Využití enzymů v medicíně 1. Stanovení enzymových aktivit diagnosticky významných enzymů 2. Stanovení analytů enzymovými analytickými metodami 3. Enzymy jako terapeutika
Enzymy jako diagnostické nástroje V buňkách 103 – 104 × vyšší konc. enzymů než v tělních tekutinách Změna energetického a metabolického stavu buněk → porušení membrán → uvolňování enzymů Rychlost podle molekulové hmotnost, lokalizace Koncentrační gradient
Některé příčiny poškození buněk 1. Hypoxie - poruchy okysličení krve - anémie, kardiovaskulární insuficience 2. Chemikálie, léky, polutanty - těžké kovy, alkohol, drogy, nikotin 3. Fyzikální - traumata - chlad, horko, radiace 4. Mikrobiální infekce - viry, bakterie, plísně, protozoa, 5. Imunitní mechnaismy - alergeny 6. Genetické defekty 7. Nedostatek výživy - nedostatek živin, vitamínů, minerálů 8. Jiné příčiny - proliferace určitého typu buněk, změna produkce
„Clearance“ enzymů inaktivace, stabilita v tělních tekutinách vstřebávání retikuloendoteliálním systémem (kostní dřeň, slezina, játra) → endocytosa regulovaná receptory → lysozomy Diagnostika Enzymová výbava buněk podobná (není orgánová specialisace) Liší se vzájemnými poměry Isoenzymy
Hlavní diagnostické enzymy
Enzym
Celosvětový objem prodeje (mil USD)
Alkalická fosfatasa
15
Peroxidasa
15
Cholesterol esterasa, oxidasa
8
G-6-PDH, HK
7
GOD
5
Lipasa
3
GluDH
2
LDH
2
MalátDH
2
Pyruvátkinasa
2
Transaminasy, ASP (EC 2.6.1.1), ALT (EC 2.6.1.2) Onemocnění jater, virová hepatitida, mononukleosa, cirhosa Svalové distrofie, svalová poranění, gangréna, pankreatitida Chemické stanovení: Oxokyselina + dinitrofenylhydrazin → DNF hydrazon
Oxaloacetát + NADH + H+
Pyruvát + NADH + H+
MDH
LDH
malát + NAD+
laktát + NAD+
Kreatinkinasa (EC 2.7.3.2, ATP: kreatin N-fosfotransferasa) Podjednotky M a B, CK-1 (BB), CK-2 (MB), CK-3 (MM), CK-Mt Vyžaduje Mg2+, inakt. Ca2+
Cr-P : ∆Gº´= - 43,1 kJ/mol-1 Reservoár ATP ve svalových a nervových buňkách Infarkt myokardu, svalové dystrofie, onemocnění CNS
Stanovení aktivity kreatinkinasy Cr + ATP → CrP + ADP (kreatin kinasa) pH 9 ADP + PPyr → ATP + Pyr (pyruvát kinasa) Pyr + NADH + H+ → laktát + NAD+ (laktát dehydrogenasa) Cr + ATP → CrP + ADP (kreatin kinasa) ATP + luciferin + O2 → APM + oxiluciferin + PPi + CO2 + hν CrP + ADP → Cr + ATP (kreatin kinasa) ATP + Glc → Glc-6-P + ADP (hexokinasa) GlC-6-P + NADP+ → 6-P-glukonát + NADPH + H+
(luciferasa)
pH 6,7 (Glc-6-P dehydrogenasa)
Laktátdehydrogenasa (EC 1.1.1.27)
LDH1 a LDH2 srdeční sval, ledviny, erytrocyty LDH4 a LDH5 – kosterní svalstvo, játra LDH 3 – plíce, slezina, ostatní tkáně
1,6 -hexandiol inh. vše kromě LDH1, Imunodetekce PL proti LD5
Diagnostika infarktu myokardu
Alkalická fosfatasa, ALP (EC 3.1.3.1),
pH optimum ≈ 10, fyziologická fce neznámá,
Ve všech tkáních, ↑konc v epitelu trávicího traktu, kostech, játrech, placentě Onemocnění jater, kostí (deformace, osteoporosa)
Kyselá fosfatasa ACP (EC 3.1.3.2), pH optimum < 7 V lysozomech, játra, slezina, mléko, kostní dřeň, krevní destičky, prostata
γ-glutamyltransferasa (EC 2.3.2.2), γ-glutamyl-peptid:aminokyselina γ-glutamyltransferasa -Transport AK přes membrány, metabolismus GSH - onemocnění jater, neprůchodnost žlučovodů,
Enzymy trávicího traktu Amylasy - pankreas CHT, TRY, PEP Lipasa - pankreas, lipoproteinlipasa - metabolismus triacylglycerolů, arteriosklerosa Stanovení aktivit :
……a navíc
Acetylcholinesterasa (EC 3.1.1.7) Onemocnění jater, otrava insekticidy, plicní embolie, akutní infekce
Stanovení analytů enzymovými metodami Kyselina močová ↑ - dna, kardiovaskulární choroby, ledvinové kameny ↓ - roztroušená skleroza Jeden z markerů oxidativního stresu
Cholesterol
Močovina + Glukosové sensory
Enzymy jako terapeutika
1. Náhrada geneticky deficientních nebo defektních enzymů 2. Doplnění enzymů produkovaných v nedostatečném množství (např v důsledku onemocnění urč. orgánu 3. Specifický biologický efekt aktivity enzymu
Požadavky na terapeutické enzymy: dosažení místa účinku stabilita rozpustnost čistota (minimalizace vedlejších účinků)
Rizika a jejich minimalizace Nízká stabilita - imobilizace biologická degradace – intravenosní, intramuskulární nebo subkutánní aplikace Neprocházejí membránami (působí extracelulárně) - snížení Mh, fuse se signálními peptidy (ve výzkumu) Imunogenicita (e. z jiných zdrojů než lidských....rekombinantní) – PEGylace, odtranění epitopů
Příklady terapeutických enzymů
Oxidoreduktasy Urikasa: Uric acid + O2 + H2O → 5-hydroxyisourate + H2O2 → allantoin + CO2 Superoxiddismutasa: 2O2− + 2H+ → O2+ H2O2.
Transferasa: Koagulační faktor XIII – transglutaminasa – tvorba ε-(γ-glutamyl)lysinových vazeb ve fibrinu – fibrinová síť
Hydrolasy Digestiva – lipasy, proteasy, glykosidasy Nukleasy – zvýšení rozpustnosti plicního sekretu při různých onemocněních dýchacích cest Glykosidasy Lysozym – antibakteriální Hyaluronidasa – hydrolysa pojivových tkání – usnadnění penetrace injektovaných preparátů, resorpce exudátů β-galaktosidasa Proteasy – odstranění krevních sraženin, ošetření ran
