kvalitativní analýza Schopnost NIR spektrofotometru byla prověřena i v kvalitativní oblasti. Byly zde analyzovány různé skupiny potravin s cílem prozkoumat zda NIR analyzátor rozdělí skupiny dle jejich originality.  Jogurty V této kapitole byly změřeny spektra bílých i ochucených jogurtů. Posuzován byl vliv teploty, síly sáčku určeného k měření vzorků a také vliv příchutí. Pomocí metody diskriminační analýzy byl potvrzen vliv teploty i síly měřícího materiálu na přesnost měření vzorků jogurtů při NIR spektrometrické analýze. Kalibrační modely je nutno měřit při jedné stálé teplotě nebo vytvořit kalibrační modely pro dané teploty, při kterých chce analytik sledovat jakost jogurtů, stejně jako držet standard v použitých transparentních materiálech, na kterých je vzorek měřen. Diskriminační analýza bezpečně rozdělila také spektra ochucených jogurtů. Je proto vhodné používat samostatné kalibrace pro homogenizované jogurty s jednotlivými příchutěmi.  Eidamy V této části práce jsme se zajímali, zda je NIR spektrofotometr natolik citlivý, aby byl schopen rozdělit stejné druhy eidamských sýrů o 45 % TVS, ve stejném stupni zrání, od čtyř rozdílných výrobců. Podařilo se od sebe bezpečně rozeznat všechny výrobce. Sýry od jednotlivých výrobců v kalibračním modelu vytvořily clustery dle druhové příslušnosti.

Rozdíly mezi

skupinami

byly zvýrazněny

přítomností

diskriminačního kříže. Pouze v jednom případě se diskriminační kříž v modelu nezobrazil. Rozdíl mezi skupinami těchto sýrů byl zaznamenán, ne však tak markantní. Po rozšíření metody o větší škálu vzorků sýru v různém stádiu zralosti, bychom jí mohli použít v praxi při charakterizaci eidamských sýrů podle původu výroby.  Analogy sýrů Tato kapitola byla zaměřena na využití NIR spektrometrie při kontrole falšování sýrů rostlinnými tuky. Jednalo se o analogy sýrů dostupných v běžné tržní síti, určené 130

Závěr

k zapékání, smažení a také analogy tavených sýrů. U všech porovnávaných skupin sýrů a analogů byl NIR přístroj schopen rozpoznat rozdíl mezi sýrem a jeho analogem. Výsledky prokázaly, že spektrometrie může být využita v rozpoznávání sýrů od jejich imitací a přispět tak k úspěšnému odhalení případných padělatelů sýrů.  Brambory V této kapitole jsme se zaměřili na porovnávání originality 10 odrůd brambor. Měřeny byly hlízy v syrovém i vařeném stavu. Poté byla spektra porovnána pomocí diskriminační analýzy. Lepších výsledků bylo dosaženo u syrových odrůd. V případě zavedení metody do praxe, při zjišťování odrůdové příslušnosti hlíz brambor, není nutné brambory předem připravovat tepelnou úpravou. Jen je třeba některé odrůdy optimalizovat rozšířením kalibračních modelů o další měření a tím zlepšit jejich funkčnost. Závěrem lze říci, že metoda NIR spektroskopie umožňuje multikomponentní analýzu surovin, meziproduktů i finálních výrobků v oblasti rostlinných i živočišných potravin. Poněkud náročnější je vytváření kalibračních modelů a také její přesnost může být ovlivněna použitými referenčními metodami. Samotné měření však nevyžaduje zvláštní nároky na obsluhující personál, prostor nebo finance. Při jednom měření lze zjistit současně několik parametrů najednou. NIR spektroskopii lze využít i pro on-line monitoring přímo ve výrobě, bez znehodnocení vzorku. Metoda blízké infračervené spektroskopie může být také významným nástrojem určování originality jednotlivých potravin a také v boji na ochranu spotřebitelů při falšování potravin.

131

Přehled literatury

7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ADAM, M., DOBIÁŠ, P., BAJEROVÁ, P., VENTURA, K., 2009: Comparison of various methods for determination of water in white yoghurts. Food Chemistry, 115: 1069-1073 ANDĚL, J., 1985: Matematická statistika, STNL - ALFA Praha, 346 s. ANONYMa, 2008: Teorie termovizního měření. Databáze online [cit. 2010-1-5]. Dostupné z http://www.termovize.com/princip-termovize/ ANONYMb, 2006: Diskriminační analýza. Lékařská a Přírodovědecká fakulta MU v Brně,

Databáze

online

[cit.

2009-6-24].

Dostupné

na:

http://www.iba.muni.cz/~budinska/microarray/res/files/diskr_analyza_0_.pdf ANONYMc, 2007: Vícerozměrná kalibrace. Databáze online [cit. 2010-2-25]. Dostupné

na

http://meloun.upce.cz/docs/research/chemometrics/methodology/4imetody.pdf ANDERSEN, CH., M., FRØST, M., B., VIERECK, N., 2010: Spectroscopic charakterization of low- and non-fat cream cheeses. International Dairy Journal, 20: 32-39 BAER, I., GURNY, R., MARGOT, P., 2007: NIRnext term analysis of cellulose and lactose-Application to ecstasy tablet analysis. Forensic Science International, 167(2-3): 234-241 BARTH, A., 2007: Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta, 1767: 1073-1101 BARTON, F., E., 2002: Theory and principles of near infrared spectroscopy. Spectroscopy Europe, 14 (1): 3122-3127 BARTOŠÍKOVÁ, H., 2008: Využití NIR spektrometrie k hodnocení kvality vybraných mlékárenských výrobků. Diplomová práce, Mendelova univerzita v Brně, Brno, 67 s. BEATEN, V., DARDENNE, P., 2002: Spectroscopy: Developments in Instrumentation and Analysis. Grasas y Aceites, 53 (1): 45-63 BEGLEY, T., H., LANZA, E., NORRIS., K.H., HRUSCHKA, W., R., 1984: Determination of Sodium Chloride in Meat by Near-Infrared Reflektance Spectroscopy. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 32: 984-987

132

Přehled literatury

BONIERBALE, M., GRÜNEBERG, W., AMOROS, W., BURGOS, G., SALAS, E., PORRAS, E., ZUM FELDE, T., 2009: Total and individual carotenoid profiles in Solanum phureja cultivated potatoes: II. Development and application of near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) calibrations for germplasm characterization. Journal of Food Composition and Analysis, 22 (6): 509-516 CEN, H., HE, Y., 2007: Theory and application of near infrared reflectance spectroscopy in determination of food quality. Trends in Food Science & Technology, 18 (2): 72-83 CENTER, V., 1999: Blízká infračervená spektroskopie (NIR) a její průmyslové využití. CHEMagazín, 1 (IX): 22-23 COLLELL, C., GOU, P., PICOUET, P., ARNAU, J., COMAPOSADA, J., 2010: Feasibility of near-infrared spectroscopy to predict aw and moisture and NaCl contents of fermented pork sausages. Meat Science, 328-330 COSTA, N., RAVASCO, F., MIRANDA, R., DUTHOIT, M., ROSEIRO, L., B., 2008: Evaluation of a commercial ELISA method for the quantitative detection of goat and cow milk in ewe milk and cheese. Small Ruminant Research, 79 (1): 73-79 CRUZ, J., BAUTISTA, M., AMIGO, J., M., BLANCO, M., 2009: Nir-chemical imaging study of acetylsalicylic acid in commercial tablets. Talanta, 80(2): 473-478 ČERMÁKOVÁ, L., NĚMCOVÁ, I., 1987: Spektrofotometrické metody v analytické chemii. Univerzita Karlova, Praha, 143 s. ČSN 57 0107, 1965: Metody zkoušení sýrů, tvarohů, krémů a pomazánek. Praha, Úřad pro normalizaci a měření, 28 s. ČSN 57 2301, 1991: Vaječná hmota. Praha, Úřad pro normalizaci a měření, 20 s. ČSN ISO 712 (461014), 2003: Obiloviny a výrobky z obilovin - Stanovení vlhkosti Praktická referenční metoda. Praha, Úřad pro normalizaci a měření, 12 s. ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., 2004: NIR spectroscopy: a useful tool for rapid monitoring of processes cheeses manufacture. Journal of Food Engineering, 61: 557560 ČURDA, L., KUKAČKOVÁ, O., NOVOTNÁ, M., 2002: NIR spektroskopie a její využití při analýze mléka a mléčných výrobků. Chemické Listy, 96: 305-310 DAVIES, T., 1998: The history of near infrared spectroscopic analysis: Past, present and future – „From sleeping technique to the morning star of spectroscopy“. Analusis 26 (4): 17-19 133

Přehled literatury

DE, S., BRAHMA, B., POLLEY, S., SINGH, K., P., SINGH, R., DATTA, T., K., GOSWAMI, S., L., 2011: Simplex and duplex PCR assays for species specific identification of cattle and buffalo milk and cheese. Food Control, 22 (5): 690-696 DOHNAL, L., 1999: Regrese a kalibrace, sympozium klinické biochemie FONS. 2: 2531, [cit. 2010-2-8]. Dostupné na http://www1.lf1.cuni.cz/~ldohna/publik/Kap_5_Regrese_a_kalibrace.pdf DOU Y., SUN, Y., REN, Y., JU, P., REN, Y., 2005: Simultaneous non-destructive determination of two components of combined paracetamol and amantadine hydrochloride in tablets and powder by NIRnext term spectroscopy and artificial neural networks. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37(3): 543-549 DRAČKOVÁ, M., JANDOVÁ, T., STANDAROVÁ, E., KORDIOVSKÁ, P., BORKOVCOVÁ, I., JANŠTOVÁ, B., NAVRÁTILOVÁ, P., VORLOVÁ, L., 2009: Stanovení obsahu polyaminů v tvarůžcích pomocí blízké infračervené reflektanční spektrometrie. Acta fytotechnica et zootechnica, mimoriadne číslo: 121-126 DRAČKOVÁ,

M.,

JANŠTOVÁ,

B.,

PŘIDALOVÁ,

H.,

VOZKOVÁ,

L.,

NAVRÁTILOVÁ, P., VORLOVÁ, L. 2008: Využití blízké infračervené reflektanční spektroskopie v analýze kozích sýrů. Sborník konference Mléko a Sýry, Praha: VŠCHT, 286 s. ECKSCHLAGER, K., 1991: Úvodní slovo ke knize MELOUN, M., MILITKÝ, J., Chemometrie – zpracování experimentálních dat na IBM-PC. SNTL, Praha, 384 s. ELLEKJÆR, M., R., HILDRUM, K., I., NÆS, T., ISAKSSON, T., 1993: Determination of the sodium chloride content of sausages by near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 1: 65-75 FERNÁNDEZ-CABANÁSA, V., M., POLVILLOA, O., RODRÍGUEZ-ACUÑAB, R., BOTELLAB, B., HORCADAA, A., 2011: Rapid determination of the fatty acid profile in pork dry-cured sausages by NIR spectroscopy. Food Chemistry, 124 (1): 373-378 FORINA, M., LANTERI, S., CASOLINO, CH., 2004: Chemometrics, Handbook of Food Ananlysis, Methods and Instruments in Applied Food Analysis. 2226 s. GAITÁN-JURADO, A., J., ORTIZ-SOMOVILLA, V., ESPAÑA-ESPAÑA, F., PÉREZ-APARICIO, F., DE PEDRO-SANZ, E., J., 2008: Quantitative analysis of pork 134

Přehled literatury

dry-cured sausages to quality control by NIRnext term spectroscopy. Meat Science, 78 (4): 391-399 GARCÍA-REYA, R., M., GARCÍA-OLMOB, J., DE PEDROC, E., QUILES-ZAFRAD, R., LUQUE DE CASTROA, M., D., 2005: Prediction of texture and colour of dry-cured ham by visible and near infrared spectroscopy using a fiber optic probe. Meat Science, 70 (2): 357-363 GONZÁLES-MARTÍN, I., HERNANDÉZ-HIERRO, J., M., VIVAR-QUINTANA, A., REVILLA, I., GONZÁLES-PERÉZ, C., 2009: The application of near infrared spectroscopy technology and remote reflectance fiber-optic probe for the determination of peptides in cheeses (cow´s, ewe´s and goat´s) with different ripening times. Food Chemistry, 114: 1564-1569 GIUNCHIA, A., BERARDINELLI, A., RAGNIA, L., FABBRIA, A., SILAGHIA, F., A., 2008: Non-destructive freshness assessment of shell eggs using FT-NIRnext term spectroscopy. Journal of Food Engineering, 89 (2): 142-148 GUOQUAN, L., HUAHONG, H., DAPENG, Z., 2006: Prediction of sweetpotato starch physiochemical quality and pasting properties using near-infrared reflectance spectroscopy. Food Chemistry, 94: 632-639 GURNÝ, P., GURNÝ, M., 2009: Lineární diskriminační analýza a Lévyho procesy při určování pravděpodobnosti úpadku finančních institucí. Sborník příspěvků z 7. mezinárodní konference Finanční řízení podniků a finančních institucí, s. 80-93 HAALAND, M., D., THOMAS, V., E., 1988a: Partial Least – Squares Methods for spectral Analyses. 1. Realtion to Other Quantitative Methods and the Extraction of Qualitative Information. Analytical Chemistry, 60: 1193-1202 HAALAND, M., D., THOMAS, V., E., 1988b: Partial Least – Squares Methods for spectral Analyses. 2. Application to Simulated and Glass Spectral Data. Analytical Chemistry, 60: 1202-1208 HERMIDA, M., GONZALEZ, J., M., SANCHEZ, M., RODRIGUEZ-OTERO, J., L., 2001: Moisture, solids-non-fat and fat analysis in butter by near infrared spectroscopy. International Dairy Journal, 11 (1-2): 93-98 HORÁK, M., VÍTEK, A., 1980: Zpracování a interpretace vibračních spekter. Nakladatelství technické literatury, Praha, 430 s. 135

Přehled literatury

HORÁK, M., PAPOUŠEK, D., 1976: Infračervená spektra a struktura molekul (Použití vibrační spektroskopie při určování struktury molekul). Academia Praha, 836 s. HURLEY, I., P., COLEMAN, R., C., IRELAND, H., E., WILLIAMS, J., H., H., 2006: Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese. International Dairy Journal, 16 (7): 805-812 CHEN, Q., ZHAO, J., LIN, H., 2009: Study on doscrimination of Roast green tes (Camellia sinensis L.) according to geographical origin by FT-NIR spectroscopy and supervised pattern recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 72: 845-850 JANKOVSKÁ, R., 2004: Využití blízké infračervené spektroskopie (NIR) při hodnocení vybraných mléčných produktů. Doktorská disertační práce, MZLU Brně, Brno, 176 s. JIRSA, O., HRUŠKOVÁ, M., ŠVEC, I., 2008: Hodnocení vlastností pšeničného těsta analýzou NIR spekter mouky. Chemické Listy, 102: 829-836 KÁBA, B., SVATOŠOVÁ, L., 1998: Některé poznatky ze statistického rozboru výsledků přijímacího řízení na PEF v letech 94-97. Sborník konference Agrární perspektivy VI, PEF ČZU, Praha, s. 439-441 KALINA, J., ŠPUNDA, V., 2004: Optická spektroskopie I. Přírodovědecká fakulta, Ostrava, 274 s. KANIA, P., 2007: Infračervená spektrometrie, Databáze online [cit. 2009-7-8]. Dostupné na http://www.vscht.cz/anl/lach1/7_IC.pdf KAROUI, R., DUFOUR, E., PILLONEL, L., SCHALLER, E., PICQUE, D., CATTENOZ, T., BOSSET, J., O., 2005: The potential of combined infrared and fluorescence spectroscopies as a method of determination of the geographic origin of Emmental cheeses. International Dairy Journal, 15: 287-298 KAROUI, R., MAZEROLLES, G., DUFOUR, E., 2003: Spectroscopic techniques coupled with chemometric tools for structure and texture determination in dairy products. International Dairy Journal, 13: 607-620 KAROUI, R., MOUAZEN, A., M., DOFOUR, E., PILLONEL, L., SCHALLER, E., BAERDENMAEKER, J., D., BOSSET, J. - O., 2006: Chemical characterisation of European Emmental cheeses by near infrared spectroscopy usány chemometrics tools. International Dairy Journal, 16: 1211-1217

136

Přehled literatury

KOSCHIN, F., KÁRNÍK, I., MAREK, L., PRŮŠA, M., ŘEZANKOVÁ, H., SVOBODA, L., VRABEC., M., 1992: Statigraphics aneb statistika pro každého. Praha, 360 s. KÖSSLER,

I., 1960: Infračervená spektroskopie v chemické analýze. Státní

nakladatelství technické literatury, Praha, 196 s. MACHO, S., LARRECHI, M., S., 2002: Near-infrared spectroscopy and multivariate calibration for the quantitative determination of certain propetries in the petrochemical industry. Trends in analytical chemistry, 21 (12): 799 – 806 MARK, H., WORKMAN, J., 1986: Effect of repack on calibrationbs produced for nerainfrared reflectance analysis. Analytical Chemistry, 58: 1454-1459 MARTÍN-DEL-CAMPO, S., T. PICQUE, D., COSÍO-RAMÍREZ, R., CORRIEU, G., 2007a: Evaluation of Chemical Parameters in Soft Mold-Ripened Cheese During Ripening by Mid-Infrared Spectroscopy. Journal of Dairy Science, 90 (6): 3018-3027 MARTÍN-DEL-CAMPO, S., T. PICQUE, D., COSÍO-RAMÍREZ, R., CORRIEU, G., 2007b: Middle infrared spectroscopy characterization of ripening stages of Camemberttype cheeses. International Dairy Journal, 17 (7): 835-845 MATĚJKA, P., 2006: Spektroskopie v blízké infračervené oblasti. Databáze online [cit. 2009-5-24]. Dostupné na: http://www.vscht.cz/anl/lach2/NIR.pdf MATĚJKA, P., 2009: Spektroskopie základní pojmy. Databáze online [cit. 2010-1-25]. Dostupné na: http://www.vscht.cz/anl/matejka/Chemie13-spektroskopie-zaklad.pdf MAYER, K., K., HEIDLER, D., ROCKENBAUERC., 1997: Determination of the percentages of cows', ewes' and goats' milk in cheese by isoelectric focusing and cationexchange HPLC of γ- and para-κ-caseins. International Dairy Journal, 7 (10): 619-628 McCLURE, W., F., 2003: 204 years of near infrared technology. Journal of near infrared spectroscopy, 11(6): 487-518 McCLURE, W., F., TSUCHIKAWA, S., 2007: Instruments, 75-108. In: OZAKI (ed.), Y., McCLURE (ed.), W., F., CHRISTY (ed.), A., A., Near – infrared spectroscopy in food science and technology, Wiley, 424 s. MELOUN, M., 2007: Statistická závislost, Chemometrie I. Databáze online [cit. 20106-12]. Dostupné na: http://meloun.upce.cz/index.php?option=com_content&view=article&id=123&Itemid= 46 137

Přehled literatury

MELOUN, M., FREISLEBEN, J., 2008: Klasifikace podzemních vod diskriminační analýzou,

Databáze

online

[cit

2010-5-6].

Dostupné

na:

http://meloun.upce.cz/docs/publication/197-manus.pdf MELOUN, M., MILITKÝ, J., 1991: Chemometrie – zpracování experimentálních dat na IBM –PC. Praha, 384 s., typové číslo L16-EI-IV-85/62 256 MILDE, D., 2008: Spektrální metody. Databáze online [cit. 2010-9-2]. Dostupné na: http://aix-lin.upol.cz/~milde/IM-uvod.pdf MÍKA, V., KOHOUTEK, A., NERUŠIL, P., 2008: Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR), výběr praktických aplikací v zemědělství. Praha, 44 s. MÍKA, V., 1996: NIR analýza potravinářských surovin. Přírodovědecká Fakulta MU, Brno, Letní škola spektroskopie, s. 19-29 MÍKA, V., 1997: Využití infračervené spektroskopie (NIRS) pro hodnocení kvality rostlinných výrobků. Metodika pro zemědělskou praxi, Praha, 28 s. MLČEK, J., ŠUSTOVÁ, K., 2006a: Porovnání senzorických a přístrojových metod stanovení tvrdosti eidamských sýrů v průběhu jejich zrání. Sborník abstraktov z IV. Medzinárodnej vedeckej konferencii študentov a doktorandov s mezinárodnou účasťou na FBP, SPU Nitra, s. 92 MLČEK, J., ŠUSTOVÁ, K., SIMEONOVOVÁ, J., 2006b: Application of FT NIR spectroscopy in the determination of basic chemical composition of pork and beef meat. Czech journal of animal science, 51 (8): 361-368 MLČEK, J., 2008: Využití NIR spektroskopie pro hodnocení kvality potravin a potravinových surovin. Doktorská disertační práce, MZLU v Brně, Brno, 147 s. MLČEK, J., ŠUSTOVÁ, K., SIMEONOVOVÁ, J., ROP, O., 2009: Applicaton of FT NIR spectroscopy in the determination of basic chemical composition of beef meat in roughly and finaly ground condition. Acta fytotechnica et zootechnica, 12: 455-462 MOLINA, E. FERNÁNDEZ-FOURNIER, A., DE FRUTOS, M., RAMOS, M., 1996: Western Blotting of Native and Denatured Bovine β-Lactoglobulin to Detect Addition of Bovine Milk in Cheese. Journal of Dairy Science, 79 (2): 191-197 NICODOM, 1997: TQ Analyst – Vývoj kalibračního modelu pro kvantitativní stanovení pomocí algoritmu PLS. Firemní literatura, 13 s. NICOLET, 2003: Omnic software – stručný návod. Firemní literatura, 50 s. NICOLET, 2006a: Result Integration software – stručný návod. Firemní literatura, 69 s. 138

Přehled literatury

NICOLET, 2006b: TQ Analyst – spektroskopický software. Firemní literatura, 51 s. NĚMCOVÁ, I., ČERMÁKOVÁ, L., RYCHLOVSKÝ, P., 2004: Spektrometrické analytické metody I. Univerzita Karlova, Praha, 166 s. OCKERMAN, D., H., GOLDSMAN, D., 1999: Student t-test and compound to detect transients in simulated time series – Theory and Methodology. European Journal of Operational Research, 116: 681-691 OPEKAR, F., JELÍNEK, I., RYCHLOVSKÝ, P., PLZÁK, Z., 2002: Základní analytická chemie. Univerzita Karlova, Praha, 201 s. OSBORNE, B., G., 2000: Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis. Encyclopedia of Analytical Chemistry, Edited by Robert A. Meyers. Ó John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 14 344 p. OZAKI, Y., MORITA, S., DU, Y., 2007: Spectral analysis, 47 – 72. In: OZAKI (ed.), Y., McCLURE (ed.), W., F., CHRISTY (ed.), A., A., Near – infrared spectroscopy in food science and technology, Wiley, 424 s. PARK, B., CHEN, Y., R., HUFFMAN, R., W., 1996: Integration of visible/NIRnext term spectroscopy and multispectral imaging for previous termpoultrynext term carcass inspection. Journal of Food Engineering, 30 (1-2): 197-207 PASQUINI, C., 2003: Near Infrared Spectroscopy: Fundamentals, Practical Aspects and Analytical Applications. Journal of the Brazilian Chemical Society, 14(2): 198-219 PEDRESCHI, F., SEGTNAN, V., H., KNUTSEN, S., H., 2010: On-line monitoring of fat, dry matter and acrylamide contents in potato chips using near infrared interactance and visual reflectance imaging. Food Chemistry, 121 (2): 616-620 PERTILE, E., ČABÍK, V., 2006: Instrumentální metody analýzy. Vysoká škola báňská, Ostrava, 238 s. PESIC, M., BARAC, M., VRVIC, M., RISTIC, N., MACEJ, O., STANOJEVIC, S., 2010: Qualitative and quantitative analysis of bovine milk adulteration in caprine and ovine milks using native-PAGE. Food Chemistry, In Press, Corrected Proof, Databáze online

[cit.

2010-10-9].

Dostupné

na

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T6R-517YNBT3&_user=10&_coverDate=10%2F16%2F2010&_alid=1529714369&_rdoc=1&_fmt=hi gh&_orig=search&_origin=search&_zone=rslt_list_item&_cdi=5037&_sort=r&_st=13 &_docanchor=&view=c&_ct=4285&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0 &_userid=10&md5=7be7f6d8537edad53794e93f09393050&searchtype=a 139

Přehled literatury

POSPÍŠIL, M., 2003: Instrumentální metody výzkumu a analýzy 1. Vydavatelství ČVUT, Praha, druhé vydání PRAUS, P., DOMEK, V., KLIKA, Z., 2001: Základy analytické chemie, učební texty pro posluchače jednosemestrálního kurzu analytické chemie. Vysoká škola báňská – technická univerzita, Ostrava, 105 s. PRIETO, N., ROEHE, R., LAVÍN, P., BATTEN, G., ANDRÉS, S., 2009: Application of nera infrared reflectance spectroscopy to predict meat and meat products duality: A review. Meat science, 83: 175-186 PROCHÁZKOVÁ,

Z., DRAČKOVÁ, M., SALÁKOVÁ, A., GALLAS, L.,

POSPIECH, M., VORLOVÁ, L., TREMLOVÁ, B., BUCHTOVÁ, H., 2010: Application of FT NIR Spectroscopy in the Determination of basic Physical and Chemical Properties of Sausages. Acta Veterinaria Brno, 79: 101-106 PUCHERT, T., LOCHMANN, D., MENEZES, J., C., REICH, G., 2010: Near-infrared chemical imaging (NIRnext term-CI) for counterfeit drug identification - A four-stage concept with a novel approach of data processing (Linear Image Signature). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 51 (1): 138-145 REVILLA, I., GONZÁLES-MARTÍN, I., HERNÁNDEZ-HIERRO, J., M., VIVARQUANTANA, A., GONZÁLES-PERÉZ, C., 2009: Texture evaluation in cheeses by NIRS technology employing a fibre-optic probe. Journal of Food Engieneering, 92 (1): 24-28 RŮŽIČKOVÁ, J., ŠUSTOVÁ, K., 2004: Využití FT NIR spektrometru při hodnocení jakostních ukazatelů jogurtů. Sborník z farmářské výroby sýrů a kysaných mléčných výrobků, s. 35-36 SATO, T., KAWANO, S., IWAMOTO, M., 1990: Detection of Foreign Fat Adulteration of Milk Fat by Near Infrared Spectroscopic Method. Journal of Dairy Science,73(12):3408-3413 SCHMILOVITCH, Z., SHMULEVICH, I., NOTEA, A., MALTZ, E., 2000: Near infrared spectrometry of milk in its heterogeneous state. Computers and Electronics in Agriculture, 29: 195-207 SCOOTER, CH., N., G., MILLAR, S., J., 2004: Analysis of Baking Products, 439 – 464. In ROBERTS, C., A.,

WORKMAN, J., J., REEVES III., B., Near Infrared

Spectroscopy in Agriculture, USA, 822 s. 140

Přehled literatury

SEIFERTOVÁ, E., 2005: NIR: k analýze obilovin a pícnin. Databáze online [cit. 20108-7].

Dostupné

na:

http://www.agroweb.cz/NIR:-k-analyze-obilovin-a-

picnin__s44x21805.html SEREGÉLY, Z., FARKAS, J., TUBOLY, E., DALMADI, I., 2006: Investigating the properties of egg white pasteurised by ultra-high hydrostatic pressure and gamma irradiation by evaluating their NIR spectra and chemosensor array sensor signal responses using different methods of qualitative analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 82 (1-2): 115-121 SHIROMA, C., RODRIGUEZ-SAONA, L., 2009: Application of NIR and MIR spectroscopy in quality control of potato chips. Journal of Food Composition and Analysis, 22: 596-605 SINELLI, N., LIMBOA, S., TORRIB, L., DI EGIDIOA, V., CASIRAGHIA, E., 2010a: Evaluation of freshness decay of minced beef stored in high-oxygen modified atmosphere packaged at different temperatures using NIRnext term and MIR spectroscopy. Meat science, Article in press, Databáze online [cit. 2010-6-25] Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T9G50C10YB1&_user=10&_coverDate=06%2F21%2F2010&_alid=1446517962&_rdoc=1 &_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_zone=rslt_list_item&_cdi=5114&_st=13 &_docanchor=&_ct=117&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1 0&md5=3de3ac1ca8a61a796171ae0376ed1509&searchtype=a SINELLI, N., CERETTANI, L., DI EGIDIO, V., BENDINI, A., CASIRAGHI, E., 2010b: Application of near infrared (NIR) and mid (MIR) infrared spectroscopy as a rapid tool to classify extra virgin oil on basis of fruity attribute intensity. Food Research International, 43: 369-375 STÁVKOVÁ, K., 2010: Využití NIR spektroskopie ke kontrole jakosti kozích sýrů. Diplomová práce, Mendelu v Brně, Brno, 57 s. ŠIKOLA, J., 2002: NIR Spektroskopie – Perspektivní metoda pro kvalitativní a kvantitativní analýzu v potravinách. Kvalita potravin, 2 (4): 18-19 ŠULCOVÁ, P., BENEŠ, L., 2008: Experimentální metody v anorganické chemii, Univerzita Pardubice. 256 s.

141

Přehled literatury

ŠUSTOVÁ, K., 2007: Posouzení vlivu teplot měření složení kravského mléka pomocí FT NIR spektroskopie. Acta univ. agric. Et silvic. Mendel. Brun., 55 (4): 95-101 ŠUSTOVÁ, K., BUCHAR, J., JANKOVSKÁ, R., KUBIŠ, I., SEDLÁČKOVÁ, M., 2002: Využití fyzikálních metod při hodnocení tavených sýrů. Sborník přednášek semináře „Mléko a sýry 2002“, 187-191 TABASI, S., H., MOOLCHANDANI, V., FAHMY, R., HOAG, S., W., 2009: Sustained release dosage forms dissolution behavior prediction: A study of matrix tablets using NIRnext term spectroscopy. International Journal of Pharmaceutics, 382 (1-2): 1-6 TISSUE, B., M., 1996. Michelson Interferometer. Databáze online [cit 2010]. Dostupné na: http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/optics/selector/michelso.htm TRILČOVÁ, A., ČOPÍKOVÁ, J., COIMBRA, M., A., BARROS, A., S., KŘÍSTKOVÁ, H., EGERT, L., SYNYTSYA, A., 2005: Využití infračervené spektroskopie při sledování kvality kakaového prášku. Chemické listy, 99: 821-824 TRCHOVÁ, M., 1999: Metodická příručka pro uživatele FTIR spektrometru. Matematicko fyzikální fakulta, UK, Praha, 49 s. WORKMAN, J., jr., SHENK, J., 2004: Understanding and Using the Near-Infrared Spectrum as an Analytical Method, 3 – 11. In ROBERTS, C., A., WORKMAN, J., J., REEVES III., B., Near Infrared Spectroscopy in Agriculture, USA, 822 s. WU, J., G., SHI, C., H., 2004: Prediction of grain wight, brown rice and amylose content in single rice grains using near-infrared reflectance spectroscopy. Field Crops Research, 87: 13-21 WÜST,E., RUDZIK, L., 2003: The use of infrared spectroscopy in the dairy industry, Journal of Molecular structure. 661-662: 291-298 ZARDETTO, S., 2005: Potential applications of near infrared spectroscopy for evaluating thermal treatments of fresh egg pasta. Food Control, 16: 249-2 ZHAO, J., LIN, H., CHEN, Q., HUANGA, X., SUN, Z., ZHOUA, F., 2010: Identification of egg’s freshness using NIR and support vector data description. Journal of Food Engineering, 98 (4): 408-414 ZOTTE, A., D., BERZAGHI, P., JANSSON, L., M., ANDRIGHETTO, I., 2006: The use of near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) in the prediction of chemical 142

Přehled literatury

composition of freeze-dried egg yolk and discrimination between different n-3 PUFA feeding sources. Animal Feed Science and Technology, 128: 108-121 ŽÁKOVSKÁ, A., 2010: Využití NIR spektroskopie při kontrole jakosti pomazánkových másel. Diplomová práce, Mendelu v Brně, Brno, 60 s.

143

Seznam obrázků

8 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ Obr. 1: Herschlův experiment (DAVIES, 1998)...................................................................... 12 Obr. 2: Rotace a vibrace dvouatomové molekuly (KLOUDA, 2003) ..................................... 16 Obr. 3: Různé druhy vibrací skupiny – CH2 – (ŠULCOVÁ et al., 2008) ................................ 17 Obr. 4: Infračervené spektrum (ANONYMa, 2008) ................................................................ 25 Obr. 7: Spektra tekutých vaječných obsahů (bílek, melanž, žloutek) ...................................... 66 Obr. 8: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny melanže (18°C) ............. 67 Obr. 9 : Kalibrační a validační výsledky pro sušinu žloutku skladovaného při 5 °C .............. 69 Obr. 10: Kalibrační a validační výsledky pro sušinu žloutku skladovaného při 18 °C............ 69 Obr. 11: Kalibrační a validační výsledky pro sušinu melanže skladovaného při 5 °C ............ 70 Obr. 12 : Kalibrační a validační výsledky pro sušinu melanže skladovaného při 18 °C ......... 70 Obr. 13: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model obsahu sušiny v pomazánkovém másle................................................................................................................................. 73 Obr. 14: Kalibrační a validační výsledky tučnosti pomazánkových másel.............................. 74 Obr. 15: Kalibrační a validační výsledky pro sušinu pomazánkových másel.......................... 75 Obr. 16: Kalibrační a validační výsledky pro pH pomazánkových másel ............................... 75 Obr. 17: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model pH kozích sýrů.................................... 78 Obr. 18: Kalibrační a validační výsledky pro titrační kyselost čerstvých kozích sýrů ............ 79 Obr. 19: Kalibrační a validační výsledky pro obsah NaCl v čerstvých kozích sýrech ............ 79 Obr. 20: Kalibrační a validační výsledky pro pH v čerstvých kozích sýrech .......................... 80 Obr. 21: Kalibrační a validační výsledky pro obsah tuku v čerstvých kozích sýrech.............. 80 Obr. 22: Kalibrační a validační výsledky pro obsah sušiny v čerstvých kozích sýrech .......... 81 Obr. 23 : Spektra sýru Niva, čerstvého kozího sýru a pomazánkového másla. ....................... 83 Obr. 24 : Spektra sýru Niva na začátku a konci doby zrání ..................................................... 83 Obr. 25: Průběh funkce PRESS pro kalibrační model pH sýrů Niva....................................... 84 Obr. 26: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu tuku v sýrech Niva .............. 86 Obr. 27: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení pH v sýrech Niva ............................. 86 Obr. 28: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu NaCl v sýrech Niva ............. 87 Obr. 29: Funkce PRESS kalibračního modelu pro stanovení obsahu tuku v kuřecích šunkách .......................................................................................................................................... 89

140

Seznam obrázků

Obr. 30: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu svalových bílkovin v kuřecích šunkách............................................................................................................................. 91 Obr. 31: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu dusíkatých látek (N látek) v kuřecích šunkách ........................................................................................................... 92 Obr. 32: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu tuku v kuřecích šunkách...... 92 Obr. 33: Kalibrační a validační výsledky pro stanovení obsahu sušiny v kuřecích šunkách... 93 Obr. 34: Spektra žita, pšenice a triticale................................................................................... 95 Obr. 35: Kalibrační a validační výsledky pro obsah vlhkosti v obilnině Triticale................... 96 Obr. 36: Spektra bílých jogurtů měřených při různých teplotách (10°C, 17°C, 25°C, 35°C) . 99 Obr. 37: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 10°C (□) a 17°C (∆) ......................................... 100 Obr. 38: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 10°C (□) a 35°C (∆) ......................................... 100 Obr. 39: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 10°C (□) a 25°C (∆) ......................................... 101 Obr. 40: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 17°C (čtverec) a 25°C (trojúhelník) ................. 101 Obr. 41: Rozdíl mezi jogurty měřenými při 35°C (□) a 25°C (∆) ......................................... 102 Obr. 42: Spektra bílých jogurtů měřených na obalech o různé síle (0,008 mm; 0,012 mm; 0,017 mm) ...................................................................................................................... 103 Obr. 43: Rozdíl mezi jogurty měřenými na obalu středně silným (∆) a nejméně silným (□) 104 Obr. 44: Rozdíl mezi jogurty měřenými na obalu nejsilnějším (∆) a nejméně silným (□) .... 104 Obr. 45: Spektra homogenizovaných a nehomogenizovaných jogurtů s příchutěmi............. 105 Obr. 46: Rozdíl mezi jogurty s příchutěmi nehomogenizovanými (∆) a homogenizovanými (□)................................................................................................................................... 106 Obr. 47: Rozdíl mezi jogurty s příchutí borůvkovou (∆) a jahodovou (□) ............................ 106 Obr. 48: Spektra eidamských sýrů z mlékáren Madeta, Jaroměřice, Jihlava a Pelhřimov .... 108 Obr. 49: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Madety (□) a z Jaroměřic (∆) ............... 108 Obr. 50: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Madety A (□) a z Jihlavy (∆) ............... 109 Obr. 51: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Madety (□) a z Pelhřimova (∆) ............ 110 Obr. 52: Diskriminační analýza eidamských sýrů z Pelhřimova (□) a z Jihlavy (∆) ............. 110 Obr. 53: Spektra eidamského sýrů, analogů Edina a bloček .................................................. 112 Obr. 54: Diskriminační analýza sýrů eidamského typu (Δ) a analogů sýrů Edina (□) .......... 113 Obr. 55: Diskriminační analýza sýrů eidamského typu (Δ) a analogů sýrů ke smažení (□).. 113 Obr. 56: Diskriminační analýza sýrů eidamského typu (Δ) a analogů Dorfdamer (□) .......... 114 Obr. 57: Diskriminační analýza analogů sýrů Edina (Δ) a analogů sýrů ke smažení (□) ...... 115

141

Seznam obrázků

Obr. 58: Diskriminační analýza analogů sýrů Edina (Δ) a analogů sýrů ke smažení (□) ...... 115 Obr. 59: Spektra taveného sýru a analogu taveného sýru ...................................................... 116 Obr. 60: Diskriminační analýza tavených sýrů (∆) a analogů tavených sýrů (□) .................. 117 Obr. 61: Diskriminační analýza tavených sýrů (∆) a analogů tavených sýrů javor (□) ......... 117 Obr. 62: Diskriminační analýza analogu tavených sýrů výrobce A (∆) a analogů tavených sýrů výrobce B (□) ................................................................................................................. 118 Obr. 63: Diskriminační analýza analogů javor (∆) a analogů javor v plátcích (□) ................ 118 Obr. 64: Spektra pařeného sýru mozzarella a jeho analogu pizzarella .................................. 120 Obr. 65: Diskriminační analýza sýrů mozzarella (□) a analogů pizzarella (∆)...................... 120 Obr. 66: Diskriminační analýza analogů (□) a sýrů (∆) ......................................................... 121 Obr. 67: Spektra odrůd brambor Jitka, Judita, Rohlíčci, Princess, Magda a Karin ............... 123 Obr. 68: Diskriminační analýza mezi odrůdami Judita (□) a Magda (∆)............................... 124 Obr. 69: Diskriminační analýza odrůdy brambor Rosara (□) a Valfi (∆) .............................. 124 Obr. 70: Diskriminační analýza odrůdy brambor RedAnna (□) a Princess (∆) ..................... 125 Obr. 71: Diskriminační analýza odrůdy brambor Judita (□) a Princess (∆)........................... 126 Obr. 72: Diskriminační analýza odrůdy brambor Judita (□) a RedAnna (∆) ......................... 126 Obr. 73: Diskriminační analýza odrůdy brambor Rosara (□) a Valfi (∆) ............................. 127

142

Seznam tabulek

9 SEZNAM POUŽITÝCH TABULEK Tab. 1: Referenční hodnoty sušiny (%) vaječných obsahů skladovaných při 5 °C ................. 56 Tab. 2: Referenční hodnoty sušiny (%) vaječných obsahů skladovaných při 18 °C ............... 56 Tab. 3: Referenční hodnoty sušiny, tuku, pH pomazánkových másel ..................................... 57 Tab. 4: Referenční hodnoty sušiny, tuku, NaCl, pH, titrační kyselosti (TK) čerstvých kozích sýrů ................................................................................................................................... 57 Tab. 5: Referenční hodnoty sušiny, tuku, NaCl, pH sýrů Niva................................................ 58 Tab. 6: Referenční hodnoty obsahu sušiny, tuku, svalových bílkovin a dusíkatých (Nlátek) látek v kuřecích šunkách.............................................................................................. .... 58 Tab. 7: Referenční hodnoty obsahu vlhkosti (%) ve šrotu triticale.......................................... 59 Tab. 8: Kalibrační výsledky obsahu sušiny vaječných obsahů při různých skladovacích teplotách. (Nžl.5°C = 33, Nžl.18°C = 20, Nmel.5°C = 33, Nmel.18°C = 33)..................68 Tab. 9: Validační výsledky obsahu sušiny vaječných obsahů při různých skladovacích teplotách (Nžl.5°C = 33, Nžl.18°C = 20, Nmel.5°C = 33, Nmel.18°C = 33)..................................... 68 Tab. 10 : Statistické vyhodnocení stanovení sušiny vaječných obsahů párovým t-testem ...... 71 Tab. 11: Kalibrační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (tuk, sušina, pH) u pomazánkových másel (N = 31)....................................................................................... 73 Tab. 12: Validační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (tuk, sušina, pH) u pomazánkových másel (N = 31)....................................................................................... 74 Tab. 13: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek pomazánkových másel párovým t-testem...............................................................................................................76 Tab. 14 : Kalibrační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (obsah tuku, sušiny, pH, titrační kyselost, obsah soli) v kozích sýrech (N = 30) .................................................... 77 Tab. 15 : Validační výsledky jednotlivých kalibrovaných složek (obsah tuku, sušiny, pH, titrační kyselost, obsah soli) v kozích sýrech (N = 30) .................................................... 78 Tab. 16: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek čerstvých kozích sýrů párovým t-testem.............................................................................................................. 81 Tab. 17: Kalibrační výsledky obsahu tuku, NaCl a pH sýrů Niva (N = 71) ............................ 84 Tab. 18: Validační výsledky obsahu tuku, NaCl a pH sýrů Niva (N = 71).............................. 85 Tab. 19: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek sýrů Niva párovým ttestem ............................................................................................................................... 87

143

Seznam tabulek

Tab. 20: Kalibrační výsledky obsahu tuku, sušiny, dusíkatých látek (Nlátky) a svalových bílkovin (%) v kuřecích šunkách (Ntuk = 35, Nsušina = 34, NNL = 32, Nsv.B = 39) ............. 90 Tab. 21: Validační výsledky obsahu tuku, sušiny, dusíkatých látek (Nlátky) a svalových bílkovin (%) v kuřecích šunkách (Ntuk = 35, Nsušina = 34, NNL = 32, Nsv.B = 39) ............. 90 Tab. 22: Statistické vyhodnocení jednotlivých kalibrovaných složek kuřecích šunek párovým t-testem ............................................................................................................................. 93 Tab. 23: Kalibrační výsledky obsahu vlhkosti v obilnině Triticale ......................................... 96 Tab. 24 : Validační výsledky obsahu vlhkosti v obilnině Triticale.......................................... 96 Tab. 25: Statistické vyhodnocení obsahu vlhkosti v obilnině Triticale ................................... 96

144

Seznam zkratek

10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A

absorbance, D

a

koeficient regresní přímky

α

hladina významnosti (α = 0,05), pravděpodobnost chyby prvního druhu, teoretická (předpokládaná) hodnota koeficientu a

ACE

metoda střídavého podmíněného očekávání

ANN

metoda neuronových sítí (artifical network)

AOTF

akusticko-opticky laditelné filtry (acousto-optical tunable filtres)

ATR

zeslabený úplný odraz (Attenuated Total Reflectance)

b

koeficient regresní přímky, optická tloušťka absorbujícího prostředí

bx ± a

parametry regresní rovnice

ci

koncentrace i-té složky ve směsi

CCV

kalibrační validační koeficient (%)

CLS

klasická metoda nejmenších čtverců

cos

funkce cosinus

CV

křížová validace (cross validation)

ČSN

česká státní norma

δ

deformační vibrace

DTGS

deuterovaný triglycinsulfát - detektor

E (n)

energie harmonického oscilátoru s vibračním kvantovým číslem n

Ε

absopční koeficient, energie harmonického oscilátoru

e

reziduum

ελ

molární absorpční koeficient i-té složky při dané vlnové délce λ

EDA

soubor emitujících diod (Emitting Diode Arrays)

EV

externí validace

Φν

spektrální hustota zářivého toku

FF

fixní filtry

FT

Fourierova transformace

H

Planckova konstanta (J.s)

H0

nulová hypotéza (μ = μ1 = μ2)

HPLC

kapalinová chromatografie

HTZ

hmotnost tisíce zrn 145

Seznam zkratek

IR

infračervená spektroskopie, FTIR, FT IR

IS

integrační sféra spektrofotometru sloužící k měření vzorků (princip difúzní polokoule)

JOT

jatečně opracované tělo

KF

Karl-Fischerova volumetrická titrace

KNN

metoda K-nejbližších sousedů (K-nearest neighbour)

LF-NMR

nukleárně resonanční reflaxometrie

LR

lineárně regresní závislost

ν

frekvence elektromagnetického záření (Hz), valenční vibrace, frekvence oscilátoru

νS

valenční vibrace symetrické

νAS

valenční vibrace asymetrické

λ

vlnová délka

μ

redukovaná hmotnost

mA

hmotnost atomu A molekuly

mB

hmotnost atomu B molekuly

max

maximální hodnota

min

minimální hodnota

MCR-ALS

multivariační obloukové rozlišení střídajících senejmenších čtverců

MIR

střední infračervená oblast (middle infrared)

MLR

vícenásobná lineární regrese (multiple linear regression)

MPLS

modifikovaná metoda částečných nejmenších čtverců

MSC

vícenásobná korekce rozptylu (multiplicative scatter correction)

MTC

detektor mercury – cadmium – telluride

MUFA

mononenasycené mastné kyseliny

‫ں‬

rychlost záření (m.s-1)

N

počet kalibračních vzorků

n

vibrační kvantové číslo

∆n

vibrační přechod

Nlákty

dusíkaté látky

NIR

blízká infračervená oblast, FTNIR, FT NIR

NIR – CI

chemická zobrazovací technika za pomoci blízké infračervené spektroskopie (Near Infrared Chemical Imaging)

146

Seznam zkratek

OLS

běžné nejmenší čtverce

PC

souřadnicový systém hlavních komponent (principal component)

PCA

analýza hlavních komponent (principal component analysis)

PCR

metoda hlavních komponent (principal component regression)

PCV

predikční variační koeficient (prediction coefficient of variation) (%)

PDA

detektor s fotodiodovou maticí (photodiode detector arrays)

PLS

metoda částečných nejmenších čtverců, počet faktorů (partial least squares)

PLS-DA

metoda diskriminační analýzy spojená s využitím algoritmu nejmenších čtverců (partial least squares discriminant analysis)

PRESS

předpovězené reziduální chyby metody PLS (predicted residual error sum of squares)

PUFA

polynenasycené mastné kyseliny

R

korelační koeficient

R2

koeficient determinace

RF

rádiové frekvence

SEC

směrodatná odchylka kalibrace (standard error of calibration)

SEP

směrodatná odchylka validace (standard error of predictiontion), SECV

SES

jednoduchý vývojový set (simple evolutional set)

SFA

nasycené mastné kyseliny

σ

vlnočet (cm-1)

sin

funkce sinus

SIMCA

metoda nezávislého modelování tříd analogů

SMLR

postupná vícenásobná lineární regrese

SVDD

podporovaný vektorový popis dat (support vector data description)

Sx

směrodatná odchylka průměru

τ

transmitance

t-test

statistický test

tstat

statistika t-test

tkrit(1)

tabulková hodnota při α = 0,05

tkrit(2)

tabulková hodnota při α = 0,01

TK

titrační kyselost (°SH)

TVS

obsah tuku v sušině

147

Seznam zkratek

UHP

ultra vysoký tlak (ultra high pressure)

UK

United Kingdom

ÚTP

Ústav technologie potravin

UV

oblast ultrafialového záření (ultraviolet)

UV/VIS

oblast ultrafialového záření, UV - VIS (ultraviolet/visible)

WIF

klínové interferenční filtra (wedge-interference filtres)

xNIR

průměrná hodnota předpověděná z NIR spektra

xp

průměr laboratorních hodnot složky

QDA

kvadratická diskriminační analýza, modelová verze UNEQ (quadratic discriminant analysis)

xREF

průměrná referenční hodnota

148

Přílohy

11 PŘÍLOHY

149

Obr. 1: Harmonický oscilátor v porovnání s reálnou molekulou dle TRCHOVÉ (1999)

Obr. 2 : Michelsonův interferometr; součástí je pevné (fixed mirror) a pohyblivé zrcadlo (moving mirror), dělič paprsků (beamsplitter). Na obrázku je zobrazen také světelný zdroj (light source) (TISSUE, 1996).

Obr. 3 : DTGS detektor (KLOUDA, 2003)

Obr.4:

Elektormagnetické (MATĚJKA, 2009)

spektrum

s jednotlivými

energetickými

přechody

Obr. 5: Ponorná sonda FT NIR Antaris při měření vaječného žloutku

Obr. 6: Měření vzorku pomazánkového másla v petriho misce na integrační sféře

Obr. 7: Kyveta na měření vzorků kozích sýrů a nivy

Obr. 8: Otočný spinner s kyvetou

Obr. 9: Měření vzorku triticale pomocí ponorné sondy

Obr. 10: Měření vzorků jogurtů v kádince a na polyetylénových sáčcích o různé síle

Obr. 11: Měření eidamských sýrů různých výrobců pomocí optické sondy

Obr. 12: Měření vzorků brambor na integrační sféře

Obr. 13: FT NIR Antaris

sušina ve vaječném obsahu 4 3,5

CCV, PCV (%)

3 2,5 2 1,5 1

CCV %

0,5

PCV %

0 sušina-žloutek 5°C

sušina-melanž 5°C

sušina-melanž 18°C

sušina-žloutek 18°C

Obr. 14: Kalibrační a variační koeficienty pro sušiny tekutých vaječných obsahů skladovaných při různých teplotách

Obr. 15: Diskriminační analýza melanže vajec skladovaných pří teplotě 18 °C (□) a 5 °C (∆)

Obr. 16: Spektra melanže vajec skladovaných při teplotě 18 °C a 5 °C

Složky pomazánkového másla 3,5 3

CCV, PCV (%)

2,5 2 1,5 1 CCV (% )

0,5

PCV (% ) 0 sušina (% )

pH

Tuk (% )

Obr. 17: Kalibrační a variační koeficienty pro obsah sušiny, tuku a pH v pomazánkových máslech

složky kozího sýru 12,00

CCV, PCV (%)

10,00 8,00 6,00 4,00 2,00

CCV (% ) PCV (% )

0,00 tuk

sušina

pH

SH

NaCl

Obr. 18: Kalibrační a variační koeficienty pro obsah sušiny, tuku, NaCl, pH a titrační kyselosti (SH) v kozích sýrech složky sýrů Niva 12

CCV, PCV (%)

10 8 6 4 2

CCV (% ) PCV (% )

0 tuk

NaCl

pH

Obr. 19: Kalibrační a variační koeficienty pro obsah sušiny, tuku a pH v sýrech Niva

složky v kuřecích šunkách 14 12

CCV, PCV (%)

10 8 6 4 2

CCV (% ) PCV (% )

0 tuk

sušina

Nlátky

sv.bílkovina

Obr. 20: Kalibrační a variační koeficienty pro obsah sušiny, tuku, dusíkatých látek (Nlátky) a svalových bílkovin v kuřecích šunkách

Využití FT NIR spektrometrie ke kontrole kvality potravin

Recommend Documents