VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ FAKULTA CHEMICKÁ
SLEDOVÁNÍ EXPRESE FYTOESTROGENŮ DO MLÉKA A MLÉČNÝCH VÝROBKŮ
MONITORING OF PHYTOESTROGENS EXPRESSION TO THE MILK AND MILK PRODUCTS
Autoreferát doktorské dizertační práce k získání vědecké hodnosti Ph.D.
BRNO 2014
Ing. Jarmila Watzková
Dizertační práce byla vypracována v rámci prezenčního studia doktorského studijního programu Chemie a technologie potravin na Vysokém učení technickém v Brně, Fakultě chemické. Uchazeč: Ing. Jarmila Watzková Ústav chemie potravin a biotechnologií, FCH VUT v Brně, Purkyňova 118, 612 00 Brno Školitel: doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ústav chemie potravin a biotechnologií, FCH VUT v Brně, Purkyňova 118, 612 00 Brno
Oponenti:
Autoreferát byl rozeslán dne: ………………………
Obhajoba dizertační práce se koná dne………………před komisí pro obhajoby doktorských dizertačních prací na FCH VUT v Brně od……….hodin.
S dizertační prací je možno se seznámit na děkanátu Fakulty chemické Vysokého učení technického v Brně, Purkyňova 118.
2
OBSAH 1 ÚVOD ...................................................................................................................... 6 1.1 1.2 1.3 1.4
1.5
Forma isoflavonů ................................................................................................................. 6 Výskyt isoflavonů ................................................................................................................ 7 Biologické účinky fytoestrogenů ......................................................................................... 8 Metabolismus fytoestrogenů ................................................................................................ 8 1.4.1 U zvířat ..................................................................................................................... 8 1.4.2 U člověka.................................................................................................................. 9 Shrnutí poznatků a závěr .................................................................................................... 11
2 CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 13 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................. 14 3.1 3.2
Fyziologický experiment (Exp. 1) ..................................................................................... 14 Poloprovozní experiment (Exp. 2) ..................................................................................... 14
4 VÝSLEDKY A DISKUSE .................................................................................... 16 4.1
4.2
Fyziologický experiment (Exp. 1) ..................................................................................... 16 4.1.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka .................................................... 16 4.1.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů .............................................................................. 20 4.1.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka ................ 20 Poloprovozní experiment (Exp. 2) ..................................................................................... 26 4.2.1 Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka .................................................... 26 4.2.2 Zdánlivá návratnost isoflavonů .............................................................................. 30 4.2.3 Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka ................ 30
5 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR ..................................................................... 35 6 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ........................................... 37 7 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ....................................................................... 38 8 VĚDECKÁ ČINNOST .......................................................................................... 49 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5
Publikace ............................................................................................................................ 49 Užitné vzory a funkční vzorky ........................................................................................... 50 Postery ................................................................................................................................ 51 Účast na odborných konferencích ...................................................................................... 51 Projektová činnost .............................................................................................................. 52
3
ABSTRAKT Fytoestrogeny jsou v posledních letech velice intenzivně studovány, protože vykazují rozličné farmakologické účinky na zdraví člověka. Bylo např. prokázáno, že fytoestrogeny snižují riziko výskytu některých typů rakoviny (prsu, prostaty nebo střeva), působí v organismu jako antioxidanty a ovlivňují aktivitu některých enzymů. Kromě toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů na zdravotní stav žen v menopauze, jako je např. snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění aterosklerózy nebo osteoporózy. Různě technologicky upravené sójové boby jsou významnou součástí krmných dávek zvláště pro vysokoprodukční dojnice, protože jsou cenným zdrojem energie a vysoce kvalitního proteinu i přes jejich možný negativní vliv na reprodukční procesy. Fytoestrogeny přijaté v krmné dávce jsou v bachoru dojnic hydrolyzovány a spolu s jejich metabolity jsou v tenkém střevě vstřebávány do krve. Z těla pak mohou být vyloučeny především močí nebo mlékem. Z tohoto pohledu se kravské mléko může stát zdrojem fytoestrogenních látek, především ekvolu v humánní výživě. Naproti tomuto, některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě na zdravotní stav člověka. U některých věkových (kojenci a malé děti) a skupinových (vegetariáni) kategorií může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí. Podle názoru většiny odborníků příznivý vliv na lidské zdraví převažuje nad možnými riziky. Přesto však rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravinách není možné přehlížet, a proto fytoestrogeny zůstávají i nadále aktuálním problémem na poli vědeckého výzkumu.
KLÍČOVÁ SLOVA Fytoestrogeny, ekvol, sójové boby, mléko, mléčné výrobky
4
ABSTRACT Phytoestrogens are very intensively studied in recent years because they show different pharmacological effects on human health. For example, it was demonstrated that phytoestrogens reduce the risk of certain cancers (breast, prostate or colon), act as antioxidants in the body and affect the activity of certain enzymes. In addition, also it was demonstrated number of positive effects of soybean phytoestrogens on the health status of women in the menopause, such as reducing the risk of atherosclerotic cardiovascular disease or osteoporosis. Various technologically processed soy beans are important part of the feed rations mainly for high-lactating dairy cows, because they are a valuable source of the energy and high-quality protein, despite their negative effect on reproductive performance. Phytoestrogens consumed from the feed rations are hydrolyzed in the rumen of dairy cow and together with their metabolites are absorbed in the small intestine into the blood. They can be excreted from the body in urine or milk. From this perspective, cow's milk may become a source of phytoestrogens substances, especially equol in the human nutrition. On the other hand, some research results suggest possible potential risks associated with phytoestrogens intake in the diet on human health. At the some age (infants and young children) and group (vegetarians) categories may be dietary intake of phytoestrogens undiserable. According to most experts, a beneficial effect on human health prevail the potential risks. However, the risks associated with phytoestrogens intake in food can not be ignored and therefore phytoestrogens are still actual problem in the field of scientific research.
KEYWORDS Phytoestrogens, equol, soy beans, milk, milk products
5
1
ÚVOD
Fytoestrogeny jsou již několik let velice intenzivně studovány pro své farmakologické účinky na zdraví člověka. Bylo např. prokázáno, že fytoestrogeny snižují riziko výskytu některých typů rakoviny (prsu, prostaty, střeva), působí v organismu jako antioxidanty a ovlivňují aktivitu některých enzymů [1, 2]. Kromě toho byla prokázána také řada pozitivních účinků sójových fytoestrogenů na zdravotní stav žen v menopauze, jako je např. snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění [3], aterosklerózy [4] nebo osteoporózy [5]. Značná pozornost je věnována především ekvolu, metabolitu daidzeinu, který sám o sobě vykazuje výrazné antikarcinogenní účinky [6]. Ekvol je u člověka produkován z daidzeinu bakteriální mikroflórou ve střevě, nicméně tuto schopnost má pouze asi třetina západní populace [6]. Různě technologicky upravené sójové boby jsou významnou součástí krmných dávek zvláště pro vysokoprodukční dojnice, protože jsou cenným zdrojem energie a vysoce kvalitního proteinu [7] i přes jejich možný negativní vliv na reprodukční procesy či dočasnou neplodnost krav [8]. Fytoestrogeny přijaté v krmné dávce jsou v bachoru dojnic hydrolyzovány a spolu s jejich metabolity jsou v tenkém střevě vstřebávány do krve. Z těla pak mohou být vyloučeny především močí [9, 10] nebo mlékem [11]. Z tohoto pohledu se kravské mléko může stát zdrojem fytoestrogenních látek, především ekvolu v humánní výživě. Naproti tomuto, některé výsledky výzkumu poukazují na možná potenciální rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravě na zdravotní stav člověka. U některých věkových (kojenci a malé děti) a skupinových (vegetariáni) kategorií může být příjem fytoestrogenů v potravě nežádoucí [12]. Podle názoru většiny odborníků, kteří se věnují této problematice, příznivý vliv na lidské zdraví převažuje nad možnými riziky. Přesto však rizika spojená s příjmem fytoestrogenních látek v potravinách není možné přehlížet, a proto fytoestrogeny zůstávají i nadále aktuálním problémem na poli vědeckého výzkumu. 1.1 FORMA ISOFLAVONŮ Sója obsahuje tři hlavní isoflavonové fytoestrogeny. Daidzein (7,4dihydroxyisoflavon), který je nejaktivnějším estrogenním isoflavonem, genistein (7,4-dihydroxy-6-methoxyisoflavon) a v malém množství také glycitein (7,4´dihydroxy-6-methoxyisoflavon) [13]. Chemická struktura těchto látek je uvedena v tabulce 1. Z dalších jsou to biochanin A, (5,7-dihydroxy-4´-methoxyisoflavon) a formononetin (7-hydroxy-4´-methoxyisoflavon). Naklíčené boby obsahují jako jeden z hlavních isoflavonů formononetin. Prekurzorem daidzeinu, formononetinu a glyciteinu je flavanon liquiritigenin (7,4-dihydroxyflavanon), prekurzorem genisteinu a biochaninu A je naringerin (5,7,4-dihydroxy-flavanon) [14]. Isoflavony se vyskytují převážně, jako 7--D-glykosidy. Glykosidem daidzeinu je daidzin, genisteinu genistin a glyciteinu glycitin [14]. Ve všech potravinách na bázi
6
sóji jsou však tyto látky přítomny ve formě aglykonu (nekonjugované formy) nebo jako -glykosidy (konjugované formy), jak je uvedeno v tabulce 1 [15, 16]. Kromě těchto sloučenin se v menším množství vyskytují i acetylderiváty glykosidů, které jsou produkty dekarboxylace příslušných malonylesterů [14]. Malonyl a acetyl glukosidy se vyskytují v menší míře, jelikož jsou velice citlivé na teplo, a proto se rychle formují na více stabilní -glykosidy [17]. Isoflavony se liší od ostatních flavonoidních látek tím, že boční aromatický B cyklus je připojen na pyronový systém v poloze 3, nikoliv v poloze 2, jak je to běžné u klasických flavonoidů. A právě tato strukturní změna významně mění biologickou aktivitu těchto látek [18]. Tab. 1: Struktura isoflavonů a jejich glykosidů [15, 19] Aglykon Daidzein Genistein Glycitein Formononetin Biochanin A Glukosid Daidzin Genistin Glycitin Acetyldaidzin Acetylgenistin Acetylglycitin Malonyldaidzin Malonylgenistin Malonylglycitin
R1
R2
R3
–H
–H
–OH
–OH
–H
–OH
–H
–OCH3 –OH
–H
–H
–OCH3
–OH
–H
– OCH3
R4
R5
R6
–H
–H
–H
–H
–H
–H
–H
–OCH3 –H
–H
–H
–COCH3
–OH
–H
–COCH3
–H
–OCH3 –COCH3
–H
–H
–COCH2COOH
–OH
–H
–COCH2COOH
–H
–OCH3 –COCH2COOH
1.2 VÝSKYT ISOFLAVONŮ Celkový obsah isoflavonů v sójových bobech se pohybuje v širokých rozmezích od zhruba 0,13 % do 0,42 %, v mouce jich bývá kolem 0,2 %, v sójových izolátech asi 0,06-0,10 % a v koncentrátech 0,07 %. Aglykony se dokonce vyskytují v kyselých hydrolyzátech sójových šrotů typu polévkového koření. Estrogenní isoflavony se kromě sóje vyskytují také v dalších rostlinách, ale v podstatně menším množství. Např. v semenech podzemnice olejné se nachází asi 0,50 mg/kg daidzeinu a 0,83 mg/kg genisteinu (volných i vázaných jako glykosidy aj. deriváty), v semenech slunečnice 0,08 mg/kg daidzeinu a 0,14 mg/kg genisteinu, v semenech máku 0,18 a 0,07 mg/kg těchto isoflavonů. Formononetin je 7
také hlavním isoflavonem některých pícnin. Např. v jeteli lučním (Trifolium pratense) z čeledi bobovitých (Fabaceae) bývá v množství 1-30 g/kg sušiny. Minoritní isoflavony pícnin jsou rovněž sloučeniny genistein, daidzein a biochanin A [14]. 1.3 BIOLOGICKÉ ÚČINKY FYTOESTROGENŮ Estrogeny jsou pro organismus zároveň užitečné i škodlivé. Endogenní estrogen savců estradiol je nezbytný pro normální vývoj a reprodukci organismu a ovlivňuje také další důležité děje související s imunitním systémem, centrální nervovou soustavou aj. Současně je však dáván do souvislosti s rakovinou mléčných žláz, konečníku a asi také prostaty [14]. Účinky dalších estrogenů jsou stále předmětem diskusí. Fytoestrogeny sice vykazují o několik řádů nižší estrogenní aktivitu než estradiol, ale vzhledem k množství, v jakém se konzumují, jsou zřejmě příčinou neplodnosti u samců a potratů u samic skotu [14]. U žen živících se potravou bohatou na fytoestrogeny byly pozorovány nepravidelnosti menstruačního cyklu. Na druhé straně byla u populace s vysokým příjmem isoflavonů ze sóje (v některých asijských zemích) pozorovány menší incidence rakoviny prsu a rakoviny prostaty u mužů. Fytoestrogeny obecně účinkují aditivně. Je-li hladina endogenních (steroidních) estrogenů nízká (běžně u zvířat), fytoestrogeny se spolu s nimi váží na příslušné receptory. Je-li hladina steroidních estrogenů vysoká (běžně u žen), působí fytoestrogeny antagonisticky (jako antiestrogeny) [14]. Isoflavony vykazují kromě estrogenní aktivity také poměrně značnou antioxidační aktivitu, která však vyžaduje přítomnost dvou hydroxylových skupin (na C-7 a C4), jako má daidzein, který je proto nejaktivnějším oxidantem. Aktivita aglykonů je vyšší než aktivita glykosidů, obecně však isoflavony vykazují nižší antioxidační aktivitu než odpovídající flavony. Isoflavony jsou hlavní měrou zodpovědné také za svíravou a hořkou chuť sójových výrobků [14]. 1.4 METABOLISMUS FYTOESTROGENŮ Schopnost produkovat metabolity fytoestrogenů závisí na kolonizaci střeva určitými bakteriálními kmeny, které jsou však přítomny pouze asi u 30–50 % lidské populace [20, 21, 22, 23, 24]. U zvířat je však schopnost produkovat tyto metabolity běžná [25]. Potraviny živočišného původu tedy mohou v podobě tzv. funkční potraviny představovat zdroj metabolitů fytoestrogennů pro humánní výživu, především pak ekvolu (metabolitu daidzeinu), který vykazuje významné biologické účinky [26]. Metabolismus fytoestrogenů u zvířat a člověka je blíže popsán níže. 1.4.1
U zvířat
Metabolismus fytoestrogenů byl poměrně dobře popsán u různých druhů zvířat včetně ovcí a skotu [10]. V průběhu trávení přijaté rostlinné potravy jsou daidzein
8
a genistein přeměňovány bachorovými mikroorganismy na ekvol a p-ethylfenol (Obr. 1) [27]. Metabolit p-ethylfenol je biologicky neaktivní [10] a ekvol naopak vykazuje značné estrogenní účinky [28]. Také dva prekurzory isoflavonů přítomné v červeném jeteli, jmenovitě biochanin A a formononetin (Obr. 1) [29], jsou metabolizovány v bachoru přežvýkavců na genistein resp. daidzein. Formononetin v bachoru přežvýkavců (stejně i při silážování krmiv a v zažívacím traktu člověka, neboť se nachází také v moči žen po konzumaci výrobků ze sóje) přechází působením bakterií po hydrolýze cukru na aglykon a dále via daidzein na estrogenní produkt ekvol (7,4dihydroxyisoflavan). Z ekvolu vzniká částečně O-demethylangolensin (O-DMA). Jako vedlejší produkt vzniká z formononetinu angolensin a 4-methylekvol, ze kterého vzniká vedlejší cestou ekvol. Ekvolu vzniká zhruba 70 %, z 5-20 % se tvoří O-demethylangolensin, minoritním produktem je 4-methylekvol a angolensin. Biochanin A se rozkládá na genistein, ten na dihydrogenistein, z něhož vzniká 4ethylfenol a další jednoduché produkty. Tyto sloučeniny se vylučují močí [14].
Obr. 1: Isoflavony a jejich metabolity [19] Mnoho studií u zvířat, zahrnujících myši, krysy, křečky, krávy, prasata, ovce, psy, opice a šimpanze [25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37] naznačily, že všechna zvířata mají schopnost produkovat ekvol. Málo studií hodnotilo u zvířat produkci O-DMA, jako je tomu u lidí. Např. v několika studiích [30, 34, 38] měřili produkci O-DMA v plazmě, výkalech a moči opic a šimpanzů, ale zdá se, že je produkován ve výrazně menším množství než ekvol [34]. 1.4.2
U člověka
Biologická aktivita fytoestrogenů u člověka není doposud plně známa, ale jednotlivé glykosidy zcela jistě nejsou estrogenně aktivní [19]. Glykosidy jsou rychle hydrolyzovány na estrogen-aktivní aglykony, buď jako výsledek výroby a přípravy sójových potravin nebo jako výsledek metabolismu střevní mikroflóry
9
[16]. Genistein je dále metabolizován ve střevě na neaktivní p-ethylfenol, a daidzein na ekvol, dihydrodaidzein a O-DMA [39]. Metabolit daidzeinu ekvol, může mít významné biologické účinky, má vysokou antioxidační aktivitu v porovnání s jinými fytoestrogeny a je často přítomen ve vysoké koncentraci v krvi a moči lidí. Metabolická cesta je shrnuta v obrázku 2 [26].
Obr. 2: Absorpce, metabolismus a exkrece isoflavonoidů [26] Ačkoliv fytoestrogeny mohou být měřeny v moči, plasmě, výkalech, spermatu, žluči, slinách a mateřském mléku, koncentrace jejich metabolitů se velmi liší mezi jednotlivci dokonce i po regulování kvantity potravinových doplňků [40]. Je to díky mnoha faktorům, jako např. střevní mikroflóra, užívání antibiotik, střevní onemocnění, odlišné pohlaví a doprovodný dietní příjem [20, 41, 42]. Mnohé studie prokázaly značné rozdíly mezi jednotlivci, přibližně 30-50 % populace je schopno produkovat z daidzeinu ekvol [20, 21, 22, 23, 24] a přibližně 80-90 % O-DMA [22, 24, 43]. Zvláštní skupinu tvoří malé děti s nedostatečně vyvinutou střevní mikroflórou, které nejsou schopny produkovat z daidzeinu ekvol ani O-DMA [44, 45].
10
Metabolismus daidzeinu může být snadno ovlivnitelný mnoha bakteriemi, např. Clostridium sp. [46] a Eubacterium ramulus [47, 48] metabolizujícími daidzein na O-DMA in vitro. Dále ekvol může být nalezen v sójovém mléku fermentovaném některými druhy Bifidobacterií [49]. Také další bakterie, jako Escherichia coli, Bacteroides ovatus, Ruminococcus productus a Streptococcus intermedius [50] mohou ovlivnit metabolismus daidzeinu. Nicméně, lidské střevní bakterie zodpovědné za metabolismus daidzeinu nebyly doposud zcela identifikovány. 1.5 SHRNUTÍ POZNATKŮ A ZÁVĚR Jak již bylo v literárním přehledu uvedeno, rozsáhlý intenzívní výzkum účinku isoflavonů na zdraví člověka prováděný v posledních desetiletích se zabýval rozličnými farmakologickými a antioxidačními vlastnostmi těchto složek [1, 2, 3, 4, 5, 51, 52, 53]. Účinek isoflavonů však není stále jednoznačný. Podle posledních zjištění se ukazuje, že účinnost isoflavonů přinejmenším z části závisí na schopnosti přeměňovat daidzein na ekvol [10]. V publikovaných studiích in vitro bylo prokázáno, že ekvol má významné biologické účinky [26] a je více bioaktivní než jeho zdrojová forma daidzein má vyšší estrogenicitu [54, 55], je účinnější antioxidant [56, 57] a vykazuje antiandrogenní vlastnosti [58]. Kromě toho, ekvol má vyšší hladiny volné efektivní frakce cirkulující v humánním séru [59] a pomalejší odbourávání v plazmě ve srovnání s daidzeinem [60]. Jak již bylo uvedeno dříve, schopnost přeměňovat daidzein na ekvol u člověka závisí na kolonizaci střeva určitými bakteriálními kmeny, které jsou však přítomny pouze asi u 30–40 % lidské populace (tzv. producenti ekvolu) [20, 21, 22, 23, 24]. Jako alternativní strategie, která by umožnila i zbývající části populace, tzv. neproducentům ekvolu, využívat zdraví prospěšné účinky ekvolu se jeví jeho orální podávání. Ačkoli již byly izolovány bakteriální kmeny podílející se na přeměně daidzeinu na ekvol [49, 50, 61, 62] a v zahraničí je již komerčně dostupný preparát obsahující ekvol vyrobený pomocí bakterie Lactococcus garvieae (SE5-OH), je možné jako potenciální zdroj ekvolu využít i některých potravin živočišného původu, protože na rozdíl od člověka, u zvířat je schopnost produkovat ekvol po příjmu isoflavonů běžná [25]. I když bylo zjištěno, že fytoestrogenní látky, zejména ekvol a daidzein mohou být distribuovány do různých tkání těl přežvýkavců, kravské mléko je pravděpodobně nejvhodnější potravinou živočišného původu, která může být cíleně upravena tak, aby mohla být potenciálním zdrojem ekvolu pro humánní výživu v podobě tzv. funkční potraviny. Zdrojem ekvolu v kravském mléce v našich podmínkách mohou být již zmíněné krmné komponenty z jetele červeného (Trifolium pratense) nebo ze sóje luštinaté (Glycine max (L.) Merr.) [13, 63, 64]. Hladina ekvolu v mléce krav krmených jetelem červeným se může pohybovat od 14 do 643 μg/l v závislosti na příjmu isoflavonů z krmné dávky [65, 66, 67, 68, 69]. Při zkrmování sójových komponent jsou dosahovány mnohem nižší hladiny ekvolu v mléce a to v rozmezí 14 až 77 μg/l [Křížová a kol. (nepublikovaná data), 70], odpovídající a úměrné příjmu (podílu) sójových komponent v krmné dávce dojnic. Např. jetel červený je hojně využíván 11
v ekologických chovech, v mléce produkovaném na ekologických farmách můžeme tedy očekávat vyšší hladiny isoflavonů, zvláště pak ekvolu, ve srovnání s mlékem z chovů konvenčních [67, 68, 71], kde je jako zdroj isoflavonů využívána sója nebo produkty z ní. Počet studií zaměřených na problematiku sójových isoflavonů je omezený a doposud rovněž nebyla dostatečně popsána ani kvantitativní stránka prostupu sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic a následně až do mléčných výrobků. Z tohoto pohledu byla tato dizertační práce zaměřena na zmapování prostupu fytoestrogenů do mléka a mléčných výrobků, u dojnic krmených krmnou dávkou cíleně obohacenou o fytoestrogeny, s důrazem na ekvol.
12
2 CÍL PRÁCE Cílem této dizertační práce bylo vypracování návrhů, realizace a vyhodnocení dvou experimentů na laktujících dojnicích: Fyziologický experiment (Exp. 1) byl tvořen kontrolní (skupina K) a pokusnou skupinou (skupina S) dojnic. Krmná dávka pokusných zvířat byla v tomto experimentu, v případě skupiny K, bez obsahu sójových fytoestrogenů, zatím co v případě skupiny S byla cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních látek ve formě extrudované plnotučné sóji. Poloprovozní experiment (Exp. 2) byl tvořen kontrolní (skupina K) a pokusnou skupinou (skupina E) dojnic. Krmná dávka pokusných zvířat byla v tomto experimentu, v případě skupiny K, bez obsahu sójových fytoestrogenů, zatím co v případě skupiny E byla cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních látek ve formě doplňku 40% sójového extraktu. Na základě vypracovaných návrhů byly oba experimenty provedeny, za současného zajištění správného dávkování pokusné složky do krmné dávky a její následný příjem pokusnými zvířaty. Během realizace obou experimentů byly průběžně odebírány vzorky krmiv a mléka a bylo zajištěno jejich prvotní zpracování. Vzorky krmiv byly následně použity na stanovení obsahu základních živin. Stanovení obsahu fytoestrogenů v krmivu byl zajištěn Vysokou školou chemickotechnologickou v Praze. Vzorky mléka byly použity na stanovení obsahu základních složek ve spolupráci s Československou společností chovatelů, a.s. (laboratoří pro rozbory mléka, Brno). Technologické zpracování mléka bylo provedeno společností MILCOM a.s., Praha. Stanovení obsahu fytoestrogenů a jejich metabolitů v mléku a mlékárenských výrobků během technologického zpracování byl zajištěn Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze. Všechny výsledky k oběma experimentům byly následně zpracovány v souvislosti se zmapováním prostupu fytoestrogenních látek metabolismem pokusných zvířat (laktujících dojnic) do mléka a následně i mléčných výrobků a vyhodnoceny v rámci této dizertační práce.
13
3
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Tato dizertační práce byla zaměřena na zmapování exprese fytoestrogenů z krmiva do mléka a mléčných výrobků prostřednictvím fyziologického (Exp. 1) a poloprovozního (Exp. 2) experimentu na laktujících dojnicích. Krmná dávka dojnic byla, u pokusných skupin dojnic, cíleně obohacena zdrojem fytoestrogenních látek ve formě extrudované plnotučné sóji (v případě Exp. 1, ve skupině S) či 40% extraktu sójových isoflavonů (v případě Exp. 2, ve skupině E). Práce byla vypracována ve spolupráci s Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Rapotín v rámci projektu Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, jehož poskytovatelem je Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT, Projekt č. 2B08073) a dále pak ve spolupráci s Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze a společností MILCOM a.s., Praha, partnery řešitelského týmu projektu. 3.1 FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1) Experiment byl proveden na 4 laktujících dojnicích Holštýnského plemene s ruminální kanylou, s průměrnou užitkovostí 18,5 ±1,7 kg/d, které byly rozděleny do dvou skupin po 2 kusech – kontrolní skupina (skupina K) a pokusná skupina (skupina S). Experiment probíhal ve 2 periodách, každá v délce 14 dní s rotací. Každá perioda byla tvořena přípravným obdobím (10 dní) a experimentálním obdobím (4 dny). V 1. periodě byly dojnice č. 1 a 2 v kontrolní skupině (skupina K) a dojnice č. 3 a 4 ve skupině pokusné (skupině S), v následující periodě se úroveň pokusného faktoru vyměnila. Dojnice byly krmeny krmnou dávkou složenou z kukuřičné siláže (63,3 %), vojtěškového sena (11,5 %) a doplňkové krmné směsi (25,2 %). Doplňková krmná směs pro kontrolní skupinu (skupina K) byla tvořena extrahovaným řepkovým šrotem (28,2 % doplňkové krmné směsi), zatímco doplňková krmná směs pro pokusnou skupinu (skupina S) byla cíleně obohacena o zdroj fytoestrogenů extrudovanou plnotučnou sóju (33,6 % z doplňkové krmné směsi). Krmná dávka byla propočtena tak, aby denní příjem fytoestrogenů u jednotlivých dojnic byl stejný. Před zahájením vlastního experimentu byl proveden návyk na daný typ krmné dávky v délce 1 týdne. 3.2 POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2) Experiment byl proveden na farmě soukromého zemědělce, Lenky Tesařové v Míšovicích, na 12 laktujících dojnicích (1. – 5. laktace, 26. týden laktace) s průměrnou užitkovostí 22,7 3,04 kg/d, které byly rozděleny do dvou skupin po 6 kusech – kontrolní skupina (skupina K) a pokusná skupina (skupina E), podle užitkovosti tak, aby průměrná užitkovost ve skupinách byla obdobná. Experiment probíhal ve 2 periodách, každá v délce 11 dní s rotací. Každá perioda byla tvořena přípravným obdobím (7 dní) a experimentálním obdobím (4 dny). V 1. periodě byly dojnice č. 1 až 6 v kontrolní skupině a dojnice č. 7 až 12 ve skupině pokusné, 14
v následující periodě se úroveň pokusného faktoru vyměnila. Dojnice byly vazně ustájeny a individuálně krmeny krmnou dávkou složenou z kukuřičné siláže, vojtěškového sena a doplňkové krmné směsi. Doplňková krmná směs pro kontrolní skupinu (skupina K) neobsahovala sójové komponenty, zatímco směs pro pokusnou skupinu (skupina E) obsahovala 40% extrakt sójových isoflavonů (Soybean isoflavones, Vita-Solar Biotechnology Co., Ltd., Čína) v množství 2,4 g/kg doplňkové krmné směsi (tj. počítáno na denní příjem 3 g isoflavonů). Před zahájením vlastního experimentu byl proveden návyk na daný typ krmné dávky v délce 1 týdne.
15
4
VÝSLEDKY A DISKUSE
V rámci této dizertační práce byly zpracovány výsledky dvou experimentů, fyziologický (Exp. 1) a poloprovozní (Exp. 2) experiment, provedených v rámci projektu č. 2B08073 Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, který byl za podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT) řešen v letech 2008-2011, ve spolupráci tří výzkumných pracovišť, jejichž role byla následující: Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín – koordinátor projektu, jehož úkolem byla příprava metodik a vlastní provádění experimentů na dojnicích, odběry a prvotní zpracování vzorků pro všechny účastníky projektu, základní analýzy krmiv, zbytků krmiv, mléka, bachorové tekutiny, krevní plazmy, výkalů a moči, statistické vyhodnocení experimentů a interpretace zjištěných výsledků. MILCOM a.s., Praha – účastník projektu, se podílel na přípravě metodik experimentů na dojnicích, jehož hlavním úkolem bylo technologické zpracování mléka na sýry s nízkodohřívanou sýřeninou a jogurty, odběr a prvotní zpracování vzorků během technologického zpracování, vyhodnocení průběhu technologického zpracování mléka a také podíl na interpretaci zjištěných výsledků. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze – účastník projektu, se podílela na přípravě metodik experimentů na dojnicích, jehož hlavním úkolem byly analýzy výše uvedených vzorků na obsah fytoestrogenních látek a také podíl na interpretaci zjištěných výsledků. Výsledky prezentované v této dizertační práci byly tedy řešeny s využitím dostupných metod a přístrojů pod Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, ve spolupráci s Vysokou školou chemicko-technologickou v Praze a společností MILCOM a.s., Praha. 4.1 FYZIOLOGICKÝ EXPERIMENT (EXP. 1) V rámci fyziologického experimentu byl u pokusných zvířat sledován příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka. Dále byla vypočtena zdánlivá návranost isoflavonů, která určuje míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka pokusných zvířat. Změny v obsahu isoflavonů byly sledovány během technologické zpracování mléka, tedy v mléku syrovém/odsředěném, smetaně, plnotučném mléku před/po pasteraci, jogurtu po výrobě/na konci skladování, syrovátce a sýru po výrobě/na konci zrání. 4.1.1
Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka
Příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů je uveden v tabulce 2. Příjem sušiny, popele, dusíkatých látek, tuku a NEL ve skupině K byl
16
nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05). Celkový denní příjem hrubé vlákniny, NDF a ADF nebyl pokusným zásahem ovlivněn (P0,05). Tab. 2: Průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S) Ukazatel Jednotky Sušina kg/d Příjem živin Popel kg/d CF kg/d NDF kg/d ADF kg/d NL kg/d Tuk kg/d NEL MJ/d Příjem isoflavonů Daidzein mg/d Genistein mg/d Glycitein mg/d CELKEM mg/d
K 16,8*
S 17,8*
SEM 0,21
1,2* 3,0 5,9 3,3 9,5* 0,5* 97,2*
1,4* 3,1 6,2 3,4 10,7* 0,6* 103,7*
0,02 0,06 0,11 0,06 0,23 0,01 1,52
1,0* 0,8* 1,0* 2,9*
438,7* 681,8* 164,2* 1284,7*
7,62 11,44 5,18 24,24
CF (Crude fiber) – hrubá vláknina; NDF (neutral detergent fibre) – neutrálně detergentní vláknina; ADF (Acid detergent fibre) – acidodetergentní vláknina; NL – dusíkaté látky; NEL (Net energy of lactation) – netto energie laktace; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05
Široká škála sójových produktů, hojně využívaná k výživě laktujících dojnic, je považována za zdroj vysoce kvalitního proteinu a energie [7]. Sójové produkty jsou však bohaté také na obsah isoflavonů, jejichž koncentrace se v těchto produktech pohybuje v rozmezí 1,2-4,2 mg/g sušiny [72, 73]. Extrudovaná plnotučná sója použitá v tomto experimentu obsahovala 377,9 mg/kg daidzeinu, 558,2 mg/kg genisteinu a 129,6 mg/kg glyciteinu, tj. celkem 1065,7 mg/kg isoflavonů. Naše hodnoty se pohybují na dolní hranici výše uvedeného rozmezí, ale v porovnání s prací Třináctý a kol. [74], který provedl ve své studii experiment se stejným typem krmiva, byly námi zjištěné koncentrace isoflavonů vyšší. V literatuře však bylo prokázáno, že obsah isoflavonů v sóji je variabilní v závislosti na kultivaru, růstu, environmentálních faktorech, stresových podmínkách, skladování a následném zpracování [70, 75, 76]. 17
Denní příjem daidzeinu, genisteinu a glyciteinu byl, dle předpokladu, ve skupině K nižší ve srovnání s pokusnou skupinou S (P<0,05). Denní příjem celkových isoflavonů ve skupině K byl zanedbatelný (2,9 mg/d), zatímco ve skupině S činil 1284,7 mg/d. Avšak v porovnání s prací Třináctý a kol. [74], celkový denní příjem isoflavonů u skupiny S byl v našem experimentu nižší, což může být způsobeno nižším poměrem extrudované plnotučné sóji v krmivu. Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce je uvedena v tabulce 3. Mléčná užitkovost ve skupině K byla nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05), užitkovost dojnic vyjádřená ve 4% FCM však nebyla pokusným zásahem ovlivněna (P0,05). Obsah tuku v mléce byl obdobný v obou skupinách, ve skupině K i skupině S (P0,05). Obsah bílkovin a kaseinu byl ve skupině K vyšší ve srovnání s pokusnou skupinou S (P<0,05). Naopak, obsah laktózy a močoviny byl ve skupině K nižší než ve skupině S (P<0,05). Tab. 3: Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S) Ukazatel K Jednotky Mléčná užitkovost Dojivost kg/d 17,6* 4% FCM kg/d 19,0 Tuk g/kg 45,1 Bílkovina g/kg 36,5* Kasein g/kg 29,1* Laktóza g/kg 46,5* Močovina mg/100 ml 16,5* Produkce složek mléka Tuk g/d 798 Bílkovina g/d 639 Kasein g/d 508 Laktóza g/d 816* Koncentrace isoflavonů v mléce Daidzein µg/l 36,5 Genistein µg/l 170,6 Glycitein µg/l 23,4*** Ekvol µg/l 3,6***
18
S
SEM
19,5* 20,9 44,9 34,4* 27,4* 47,9* 19,4*
0,48 0,68 1,05 0,19 0,15 0,21 0,49
872 672 534 934*
32,90 16,44 13,04 23,68
40,3 175,8 27,9*** 15,6***
1,88 8,36 0,77 1,08
Ukazatel Jednotky CELKEM µg/l Produkce isoflavonů v mléce Daidzein µg/d Genistein µg/d Glycitein µg/d Ekvol µg/d CELKEM µg/d
K 234,1
S 259,6
SEM 9,88
643,9* 3008,6 417,1*** 65,2*** 4134,8**
776,9* 3396,2 543,2*** 305,5*** 5021,8**
33,72 144,37 19,58 21,92 219,59
FCM (= Fat-corrected milk) mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství tuku, tj. 4%; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001
Ačkoliv mléčná užitkovost ve skupině K byla signifikantně nižší v porovnání se skupinou S, mléčná užitkovost vyjádřená ve 4% FCM naznačovala pouze trend k nižším hodnotám. Námi zjištěné výsledky jsou v souladu s prací Kudrna a Marounek [77] nebo Komprda a kol. [78], kteří také ve svých studiích nezaznamenali rozdíl v mléčné užitkovosti u dojnic krmených řepkovým šrotem v porovnání s extrudovanou plnotučnou sóju. Vzhledem k dosažené rozdílné užitkovosti v obou skupinách (ve skupině K i skupině S), nebyl zjištěn průkazný rozdíl u denní produkce tuku, proteinu a kaseinu (P0,05). Denní produkce laktózy byla ve skupině K nižší ve srovnání se skupinou S (P<0,05). Rozdíl v koncentraci isoflavonů (daidzeinu a genisteinu) v mléce mezi skupinou K a skupinou S nebyl průkazný (P>0,05), numericky vyšší hodnoty u skupiny S byly však zaznamenány, jak u daidzeinu (36,5 vs. 40,3 g/l), tak i u genisteinu (170,6 vs. 175,8 g/l). Naproti tomu, denní produkce daidzeinu byla průkazně nižší ve skupině K v porovnání se skupinou S (P<0,05) a tentence k vyšším hodnotám u skupiny S byla zaznamenána také u genisteinu. Koncentrace glyciteinu a ekvolu v mléce, stejně tak i denní produkce těchto složek, byla ve skupině K nižší než ve skupině S (P<0,001). Ačkoliv celková koncentrace isoflavonů v mléce nebyla signifikantní, pouze tendence k vyšším hodnotám ve skupině S (P=0,08), denní produkce isoflavonů byla ve skupině K průkazně nižší (4134,9 g/d) než ve skupině S (5021,8 g/d, P<0,01). Koncentrace isoflavonů v mléce je v souladu s publikací Třináctý a kol. [74]. Nicméně, na základě předchozích studií, koncentrace ekvolu byla nižší, než bylo předpokládano. Možným vysvětlením těchto rozdílů by mohly být degradační změny probíhající v bachoru. Metabolická aktivita ananerobních bakterií bachoru je velmi závislá na změně pH, redoxním potenciálu, anaerobních podmínkách a teplotě uvnitř bachoru [79, 80, 81], proto např. tyto faktory společně se způsobenými rozdíly v technologické úpravě sóji mohou ovlivnit úroveň degradace isoflavonů v bachoru. Nízká hladina isoflavonů v mléce byla detekována, stejně jako
19
v předchozí studii Třináctý a kol. [74], také u kontrolní skupiny (skupiny K), ačkoliv celkový příjem isoflavonů v této skupině byl velmi nízký (pouze 2,9 mg/d). Jak již bylo však uvedeno dříve, složení mikrobiální populace bachoru je velice široké, v bachoru jsou tři skupiny mikroorganismů (bakterie, prvoci a houby), přičemž počet bakteriálních druhů dosahuje hodnot 300-400 [82], a je závislé na mnoha faktorech. V tomto případě, v závislosti na dlouhodobém podávání standardní krmné dávky dojnicím, před provedením experimentu, mohlo dojít k selekci určitého druhu mikroorganismů, které zapříčinily zvýšený nárůst isoflavonů v mléce i na úkor nízkého příjmu. Podobná zjištění (výskyt isoflavonů v mléce při zanedbatelném dietárním příjmu isoflavonů) však byla zmíněna i v jiných pracech [65, 74, 83]. 4.1.2
Zdánlivá návratnost isoflavonů
V tabulce 4 je vypočtena tzv. apparent recovery (tj. zdánlivá návratnost) určující míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic obou skupin. Zdánlivá návratnost daidzenu, genisteinu a glyciteinu ve skupině K se pohybovala v řádu stovek až tisíců, zatímco ve skupině S dosahovala velmi nízkých hodnot (P<0,001). Podobné výsledky byly však zaznamenány také v již dříve publikovaných studiích [65, 66, 84], které se zabývaly zdánlivou návraností fytoestrogenů z červeného jetele. Steinshamn a kol. [66] potvrdil, že míra prostupu isoflavonů z krmiva do mléka je vyšší při nízkém příjmu než při vyšším příjmu celkových isoflavonů. Tab. 4: Zdánlivá návratnost isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S) Ukazatel Návratnost daidzeinu Návratnost genisteinu Návratnost glyciteinu
Jednotky µg/mg µg/mg µg/mg
K 670,7*** 3568,5*** 393,5***
S 2,5*** 5,0*** 3,9***
SEM 26,07 160,79 13,00
SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; *** hodnoty se průkazně liší P<0,001
4.1.3
Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka
V předchozích letech bylo publikováno několik studií zabývajících se sledováním koncentrace isoflavonů v různých rostlinách a potravinách rostlinného původu [85, 86, 87, 88]. Nicméně, studií zabývajících se prostupem isoflavonů z krmiva do mléka laktujících dojnic je poměrně málo, většina z těchto prací používá, jako zdroj isoflavonů, krmiva z jetele červeného nebo bílého. Bylo zjištěno, že obsah isoflavonů v mléce kolísá v závislosti na mnoha faktorech, kterými jsou mimo jiné složení krmné dávky nebo roční období. Tak např. koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmnou dávkou založenou na červeném jeteli se může pohybovat v rozmezí 14-643 g/l, v závislosti na příjmu isoflavonů [12, 65, 66, 67, 68, 71], 20
zatímco koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmivem sójového původu byla 55 g/l [74]. Nebo např. koncentrace ekvolu v mléku dojnic krmených krmnou dávkou založenou na různé zralosti či počtu sklizně u červeného jetele se může pohybovat v rozmezí hodnot 458-643 g/l [65]. King s kol. [12] také zaznamenal rozdílné koncentrace ekvolu (45-293 g/l) ve vzorcích mléka z několika různých australských farem, přičemž nejvyšší hodnoty byly ve vzorku ze západní austrálie, odebraného na jaře, když dominantní část pastvy tvoří na isoflavony bohatý jetel. Obsah isoflavonů ve vzorcích mléka odebraných během technologického zpracování je znázorněn na obrázku 3. Obsah celkových isoflavonů v mléce syrovém 47,6 g/l, odstředěném 43,5 g/l a smetaně 49,4 g/l ve skupině K byl obdobný, jako u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (skupina S; 45,4 g/l v mléce syrovém, 50,2 g/l v mléce odstředěném a 47,7 g/l ve smetaně). Pozn.: Statistické hodnocení u dat získaných během technologického zpracování mléka nebylo provedeno, protože byly získány pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).
Obr. 3: Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Publikovaných dat vztahujících se k obsahu isoflavonů v mléčných produktech je nedostatek, ale např. Kuhnle s kol. [89] analyzoval 115 vzorků potravin živočišného původu a jim odpovídající vegetariánské náhražky na obsah celkových fytoestrogenů a ekvolu. Na základě této studie byl zjištěn nízký obsah isoflavonů a ekvolu ve všech vzorcích mléka a komerčně dostupných mléčných výrobcích
21
s vyjímkou másla, ve kterém ekvol nebyl zjištěn. Celkový obsah isoflavonů v jejich studii u syrového a odstředěného mléka, smetany a jogurtu byla značně nižší než koncentrace isoflavonů sledovaná v našem experimentu u kontrolní skupiny (skupina K). Avšak koncentrace ekvolu v produktech sledovaných v jejich studii byla vyšší v porovnání s kontrolní skupinou (skupina K), ale naopak nižší než u pokusné skupiny (skupina S), v tomto experimentu. Na obrázku 4-5 je uveden vliv tepelného ošetření mléka (pasterace mléka), výroby a skladování jogurtů. Na základě předchozích studií bylo potvrzeno, že isoflavony nejsou tepelně labilní, tedy že nepodléhají rozkladu vlivem tepelného zpracování, ale mohou vlivem vysokých teplot přecházet v jiné formy [90, 91, 92]. Ztráty isoflavonů zaznamenané během tepelného zpracování byly často přisuzovány ztrátám způsobeným uvolnění isoflavonů např. do vody, ve kterém byla daná potravina vařena [16, 90, 91, 93, 94].
Obr. 4: Vliv pasterace mléka na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Pasterizace, která v tomto experimentu probíhala při 65 °C po dobu 30 min., neměla žádný vliv na jednotlivé isoflavony ani ve skupině K či skupině S. Podobné výsledky publikovali King a kol. [12] pro ekvol a genistein v mléku dojnic krmených červeným jetelem po pasterizaci, ačkoliv v publikaci nebyly blíže specifikovány podmínky pasterizace. Také Uzzan a kol. [92] a autoři Uzzan a Labuza [95] neshledali žádný vliv na obsah daidzeinu, genisteinu a glyciteinu v isoflavony obohaceném mléce při záhřevu na 72, 121, 140 a 140 °C po dobu 120, 24, 2 a resp. 20 sec. 22
V průběhu fermentace jogurtovou kulturou byl zaznamenán pokles v pH u obou sledovaných skupin, u skupiny K i skupiny S (z 6,55 na 4,18 resp. z 6,53 na 4,20). Pokles pH byl totožný v obou skupinách. V dostupné literatuře nebyla nalezena studie sledující změny obsahu isoflavonů během fermentace a skladování isoflavony obohacené mléčné produkty. V několika studiích [49, 92, 96] byl však sledován vliv fermentace na sójové produkty s odlišnými kmeny bakterií a vliv následného skladování fermentačních produktů především se zaměřením na -glukosidázovou aktivitu sledovaných bakteriálních kmenů a zhodnocením konverze isoflavonových glukosidů na aglykony, které jsou u člověka mnohem rychleji absorbovány a to ve větším množství než isoflavonové glykosidy [97]. V této studii celková koncentrace isoflavonů v jogurtu po záhřevu na 37 °C po dobu fermentace 16-18 h poklesla z 239,6 na 239,2 g/l u skupiny K, zatímco u skupiny S byl zaznamenán pokles z 246,5 na 237,2 g/l. Tyto závěry jsou v souladu s dalšími studiemi Chen a kol. [96], Tsangalis a kol. [49] nebo King a Bignell [98], kteří uvedli, že ztráty v celkovém obsahu isoflavonů jsou způsobeny hydrolytickým odštěpením glukosy z glukosidů, které přispívají k množství isoflavonů, jako glukosidové formy. Podobně, Tsangalis s kol. [49] zaznamenal signifikantní ztráty v obsahu celkových isoflavonů během fermenatce sójového mléka, kde došlo pouze k enzymatické hydrolýze glukosidů isoflavonů. Koncentrace ekvolu během fermentace mírně vzrostly u obou sledovaných skupin (ze 4 na 6 g/l u skupiny K a z 26,7 na 26,8 g/l u skupiny S). I když dostupných dat k objasnění tohoto jevu je nedostatek, nedávné studie prokázaly, že ekvol se může ve fermentovaných produktech vyskytovat, jako výsledek fermentace několika bakterálních kmenů. Např. Tsangalis a kol. [49] zaznamenali ekvol v sójovém mléce fermentovaném Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium longum-a a Bifidobacterium animalis. V této studii, jogurtové kultury pravděpodobně přispěly ke zvýšení koncentrace ekvolu přeměnou daidzeinu na ekvol. Koncentrace isoflavonů po jednoměsíčním skladování jogurtu mírně poklesla v obou skupinách (z 239,2 na 236,4 g/l u skupiny K, z 237,2 na 231,1 g/l u skupiny S). Podobné výsledky byly publikovány skupinou Otieno a kol. [99] pro sójové mléko fermentované Bifidobacterium animalis a skladované 8 týdnů při 4 °C. Tento pokles je způsoben pravděpodobně rozkladnými reakcemi glukosidů isoflavonů (daidzin, genistin a glycitin), které nejsou během skladování stabilní, na aglykony (daidzein, genistein a glycitein) a následně vznikem jejich metabolitů [100]. Genistein je metabolizován na 6'-hydroxy-O-desmethylalgolensin, 2,4,6trihydroxybenzoovou kyselinu a p-ethylfenol, zatímco hlavními metabolity daidzeinu jsou O-desmethylalgolensin a ekvol [101, 102].
23
Obr. 5: Vliv výroby a skladování jogurtu na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Vliv výroby a zrání sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na obsah jednotlivých isoflavonů je znázorněn na obrázku 6. Z celkového množství 5 kg pasterizovaného mléka, použitého pro výrobu sýra, bylo připraveno 0,68 kg ve skupině K a 0,67 kg sýra ve skupině S. Sýr po výrobě obsahoval 576,0 a 581,9 g/kg sušiny a 14,4 a 14,3 g/kg solí (pro skupinu K resp. skupinu S). Koncentrace jednotlivých isoflavonů (daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu) v syrovátce byla 43,3; 156,4; 12,1 a 4,3 g/l ve skupině K a 42,3; 151,2; 13,2 a 11,3 g/l ve skupině S. Celková koncentrace isoflavonů v syrovátce pak byla 216,1 vs. 218 g/l (u skupiny K vs. skupiny S). Poměrně vysoká koncentrace isoflavonů v syrovátce však odpovídá výsledkům z dostupné literatury, které potvrzují, že i isoflavony během zpracování sóji přechází alespoň částečně do syrovátky nebo melasy, které mohou být dalším využitelným zdrojem bohatým na isoflavony [91, 103]. Během srážení bílkovin mléka byl zaznamenán pokles pH z původních 6,44 a 6,42 (pH mléka před srážením) na 6,08 a 6,10 (pH sýra po zpracování) u skupiny K a skupiny S. Hodnoty pH sýra stanovené na začátku (1 den) a na konci (90 den) zrání bylo 5,17 a 5,40 u skupiny K a 5,20 a 5,35 u skupiny S, v tomto pořadí. Změna pH byla patrná u obou skupin (u skupiny K i skupiny S). Vzhledem k tomu, že nebyly v dostupné literatuře dohledány studie, které by se zabývaly vlivem zpracování a zrání sýrů na koncentraci isoflavonů, diskuse těchto výsledků byla velice obtížná. Nicméně, např. Kuhnle a kol. [89] uvádí, že koncentrace celkových isoflavonů u 27 odlišných typů sýra vyrobeného různými výrobci se pohybovala
24
v rozmezí 1-17 g/100 g a koncentrace ekvolu 1-14 g/100 g, což je srovnatelné s výsledky v této dizertační práci. Během 90 dnů zrání došlo k vyššímu poklesu koncentrace celkových isoflavonů u skupiny K (z 98,7 na 54,1 mg/kg; tedy cca o 45 %) v porovnání se skupinou S (ze 78,1 na 54,6 mg/kg; tedy cca o 30 %). Ačkoliv ztráty isoflavonů během zrání byly u obou skupin poměrně vysoké (daidzein cca o 44 vs. 33 %, genistein cca o 48 vs. 27 %, glycitein cca o 43 vs. 25 % a ekvol cca o 46 vs. 34 %, pro skupinu K vs. skupinu S), koncentrace jednotlivých isoflavonů, především pak ekvolu, jsou v isoflavony obohacených sýrech stále vysoké (16 mg/kg ve skupině S) a mohou být zdrojem ekvolu v lidské výživě.
Obr. 6: Vliv výroby a zrání sýra na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), S u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem extrudované plnotučné sóji (pokusná skupina, skupina S); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Výsledky fyziologického experimentu, které vznikly ve spolupráci Výzkumného ústavu pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, Vysoké školy chemicko-technologické v Praze a společností MILCOM a.s., Praha, v rámci projektu Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování, jehož poskytovatelem je Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky (MŠMT, Projekt č. 2B08073) byly publikovány formou recenzovaných vědeckých článků [104, 105].
25
4.2 POLOPROVOZNÍ EXPERIMENT (EXP. 2) V rámci poloprovozního experimentu byl u pokusných zvířat sledován příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka. Dále byla vypočtena zdánlivá návranost isoflavonů, která určuje míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka pokusných zvířat. Změny v obsahu isoflavonů byly sledovány během technologické zpracování mléka, tedy v mléku syrovém/odsředěném, smetaně, plnotučném mléku před/po pasteraci, jogurtu po výrobě/na konci skladování, syrovátce a sýru po výrobě/na konci zrání. 4.2.1
Příjem živin, mléčná užitkovost a složení mléka
Z doposud publikované literatury bylo zjištěno že, absorpce, biotransformace, metabolismus a biologická dostupnost isoflavonů je závislá na několika faktorech, např. na imunologickém stavu, stádiu gravidity či aktuálních podmínkách v trávicím traktu. Podle studií Cohen a kol. [106] či Nielsen a Williamson [107] absorpce a biologická dostupnost isoflavonů u člověka závisí na složení střevní mikroflóry, době zdržení v zažívacím traktu, obsahu vlákniny aj. Stejné faktory však ovlivňují také absorpci, biotransformaci a metabolismus isoflavonů u pokusných zvířat. Například složení mikrobiální populace bachoru je velice široké, v bachoru se vyskytují tři skupiny mikroorganismů (jak bakterie, prvoci, tak i houby), přičemž počet bakteriálních druhů dosahuje hodnot 300-400 [82] a je závislé na mnoha dalších faktorech. Několik předchozích studií také dokládá, že dlouhodobé zkrmování krmiva s vysokým obsahem sóji může narušovat reprodukční cyklus skotu, a to tím, že mění poměr mezi PEG2 a PGF2, což může způsobovat ranou embryonální mortalitu nebo zvyšovat počty inseminací nutných k zabřeznutí (inseminační index) [108, 109, 110, 111]. V druhé periodě našeho experimentu byla z pokusného sledování vyřazena dojnice č. 4 ze zdravotních důvodů (akutní mastitida). V tabulce 5 je uveden průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a příjem isoflavonů. Příjem sušiny a živin nebyl pokusným zásahem ovlivněn. U obou skupin (skupiny K i skupiny E) bylo dojnicím podáváno ve stejném množství stejné krmivo, které bylo ve skupině E doplněno 40% sójovým extraktem isoflavonů (Soybean isoflavones, Vita-Solar Biotechnology Co., Ltd., Čína), který byl zdrojem isoflavonů v krmné dávce pokusné skupiny (0,24 % v doplňkové krmné směsi). Tento 40% sójový extrakt isoflavonů obsahoval 9,6 mg/g daidzeinu, 0,4 mg/g genisteinu a 1,5 mg/g glyciteinu. Celkové množství isoflavonů v komerčně dostupném extraktu bylo 419,4 mg/g. Množství extraktu bylo vypočteno tak, aby denní příjem isoflavonů v krmné dávce dosahoval 3 g. Toto množství bylo voleno s ohledem na denní příjmy isoflavonů dosahované v předchozích experimentech, kde byla jako zdroj isoflavonů použita různě technologicky upravena sója [74, 112]. Denní příjem isoflavonů ve skupině E byl 4616,8 mg. Tato hodnota byla výrazně vyšší než denní příjmy dosažené v obou výše uvedených pracích [74, 112]. Stejně
26
tomu bylo i u kontrolní skupiny K, kde denní příjem isoflavonů dosahoval dokonce 541,8 mg. Příjem celkových isoflavonů (daidzenu a genisteinu) ve studii Třináctý a kol. [74] dosahoval hodnot 3297 mg/d v pokusné skupině (skupině E) dojnic krmených extrudovanou plnotučnou sójou a 58 mg/d v kontrolní skupině (skupině K) dojnic krmených extrudovanými řepkovými pokrutinami. Pravděpodobným vysvětlením této skutečnosti je nepředpokládaný výskyt isoflavonů v kontrolní doplňkové krmné směsi, který se v jednotlivých odebraných vzorcích (vzorky byly odebírány v každé periodě) blížil k 140 mg/kg. Protože obě krmné směsi (u skupiny K i skupiny E) měly stejné složení základních surovin, je možné, že se na celkové denní expozici isoflavonů u skupiny E rovněž podílely, alespoň z části i další krmné komponenty. Tab. 5: Průměrný denní příjem sušiny, příjem živin a průměrný denní příjem isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E) Ukazatel Jednotky Sušiny kg/d Příjem živin Popel kg/d CF kg/d NDF kg/d ADF kg/d NL kg/d Tuk kg/d NEL MJ/d Příjem isoflavonů Daidzein mg/d Genistein mg/d Glycitein mg/d CELKEM mg/d
K 18,5
E 18,6
SEM 0,05
1,4 2,9 5,8 3,6 3,0 0,9 118,6
1,4 2,9 5,8 3,6 3,0 0,9 118,7
0,02 0,04 0,05 0,02 0,04 0,04 0,04
227,6* 154,4* 159,8* 541,8*
1993,4* 968,7* 1654,7* 4616,8*
221,2 149,4 153,8 524,4
CF (Crude fiber) – hrubá vláknina; NDF (neutral detergent fibre) – neutrálně detergentní vláknina; ADF (Acid detergent fibre) – acidodetergentní vláknina; NL – dusíkaté látky; NEL (Net energy of lactation) – netto energie laktace; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05
Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce je uvedena v tabulce 6.
27
Mléčná užitkovost (P>0,05) a užitkovost dojnic vyjádřená ve 4% FCM (P>0,05) nebyly pokusným zásahem ovlivněny. Obsah tukuprosté sušiny, bílkovin a kaseinu byl vyšší ve skupině K ve srovnání se skupinou E (P<0,05). Obsah tuku, laktózy a močoviny nebyl pokusným zásahem ovlivněn (P>0,05). Denní produkce jednotlivých složek mléka byla vyšší ve skupině K než ve skupině E (P<0,05). V dostupné literatuře nebyly doposud publikovány žádné práce, které by se zabývaly možností využití extraktů sójových isoflavonů ve výživě laktujících dojnic, se kterými by bylo možné naše výsledky porovnat. Tab. 6: Mléčná užitkovost, produkce složek mléka, koncentrace isoflavonů v mléce a denní produkce isoflavonů v mléce: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E) Ukazatel Jednotky Mléčná užitkovost Dojivost kg/d # 4% FCM kg/d Tukuprostá sušina g/kg Tuk g/kg Bílkovina g/kg Kasein g/kg Laktóza g/kg Močovina mg/100 ml Produkce složek mléka Tukuprostá sušina kg/d Tuk g/d Bílkovina g/d Kasein g/d Laktóza g/d Koncentrace isoflavonů v mléce Daidzein µg/l Genistein µg/l Glycitein µg/l Ekvol µg/l CELKEM µg/l Produkce isoflavonů v mléce Daidzein µg/d Genistein µg/d
28
K
E
SEM
23,8 23,4 85,7* 38,7 32,1* 25,3* 47,9 29,4
23,3 22,5 84,9* 37,5 31,6* 24,7* 47,6 28,7
0,20 0,49 0,15 0,59 0,18 0,13 0,19 0,42
2,04* 926,6* 762,7* 597,9* 1138,0*
1,97* 879,1* 732,2* 571,6* 1106,6*
0,02 15,09 7,53 5,57 10,13
14,7 34,7 4,5* 14,5* 68,4
15,4 32,4 14,4* 76,8* 139,0
0,74 1,66 0,91 3,32 6,62
347,51 827,5
358,0 752,5
18,17 39,15
Ukazatel Glycitein Ekvol CELKEM
Jednotky µg/d µg/d µg/d
K 94,3* 284,2* 1553,5
E 331,8* 1769,0* 3211,3
SEM 23,41 79,55 160,28
FCM (= Fat-corrected milk) mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství tuku, tj. 4%; SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; * hodnoty se průkazně liší P<0,05
Koncentrace a celková denní produkce daidzeinu a genisteinu nebyla pokusným zásahem ovlivněna (P>0,05). Co se týče daidzeinu, koncentrace zjištěné v našem experimentu v obou skupinách, skupině K i skupině E, odpovídaly hodnotám zjištěným skupinou Třináctý a kol. [74]. Naproti tomu Flachowsky s kol. [70], který ve své práci použil jako zdroj isoflavonů odtučněný sójový šrot v různých hladinách, detekovali nízké hladiny daidzeinu (1,1 mikrog/kg) na konci periody s hladinou 30 % odtučněného sójového šrotu v sušině krmné dávky. Podle Falchowského a kol. [70] jsou vzniklé rozdíly způsobené různou úrovní metabolismu daidzeinu bachorovými mikroorganismy. Koncentrace genisteinu byla v obou skupinách (ve skupině K i skupině E) obdobná, stejné hodnoty zaznamenal i Třináctý a kol. [74] rovněž v obou sledovaných skupinách. Podobná zjištění publikoval i Flachowsky s kol. [70], který zjistil hladiny genisteinu ve všech sledovaných skupinách a udával, že podíl genisteinu z celkových isoflavonů v mléce se pohyboval v rozmezí 48,5-89,8 %. V našem pokusu byl podíl genisteinu z celkových isoflavonů na úrovni 50,7 % u skupiny K a 23,3 % u skupiny E, zatímco ve studii Třináctý a kol. [74] byly podíly genisteinu z celkových isoflavonů také vyšší, a to 68,3 % u skupiny kontrolní (skupiny K) a 34,6 % u skupiny pokusné (skupiny E). Obsah glyciteinu a ekvolu a také celková denní produkce glyciteinu, a zvláště pak ekvolu, byla ve skupině K nižší než ve skupině E (P<0,05). Tyto závěry jsou v souladu jak s výstupy z předchozího fyziologického experimentu, tak i s dalšími pracemi zaměřenými na transfer sójových isoflavonů do mléka [70, 74]. Koncentrace ekvolu v našem pokuse (76,8 g/l) byla výrazně vyšší než v obou uvedených studiích, kde obsah ekvolu v mléce byl 54,8 g/l [74] nebo se pohyboval v rozmezí 14,5 až 61,1 g/kg v závislosti na podílu sójových komponent v krmné dávce [70]. Koncentrace isoflavonů v mléce byla detekována, stejně jako v předchozí studii Třináctý a kol. [74] a v Exp. 1, také u kontrolní skupiny (skupiny K). Byla však vyšší než v obou zmíněných literárních odkazech a odpovídala zvýšenému příjmu isoflavonů ve skupině K. Flachowsky s kol. [70], který rovněž zjistil nízké hladiny isoflavonů v kontrolním mléce, které dosahovaly hodnot 82,5 a 66,6 g/kg) však soudí, že u zvířat dochází k deponování isoflavonů, které je delší než 21 dní.
29
4.2.2
Zdánlivá návratnost isoflavonů
V tabulce 7 je stejně jako v předchozím experimentu vypočtena tzv. apparent recovery (tj. zdánlivá návratnost) určující míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic. Rozdíl mezi skupinami v míře prostupu isoflavonů do mléka dojnic byl vysoce průkazný (P0,0001). Apparent recovery u daidzeinu a ekvolu, tj. isoflavonů jedné metabolické skupiny, byla ve skupině E na úrovni 1,1 µg/mg, což odpovídá hodnotám publikovaným pro plnotučnou extrudovanou sóju (1,3 µg/mg) [74]. Flachowsky a kol. [70] porovnávali míru prostupu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic v závislosti na příjmu isoflavonů. Co se týče prostupu daidzeinu a ekvolu, vypočetl apparent recovery v rozmezí 2,0; 4,4 a 2,2 µg/mg ve skupinách s 10, 20 a 30 % odtučněného sójového šrotu v krmné dávce, což jsou vyšší hodnoty, než jaké byly dosaženy v našem experimentu. Flachowsky a kol. [70] zjistili, že míra prostupu isoflavonů do mléka se snižuje se zvyšujícím se příjmem isoflavonů podle následujícího vztahu: y = (-0,0001 . x) + 0,0006 (kde R2=0,6903). Vzhledem k tomu, že v našem pokuse byl příjem isoflavonů mnohem vyšší, jsou naše výsledky v souladu i s posledně zmíněnou prací. Tab. 7: Zdánlivá návratnost isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E) Ukazatel Návratnost daidzeinu a ekvolu Návratnost genisteinu Návratnost glyciteinu
K Jednotky µg/mg 55,5*** µg/mg 119,0*** µg/mg 6,2***
E 1,1*** 0,8*** 0,2***
SEM 1,87 7,05 0,48
SEM (Standard error of the mean) – střední chyba průměru; *** hodnoty se průkazně liší P<0,001
4.2.3
Změny v obsahu isoflavonů během technologického zpracování mléka
Jak již bylo uvedeno výše (viz výsledky a diskuse k Exp. 1), v dostupné literatuře bylo doposud publikováno jen málo prací, které by se věnovaly problematice transferu sójových isoflavonů z krmiva do mléka a problematice změn v obsahu isoflavonů během technologického zpracování kravského mléka. Vliv doplňku sójového extraktu, jako dalšího možného zdroje isoflavonů do krmné dávky laktujících dojnic na koncentraci isoflavonů v mléku a z něj vyrobených mléčných produktů nebyl doposud sledován. Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (skupina K) či krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (skupina E) je znázorněn na obrázku 7. Pozn.: Statistické hodnocení u dat získaných během technologického zpracování mléka nebylo provedeno, protože byly získány pouze dvě hodnoty od každého sledovaného ukazatele ve skupině (n = 2).
30
Obr. 7: Obsah isoflavonů v mléce syrovém, odstředěném a smetaně: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Na obrázku 8-9 je uveden vliv tepelného ošetření mléka (pasterace mléka) a vliv výroby a skladování jogurtů na změny v obsahu isoflavonů. V souladu s dostupnou literaturou [12, 92, 95] po provedení šetrné pasterace (65 °C, 30 min.) nebyly zjištené výrazné rozdíly v obsahu jednotlivých isoflavonů v obou skupinách s výjimkou ekvolu ve skupině E, kde byl zjištěn cca 20% pokles. Bez dalšího ověření tohoto výsledku prozatím nelze říct, proč k poklesu ekvolu došlo. Jedním z možných vysvětlení by mohla být přeměna v jinou formu, jak naznačují studie Uzzan a kol. [92], Jackson a kol. [90] nebo Grun a kol. [91]. V průběhu fermentace při výrobě jogurtů byl zaznamenán pokles v pH u obou sledovaných skupin, skupiny K i skupiny E (z 4,37 na 4,17 resp. z 4,52 na 4,22). Pokles pH, zaznamenaný mezi vzorky po výrobě a po měsíčním skladování, byl totožný v obou skupinách, stejně jako v předchozím fyziologickém experimentu.
31
Obr. 8: Vliv pasterace mléka na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Celková koncentrace isoflavonů v jogurtu během fermentace (16-18 h. při 37 °C) poklesla z 73,8 na 43,8 ng/ml ve skupině K a z 147,2 na 76,9 ng/ml ve skupině E. Tyto závěry jsou v souladu s výsledky z předchozího fyziologického experimentu, ve kterém byl také zaznamenán pokles celkových isoflavonů po fermentaci u obou sledovaných skupin. Podobně také Chen a kol. [96], Tsangalis a kol. [49] nebo King a Bignell [98] ve svých studiích uvedli, že ztráty v celkovém obsahu isoflavonů jsou způsobeny hydrolytickým odštěpením glukosy z glukosidů, které přispívají k množství isoflavonů, jako glukosidové formy. Koncentrace celkových isoflavonů po jednoměsíčním skladování jogurtu vzrostly v obou skupinách (u skupiny K i skupiny E). Koncentrace celkových isoflavonů po výrobě vzrostla během měsíčního skladování z 43,8 na 56,6 ng/ml ve skupině K a z 76,9 na 124,4 ng/ml ve skupině E. Tento výsledek je v rozporu s naším předpokladem i s výsledky získanými během fyziologického experimentu, proto není možné činit jakékoli závěry, pokud nebude tato problematika dále prozkoumána.
32
Obr. 9: Vliv výroby a skladování jogurtu na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol Vliv výroby a zrání sýra s nízkodohřívanou sýřeninou na obsah jednotlivých isoflavonů je znázorněn na obrázku 10. Z celkového množství 5 kg pasterizovaného mléka bylo vyrobeno 0,51 kg sýra ve skupině K a 0,52 kg sýra ve skupině E. Sýr po výrobě obsahoval 59,43 a 60,77 g/kg sušiny a 22,30 a 20,25 g/kg solí ve skupině K a skupině E, v tomto pořadí. Stejně jako v předchozím pokuse bylo zjištěno, že část isoflavonů se během výroby uvolnila do odtékající syrovátky. Koncentrace jednotlivých isoflavonů daidzeinu, genisteinu, glyciteinu a ekvolu v syrovátce byla 12,4; 29,6; 1,1 a 6,1 ng/ml ve skupině K a 17,0; 33,0; 12,7 a 75,5 ng/ml ve skupině E. Celková koncentrace isoflavonů v syrovátce pak byla 49,2 resp. 138,2 ng/ml. Poměrně vysoká koncentrace isoflavonů v syrovátce však odpovídá výsledkům jak z předchozího fyziologického experimentu, tak i výsledkům z dostupné literatury [91, 103]. Během srážení bílkovin mléka byl zaznamenán pokles pH z původních 6,57 a 6,05 (pH mléka před srážením) na 6,0 a 5,95 (pH sýra po zpracování) u skupiny K a skupiny E. Hodnota pH sýra stanovená na začátku (1 den) a na konci (90 den) zrání byla 5,21 a 5,44 u skupiny K a 5,14 a 5,50 u skupiny E, v tomto pořadí. Změna pH byla patrná u obou skupin (u skupiny K i skupiny E), stejně jako v předchozím fyziologickém experimentu. Během 90 dnů zrání sýrů došlo k poklesu koncentrace celkových isoflavonů u skupiny K (z 218,3 na 184,0 ng/g, tedy cca o 16 %) i skupiny E (z 1153,1 na 913,6 ng/g; tedy cca o 21 %). Pokles hodnot, mezi sýrem po výrobě a po skladování, byl
33
zaznamenán také u jednotlivých isoflavonů daidzeinu (9 vs. 11 %), genisteinu (18 vs. 19 %), glyciteinu (11 vs. 14 %) i ekvolu (18 vs. 23 %, pro skupinu K resp. skupinu E), jak je zřejmé z obrázku 10. Výsledky jsou v souladu s dostupnou literaturou a také v souladu s naším předpokladem, že během zrání dojde k poklesu koncentrace isoflavonů v důsledku rozkladných reakcí glukosidů isoflavonů, které jsou během skladování nestabilní [100].
Obr. 10: Vliv výroby a zrání sýra na koncentraci isoflavonů: K u dojnic krmených kontrolní krmnou dávkou (kontrolní skupina, skupina K), E u dojnic krmených krmnou dávkou s doplňkem 40% sójového extraktu (pokusná skupina, skupina E); Da – daidzein, Ge – genistein, Gl – glycitein, Ek – ekvol
34
5
SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ A ZÁVĚR
V mnoha předešlých studiích [113, 114, 115, 116, 117, 118] bylo prokázáno, že fytoestrogeny jsou biologicky aktivní již v nízkých koncentracích a díky svým výrazným estrogenním účinkům mohou ovlivňovat léčbu některých tipů rakoviny, kardiovaskulárních onemocnění, osteoporózy, symptomů menopauzy, obezity, cukrovky 2. typu aj. Avšak množství isoflavonů, které je konzumováno běžnou stravou západní populace se pohybuje v rozmezí 1-2 g/d. Naopak, v asijských zemích je denní konzumace isoflavonů výrazně vyšší, 11-47 mg/d [119]. Příčinou těchto značných rozdílů jsou sójové produkty, které obsahují vysoké hladiny isoflavonů (0,2-6,5 mg/ml) a jsou hojně konzumovány právě v asijských zemích [120]. U západní, především americké populace však bylo prokázáno, že se na celkovém příjmu isoflavonů rovněž podílí konzumace kravského mléka a mléčných výrobků [121]. Pokusy z posledních let pak naznačují, že kravské mléko je pravděpodobně nejvhodnější potravinou živočišného původu, která může být cíleně upravena tak, aby mohla být potenciálním zdrojem isoflavonů pro humánní výživu [65, 66, 74] v podobě tzv. funkční potraviny. Cílem této dizertační práce bylo na základě provedených experimentů popsat transfer sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic. Jako zdroj isoflavonů byla použita plnotučná extrudovaná sója (Exp. 1) a 40% extrakt sójových isoflavonů (Exp. 2). Dalšími vedlejšími sledovanými ukazateli byly změny v obsahu isoflavonů v mléce v průběhu technologického zpracování na bílý jogurt a sýr s nízkodohřívanou sýřeninou. Po zařazení obou výše zmiňovaných sójových komponent do krmné dávky laktujících dojnic jsme zaznamenali zvýšené hladiny isoflavonů, především pak metabolitu ekvolu v mléce. Námi zjištěné koncentrace isoflavonů v mléce odpovídají hodnotám publikovaným v literatuře, kde jako zdroj dietárních isoflavonů byla použita sója nebo sójové produkty, ale jsou mnohem nižší, než jakých bylo dosaženo s využitím krmiv na bázi jetele červeného nebo bílého. Z kvantitativního hlediska naše pokusy potvrdily, že míra prostupu isoflavonů do mléka se snižuje se zvyšujícím se příjmem isoflavonů v krmné dávce. Pro přesné zmapování kvantitativního aspektu transferu sójových isoflavonů z krmiva do mléka dojnic bude potřeba provést další studie, přičemž klíčový je především metabolismus isoflavonů v bachoru. Jako vhodný zdroj isoflavonů je pro tyto účely možné využít sójových extraktů isoflavonů, které umožňují přesnější modelování stanovených hladin dietárního příjmu a rovněž by mohly umožnit i namodelovat vyšší příjmové hladiny, blízké příjmům dosahovaným např. při zkrmování jetele červeného, kterých s běžnými sójovými komponentami nelze dosáhnout. Z kvalitativního hlediska stojí za zmínku zjištění, že nejen mléko, ale i mléčné výrobky mohou být produkovány, jako cíleně obohacované o isoflavony, i když během technologického zpracování může docházet ke změnám právě v obsahu isoflavonů. Zajímavým produktem z tohoto pohledu je i syrovátka, do níž se část isoflavonů během výroby sýrů vyloučí. V dostupné literatuře dosud tyto aspekty 35
nebyly dostatečně popsány a také výsledky našich pokusů mají svá omezení (monitoring technologického zpracování proběhl v omezeném rozsahu), a proto jsou potřebné další studie pro podrobnější zdokumentování změn v obsahu isoflavonů, včetně možných konverzí mezi jednotlivými formami (glykosidy, aglykony, malonyl- a acetyl- deriváty aj.) během technologického zpracování mléka. Závěrem lze říci, že volbou vhodné krmné strategie lze dosáhnout žádoucích hladin ekvolu v kravském mléce, případně mléčných výrobcích, které tak mohou být považovány za potenciální zdroj ekvolu v humánní výživě a to zvláště pro tzv. neproducenty ekvolu, pro které se takto otevírá možnost k využívání zdravotních benefitů spojených s konzumací isoflavonů v potravě. Znalostí týkajících se kvantitativní stránky přenosu isoflavonů z krmiva do mléka dojnic je však možné využít i naopak, tj. pro cílenou produkci potravin živočišného původu bez obsahu isoflavonů pro specifické kategorie spotřebitelů (např. kojenci, lidé s určitým zdravotním omezením), jejichž zdravotní stav nebo zdravý vývoj by mohl příjem isoflavonů v potravě negativně ovlivnit.
36
6
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ
Da Ge Gl Ek Dain Gein Glin a kol. / s kol. tj. např. resp. Exp. 1 Exp. 2 skupina K skupina S skupina E CF NDF ADF NEL SEM P 4% FCM
Daidzein Genistein Glycitein Ekvol Daidzin Genistin Glycitin a kolektiv / s kolektivem (autorů) to je například respektive Fyziologický experiment Poloprovozní experiment Kontrolní skupina (kontrolní krmná dávka) Pokusná skupina Exp. 1 (krmná dávka s doplňkem extrudované plnotučné sóji) Pokusná skupina Exp. 2 (krmná dávka s doplňkem 40% extraktu práškových isoflavonů) Hrubá vláknina (Crude fiber) Neutrálně detergentní vláknina (Neutral detergent fibre) Acidodetergentní vláknina (Acid detergent fibre) Netto energie laktace (Net energy of lactation) Střední chyba průměru (Standard error of the mean) Průkaznost (Probability) Mléčná užitkovost přepočtená na standardní množství tuku, tj. 4% (Fat-corrected milk)
37
7 [1]
SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ
Adlercreutz H., Mazur W.: Phyto-oestrogens and Western diseases. Annals of Medicine, 1997, 29, pp. 95-120. ISSN: 0785-3890. [2] Lu L.J., Anderson K.E., Grady J.J., Nagamani M.: Effects of an isoflavonefree soy diet on ovarian hormones in premenopausal women. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2001, 86, pp. 3045-3052. ISSN: 0021972X. [3] Vanharanta M., Voutilainen S., Lakka T.A., van der Lee M., Adlercreutz H., Salonen J.T.: Risk of acute coronary events according to serum concentrations of enterolactone: a prospective population-based casecontrol study. The Lancet, 1999, 354, pp. 2112-2115. ISSN: 0140-6736. [4] Horiuchi T., Onouchi T., Takahashi M., Ito H., Orimo H.: Effect of soy protein on bone metabolism in postmenopausal Japanese women. Osteoporos International, 2000, 11, pp. 721-724. ISSN: 0937-941X. [5] Picherit C., Coxam V., Bennetau-Pelissero C., Kati-Coulibaly S., Davicco M. J., Lebecque P., Barlet J. P.: Daidzein is more efficient than genistein in preventing ovariectomy-induced bone loss in rats. Journal of Nutrition, 2000, 130, pp. 1675-1681. ISSN: 0022-3166. [6] Sathyamoorthy N., Wang T.T.Y.: Differential effects of dietary phytooestrogens daidzein and equol on human breast cancer MCF-7 cells. European Journal of Cancer, 1997, 33, pp. 2384-2389. ISSN: 0959-8049. [7] Chouinard P.Y., Le´Vesque J., Girard V., Brisson G.J.: Dietary Soybeans Extruded at Different Temperatures: Milk Composition and In Situ Fatty Acid Reactions. Journal of Dairy Science, 1997, 80, pp. 2913-2924. ISSN: 00220302. [8] Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Korzekwa A., Piskula M.K, Wiczkowski W., Depta A., Skarzynski D.J.: Soybean-Derived Phytoestrogens Regulate Prostaglandin Secretion in Endometrium During Cattle Estrous Cycle and Early Pregnancy. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 189199. ISSN: 1535-3702. [9] Woclawek-Potocka I., Korzekwa A., Piskula M., Skarzynski D.J.: Role of soy derived phytoestrogens in prostaglandin synthesis in the bovine endometrium. Biology of Reproduction (Special Issue), 2004, 194, abstract 443. ISSN: 00063363. [10] Setchell K.D.R., Brown N.M., Lydeking-Olsen E.: The Clinical Importance of the Metabolite Equol – A Clue to the Effectiveness of Soy and Its Isoflavones. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3577-3584. ISSN: 0022-3166. [11] Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Mäkelä T., Wähälä K., Brunow G., Hase T.: Assay of lignans and phatoestrogens in urine of women and in cow´s milk by GC/MS (SIM). Todd JFJ, ed. Advances in mass spectrometry. Proceedings of the 10th International Mass Spectrometry Konference, 1985. Chichester, UK: J Wiley. ISSN: 0277-7037. 38
[12] King R.A., Mano M.M., Head R.J.: Assessment of isoflavonoid concentrations in Australian bovine milk samples. Cambridge University Press, 1998, 65, pp. 479-489. ISSN: 1751-7311. [13] Kudou S., Fleury Y., Welti D., Magnolato D., Uchida T., Kitamura K., Okubo K.: Malonyl isoflavone glycosidesin soybean seeds (Glycine max Merrill). Agricultural and Biological Chemistry, 1991, 55, pp. 2227. ISSN: 0002-1369. [14] Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin II., Ossis, Tábor 2009, 644 s. ISBN 978-80-86659-16-9. [15] Shimoni E.: Stability and Shelf Life of Bioactive Compounds during Food Processing and Storage: Soy Isoflavones. Journal of food science, 2004, 69 (6), pp. 160-166. ISSN: 1750-3841. [16] Setchell K.D.R.: Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones. American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68 (Suppl.), pp. 1333S-46S. ISSN: 0002-9165. [17] Barnes S., Kirk M., Coward L.: Isoflavones and their conjugates in soy foods: extraction conditions and analysis by HPLC-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42, pp. 2466-2474. ISSN: 00218561. [18] Opletal L., Šimera B.: Toxické látky přírodního původu (sekundární metabolity rostlin a hub) v surovinách pro výrobu krmiv a možnost jejich stanovení. Vědecký výbor výživy zvířat. Praha, červen 2006. [19] Bingham S.A., Atkinson C., Liggins J., Bluck L., Coward A.: Review article: Phyto-oestrogens: Where are we now? British Journal of Nutrition, 1998, 79, pp. 393-406. ISSN: 0007-1145. [20] Hutchins A.M., Slavin J.L., Lampe J.W.: Urinary isoflavonoid phytoestrogen and lignan excretion after consumption of fermented and unfermented soy products. Journal of the American Dietetic Association, 1995, 95, pp. 545551. ISSN: 0002-8223. [21] Akaza H., Miyanaga N., Takashima N., Naito S., Hirao Y., Tsukamoto T., Mori M.: Is daidzein non-metabolizer a high risk for prostate cancer? A casecontrolled study of serum soybean isoflavone concentration. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2002, 32, pp. 296-300. ISSN: 1465-3621. [22] Kelly G.E., Joannou G.E., Reeder A.Y., Nelson C., Waring M.A.: The variable metabolic response to dietary isoflavones in humans. Proceeding of the Society for Experimentyl Biology and Medicine, 1995, 208, pp. 40-43. ISSN: 1525-1373. [23] Lampe J.W., Karr S.C., Hutchins A.M., Slavin J.L.: Urinary equol excretion with a soy challenge: influence of habitual diet. Proceeding of the Society for Experimentyl Biology and Medicine, 1998, 217, pp. 335-339. ISSN: 15251373. [24] Arai Y., Uehara M., Sato Y., Kimira M., Eboshida A., Adlercreutz H., Watanabe S.: Comparison of isoflavones among dietary intake, plasma
39
[25]
[26] [27]
[28]
[29] [30]
[31]
[32]
[33]
[34]
[35]
[36]
40
concentration and urinary excretion for accurate estimation of phytoestrogen intake. Journal of Epidemiology, 2000, 10, pp. 127-135. ISSN: 2165-7459. Lundh T.: Metabolism of estrogenic isoflavones in domestic animals. Proceedinf of the Society Experimentyl Biology and Medicine, 1995, 208, pp. 33-39. ISSN: 1525-1373 . Rishi, R.K.: Phytoestrogens in health and illness. Indian Journal of Pharmacology, 2002, 34, pp. 311-320. ISSN: 0253-7613. Lundh T.J.O., Pettersson H., Marinsson K.A.: Comparative levels of free and conjugated plant estrogens in blood plasma and cattle fed estrogenic silage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38, pp. 1530-1334. ISSN: 0021-8561. Setchell K.D.R., Bordello S.E., Hulme P., Axelson M.: Nonsteroidal estrogens of dietary origin: possible roles in hormone-dependent disease. American Journal of Clinical Nutrition, 1984, 40, pp. 569-578. ISSN: 0002-9165. Bradbury R.B., White D.E.: Estrogens and related substances in plants. Vitamins & Hormones, 1954, 7, pp. 207-233. ISSN: 0083-6729. Adlercreutz H., Musey P.I., Fotsis T., Bannwart C., Wähälä K., Mäkelä T., Brunow G., Hase T.: Identification of lignans and phytoestrogens in urine of chimpanzees. Clinica Chimica Acta, 1986, 158, pp. 147-154. ISSN: 00098981. Juniewicz P.E., Pallante M.S., Moser A., Ewing L.L.: Identification of phytoestrogens in the urine of male dogs. The Journal of Steroid Biochemistry, 1988, 31, pp. 987-994. ISSN: 0960-0760. Monfort S.L., Thompson M.A., Czekala N.M., Kasman L.H., Shackleton C.H., Lasley B.L.: Identification of a non-steroidal estrogen, equol, in the urine of pregnant macaques: correlation with steroidal estrogen excretion. The Journal of Steroid Biochemistry, 1984, 20, pp. 869-876. ISSN: 0960-0760. Blair R.M., Appt S.E., Bennetau-Pelissero C., Clarkson T.B., Anthony M.S., Lamothe V., Potter S.M.: Dietary soy and soy isoflavones have genderspecific effects on plasma lipids and isoflavones in golden Syrian f(1)b hybrid hamsters. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3585-3591. ISSN: 0022-3166. Blair R.M., Appt S.E., Franke A.A., Clarkson TB.: Treatment with antibiotics reduces plasma equol concentration in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Journal of Nutrition, 2003, 133, pp. 2262-2267. ISSN: 00223166. Ohta A., Uehara M., Sakai K., Takasaki M., Adlercreutz H., Morohashi T., Ishimi Y.: A combination of dietary fructooligosaccharides and isoflavone conjugates increases femoral bone mineral density and equol production in ovariectomized mice. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 2048-2054. ISSN: 0022-3166. Brown N.M., Setchell K.D.: Animal models impacted by phytoestrogens in commercial chow: implications for pathways influenced by hormones. Lab. Incest., 2001, 81, pp. 735-747.
[37] Lamartiniere C.A., Wang J., Smith-Johnson M., Eltoum I.E.: Daidzein: bioavailability, potential for reproductive toxicity, and breast cancer chemoprevention in female rats. Toxicological Sciences, 2002, 65, pp. 228238. ISSN: 1096-0929. [38] Bayer T., Colnot T., Dekant W.: Disposition and biotransformation of the estrogenic isoflavone daidzein in rats. Toxicological Sciences, 2001, 62, pp. 205-211. ISSN: 1096-0929. [39] Anderson J.J.B., Anthony M., Messina M., Garner S.C.: Effects of phytoestrogens on tissues. Nutrition Research Reviews, 1999, 12, pp. 75-116. ISSN: 0954-4224. [40] Murkies A.L., Wilcox G., Davis S.R.: Phytoestrogens. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1998, 83, pp. 297-303. ISSN: 0021-972X. [41] Adlercreutz H., Hockerstedt K., Bannwart C.: Effect of dietary components, including lignans and phytoestrogens, on enterohepatic circulation and liver metabolism of estrogens and on sex hormone binding globulin (SHBG). The Journal of Steroid Biochemistry, 1987, 27, pp. 1135-44. ISSN: 0960-0760. [42] Hutchins A.M., Lampe J.W., Martini M.C., Campbell D.R., Slavin J.L.: Vegetables, fruits and legumes: Effect on urinary isoflavonoid phytoestrogen and lignan excretion. Journal of the American Dietetic Association, 1995, 95, pp. 769-74. ISSN: 0002-8223. [43] Frankenfeld C.L., McTiernan A., Tworoger S.S., Atkinson C., Thomas W.K., Stanczyk F.Z., Marcovina S.M., Weigle D.S., Weiss N.S., Holt V.L., Schwartz S.M., Lampe J.W.: Serum steroid hormones, sex hormonebinding globulin concentrations, and urinary hydroxylated estrogen metabolites in post-menopausal women in relation to daidzeinmetabolizing phenotypes. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 88, pp. 399408. ISSN: 0960-0760. [44] Cruz M.L.A., Wong W.W., Mimouni F., Hachey D.L., Setchell K.D.R., Klein P.D., Tsang R.C.: Effects of infant nutrition on cholesterol synthesis rates. Pediatric Research, 1994, 35, pp. 135-140. ISSN: 0031-3998. [45] Rowland I., Wiseman H., Sanders T., Adlercreutz H., Bowey E.: Metabolism of oestrogens and phytoestrogens: role of the gut microflora. Biochemical Society Transactions, 1999, 27, pp. 304-308. ISSN: 1470-8752. [46] Hur H.G., Beger R.D., Heinze T.M., Lay J.O.Jr., Freeman J.P., Dore J., Rafii F.: Isolation of an anaerobic intestinal bacterium capable of clearing the Cring of the isoflavonoid daidzein. Archives of Microbiology, 2002, 178, pp. 812. ISSN: 1432-072X. [47] Schoefer L., Mohan R., Braune A., Birringer M., Blaut M.: Anaerobic Ring cleavage of genistein and daidzein by Eubacterium ramulus. FEMS Microbiology Letters, 2002, 208, pp. 197-202. ISSN: 1574-6968. [48] Blaut M., Schoefer L., Braune A.: Transformation of flavonoids by intestinal microorganisms. International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 2003, 2, pp. 79-87. ISSN: 0300-9831.
41
[49] Tsangalis D., Ashton J.F., McGill A.E.J., Shah N.P.: Enzymic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by –glucosidaseproducing Bifidobacteria. Journal of Food Science, 2002, 67, pp. 3104-3113. ISSN: 1750-3841. [50] Ueno T., Uchiyama S., Kikuchi N.: The role of intestinal bacteria on biological effects of soy isoflavones in humans. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 594S. ISSN: 0022-3166. [51] Adlercreutz C.H., Goldin B.R., Gorbach S.L., Hockerstedt K.A., Watanabe S., Hamalainen E., Adlercreutz C.H.: Epidemiology of phytoestrogens. Clinical Endocrinology and Metabolism, 1998, 12 (4), pp. 605-623. ISSN: 0021-972X. [52] Lichtenstein A.H.: Soy protein, phytoestrogens and cardiovascular disease risk. Recent Advances Nutr. Sci., 1998, 10, pp. 1589-1592. [53] Wu A.H., Ziegler R.G., Nomura A.M., West D.W., Kolonel L.N., Horn-Ross P.L., Hoover R.N., Pike M.C.: Soy intake and risk of breast cancer in Asians and Asian Americans. The American Journal of Clinical Nutrition, 1998, 68, pp. 1437–1443. ISSN: 0002-9165. [54] Kostelac D., Rechkemmer G., Briviba K.: Phytoestrogens modulate binding response of estrogen receptors alpha and beta to the estrogen response element. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51 (26), pp. 7632-7635. ISSN: 0021-8561. [55] Muthyala R.S., Ju J.H., Sheng S., Williams L.D., Doerge D.R., Katzenellenbogen B.S., Helferich W.G., Katzenellenbogen J.A.: Equol, a natural estrogenic metabolite from soy isoflavones: convenient preparation and resolution of R- and S-equols and their differing binding and biological activity through estrogen receptors a and b. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, 12, pp. 1559-1567. ISSN: 0968-0896. [56] Turner R., Baron T.,Wolffram S., Minihane A.M., Cassidy A., Rimbach G., Weinberg P.D.: Effect of circulating forms of soy isoflavones on the oxidation of low density lipoprotein. Free Radical Research, 2004, 38, pp. 209-216. ISSN: 1071-5762. [57] Rimbach G., De Pascual-Teresa S., Ewins B.A., Matsugo S., Uchida Y., Minihane A.M., Turner R., Vafei Adou K., Weinberg P.D.: Antioxidant and free radical scavenging activity of isoflavone metabolites. Xenobiotica, 2003, 33, pp. 913-925. ISSN: 1366-5928. [58] Lund T.D., Munson D.J., Haldy M.E., Setchell K.D.R., Lephart E.D., Handa R.J.: Equol is a novel anti-androgen that inhibits prostate growth and hormone feedback. Biology of Reproduction, 2004, 70, pp. 1188-95. ISSN: 0006-3363. [59] Nagel S.C., vom Saal F.S., Welshons W.V.: Developmental effects of estrogenic chemicals are predicted by an in vitro assay incorporating modification of cell uptake by serum. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1999, 69, pp. 343-357. ISSN: 0960-0760.
42
[60] Setchell K.D.R., Brown N.M., Lydeking-Olsen E.: The clinical importance of the metabolite equol - a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones. Journal of Nutrition, 2002, 132, pp. 3577-3584. ISSN: 1541-6100. [61] Wang X.L., Kim H.J., Kang S.I., Kim S.I., Hur H.G.: Production of phytoestrogen S-equol from daidzein in mixed culture of two anaerobic bakteria. Microbiology, 2007, 187, pp. 155-160. ISSN: 1350-0872. [62] Decroos K. Vanhemmens S., Cattoir S., Boon N., Verstraete W.: Isolation and characterization of an equol producing mixed microbial culture from a human faecal sample and its activity under gastrointestinal conditions. Archives of Microbiology, 2005, 183, pp. 45-55. ISSN: 1432-072X. [63] Kaprál A., Fait T.: Estrogeny v životním prostředí a jejich význam v klimakterické medicíně. Praktická gynekologie, 2003, 4, s. 10-13. ISSN: 1801–8750 . [64] Moravcová J., Vänttinen K.: Fytoestrogeny v kručince barvířské (Genista tinctoria) a janovci metlatém (Sarothamnus scoparius), Horticultural Science, 1999, 26, s. 63-68. ISSN: 0862-867X. [65] Mustonen E.A., Tuori M., Saastamoinen I., Taponen J., Wähälä K., Saloniemi H., Vanhatalo A.: Equol in milk of dairy cows is derived from forage legumes such as red clover. British Journal of Nutrition, 2009, 102, pp. 1552-1556. ISSN: 0007-1145. [66] Steinshamn H., Purup S., Thuen E., Hansen-Møller J.: Effects of clover-grass silages and concentrate supplementation on the content of phytoestrogens in dairy cow milk. Journal of Dairy Science, 2008, 91, pp. 2715-2725. ISSN: 0022-0302. [67] Hoikkala A., Mustonen E., Saastmoinen I., Jokela T., Teponen J., Saloniemi H., Wähälä K.: High levels of equol in skimmed Finnish cow milk. Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51, pp. 782-786. ISSN: 1613-4125. [68] Purup S., Hansen-Møller J., Sejrsen K., Christensen L.P., Lykkesfeldt A.E., Leffers H., Skakkebǽk N.E.: Increased phytoestrogen content in organic milk and the biological importance. Newsletter from Danish Research Centre for Organic Farming, 2005, No. 2. Danish Research Centre for Organic Farming, Tjele, Denmark. [69] King R.A., Mano M.M., Head R.J.: Assessment of isoflavonoid concentrations in Australian bovine milk samples. Journal of Dairy Research, 1998, 65, pp. 479-489. ISSN: 0022-0299. [70] Flachowsky G.:, Hünerberg M., Meyer U., Kammerer D.R., Carle R., Goerke M., Eklund M.: Isoflavone concentration of soybean meal from various origins and transfer of isoflavones into milk of dairy cos. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2011, 6, pp. 449-456. ISSN: 1661-5751. [71] Antignac J.P., Cariou R., Le Bizec B., Andre F.: New data regarding phytoestrogens content in bovine milk. Food Chemistry, 2004, 87, pp. 275281. ISSN: 0308-8146.
43
[72] Kurzer M.S., Xu X.: Dietary phytoestrogens. Annual Review of Nutrition, 1997, 17, pp. 353-381. ISSN: 0199-9885. [73] Holman P:. Evidence for health benefits of plant phenols: local or systemic effects? Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81, pp. 842852. ISSN: 0022-5142. [74] Třináctý J., Křížová L., Schulzová V., Hajšlová J., Hanuš O.: The effect of feeding soybean-derived phytoestrogens on their concentration in plasma and milk of lactating dairy cows. Archives of Animal Nutrition, 2009, 63, pp. 1-11. ISSN: 1745-039X. [75] Chapin R.E., Stevens J.T., Hughes C.L., Kelce W.R., Hess R.A., Daston G.P.: Endocrine modulation of reproduction. Fundamental and Applied Toxicology, 1996, 29, pp. 1-17. ISSN: 0272-0590. [76] Wang H.J., Murphy P.A.: Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in Iowa: effects of variety, crop year, and location. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42, pp. 1674-1677. ISSN: 00218561. [77] Kudrna V., Marounek M.: Feeding oilseed products to dairy cows. Journal of Animal and Feed Sciences, 2006, 15, pp. 36–69. ISSN: 1230-1388. [78] Komprda T., Dvořák R., Suchý P., Fialová M., Šustová K.: Effect of heat treated rapeseed cakes in dairy cow diet on yield, composition and fatty acid pattern of milk. Czech Journal of Animal Science, 2000, 45, pp. 325-332. ISSN: 1212-1819. [79] Křížová L., Richter M., Třináctý J., Říha J., Kumprechtová, D. The effect of feeding live yeast cultures on ruminal pH and redox potential In dry cows as continuously measured by a new wirelees device. Czech Journal of Animal Science, 2011, 56, pp. 37-45. ISSN: 1212-1819. [80] Richter M., Křížová L., Třináctý J.: The effect of individuality of animal on diurnal pattern of pH and redox potential in the rumen of dry cows. Czech Journal of Animal Science, 2010, 55, pp. 401-407. ISSN: 1212-1819. [81] Marden J.P., Bayourthe C., Enjalbert F., Moncoulon R.: A New Device for Measuring Kinetics of Ruminal pH and Redox Potential in Dairy Cattle. Journal of Dairy Science, 2005, 88, pp. 277-281. ISSN: 0022-0302. [82] Edwards J.E., McEwan N.R., Travis A.J., Wallace R.J.: 16SrDNA librarybased analysis of ruminal bacterial diversity. Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 2004, 86 (3), pp. 263-281. [83] Watzková J., Křížová L., Pavlík A., Schulzová V., Hajšlová J., Lojza L.: The Effect of Soybean-Derived Phytoestrogens on Concentrations of Plasma Isoflavones, 15-keto-13,14-dihydroprostaglandin F2 and Progesterone in Dairy Cows. Acta Vet. Brno, 2010, 79, pp. 537-544. ISSN 0001-7213. [84] Andersen C., Weisbjerg M.R., Hansen-Møller J., Sejrsen K.: Effect of forage on the content of phyto-oestrogens in bovine milk. Animal, 2009, 3, pp. 617622. ISSN: 1751-7311.
44
[85] Umphress S.T., Murphy S.P., Franke A.A., Custer L.J., Blitz C.L.: Isoflavone content of foods with soy additives Journal of Food Composition and Analysis, 2005, 18, pp. 533-550. ISSN: 0889-1575. [86] Nurmi T., Mazur W., Heinonen S., Kokkonen J., Adlercreutz H.: Isoflavone content of the soy based supplements. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, 28, pp. 1-11. ISSN: 0731-7085. [87] Liggins J., Bluck L.J.C., Runswick S., Atkinson C., Coward W.A., Bingham S.A.: Daidzein and genistein contents of vegetables. British Journal of Nutrition, 2000, 84, pp. 717-725. ISSN: 0007-1145. [88] Liggins J., Bluck L.J.C., Runswick S., Atkinson C., Coward W.A., Bingham S.A.: Daidzein and genistein content of fruits and nuts. Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11, pp. 326-331. ISSN: 0955-2863. [89] Kuhnle G.G.C., Delcaqulla C., Aspinall S.M., Runswick S.A., Mulligan A.A., Bingham S.A.: Phytoestrogen content of foods of animal origin: dairy products, eggs, meat, fish, and seafood. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56 (21), pp. 10099-10104. ISSN: 0021-8561. [90] Grun I.U., Adhikari K., Li C., Li Y., Lin B., Zhang J., Fernando L.N.: Changes in the profile of genistein, daidzein, and their conjugates during thermal processing of tofu. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49, pp. 2839-43. ISSN: 0021-8561. [91] Jackson C.J.C., Dini J.P., Lavandier C., Rupasinghe H.P.V., Faulkner H., Poysa V., Buzzell D., DeGrandis S.: Effects of processing on the content and composition of isoflavones during manufacturing of soy beverage and tofu. Process Biochemistry, 2002, 37, pp. 1117-23. [92] Uzzan M., Nechrebeki J., Labuza T.P.: Thermal and storage stability of nutraceuticals in a milk beverage dietary supplement. Journal of Food Science, 2007, 72, pp. E109-E114. ISSN: 0022-1147. [93] Frank A.A., Hankin J.H., Yu M.C., Maskarinec G., Low S.H., Custer L.J.: Isoflavone level in soy foods consumed by multiethnic populations in Singapore and Hawaii. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47, pp. 977-986. ISSN: 0021-8561. [94] Hendrich S., Murphy P.A.: Isoflavones: source and metabolism. In: Wildman REC, editor. Handbook of nutraceuticals and functional foods. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2001. pp. 55-75. [95] Uzzan M., Labuza T.P.: Critical Issues in R&D of Soy Isoflavone–enriched Foods and Dietary Supplements. Journal of Food Science, 2004, 69 (3), pp. 77-86. ISSN: 1750-3841. [96] Chen T.R., Su R.Q., Wei Q.K.: Hydrolysis of isoflavone phytoestrogens in soymilk fermented by Lactobacillus and Bifidobacterium cocultures. Journal of Food Biochemistry, 2010, 34, pp. 1-12. ISSN: 0145-8884. [97] Izumi T., Piskula M.K., Osawa S., Obata A., Tobe K., Saito M., Kataoka S., Kubota A.Y., Kikuchi M.: Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and
45
[98]
[99]
[100]
[101]
[102]
[103]
[104]
[105]
[106]
[107]
46
in higher amounts than their glucosides in humans. Journal of Nutrition, 2000, 130, pp. 1695-1699. ISSN: 0022-3166. King R.A., Bignell C.M.: Concentrations of isoflavone phytoestrogens and thein glucosides in Australian soya beans and soya foods. Australian Journal of Nutrition and Dietetics, 2000, 57, pp. 70-78. ISSN: 1032-1322. Otieno D.O., Ashton J.F., Shah N.P.: Stability of isoflavone phytoestrogens in fermented soymilk with Bifidobacterium animalis Bb12 during storage at different temperatures. International Journal of Food Science and Technology, 2006, 41, pp. 1182-1191. ISSN: 0950-5423. Coldham N.G., Darby C., Hows M., King L.J., Zhang A.Q., Sauer M.J.: Comparative metabolism of genistin by human and rat gut microflora: detection and identification of the end-products of metabolism. Xenobiotica, 2002, 32, pp. 45-62. ISSN: 0049-8254. Heinonen S., Wähälä K., Adlercreutz H.: Identification of isoflavone metabolites dihydrodaidzein, dihydrogenistein, 6'-OH-O-dma, and cis-4-OHequol in human urine by gas chromatography-mass spectroscopy using authentic reference compounds. Analytical Biochemistry, 1999, 274, pp. 211219. ISSN: 0003-2697. Adlercreutz H., Fotsis T., Bannwart C., Wähälä K., Makela T., Brunow G., et al.: Determination of urinary lignans and phytoestrogen metabolites, potential antiestrogens, and anticarcinogens in urine of women on various habitual diets. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1986, 25, pp. 791-797. ISSN: 0960-0760. Waggle D.H., Bryan B.A. (Inventors): Recovery of isoflavones from soy molasses. Protein Technologies International Inc., assignee. 2003 July, 10. U.S.Patent 2, 003,0129,263. Křížová L., Veselý A., Třináctý J., Schulzová V., Hurajová A., Hajšlová J., Kvasničková E., Havlíková Š.: Changes in isoflavones concentrations in cheese during processing and ripening. Acta universitatis agriculturae et silviculturae mendelianae brunensis, 2011, LIX (1), pp. 153-162. ISSN: 12118516. Křížová L., Třináctý J., Hajšlová J., Havlíková Š.: The effect of technological processing on the kontent of isoflavones in bovine milk and dairy products. Soybean – Aplicationas and Technology, 2011, Prof. Tzi-Bun Ng (Ed.), pp. 95-110. ISBN: 978-953-307-207-4. Cohen L.A., Crespin J.S., Wolper C., Zang E.A., Pittman B., Zhao Z., Holt P.R.: Soy isoflavone intake and estrogen excretion patterns in young women: effect of probiotic administrativ. In Vivo, 2007, 21, pp. 507-512. ISSN: 17917549. Nielsen I.L., Williamson G.: Review of the factors affecting bioavailability of soy isoflavones in humus. Nutrition and Cancer, 2007, 57, pp. 1-10. ISSN: 0163-5581.
[108] Piotrowska K., Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Piskula M., Pilawski W., Bober A., Skarzynski D.J.: Phytoestrogens and thein metabolites inhibit the sensitivity of the bovine corpus luteum on luteotropic factors. Journal of Reproduction and Development, 2006, 52, pp. 33-41. ISSN: 0916-8818. [109] Woclawek-Potocka I., Bah M.M., Korzekwa A., Piskula M., Wiczkowski W., Depta A., Skarzynski D.J.: Soy-bean derived phytoestrogens regulate prostaglandin secretion in endometrium during the estrous cycle and early pregnancy in cattle. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 189199. ISSN: 1535-3702. [110] Woclawek-Potocka I., Okuda K., Acosta TJ., Korzekwa A., Pilawski W., Skarøyn´ski D.J.: Phytoestrogen metabolites are much more active than phytoestrogens themselves in increasing prostaglandin F2_ synthesis via prostaglandin F2_ synthase-like 2 stimulation in bovine endometrium. Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 2005, 78, pp. 202-217. ISSN: 1098-8823. [111] Woclawek-Potocka I., Acosta TJ., Korzekwa A., Bah M.M., Shibaya M., Okuda K., Skarzynski D.J.: Phytoestrogens modulace prostaglandin production in bovine endometrium: cell type specificity and intracellular mechanisms. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230, pp. 326-333. ISSN: 1535-3702. [112] Křížová L., Hadrová S., Schulzová V., Hajšlová J., Veselý A., Pavlok S.: Sójové isoflavony v krmné dávce laktujících dojnic a jejich prostup do mléka, metodická příručka, Agrovýzkum Rapotín s.r.o., 2011, s. 22. ISBN: 978-8087592-03-8. [113] Low Y.L., Taylor J.I., Grace P.B., Dowsett M., Scollen S., Dunning A.M., Mulligan A.A., Welch A.A., Luben R.N., Khaw K.T., Day N.E., Wareham N.J., Bingham S.A.: Phytoestrogen exposure correlation with plasma estradiol in postmenopausal women in European Prospective Investigation of Cancer and Nutrition-Norfolk may involve diet-gene interactions. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2005, 14 (1), pp. 213-220. ISSN: 1055-9965. [114] Low Y.L., Dunning A.M., Dowsett M., Luben R.N., Khaw K.T., Wareham N.J., Bingham S.A.: Implications of gene-environment interaction in studies of gene variants in breast cancer: an example of dietary isoflavones and the D356N polymorphism in the sex hormone-binding globulin gene. Cancer Research, 2006, 66 (18), pp. 8980-8983. ISSN: 0008-5472. [115] Low Y.L., Dunning A.M., Dowsett M., Folkerd E., Doody D., Taylor J., Bhaniani A., Luben R., Khaw K.T., Wareham N.J., Bingham S.A.: Phytoestrogen Exposure Is Associated with Circulating Sex Hormone Levels in Postmenopausal Women and Interact with ESR1 and NR1I2 Gene Variants. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2007, 16 (5), pp. 10091016. ISSN: 1055-9965.
47
[116] Adlercreutz, H.: Phyto-estrogens and cancer. The Lancet Oncology, 2002, 3 (6), pp. 364-373. ISSN: 1470-2045. [117] Stark A., Madar Z.: Phytoestrogens: a review of recent findings. Journal of Pediatric Endocrinology & Metabolism, 2002, 15 (5), pp. 561–572. ISSN: 0334-018X. [118] Bhathena S.J., Velasquez M.T.: Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition, 2002, 76 (6), pp. 1191-1201. ISSN: 0002-9165. [119] Arai Y., Watanabe S., Kimira M., Shimoi K., Mochizuki R., Kinae N.: Dietary intakes of flavonols, flavones and isoflavones by Japanese women and the inverse correlation between quercetin intake and plasma LDL cholesterol concentration. Journal of Nutrititon, 2000, 130, pp. 2243-2250. ISSN: 00223166. [120] Nielsen T.S., Purup S., Wärri A., Godschalk R.W., Hilakivi-Clarke L.: Effects of maternal exposure to cow's milk high or low in isoflavones on karcinogeninduced Maďary tumorigenesis among rat offspring. Cancer Prevention Research, 2011, 4 (5), pp. 1-8. ISSN: 1940-6215. [121] Frankenfeld C.L.: Dairy consumption is a signifiant correlate of urinary equol concentration in a representative samole of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition, March 9, 2011, pp. 1-8, doi: 10.3945/ajcn.111.011825. ISSN: 0002-9165.
48
8
VĚDECKÁ ČINNOST
8.1 PUBLIKACE Svobodová J.: Extrakce, separace a identifikace anthokyanových barviv ve slupkách bobulí červených odrůd Vitis vinifera L. Diplomová práce 2008, Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 58 s. 2. Křížová L., Svobodová J., Richter M., Homolka P., Hadrová S.: The effect of dietary soybean isoflavones on their concentration and total output in bovine milk. Advances in Animal Biosciences, Proceedings of the British Society of Animal Science (BSAS), March 2009, Southport, England, pp. 156. ISBN 9780-906562-65-9, ISSN 2040-4700. 3. Křížová L., Svobodová J., Pavlok S., Třináctý J., Nedělník J., Kocourek F.: Effect of Insect-protected maize silage (Bt-MON 810) on feeding value and digestibility of nutrients estimated with wethers. Slovak J. of Anim. Sci., 2009, 42 (3), pp. 125-130. ISSN 1337-9984. 4. Svobodová J., Třináctý J., Křížová L.: Sójové fytoestrogeny ve výživě dojnic. Náš chov, 2009, 10, s. 55-56. ISSN 0027-8068. 5. Svobodová J., Křížová L.: Výroční konference BSAS, Southport, Anglie, 30.3. – 1.4.2009. Výzkum v chovu skotu, 2009, 3, s. 88-89. ISSN 0139-7265. 6. Svobodová J., Richter M., Kadlec R., Křížová L., Třináctý J.: Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny. Výzkum v chovu skotu, 2009, 3, s. 84-85. ISSN 0139-7265. 7. Křížová L., Pavlok S., Svobodová J., Richter M., Doležal P.: Evaluation of nutritional quality, mycotoxins content and ensiling process of Bt-maize after artificial inoculation with selected Fusarium strains. Výzkum v chovu skotu, 2009, 51 (4), pp. 74-80. ISSN 0139-7265. 8. Svobodová J., Třináctý J.: Setkání expertů na mléko v Berlíně. Zemědělec, 2009, 17 (51), s. 25. ISSN 1211-3816. 9. Svobodová J.: Konference: "Potravinářský výzkum podporující vědecky založenou legislativu: příležitosti pro výrobce a spotřebitele". Výzkum v chovu skotu, 2009, 51 (4), s. 83-84. ISSN 0139-7265. 10. Svobodová J., Třináctý J.: Setkání odborníků na mléko a mléčné výrobky v Berlíně. Náš chov, 2010, 70 (2), s. 62-65. ISSN 0027-8068. 11. Křížová L., Třináctý J., Svobodová J., Richter M., Černý V., Jarošová A.: Efect of suplemental rumen-protected lysine, methionine or boths added to diet of lactating dairy cos on milk fatty acids profile. Acta Universitatis Mendelianae Brunensis, 2010, 58 (1), pp. 87-94. ISSN 1211-8516. 12. Třináctý J., Křížová L., Svobodová J., Richter M.: The Effect of Feeding Live Yeast Cultures on Ruminal pH Continuously Measured by a New Wireless Device in Dry Cows. Proceedings of the International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics, 15-17 June 2010, Košice, Slovakia, pp. 182-183. ISBN 978-80-970168-4-5. 1.
49
13. Richter M., Svobodová J., Křížová L., Třináctý J., Homolka P.: Effect of duodenal infusions of leucine on milk yield and plasma amino acids in dairy cows. Czech J. Anim. Sci., 2010, 55 (9), pp. 351–358. ISSN 1212-1819. 14. Watzková J., Křížová L., Pavlík A., Schulzová V., Hajšlová J., Lojza L.: The Effect of Soybean-Derived Phytoestrogens on Concentrations of Plasma Isoflavones, 15-keto-13,14-dihydroprostaglandin F2 and Progesterone in Dairy Cows. Acta Vet. Brno, 2010, 79, pp. 537-544. ISSN 0001-7213. 15. Watzková J., Třináctý J.: Problematika probiotik a prebiotik na mezinárodní konferenci. Náš chov, 2010, 70 (9), s. 5-6. ISSN 0027-8068. 16. Watzková J., Křížová L., Říha J.: Je povědomí o mléku a mléčných výrobcích dostatečné? Náš chov, 2010, 70 (9), s. 60-62. ISSN 0027-8068. 17. Třináctý J., Watzková J.: Cestovní zpráva z mezinárodní konference: „International Scientific Conference Probiotics and Prebiotics – IPC2010“. Výzkum v chovu skotu 2010, 52, 92. ISSN 0139-7265. 18. Křížová L., Watzková J., Třináctý J., Richter M.: Pijeme dostatečné množství mléka? Zemědělec, 2010, 18 (37), s. 26. ISSN 1211-3816. 19. Křížová L., Watzková J., Třináctý J., Richter M., Buchta M.: Rumen degradability and whole tract digestibility of flavonolignans from Milk thistle (Silybum marianum) seed expeller in dairy cows. Czech J. Anim. Sci. (přijato do tisku). ISSN 1212-1819. A další z oblasti imobilizace biologicky aktivních látek: 20. Watzková J., Říha J., Křížová L., Třináctý J.: Průzkum spotřebitelských postojů k mléku a mléčným výrobkům. Mlékařské listy, 2011, 121, s. 12-18. ISSN 1212-950X. 21. Stloukal R., Watzková J.: Immobilization of biologically active compounds. Book of Abstracts, Biotech 2011 & 5th Czech-Swiss Symposium with Exhibition, Prague, 15-17 June 2011, pp. 41. ISBN 978-80-7080-782-8. 22. Stloukal R., Watzková J., Gregušová B.: Dye decolorization by laccase immobilized into polyvinylalcohol matrix. Proceedings 40 th International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare, Slovakia, 27-31 May, 2013, p. 21. ISBN 978-80-89475-09-4. 8.2 UŽITNÉ VZORY A FUNKČNÍ VZORKY 1.
2.
50
Přihláška užitného vzoru PUV 2009-21097 – zápis UV 19728 (dne 15.6.2009). Název: Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny; Původci: Richter M., Kadlec R., Třináctý J., Svobodová J.; Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. Přihláška funkčního vzorku 2009 (identifikační kód G-R-002/09). Zařízení pro měření hodnot redox potenciálu bachorové tekutiny; Původci: Svobodová J., Richter M., Kadlec R., Křížová L., Třináctý J. Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.
3.
Přihláška funkčního vzorku 2010 (identifikační kód G-R-002/10). Zařízení pro měření hodnot pH bachorové tekutiny. Funkční vzorek; Původci: Křížová L., Richter M., Svobodová J., Třináctý J.; Přihlašovatel: Agrovýzkum Rapotín, s.r.o.
8.3 POSTERY 1.
2.
3.
4.
BSAS Southport, 2009 – Křížová L., Svobodová J., Richter M., Homolka P., Hadrová S.: The effect of dietary soybean isoflavones on their concentration and total output in bovine milk. IDF Berlín, 2009 – Třináctý J., Svobodová J., Křížová L., Vespalcová M.: Concentration and Output of Isoflavones and their Metabolites in Milk as Affected by Inclusion of Extruded Full-fat Soya into the Diet of Lactating Dairy Cows. NRC 2001 Brno, 2009 – Svobodová J., Křížová L., Šimůnek J.: Sójové fytoestrogeny ve výživě dojnic, prostup do mléka a jejich vliv na zdraví člověka. IPC Košice, 2010 – Třináctý J., Křížová L., Svobodová J., Richter M.: The Effect of Feeding Live Yeast Culturec on Ruminal pH Contunuously Measured by New Wireless Device in Dry Cows.
A další z oblasti imobilizace biologicky aktivních látek: 5. SSCHE Tantranské Matliare, 2013 Stloukal R., Watzková J., Gregušová B.: Dye decolorization by laccase immobilized into polyvinylalcohol matrix. 8.4 ÚČAST NA ODBORNÝCH KONFERENCÍCH Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti
30. března – 1. dubna 2009 BSAS Annual conference Southport, Anglie British Society of Animal Science (BSAS) Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku
Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti
22. – 24. září 2009 IDF World Dairy Summit United Dairy World 2009 Berlín, Německo International Dairy Federation (IDF) Aktivní účast ve formě posteru
Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti
22. říjen 2009 Šlechtění a výživa dojnic s využitím NRC 2001 Brno, Česká republika Výzkumný ústav pro chovu skotu, s r.o. Člen organizačního výboru, aktivní účast ve formě posteru
51
Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti
Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti Období Odborná konference Místo konání Organizace/pořadatel Typ účasti 8.5
15. – 17. červen 2010 International Scientific Conference Probiotics and Prebiotics – IPC2010 Košice, Slovensko Univerzita Pavla Josefa Šafárika v Košicích (UPJS) Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku 27. 31. květen 2013 40th International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering SSCHE2013 Tatranské Matliare, Slovensko Slovak Society of Chemical Engineering and Institute of Chemical and Environmental Engineering of Slovak University of Technology in Bratislava Aktivní účast ve formě posteru, příspěvek do sborníku
PROJEKTOVÁ ČINNOST
Značení CEP Název projektu Identifikační kód Poskytovatel Doba řešení Příjemce Řešitel Značení CEP Název projektu Identifikační kód Poskytovatel Doba řešení 52
12. listopad 2009 Vliv výživy hospodářských zvířat na kvalitu živočišných produktů s důrazem na zdraví člověka Pohořelice, Česká republika Výzkumný ústav pro chovu skotu, s r.o. Aktivní účast ve formě přednášky na téma: "Alergenní látky v potravinách živočišného původu" a "Vliv výživy zvířat na kvalitu masa, vajec a mléka"
CEP11-MSM-LA-U/01:1 Spolupráce v rámci International Dairy Federation (IDF) LA328 MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT) 1.3.2007 - 31.12.2010 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Dr. Ing. Jiří Třináctý CEP12-MSM-LA-U/01:1 Práce v British Society of Animal Science LA08040 MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT) 4.1.2008 - 31.12.2011
Příjemce Řešitel
Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Mgr. Ing. Ludmila Křížová, Ph.D.
Značení CEP Název projektu
CEP12-MSM-2B-U/01:1 Metody zjišťování exprese fytoestrogenů do mléka dojnic a jejich dynamika při technologickém zpracování 2B08073 MSM – Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (MŠMT) 1.3.2008 – 31.12.2011 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o. Mgr. Ing. Ludmila Křížová, Ph.D.
Identifikační kód Poskytovatel Doba řešení Příjemce Řešitel Název projektu Akronym projektu Číslo projektu Poskytovatel Program Výzva Doba řešení Příjemce Řešitel Název projektu Akronym projektu Číslo projektu Poskytovatel Program Výzva Doba řešení Příjemce Řešitel
Developing the Next Generation of Biocatalysts for Industrial Chemical Synthesis BIONEXGEN 266025 EU Framework Programme 7 (FP7) KBBE.2010.3.3-02 Biotechnology for 'greening' the chemical industry – Industrial bioprocesses for fine and speciality chemicals and intermediates FP7-KBBE-2010-4 1.2.2011 – 31.1.2014 The University of Manchester Prof. Nicholas J. Turner Mastering Bioprocess Integration and Intensification Across Scales BIOINTENSE 312148 EU Framework Programme 7 (FP7) KBBE.2012.3.3-03: Mastering integration and intensification of bioprocesses FP7-KBBE-2012-6-singlestage 1.8.2012 – 31.1.2015 Technical University of Denmark Prof. John Woodley
53
