VYSOKÉ U ENÍ TECHNICKÉ V BRN FAKULTA CHEMICKÁ
STUDIUM VYBRANÝCH TYP SIRNÝCH LÁTEK V PIVU A PIVOVARSKÝCH SUROVINÁCH
STUDY OF THE SELECTED TYPES OF SULPHUR COMPOUNDS IN BEER AND BREWING MATERIALS
Autoreferát doktorské diserta ní práce k získání v decké hodnosti Ph.D.
BRNO 2010
RNDr. Renata Mikulíková
Diserta ní práce byla vypracována v rámci doktorského studijního programu Chemie a technologie ochrany životního prost edí ve form kombinované
Uchaze :
RNDr. Renata Mikulíková Ústav chemie potravin a biotechnologií, FCH VUT Brno, R
Školitel:
Doc. RNDr. Ivana Márová, CSc. ÚPCHBT FCH VUT Brno, Purky ova 118, 612 00 Brno
Oponenti:
Autoreferát byl rozeslán dne:………………………
Obhajoba diserta ní práce se koná dne………………….p ed komisí pro obhajoby doktorských diserta ních prací na FCH VUT v Brn od…………….hodin.
S diserta ní prací je možno se seznámit na d kanátu Fakulty chemické Vysokého u ení technického v Brn , Purky ova 118.
2
OBSAH 1. P EHLED AKTUÁLNÍCH POZNATK ..................................................... 7 1.1. Výskyt a význam sirných látek v je meni, sladu a pivu ................................................ 7 1.2. Metody stanovení aminokyselin v biologických matricích............................................ 8 1.3. Metody stanovení sirných senzoricky aktivních látek ................................................... 9
2. CÍL PRÁCE ................................................................................................. 12 3. METODICKÉ POSTUPY ............................................................................ 13 3.1. Vzorky je men , slad a piv ...................................................................................... 13 3.2. Technologie mikrosladování ...................................................................................... 13 3.3. Stanovení methioninu, cysteinu a homocysteinu plynovou chromatografií v zrnu je mene, sladu a pivu ........................................................................................................ 14 3.4. Stanovení prekursor dimethylsulfidu plynovou chromatografií ve sladu a pivu......... 14 3.5. Stanovení sirných t kavých látek metodou HS-SPME/GC/FPD v pivu ...................... 14 3.6. Porovnání stanovení sirných t kavých látek metodou SPME, SPDE a TDAS ............. 15
4. VÝSLEDKY A DISKUSE .......................................................................... 15 4.1. Výsledky analýz sirných aminokyselin v zrnu je mene, sladu a pivu .......................... 15 4.2. Výsledky analýz prekursor dimethylsulfidu v zrnu je mene, sladu a pivu ................. 19 4.3. Sledování obsahu methioninu, cysteinu a prekursor dimethyldsulfidu b hem hvozd ní (pražení) sladu ................................................................................................... 19 4.4. Stanovení sirných t kavých látek v pivu ..................................................................... 22
5. ZÁV RY ..................................................................................................... 25 6. SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJ ............................................................ 27 7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOL ............................... 30 8. SEZNAM PRACÍ AUTORA ....................................................................... 31
3
ABSTRAKT V poslední dob je celosv tov a rovn ž v R v nována zvýšená pozornost senzoricky aktivním látkám ovliv ujícím kvalitu piva. Mezi senzoricky aktivními látkami ovliv ujícími zásadn kvalitu piva hrají významnou úlohu heterocyklické a sirné slou eniny, z nichž n které se vyzna ují vysokou senzorickou aktivitou i v extrémn nízkých koncentracích. Stopová množství chto slou enin, která lze b žn nalézt v potravinách, se spolupodílejí na vytvá ení jejich aroma a tento vliv lze obecn hodnotit jako p íznivý. U sladu, resp. u piva však toto platí jen v omezené mí e a p ítomnost heterocyklických a sirných látek se hodnotí spíše nep ízniv . Cílem p edložené práce je poskytnout p ehled o problematice sirných slou enin v je meni, sladu a pivu, popsat metabolické dráhy vedoucí k jejich vzniku a experimentáln ov it možnosti jejich stanovení s využitím moderních analytických metod. Sirné aminokyseliny, které jsou p irozenou sou ástí je mene, sladu i piva jsou prekursory vzniku t kavých sirných látek. Pro analytická sledování byly vybrány nej ast ji se vyskytující sirné aminokyseliny methionin, cystein a homocystein. K jejich stanovení v je meni, sladu a pivu byla použita metoda plynové chromatografie. P ed vlastní analýzou byly sirné aminokyseliny derivatizovány za vzniku t kavých N(O,S)-ethoxykarbonyl propyl ester , které byly následn identifikovány metodou plynové chromatografie ve spojení s hmotnostním detektorem (GC/MSD) a analyzovány metodou plynové chromatografie s plamenofotometrickým detektorem (GC/ FPD). ímá analýza sirných t kavých látek je možná jen z ídka, protože se nacházejí v analyzovaných matricích (slad, pivo) ve velmi nízkých koncentracích ( g/kg,l - ng/kg,l). P ed vlastní analýzou je t eba analyty extrahovat z matrice a zakoncentrovat. K extrakci a následnému zakoncentrování sirných t kavých látek byly experimentáln porovnávány moderní analytické metody SPME (mikroextrakce na pevnou fázi), SPDE (dynamická mikroextrakce na pevnou fázi) a TDAS (automatizovaná termická desorpce). Pro vlastní analýzu sirných kavých látek byla použita plynová chromatografie ve spojení s plamenofotometrickým detektorem. Byly sledovány tyto t kavé sirné látky: dimethylsulfid, dimethyldisulfid, dimethyltrisulfid, sirouhlík, ethylsulfid, diethyldisulfid, methionol, 3-methylthiofen, ethylthioacetát, 2-methyl-1buthanthiol. V analyzovaných vzorcích je mene byl ve významném množství detekován pouze methionin. Sledován byl nejen obsah, ale i závislost na odr a lokalit . Byly také sledovány zm ny obsahu methioninu, cysteinu a PDMS v pr hu sladování. Výsledky prokázaly výrazný pokles obsahu t chto látek v závislosti na teplot hvozd ní. Pro analýzy vybraných sirných t kavých látek v pivu byly u metody SPME testovány t i typy vláken. PEG – vlákno se stacionární fází Carbowax, PDMS – vlákno se stacionární fází polydimethylsiloxan a kombinované vlákno 4
CAR/PDMS – Carboxen a polydimethylsiloxan. Touto metodou byly detekovány sirouhlík, methionol, dimethylsulfid, 3-methylthiophen a diethyldisulfid. Obsah ostatních analyzovaných sirných t kavých látek byl pod mezí detekce. Dále byla ov ována možnost použití metod SPDE a TDAS. Bylo zjišt no, že ob metody jsou vhodné pro stanovení sirných t kavých látek v pivu.
ABSTRACT Much attention has been recently devoted to sensorially active substances affecting beer quality in the Czech Republic and worldwide. Among them, the heterocyclic and sulphur containing compounds play an important role, some of them with high sensorial activity even in extremely low concentrations. Trace amounts of these compounds, which can be frequently found in foods, participate in formation of their aroma and this effect can be generally evaluated as favorable However, in malt or beer it is true only to a limited extent and the presence of heterocyclic and sulphur containing compounds are in this respect assessed rather unfavorably. The aim of the present study was to provide a survey about of problems in the field of sulphur containing compounds in barley, malt and beer, to describe metabolic paths leading to their formation and to verify experimentally possibilities of their determination using modern analytical methods. Sulphur-containing amino acids are a natural part of barley, malt and beer and are precursors of the origin of volatile sulphur substances. The most frequently occurring sulphur amino acids, methionine, cysteine and homocysteine, were selected for analytical monitoring. The method of gas chromatography was used to determine sulphur-containing amino acids in barley, malt and beer. Prior to the analysis, sulphur-containing amino acids were derived and volatile N(O,S)-ethoxycarbonyl propyl esters were formed; they were subsequently analyzed using the gas chromatography with mass detector (GC/ MSD) and the gas chromatography with flame photo detector (GC/ FPD). Direct analysis of sulphur volatile substances is possible only rarely as they are found in the analyzed matrices (malt, beer) only in very low concentrations ( g/kg,l - ng/kg,l). Before the analysis, the analytes must be extracted from the matrix and concentrated. The modern analytical methods SPME (Solid Phase Micro Extraction), SPDE (Solid Phase Dynamic Extraction) and TDAS (Thermal Desorption Autosampler) were experimentally compared for the extraction and subsequent concentration of sulphur volatile substances. The method of gas chromatography with flame photo detector was used to determine sulphur volatile substances. Following volatile sulphur substances were monitored: dimethyl sulphide, dimethyl disulphide, dimethyl trisulphide, carbon disulphide, ethyl sulphide, diethyl disulphide, methionol, 3methylthiophen, ethyl thioacetate, 2-methyl-1-buthanthiol. 5
Only methionine was detected in significant amounts in the barley samples analyzed. Not only content but also dependence on a variety and locality were studied. Further, changes in methionine, cysteine and PDMS content during malting were followed. Results proved a significant decline in these substances content depending on the kilning temperature. Three types of fibers were tested for the analyses of the selected volatile sulphur substances in beer in the SPME method. PEG - a fiber with stationary phase Carbowax, PDMS - a fiber with stationary phase polydimethylsiloxan and a combined fiber CAR/PDMS - Carboxen and polydimethylsiloxan. Carbon disulphide, methionol, dimethyl sulphide, 3-methylthiophen and diethyl disulphide were detected with this method. Content of the other analyzed volatile sulphur substances was below the limit of detection. Further was tested usage the SPDE and TDAS methods. Both methods appear to be the suitable for the determination of volatile sulphur substances in beer.
6
1.
EHLED AKTUÁLNÍCH POZNATK
Pivo pat í již po staletí k tradi ním eským nápoj m. Vždy bylo považováno nejen za osv žující, ale také za velmi zdravý, výživný a chutný nápoj, který že být dokonce lékem na adu nemocí. V poslední dob je celosv tov a rovn ž v eské republice v nována zvýšená pozornost senzoricky aktivním látkám ovliv ujícím kvalitu piva. Na senzorickém charakteru i analytickém složení piva se spolupodílí kvalita pivovarských surovin, technologie výroby sladiny a mladiny i technologie kvašení a zrání piva. Mezi senzoricky aktivními látkami ovliv ujícími zásadn kvalitu piva hrají významnou úlohu heterocyklické a sirné slou eniny, z nichž které se vyzna ují vysokou senzorickou aktivitou i v extrémn nízkých koncentracích. Stopová množství t chto slou enin, které lze b žn nalézt v potravinách, se spolupodílejí na vytvá ení jejich aroma a tento vliv lze obecn hodnotit jako p íznivý. U sladu, resp. u piva to však platí jen ve velmi omezené mí e a p ítomnost heterocyklických a sirných látek se v tomto sm ru hodnotí spíše nep ízniv . Sirné slou eniny se do piva dostávají bu s výchozími surovinami (slad, chmel), nebo vznikají v pr hu chemických i enzymatických reakcí b hem jednotlivých etap výroby (rmutování, va ení, fermentace, stárnutí). V je meni a chmelu m že obsah sirných slou enin záviset nejen na odr , ale i na stebním míst , pr hu po así a použité technologii p stování. U sladu pak závisí obsah sirných látek p edevším na technologii sladování a eventuální kontaminaci nežádoucími mikroorganizmy.
1.1. Výskyt a význam sirných látek v je meni, sladu a pivu Sirné aminokyseliny jsou p irozenou sou ástí je mene, sladu i piva, kde p sobí jako prekursory t kavých sirných látek. Tyto látky pak mají nezanedbatelnou roli v senzorické kvalit piva. T kavé sirné látky mohou nep ízniv ovlivnit chu piva i ve velmi nízkých koncentracích. Proto je nutné znát nejen obsah jejich prekursor , ale i možnosti jejich vzniku v pr hu technologie výroby piva. Mezi hlavní meziprodukty vzniku senzoricky aktivních sirných látek b hem výroby piva pat í S-methylmethionin, který vzniká metylací methioninu v cyklu sirných aminokyselin [1,2]. B hem hvozd ní sladu, když teplota esáhne 60 °C, je S-methylmethionin degradován na homoserin a dimethylsulfid, takže nezanedbatelná ást m že být ztracena stržením do plynu. Degradace a syntéza S-methylmethioninu je závislá na vlhkosti a teplot zrna. Oxidací uvoln ného dimethysulfidu vzniká dimethylsulfoxid. Rychlost oxidace roste s teplotou hvozd ní. Rozsáhlejší oxidace dimethylsulfidu vede ke vzniku dimethylsulfonu, který není kvasinkami metabolizován [3,4].
7
Další cesta vzniku dimethylsulfidu zahrnuje rozklad methioninu vzájemnou reakcí s redukujícími cukry. Hlavním produktem této degradace je methional nebo od n j odvozený methionol. Dalšími dv ma produkty jsou dimethylsulfid a dimethylsulfoxid. Rozkladem methionalu m že vznikat ehylmethylsulfid. Termickým rozkladem cysteinu a cystinu vzniká sulfan [2,4]. hem rmutování p echází S-methylmethionin, vzniklý p i sladování, do roztoku, kde probíhá jeho rozklad. Vznikající dimethylsulfid je strháván vroucími parami. Rychlost vypa ování dimethylsulfidu je v této fázi rychlejší než jeho syntéza [2,4]. Po va ení dochází v chladnoucí mladin stále k degradaci S-methylmethioninu, ale již nedochází k odpa ování dimethylsulfidu [2,4]. hem výroby piva mohu vznikat také r zné alkylpolysulfidy. Prekursory chto alkylpolysulfid jsou trioly, S-alkylcystein sulfoxid, methional, thiosulfináty a methionin- sulfoxid [4,5]. hem fermentace piva jsou pivní kvasinky Saccharomyces cerevisiae schopné metabolizovat sirné aminokyseliny na jednodušší slou eniny, mimo jiné i na kavé sirné látky [6]. P i kvašení mladiny jsou kvasinky schopné metabolizovat S-methylmethionin, ale nejsou schopny ho degradovat na dimethylsulfid. Pravd podobn ho p em ují na methionin ú inkem methyltransferázy [4,6]. B hem fermentace kvasinky produkují sulfan, a to evážn z cysteinu, v menší mí e ze síran a zanedbateln z methioninu. Kvasinky jsou schopny b hem kvašení mladiny produkovat dimethylsulfid rovn ž enzymatickou redukcí dimethylsulfoxidu. Tato produkce dimethylsulfidu je nicmén kompenzována jeho ztrátou strháváním s CO2. Produkovány mohou být i polysulfidy, jako dimethyldisulfid a dimethyltrisulfid [4,7]. Kvasinky b hem života p ijímají organickou i anorganickou síru z prost edí, aby ji použily v metabolismu aminokyselin. Prekursory metabolizovanými kvasinkami jsou sírany, si itany, methionin, cystein, cystin, thiamin a glutathion [7]. V ležáckých pivech se nachází dimethyltrisulfid, který vzniká degradací methionalu a methionolu v erstvém pivu. Methional pochází p edevším ze Streckerovy eliminace methioninu p i sladování je mene [8,9]
1.2. Metody stanovení aminokyselin v biologických matricích Stanovení aminokyselin vyžaduje náro ný výb r vhodné separa ní metody, která zaru uje dostate nou p esnost a správnost [10]. Chromatografické metody pat í k nejd ležit jším metodám, které umož ují analyzovat složité sm si biologických molekul. Vysokoú inná kapalinová chromatografie (HPLC) V sou asné dob se k separaci a kvantifikaci aminokyselin používá hlavn kapalinová chromatografie. Nejstarší metodou použitou k separaci
8
aminokyselin byla chromatografie na iontom ni ích, která se v r zných modifikacích se v automatických analyzátorech aminokyselin používá dodnes. Nejnov jší metodou je kapalinová chromatografie založená na hydrofilních interakcích mezi stacionární fází a separovanými látkami (HILIC: hydrophilic interaction liquid chromatography) [11,12]. Stanovení stopových množství aminokyselin ve vzorcích pomocí HPLC je omezené, protože tyto látky nemají chromofory a mají tak velmi nízkou odezvu na b žn užívaných LC detektorech. Tento problém se obchází p evedením neabsorbujících aminokyselin na jejich deriváty. Vzniklé deriváty jsou snadno separovány gradientovou elucí o r zném složení mobilních fází p i teplot 35 ºC na reverzní fázi (C18, 150×3,9 mm). K detekci derivát aminokyselin se nej ast ji používá UV nebo fluorescen ní detektor. Jako derivatiza ní inidla se používají ninhydrin, fluorescamin, dansyl chloride, 4-fluoro-7-nitrobenzo-2, 1,3-oxadiazol, phenylisothiokyanát (PTIC), 9-fluorenyl-methoxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl), 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamát (AQC), o-phthalaldehyd a o-phthaldialdehyd (OPA). [13,14] Plynová chromatografie Stanovení sirných aminokyselin plynovou chromatografií je využíváno ím dál více, protože tato metoda je relativn jednoduchá, rychlá a p esná. P ed vlastní analýzou je t eba aminokyseliny derivatizovat. Derivatizace se provádí ke zvýšení t kavosti a zlepšení stability separovaných aminokyselin [15]. K derivatizaci aminokyselin lze využít n kolik derivatiza ních metod [15]. Esterifikace karboxylu bezvodým alkoholem v HCl a následná acylace dalších protických funk ních skupin. Silylace protických funk ních skupin za tepla v bezvodém prost edí pomocí trimethylsilyl- nebo tercbutyldimethylsilylderivát . Derivatizace alkyl-chlorformiáty. K detekci aminokyselin lze použít plameno-ioniza ní detektor FID (Flame ionization detection) i plamenofotometrický detektor FPD (Flame photometric detection) – selektivní pro sirné látky. V sou asné dob se v plynové chromatografii používají hmotnostní detektory, protože umož ují potvrzení identifikace látek pomocí hmotnostních spekter. [16,17,18] Pro analýzu sirných aminokyselin metodou GC - MS se používají kolony s mírn polární fází 5 % - phenyl-95 % - dimethylpolysiloxanu [16].
1.3. Metody stanovení sirných senzoricky aktivních látek ímá analýza sirných senzoricky aktivních látek je možná jen z ídka, protože se nacházejí v analyzovaných matricích (slad, pivo) ve velmi nízkých koncentracích ( g.kg–1,l–1 – ng.kg–1,l–1). P ed vlastní analýzou je t eba analyty extrahovat z matrice a zakoncentrovat. Výb r vhodné metody p ípravy vzorku 9
pak výrazn ovliv uje rychlost, spolehlivost a p esnost analýzy [10]. Pro zakoncentrování t kavých látek se používá destilace s vodní parou, headspace metody (extrakce plynem) a mikroextrakce tuhou fází (SPME) [19,20]. Destilace s vodní parou Destilace je fyzikální separa ní metoda, která umož uje d lení složek kapalné sm si na základ jejich rozdílné t kavosti. Destilace s vodní parou umož uje získat ze vzorku t kavé složky p i teplotách nižších než je jejich bod varu a zabránit tak ztrátám n kterých termolabilních látek [10]. Headspace techniky kavé látky lze z kapalných i rozm ln ných pevných vzork izolovat šetrnou extrakcí plynem, tedy s využitím tzv. headspace techniky (HS). Podstatou chto metod je analýza plynné fáze, která byla v kontaktu s extrahovaným materiálem, v ideálním p ípad až do ustavení rovnovážné distribuce t kavých látek mezi plynnou a kondenzovanou (kapalnou nebo pevnou) fází, která je popsána distribu ní konstantou jednotlivých složek v dané soustav . Rozlišují se dva zp soby uspo ádání headspace analýzy [19,20]: Statická headspace V tomto uspo ádání se analyzuje vzorek plynu odebraný z prostoru nad kondenzovanou fází ve statickém uzav eném systému. Dynamická headspace Kondenzovaná fáze se kontinuáln extrahuje proudem inertního plynu (tzv. stripování), z n hož jsou vynášené páry t kavých látek vhodným zp sobem zachycovány. Mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextraction – SPME) Mikroextrakce tuhou fází (SPME) je bezrozpoušt dlová metoda p ípravy vzorku. Metoda nevyžaduje složitou instrumentaci a je založena na sorpci analytu malým množstvím extrak ní fáze na povrchu k emenného vlákna. Analyty se sorbují do dosažení rovnovážného stavu. Množství extrahovaného analytu závisí na hodnot rozd lovacího koeficientu analyt – vlákno [20]. Existuje n kolik typ vláken vhodných pro extrakci t kavých látek. Afinita vlákna v i analytu závisí na polarit stacionární fáze a na vlastnostech daného analytu. Nap íklad nepolární polydimethylsiloxanové (PDMS) vlákno je preferováno pro extrakci nepolárních analyt , kterými jsou i n které t kavé aromatické látky. Více polární polyakrylátové vlákno (PA) je vhodn jší pro více polární látky, jako jsou fenoly nebo alkoholy. Kombinovaná vlákna, obsahující divinylbenzen (DVB) nebo Carboxen (CAR), zvyšují reten ní kapacitu [20,22].
10
Dynamická mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Dynamic Microextraction – SPDE) SPDE je nov jší a modern jší uspo ádání SPME. Jedná se o dynamickou extrakci kapalných nebo plynných vzork . Princip metody SPDE je obdobný jako SPME s tím rozdílem, že sorbent je nanesen na vnit ní povrch jehly ipojené k plynot sné st íka ce. Opakovaným nabíráním plynné (HS – SPME) nebo kapalné fáze (DI – SPME) vzorku dochází k zakoncentrování stanovovaných analyt uvnit jehly. Tento zp sob extrakce je robustn jší než SPME a umož uje stanovit i velmi nízké koncentrace. Single-drop mikroextrakce (Single Drop Microextraction – SDME) V posledních letech se za ala krom SPME extrakce používat SDME – tzv. single-drop mikroextrakce. SDME je miniaturizace tradi ní extrakce kapalinakapalina, kde je významn sníženo množství organického rozpoušt dla. Probíhá na kapce rozpoušt dla vytla eného z jehly st íka ky se zkoseným hrotem. Metoda je vhodná pro extrakci t kavých látek. Na základ srovnání SPME a SDME metod je metoda SDME doporu ována také pro stanovení kavých sirných látek v pivu a jiných nápojích plynovou chromatografií s FPD detekcí. [23]. ITEX – In-Tube Exraction ITEX je nová technika p ípravy vzork pro GC analýzy t kavých a semit kavých látek v plynných, kapalných a pevných matricích. U této techniky je plynná fáze pomocí head-space st íka ky prosávána a adsorbována na sorbent. Po ukon ení adsorpce jsou analyty tepeln desorbovány p ímo do nást ikového bloku plynového chromatografu. Pro tuto techniku se mohou používat r zné nápln (sorbenty) podle typu aplikace. 1.3.1. Chromatografické stanovení sirných t kavých látek v pivu a surovinách Pro analýzu sirných t kavých látek bývá nej ast ji využívána plynová chromatografie ve spojení se selektivními detektory. Selektivní detektory jsou obzvlášt výhodné p i analýzách rozmanitých sirných látek ve složitých matricích. Tyto detektory mohou redukovat asov náro né išt ní vzork , které m že být p inou zne išt ní vzork dalšími kontaminanty, nebo dokonce ztráty stanovovaných analyt [58]. Stále nejvíce používaným detektorem pro analýzu sirných látek je plamenový fotometrický detektor (FPD). Pro analýzu t kavých sirných látek metodou plynové chromatografie se používají kolony s polární stacionární fází polyethylenglykolu nebo s mírn polární fází 5 % - phenyl-95 % dimethylpolysiloxanu [19,24,25]. 11
2. CÍL PRÁCE Cílem diserta ní práce bylo sledování vybraných sirných aminokyselin a produkt jejich metabolických reakcí, které jsou významnými chu ovými a aromatickými látkami a mohou mít nezanedbatelný vliv na výsledný senzorický profil piva. Sirné slou eniny se do piva dostávají bu s výchozími materiály, nebo v pr hu jednotlivých etap výroby. Za ú elem spln ní uvedených cíl byly v rámci diserta ní práce ešeny následující díl í úkoly: optimalizace analytických postup analýza vybraných typ sirných látek (sirné aminokyseliny methionin, cystein, homocystein a S-methylmethionin) a produkt jejich metabolizace (senzoricky aktivní sirné látky - sulfidy, polysulfidy, thioalkoholy, thioestery) v pivu a pivovarských surovinách optimalizace extrakce, derivatizace a GC/FPD a GC/MS metody stanovení sirných aminokyselin a jejich metabolit optimalizace SPME extrakce a GC/MSD, GC/FPD metody p i stanovení sirných senzoricky aktivních látek v pivu a pivovarských surovinách (sulfidy, polysulfidy, thioalkoholy, thioestery) identifikace metabolit sirných látek pomocí GC/MS porovnání extrak ních SPME a headspace technik testování možností stanovení sirných látek (sirné aminokyseliny) metodou HPLC, p ípadn LC/MS sledování obsahu sirných látek v je meni a sladu ve vztahu k odr je mene ve vztahu k p stebnímu místu je mene ve vztahu k aplikaci fungicid ve vztahu k technologii výroby sladu sledování zm n obsahu sirných aminokyselin a jejich metabolit v ad je men – slad – pivo sledování obsahu sirných látek v pivu ve vztahu k technologii výroby piva
12
3. METODICKÉ POSTUPY 3.1. Vzorky je men , slad a piv Ke sledování obsahu volných sirných aminokyselin v zrnu je mene a sladu, jako prekursor senzoricky aktivních t kavých sirných látek, byly analyzovány vybrané odr dy je mene z ro ník 2006, 2007, 2008 a 2009. Ze skliz ového ro níku 2006 byly analyzovány odr dy jarního je mene Bojos, Jersey, Radegast, Sebastian a Tolar, které pocházely z p ti šlechtitelských a zkušebních stanic (Branišovice, Lednice, V rovany, Vysoká a Žatec). Analyzované vzorky sladu byly vyrobeny ze ty odr d je mene (Bojos, Jersey, Tolar a Radegast) z lokalit Branišovice, V rovany a Vysoká. Vzorky zrna 5 odr d je mene (Bojos, Jersey, Radegast, Sebastian a Tolar) ze sklizní 2007, 2008 a 2009 pocházely ze 4 šlechtitelských a zkušebních stanic (Branišovice, Hrub ice, Krásné Údolí a Lednice). Z ro ník 2007, 2008 a 2009 byly z každé stanice dodány od každé odr dy 2 vzorky. Jeden pocházel z porost ošet eného fungicidem proti chorobám pat stébel a proti listovým a klasovým chorobám, druhý vzorek pocházel z porostu bez fungicidního ošet ení. Ze všech variant byly vyrobeny slady, které byly dále analyzovány. U vybraného vzorku sladu bylo v pr hu hvozd ní (pražení) sladu odebíráno vždy 18 vzork . První vzorek byl odebrán p i 50 °C a poslední p i 220 °C, teplotní interval odebírání byl 10 °C. Ke sledování obsahu volných sirných aminokyselin a sirných t kavých látek v pivu bylo analyzováno celkem 35 r zných druh piv zakoupených v obchodní síti. Pro analýzu bylo vybráno 18 sv tlých ležák , 8 sv tlých vý epních piv, 6 tmavých piv a 3 nealkoholická piva.
3.2. Technologie mikrosladování Sladování 0,5 kg vzork probíhalo v mikrosladovn fy KVM ( R). Pro laboratorní sladování byl použit následující postup tradi používaný ve VÚPS, který je v podstat totožný s metodikou MEBAK [26]: Namá ka: teplota vody a teplota vzduchu v pr hu vzdušných estávek 14.5 °C. Délka namá ek - 1. den - 5 h, 2. den - 4 h, 3. den byl obsah vody v klí ícím zrnu namá kou nebo kropením upraven na hodnotu 45,5 %. Klí ení: teplota v pr hu klí ení byla 14,5 °C. Celkový as má ení a klí ení byl 144 hod. Hvozd ní: jednolískový elektricky vyh ívaný hvozd. Celková doba klí ení byla 22 h, p edsoušení probíhalo p i teplot 55 °C, teplota hvozd ní byla 80 °C po 4 h. Technologické parametry byly stanoveny podle metodik uvedených v publikacích EBC, MEBAK a Basa ová et al. [27]. 13
3.3. Stanovení methioninu, cysteinu a homocysteinu plynovou chromatografií v zrnu je mene, sladu a pivu Analýzy naderivatizovaných sirných aminokyselin byly provád ny na plynovém chromatografu Trace GC Ultra s plamenofotometrickým detektorem (FPD) selektivním pro síru. K separaci analyzovaných látek byla použita kapilární kolona RTX-5 (15 m x 0,32 mm i.d., 0,25 m, stacionární fáze 5 % difenyl - 95 % dimethylpolysiloxan). Identifikace byla provedena na plynovém chromatografu Trace GC Ultra s hmotnostním detektorem DSQ. K separaci analyzovaných látek byla použita kapilární kolona DB5-MS (30m x 0,25 mm i.d., 0,25 m, stacionární fáze 5 % difenyl - 95 % dimethyl polysiloxan). Pro separaci analyzovaných látek byla také testována kapilární kolona OV1701 (30 m x 0,25 mm i.d., 0,25 m stacionární fáze7 % methylkyanopropylsilikon a 7 % fenylkyanopropylsilikon).
3.4. Stanovení prekursor dimethylsulfidu plynovou chromatografií ve sladu a pivu Ve vzorcích sladu a piva byly stanoveny prekursory dimethylsulfidu - PDMS (s-methylmethionin je hlavní prekursor dimethylsulfidu a je obecn ozna ován jako PDMS) podle metodiky VÚPS 3000. Metoda je založena na alkalické hydrolýze prekursor dimethylsulfidu na dimethylsulfid a jeho následném stanovení plynovou chromatografií, metodou statické rovnovážné extrakce plynem. Z rozdíl obsahu dimethylsulfidu p ed a po hydrolýze se ur í jejich obsah ve vzorku. Tato metoda je ve VÚPS akreditována. Vzorky sladu byly ipraveny podle akreditované metody a analyzovány metodou plynové chromatografie s FPD detektorem.
3.5. Stanovení sirných t kavých látek metodou HSSPME/GC/FPD v pivu Metodou extrakce HS-SPME byly pomocí GC/FPD analyzovány tyto sirné kavé látky – dimethylsulfid (DMS), dimethyldisulfid (DMDS), dimethyltrisulfid DMTS), sirouhlík (CS2), ethanthiol (EtSH), diethyldisulfid (DEDS), methionol, 3-methylthiofen (3MTP), ethylthioacetát (EtSAc) a 2methyl-1-buthanthiol (2MBT). Senzoricky aktivní sirné látky byly po tepelné desorpci separovány na plynovém chromatografu s FPD detektorem. Tepelná desorpce probíhala v nást ikovém bloku (PTV injektor vhodný pro SPME desorpci) plynového chromatografu 3 min p i 250 °C. P i desorpci byla na držáku SPME nastavena maximální hloubka pro vsunutí jehly do PTV injektoru (4,5 cm). Pro separaci analyzovaných látek byla použita kapilární kolona GS-Gaspro (60 m x 0,32 mm). Kvantifikace byla provedena metodou vnit ního standardu a
14
vyhodnocena pomocí softwaru ChromCard. Metoda byla validována pomocí programu EffiValidation 3.0.
3.6. Porovnání stanovení sirných t kavých látek metodou SPME, SPDE a TDAS Ke stanovení sirných t kavých látek byly porovnávány metody automatizované SPME (mikroextrakce na pevnou fázi), SPDE (dynamická mikroextrakce na pevnou fázi) a TDAS (automatizovaná termická desorpce). Porovnání bylo provád no na vzorku sm sného standardu, který obsahoval dimethylsulfid (DMS), dimethyldisulfid (DMDS), dimethyltrisulfid (DMTS), sirouhlík (CS2), ethanthiol (EtSH), diethyldisulfid (DEDS), methionol, 3-methylthiofen (3MTP), ethylthioacetát (EtSAc) a 2-methyl-1-buthanthiol (2MBT). Podle ploch pík sledovaných analyt byly nalezeny vhodné podmínky pro jejich stanovení.
4. VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1. Výsledky analýz sirných aminokyselin v zrnu je mene, sladu a pivu Stanovení sirných aminokyselin vyžaduje v první ad výb r vhodné separa ní metody, která zaru uje dostate nou p esnost a správnost. Analýza aminokyselin je navíc komplikována p ítomností dalších složek v analyzovaných matricích, které dané stanovení mohou rušit, p ípadn mohou poskytovat falešn pozitivní výsledky. Jedním z d ležitých krok p i analýze sirných aminokyselin je jejich extrakce z matrice a p íprava vzorku k vlastní analýze. Pro extrakci sirných aminokyselin (methioninu a cysteinu) byly porovnávány 2 extrak ní média: sm s methanol – deionizovaná voda v pom ru 4:1 a samotná deionizovaná voda. Výsledky prokázaly dobrou rozpustnost sirných aminokyselin ve vod [1]. Výt žnost extrakce deionizovanou vodou byla u methioninu 2,9-krát vyšší a u cysteinu pak dokonce 3,8-krát vyšší než u extrakce sm sí methanol – deionizovaná voda. Dále byly porovnávány dva zp soby uspo ádání extrakce, a to v ultrazvukové lázni a na t epa ce. Mezi porovnávanými zp soby extrakce nebyly zjišt ny významné rozdíly, takže byl pro analýzy reálných vzork vybrán jednodušší a mén hlu ný zp sob uspo ádání, a to na t epa ce. U provedení extrakce na epa ce byla sou asn sledována optimální doba trvání extrakce. Maximální výt žnost byla dosažena p i dob extrakce nejmén 15 min. Zcela p evládajícím postupem analýzy obsahu sirných aminokyselin v reálných vzorcích jsou chromatografické metody [10,11,14], p edevším plynová chromatografie a kapalinová chromatografie. U plynové chromatografi lze navíc využít selektivní detektory [15,16]. Sirné aminokyseliny však nelze 15
plynovou chromatografií stanovit bez derivatizace. Derivatizace se provádí ke zvýšení t kavosti a zlepšení stability separovaných aminokyselin [15]. Hušek a kol. [28] dosáhly nejlepších výsledk p i použití alkylchloroformiát jako derivatiza ního inidla pro derivatizaci homocysteinu. V experimentální ásti edložené práce byly pro analýzu sirných aminokyselin porovnávány postupy derivatizace s pomocí ethyl- a methylchloroformiátu, analýza byla provedena modifikovanou metodou dle [28]. Výsledky potvrdily srovnatelnou možnost použití obou derivatiza ních inidel u analýzy methioninu a cysteinu. Pro stanovení homocysteinu byly dosaženy lepší výsledky p i použití ethylchloroformiátu. Ethylchloroformiát byl proto v dalších experimentech použit jako derivatiza ní inidlo pro stanovení všech analyzovaných sirných aminokyselin- methioninu, cysteinu i homocysteinu. Pro analýzu sirných aminokyselin metodou plynové chromatografie se používají kapilární kolony s mírn polární fází tvo enou 5 % fenyl - 95 % dimethylpolysiloxanem [28]. Separace vzniklých alkylchroroformiát sirných aminokyselin byla v p edložené práci provád na na kapilárních kolonách s r znou délkou a polaritou (OV-1701, DB-5, RTX-5). Zatímco kapilární kolony DB-5 a RTX-5 s mírn polární fází tvo enou 5 % bifenyl- 95 % dimethylpolysiloxanem se b žn používají pro analýzu sirných aminokyselin [15,28], kolona OV-1701 se sm snou st edn polární fází tvo enou 7 % methylkyanopropylsilikonu a 7 % fenylkyanopropylsilikonu byla testována jako alternativní možnost. Provedené analýzy prokázaly možnost použití všech t í testovaných kolon pro separaci sirných aminokyselin. Pro rutinní analýzy byla zvolena na základ dosažených výsledk kapilární kolona RTX-5. Na této kolon byly sledované látky separovány v krátkém ase, itom však se srovnatelnou separa ní ú inností jako na kolon DB-5MS a OV-1701. To umožní zrychlení analýzy sérií reálných vzork za ú inných podmínek separace. Vypracování spolehlivé metody pro analýzu parametr kvality surovin v reálných vzorcích je d ležité z hlediska praktické aplikace v rámci monitoringu pivovarského procesu. Optimalizovanou metodou GC/FPD byl analyzován obsah methioninu, cysteinu a homocysteinu ve vzorcích zrna je mene a sladu získaných v pr hu let 2006 – 2009. V roce 2006 byly analyzovány vzorky zrna je mene odr d Bojos, Jersey, Radegast, Sebastian a Tolar z lokalit Branišovice, Lednice, V rovany, Vysoká a Žatec. Vzhledem k abnormálnímu pr hu po así v roce 2006 došlo k naklí ení zrna je mene již na poli (tzv. porostlost). V n kterých lokalitách byla porostlost tak vysoká, že z vyp stovaných zrn je mene nemohl být vyroben slad. Proto byly v roce 2006 analyzovány slady pouze z lokalit Branišovice, V rovany a Vysoká. U ro níku 2006 byly pozitivní nálezy vyšší koncentrace methioninu zjišt ny i v zrnu je mene. Nam ené hodnoty se pohybovaly od 3,6 do 19,5 mg.kg–1. Nejvyšší obsahy methioninu byly 16
prokázány u odr dy Jersey v lokalit Vysoká a Žatec. Obsah methioninu v odr Radegast byl pod mezí stanovení u všech sledovaných lokalit. Nam ené hodnoty methioninu ve sladu se u ro níku 2006 pohybovaly v rozmezí 50,0 – 85,0 mg.kg–1. V d sledku anomálního pr hu po así v roce 2006 bylo možné provést porovnání obsahu methioninu v zrnu je mene a ve sladu (obr.1). Bylo zjišt no, že b hem sladování dochází v zrnu je mene v d sledku aktivace enzym k výrazným metabolickým zm nám, což má za následek zvýšení obsahu volného methioninu ve sladu. Vzorky zrna je mene z ro ník 2007 - 2009 odr d Bojos, Jersey, Radegast, Seabastian a Tolar pocházely z lokalit Branišovice, Hrub ice, Krásné Údolí a Lednice. Ze všech t chto vzork je mene byl vyroben rovn ž slad. Obsah methioninu ve všech vzorcích analyzovaného zrna je mene byl pod mezí stanovení, zatímco hladiny methioninu ve sladech vyrobených ze zrna je mene z ro ník 2007 – 2009 se pohybovaly v rozmezí od 44,4 – 200,9 mg.kg–1. Ve sledovaných ro nících nebyla prokázána závislost obsahu methioninu ve sladu na odr , lokalit a na ošet ení porost fungicidy, což potvrzuje roli methioninu jakožto primárního metabolitu.
Obr. 1: Výsledky stanovení obsahu methioninu ve sladu v závislosti na lokalit a odr , 2006 Ve všech analyzovaných pivech byl stanoven pouze methionin. Obsahy methioninu se ve sv tlých ležáckých pivech pohybovaly v rozmezí 3,4 – 12,9 mg.l–1, ve vý epních pivech mezi 4,0 – 6,0 mg.l–1, v tmavých pivech v rozmezí 3,4 – 6,3 mg.l–1 a v nealkoholických pivech v rozmezí 3,4-3,7 mg.l–1. Obsah methioninu se celkov pohyboval v rozmezí 3,4 - 13,0 mg.l–1. 17
Nejvyrovnan jší obsahy byly u tmavých a u nealkoholických piv. Nejv tší rozdíly v obsahu methioninu byly u ležák , kde nejvyšší obsah methioninu byl prokázán u piva Bernard tradi ní. 4.1.1. Porovnání HPLC a GC metod pro stanovení sirných aminokyselin Jako alternativa k plynové chromatografii byla testována i možnost stanovení methioninu metodou kapalinové chromatografie s detekcí pomocí diodového pole (PDA detektor). Stanovení stopových množství sirných aminokyselin je pomocí HPLC omezené, protože tyto látky nemají chromofory a mají tak velmi nízkou odezvu. Tento problém se obchází derivatizací. Pro stanovení methionu kapalinovou chromatografií bylo použito jedno z nov jších derivatiza ních inidel – 6-aminoquinolyl-N-hydroxysukcinimidylkarbamát (AQC). P íprava derivát byla provedena komer ním setem firmy Waters. Porovnání HPLC a GC metod bylo provedeno u 10 vzork sladu. Pro analýzy byly vybrány vzorky slad ze sklizn roku 2009 zám rn s rozdílnými obsahy methioninu. Výsledky stanovení methioninu HPLC a GC jsou uvedeny na obr. 2. P i porovnání výsledk stanovení methioninu metodou GC a HPLC se hodnoty získané u obou typ analýz pohybovaly v rámci rozší ené kombinované nejistoty. Na základ t chto dosažených výsledk lze považovat ob metody za srovnatelné. P i výb ru konkrétní techniky záleží pak zejména na dostupné instrumentaci v dané laborato i a p ípadn zkušenosti analytika.
Obr. 2: Porovnání výsledk PDA a GC/FPD
stanovení obsahu methioninu metodou HPLC/
18
4.2. Výsledky analýz prekursor dimethylsulfidu v zrnu je mene, sladu a pivu Akreditovanou metodou VÚPS, a.s., byl stanoven obsah prekursor dimethylsulfidu (PDMS) ve sladu v ro nících 2007 – 2009 a ve vybraných vzorcích piv. Ke sledování obsahu volných sirných sirných aminokyselin a prekursor dimethylsulfidu (PDMS) v pivu bylo analyzováno 18 ležák , 8 vý epních piv, 6 tmavých piv a 3 nealkoholická piva. Obsahy prekursor dimethylsulfidu (PDMS) se ve sladech z ro ník 2007 – 2009 pohybovaly v rozmezí 3,7 – 17,3 mg.kg–1. Také u t chto vzork nebyly prokázány závislosti obsahu PDMS na odr , lokalit a na ošet ení porost fungicidy. Tuto skute nost potvrdilo i statistické vyhodnocení. Pouze u odr dy Jersey byla patrná tendence nižšího obsahu methioninu na všech sledovaných lokalitách u ro ník 2008 a 2009. Obsahy prekursor dimethylsulfidu v pivu se celkov pohybovaly v rozmezí 5,7 - 64,6 g.l–1 a hodnoty kolísaly podle producenta piva. Nejvyšší obsah prekursor dimethylsulfidu byl prokázán podobn jako u methioninu u piva Bernard tradi ní (64,6 g.l–1), což potvrzuje roli methioninu jako prekursoru PDMS. Ze získaných výsledk vyplývá, že obsah methioninu a PDMS úzce souvisí s technologií výroby piva.
4.3. Sledování obsahu methioninu, cysteinu a prekursor dimethyldsulfidu b hem hvozd ní (pražení) sladu Jak již bylo uvedeno, hladiny cysteinu a homocysteinu byly v zrnu je mene i ve sladu ve všech ro nících, lokalitách, odr dách a v pivu pod mezí stanovení. U vzorku zeleného sladu (naklí eného sladu, kdy st elka dosahuje 3/4 délky zrna), získaného ze sladovny Bernard, byla sledována závislost obsahu methioninu, cysteinu a PDMS na teplot hvozd ní (resp. pražení) sladu. Hvozd ní je záv re nou fází výroby sladu. Zatímco zelený slad není v d sledku vysokého obsahu vody skladovatelný, snížením obsahu vody hem hvozd ní se slad stává skladovatelným a stabilním. Zelený slad je na hvozd nejprve p edsušen p i teplotách do 60 °C, následn pak vyh át a dotažen p i teplotách od 80 do 105 °C. Hvozd ní zastavuje životní pochody zárodku, tzn. zastavuje se klí ení a další lušt ní zrna. B hem hvozd ní se tvo í barevné a aromatické látky, které jsou charakteristické pro jednotlivé druhy slad a piv. [2,5] Sirné aminokyseliny (cystein, methionin a jeho metabolit smethylmethionin - PDMS) obsažené ve sladu, vznikají hlavn p i klí ení [2,3,29]. P sobením zvýšených teplot p i hvozd ní dochází k jejich degradaci za vzniku t kavého dimethylsulfidu a sulfanu [2]. Toto potvrdily i výsledky dosažené v p edložené práci (obr.3-5). Nejvyšší hodnoty methioninu, cysteinu a PDMS byly p i sledování závislosti na teplot hvozd ní nam eny v zeleném (naklí eném) sladu. Teploty nad 70 °C vedly k poklesu hodnot uvedených parametr na minimum, což je z ejm i vysv tlením, pro nebyly v žádném 19
vzorku hotového sladu nam eny hodnoty cysteinu nad mezí detekce. Od 50 °C docházelo k pomalému poklesu hodnot cysteinu a p i 70 °C došlo k jeho k degradaci na sulfan a ke snížení obsahu pod mez detekce. U methioninu došlo k výraznému poklesu obsahu p i teplot 60° C. P i t chto teplotách probíhají v zrn chemické reakce za vzniku barevných a aromatických látek. Od 60° C docházelo k pozvolnému snížení obsahu methioninu na hodnoty, které byly stanoveny ve sladech p i monitorování. K dalšímu výraznému poklesu cca o 50 % došlo p i teplotách 100 a 110° C. Od 130 °C byl již obsah methioninu pod mezí stanovení. P i sledování obsahu PDMS byla závislost jeho obsahu na vzr stající teplot obdobná k ivce methioninu. B hem hvozd ní sladu, když teplota p esáhla 60 °C, došlo k výraznému poklesu PDMS a p i teplot 80 °C byly hodnoty na úrovni obvyklých hodnot ve sv tlých sladech (2,0 – 6,0 mg.kg–1).
Obr. 3: Závislost obsahu methioninu na teplot hvozd ní (pražení) sladu. i vyhodnocování obsahu methioninu, cysteinu a PDMS ve sladech odebíraných p i teplotách 50 až 220 °C vykazovaly slady snižující se koncentraci sledovaných látek se vzr stající teplotou. Tato závislost je zp sobena tepelnou degradací t chto sirných slou enin na senzoricky aktivní látky [2].
20
Obr. 4: Závislost obsahu cysteinu na teplot hvozd ní (pražení) sladu
Obr. 5: Závislost obsahu PDMS na teplot hvozd ní (pražení) sladu.
21
4.4. Stanovení sirných t kavých látek v pivu 4.4.1. Analýza vzork piv Se sladem vstupuje do procesu výroby piva velké množství slou enin, které fungují jako prekursory vzniku t kavých senzoricky nežádoucích látek [2]. Další sirné slou eniny se dostávají do piva s chmelem. Sirné slou eniny chmelových silic typu terpenových sulfid , polysulfid a thioester mohou nep ízniv ovlivnit v ni a chu piva [30]. Je to nap . sulfan, methanthiol, dimethylsulfid, dimethyldisulfid, dimethyltrisulfid, dimethyltetrasulfid, 3methylthiofen. Za senzoricky nejaktivn jší již v koncentracích 0,2 % se považují dimethyltrisulfid a dimethyltetrasulfid, které dávají pivu cibulovou ni. V chmelu se mohou vyskytovat i další sirné slou eniny jako diethyldisulfid a ethanthiol [2,30]. Na základ literárních údaj byly ke sledování v pivu vybrány následující kavé sirné látky: dimethylsulfid, dimethyldisulfid, dimethyltrisulfid, sirouhlík, ethanthiol, diethyldisulfid, methionol, 3-methylthiofen, ethylthioacetát a 2-methyl-1-buthanthiol. Pro stanovení t chto sirných senzoricky aktivních látek byla zvolena relativn nová technika zakoncentrování pomocí HS-SPME ve spojení s GC a FPD detektorem selektivním pro síru. Tuto kombinaci pro stanovení sirných t kavých látek popisuje n kolik autor [24,25]. V p edložené práci byla testována t i komer vyráb na vlákna: PEG – vlákno potažené Carbowaxem, PDMS – vlákno potažené polydimethylsiloxanem a CAR/PDMS – kombinované vlákno potažené sm sí Carboxen a polydimethylsiloxan. Na základ odezvy stanovovaných analyt bylo jako nejvhodn jší vlákno vybráno kombinované vlákno CAR/PDMS [25]. Pro vybrané vlákno byla dále optimalizována doba extrace analyt na vlákno na 30 min p i 45°C [25]. Optimalizovanou metodou HS-SPME bylo poté analyzováno 18 sv tlých ležák , 8 vý epních piv, 6 tmavých piv a 3 nealkoholická piva. Všechny vzorky byly získány z obchodní sít a pocházely od eských výrobc . Ve všech vzorcích bylo identifikováno a kvantitativn stanoveno p t derivát : dimethylsulfid (DMS), diethyldisulfid, methionol, 3-methylthiofen a sirouhlík. Hodnoty obsahu DMS v r zných typech piv jsou nižší, než uvádí literatura [24,25]. Zatímco u zahrani ních piv byly nam eny hodnoty DMS v rozmezí 35 – 70 g.l–1, p i monitorování eských piv stejnou technikou byly nam eny hodnoty 30 g.l–1 a nižší. Podle literárních údaj až hodnoty DMS nad 50 gl–1 negativn ovlivní senzorické vlastnosti piva [2]. Nejvyšší obsahy DMS byly nalezeny v analyzovaných ležáckých pivech, o n co nižší byly ve vý epních a tmavých pivech. V nealkoholických pivech byly obsahy DMS pod mezí stanovení. Tato skute nost souvisí s technologií výroby piva [2,30]. Dimethylsulfid a methional se vyskytují v mladinách od 70 do 150 g.l–1, hem kvašení poklesnou na 13 až 20 g.l–1 [2]. 22
Sirouhlík byl ve sv tlých ležáckých pivech a tmavých pivech pod mezí stanovení. Pozitivní hodnoty sirouhlíku byly prokázány u vý epních piv a u nealkoholických piv. Obsah 3-methylthiofenu byl v ležáckých pivech pod mezí stanovení, zatímco diethyldisulfid byl kvantifikován v množství od 0,05 do 0,24 g.l–1. Ob tyto sirné látky p ináší do piva chmel [2] a tak byl p edpoklad, že se budou ob vyskytovat spíše v ležáckých pivech. P itom ve vý epních pivech byl 3-methylthiofen kvantifikován v množství až o ád vyšším (0,11 – 0,14 g.l–1), než byl kvantifikován v zahrani ních pivech (0,011 – 0,026 g.l–1) [69, 73]. Diethyldisulfid byl také stanoven ve vý epních pivech (0,08 – 0,2 g.l–1) a tmavých pivech (0,12 – 0,19 g.l–1), v nealkoholických pivech byl pod mezí stanovení. Methionol byl kvantifikován ve všech typech piv, p itom nejvyšší obsahy byly u vý epních piv (4,56 – 6,18 g.l–1) a nejnižší u nealkoholických piv (0,24 – 0,63 g.l–1). U sv tlých ležák byly obsahy methionolu od 2,03 do 3,34 g.l–1 a u tmavých piv byly hodnoty methionolu nejvíce nevyrovnané a pohybovaly se od 2,03 do 4,01 g.l–1. Všechny tyto hodnoty jsou však o t i až ty i ády nižší než v zahrani ních pivech, kde se hodnoty methionolu pohybují od 200 do 2600 g.l–1 [25]. Z uvedených výsledk vyplývá, že obsahy sirných látek závisí nejen na surovin (slad, chmel), ale hlavn na technologii výroby piva. P evážná v tšina eských piv podle dosažených výsledk tedy vykazuje podstatn nižší hladiny kavých sirných látek, což je pravd podobn jedním z d vod jejich dobré chuti, senzorické kvality a vysoké úrovn pitelnosti. 4.4.2. Porovnání automatizované HS-SPDE, HS-SPME a TDAS metody Pro porovnání výt žností automatizovaných metod HS-SPME a HS-SPDE bylo pro HS-SPME metodu použito vlákno se stacionární fází 100 m PDMS (polydimethylsiloxan) a pro HS-SPDE vlákno se stacionární fází 50 m PDMS. U obou metod byla snaha dodržet stejné podmínky sorpce na vlákno a desorpce v nást ikovém bloku plynového chromatografu. Separa ní podmínky na kapilární kolon GS-GasPro byly pro ob metody stejné. K porovnání automatizované metody HS-SPME a HS-SPDE byly sledovány sirné látky: dimethylsulfid (DMS), dimethyldisulfid (DMDS), dimethyltrisulfid (DMTS), sirouhlík (CS2), ethanthiol (EtSH), diethyldisulfid (DEDS), methionol, 3methylthiofen (3MTP), ethylthioacetát (EtSAc) a 2-methyl-1-buthanthiol (2MBT). Z experimentálních výsledk je z ejmé, že u metody HS-SPDE došlo k zachycení 9 analyt , zatímco u HS-SPME metody pouze 8 analyt . U metody HS-SPDE byly za stejných experimentálních podmínek porovnávány dv jehly s r znou stacionární fází. Jehla se stacionární fází PDMS (polydimethylsiloxan) a jehla s kombinovanou stacionární fází PDMS/AU (polydimethylsiloxan a aktivní uhlí). Na jehlu s kombinovanou stacionární fází se nasorbovaly všechny sledované analyty a výt žnost sorpce byla velmi dobrá. 23
i optimalizaci metody TDAS byly testovány dva typy sorbent – Tenax TA a Carbotrap. Oba sorbenty se používají pro analýzy t kavých látek. Vhodn jší pro analýzy sirných t kavých látek byl Tenax TA. Na sorbentu Tenax TA se zakoncentrovalo všech 10 sledovaných sirných látek: dimethylsulfid (DMS), dimethyldisulfid (DMDS), dimethyltrisulfid (DMTS), sirouhlík (CS2), ethanthiol (EtSH), diethyldisulfid (DEDS), methionol, 3-methylthiofen (3MTP), ethylthioacetát (EtSAc) a 2-methyl-1-buthanthiol (2MBT), zatímco na sorbentu Carbotrap pouze 5 analyt (3MTP, DMDS, DEDS, EtAc, EtSH).
Obr. 6: Porovnání HS-SPME (vlákno PDMS), HS-SPDE (jehla PDMS/AU) a TDAS (Tenax TA) metod i porovnání dynamické head-space s automatizovanou TDAS se sorbentem Tenax TA, s automatizovanou HS-SPDE se stacionární fází PDMS/AU a ru ní HS-SPME s vláknem CAR/PDMS je nejvýt žn jší metoda dynamické headspace (obr.6). Sirné aminokyseliny jsou p irozenou sou ástí je mene, sladu i piva. Krom fyziologického významu jsou však tyto látky prekursory vzniku t kavých sirných látek, které mohou negativn ovlivnit senzorickou kvalitu piva. estože sirné aminokyseliny nelze z pivovarských surovin eliminovat, lze hledat a testovat odr dy, podmínky a technologické procesy, které mohou ovliv ovat množství sirných aminokyselin a p ípadn jejich p em nu na t kavé sirné látky. V p edložené práci byly sledovány sirné aminokyseliny methionin, cystein a S-methylmethionin jako hlavní prekursory vzniku t kavých sirných látek a rovn ž samotné senzoricky aktivní sirné látky. Uvedené deriváty byly analyzovány v pivovarských surovinách i v pivu a krom optimalizace parametr analýzy byl sledován vliv odr dy, lokality, klimatických podmínek, ošet ení porost i technologických procedur na obsah sirných látek v pivu a surovinách. Získané výsledky mohou p isp t k up esn ní faktor ovliv ujících kvalitu piva jakožto finálního výrobku pivovarského procesu. 24
5. ZÁV RY V rámci teoretické ásti p edložené diserta ní práce byla studována problematika sirných senzoricky aktivních látek a jejich prekursor v zrnu je mene, sladu a pivu, dále metabolické dráhy vedoucí k jejich vzniku a možnosti jejich stanovení s využitím nejnov jších analytických metod. V experimentální ásti byla nejprve optimalizována metoda stanovení sirných aminokyselin (methioninu, cysteinu a homocysteinu). Optimalizace extrakce spo ívala v použití r zných extrak ních rozpoušt del, pro optimalizaci derivatizace byly srovnávány dv derivatiza ní inidla. Na základ experimentálního ov ení byla zvolena jako nejvhodn jší extrakce deionizovanou vodou s využitím laboratorní t epa ky a derivatizace ethyl chlorformiátem Optimalizovanou metodou byly analyzovány vzorky zrna je mene a sladu ze sklizn 2006, 2007, 2008 a 2009. M itelné množství obsahu methioninu ve vzorcích zrna je mene bylo stanoveno pouze u vzork ze sklizn 2006, což souviselo s porostlostí je mene. Ve vzorcích zrna je mene ze sklizn 2007, 2008 a 2009 byl obsah methioninu, cysteinu a homocysteinu pod mezí stanovení. Ve sladech p ipravených ze vzork je mene ro ník 2006-2009 byly nalezeny podstatn vyšší hodnoty methioninu než v je menech, což souvisí s metabolickými pochody probíhajícími v je meni p i sladování. Nebyl nalezen vztah mezi hladinou methioninu ve sladu a odr dou, lokalitou a ošet ením porost fungicidy. i analýze slad hvozd ných (pražených) p i r zných teplotách byla prokázána závislost poklesu obsahu methioninu, cysteinu a prekursor dimethylsulfidu (PDMS) na vzr stající teplot . Tato skute nost souvisí s degradací aminokyselin na jednodušší sirné látky. Prokázanou závislost obsahu methioninu na teplot lze využít p i optimalizaci teploty hvozd ní za ú elem snížení obsahu methioninu Hladiny methioninu a prekursor dimethylsulfidu (PDMS) byly dále analyzovány v 18 vzorcích ležáckých piv, 8 vzorcích vý epních sv tlých piv, 6 vzorcích tmavých piv a 3 vzorcích nealkoholických piv. Dosažené výsledky neprokázaly souvislost mezi obsahem PDMS a methioninu v analyzovaných ležáckých a vý epních sv tlých pivech. Rovn ž nebyly zjišt ny významné rozdíly v obsahu PDMS a methioninu v pivech r zných výrobc . Výrazn vyšší obsahy PDMS a methioninu byly nam eny pouze u sv tlého ležáku Bernard tradi ní. erná piva vykazovala velmi vyrovnaný a celkov nižší obsah methioninu a významné rozdíly v obsahu PDMS. U nealkoholických piv byl obsah methioninu a PDMS nižší než u ostatních kategorií piv.
25
V další ásti práce byla optimalizována metoda HS-SPME/GC/FPD pro stanovení sirných t kavých látek v pivu. Optimalizace extrakce SPME spo ívala v testování 3 typ vláken a doby sorpce na vlákno. Na základ experimentálního ov ení bylo zvoleno jako nejvhodn jší kombinované vlákno CAR/PDMS (vlákno potažené fází Carboxen a polydimethylsiloxan). Optimální doba sorpce byla stanovena na 30 minut i 45 °C. Optimalizovanou metodou byly analyzovány t kavé sirné látky ve všech 35 vzorcích piv popsaných výše. V rámci optimalizace metody stanovení t kavých sirných látek byly dále porovnávány metody SPME, SPDE a TDAS. Byla prokázána také vhodnost nové SPDE metody pro stanovení sirných t kavých látek. V pivech byly identifikovány a kvantifikovány následující sirné t kavé látky: sirouhlík, dimethylsulfid, diethyldisulfid, methionol a 3-methylthiofen. V eských pivech byla prokázána podstatn nižší hladina nežádoucích sirných látek, než se uvádí pro zahrani ní piva. Obsah kavých sirných látek významn souvisí s technologickým postupem a kvalitou surovin.
26
6. SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJ [1] Voet, D., Voetová, J.: Biochemie. 1. vyd., Praha: Victoria Publishing, a.s., 1995, 1325 s., ISBN 80-85605-44-9 1 [2] Basa ová, G., Šavel, J., Basa , P., Lejsek, T.:Pivovarství teorie a praxe výroby piva. 1. vyd. Praha: VŠCHT , 2010, 863 s. ISBN 978-80-7080734-7 26 [3] White, F.H., Wainwright, T.: The presence of two dimethyl sulphide precursors in malt, their control by malt kilning conditions, and their effect on beer MS levels. Journal of the Institute of Brewing, 1977, vol.83no. 4, pp. 224-230. ISSN 0046-9750. 2 [4] Gijes L.,Veermeulen C., Collin S.: Review. Occurrence et voies de formation des aromes soufrés dans la biére 2.Les thioesters et les dérivés alkylthio. Cerevisia, 2003, vol. 28, no. 2, p. 59-66. ISSN 07701713. [5] Landaud, S., Helinek, S., Bonnarme, P.: Formation of volatile sulphur compounds and metabolism of metionine and other sulphur compounds in fermented food. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, vol. 77, pp.11911205. ISSN 0146-0749. [6] Perpete P., Gijs L., Collin S.: Methionine: A key amino acid for flavour biosynthesis in beer. Brewing Yeast Fermentation Performance. K. Smart ed. Ed.2, Blackwell Science Ltd, , 2003, p. 206-212. ISBN 0632-06498-6, [7] Pheifer, J.H., Briggs, D.E.: The estimation of thiols and disulphides in barley. Journal of the Institute of Brewing, 1995, vol. 101, p. 5-10. ISSN 0046-9750. [8] Perpete, P., Collin, S: How to improve the enzymatic flawour reduction in a cold contact fermentation. Food Chemistry, 2000, vol. 70, p. 457462. ISSN 0308-8146. [9] Perpete, P., Collin, S.: Influence of beer ethanol content on the wort flavour perception. Food Chemistry, 2000, vol. 71, p. 379-385. ISSN 0308-8146 [10] Davídek, J., a kol.: Laboratorní p íru ka analýzy potravin. 2. vyd., Praha: SNLT 1981, 718 s. ISBN 04-814-81. [11] Vacek, J., Onofrejová, L., Klejdus B., Kubá V.: Využití kapalinové chromatografie založené na hydrofilních interakcích pro separace polárních látek. Chemické Listy, 2009, ro . 103, s.381 385 (2009) ISSN 1213-7103 27
[12] Langrock T., Czihal P., Hoffmann R.: Amino acid analysis by hydrophilic interaction chromatography coupled on-line to electrospray ionization mass spectrometry. Amino Acids, 2006, vol. 30, pp. 291 297. ISSN 0939-4451. [13] Furst, P., Pollack, l., Grasert, A., Godel, H., and Stehle, P.: Appraisal of four pre-column derivatization methods for the high-performance liquid chromatographic determination of free amino acids in biological materials. Journal of Chromatography B, 1990, vol. 499, pp. 557 569. ISSN 1570-0232 [14] Cohen S.A., Michaud D.P.: Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, and its application for the analysis of hydrolysate amino acids via highperformance liquid chromatography. Analytical Biochemistry, 1993, vol. 211, pp. 279–287. ISSN 0003-2697 [15] Hušek P.: Chloroformates in gas chromatography as general purpose derivatizing agents. Journal of Chromatography B, 1998, vol. 717, p. 57–91. ISSN 1570-0232 [16] Myung S., Kim M., Min H., Yoo E., Kim K.: Determination of homocysteine and its related compounds by SPME/ GC/ MSD. Journal of Chromatography B, 1999, vol. 727, p. 1-8. ISSN 1570-0232 [17] Mayadunne, R., Nguyen, T.-T., Marriott, P., J.: Amino acid analysis by using comprehensive two-dimensional gas chromatography. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, vol. 382, pp.836-847. ISSN 1618-2542 [18] Erbe, T., Brückner, H.: Chromatographic determination of amino acid enantiomers in beers and raw materials used for their manufacture. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 881, pp. 81-91. ISSN 00219673 [19] Mestres, M., Busto, O., Guasch, J.: Chromatographic analysis of volatile sulphur compounds in wines using the static headspace technigue with flame photometric detection. Journal of Chromatography A, 1997, vol.773, p. 261-269. ISSN 0021-9673 [20] Pawliszyn, J.: Aplications of solid-phase microextraction in food analysis. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 880, p. 35-62. ISSN 0021-9673 [21] Kolb, B.: Headspace sampling gas analysis by gas chromatography. Journal of Chormatography, 1999, vol. 842, p. 163-205. ISSN 00219673
28
[22] Pawliszyn, J.: Solid phase Microextraction: theory and practice. New York: 1997 Wiley - VCH , Inc. ISBN 0-471-19034-9 [23] Xiao, Q., Zu, Ch., Xing, J., Hu, B.: Comparison of headspace and direct single-drop microextraction and headspace solid-phase microextraction for the measurement of volatile sulphur compounds in beer and beverage by gas chromatography with flame photometric detection. Journal of Chromatography A, 2005, vol.,pp. 133-137. ISSN 0021-9673 [24] Scarlata, Ch., J., Ebeler, S., E.: Headspace Solid-Phase Microextraction for the Analysis of Dimethyl Sulfide in Beer. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, vol. 47, pp. 2505-2508. ISSN 0021-8561 [25] Hill, P.G., Smith, R.M.: Determination of sulphur compounds in beer using headspace solid- phase microextraction and gas chromatographic analysis with pulsed flame photometric detection. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 872, pp. 2003-213. ISSN 0021-9673 [26] MEBAK: Brautechnische Analysenmethoden, Band I, Freising – Weihenstephan, 1997. [27] Basa ová,G. A kol.: Pivovarsko-slada ská analytika (1). Praha: Merkanta, 1992, 385 s. [28] Hušek P., Matucha P., Vránová A., Šimek P.: Simple plasma work-up for fast chromatographic analysis of homocysteine, cysteine, methionine and aromatic amino acids. Journal of Chromatography B, 2003, vol. 789, p. 311-322. ISSN 1570-0232 [29] Narziss, L., Mienader, H., Bourjan, T.: Der Einfluss von Parameter der Malz und Würzeherstellung auf den Gehalt an Dimethylsulfid und dessen Verläufer. Brauwissenschaft, 1979, vol. 32, pp.62-69 [30] Miracle, R.E., Ebeler, S.E., Bamforth, C., W.: The Measurement of Sulfur-Containing Aroma Compounds in Samples from ProductionScale Brewery Operations. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 2005, vol. 63, no. 3, pp. 129-134, ISSN 0361-0470
29
7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOL AED APS ATP Cys CZE DMDS DMQS DMTS EOF Eth FID FPD GC Hcy HPLC Met NAD+ NADP+ PAPS PFPD PJ PTV RP-HPLC SCD SPME SSL UV
atomový emisní detektor adenosin-5-fosfosulfát adenosintrifosfát cystein kapilární zónová elektroforéza dimethyldisulfid dimethytetrasulfid dimethyltrisulfid elektroosmotický tok ethionin plamenov ioniza ní detektor plamenov fotometrický detektor plynová chromatografie homocystein vysokoú inná kapalinová chromatografie methionin nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma) nikotinamidadenindinukleotid fosfát (oxidovaná forma) 3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát pulzní plamenov fotometrický detektor pastera ní jednotka Programmed Temperature Vaporized – injektor s programovatelnou teplotou vysokoú inná kapalinová chromatografie s reverzní fází sirný chemiluminiscen ní detektor Solid Phase Microextraction split/splitless ultrafialový
30
8. SEZNAM PRACÍ AUTORA Publikace v impaktovaných asopisech 1. Obru a S., Márová I., Svoboda Z., Mikulíková R.: Use of controlled exogenous stress for improvement of poly(3-hydroxybutyrate) production in Cupriavidus necatorH16. Folia Microbiologica, 2010, vol.55, 17-22, p, ISSN 0015-5632 (IF 0,978) 2. Obru a S., Márová I., Pa ilová K., Müller L., Zdráhal Z., Mikulíková R.: A contribution to analysis of „Czech beer“ authenticity. Czech Journal of Food Sciences, 2009, vol. 26, S323-S326. ISSN 1212-1800 (IF 0,472) 3. Mikulíková, R., B láková, S., Svoboda, Z., Macuchová, S.: Monitoring of sensorially active sulphur subsatnces in malt and beer, Chem. Listy S, 2008, vol. 102, s265-s1311, ISSN 1803-2389 (IF 0,683) 4. Winterová, R., Mikulíková, R., Mazá , J., Havelec,P.: Assessmen of the autenticity of fruit spirits by gas chromatography and stable isotope ratio analyses. Czech Journal of Food Sciences, 2008, vol. 26, pp. 368-375. ISSN 1212-1800 (IF 0,448) 5. Mikulíková, R., B láková, S., Svoboda, Z., Macuchová, S.: Content of strobilurin fungicides in barley, malt, and beer, Chem. Listy S, 2008, vol.102, s265-s1311, ISSN 1803-2389 (IF 0,683) 6. láková, S., Mikulíková, R., Svoboda, Z., Macuchová, S.: Monitoring of ferulic acid content during malt production, Chem. Listy S, 2008, vol. 102, s265-s1311, ISSN 1803-2389 (IF 0,683) 7. Macuchová, S, Mikulíková, R., Márová, I.,B láková, S.: Determination of selected antioxidant enzymes in barley and malt, Chem. Listy S, 2008, vol. 102, s265-s1311, ISSN 1803-2389 (IF 0,683) 8. Márová, I., Mikulíková, R., Zdráhal, Z., Kone ná, H., Pa ilová, K., Halienová, A.: Characterization of „Czech Beer“ – a pilot study, Chem. Listy S, 2008, vol. 102, s265-s1311, ISSN 1803-2389 (IF 0,683) 9. Mikulíková, R., Sobotová, K.: Determination of acrylamide in malt with GC/MS, Acta Chimica Sloenica. 2007,vol. 54, p. 98-101. ISSN 1318-0207 (IF 0,703) Publikace v recenzovaných asopisech 10.Benešová, K., Macuchová, S., B láková, S., Mikulíková, R., Svoboda, Z.: Stanovení obsahu š avelové kyseliny v je meni a sladu pomocí RP-HPLC. Kvasný pr mysl , 2010, ro . 56 , . 5, s. 247-250, ISSN 0023-5830 11.Mikulíková R., Svoboda Z., Benešová K., B láková S.: Determination of methionine in malt. Kvasný Pr mysl 2009, ro . 55, . 11-12, s. 310 – 314. ISSN 0023-5830 12.Mikulíková, R., Goliáš, J., Mrázová, V.: SPME-GC-MS analysisi of volatile compounds in Czech white wines from five grape varieties. Mitteilungen Klosterneuburg 2009,vol. 59, p. 159-156, ISSN 0007-5922 31
13.Svoboda Z., Mikulíková R., B láková S., Benešová K., Nesvadba Z.: Determination of lipid content and fatty acid representation in barley caryopses and malt. Kvasný Pr mysl, 2009, ro . 55, . 11-12, s. 315 – 320. ISSN 0023-5830 14.Mikulíková, R., Svoboda, Z., B láková, S.: Monitoring reziduí fungicid používaných v ochran sladovnického je mene. Monitoring of residues of fungicides used in malting barley protection, Kvasný pr mysl, 2008, ro .54, . 11 - 12, s. 332 – 337, ISSN 0023-5830 15.Mikulíková, R., Svoboda, Z., B láková, S., Macuchová, S.: Sledování akrylamidu v pr hu sladování a v pivu. Monitoring of acrylamide in the course of malting and in beer, Kvasný pr mysl, 2008, ro . 54, .6,, s.181185, ISSN 0023-5830 ísp vky ve sbornících – mezinárodní konference 16.Benešová, K., B láková, S., Mikulíková, R., Svoboda, Z.: Application of HPLC-MS for identification of tocopherols and tocotrienols in barely and malt, 27th Informal Meeting on Mass Spectrometery 2009, Retz, Austria, Book of Abstracts, p.46. ISBN 978-3-200-01508-1, 3.–7.5.2009 17.Svoboda Z., Mikulíková R., B láková S., Benešová K: Use of the GC-MS method for monitoring strobilurine residues in barley, malt and beer, 27th Informal Meeting on Mass Spectrometery 2009, Retz, Austria, Book of Abstracts,ISBN 978-3-200-01508-1, 3.–7.5.2009, 18.Mikulíková, R., Svoboda, Z., B láková, S., Hönigová, V.: Monitoring of strobilurin fungicides in barley, malt and beer, Prevention policies for food safety, International convention Nancy, France, 19.-20. 5. 2008 19. láková, S., Mikulíková, R., Svoboda, Z., Macuchová, S., Hönigová, V.: Masked mycotoxins – a hilden danger for foodstuffs, Prevention policies for food safety, International convention Nancy, France, 19.-20. 5. 2008 20.Obruca S., Melusova S., Marova I., Koci R., Mikulikova R., Svoboda Z.: Analysis of Poly-(3-hydroxybutyrate) Produced by Bacillus megaterium and Wautersia eutropha Grown under Physiological Stress, 14th International Symposium on Separation Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.-3.10.2008, ISBN 978-9536894-36-9 21.Mikulíková R., Svoboda Z., Beláková S., Macuchová S.: Comparison of Modern Analytical Methods for the Analysis of Sulphur Flavors in Malt and Beer, 14th International Symposium on Separation Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.3.10.2008, ISBN 978-953-6894-36-9 22.Blaštík O., Svoboda Z., Olšanský R., Mikulíková R., Kocourková B., Reinöhl V.: Evaluation of Methods for the Assessment of Carvone in Caraway Essential Oil, 14th International Symposium on Separation
32
Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.-3.10.2008, ISBN 978-953-6894-36-9 23.Beláková S., Mikulíková R., Svoboda Z., Macuchová S.: Monitoring of Changes of Ferulic Acid Content in Brewing Materials Using the UPLCMethod with PDA Detector, 14th International Symposium on Separation Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.-3.10.2008, ISBN 978-953-6894-36-9 24.Beláková, S., Mikulíková R., Svoboda Z., Macuchová S.: Determination of 5-methyltetrahydrofolate in Brewing Materials Using the UPLC Method with FLR Detector, 14th International Symposium on Separation Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.3.10.2008, ISBN 978-953-6894-36-9 25.Macuchová S., Beláková S., Mikulíková R., Svoboda Z.: Determination of Oxalic Acid Content in Brewing Materials with RP-HPLC, 14th International Symposium on Separation Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.-3.10.2008, ISBN 26.Márová I. , Zdráhal Z. , Kocí R. ,Halienová A. , Obruca S. , Ondruška V. , Duronová K. , Parilová K. , Mikulíková R.: Proteomic and Metabolomic Analysis of Selected Beer Components Suitable for Authenticity Determination, 14th International Symposium on Separation Science, New Achienements in Chromatography, Primošten, Chorvatsko, 30.9.3.10.2008, ISBN 978-953-6894-36-9 27.Márová I., ešková I., Macuchová S., Mikulíková R.: Seasonal changes of antioxidant content in Breast milk in a sample of Czech population. Vitamins 2007,19.-21.9.2007, Praha. Book of Abstracts, p.138-139. ISBN 978-80-7194-937-4. 28.Duro ová K., Márová I., Macuchová S., Mikulíková R.: Study of Antimutagenic Activity of Barley and Malt. Vitamins 2007, 19.-21.9.2007, Praha. Book of Abstracts, p.129-130. ISBN 978-80-7194-937-4. 29.Macuchová S., Márová I., Halienová A., Mikulíková R., Drábková M., Kubešová J., Ko í R.: Use of microfluidic electrophoresis to the analysis of proteins in various type sof biological materials: a comparison with gel and gel-free techniques. 12th International Symposium on Separation Sciences, 27-29.9.2006, Lipica, Slovenia. 30.Márová I., Macuchová S., Mikulíková R., Kotrla R.: Influence of several types of komplex antioxidant preparatives on metabolit and antioxidant status: a comparative study. XX. Biochemický zjazd, 12.-16.9.2006, Pieš any (Slovakia). Book of Abstracts, p.113. ISBN 80-969532-6-5. 31.Macuchová S., Márová I., Turková V., Mikulcová A., Mikulíková R.: Antioxidant and antimutagenic properties of beer, malt and barley. XX. Biochemický zjazd, 12.-16.9.2006, Pieš any (Slovakia). Book of Abstracts, p.336. ISBN 80-969532-6-5.
33
32.Havlová, P., Mikulíková, R., Prýma, J., Folkmerová, J.: Influence of selected chemical and biological factors on superoxidedismutase levels in barley and malt, XX. Biochemický zjazd, Pieš any, September 12.-.16.2006, ISBN 80-969532-6-5 33.Mikulíková, R., Sobotová, K., Svoboda, Z., Šusta, J.: Monitoring of acrylamide content in the course of malting and beer production, EMEC7, December 6-9, 2006, Brno, Czech Republic, The Book of abstracts, ISBN 80-214-3320-5 34.Mikulcová A., Turková V., Márová I., Mikulíková R., Kubešová J.: Use of Saccharomyces cerevisiae D7 to analysis of antimutagenic/genotoxic effects of beer, malt and products of their manufacturing. 20th International ICFMH Symposium Food Micro 2006, 29 Aug – 02 Sept 2006, Bologna ,Italy. Book of Abstracts, p. 364 35.Mikulcová A., Turková V., Márová I., Mikulíková R.: Antimutagenic and antioxidant characteristics of selected sorts of beer, malt and barley. International Conference Vitamins 2006, September 11-13 2006, Pardubice, CZ. Book of Abstracts p. 147. ISBN 80-7194-855-1 ísp vky ve sbornících – konference v R, SR s mezinárodní ú astí: 36.Macuchová S., B láková S., Mikulíková R., Svoboda S.: Vliv technologie sladování na chemické zm ny v obilkách je mene napadených patogenními plísn mi rodu Fusarium; XXXIX. symposium o nových sm rech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dv r u Byst ice nad Pernštejnem, 26. - 28. 5. 2008 37.Márová I., Macuchová S. , Duro ová K. , Mikulcová A., Mikulíková R.,: Studium antimutagenních ú ink r zných druh sladu a piva. XXXVIII. Symposium o nových sm rech výroby a hodnocení potravin, 21.-23.5.2007, Skalský Dv r. Sborník souhrn sd lení, s. 10. 38.Mikulíková, R., Svoboda, Z.: Sledování obsahu prekursor senzoricky aktivních sirných látek v je meni, sladu a pivu, XXXVIII. Symposium o nových sm rech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dv r u Byst ice nad Pernštejnem, 21. - 23. 5. 2007 39.Mikulíková, R., Sobotová, K., Šusta, J.: Stanovení obsahu akrylamidu ve speciálních sladech, Kvasny Prum. 52, 2006,9: 284. ISSN 0023-5830 40.Prokeš, J., Mikulíková, R., Votava, J.: Vliv podmínek sladování na obsah slou enin síry ve sladu, Kvasny Prum. 52, 2006, 9: 285. ISSN 0023-5830 41.Márová I., Macuchová S., Drábková M., Mikulíková R., Ptá ek P.: Influence of PUFA/tocopherol suplement on lipid metabolism and antioxidant status in patiens with hyperlipidaemia. 46th ICBL Meeting, 20.24.9.2005, Ajjacio, Corsica (France); Chemistry and Physics of Lipids 136, 2005, p.156-156. ISSN 0009-3084. 42.Macuchová S., Kotrla R., Márová I:, Mikulíková R.: Influence of food supplements containing antioxidants and/or PUFA on selected metabolit 34
functions in humans. 57. zjazd chemických spolo ností, 4.-8. zá í 2005, Tatranské Matliare (Slovensko); ChemZi 1/1, 2005, p.372-373. ISSN 13367242. 43.Macuchová S., Kotrla R., Márová I., Mikulíková R.: Study of PUFA/tocopherol suplement intake on lipid metabolism and antioxidant status in hyperlipidaemics. Vitamins 2005 – targeted nutritional therapy; 14-15 September 2005, Pardubice. Book of abstracts, p.103-104. ISBN 807194-748-2. 44.Mikulíková R., Winterová R., Flodrová D.: Determination of markers for distinguishing fruit distillates, Chemické listy CHLSAC 99 (s) s324 ISSN 0009-2770 45.Mikulíková R., Mikyška A., Kosík O.: Determination of phytoestrogens in beer and brewing materials, Chemické listy CHLSAC 99 (s) s323 ISSN 0009-2770 46.Mikulíková R., Winterová R., Flodrová D.: Využití GC-MS/SPME p i analýze ovocných destilát , ChemZi 1/12005 57. zjazd chemických spole ností, s.137, ISSN 1336-7242 47.Mikulíková R., Mikyška A., Kosík O.: Determination of phytoestrogens in line malt-wort-beer, Sborník p ísp vk „Vitamins 2005 – Targeted Nutritional Therapy“, Pardubice 14. –15.9.2005, ISBN 80-7194-748-2 48.Mikyška A., Prokeš J., Hašková D., Havlová P., Mikulíková R., Prýma J.: Vliv odr dy je mene a technologie sladování na irost sladin a filtrovatelnost piv, 21. Pivovarsko – slada ské dny, Ústí nad Labem 6. – 7.10.2005 49.Mikyška A., Hašková D., Mikulíková R.: Fytoestrogeny v pivovarských surovinách a pivu, 21. Pivovarsko– slada ské dny, Ústí nad Labem 6. – 7.10.2005
35
