VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta strojního inženýrství Ústav fyzikálního inženýrství

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta strojního inženýrství Ústav fyzikálního inženýrství

doc. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D.

KOHERENCÍ ŘÍZENÁ HOLOGRAFICKÁ MIKROSKOPIE COHERENCE-CONTROLLED HOLOGRAPHIC MICROSCOPY

TEZE PŘEDNÁŠKY K PROFESORSKÉMU JMENOVACÍMU ŘÍZENÍ V OBORU APLIKOVANÁ FYZIKA

BRNO 2011

KLÍČOVÁ SLOVA digitální holografická mikroskopie, kvantitativní fázový kontrast, koherence světla, optický řez, koherenční brána, biologie živé buňky

KEYWORDS digital holographic microscopy, quantitative phase contrast, coherence of light, optical section, coherence gate, biology of living cells

© Radim Chmelík, 2011 ISBN 978-80-214-4336-5 ISSN 1213-418X

OBSAH  PŘEDSTAVENÍ AUTORA ............................................................................................................... 4  1  ÚVOD ........................................................................................................................................... 6  2  HOLOGRAFICKÁ MIKROSKOPIE ........................................................................................... 6  3  NEKOHERENTNÍ HOLOGRAFICKÁ MIKROSKOPIE ........................................................... 8  3.1  Emmett Leith a nekoherentní holografie ............................................................................. 8  3.2  Paralelně zobrazující konfokální mikroskop........................................................................ 9  3.2.1  Konstrukční řešení mikroskopu ................................................................................ 9  3.2.2  Měření povrchů ...................................................................................................... 10  3.3  Koherencí řízená holografická mikroskopie ...................................................................... 11  3.3.1  Konstrukce mikroskopu .......................................................................................... 11  3.3.2  Biologické aplikace a metoda dynamických fázových diferencí ............................ 12  3.3.3  Zobrazení balistickým světlem v difuzním prostředí .............................................. 13  3.3.4  Zobrazení nebalistickým světlem v difuzním prostředí .......................................... 14  3.3.5  Další vývoj mikroskopu .......................................................................................... 14  4  TEORIE ZOBRAZENÍ ............................................................................................................... 15  5  EXPERIMENTÁLNÍ BIOFOTONIKA ...................................................................................... 19  6  SOUHRN .................................................................................................................................... 20  PODĚKOVÁNÍ ............................................................................................................................... 21  LITERATURA................................................................................................................................. 21  ABSTRACT ..................................................................................................................................... 23 

3

PŘEDST TAVENÍ AUTORA A A Radim m Chmelík je docentem m na Ústav vu fyzikálního inženýrsství FSI VU UT v Brně. Narodil se 31. leedna 1966 v Kyjově, av však většinuu života stráávil v Brně, kde v roce 1984 ukončil maturitou m sttudium na gymnáziu na tř. Kptt. Jaroše. Následující N studiuum oboru Fyzika F pevnných látek na n Přírodovvědecké fakkultě MU Brno B (dříve UJEP P) absolvovval v roce 1989 obhajo obou diplom mové práce „Dynamick ká difrakce rtg. záření z na kryystalech s teenkými vrsttvami“ a obdržel titul R RNDr. Poo základní vojenské službě nasstoupil jakoo odborný pracovník na Ústav přístrrojové technniky AV ČR R v Brně, kde k se v lettech 1990-11993 věnov val difrakci světla, vlnnové opticee a hologrrafii. Jeho doktorská práce obháájená v rocce 1997 po od názvem „Zobrazovvání difraktiivní čočkouu“ byla takéé proto zaměěřena na diffraktivní optické prvky y. Na Ústav fyzikálníhho inženýrsttví FSI VU UT v Brně nastoupil n v roce r 1993. Habilitovall se v roce 2002 prací „Korelačnní mikroskoopie, alternaativní metoda vícekanálového koonfokálního zobrazení““. Od roku 2003 je proděkanem p m pro studdijní záležittosti, od ro oku 2010 také vedouucím Odbo oru přesné mechanikyy a optiky ÚFI. Ú Po násstupu na FS SI v roce 1993 1 se zaačal věnovaat také probblematice ssvětelné miikroskopie, trojrozměrrného zobraazování a konfokální k mikroskop pie, která postupem čaasu v jeho odborných zájmech získala z domiinantní posttavení. Od druhé d polov viny 90. let se společněě s doc. Ing g. Zdeňkem Harnou, CSc., C a pozzději Ing. Pavlem P Koolmanem, Ph h.D., teoretticky i expperimentáln ně zabýval aplikací principů p nekkoherentní holografie v mikrosko opii. Výsleddkem je obeecný teorettický popis zobrazení holografickkými mikrooskopy a taaké konstruk kční realizaace laboratoorních vzork ků světově unikátníchh holograficckých mikrroskopů v mimoosovém m m uspořádáání, které zzobrazují s osvětlením o libovolné koherence. Mikroskoppy byly úspěěšně aplikov vány v bioloogii při pozzorování živ vých buněk a při výzkkumu aktivitty rakovinnýých buněk. Vývoj jedné z varriant mikrooskopu pokrračuje ve spolupráci s s firmou Tescan, a.s. Technické řešení mikkroskopu jee patentově chráněno v ČR a pattentové přihhlášky bylyy podány také v USA, Japonsku, Číně, zem mích evropsské patentoové úmluvy y a zemích eurasijskéhho patentu. Autorova výzkumnáá skupina see v současnnosti zaměřuuje na teoreetické a expperimentálníí studium pokročilých p metod svvětelné miikroskopie využívajíccích nekoh herentní hoolografie. Biologickéé aplikace vyvíjenýchh mikroskoopií jsou zkkoumány v nově n zřízen né laboratořři Experimeentální biofo fotoniky na ÚFI FSI. mci 4 projeektů GAČR R, projektu F FRVŠ a vý ýzkumného Odbornné aktivity autora probbíhaly v rám záměru MŠMT. M Získkané výsleddky byly zvveřejněny ve v 13 článccích v mezinárodních časopisech s impaktníím faktorem m, ve 12 člláncích v oddborných reecenzovanýých časopiseech a prostřednictvím 34 příspěvvků v konfe ferenčních sbornících s (z toho by yly 4 přednnášky zvanné – 1 na světovém sympoziu a 1 na mezzinárodní konferenci). k Tyto publikace byly 23krát citoovány (bez autocitací) podle Scieence Citatioon Index (Thhomson Reuuters Web of o Science). Současný hh-index auto ora je 4. Pedagoogické činnoosti se autoor věnuje odd svého přícchodu na faakultu. Výuuka v základ dním kurzu fyziky na FSI, tj. v kurzech k „Fyyzika I“, kteerou autor nyní n garantuuje, a „Fyzika II“, bylaa postupně doplněna přednáškov p vou činnostíí v předmětuu „Obecná fyzika II – Elektřina a magnetism mus“. Autor zavedl výýuku nových předmětůů „Experim mentální bio ofotonika“, „Mikroskoppie a spekttroskopie“, „Světelná mikroskoppie“ (pro doktorské d s studium) a „Pokročiláá světelná m mikroskopie – teorie zobrazení““ (pro dokttorské studiium). Autorr také vedee přednáškyy a cvičení v předmětu u „Brýlová optika I a II“ v oboruu „Optometrrie“ vyučovvaném na LF F MU v Brnně. Autor bběhem svého o působení na FSI vedl k úspěšnné obhajoběě 3 bakalářské práce a 19 diplomoových prací. Disertačníí práci pod jeho vedeením úspěššně obhájilii 4 doktorandi v obo oru „Fyzikáální a mateeriálové inžženýrství“; v současnéé době je škkolitelem 9 doktorandůů v tomto ob boru.

4

Mezi další aktivity autora patří členství ve dvou oborových radách doktorských studijních programů na Přírodovědecké fakultě UP Olomouc („Aplikovaná fyzika“ od roku 2003, „Optika a optoelektronika“ od roku 2007) a členství v Radě ÚPT AV ČR (od roku 2007). Angažuje se také při popularizaci technických a přírodovědných oborů, a to zejména od roku 2009, kdy byl jmenován hlavním odborným garantem projektu „Podpora technických a přírodovědných oborů“ (individuální projekt národní s rozpočtem 200 mil. Kč řešený MŠMT v rámci operačního programu „Vzdělávání pro konkurenceschopnost“).

5

1

ÚVOD

Aplikace mimoosové holografie ve světelné mikroskopii byla experimentálně ověřena již v 60. letech minulého století (R. F. Van Lighten, H. Osterberg, 1966). Zaznamenaný hologram však bylo nutno vyvolávat mokrým fotografickým procesem a metoda proto nebyla vhodná pro většinu praktických pozorování. Úplný záznam1 koherentní světelné vlny začal být ve světelné mikroskopii využíván až poté, co se rozšířila praktická dostupnost elektronického záznamu hologramu a možnost okamžitě jej počítačově zpracovávat. Výstup počítačového zpracování navíc předčí klasickou holografii. Umožňuje nejen trojrozměrně rekonstruovat intenzitu zaznamenané světelné vlny, ale zejména vypočítat její fázi. Digitální holografická mikroskopie se tím stává velmi vhodnou technikou pro zobrazování fázových objektů, například živých buněk, které ovlivňují podstatně více fázi světla, než jeho intenzitu. Z vypočteného rozložení fáze lze navíc s vysokou přesností určit rozložení některých parametrů vzorku, například výšky povrchu nebo hustoty buněčné hmoty. Tím se digitální holografická mikroskopie odlišuje od klasického Zernikova fázového kontrastu, který změny fáze pouze zviditelňuje. Digitální holografická mikroskopie proto nachází v posledním desetiletí nespočet aplikací hlavně v oblasti biologie živých buněk, neboť umožňuje jejich neinvazivní pozorování s kvantitativním kontrastem v přirozených podmínkách. Tato práce ukazuje, že možnosti holografického zobrazení ve světelné mikroskopii nejsou zdaleka vyčerpány, ale lze je dále rozšiřovat využitím koherenčních vlastností světla.

2

HOLOGRAFICKÁ MIKROSKOPIE

Snaha docílit vyšších zvětšení prozařovací elektronové mikroskopie narážela v polovině minulého století na problém otvorové vady magnetických čoček, která limitovala jejich rozlišovací schopnost. Původní myšlenkou objevitele principu holografie, Dennise Gabora (viz obr. 1), v roce 1948 bylo docílit vyššího zvětšení jiným způsobem. Hologram zaznamenaný pomocí elektronového svazku měl být rekonstruován viditelným světlem, což by přineslo zvětšení obrazu v poměru vlnových délek světla a elektronového svazku – tedy asi o pět řádů. Bylo možno takto postupovat, protože hologram nepředstavuje pouhý záznam intenzity záření jako fotografie, ale záznam interferenčního obrazce, který uchovává také informaci o fázi vlny. Vyvolaný hologram totiž propouští rekonstrukční Obr. 1: Dennis Gabor, objevitel principu záření pouze v místech, která správně odpovídají fázi původního svazku. holografie. Tím je rekonstruována takřka přesně původní vlna [1]. Experimentální ověření navrženého principu M. E. Hainem a T. Mulveyem v roce 1952 [2] způsobilo zklamání: rekonstrukce hologramu odlišnou vlnovou délkou způsobuje aberace zobrazení limitující rozlišovací schopnost na asi 1 nm, což je hodnota dosažitelná elektronovou mikroskopií i bez využití holografie. Rekonstrukce vlnoplochy, jak se také holografický princip zobrazení nazýval, však postupně nacházela další možnosti použití. Uplatnila se při zobrazování vlněním, pro něž neexistovala vhodná optika (rtg. záření), a umožnila trojrozměrný záznam rychlých dějů, například proudění částic, který pak bylo možno rekonstruovat z jediného hologramu. Přelomem ve vývoji holografie byl objev mimoosové (offaxis) holografie (E. N. Leith, J. Upatnieks, 1965, [3]), která umožnila separovat vícenásobné obrazy vznikající v původním Gaborově uspořádání, spojený s objevem laseru, jehož koherentní světlo umožnilo provádět kvalitní holografický záznam. Brzy nato vzniká i první významná aplikace mimoosové holografie ve světelné mikroskopii, tzv. hybridní holografický mikroskop [4]. Jeho optické schéma (viz obr. 2) odpovídalo klasickému mimoosovému holografickému uspořádání. Do předmětové větve Machova-Zehnderova 1

Řecky όλος (holos) znamená celý, γράφω (grafo) psát.

6

interferometru byla navíc vložena mikroskopová optická soustava, která zobrazovala pozorovaný vzorek do roviny záznamu hologramu na fotografickou desku. Zobrazení získané optickou rekonstrukcí mělo všechny rysy holografie: z jediného hologramu bylo možno opticky rekonstruovat zobrazení vzorku, ale také rozsáhlé oblasti nad i pod rovinou ostrosti. Technika se v této době neujala zejména kvůli komplikacím spojeným se záznamem hologramu na fotografickou desku. Použití laserového světla pro záznam hologramu navíc zatěžuje zobrazení koherenční zrnitostí. Tento efekt je zvláště výrazný ve světelné mikroskopii, neboť zobrazovací svazek prochází velkým počtem optických ploch a dalšími oblastmi s optickými nehomogenitami, které koherenční zrnitost vytvářejí. V posledním desetiletí se na trhu objevily holografické mikroskopy, jejichž uspořádání je obdobné, jako na obrázku 2, avšak detekce a zpracování hologramu je elektronické, pomocí CCD kamery a počítače. Technika se proto nazývá digitální holografická mikroskopie (DHM). Kombinace mimoosového holografického uspořádání s elektronickým záznamem umožňuje holografické Obr. 2: Optické schéma digitálního holografického mikroskopu podle zobrazování v reálném čase a použití matematických procedur [4]. Sp…vzorek, Obj…objektiv, pro další zpracování záznamu, jako je například numerické Cond…kondenzor, BS…dělič přeostřování [5] nebo dekonvoluce obrazové komplexní svazku, M…zrcadlo. amplitudy [6]. Výstupem počítačového zpracování digitálního hologramu je komplexní amplituda předmětové vlny , , kterou lze zapsat v polárním tvaru | |exp . Z komplexní amplitudy , lze pak vypočítat fázový posuv , světelné vlny ve všech bodech , obrazové roviny. Takto získaný obrazový signál je proto kvantitativním fázovým kontrastem (viz např. [5]), na rozdíl od Zernikova fázového kontrastu, jehož výstupem nejsou číselné hodnoty obrazové fáze. Z hlediska aplikací moderní holografické mikroskopie je podstatné, že při pozorování odrazných vzorků je fázový posuv světla úměrný výšce , povrchu vzorku v daném bodě ,

4

,

/ ,

(1)

kde označuje vlnovou délku světla. Rozložení výšky povrchu může být z hodnot obrazové fáze vypočteno s přesností až desetin nanometrů (viz např. [7]), pod podmínkou, že je vhodným způsobem respektována geometrie vzorku [8]. Při použití rychlé kamery a počítače může být rychlost snímání dostatečná pro dynamická měření pohybů MEMS či MOEMS [9]. Ještě rozsáhlejší aplikační oblastí DHM je biologie živých buněk (viz např. [10], [11], [12]). Fázový posuv světelné vlny je v tomto případě způsoben jejím průchodem pozorovaným objektem a závisí na součinu jeho lokální tloušťky , a indexu lomu , . Pro pozorování živých buněk byl odvozen [13] zásadní vztah úměrnosti fázového posuvu , světla plošné hustotě , suché hmoty buňky (tj. hustotě její hmoty tvořené zejména proteiny po hypotetickém odstranění vody z buňky) , , . (2) DHM tedy umožňuje zviditelnit rozložení suché hmoty buňky, a tím její velmi kontrastní zobrazení bez použití markerů, které jsou pro buňku obvykle toxické. Pomocí DHM může být buňka a její motilita pozorována v přirozených případně definovaným způsobem modifikovaných podmínkách po velmi dlouhou dobu (hodiny až dny). Díky kvantitativní povaze obrazové fáze lze suchou hmotu buňky nejen pozorovat, ale také měřit a z naměřených hodnot provádět další výpočty charakteristik, které popisují časový vývoj stavu pozorované buňky. Holografický

7

charakter zobrazení rovněž umožňuje výsledné zobrazení numericky přeostřovat, a tím například trasovat pohyb buňky v trojrozměrné oblasti [14]. Kromě základních sestav pro DHM vznikají pokročilé laboratorní sestavy pro multimodální mikroskopii kombinující DHM s fluorescenční mikroskopií [15], s optickou mikromanipulací [16], případně umožňující provádět holografický záznam druhé harmonické vlny generované laserovými pulsy ve vzorku [17]. Klasické digitální holografické mikroskopy v dnešní době nabízí několik firem na světě ve dvou variantách. Varianta pro odražené světlo je určena k vysoce přesným měřením povrchů; varianta pro procházející světlo je uzpůsobena pro pozorování buněk. Nevýhodou všech těchto mikroskopů je optická soustava pro mimoosovou holografii využívající klasických interferometrů. Tyto interferometry pracují s koherentním osvětlením. Koherentní osvětlení však narušuje mikroskopové zobrazení koherenčním šumem a nežádoucími interferencemi, které snižují kvalitu výsledného zobrazení. Navíc je vlivem vyšší koherence světla zhoršena příčná rozlišovací schopnost mikroskopu oproti klasickým světelným mikroskopům s týmiž objektivy (viz kapitolu 4). Z těchto důvodů je vhodné použít v DHM osvětlení se sníženou koherencí (viz např. [14], [18], [19], [20]). Nevýhodou redukce prostorové koherence je ztenčení trojrozměrné oblasti, v níž je možné numerické přeostření [18]. Zásadní výhodou je však účinné potlačení vlivu rozptylujícího (opticky difuzního) prostředí obklopujícího pozorovaný objekt (kolagen, gely). Redukce časové koherence tento efekt dále zesiluje [14], [20]. Hloubková diskriminace zobrazení dosažená pomocí nízké koherence (koherenční brána) může být účinnější než při zobrazení konfokálním mikroskopem [21]. Důvodem je kombinace několika diskriminačních mechanismů, optické zesílení detekovaného signálu vůči šumu a dodatečná ztráta koherence světla rozptýleného v difuzním prostředí [22]. Žádoucímu omezení koherence osvětlení brání především optická soustava klasického DHM. Proto je omezení koherence obvykle kompromisní – takové, aby částečně redukovalo koherenční artefakty, ale přitom ještě poskytovalo přijatelný kontrast interferenčních proužků v celém pozorovaném poli. Přijatelná míra omezení koherence závisí na konstrukčních detailech použitého interferometru (viz např. [20]).

difrakční mřížka

čočka

ohnisková rovina

obrazová rovina

Obr. 3: Příklad achromatického interferometru pro nekoherentní holografii. Difrakční mřížka v předmětové rovině čočky dělí vstupní světelný svazek do dvou řádů, které jsou separovány v ohniskové rovině a interferují v obrazové rovině. Vznikající interferenční obrazec je současně zobrazením difrakční mřížky čočkou.

3

NEKOHERENTNÍ HOLOGRAFICKÁ MIKROSKOPIE

3.1

EMMETT LEITH A NEKOHERENTNÍ HOLOGRAFIE

Nekompromisním řešením popsaného problému je konstruovat holografický mikroskop s využitím nekoherentní holografie, jejíž princip navrhli Emmett Leith a Juris Upatnieks v roce 1967 [23]. K vytvoření interferenční struktury hologramu v nekoherentním světle se využívá tzv. achromatického interferometru s difrakční mřížkou jako děličem svazku. Příklad achromatického

8

interferometru je znázorněn na obrázku 3. Interferenční obrazec je současně zobrazením difrakční mřížky čočkou, a proto jeho podoba nezávisí ani na směru, ani vlnové délce světla dopadajícího na mřížku. Interferometr je tedy achromatický a prostorově invariantní a hologram lze vytvářet se zcela časově i prostorově nekoherentním světlem. Po vložení mikroskopových zobrazovacích soustav do větví interferometru vznikne holografický mikroskop umožňující použít osvětlení s libovolně nízkou koherencí. Toho jsme využili při vývoji holografických mikroskopů na Ústavu fyzikálního inženýrství. 3.2

PARALELNĚ ZOBRAZUJÍCÍ KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP

3.2.1

Konstrukční řešení mikroskopu

Princip Leithovy nekoherentní holografie jsme poprvé uplatnili v roce 1998 při návrhu a konstrukci DHM pro odražené světlo [24], jehož optické schéma a výsledný vzhled je znázorněn na obrázku 4. Motivací ke stavbě mikroskopu byla snaha docílit efektu optických řezů známých z konfokální mikroskopie nerastrovací metodou [25]. Větve interferometru obsahují opticky shodné optické soustavy (objektivy Obj), které zobrazují vzorek a referenční zrcadlo do výstupní roviny (OP) zobrazené na CCD kameru, v níž vzniká kontrastní obrazový hologram vzorku i při použití zdroje (S) nekoherentního světla. Technické řešení mikroskopu bylo ochráněno jako užitný vzor [26]. Elektronicky zaznamenávaný hologram je průběžně rekonstruován v připojeném počítači fourierovským zpracováním spektra prostorových frekvencí [27], jehož výsledkem je | | exp komplexní amplituda zobrazení vzorku. Kvantitativní fázi lze převádět na distribuci výšky povrchu , s nanometrovou přesností. a)

b)

Obr. 4: Paralelně zobrazující konfokální mikroskop. Na obrázku a) je optické schéma mikroskopu: S…plošný zdroj, D…difrakční mřížka, M…zrcadla, L1,2…čočky, Obj…objektivy, BS…děliče svazku, RM…referenční zrcadlo, Sp…vzorek, OP…výstupní rovina. Na obrázku b) je fotografie konstrukční realizace mikroskopu.

Při použití prostorově nekoherentního světla (plošného zdroje) vznikají vlivem koherenční brány optické řezy vzorkem (viz obr. 5). Znamená to, že intenzita zobrazení |o| povrchu vzorku se rychle snižuje se vzdáleností povrchu od předmětové roviny objektivu. Teoretický výpočet i experiment [28] prokazují, že tato závislost odpovídá efektu optických řezů v konfokálním mikroskopu, který jej však dociluje časově náročnějším rastrováním vzorku. Proto byl mikroskop v době vzniku, kdy ještě nebylo běžné užívat adjektiva „holografický“, označen jako „paralelně zobrazující konfokální mikroskop“ („parallel-mode confocal microscope“, PMCM), tedy jako mikroskop, který konfokálního efektu dociluje bez rastrovací soustavy pro všechny body pozorovaného pole současně. Současně je pozorována kvantitativní fáze. Při omezení prostorové

9

i časové koherence, tj. při rozšíření spektrálního pásma osvětlení, je optický řez významně ztenčen [28], a to přibližně v poměru 1 cos / cos , kde je vlnočet jsou mezní vlnočty spektrálního pásma širokopásmového monochromatického osvětlení, , osvětlení a je úhlová apertura objektivu [29]. 3.2.2

Měření povrchů

Paralelně zobrazující konfokální mikroskop (PMCM) vytváří dvě výstupní obrazová pole: hloubkově diskriminovanou intenzitu a kvantitativní fázi. Oba obrazové výstupy lze použít k měření topografie povrchu vzorku. Fázi lze přepočítat na výšku povrchu s nanometrovou a)

b)

10 μm

Obr. 5: Optické řezy vytvářené PMCM při pozorování povrchu křemíkového vzorku s motivem vyleptaným do hloubky 7 μm. Mikroskop byl zaostřen a) na povrch vzorku, b) na dno leptané oblasti. Oblast, která se nachází v blízkosti předmětové roviny, se jeví jako osvětlená, zatímco rozostřené oblasti jsou temné.

přesností. Přitom je třeba brát v úvahu deformaci průběhu fáze vlivem omezené příčné rozlišovací schopností mikroskopu [8]. Protože je fáze z komplexní amplitudy vypočítávána modulo 2 , obsahují fázové obrazy oblastí povrchu vzorku oddělených nulovou intenzitou (viz obr. 6 b) neznámé fázové posuvy 2 , kde je celé číslo, které může být jiné pro každou oblast. a)

b)

Obr. 6: Měření povrchu vzorku pomocí PMCM [29]. Povrchový profil vzorku se stupněm o výšce 60 nm na obrázku a) byl vypočten z jediného fázového zobrazení. Směrodatná odchylka měření daná zejména výstřelovým šumem je na většině pozorované oblasti nižší než 1 nm. Povrchový profil vzorku s motivem vyleptaným do hloubky 7 µm na obrázku b) byl změřen kombinovanou metodou pomocí dvou fázových zobrazení a hloubkově diskriminované intenzity. Směrodatná odchylka měření činí v tomto případě asi 25 nm. Čísla v závorce na výškové škále odpovídají nevyleptané oblasti povrchu, tedy čtyřem vnějším oblastem na obrázku b).

Maximální hodnota hloubkově diskriminované intenzity indikuje, že bod povrchu vzorku leží právě v předmětové rovině. Proto může být série intenzitních zobrazení rovněž využito pro stanovení výškové polohy bodů povrchu. Přesnost měření je asi o dva řády nižší než při využití obrazové fáze. Toto měření však neobsahuje žádnou nejednoznačnost a může být provedeno

10

v rozsahu, který je omezen pouze mechanicky, pohybem stolku preparátu. Lze jej proto kombinovat s fázovým měřením a využít k určení neznámého celého čísla , a tím k odstranění nejistoty v přesném fázovém měření. Popsaná kombinovaná měřicí metoda byla ověřena experimentálně [29] a později zdokonalena zavedením fázového odměřování osového posuvu vzorku [30]. Příklady měření povrchů popsanými metodami jsou na obr. 6. 3.3 3.3.1

KOHERENCÍ ŘÍZENÁ HOLOGRAFICKÁ MIKROSKOPIE Konstrukce mikroskopu

Poté, co byl koncept nekoherentní holografie aplikován a ověřen holografickým mikroskopem uspořádaným pro světlo odražené od vzorku, následovala jeho aplikace rovněž v uspořádání pro detekci světla procházejícího vzorkem [31]. Toto uspořádání je vhodné při pozorování biologických vzorků. Optické schéma (viz obr. 7) je obdobné mikroskopu pro odražené světlo, navíc doplněné osvětlovací soustavou. Z důvodu optické shody osvětlovací a a) b) zobrazovací části každé větve interferometru byly použity shodné mikroskopové objektivy na místě kondenzorů. Technické řešení mikroskopu bylo ochráněno jako užitný vzor [32]. Experiment prokázal vznik kontrastního hologramu s časově i prostorově nekoherentním zdrojem světla. Jeho počítačovou rekonstrukcí jsme získali zobrazení s kvantitativním fázovým kontrastem. Protože holografický záznam Obr.7: Koherencí řízený holografický v tomto mikroskopu je možný mikroskop. Na obrázku a) je optické schéma mikroskopu: S…zdroj, s libovolnou koherencí světla, M…zrcadlo, D…difrakční mřížka, stává se koherence volným Obj…objektiv, Sp…vzorek, R…refeparametrem, který ovlivňuje renční rovina, OP…výstupní rovina. Na celkový zobrazovací proces. Při obrázku b) je fotografie konstrukčního osvětlení s vysokou koherencí provedení mikroskopu. zobrazuje mikroskop v režimu, který odpovídá klasickému digitálnímu holografickému mikroskopu. V tomto režimu lze numericky přeostřovat v širokém rozsahu hodnot osové souřadnice, a tím rekonstruovat trojrozměrnou scénu z jednoho digitálního hologramu. Snížení koherence osvětlení odstraňuje z obrazu koherenční šum a artefakty, takže zobrazení dosahuje kvality a rozlišovací schopnosti obvyklé v klasické světelné mikroskopii. Kvantitativní fázový kontrast je pozorovatelný bez ohledu na koherenci světla. Podstatné snížení koherence osvětlení převádí mikroskop do zobrazovacího režimu, který se podobá konfokálnímu. Začíná se projevovat koherenční brána, která potlačuje světlo rozptýlené v médiu obklopujícím objekt a pouze balistické světlo nerozptýlené v médiu může vytvářet zobrazení. V konfiguraci mikroskopu pro odražené světlo (viz předchozí kapitolu) tato situace odpovídá vzniku optických řezů odrazným vzorkem. Tuto vlastnost mikroskopu vystihuje název „koherencí řízený holografický mikroskop“ („coherence-controlled holographic microscope“, CCHM), který může být zpětně uplatněn i na mikroskop v uspořádání pro odražené světlo.

11

3.3.2

Biologické aplikace a metoda dynamických fázových diferencí

Kvantitativní fázové zobrazení pomocí CCHM je demonstrováno na obr. 8, kde jsou dva snímky živých buněk z desetihodinové časosběrné série. Celková délka pozorování ilustruje již dříve zmíněný přínos metody digitální holografické mikroskopie pro biologii živých buněk. Kontrastní zobrazování buněk bez použití markerů (například fluorescenčních barviv), které mají toxické účinky, umožňuje dlouhodobé přežití buněk in vitro. Lze pozorovat reakce buněk na vnější podněty v přirozených podmínkách. Fáze, která je na obrázku 8 znázorněná trojrozměrně, 9:28 h

0:00 h

Obr. 8: Dvě buňky krysího Rousova sarkomu buněčné linie RsK4 ve standardním růstovém médiu po mitóze byly časosběrně pozorovány pomocí CCHM po dobu 10 hodin. Na obrázcích jsou dva snímky buněk v kvantitativním fázovém kontrastu v indikovaných časech. Byly použity objektivy 20x/0,40 a osvětlení halogenovou lampou (plošný zdroj) spektrálně omezené interferenčním filtrem s maximem propustnosti na vlnové délce 650 nm a pološířkou maxima 10 nm.

reprezentuje hustotu hmoty buňky za sucha. Časová změna v jejím rozložení indikuje změnu v rozložení buněčné hmoty, která má charakteristický průběh pro různé buněčné děje, například buněčnou smrt nebo reakci buňky na stresové podmínky. Sledování těchto pohybů buněčné hmoty rychle signalizuje změnu životních podmínek buňky a lze je využít například k testům cytopatogenicity či cytotoxicity látek. a)

b)

c)

d)

20 µm

Obr. 9: Pozorování reakcí nádorových buněk na akutní nutriční/energetickou deprivaci v médiu bez výživových látek [33]. Intenzita červené (zelené) barvy indikuje velikost přírůstku (úbytku) hustoty buněčné hmoty za sucha. a) Normální lidské fibroblasty LF (13. minuta po umístění do média), b) buňky krysího Rousova sarkomu LW13K2 (8. minuta), c) buňky krysího sarkomu A3 (22. minuta), d) buňky lidského karcinomu prsu G3S2 (10. minuta). Byly použity objektivy 10x/0,25 a osvětlení halogenovou lampou (plošný zdroj) spektrálně omezené interferenčním filtrem s maximem propustnosti na vlnové délce 650 nm a pološířkou maxima 10 nm.

Procesy související s motilitou buněk probíhají tempem, při němž není pro pozorovatele snadné zaznamenat změny v rozložení hustoty buněčné hmoty v krátkých časových intervalech. V jiných případech naopak chybí přehled o celkové změně rozložení hmoty buňky od počátku experimentu. Jako vhodný nástroj pro vizualizaci, případně kvantifikaci časových změn distribuce buněčné hmoty byla navržena metoda dynamických fázových diferencí (DPD). Matice DPD jsou

12

vypočítávány jako rozdíl aktuální matice kvantitativní fáze a předchozí, případně první matice kvantitativní fáze dané časosběrné série. V prvém případě jsou citlivě zviditelněny okamžité změny rozložení buněčné hmoty, ve druhém případě jeden obrázek znázorňuje průběh celé časosběrné série. Při vhodně zvoleném barevném kódování přírůstků a úbytků fáze jde o vynikající nástroj pro zviditelnění změn hustoty buněčné hmoty, který signalizuje podstatné buněčné události a jejich charakter. Metody DPD bylo úspěšně využito při testování nádorových buněk podrobených akutní energetické a nutriční deprivaci navozené umístěním živých buněk do média bez výživových látek (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem) [33]. Charakter stresové reakce buněk různých buněčných linií při jejich umístění do nutričně chudého média je znázorněn metodou DPD na obrázku 9. Reakce závisely na typu nádorových buněk i na jejich metastatické aktivitě. Z těchto výsledků bylo možno odvodit jak vhodnost metody DPD, tak obecnější závěr, že zavedení CCHM do buněčné biologie umožňuje charakterizaci buněk během aktuálního pozorování. Protože jde o neinvazivní intravitální metodu, lze očekávat její významný dopad na výzkum v oblasti individuálních buněčných vlastností – v kontrastu k pozorování průměrných vlastností buněčné populace. 3.3.3

Zobrazení balistickým světlem v difuzním prostředí

Výjimečnost CCHM vyniká při zobrazení v difuzních (rozptylujících) prostředích, kde pro fázové zobrazení nelze využít klasické DHM ani Zernikova fázového kontrastu. Na obrázcích 10 a) – d) je demonstrován účinek koherenční brány vytvářené CCHM při použití nekoherentního zdroje světla na zobrazení otvorů v měděné fólii překryté difuzérem (rozptylující fólií). Klasické zobrazení tohoto modelového vzorku získané pouze předmětovou větví mikroskopu je zcela znehodnoceno tím, že ostrý obraz je překryt světlem náhodně rozptýleným v difuzéru (obr. 10 b). Při holografickém pozorování s nekoherentním světlem v CCHM je však hologram a také zobrazení vytvářeno pouze světlem balistickým, tj. v difuzéru nerozptýleným, a zobrazení je jasně patrné (obr. 10 d). Efekt nastává proto, že v referenční větvi není světlo rozptylováno a šíří se tudíž pouze „balisticky“.

a) 

b) 

e) 

f) 

c) 

d) 

g) 

h) 

Obr. 10: Účinek koherenční brány v CCHM. Zobrazení a) otvorů v měděné fólii [31] klasickou mikroskopií ve světlém poli (odstíněna referenční větev CCHM) je znehodnoceno b) při překrytí vzorku difuzérem. Naproti tomu zobrazení c) téhož vzorku pomocí CCHM (obrazová intenzita) zůstává neporušeno při překrytí vzorku difuzérem d). V obou případech bylo použito prostorově nekoherentní osvětlení halogenovou lampou (plošný zdroj) s interferenčním filtrem s maximem propustnosti na vlnové délce 650 nm (pološířka 10 nm) a objektivy 10x/0,25. Na obrázcích vpravo je zobrazení živých buněk lidského karcinomu prsu buněčné linie G3S2 in vitro v médiu s aktivními fosfolipidy na počátku experimentu (e, g) a po 14,5 h (f, h). Fosfolipidy vytvářejí opticky difuzní prostředí, v němž není klasický Zernikův fázový kontrast ani DHM aplikovatelné. Bylo použito totéž nekoherentní osvětlení jako v předchozím případě a objektivy 20x/0,40; intenzita zobrazení CCHM je na obrázcích (e, f), fáze na obrázcích (g, h).

13

Podobný efekt je zřejmý i na obrázcích 10 e) – h) zachycujících zobrazení buněk v médiu s aktivními fosfolipidy, které představuje difuzní prostředí. Buňky jsou zřetelné v intenzitě a zvláště ve fázi zobrazení pomocí CCHM, ačkoli jsou umístěny v prostředí, v němž nelze zobrazovat klasickou DHM, ani pomocí Zernikova fázového kontrastu. 3.3.4

Zobrazení nebalistickým světlem v difuzním prostředí

Také jiné mikroskopové techniky (například konfokální mikroskopie) umožňují separovat balistické světlo a jeho pomocí vytvořit téměř neporušené zobrazení objektu umístěného v difuzním prostředí. Kvalita zobrazení a zařízení je posuzována podle míry separace balistického světla a světla rozptýleného v oblasti mimo rovinu ostrosti (označme toto světlo jako difuzní světlo), které je považováno za balastní světlo snižující kontrast zobrazení. V této podkapitole ukážeme, že CCHM dovoluje využít také difuzního světla k zobrazování [34]. Difuzní světlo je rozptylem mimo předmětovou rovinu vychýleno a dopadá do obrazové roviny mimo příslušné Gaussovy obrazové body. Pokud při nekoherentním osvětlení posuneme referenční vlnu ve výstupní rovině stranově o vektor Δ, bude hologram vytvářen difuzním světlem, které je v obrazové rovině vychýleno o týž vektor posunutí Δ. Zbývající difuzní a balistické světlo v předmětovém svazku nebude interferovat s referenčním svazkem a ze zobrazovacího procesu bude koherenční branou vyloučeno. Efektu zobrazování difuzním světlem, který je demonstrován na obrázku 11, nebylo dosud dosaženo jinou technikou.

Obr. 11: Demonstrace zobrazení difuzním světlem v CCHM [34]. Zobrazeným vzorkem je krycí sklíčko CELLocate s reliéfem ve tvaru mřížky a písmene „M“. Sloupec „světlé pole“ označuje zobrazení pouze předmětovou větví CCHM, tedy klasickou mikroskopií. Překrytí vzorku difuzérem (obrázky na 2. řádku) způsobí ztrátu zobrazení ve světlém poli. Fázové zobrazení pomocí CCHM je však viditelné jak v balistickém světle (2. řádek), tak i v difuzním světle při posunutí referenčního svazku o ∆ = 20 µm (3. řádek, vzdálenost Δ byla přepočtena do předmětové roviny). Použili jsme osvětlení halogenovou lampou (plošný zdroj) s interferenčním filtrem s maximem propustnosti na vlnové délce 650 nm (pološířka 10 nm) a objektivy 10x/0,25.

3.3.5

Další vývoj mikroskopu

V posledních dvou letech bylo navrženo a experimentálně ověřeno nové optické uspořádání CCHM, které dovoluje použít moderních objektivů korigovaných na nekonečnou tubusovou délku, nahradit osvětlovací objektivy klasickými kondenzory a kombinovat holografické pozorování

14

s jinými technikami, zejména s fluorescenční mikroskopií, případně optickou mikromanipulací [35]. Zařízení v této podobě je možné nabídnout biologickým laboratořím. Proto byla ve spolupráci VUT v Brně a firmy Tescan, a.s., podána patentová přihláška a byl zahájen vývoj prototypu zařízení s předpokladem jeho komerční výroby v příštích letech. Patent byl zatím udělen v České republice [36]. Přihlášky k patentové ochraně (rozšíření prioritní přihlášky) jsou podány rovněž v následujících teritoriích: USA, Japonsko, Čína, země evropské patentové úmluvy a země eurasijského patentu. V případě udělení evropského patentu budou provedeny jeho validace minimálně ve Francii, Německu, Itálii a Spojeném království.

4

TEORIE ZOBRAZENÍ

Vývoj principiálně nových mikroskopů vyžaduje detailní porozumění jejich zobrazovacímu procesu. Proto autor vypracoval obecnou teorii zobrazení interferenčními a holografickými mikroskopy [37], která vychází z vlnové teorie světla, není omezena na paraxiální aproximaci, která je při zobrazování mikroskopovými objektivy nevhodná, a umožňuje uvažovat libovolně nízkou časovou i prostorovou koherenci zdrojů. V této kapitole uvedeme základní myšlenky teoretického výpočtu. Intenzita světla detekovaná ve výstupní rovině interferenčního nebo holografického mikroskopu při osvětlení koherentním zdrojem se předpokládá v obecném tvaru |

exp iΦ |

| |

| |

exp iΦ

exp

iΦ ,

(3)

kde o, resp. r označuje rozložení komplexní amplitudy předmětové, resp. referenční vlny v obrazové rovině objektivu. Funkce Φ popisuje uměle vnesený fázový posuv, který v případě mikroskopie s řízenou fází nabývá několika konstantních hodnot pro každé výsledné zobrazení. V případě mimoosové holografie závisí funkce Φ lineárně na prostorové souřadnici. Tím se zavádí prostorová nosná frekvence. Pokud je koeficient lineární závislosti (tj. nosná frekvence) dostatečně vysoký, lze při následném počítačovém zpracování fourierovsky oddělit člen , který je úměrný komplexní amplitudě předmětové vlny a představuje výstupní obrazový signál mikroskopu. Při dalším teoretickém výpočtu jsou vyjádřeny komplexní amplitudy o a r pro myšlený monochromatický bodový zdroj umístěný v určitém bodě skutečného plošného polychromatického zdroje. Jde tedy o myšlené koherentní vlny, jejichž komplexní amplituda obecně označená , , , je při výpočtu převedena dvojrozměrnou Fourierovou transformací na tzv. úhlové spektrum exp

κ kde κ , . Při šíření vlny z roviny popsána vztahem (viz [37])

0 do roviny se souřadnicí κ

exp 2 i

2 iκ ·

d

,

(4)

je transformace jejího úhlového spektra κ ,

(5)

označuje osovou složku vektoru κ , , o velikosti |κ | rovné vlnočtu v němž světelné vlny. Znaménko souřadnice se řídí směrem šíření vlny. Pro zjednodušení byly zobrazovací soustavy při výpočtu považovány za lineární prostorově invariantní systémy. Pak bylo možno zobrazení popisovat pomocí zobecněných přenosových funkcí κ jednotlivých kondenzorů a objektivů (viz [37]). Při průchodu zobrazovací soustavou je úhlové spektrum vlny filtrováno podle vztahu κ

κ

κ .

(6)

Funkce κ je současně zobecněnou pupilovou funkcí soustavy. Tato funkce nabývá nulové hodnoty, pokud je odchylka vektoru κ od kladného směru osy (optické osy) větší, než je úhlová

15

/ apertura α soustavy, a hodnoty / pro odchylky menší nebo rovné α. To platí pro aplanatickou optickou soustavu. Interakce světelné vlny se vzorkem je popsána jako pružný rozptyl v první Bornově aproximaci je pak vyjádřeno teorie rozptylu (viz např. [38], str. 699). Úhlové spektrum rozptýlené vlny superpozičním integrálem úhlového spektra primární vlny násobeného funkcí rozptylu κ , κ závisející na vzorku (viz [37]). Platí

κ ,κ

κ

κ d κ,

(7)

kde κ , κ jsou příčné složky vektorů κ, κ , které jsou rovny vlnovým vektorům rovinných složek primární a rozptýlené vlny násobeným 1/2π. Pro jejich velikosti platí |κ| |κ | , neboť předpokládáme pružný rozptyl. Dále definujeme vektor rozptylu κ κ . Pro funkci rozptylu platí (viz [37]) κ ,κ Funkce

,κ

.

(8)

2 i ·r d r

(9)

je vyjádřena Fourierovou transformací r exp

rozptylového potenciálu r vzorku a popisuje tedy spektrum prostorových frekvencí vzorku. Je zřejmé, že , , má také význam trojrozměrného vektoru prostorových frekvencí. ,κ je korekční funkce nebo geometrický faktor závisející na charakteru vzorku. Pro volný prostor je rozptylový potenciál formálně vyjádřen Diracovou funkcí r . Pomocí vztahů (4) – (9) jsou analyticky vyjádřeny komplexní amplitudy o a r a pak také výstupní intenzita i (viz (3)) pro myšlený monochromatický bodový zdroj umístěný v určitém bodě skutečného plošného širokopásmového zdroje. Výstupní intenzita při osvětlení plošným širokopásmovým zdrojem je vypočtena pomocí zobecněné Hopkinsovy formule ([38], str. 577) integrací intenzity i na ploše a spektrálním pásmu zdroje. Výstupní signál představuje integrál ze čtvrtého členu výrazu (3). Při integraci předpokládáme, že uměle zavedený fázový posuv Φ nezávisí na integračních proměnných, tedy na poloze bodového zdroje a na vlnočtu světla. To odpovídá použití achromatického a prostorově invariantního interferometru. Pak je možné funkci exp iΦ vytknout před integrál. Tato funkce slouží pouze k oddělení integrovaného čtvrtého členu ve fourierovském prostoru a je přitom je pak dán uvedenou integrací pouhého součinu eliminována. Výsledný obrazový signál komplexních amplitud , který vystupuje ve výrazu (3). Plošné a spektrální rozložení intenzity světla emitovaného zdrojem je při integraci popsáno funkcí κ . V argumentu funkce je použit vektor κ. Předpokládáme totiž Köhlerovo osvětlení, při jehož aplikaci každému bodu zdroje a každému vlnočtu emitovaného světla odpovídá v předmětovém prostoru rovinná vlna s vlnovým vektorem 2 κ. Je tedy jednoznačný vztah mezi dvojicí prostorových souřadnic bodu zdroje a vlnočtem emitovaného světla na jedné straně a vektorem κ na straně druhé. Popsaným způsobem byl odvozen [37] vzorec popisující výstupní obrazový signál v konfokální mikroskopii, interferenční a holografické mikroskopii, korelační a optické koherenční mikroskopii. Ve všech případech má shodný tvar exp 2

·

d

,

(10)

který ukazuje, že zobrazovací proces všech uvedených mikroskopií je koherentní. Výraz (10) obsahuje trojrozměrnou koherenční funkci přenosu (CTF) , která popisuje zobrazení mikroskopem jako filtraci prostorových frekvencí vzorku. CTF závisí na zobecněných pupilových funkcích κ objektivů, charakteristické funkci , κ vzorku a koherenčních vlastnostech zdroje vyjádřených jeho plošnou a spektrální intenzitou κ . Výrazy pro CTF popisující

16

jednotlivé mikroskopie se liší. Trojrozměrný vektor obrazových souřadnic je rozdílem 2 dvojrozměrného vektoru kartézských souřadnic bodu na CCD čipu a trojrozměrného vektoru posuvu vzorku při jeho přeostřování nebo rastrování. Koherenční funkce přenosu pro koherencí řízený holografický mikroskop byla odvozena v následujícím tvaru κ |

κ |

κ

κ

,κ /

d κ,

(11)

kde , , je vektor prostorových frekvencí, κ , , , přičemž 2 κ je vlnový vektor rovinné komponenty osvětlovací vlny. Funkce κ popisuje spektrální a plošnou intenzitu zdroje, κ , resp. κ je zobecněná pupilová funkce objektivu, resp. kondenzoru. Horní znaménka v argumentech funkcí platí pro procházející světlo, dolní pro odražené světlo. Diracova funkce vyjadřuje podmínku pružnosti rozptylu světla ve vzorku a omezuje integraci na rovinu /2. Integrál (11) lze proto zjednodušit na dvojný vhodnou transformací souřadnic (viz κ· [37]).

Obr. 12: Řez nosičem (oblastí nenulových hodnot) trojrozměrné CTF (přenosovým pásmem) CCHM v uspořádání a) pro procházející světlo, b) pro odražené světlo. Výpočet je proveden pro plošný monochromatický (tj. (plocha tmavě šedé barvy), resp. /2 (plocha světle šedé nekoherentní) zdroj osvětlení s vlnočtem (kruhové oblouky o poloměru barvy) a pro bodový monochromatický (tj. koherentní) zdroj s vlnočtem 0 ). Pro výpočet byla zvolena úhlová apertura a) α = π/3, b) α = π/4 kondenzorů i objektivů. Trojrozměrné přenosové pásmo vznikne rotací vyznačených ploch, resp. čar kolem osy s. Je zřejmé, že změna vlnočtu vede ke škálování přenosového pásma. V případě a) leží pásmo pro nižší vlnočet vždy uvnitř pásma pro vyšší vlnočet. V případě b) dochází k posuvu pásem a širokopásmové osvětlení tedy vytváří rozsáhlé přenosové pásmo vyplňující příslušnou oblast vlnočtů. Řez přenosovým pásmem pro hypoteticky spektrálně neomezené osvětlení vyplňuje oblast mezi a) přímkami, které procházejí bodem (0,0) a svírají úhel ±α s osou m, b) polopřímkami s počátkem v bodě (0 0) které svírají úhel π ± α s osou s

CTF byly odvozeny také pro ostatní výše zmíněné mikroskopie (viz [37]). Porovnání výsledků ukázalo, že přenosová pásma pro monochromatické osvětlení plošným zdrojem se ve všech případech shodují a odpovídají přenosovým pásmům CCHM na obrázku 12. Pokud uvažujeme uspořádání s odraženým světlem, pak se shoduje dokonce přímo normovaná CTF. To znamená, že použití plošného (prostorově nekoherentního) monochromatického zdroje v holografické, interferenční, korelační či optické koherenční mikroskopii má za následek vznik zobrazení stejné povahy jako v konfokálním mikroskopu. Ve skutečnosti můžeme u nekonfokálních technik 2

Pokud je detektor bodový, dosadí se hodnoty (0,0) souřadnic.

17

očekávat dokonce lepší zobrazovací vlastnosti. Výpočet pro konfokální mikroskop byl totiž proveden v aproximaci bodového zdroje a detektoru. Reálné konfokální mikroskopy s konečně velkými aperturami zdroje a detektoru mají horší zobrazovací vlastnosti [39], než odpovídá popsané teorii. Další výhodou interferenčně založených mikroskopií je optické zesílení detekovaného signálu nad vlastní šum detektoru, takže detekce je limitovaná pouze výstřelovým šumem. Na obrázku 12 jsou zakresleny také řezy přenosovými pásmy pro bodový monochromatický (koherentní) zdroj osvětlení. Jde o kruhové oblouky o poloměru se středem v bodě , 0, . Tato pásma mají nulovou tloušťku ve směru osy s, a následkem toho nevznikají optické řezy v uspořádání na odraz. Šířka optického řezu je totiž přibližně nepřímo úměrná délce úseku, který vymezuje přenosové pásmo na ose s, jak vysvětlíme dále. Nejvyšší příčná prostorová frekvence přenášená mikroskopem je dána nejvyšší hodnotou prostorové frekvence m, kterou obsahuje přenosové pásmo. Z obrázku 12 lze pro obě uspořádání mikroskopu odečíst, že pro plošný (nekoherentní) zdroj s vlnočtem tento průsečík leží v bodě max, i

2

NA

sin

v

v

,

(12)

kde NA sin označuje numerickou aperturu objektivů a kondenzorů a λv je vlnová délka osvětlení ve vakuu. Pokud namísto plošného zdroje použijeme bodový (koherentní) zdroj, sníží se podle obrázku 12 mezní přenosová frekvence na poloviční hodnotu max, c

NA v

.

(13)

Také z tohoto důvodu je v DHM výhodné používat nekoherentních zdrojů osvětlení. Funkce κ popisuje nejen prostorovou, ale i časovou koherenci zdroje, a tak jsou všechny koherenční efekty popsány pouze prostřednictvím CTF. V případě procházejícího světla je přenosové pásmo pro nižší vlnočet osvětlení vždy obsaženo uvnitř pásma pro vyšší vlnočet (viz obr. 12 a) a rozšiřování spektrálního pásma osvětlení nemá tedy podstatný vliv na charakter zobrazení. Jinak je tomu u odraženého světla. Při rozšiřování spektrálního pásma osvětlení se v tomto případě také axiálně rozšiřuje přenosové pásmo mikroskopu (viz obr. 12 b), což vede k zesílení hloubkové diskriminace koherenční branou, tj. zúžení optického řezu. Efekt optických řezů v uspořádání na odraz lze popsat pomocí osové závislosti intenzity zobrazení rovinného reflektoru, tzv. osové intenzitní odezvy mikroskopu. Pro rovinný reflektor platí r je pak podle (10) a podle (9) platí . Závislost signálu na osové souřadnici vyjádřena vztahem 0,0,

exp 2 i

d .

(14)

Pro přibližný výpočet aproximujme CTF hodnotou 1 na nosiči a 0 vně nosiče CTF. , . Předpokládejme dále osvětlení se spektrálním pásmem ohraničeným na interval vlnočtů Uvnitř nosiče CTF leží hodnoty s z intervalu 2 , 2 cos , což lze odečíst z obrázku 12 b) po doplnění příslušných přenosových pásem pro uvedený interval vlnočtů. Pro obrazový signál pak podle (14) platí vztah cos

exp 2 i

cos

exp 2 i sinc 2

d cos

.

(15)

Argument funkce sinc sin / vyjadřuje závislost tloušťky optického řezu na úhlové apertuře objektivů a vlnočtech osvětlení. Výsledek pro monochromatické světlo získáme tak, že položíme . Poměr tlouštěk optického řezu při polychromatickém a monochromatickém osvětlení je roven přibližně

18

1

cos . cos

(13)

Na obrázku 13 je znázorněn průběh osové intenzitní odezvy CCHM vypočtený pro gaussovskou spektrální funkci. Je zřejmé, že zvětšení disperze spektrální funkce vede k zúžení optického řezu. To je potvrzeno také experimentálními výsledky uvedenými na obrázku 13. Podobného efektu nelze dosáhnout konfokální mikroskopií. Kromě uvedených výsledků vznikla na základě popsaného teoretického aparátu práce popisující vliv omezené příčné rozlišovací schopnosti mikroskopu na přesnost interferenčních měření povrchů vzorků [8]. V současnosti jsme pomocí tohoto aparátu interpretovali zobrazování difuzním světlem a popsali možnost numerického ostření s nekoherentním osvětlením (dosud nepublikováno). Výpočty ukazují také další možnosti využití achromatického interferometru pro dosažení hloubkově diskriminovaného nekonfokálního zobrazení fluorescenčně obarvených vzorků. a)

b)

i

z

i

z

Obr. 13: Osová intenzitní odezva CCHM pro osvětlení s gaussovskou spektrální hustotou [28]. Plná čára označuje teoretický výpočet, křížky experimentální hodnoty, čárkovaná čára teoretický průběh pro monochromatické osvětlení a také pro ideální konfokální mikroskop. Hodnoty disperze Δκ a střední vlnové délky λ0 jsou a) Δκ = -1 -1 0,02 μm , λ0 = 547 nm, b) Δκ = 0,06 μm (hodnota byla získána fitováním teoretické křivky na experimentální data), λ0 = 508 nm. Byly použity objektivy 10x/0,25.

5

EXPERIMENTÁLNÍ BIOFOTONIKA

Vývoj koherencí řízených holografických mikroskopů na Ústavu fyzikálního inženýrství byl zejména v posledních letech úzce spjat také s rozvojem jejich aplikací v biologii živých buněk. Důležitým počátečním stimulem byla spolupráce s profesorem Alanem Boydem (Queen Mary University of London), která se odvíjela od společného zájmu o biologickou konfokální mikroskopii a jí příbuzné techniky. Na ni navázala dlouhodobá spolupráce s doktorem Pavlem Veselým (Ústav molekulární genetiky AV ČR v Praze) a později také s kolegy z Katedry buněčné biologie Přírodovědecké fakulty UK v Praze. Tato spolupráce ukázala způsob, jímž je třeba adaptovat zařízení, a umožnila provést klíčové experimenty, které prokázaly, že CCHM představuje techniku velmi vhodnou pro neinvazivní pozorování živých buněk a jejich reakcí na vnější zásahy, a to i v dlouhodobých časosběrných experimentech (viz kapitolu 3.3.2). Možnost omezit koherenci světla a tak pomocí CCHM pozorovat buňky i v rozptylujících prostředích, která jsou často biologicky významná (média s obsahem lipidů, gely, vícevrstevný buněčný porost),

19

znamená podstatné rozšíření biologických aplikací do oblastí dosud nedostupných pro digitální holografickou mikroskopii. Získané poznatky s aplikací CCHM v biologii tvoří základ již více než deseti konferenčních sdělení. Studie chování živých buněk pomocí CCHM splnila kritéria pro publikaci [33] v biologickém časopise s impaktním faktorem. Teoretický výpočet naznačuje další možnost vývoje CCHM pro biologické aplikace, a to kombinací CCHM s tzv. light-sheet mikroskopií [40], která biologické objekty pozoruje v trojrozměrném prostředí. Kromě adaptace CCHM pro pozorování živých buněk bylo třeba vytvořit podmínky pro uchovávání buněk, přípravu preparátů a jejich umístění v mikroskopu při vhodné teplotě a v prostředí, které umožňuje dlouhodobé přežití buněk. Kromě samotného mikroskopu byly proto souběžně vyvíjeny pozorovací komůrky, stacionární i průtokové, které umožňují výměnu média během experimentu a pozorování reakce buňky na změny prostředí. Mikroskop musel být pro pozorování savčích buněk umístěn do temperovaného boxu a vybaven vyhřívaným stolkem udržovaným na stálé teplotě 37 °C. Doplněním přístrojového vybavení původně optické laboratoře instrumenty pro buněčnou biologii vznikla na ÚFI Laboratoř experimentální biofotoniky. Tato laboratoř je v současnosti dále budována a nyní zahrnuje kultivaci buněk, přípravu buněčných preparátů, jejich pozorování pokročilými metodami světelné, zejména holografické mikroskopie a počítačové zpracování získaných výsledků. Tím, že není nutná přeprava citlivých vzorků mimo laboratoř, je splněn předpoklad pro provádění náročnějších biologických experimentů. Do práce v laboratoři jsou zapojeni také studenti oborů „Fyzikální inženýrství a nanotechnologie“ a „Přesná mechanika a optika“ a doktorandi v oboru „Fyzikální a materiálové inženýrství“. Významně se podílejí na výpočtech, experimentech, návrhu a konstrukční realizaci experimentálního zařízení. Jejich inženýrské dovednosti s hlubším fyzikálním základem získané studiem oboru jsou zde rozšiřovány o základní poznatky z buněčné biologie, světelné a holografické mikroskopie a schopnosti připravit a uskutečnit mikroskopové pozorování živých buněk in vitro. Také pro tyto studenty byly do studijních plánů zmíněných oborů magisterského studia zavedeny nové předměty – povinný předmět „Mikroskopie a spektroskopie“ a nepovinný předmět „Experimentální biofotonika“. Experimentální biofotonika se tím stává jednou z možných mezioborových specializací v rámci studijních oborů garantovaných ÚFI. Lze shrnout, že důležité aplikační výsledky vznikly díky úzké spolupráci odborníků v oblasti aplikované optiky a v oblasti buněčné biologie. Tato spolupráce iniciovala a umožnila vznik laboratoře experimentální biofotoniky a prohlubuje se mezioborovou výchovou nových odborníků.

6

SOUHRN

Myšlenka koherencí řízené holografické mikroskopie vznikla, byla rozvinuta, experimentálně ověřena a úspěšně aplikována na ÚFI. Velký potenciál této techniky spočívá jednak v možnosti vůbec použít pro holografickou mikroskopii světla s velmi nízkou koherencí, a tím dosáhnout vysoce kvalitního zobrazení, jednak v možnosti měnit charakter zobrazení volbou koherence osvětlení. Lze tak dosáhnout dvou extrémů – jeden odpovídá koherentní holografické mikroskopii s možností 3D rekonstrukce obrazu, druhým extrémem je efekt koherenční brány vyvolaný velmi nízkou koherencí, který činí holografické zobrazení podobné konfokálnímu. Nutnou podmínkou pro to, aby se koherence světla stala volným parametrem řídícím povahu zobrazení při mimoosové holografii, je optický design mikroskopu založený na Leithově achromatickém a prostorově invariantním interferometru. Řízení obrazových charakteristik pomocí koherence osvětlení bylo popsáno teoreticky a ověřeno experimentálně pomocí holografických mikroskopů uspořádaných pro odražené a procházející světlo. Kvantitativní fázový kontrast poskytovaný CCHM v koherentním i nekoherentním režimu umožňuje dlouhodobá sledování a kvantifikaci pohybu buněčné hmoty, a tím se stává slibným nástrojem pro budoucí vyhodnocování chování živých nádorových buněk, zejména z hlediska nitrobuněčné motility. Bylo ověřeno, že koherenční brána indukovaná nekoherentním osvětlením poskytuje jak standardní možnost pozorování v difuzním prostředí

20

pomocí separace balistického světla obdobné konfokální mikroskopii, tak také zcela nový typ zobrazování, který využívá světla difuzního. Koherencí řízený holografický mikroskop byl patentován v České republice. Patentová přihláška byla podána také mezinárodně a výroba CCHM se připravuje ve spolupráci s firmou Tescan. Vzhledem k mimořádně dobré aplikovatelnosti vyvíjené techniky v biologii živých buněk vznikla na ÚFI laboratoř a výzkumná skupina „Experimentální biofotonika“. Mezioborová výzkumná činnost skupiny je založena na spolupráci odborníků v aplikované optice a buněčné biologii. Na její činnosti se podstatnou měrou podílejí také doktorandi a studenti. Experimentální biofotonika se tím stává rovněž studijní specializací oborů garantovaných ÚFI. Po téměř patnácti letech výzkumu a vývoje se aplikace nekoherentní holografie v mikroskopii staly nosným programem pro činnost výzkumné skupiny také v blízké budoucnosti.

PODĚKOVÁNÍ Děkuji všem kolegům za jejich spolupráci, pomoc a také vlídnou pracovní atmosféru, bez níž by tato práce nemohla vzniknout. Tato práce souvisí s tématikou projektu MŠMT ČR MSM0021630508.

LITERATURA [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9]

[10] [11]

[12] [13]

D. Gabor: A new microscope principle, Nature 161 (1948) 777. M. E. Haine, T. Mulvey: The Formation of the Diffraction Image with Electrons in the Gabor Diffraction Microscope, JOSA 42 (1952) 763. E. N. Leith, J. Upatnieks: Microscopy by Wavefront Reconstruction, JOSA 55 (1965) 569. R. F. Van Lighten, H. Osterberg: Holographic Microscopy, Nature 211 (1966) 282. E. Cuche, F. Bevilacqua, C. Depeursinge: Digital holography for quantitative phasecontrast imaging, Opt. Lett. 24 (1999) 291. Y. Cotte, M. F. Toy, N. Pavillon, C. Depeursinge: Microscopy image resolution improvement by deconvolution of complex fields, Opt. Expr. 18 (2010) 19462. J. Kühn, F. Charrière, T. Colomb, E. Cuche, F. Montfort, Y. Emery, P. Marquet, C. Depeursinge: Axial sub-nanometer accuracy in digital holographic microscopy, Meas. Sci. Technol. 19 (2008) 074007. L. Lovicar, J. Komrska, R. Chmelík: Quantitative-phase-contrast imaging of a two-level surface described as a 2D linear filtering process, Opt. Expr. 18 (2010) 20585. Y. Emery, E. Cuche, F. Marquet, N. Aspert, P. Marquet, J. Kühn, M. Botkine, T. Colomb, F. Montfort, F. Charrière, C. Depeursinge, P. Debergh, R. Conde: Digital Holographic Microscopy (DHM) for metrology and dynamic characterization of MEMS and MOEMS, Proc. SPIE 6186 (2006) N1860. D. Carl, B. Kemper, G. Wernicke, G. von Bally: Parameter-optimized digital holographic microscope for high-resolution living-cell analysis, Appl. Opt. 43 (2004) 6536. P. Marquet, B. Rappaz, P. J. Magistretti, E. Cuche, Y. Emery, T. Colomb, C. Depeursinge: Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy, Opt. Lett. 30 (2005) 468. B. Kemper, D. Carl, J. Schnekenburger, I. Bredebusch, M. Schäfer, W. Domschke, G. von Bally: Investigation of living pancreas tumor cells by digital holographic microscopy, J. Biomed. Opt. 11 (2006) 34005. R. Barer: Interference microscopy and mass determination. Nature 169 (1952) 366.

21

[14] F. Dubois, C. Yourassowsky, O. Monnom, J. C. Legros, O. Debeir, P. V. Ham, R. Kiss, C. Decaestecker: Digital holographic microscopy for the three-dimensional dynamic analysis of in vitro cancer cell migration, J. Biomed. Opt. 11 (2006) 054032. [15] N. Pavillon, A. Benke, D. Boss, C. Moratal, J. Kühn, P. Jourdain, Ch. Depeursinge, P. J. Magistretti, P. Marquet: Cell morphology and intracellular ionic homeostasis explored with a multimodal approach combining epifluorescence and digital holographic microscopy, J. Biophoton. 3 (2010) 432. [16] M. DaneshPanah, S. Zwick, F. Schaal, M. Warber, B. Javidi, W. Osten: 3D Holographic Imaging and Trapping for Non-Invasive Cell Identification and Tracking, J. Display Technol. 6 (2010) 490. [17] E. Shaffer, C. Moratal, P. Magistretti, P. Marquet, Ch. Depeursinge: Label-free secondharmonic phase imaging of biological specimen by digital holographic microscopy, Opt. Lett. 35 (2010) 4102. [18] F. Dubois, L. Joannes, J.-C. Legros: Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence, Appl. Opt. 38 (1999) 7085. [19] F. Dubois, N. Callens, C. Yourassowsky, M. Hoyos, P. Kurowski, O. Monnom: Digital holographic microscopy with reduced spatial coherence for three-dimensional particle flow analysis, Appl. Opt. 45 (2006) 864. [20] F. Dubois, C. Yourassowsky, N. Callens, C. Minetti, P. Queeckers: Applications of digital holographic microscopes with partially spatial coherence sources, Journal of Physics: Conference Series 139 (2008) 012027. [21] M. Kempe, W. Rudolph: Analysis of heterodyne and confocal microscopy for illumination with broad-bandwidth light, J. Mod. Opt. 43 (1996) 2189. [22] M. Kempe, W. Rudolph, E. Welsch: Comparative study of confocal and heterodyne microscopy for imaging through scattering media, J. Opt. Soc. Am. A 13 (1996) 46. [23] E. N. Leith, J. Upatnieks: Holography with Achromatic-Fringe Systems. J. Opt. Soc. Am. 57 (1967) 975. [24] R. Chmelík, Z. Harna: Parallel-Mode Confocal Microscopy, Opt. Eng. 38 (1999) 1635. [25] P. C. Sun, E. N. Leith: Broad source image-plane holography as a confocal imaging process, Appl. Opt. 33 (1994) 597. [26] R. Chmelík, Z. Harna: Holografický konfokální mikroskop pro bílé světlo, užitný vzor č. 8547, datum zápisu u ÚPV: 16. 4. 1999. [27] T. Kreis: Digital holographic interference-phase measurement using the Fourier-transform method, J. Opt. Soc. Am. A 3 (1986) 847. [28] R. Chmelík, Z. Harna, M. Machálek, M. Matoušek: Závislost osové odezvy holografického konfokálního mikroskopu na spektrální hustotě osvětlení, Jemná mechanika a optika 46 (2001) 127. [29] R. Chmelík, Z. Harna: Surface profilometry by a parallel-mode confocal microscope, Opt. Eng. 41 (2002) 744. [30] L. Lovicar, L. Kvasnica, R. Chmelík: Surface observation and measurement by means of digital holographic microscope with arbitrary degree of coherence, Proc. SPIE 7141 (2008) 71411S-1. [31] P. Kolman, R. Chmelík: Coherence-controlled holographic microscope. Opt. Expr. 18 (2010) 21990. [32] R. Chmelík, P. Kolman: Holografický mikroskop, užitný vzor č. 19150, datum zápisu u ÚPV: 8. 12. 2008. [33] H. Janečková, P. Veselý, R. Chmelík: Proving Tumour Cells by Acute Nutritional/Energy Deprivation as a Survival Threat: A Task for Microscopy, Anticancer Res. 29 (2009) 2339.

22

[34] M. Lošťák, P. Kolman, Z. Dostál, R. Chmelík: Diffuse light imaging with a coherence controlled holographic microscope, Proc. SPIE 7746 (2010) 77461N-1. [35] T. Slabý, M. Antoš, Z. Dostál, P. Kolman, R. Chmelík: Coherence-controlled holographic microscope, Proc. SPIE 7746 (2010) 77461R-1. [36] R. Chmelík, P. Kolman, T. Slabý, M. Antoš, Z. Dostál: Interferometrický systém s prostorovou nosnou frekvencí zobrazující v polychromatickém záření, patent č. 302491, udělen ÚPV dne 4. 5. 2011. [37] R. Chmelík: Three-dimensional scalar imaging in high-aperture low-coherence interference and holographic microscopes, J. Mod. Opt. 53 (2006) 2673. [38] M. Born, E. Wolf: Principles of Optics, 7th Edition. Cambridge University Press, Cambridge 2002. [39] T. Wilson: Optical Aspects of Confocal Microscopy, in Confocal Microscopy (T .Wilson, Ed.). Academic Press, London 1990, str. 93. [40] C. J. Engelbrecht, E. H. K. Stelzer: Resolution enhancement in a light sheet based microscope (SPIM), Opt. Lett. 31 (2006) 1477.

ABSTRACT The idea of coherence-controlled holographic microscopy (CCHM) has been created, developed, proved experimentally, and successfully applied at the Institute of Physical Engineering (IPE). A great potential of this technique consists partly in the possibility to use light of low coherence for holographic microscopy at all and to reach a very high quality of imaging in this way. Partly its capacity follows from the fact, that the image character depends considerably on the level of illumination coherence. Two extremes are accessible – one corresponds to a coherent holography including 3D reconstructions, the other to confocal-microscopy-like imaging induced by a coherence gate. The necessary condition for making the coherence a free parameter controlling the nature of imaging is the optical design based on the achromatic and spatially invariant Leith interferometer. The above described control of imaging characteristics by the illumination coherence was studied theoretically and proved experimentally by means of holographic microscopes in both reflected and transmitted light configurations. Quantitative phase contrast provided by CCHM in both coherent and incoherent mode makes possible a long-range observation and quantification of cellular mass translocations. Hereby CCHM becomes a promising instrument of future evaluation of living cancer cells behaviour particularly from the point of view of intracellular motility. The presence of the coherence gate is demonstrated by imaging of model samples through scattering obstacles. Standard imaging mechanism using ballistic light separation similar to that of a confocal microscope was proved. Also, completely novel type of imaging by diffuse light was discovered and demonstrated in CCHM. At present, the coherence-controlled holographic microscope is internationally patent pending and it has been already patented in the Czech Republic. Production of CCHM is prepared in collaboration with the Tescan Company. With respect to a very good applicability of developed technique in biology of living cells, the “Experimental biophotonics” research group and laboratory has been established at IPE. Interdisciplinary research activity of the group is based on collaboration of specialists in applied optics and cell biology. Its activities are participated substantially by undergraduate and postgraduate students. Experimental biophotonics thus becomes specialisation within the frame of the study programmes taught at IPE. After about 15 years of research and development, incoherent holography applications in microscopy became the fundamental programme of our research group also in the near future.

23