S-NITROSOGLUTATHIONREDUKTASA: KLÍČOVÝ ENZYM REGULACE S-NITROSYLACE

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

S-NITROSOGLUTATHIONREDUKTASA: KLÍČOVÝ ENZYM REGULACE S-NITROSYLACE LUCIE KUBIENOVÁ, TEREZA TICHÁ, JANA JAHNOVÁ, LENKA LUHOVÁ a MAREK PETŘIVALSKÝ

vyvolávajících jeho tvorbu. Na produkci NO se u živočichů podílejí zejména konstitutivní a inducibilní isoformy synthasy oxidu dusnatého (NOS, EC 1.14.13.39), důležité zdroje NO v neenzymových reakcích pak představují především dusitany a S-nitrosothioly, významné meziprodukty metabolismu NO (cit.1,4). NO je vysoce reaktivní molekula, která může díky lipofilní povaze procházet membránami a působit do jisté míry i na okolní buňky a tkáně. Plynný radikál NO má v buněčném prostředí krátkou dobu života cca 3–5 s a rychle reaguje zejména se superoxidovým anionradikálem, atomy přechodných kovů a thioly5.

Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého, Šlechtitelů 11, 78371 Olomouc [email protected] Došlo 11.6.12, přijato 30.7.12.

Klíčová slova: S-nitrosoglutathionreduktasa, S-nitrosylace, S-nitrosothioly, oxid dusnatý, S-(hydroxymethyl)glutathion, abiotický stres, biotický stres

2.

S-nitrosace a S-nitrosothioly v signálních drahách NO

S-nitrosothioly (RSNOs) vznikají kovalentní vazbou funkční nitrososkupiny (NO-) na thiolovou skupinu (SH-) cysteinu v nízkomolekulárních thiolech a proteinech a dle současných znalostí představují relativně stabilní zásobní a transportní formy NO in vivo6,7. S-nitrosoglutathion (GSNO, obr. 1) je obecně nejrozšířenějším nízkomolekulárím S-nitrosothiolem, který může za určitých podmínek volný NO opět uvolňovat, nebo se může podílet na transportu NO a na transnitrosačních reakcích, kdy je nitrososkupina S-nitrosothiolu přenesena na thiolovou skupinu jiné molekuly8–10. GSNO vzniká v aerobním prostředí zejména reakcí tripeptidu glutathionu (GSH, γ-Glu-Cys-Gly) s reaktivními formami dusíku a má klíčovou funkci při udržování fyziologické hladiny celkových nízko- i vysokomolekulárních S-nitrosothiolů v buňkách. Dle aktuálních poznatků patří S-nitrosylace proteinů mezi nejvýznamnější post-translační modifikace proteinů11. V současnosti bylo identifikováno více než 100 možných cílů pro S-nitrosace, včetně regulačních proteinů a enzymů zapojených v buněčných pochodech, jako je apoptosa nebo udržování homeostasy železa12,13. Není tedy překvapující, že poruchy regulace hladiny buněčných S-nitrosothiolů jsou úzce spojeny s rozvojem řady patologických stavů14.

Obsah 1. Úvod 2. S-nitrosace a S-nitrosothioly v signálních drahách NO 3. S-nitrosoglutathionreduktasa: klíčový enzym regulace hladiny S-nitrosothiolů a detoxifikace formaldehydu 3.1. S-nitrosoglutathionreduktasa a katabolismus S-nitrosothiolů 3.2. S-nitrosoglutathionreduktasa a detoxifikace formaldehydu 4. Vlastnosti S-nitrosoglutathionreduktasy 4.1. Struktura S-nitrosoglutathionreduktasy 4.2. Substrátová specificita a kinetické parametry S-nitrosoglutathionreduktasy 5. Význam a funkce S-nitrosoglutathionreduktasy u živočichů 6. Význam a funkce S-nitrosoglutathionreduktasy u rostlin 7. Závěr

1. Úvod Oxidu dusnatý (NO), původně identifikovaný u savců jako endoteliální relaxační faktor, je považován za významnou signální molekulu v biologických pochodech v řadě organismů. V současnosti je známo, že u živočichů se NO účastní řady fyziologických procesů, jako je vasorelaxace, neurotransmise a regulace imunitního systému, a že poruchy v regulaci hladiny NO a příbuzných reaktivních forem dusíku jsou podstatou řady patologických stavů1. NO se také účastní regulace řady fyziologických pochodů u rostlin a je součástí signálních kaskád rostlinných reakcí na stresové podmínky2,3. Biosyntéza NO může probíhat enzymovými i neenzymovými pochody, v závislosti na lokalizaci a stimulech

N

O O

N O

O

N S N

O

O

O

Obr. 1. Strukturní vzorec S-nitrosoglutathionu (GSNO). Sumární vzorec je C10H16N4O7S a systematický název je 2S-2-amino-5-[[2R-1-(karboxymethylamino)-3-nitrososulfanyl-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanová kyselina

202

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

(GSNOR), tento název však zatím nebyl Názvoslovnou komisí IUBMB schválen. Z hlediska enzymové klasifikace patří GSNOR do rodiny zinek-dependentních alkoholdehydrogenas třídy III (ADH3; EC 1.1.1.1), které se vyznačují vyšší afinitou k alkoholům s delším řetězcem20.

3. S-nitrosoglutathionreduktasa: klíčový enzym regulace hladiny S-nitrosothiolů a detoxifikace formaldehydu Výsledky výzkumu posledních let ukázaly, že stěžejní úlohu v katabolismu GSNO a zprostředkovaně i regulaci celkové hladiny S-nitrosothiolů má enzym S-nitrosoglutathionreduktasa (GSNOR)15. Bylo zjištěno, že aktivita GSNOR je spojena s již dříve známým enzymem, ve starší literatuře původně označovaným jako glutathiondependentní formaldehyddehydrogenasa (FALDH; EC 1.2.1.1)16. Vzhledem k pozdějšímu odhalení reakčního mechanismu, kdy vlastním substrátem enzymu není glutathion, ale spontánně vznikající adukt glutathionu a formaldehydu S-(hydroxymethyl)glutathion (HMGSH), se enzym od roku 2005 označuje jako S-(hydroxymethyl) glutathiondehydrogenasa (EC 1.1.1.284). Tento enzym tedy katalyzuje oxidaci HMGSH na S-formylglutathion za účasti NAD+ jako koenzymu. Za fyziologicky významnější se dnes ovšem považuje S-nitrosoglutathionreduktasová aktivita, kdy NADH-dependentní redukce GSNO vede k tvorbě oxidovaného glutathionu (GSSG) a amoniaku17–19. Nejčastěji používaným názvem enzymu v současné vědecké literatuře je tedy S-nitrosoglutathionreduktasa

A

O O

GSH + CH2O

O

GSNOR se klíčovým způsobem podílí na regulaci intracelulární hladiny GSNO a S-nitrosothiolů a hraje tak důležitou roli v celkovém metabolismu NO a reaktivních forem dusíku15. Přestože metabolické dráhy S-nitrosothiolů a jejich regulace nejsou stále plně prozkoumány, bylo prokázáno, že GSNO může být za určitých podmínek substrátem i dalších enzymů kromě GSNOR a že S-nitrosoglutathionreduktasová aktivita je podobně jako u GSNOR spojena s jinými známými enzymovými aktivitami odlišných proteinů: thioredoxinu, xanthinoxidasy, glutathionperoxidasy, glutamylpeptidasy, Cu/Zn-superoxiddismutasy a nitroreduktasy15. Významným faktorem regulujícím redukci GSNO katalyzovanou GSNOR je buněčný redoxní potenciál. Reakční mechanismu redukce GSNO vede ke vzniku nesta-

ADH3

O O

S

O

NH2

H N

N H

3.1. S-nitrosoglutathionreduktasa a katabolismus S-nitrosothiolů

N H

O

O

NAD+

HO

O

NADH + H+

O

O O

S

HMGSH

NH2

H N

O

S-formylglutathion

B

B O O O

N H S O

O

NH2

H N

O

O

GSNOR

O

O

O

N

NADH

GSNO

O O O

N H

N H

O S NH2

O

GSSG S

O

O

NH2OH

NAD+

NHOH

GSNHOH

O

H2O

NH2

H N

O

O O

GSH

NH2

H N

O

O

NH4+

GSONH2

N H

O S OH

NH2

H N

O O

O

GSOOH

Obr. 2. Reakce katalyzované GSNOR (alkoholdehydrogenasa třídy III); (A) v dehydrogenasovém modu katalyzuje GSNOR/ADH3 oxidaci S-(hydroxymethyl)glutathionu (HMGSH), aduktu formaldehydu a glutathionu, na S-formylglutathion; (B) v reduktasovém modu GSNOR/ADH3 katalyzuje NADH-dependentní redukci S-nitrosoglutathionu (GSNO) na nestabilní intermediát N-hydroxysulfinamid (GSNHOH)

203

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

látu a cytochrom P450-dependentní oxidací herbicidů24. ADH3 je tedy ze všech doposud popsaných enzymů nejvíce efektivním formaldehyd-metabolizujícím enzymem in vitro20. Katalýza NAD+-dependentní oxidace S-(hydroxymethyl)glutathionu, který vzniká samovolnou a spontánní reverzibilní reakcí formaldehydu s glutathionem, představuje klíčový krok detoxifikace exogenního i endogenního formaldehydu. U některých bakterií je syntéza substrátu HMGSH urychlována enzymem S-(hydroxymethyl) glutathionsynthasou (EC 4.4.1.22). GSNOR se tedy u všech organismů účastní metabolických drah zodpovědných za detoxifikaci intracelulárního formaldehydu, produkt této reakce (S-formylglutathion) je dále hydrolyzován enzymem S-formylglutathionhydrolasou (EC 3.1.2.12)24.

bilního meziproduktu N-hydroxysulfinamidu (GSNHOH). Konečný produkt je závislý na lokální koncentraci GSH: v jeho nadbytku vede nukleofilní atak GSH k uvolnění hydroxylaminu (NH2OH) a glutathiondisulfidu (GSSG), při nízké hladině GSH se může GSNHOH spontánně přeskupit na glutathionsulfinamid (GSONH2), který je v kyselém prostředí hydrolyzován na glutathionsulfinovou kyselinu (GSO2H) a amoniak17 (obr. 2). V buňce je za fyziologických podmínek koncentrace GSH řádově milimolární, bude tedy docházet k posunutí reakce ve směru tvorby GSSG a hydroxylaminu21,22. Je známo, že intracelulární hladina GSH může významně kolísat, např. při expozici toxickým látkám nebo v případě oxidačního stresu spojeného s patologickými procesy. Studie provedené in vitro prokázaly, že snížená koncentrace GSH vedla k posunutí reakce od meziproduktu GSNHOH k tvorbě GSONH2, který dále hydrolyzuje na GSO2H. Ta může být v podmínkách silného oxidačního stresu oxidována až na kyselinu glutathionsulfonovou (GSO3H)20. GSONH2, GSO2H i GSO3H mají rostoucí potenciál inhibovat enzymy z rodiny glutathiontransferas, důležitých pro detoxifikaci řady xenobiotik jejich konjugací s GSH. Inhibice aktivity GSH-dependentních enzymů vede následně k intenzivnímu nitrosačnímu a oxidačnímu stresu22. Je známo, že GSH se v buňkách podílí v askorbátglutathionovém cyklu na antioxidačních mechanismech a má funkci jako detoxifikační molekula pro těžké kovy a jiná xenobiotika22. Lze předpokládat, že dalším faktorem regulace hladiny GSNO v buňce by mohla být dostupnost koenzymu GSNOR, tedy NADH. Za normálních podmínek je v cytoplasmě hodnota poměru oxidované a redukované formy NAD+/NADH cca 700, naopak poměr pro koenzym NADP+/NADPH je nízký, což umožňuje redukované formě NADPH vystupovat jako reduktant v biosyntetických drahách. Tyto rozdílné poměry jsou klíčové pro různé metabolické role koenzymů NADH a NADPH. U zatím popsaných forem GSNOR bylo prokázáno, že pro redukci GSNO nemůže být ve významné míře alternativně využit NADPH jako koenzym. Větší dostupnost a hladina NADH vedou k vyšší redukci GSNO. GSNOR jako člen rodiny alkoholdehydrogenas třídy III (ADH3) může také sama produkovat NADH, a to dehydrogenací aduktu GSH a formaldehydu, S-hydroxymethlyglutathionu20.

4. Vlastnosti S-nitrosoglutathionreduktasy 4.1. Struktura S-nitrosoglutathionreduktasy GSNOR má obdobně jako jiné enzymy z rodiny alkoholdehydrogenas homodimerní strukturu obsahující dva atomy zinku. Každý monomer se skládá z velké katalytické domény a z menší nekatalytické domény s vazebným místem pro koenzym25,26. Oba zinečnaté ionty jsou vázány v katalytické doméně, avšak v katalýze je zapojen pouze jeden z nich; druhý atom zinku má strukturní funkci. Aktivní místa monomerů GSNOR jsou lokalizována ve štěrbině mezi katalytickou doménou a vazebnou doménou pro koenzym. V lidské GSNOR je katalytický zinek vázán na His69, Cys177 a Cys47, zatímco strukturální zinek je vázán na čtyři cysteiny. Dimer drží pohromadě pomocí dvanácti prvků pseudokontinuálního beta-listu, který tvoří většinu vazebné domény pro koenzym. Úloha specifických residuí v aktivním místě při vazbě fyziologicky důležitých substrátů a strukturní změny proteinu během katalytického cyklu dehydrogenasové reakce GSNOR byly zkoumány na základě krystalové struktury ternárního komplexu enzymu se substrátem HMGSH a koenzymem NADH v rozlišení 1,6 Å (cit.26,27). Tvorba ternárního komplexu zahrnuje pohyb katalytické domény směrem k doméně vázající koenzym. Molekula vody přilehlá k 2᾿-hydroxylu ribosy naznačuje, že proton substrátu je přenášen do rozpouštědla přímo z koenzymu a ne přes terminální histidin, jak je tomu při přenosu protonu u ADH1. HMGSH je přímo koordinován k zinku v aktivním místě a interaguje s vysoce konzervovanými residui Arg114, Asp55, Glu57 a Thr46. Vazebné místo katalytického zinku má tetrahedrální koordinaci s účastí Cys44, His66 a Cys173 a HMGSH. To je v kontrastu s koordinací zinku v binárním komplexu GSNOR pouze s koenzymem, kde všechny ligandy pochází z enzymu a zahrnují čtvrtý ligand Glu67. Změny v koordinaci zinku v ternárním komplexu je dosaženo pohybem katalytické domény v rozsahu 2,3 Å (cit.26,27).

3.2. S-nitrosoglutathionreduktasa a detoxifikace formaldehydu Toxicita produktu katabolismu uhlíkatých sloučenin, formaldehydu, je spojena s vysokou reaktivitou karbonylové skupiny, která může reagovat s DNA a proteiny za vzniku stálých karboxylovaných produktů. U rostlin vzniká disociací 5,10-methylentetrahydrofolátu a oxidací methanolu, vznikajícího demethylací pektinu23. Formaldehyd může také vznikat během jiných oxidačně-demethylačních reakcí, např. dekarboxylací glyoxy-

204

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

4.2. Substrátová specificita a kinetické parametry S-nitrosoglutathionreduktasy

5. Význam a funkce S-nitrosoglutathionreduktasy u živočichů

Struktura aktivního místa GSNOR, zástupce ADH třídy III, je výrazně odlišná oproti klasickým ADH třídy I. Rezidua 53-59 a 113-120 jsou situována dále od aktivního místa, které se tím podstatně zvětší a vytváří se rozšířený vstup pro substrát do vazebné domény. Tyto strukturní změny jsou základem odlišné substrátové specificity ADH3, jejíž zvětšené aktivní místo nemůže být nasyceno ethanolem jako u ADH1, ale je uzpůsobeno pro vazbu větších substrátů, jako je GSNO, HMGSH, alkoholy s delším řetězcem a ω-hydroxymastné kyseliny. Pro vazbu HSGSH a GSNO hraje stěžejní úlohu zejména Arg114, jehož kladný náboj ve vazebném místě usnadňuje vazbu a správnou orientaci negativně nabitých substrátů22,28. GSNOR tedy specificky katalyzuje oxidaci alkoholů s dlouhým řetězcem jako cinnamylalkohol, farnesol a geraniol na příslušné aldehydy za účasti NAD+. Alkoholy, které mají řetězec delší než 4 uhlíky, jsou mnohem efektivněji oxidovány než ethanol, který je velmi „slabým“ substrátem21. Pro další možné substráty, jako ω-hydroxymastné kyseliny (např. kyselina 12-hydroxydodekanová), však GSNOR vykazuje mnohem nižší katalytickou účinnost29. Dalším substrátem GSNOR je již zmíněný spontánní adukt glutathionu a formaldehydu S-(hydroxymethyl) glutathion, jehož oxidací za účasti NAD+ je GSNOR zapojena do detoxifikace endogenního a exogenního formaldehydu. Dle současných poznatků je však fyziologicky nejvýznamnějším substrátem enzymu S-nitrosoglutathion (GSNO) – hodnota konstanty KM lidské ADH3 pro HMGSH je přibližně 100 vyšší než pro GSNO. Katalytická konstanta je 10 vyšší pro redukci GSNO, avšak katalytická efektivita asi 2 vyšší pro HMGSH30–32. Je známo, že kyselina dodekanová, 4-pentylpyrazol a 1,10-fenantrolin se chovají jako inhibitory oxidace alkoholů. U 4-pentylpyrazolu a 1,10-fenantrolinu bylo zjištěno, že inhibují také enzymy jiných tříd ADH. Kyselina dodekanová je specifický inhibitor GSNOR, kde byla prokázána interakce s Arg114. V nedávné studii byl otestován vliv různých substrátových analog, včetně mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem a derivátů glutathionu, na inhibici GSNOR21. U většiny se jednalo o nekompetitivní typ inhibice. Inhibiční konstanty pro odpovídající ω-mastné kyseliny byly v mikromolárním rozsahu a vykazovaly jasnou závislost na délce řetězce, přičemž nejúčinnějšími inhibitory byly kyselina dodekanová a dodekandiová. Obdobně všechny inhibitory odvozené od glutathionu (S-methylglutathion, kyselina glutathionsulfonová, S-acetamidoglutathion, glutathiondisulfid) měly inhibiční konstanty v řádu milimolárním – odstranění funkčních skupin molekul inhibitorů navázaných v aktivním místě zinku vedlo ke snížení afinity o tři řády. Aktivní místo s atomem zinku je nezbytné pro oxidaci a redukci všech substrátů, protože koordinuje příslušný atom kyslíku21.

GSNO představuje signální dráhu NO nezávislou na cGMP, která reguluje široké spektrum buněčných proteinů a jejich funkce prostřednictvím S-nitrosylace cysteinových residuí. Tento proces zahrnuje např. modulaci receptorů spřažených s G-proteiny, regulaci transkripčních faktorů a degradaci tumor-supresorového genu p53 (cit.11). Poruchy v regulaci hladiny S-nitrosothiolů jsou prokázány v řadě onemocnění nervového a kardiovaskulárního systému a u plicních chorob33. Experimentálně byla prokázána porucha homeostázy S-nitrosothiolů v souvislosti se zapojením GSNOR v metabolismu formaldehydu22,35. Je tedy zřejmé, že distribuce, ontogeneze a regulace GSNOR bude mít významné důsledky pro metabolismus endogenního i exogenního formaldehydu, stejně jako regulaci a modulaci signálních drah NO. Strukturální a funkční aspekty GSNOR poukazují na zásadní roli tohoto proteinu v buněčné signalizaci14,34, avšak výzkumu vlivu formaldehydu na S-nitrosothioly a související signální dráhy se doposud věnovaly pouze tři studie19,22,35. In vitro studie ukazují, že formaldehyd může urychlit redukci GSNO prostřednictvím recyklace koenzymů NAD+/NADH, a tím způsobí změny hladin S-nitrosothiolů19. Dehydrogenací formaldehydu dochází k produkci NADH, který je následně využit v reakci s GSNO. Tento jev není pro ADH3 jedinečný, také jiné ADH mají schopnost opětného použití koenzymu. Společně tyto údaje naznačují, že nadbytek formaldehydu z endogenního nebo i exogenního zdroje může měnit homeostázu thiolů in vivo19,22. V nedávné studii byla prokázána společná lokalizace GSNOR a NOS ve střevě a v kyjovité žláze u Branchiostoma floridae, což podporuje názor, že GSNOR a NOS společně přispívají k udržení NO/RSNOs homeostázy36. U savců je exprese GSNOR všudypřítomná a v mnoha tkáních je i značná distribuce a překrývání isoforem NOS. Společná funkce GSNOR, NOS a funkce dalších proteinů by tak mohla regulovat homeostázu S-nitrosothiolů14. All-trans retinol, účinná forma vitaminu A, je považován za další fyziologický substrát GSNOR (ADH3), přičemž oxidace retinolu byla studována na enzymu izolovaném z myších jater. In vitro oxidace all-trans retinolu byla velmi nízká ve srovnání s mnohem efektivnějšími enzymy jako ADH1 a ADH4. Významný pokles hladiny kyseliny all-trans retinové v séru u Adh3-deficientních myší potvrzuje podíl GSNOR na tvorbě kyseliny retinové in vivo. Díky všudypřítomné expresi GSNOR je možné, že existuje více fyziologicky významných substrátů s vysokými hodnotami KM (cit.20). GSNOR (ADH3) se jako jediná třída ADH enzymů vyskytuje v mozkové tkáni u lidí i hlodavců, u kterých je distribuce GSNOR podobná lidské. Na subcelulární úrovni je GSNOR lokalizována v cytoplasmě a v jádře několika typů buněk. Významná aktivita lidské GSNOR se vyskytuje v plicích, játrech, mozku a v ledvinách. Farmakologické studie prokázaly, že plíce novorozenců a dětí absorbují 205

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

více částic a reaktivních plynů. Většina enzymových systémů není u kojenců plně vyvinuta, avšak může v průběhu dětství převýšit hladinu enzymu u dospělých jedinců. Aktivita GSNOR je po narození velmi nízká, v průběhu dětství roste a dosahuje maxima, v dospělosti je opět snížená34. Porovnání sekvencí lidské GSNOR (ADH3) a ADH1 vykazuje až 83% identitu, avšak oblast promotoru GSNOR je u jednotlivých druhů daleko méně zachována oproti promotorové oblasti ADH1. To naznačuje, že její regulace u jednotlivých druhů může být poměrně odlišná. 5᾿ konec lidské ADH3 postrádá TATA box a obsahuje mnoho CG párů. Tyto vlastnosti jsou typické pro tzv. „housekeeping“ geny. Lidská ADH3 také obsahuje dvě startovací místa upstream od otevřeného čtecího rámce, což je charakteristické pro geny s regulační funkcí, jako jsou růstové faktory, transkripční faktory a geny zahrnuté v signální transdukci34.

nech, vykazuje podobné kinetické a molekulární vlastnosti jako savčí GSNOR40–42. Řada publikovaných výsledků potvrzuje významnou úlohu GSNOR v mechanismech rostlinné odpovědi na abiotické stresové faktory. V případě mechanického poranění dochází k represi genu AtGSNOR, naopak působením kyseliny salicylové, mediátoru biotického stresu, je gen aktivován. Podobně v rostlinách tabáku po ošetření kyselinou jasmonovou hladina i aktivita GSNOR poklesla a vzrostla v odpovědi na salicylát37. U mechanicky poraněných rostlin slunečnice také došlo k silnému snížení aktivity a exprese GSNOR43. Nedávná studie prokázala, že GSNOR je zapojena v mechanismu termotolerance rostlin a že aktivita GSNOR je nezbytná pro aklimatizaci rostlin A. thaliana na vysoké teploty42. Rostliny s defektním genem GSNOR (hot5 mutant) mají sníženou odolnost na stres zvýšenou teplotou v důsledku narušené homeostázy buněčných S-nitrosothiolů a signálních drah reaktivních forem dusíku. V případě chladového stresu u rostlin hrachu byl pozorován nárůst aktivity GSNOR společně s indukcí aktivity NOsynthasy, výrazným nárůstem hladiny celkových RSNOs a nitrovaných proteinů jako markerů nitrosativního stresu44. V této studii byly získány i prvotní poznatky o změnách aktivity GSNOR v reakci na světelné podmínky44. U papriky naopak aklimatizace na chladový stres vede k mírnému nárůstu aktivity GSNOR45. Mechanismus toxických účinků těžkých kovů jako kadmium zahrnuje narušení antioxidační obrany a indukce oxidační stresu, které se u rostlin projevují významnou inhibicí růstu a snížením transpirace, rychlosti fotosyntézy a obsahu chlorofylu. U listů Pisum sativum ošetřených

6. Význam a funkce S-nitrosoglutathionreduktasy v rostlinách GSNOR jako klíčový enzym katalyzující redukci GSNO a regulující intracelulární hladinu GSNO a S-nitrosothiolů byl v rostlinných systémech poprvé popsán u Arabidopsis thaliana. Gen AtGSNOR1 (původně označován jako adh5) se nachází v genomu v jedné kopii, odpovídající mRNA, má délku 1,4 kb a byl charakterizován po stránce genetické i biochemické v řadě publikací jako ADH třídy III a glutathion-dependentní formaldehyddehydrogenasa29,37–39. S-nitrosoglutathionreduktasová aktivita rostlinného enzymu, vyskytujícího se ve všech rostlinných orgá-

Obr. 3. Hypotetický model role GSNOR v obranné reakci rostlin v místě infekce patogenem a systémově získané rezistenci (SAR) ve vzdálených částech rostliny (upraveno podle cit.41)

206

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

50 M kadmiem bylo zaznamenáno snížení aktivity a exprese GSNOR o 30 % (cit.46), podobný trend byl zaznamenán u semenáčků A. thaliana rostoucích v přítomnosti 0,5 mM arseničnanu47. Oxid dusnatý a S-nitrosothioly jsou významné signální molekuly, které se účastní regulace imunitních odpovědí u rostlin i živočichů. Lze předpokládat, že změny hladiny RSNOs in vivo vlivem změn katabolismu GSNO kontrolovaného GSNOR povedou u rostlin k modulaci obranných reakcí na patogeny podobně jako u živočichů48. Ve studii Rusterucci a spol.41 bylo prokázáno, že transgenní rostliny A. thaliana se sníženou hladinou GSNOR pomocí antisense strategie vykazují zvýšenou bazální odolnost vůči biotrofnímu patogenu Peronospora parasitica. Snížené množství GSNOR korelovalo s vyššími vnitrobuněčnými hladinami RSNOs a konstitutivní aktivací genu PR-1 (pathogenesis-related 1). Naopak u rostlin s overexpresí GSNOR bylo pozorováno oslabení systémově získané rezistence (SAR). Popsaná lokalizace GSNOR ve floému by mohla souviset s regulací přenosu mobilního signálu systémové odpovědi cévním systémem. Na základě získaných experimentálních dat byl navržen hypotetický model, ve kterém jsou NO a GSNO předpokládanými pozitivními regulátory rezistence rostlin, hypersenzitivní odpovědi a aktivace obranných genů, a kde imunita rostlin je zvyšována snížením hladiny GSNOR se současným zvyšováním intracelulárních hladin RSNOs. Z obr. 3 je zřejmé, že rozpoznání patogenů vede k zvýšené produkci NO, reaktivních forem kyslíku (H2O2, O2–) a rostlinného hormonu kyseliny salicylové (SA), které působí synergicky na spuštění hypersenzitivní odpovědi (HR) a dalších obranných odpovědí na úrovni genové exprese. Aktivita GSNOR je klíčovým regulátorem intracelulární hladiny GSNO a S-nitrosothiolů – snížením aktivity GSNOR dojde ke zvýšení intracelulární hladiny S-nitrosothiolů a tím k posílení rostlinné imunity na lokální i systémové úrovni. Jiné studie však vedou k opačným závěrům, kde snížení aktivity GSNOR a následné zvýšení hladiny RSNOs vedou ke snížení bazální i nehostitelské rezistence, jako v případě rostlin A. thaliana infikovaných bakterií Pseudomonas syringae49 nebo slunečnice Helianthus annuus L. rezistentní k patogenní houbě Plasmopara halstedii50. Detailní poznání úlohy GSNOR v rostlinné odpovědi na infekci patogenem si stále vyžaduje další zkoumání48,51.

GSNOR ve fyziologickém vývoji rostlin a v obranných reakcích rostlin na řadu abiotických a biotických stresových stimulů. Tato práce vznikla díky finanční podpoře grantu MŠMT ČR LH11013. Seznam zkratek ADH3 cGMP GSH GSNO GSNOR HMGSH HR NADH NO NOS RSNOs SA SAR

alkoholdehydrogenasa třídy III cyklický guanosinmonofosfát glutathion S-nitrosoglutathion S-nitrosoglutathionreduktasa S-(hydroxymethyl)glutathion hypersenzitivní odpověď nikotinamiddinukleotidfosfát oxid dusnatý synthasa oxidu dusnatého S-nitrosothioly kyselina salicylová systémově získaná rezistence

LITERATURA 1. Luiking Y. C., Engelen M. P., Deutz N. E.: Curr. Opin. Clin. Nutr. 13, 97 (2010). 2. Piterková J., Petřivalský M., Luhová L.: Chem. Listy 102, 410 (2008). 3. Šírová J., Sedlářová M., Piterková J., Luhová L., Petřivalský M.: Plant Sci. 181, 560 (2011). 4. Weitzberg E., Hezel M., Lundberg J. O.: Anesthesiology 113, 1460 (2010). 5. Kelm M.: Biochim. Biophys. Acta 1411, 273 (1999). 6. Gaston B.: Biochim. Biophys. Acta 1411, 123 (1999). 7. Handy D. E., Loscalzo J.: Arterioscl. Throm. Vas. 26, 1207 (2006). 8. Martínez-Ruiz A., Lamas S.: Cardiovasc. Res. 62, 43 (2004). 9. Derakhshan B., Hao G., Gross S. S.: Cardiovasc. Res. 75, 210 (2007). 10. Marino S. M., Gladyshev V. N.: J. Mol. Biol. 395, 844 (2010). 11. Hess D. T., Stamler J. S.: J. Biol. Chem. 287, 4395 (2012). 12. Lane P., Hao G., Gross S. S.: Sci. STKE 86, re1 (2001). 13. Seth D., Stamler J. S.: Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 129 (2011). 14. Foster M. W., Hess D. T., Stamler J. S.: Trends Mol. Med. 15, 391 (2009). 15. Benhar M., Forrester M. T., Stamler J. S.: Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 721 (2009). 16. Koivusalo M., Baumann M., Uotila L.: FEBS Lett. 257, 105 (1989). 17. Jensen D. E., Belka G. K., Du Bois G. C.: Biochem. J. 331, 659 (1998). 18. Liu L., Hausladen A., Zeng M., Que L., Heitman J., Stamler J. S.: Nature 410, 490 (2001).

7. Závěr Aktuální poznatky prokazují klíčovou úlohu enzymu GSNOR v regulaci vnitrobuněčné hladiny GSNO a proteinových S-nitrosothiolů. GSNO je tak prostřednictvím regulace hladiny reaktivních metabolitů NO zapojen v širokém spektru pochodů buněčné signalizace a odpovědí organismů na různé typy stresových faktorů. Na detailní poznání struktury a molekulárních vlastností enzymu navazují současné studie odhalující stěžejní úlohu GSNOR v řadě fyziologických i patologický procesů u živočichů. Obdobně jsou v současnosti rozšiřovány znalosti o úloze 207

Chem. Listy 107, 202208 (2013)

Referát

19. Staab C. A., Alander J., Brandt M., Lengqvist J., Morgenstern R., Grafström R. C., Höög J. O.: Biochem. J. 413, 493 (2008). 20. Staab C., Hellgren M., Höög J. O.: Cell. Mol. Life Sci. 65, 3950 (2008). 21. Staab C. A., Hellgren M., Grafström R. C., Höög J. O.: Chem.-Biol. Interact. 180, 113 (2009). 22. Staab C. A., Alander J., Morgenstern R., Grafström R. C., Höög J. O. : Chem.-Biol. Interact. 178, 29 (2009). 23. Hanson A. D., Gage D. A., Shachar-Hill Y.: Trends Plant Sci. 5, 206 (2000). 24. Espunya M. C., Díaz M., Moreno-Romero J., Martínez M. C.: Plant Cell Environ. 29, 1002 (2006). 25. Engeland K., Höög J. O., Holmquist B., Estonius M., Jörnvall H., Vallee B. L.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 2491 (1993). 26. Sanghani P. C., Robinson H., Bennett-Lovsey R., Hurley T. D., Bosron W. F.: Chem.-Biol. Interact. 143144, 195 (2003). 27. Sanghani P. C., Robinson H., Bosron W. F., Hurley T. D.: Biochemistry 41, 10778 (2002). 28. Sanghani P. C., Bosron W. F., Hurley T. D.: Biochemistry 41, 15189 (2003). 29. Achkor H., Díaz M., Fernández M. R., Biosca J. A., Parés X., Martínez M. C.: Plant Physiol. 132, 2248 (2003). 30. Hedberg J. J., Griffiths W. J., Nilsson S. J. F., Höög J. O. : Eur. J. Biochem. 270, 1249 (2003). 31. Sanghani P. C., Stone C. L., Ray B. D., Pindel E. V., Hurley T. D., Bosron W. F.: Biochemistry 39, 10720 (2000). 32. Green L. S., Chun L. E., Patton A. K., Sun X., Rosenthal G. J., Richards J. P.: Biochemistry 51, 2157 (2012). 33. Gaston B., Singel D., Doctor A., Stamler J. S.: Am. J. Respir. Crit. Care Med. 173, 1186 (2006). 34. Thompson C. M., Sonawane B., Grafström R. C.: Drug Metab. Dispos. 37, 1565 (2009). 35. Cao Y., Liang S., Zheng Y., Liu D., Xu D., Yang X.: Environ. Toxic. 26, 294 (2009). 36. Godoy L., Gonzalez-Duarte R., Albalat R.: Int. J. Biol. Sci. 2, 117 (2006). 37. Díaz M., Achkor H., Titarenko E., Martinez M. C.: FEBS Lett. 543, 136 (2003). 38. Sakamoto A., Ueda M., Morikawa H.: FEBS Lett. 515, 20 (2002). 39. Martínez M. C., Achkor H., Persson B., Fernández M. R., Shafqat J., Farrés J., Jörnvall H., Parés X.: Eur. J. Biochem. 241, 849 (1996). 40. Feechan A., Kwon E., Yun B. W., Wang Y., Pallas J. A., Loake G. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 8054 (2005). 41. Rusterucci C., Espunya M. C., Diaz M., Chabannes M., Martinez M. C.: Plant Physiol. 143, 1282 (2007). 42. Lee U., Wie C., Fernandez B. O., Feelisch M., Vierling E.: Plant Cell 20, 786 (2008). 43. Chaki M., Valderrama R., Fernández-Ocaña A. M., Carreras A., Gómez-Rodríguez M. V., Pedrajas J. R.,

44.

45. 46.

47. 48. 49. 50.

51.

Begara-Morales J. C., Sánchez-Calvo B., Luque F., Leterrier M., Corpas F. J., Barroso J. B.: J. Exp. Bot. 62, 1803 (2011). Corpas F. J., Chaki M., Fernández-Ocaña A., Valderrama R., Palma J. M., Carreras A., Begara-Morales J. C., Airaki M., del Río L. A., Barroso J. B.: Plant Cell Physiol. 49, 1711 (2008). Airaki M., Leterrier M., Mateos R. M., Valderrama R., Chaki M., Barroso J. B., Del Río L. A., Palma J. M., Corpas F. J.: Plant Cell Environ. 35, 281 (2012). Barroso J. B., Corpas F. J., Carreras A., RodriguezSerrano M., Esteban F. J., Fernández-Ocaña A., Chaki M., Romero-Puertas M. C., Valderrama R., Sandalio L. M., Del Río L. A.: J. Exp. Bot. 57, 1785 (2006). Leterrier M., Airaki M., Palma J. M., Chaki M., Barroso J. B., Corpas F. J.: Environ. Pollut. 166, 136 (2012). Malik S. I., Hussain A., Yun B. W., Spoel S. H., Loake G. J.: Plant Sci. 181, 540 (2011). Feechan A., Kwon E., Yun B. W., Wang Y., Pallas J. A., Loake G. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 8054 (2005). Chaki M., Fernández-Ocaña A. M., Valderrama R., Carreras A., Esteban F. J., Luque F., GómezRodríguez M. V., Begara-Morales J. C., Corpas F. J., Barroso J. B.: Plant Cell Physiol. 50, 265 (2009). Leterrier M., Chaki M., Airaki M., Valderrama R., Palma J. M., Barroso J. B., Corpas F. J.: Plant Signaling Behav. 6, 789 (2011).

L. Kubienová, T. Tichá, J. Jahnová, L. Luhová, and M. Petřivalský (Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc): S-Nitrosoglutathione Reductase: The Key Enzyme Regulator of S-nitrosylation S-nitrosylation has recently emerged as an ubiquitous posttranslational protein modification. S-nitrosothiols, which can serve as stable and mobile reservoirs of nitric oxide, show convergence of signalling pathways of reactive nitrogen and oxygen species. This review summarizes the current knowledge of S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR), a key enzyme involved in the regulation of intracellular levels of S-nitrosoglutathione and protein S-nitrosothiols. The biological functions of GSNOR are based on its ability to decompose GSNO with concomitant production of oxidized glutathione. Altered expression and levels of GSNOR have been found associated with important pathological processes. Similarly, GSNOR is involved in signalling mechanisms and defence responses of plants to various abiotic and biotic stress stimuli. Despite recent considerable advances in S-nitrosothiol research, our understanding of signalling pathways and GSNORmediated catabolism of GSNO in vivo are still limited. Current research involves studies of the role of GSNOR in human pathophysiological processes and in plant response to stress conditions. 208