VYSOKÉ U ENÍ TECHNICKÉ V BRN

VYSOKÉ UýENÍ TECHNICKÉ V BRNċ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ

FAKULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

VLIV NANOýÁSTIC PbO A CdO NA VYBRANÉ FYZIOLOGICKÉ FUNKCE MYŠI. Influence of PbO and CdO nanoparticles on particular physiological functions in mouse.

BAKALÁěSKÁ PRÁCE BACHELOR´S THESIS

AUTOR PRÁCE

Eva Svozilová

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2015

Ing. ZbynČk VeþeĜa, CSc.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-BAK0904/2014 Akademický rok: 2014/2015 Ústav chemie potravin a biotechnologií Eva Svozilová Chemie a technologie potravin (B2901) Biotechnologie (2810R001) Ing. Zbyněk Večeřa, CSc.

Název bakalářské práce: Vliv nanočástic PbO a CdO na vybrané fyziologické funkce myši.

Zadání bakalářské práce: Cílem práce je vyhodnotit dlouhodobý vliv inhalace nanočástic PbO a CdO na vybrané orgány pokusných bílých myší. Vzorky budou odebírány v určených časových intervalech a bude sledována kauzalita mezi inhalací výše uvedených nanočástic a změnami hmotnosti a morfologie testovaných orgánů. Obsah práce: 1. Literární rešerše zaměřená na následujcí okruhy: - Příjem, transport a mechanismus působení těžkých kovů na organismus. - Změny v organismu po působení tězkých kovů. - Biochemické procesy a vylučování kovů v jednotlivých orgánech. - Generování nanočástic PbO a CdO. - Bílá pokusná myš (Mus musculus var. Alba). - Histologická stavba orgánů (slezina, játra, ledviny, plíce, mozek). 2. Experimentální část - Odběr, zpracování vzorků orgánů, příprava vzorků. - Analýza stanovených parametrů. 3. Vyhodnocení výsledků a diskuse.

Termín odevzdání bakalářské práce: 22.5.2015 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.

----------------------Eva Svozilová Student(ka)

V Brně, dne 30.1.2015

----------------------Ing. Zbyněk Večeřa, CSc. Vedoucí práce

----------------------prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. Děkan fakulty

ABSTRAKT Cílem bakaláĜské práce je vyhodnotit dlouhodobý vliv inhalace nanoþástic oxidu olovnatého a oxidu kademnatého na hmotnost vybraných orgánĤ pokusných bílých myší. Vybrané orgány (slezina, játra, ledvina, plíce, mozek) byly postupnČ odebírány po dobu tĜinácti týdnĤ. V obou experimentech (PbO a CdO) byl zkoumán vztah mezi hmotností jednotlivých orgánĤ a dobou inhalace, vztah mezi hmotností jednotlivých orgánĤ a inhalací rozdílné poþetní koncentrace nanoþástic kovĤ a statisticky byl vyhodnocen vliv inhalace oxidĤ obou kovĤ na hmotnost orgánĤ. Výsledky obou experimentĤ byly porovnány.

ABSTRACT The aim of this bachelor´s thesis is to assess the long-term effects of inhalation of nanoparticles of lead oxide and cadmium oxide on the weight of selected organs of experimental white mice. The selected organs (spleen, liver, kidney, lungs, brain) were successively collected during a period of thirteen weeks. The effect of inhalation of both metal oxides was statistically evaluated. In both study groups of the experiment (PbO and CdO), the relation between organs weight and the length of inhalation and the relation between organs weight and inhalation of differing metal concentrations were evaluated, and results both of the study groups were compared to each other.

KLÍýOVÁ SLOVA Nanoþástice, oxid olovnatý, oxid kademnatý, inhalace, slezina, játra, ledvina, plíce, mozek, myš.

KEYWORDS Nanoparticles, lead oxide, cadmium oxide, inhalation, spleen, liver, kidney, lungs, brain, mouse.

3

SVOZILOVÁ, E. Vliv nanoþástic PbO a CdO na vybrané fyziologické funkce myši. Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, Fakulta chemická, 2015. 36 s. Vedoucí bakaláĜské práce Ing. ZbynČk VeþeĜa, CSc..

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakaláĜskou práci vypracovala samostatnČ a že všechny použité literární zdroje jsem správnČ a úplnČ citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem fakulty chemické VUT v BrnČ a mĤže být použita ke komerþním úþelĤm jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a dČkana FCH VUT.

………………………….. podpis studenta

PODċKOVÁNÍ Ráda bych podČkovala svému vedoucímu práce panu Ing. ZbyĖku VeþeĜovi, CSc., za odborné rady, cenné pĜipomínky a trpČlivost pĜi zpracování zadané problematiky. Dále bych ráda podČkovala svým rodiþĤm, celé rodinČ a nejbližším za podporu a porozumČní bČhem celého studia.

4

OBSAH 1.

Úvod ................................................................................................................................... 6

2.

Teoretická þást .................................................................................................................... 7 2.1. Laboratorní myš (Mus musculus var. Alba)................................................................. 7 2.2. Histologická stavba orgánĤ ......................................................................................... 8 2.2.1.

Slezina .................................................................................................................. 9

2.2.2.

Játra .................................................................................................................... 10

2.2.3.

Ledviny............................................................................................................... 11

2.2.4.

Plíce .................................................................................................................... 12

2.2.5.

Mozek ................................................................................................................. 12

2.3. Generování nanoþástic PbO a CdO ........................................................................... 13 2.4. Vliv tČžkých kovĤ na organismus ............................................................................. 13 2.4.1.

PĜíjem, transport a mechanismus pĤsobení tČžkých kovĤ na organismus ......... 15

3.

Cíle práce.......................................................................................................................... 17

4.

Experimentální þást .......................................................................................................... 18 4.1. OdbČr, zpracování orgánĤ a pĜíprava vzorkĤ ............................................................ 19

5.

Výsledky a Diskuse .......................................................................................................... 21 5.1. Hodnocení výsledkĤ pro PbO .................................................................................... 22 5.1.1.

Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Pb2) – ledvina ................................... 24

5.1.2.

Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Pb2) - plíce........................................ 25

5.2. Hodnocení výsledkĤ pro CdO ................................................................................... 25 5.2.1.

Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - slezina .................................... 27

5.2.2.

Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - játra ........................................ 28

5.2.3.

Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - plíce ........................................ 28

5.2.4.

Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - mozek ..................................... 29

5.2.5.

Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Cd2) - slezina .................................... 30

5.2.6.

Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Cd2) – plíce ...................................... 30

5.3. Porovnání PbO a CdO ............................................................................................... 31 6.

ZávČr................................................................................................................................. 32

7.

Použitá literatura .............................................................................................................. 34

5

1. ÚVOD PĜestože byli lidé vystaveni vzduchu s nanoþásticemi, které se tvoĜí pĜi spalovacích procesech napĜ. lesní požáry a sopeþná þinnost, po celou dobu jejich vývoje, prĤmyslová revoluce vedla k dramatickému vzestupu expozice nanoþásticím pocházejících z antropogenních zdrojĤ, jako jsou spalovací motory, elektrárny atp. (tryskové motory, spalovny komunálního odpadu, svaĜování) [12]. Jako nanoþástice oznaþujeme takové objekty, jejichž rozmČry jsou alespoĖ v jednom rozmČru menší než 100 nm. Pro pĜedstavu o velikosti nanoþástic a jejich poþtu, jenž vzniká pouhým dČlením pĤvodního materiálu, mĤžeme použít srovnání s bČžnými objekty, kterým mĤže být napĜíklad lidský vlas. Lidský vlas má v prĤmČru 60 ђm. Pokud bychom mČli kulovou þástici o tomto prĤmČru, mohli bychom jejím postupným dČlením získat jeden milion stejných kulových þástic o prĤmČru 600 nm, tedy jednu miliardu þástic s prĤmČrem 60 nm, viz obr. 1.

Obr. 1: Porovnání velikostí þástic vzniklých dČlením lidského vlasu o prĤmČru 60 µm [11]. Zkoumáním nanomateriálĤ a jejich vlastností se zabývá nanovČda. Nanotechnologie se následnČ zabývají praktickým využitím vlastností nanomateriálĤ pĜi tvorbČ nových materiálĤ, konstrukci nových struktur a zaĜízení. Využití nanotechnologií je rozsáhlé a uplatĖuje se od stavebnictví, textilního prĤmyslu pĜes ukládání a pĜenos informací, nanobiotechnologie a nanomedicínu až po využití napĜ. kvantových teþek, což jsou ohraniþené oblasti polovodiþe (v prĤmČru 30 nm, 8 nm na výšku) schopné vázat elektrony, a které se využívají ve speciálních souþástkách pracujících s jednotlivými elektrony nebo fotony [8]. Dnes je již zĜejmé, že nanoþástice mají negativní vliv na zdraví. Zejména ty nanoþástice, jejichž velikost je menší než 30 nm, protože jsou schopny pĜecházet po inhalaci do krevního obČhu. Poté, co jsou nanoþástice pĜeneseny do krevního ĜeþištČ, mohou být transportovány do celého tČla a do orgánĤ jako jsou ledviny, mozek a kosti atd., pĜiþemž játra jsou významným místem jejich kumulace [9] [19] [21]. PĜi dýchání jsou v nose odfiltrovány þástice vČtší než 5 µ m, které se nedostanou do plic. ýástice menší než 1 - 2 µ m se pĜevážnČ ukládají v plicních alveolách, a z nich 60 - 80 % pĜechází do krevního obČhu a posléze do tČlních orgánĤ [13]. KromČ velikosti þástic hraje dĤležitou roli pĜi vzniku zdravotních rizik jejich chemické složení a zejména jejich povrchová morfologie. PĜi translokaci do krevního 6

ĜeþištČ mohou nanoþástice vyvolávat alveolární zánČtlivé procesy, které mohou být provázeny kardiovaskulárními problémy. Nanoþástice, jenž se dostanou do organismu, mohou být v dĤsledku jejich vysoké povrchové energie, zdrojem volných radikálĤ vytváĜejících oxidaþní stres, pĜi kterém dochází k akumulaci ROS nebo ke snížení hladiny antioxidantĤ v lidském tČle. NČkterým nanoþásticím, pokud jsou dostateþnČ malé, se podaĜí proniknout i do bunČk, kde mohou pĤsobit neurotoxicky, nebo mohou vyvolávat i zmČnu složení genĤ v prĤbČhu pĜepisu DNA. NejþastČjší mechanismy toxicity nanoþástic jsou genotoxicita, indukce oxidativního stresu a bunČþná toxicita/tvorba zánČtu [15].

2. TEORETICKÁ ýÁST 2.1. Laboratorní myš (Mus musculus var. Alba) Laboratorní myš patĜí k nejþastČji používaným zvíĜatĤm urþených pro pokusné úþely. Bílá myš je speciálnČ chována k laboratorním úþelĤm a jedná se o albinotickou formu myši domácí, která špatnČ snášela zajetí. Myš domácí (Mus musculus) patĜí do þeledi myšovitých (Muridae), Ĝádu hlodavcĤ (Rodentia) a tĜídy savcĤ (Mammalia) [4]. Jako první myš domácí chovali ýíĖané a Japonci, kteĜí z ní získali postupnČ stálý typ bílé myši. Oproti jiným laboratorním zvíĜatĤm je celkem plachá. V prĤbČhu dne stĜídavČ spí, nebo zase rychle bČhá a šplhá po stČnách klece [3].

Obr. 2: Laboratorní myš. Bílá myš, na obr. 2, má válcovité tČlo, které je vpĜedu zúžené. Jednotlivé þásti tČla, což je hlava, krk, trup, ocas, pĜední a zadní konþetiny jsou od sebe velmi dobĜe rozlišeny. Na pĜední konþetinČ rozlišujeme rameno, pĜedloktí, zápČstí, záprstí a prsty. Zadní noha je rozdČlena na stehno, bérec, zánártí, nárt a prsty. PĜední nohy mají þtyĜi prsty, protože první prst (vnitĜní) je redukován. Na zadní nožce je pČt prstĤ. Konþetiny jsou krátké s ostrými drápky. Lehkou hlavu, vybíhající ve špiþatý þenich, nese krátký a pohyblivý krk. Nevýrazný zevní nos tvoĜí s dolními þelistmi zhruba tvar protáhlého komolého kužele. Bezchlupý 7

chrupavþitý þenich ukonþuje mezinozdrovou pĜepážku, hĜbet a nosní kĜídla. Z horního pysku pĜestupuje na þenich mČlká brázdiþka. Bílá myš má velké oþi a úzká víþka. Ve vnitĜním koutku oka je uložený malý val, jenž je pozĤstatek z rudimentálního tĜetího víþka. Po stranách hlavy jsou nápadné velké a témČĜ lysé ušní boltce. Blízká oblast kolem nosu je vybavena hmatovými (sinusovými) chlupy, které jsou velmi dĤležité pro orientaci v prostoru. Aby horní pysk nepĜekážel a nedošlo k jeho poranČní pĜi hryzání je horní pysk rozpolcený [2]. V každé þelisti se nacházejí dva dlátkovité Ĝezáky zvané hlodáky. Špiþáky nejsou vyvinuté, proto je mezi hlodáky a stoliþkami s koĜeny, velká mezera. TČlo je pokryto bílou srstí, jež má na hĜbetČ výraznČ vyvinuté elastické podkoží, takže se dá snadno vytáhnout v kožní Ĝasu. Uši, cévnatka, duhovka, kĤže a konec nožek mají rĤžovou barvu, protože jim chybí pigment. Dlouhý válcovitý ocas dosahuje délky až 9 cm a je kryt jemnou holou kĤží. KĤže ocasu nese šupinovité prstence a skrz ni se rýsují ocasní žíly. Pod koĜenem ocasu se nachází Ĝitní otvor a pod Ĝitním otvorem je otvor urogenitální. Úzká hrázka (perineum) oddČluje od sebe Ĝitní a urogenitální otvor. Po stranách Ĝitního a urogenitálního otvoru ústí anální aromatické (pachové) žlázky, jež mají význam pĜi vyhledávání partnera v dobČ rozmnožování. DospČlí samci mají varlata uložena v šourku na bocích penisu. Samice mají na bĜiše pČt párĤ mléþných bradavek uložených laterálnČ od stĜední linie [2]. Jako živoþišný model v experimentech se vČtšinou využívají inbrední nebo outbrední kmeny myší. Inbrední zvíĜata jsou získaná kĜížením navzájem pĜíbuzných rodiþĤ, vČtšinou bratrĤ a sester, po více než 20 generací. Tyto kmeny myší: BALB/c. C3H, FVB, DBA/1 atd. se používají v experimentech, ve kterých se sleduje vliv genetického pozadí zvíĜete a pĜevážnČ k cílené modifikaci genomu v podmínkách živého organismu a zpČtnému sledování dopadĤ této zmČny. Do geneticky nedefinované linie patĜí outbrední linie myší. Tyto linie jsou geneticky heterogenní a nemají zvýšený podíl homozygotĤ, tak jako je tomu u inbredních kmenĤ. Outbrední linie nejsou cílenČ pĜipravovány pĜíbuzenskou plemenitbou, þímž jsou také levnČjší. Jejich charakteristickými fenotypovými vlastnostmi je dosažení vČtší tČlesné hmotnosti, vyšší plodnosti a þasného odstavu mláćat. Tyto linie ICR (CD-1), NMRI, MF1 se nejvíce využívají v pĜedbČžných experimentech pĜed nasazením inbredních linií a v experimentech, kde velikost a plodnost zvíĜete je dĤležitČjší než definovaný genotyp [5].

2.2. Histologická stavba orgánĤ Základními stavebními jednotkami orgánĤ tČla jsou tkánČ. TkáĖ je definována jako soubor morfologicky podobných bunČk a jejich derivátĤ se shodnou nebo velmi podobnou funkþní specializací. Všechny tkánČ se vyvíjejí ze zárodeþných listĤ a z mezenchymu procesem oznaþovaným histogeneze. Na základČ strukturních a funkþních znakĤ se tkánČ rozdČlují na þtyĜi základní typy: tkáĖ epitelovou, pojivovou, svalovou a nervovou tkáĖ. TkáĖ epitelová se skládá z tČsnČ na sebe naléhajících bunČk a z nepatrného množství mezibunČþné hmoty. Spojení bunČk je velmi pevné. Epitely plní mnoho funkcí jako je funkce krycí, resorpþní, sekreþní a smyslová. Epitely se dČlí podle tvaru na epitely trámþité, plošné a retikulární. Dle funkce se epitely rozdČlují na krycí, žlázové, resorpþní, respiraþní, smyslové 8

a svalové. BuĖky trámþitého epitelu jsou seĜazeny po jedné nebo dvou do bunČþných trámcĤ, které mezi sebou þasto anastomozují. Mezi trámci se nacházejí sinusoidní kapiláry, které stejnČ jako trámce tvoĜí složité sítČ. Trámþitý epitel se vyskytuje v játrech a nČkterých žlázách s vnitĜní sekrecí. Epitely plošné jsou složeny z bunČk seskupených do plochy v jedné þi více vrstvách. Charakter plošných epitelĤ mají všechny epitely krycí, resorpþní, respiraþní i smyslové. Mezi pojivovou tkáĖ patĜí vazivo, chrupavka a kost. Pojiva se skládají z bunČk a mezibunČþné hmoty, která obsahuje vlákna a základní amorfní hmotu. Pojivová tkáĖ má funkci mechanickou, reguluje vodní a iontové hladiny, chrání proti škodlivým vlivĤm. TkáĖ svalová se skládá ze svalových bunČk, které v cytoplazmČ obsahují vlákénka oznaþována jako myofibrily. Díky tČmto vláknĤm je svalová tkáĖ schopna kontraktility. Nervová tkáĖ se skládá ze dvou druhĤ bunČk. Jsou to neurony neboli gangliové buĖky s dlouhými cytoplazmatickými výbČžky a z podpĤrných bunČk oznaþovaných jako neuroglie. Nervové buĖky mají dráždivou a vodivostní funkci [6].

2.2.1. Slezina Slezina (spleen, lien) je opouzdĜený lymfatický orgán. Skládá se z nČkolika stavebních složek, kterými je vazivo, krevní cévy a dĜeĖ neboli pulpa. Na povrchu sleziny vytváĜí vazivo tuhé pouzdro, složené hlavnČ z kolagenních vláken s pĜímČsí elastických vláken a výjimeþnČ z hladkých svalových bunČk. Pouzdro je kryto jednovrstevným plochým epitelem. Z vazivového pouzdra odstupují po celém obvodu do stĜedu orgánu vazivové pruhy, které mezi sebou anastomozují a vytváĜí prostorovou trámþinu, uvnitĜ které je dĜeĖ. Celý orgán se díky pĜítomnosti elastických vláken ve vazivových pruzích mĤže dle potĜeby zvČtšovat þi zmenšovat [1]. Do sleziny pĜivádí krev arterie lienalis, jenž vstupuje do vazivových pruhĤ a spolu s nimi za stálého vČtvení pronikají hloubČji do sleziny už jako arteriae trabeculares. StĜedem lymfatických uzlíkĤ probíhají arteriální vČtévky oznaþovány jako arteriae centrales, které se dále vČtví na arteriolae penicillatae [1]. Slezinné sinusy jsou kanálky s nepravidelným prĤsvitem, které jsou široké 80-150 ђm. Jejich stČna je tvoĜena retikulárními buĖkami vĜetenovitého tvaru. BuĖky k sobČ volnČ pĜisedají a jejich dlouhé cytoplazmatické výbČžky mohou pĜepažovat lumen sinusu. Bazální lamina je fenestrována a zevnČ na výstelkové retikulární buĖky naléhají retikulární vlákna, která jsou uspoĜádána cirkulárnČ. Díky této Ĝídké architektuĜe se snadno krev navrací z þervené pulpy do cévního systému. Sinusy pak pĜechází v krátké vény pulpy, kterými krev proudí do vén trabekulárních, jenž tvoĜí v hilu sleziny vénu lienalis [1]. DĜeĖ neboli pulpa sleziny je tvoĜena tkání dvojího typu, která se liší uspoĜádáním i složením. Ve slezinČ tedy rozeznáváme pulpu bílou a ji obklopující pulpu þervenou. Bílá pulpa je typickou lymfatickou tkání. Její stroma tvoĜí retikulární vazivo, v nČmž jsou vloženy T- a B- lymfocyty, jejich aktivované formy, makrofágy a dendritické buĖky. Bíla pulpa jako obal obklopuje vČtévky arterie lienalis. Tento obal se oznaþuje jako periarteriolární lymfatická pochva (PALS). PALS je oblast thymodependentní, obsahuje T-lymfocyty a místy ztlušĢuje v lymfatické uzlíky. Mezi bílou a þervenou pulpou se nachází marginální zóna. Marginální zóna spolu s lymfatickými uzlíky tvoĜí periferní bílou pulpu, ve které se vyskytují pĜevážnČ 9

B-lymfocyty. V marginální zónČ se dostávají lymfocyty do kontaktu s antigeny a také tu opouštČjí krevní cirkulaci a pronikají do pulpy bílé. Aktivované B-lymfocyty pak putují do centra lymfatických uzlíkĤ a mČní se v imunoblasty, plazmatické nebo pamČĢové buĖky. ýervená pulpa je tvoĜena z retikulární tkánČ, která je uložena v okolí sinusĤ, a volných bunČk. Z volných bunČk jsou zastoupeny hlavnČ erytrocyty, které pĜedstavují charakteristické zabarvení této složky sleziny, a dále pak lymfocyty, granulocyty a makrofágy. KromČ funkþních þervených krvinek se zde nacházejí také poškozené a funkþnČ ménČcenné erytrocyty, které jsou fagocytovány, odbourávány a odstraĖovány z krevního ĜeþištČ [1]. U bílé myši má slezina þervenohnČdou barvu, jazykovitý tvar a trojúhelníkovitý prĤĜez. U rĤzných jedincĤ bývá rozdílnČ velká. Její váha dosahuje pĜibližnČ 0,2 g. Pro dospČlou myš se udávají nejmenší rozmČry 0,7 x 0,5 x 0,3 cm. Myš má uloženou slezinu šikmo, pĜibližnČ ve smČru posledního žebra. PĜední úsek útrobní plochy (facies gastrica) pĜisedá k velkému zakĜivení žaludku, zadní úsek (facies pancreatica) pĜiléhá ke kliþkám tenkého stĜeva a k ocasu pankreatu. Brázda slezinná (hilus lienalis) oddČluje od sebe obČ plošky [2].

2.2.2. Játra Játra (hepar) jsou nejvČtší žlázou tČla, která svojí exokrinní i endokrinní funkcí hraje nejdĤležitČjší roli v metabolických procesech organismu. Povrch jater pokrývá tenká capsula fibrosa hepatis, která je složená z hustého plsĢovitého kolagenního vaziva, které se zhušĢuje v oblasti porta hepatis. Z porta hepatis vstupuje málo Ĝídké intersticiální vazivo do jaterního parenchymu a nezĜetelnČ ohraniþuje jaterní lalĤþky. Místa, kde se setkávají jaterní lalĤþky (vČtšinou 3-4) se na histologických Ĝezech vyznaþují pĜibližnČ trojúhelníkovitým tvarem a nazývají se portobiliární þi periportální oblasti. V každé portobiliární oblasti se ve vazivu nachází interlobulární arterie, interlobulární véna a interlobulární žluþovod. Tyto tĜi složky spolu dohromady pĜedstavují tzv. trias hepatis [1]. Základní morfologickou jednotkou žlázového parenchymu jater je lobulus venae centralis neboli lalĤþek centrální vény, útvar podobný šestibokému hranolu. V podélné ose lalĤþku probíhá centrální žíla. Každý lalĤþek se skládá z jaterních bunČk neboli hepatocytĤ, které jsou spojeny do jedno-nebo dvouvrstevnatých, prostorovČ navzájem anastomozujících, jaterních trámcĤ. Trámce hepatocytĤ vykazují vzhledem k centrální vénČ charakteristické radiální uspoĜádání. Mezi trámci probíhají jaterní sinusoidy. UvnitĜ trámcĤ jsou tenké intercelulární žluþovody (žluþové kapiláry) [1]. Jaterní buĖky jsou buĖky polygonálního tvaru s hojnou cytoplazmou a jedním þi více kulatými jádry s nápadnými jadérky. Hepatocyty jsou bohaté na organely, což dokazuje vysokou metabolickou aktivitu [1]. Intercelulární žluþovody jsou tenké kanálky, které probíhají mezi dvČma sousedními hepatocyty. Vypadají jako oválná rozšíĜení mezibunČþného prostoru. Povrchy jaterních bunČk, jež ohraniþují žluþovou kapiláru, vybíhají v krátké mikroklky. Na tyto mikroklky je vázána alkalická fosfomonoesteráza a ATP-áza [1]. Funkce hepatocytĤ jsou velmi rozliþné. KromČ tvorby žluþi zaujímají klíþovou úlohu v intermediárním metabolismu nejen všech základních živin, tj. bílkovin, lipidĤ, glycidĤ, ale i v pĜemČnČ steroidĤ a purinĤ. Vyznaþují se také schopností skladovat vitamíny (D, B12), 10

ukládat železo ve formČ feritinu a produkovat plazmatické bílkoviny pro krevní srážení (fibrinogen, protrombin). Jaterní buĖky mají výraznou detoxikaþní funkci a regeneraþní schopnost [1]. Jaterní sinusoidy vytváĜí mohutnou anastomozující síĢ v lalĤþku centrální vény. StČna jaterních sinusoid je tvoĜena speciálními endotelovými buĖkami nepravidelného tvaru, mezi které, se vkládají Kupfferovy buĖky. Kupfferovy buĖky mají na rozdíl od endotelových bunČk hvČzdicovitý tvar, vystupĖovanou schopnost fagocytózy a stĜádání [1]. Laboratorní myši mají vytvoĜený velký žluþový mČchýĜ, který je uložen mezi pravým a levým stĜedním lalokem (lobus sinister medialis et lobus dexter medialis). Mikroskopický obraz jater je trochu odlišný od jiných savcĤ. Vazivová tkáĖ mezi hepatocyty je slabČ vyvinuta, takže nejsou od sebe témČĜ ohraniþeny. Ve vazivové tkáni se kolem cév nalézají lymfoidní buĖky. Protoplazma jaterních bunČk má hrudkovitou stavbu. Žluþovody mají nízký epitel, proto pĜipomíná spíše endotel. Teprve až ve žluþovém mČchýĜi se mČní v epitel cylindrický. Za normálních podmínek se u dospČlé myši tvorba krve v játrech nevyskytuje [2].

2.2.3. Ledviny Ledvina (lat. ren, Ĝec. nephros) je párový orgán tvoĜící moþ, který odstraĖuje z organizmu vodu a v ní rozpuštČné rozpadové produkty látkové výmČny [1]. Ledvina má þervenohnČdou barvu a obvyklý fazolovitý tvar s hladkým povrchem. Povrch ledviny kryje tenké a pevné vazivové pouzdro. U dobĜe živených jedincĤ obaluje ledviny také tukové vazivo, které tvoĜí tzv. tukový polštáĜ. Ledviny mají délku cca 0,9 cm, šíĜku 0,5 cm a tloušĢku 0,4 cm. Levá ledvina se nachází níž než pravá. Dolní pól pravé ledviny dosahuje asi do výše horního pólu levé ledviny. Játra svou renální prohloubeninou pĜiléhají k horní þásti pravé ledviny [2]. TkáĖ ledviny je uspoĜádána tak, že již pouhým okem mĤžeme rozlišit dvČ základní složky a tČmi jsou kĤra a dĜeĖ. DĜeĖ je složena z nČkolika ledvinných pyramid, jejichž báze jsou obráceny k povrchu ledviny a jejich vrcholy vyþnívají jako jediná papila ledvinná, která þní do ledvinné pánviþky [1] [2]. KĤra tvoĜí vrstvu mezi bázemi dĜeĖových pyramid a pouzdrem. Parenchym ledviny lze rozlišit na dvČ rozdílné složky, které se rozlišují jak vývojem, tak stavbou i funkcí. TČmito složkami jsou vlastní žlázová exkreþní složka a na ni navazující vývodní složka. Základní stavební a funkþní jednotkou exkreþní žlázové tkánČ je nefron. Nefron se skládá z ledvinného tČlíska, proximálního a distálního tubulu a Henleovy kliþky. Na nefron navazuje sbČrací kanálek [1]. V ledvinČ je pomČrnČ málo vazivové tkánČ, pouze v kĤĜe je trochu bohatší. Za normálních podmínek se v epiteliálních buĖkách moþových kanálkĤ neukládá tuk. Oproti tomu se zde hojnČ ukládá glykogen, hlavnČ u mladých zvíĜat [2].

11

2.2.4. Plíce Plíce (lat. pulmo, Ĝec. pneumón) jsou párový orgán, který vyplĖuje velkou þást dutiny hrudní [1]. PrĤdušnice se v dutinČ hrudní vČtví na dvČ hlavní prĤdušky, z nichž každá vstupuje do pĜíslušné plíce. Pravá prĤduška je krátká a probíhá nad plicní tepnou. Levá prĤduška smČĜuje strmČ dolĤ pod plicní tepnu. Levá plíce má pouze jeden lalok. Pravá plíce je vČtší a je rozdČlena na þtyĜi laloky. K obČma spodním lalokĤm (levému laloku a brániþnímu) je od bránice pĜipojeno jemné, blanité ligamentum pulmonale. Zvláštností je pleurální vak pro srdeþní lalok, který vznikl zdvojením poplicnice. PrĤdušinky se dČlí ve dvČ, nČkdy tĜi, prĤdušinky vrcholové (bronchioli terminales), které pokraþují jako prĤdušinky dechové (bronchioli respiratorii), které jsou ojedinČle ukonþeny plicními sklípky. VČtšinou se však na dechové prĤdušinky pĜipojují další alveolární chodbiþky (ductus alveolares), ze kterých vychází alveolární váþky a alveoly. V alveolárních stČnách jsou póry, které spojují sousední alveoly, i pĜesto že nepatĜí ke stejné prĤdušince. Ve sliznici velkých bronchĤ jsou ojedinČlé hlenové žlázy a ve sliznici malých bronchĤ hlenové žlázky nejsou. Ve stČnách žil jsou svazky pĜíþnČ pruhovaných svalových vláken. Plicní tepny mají silnou svalovou vrstvu. V plicích hlodavcĤ hraje velmi dĤležitou roli lymfatická tkáĖ, která je velmi reaktivní na rĤzné podnČty. Lymfatická tkáĖ se vyskytuje buć v podobČ kompaktních ohraniþených uzlíkĤ kolem cév a prĤdušek, nebo je rozptýlena ve formČ shlukĤ v jemných alveolárních pĜepážkách. Uzlíky lymfatické tkánČ se þasto vyskytují pod poplicnicí. ýetnými mízními cévami jsou obklopeny prĤdušky i cévy [2].

2.2.5. Mozek Centrální nervový systém se skládá ze hĜbetní míchy, mozkového kmene, mozeþku a koncového mozku. Všechny þásti jsou chránČny vazivovými obaly a kostními strukturami, jimiž jsou páteĜní kanál a lebka. Základním stavebním materiálem všech þástí centrální nervové soustavy je šedá a bílá hmota, která se odlišuje vzhledem i stavbou [1]. Mozek (cerebrum) je dopĜedu znaþnČ protáhlý a ukonþený výraznými þichovými laloky. Týlní laloky vzadu nedosahují k relativnČ velkému þtverohrbolí. Mozek se skládá z prodloužené míchy, mozeþku, stĜedního mozku, mezimozku a pĜedního mozku [2]. Prodloužená mícha (medula oblongata) leží na týlní kosti. Po stranách ji obklopuje malý lalĤþek nazývaný vloþka mozeþku (paraflocculus). Mozeþek (cerebellum) je rozþlenČn do šesti pĜíþnČ rozbrázdČných lalokĤ, které jsou po tĜech uloženy po stranách stĜedního úseku zvaného pyramida. Na každé stranČ se zevnČ pĜipojuje vloþka mozeþku, která tvoĜí ventrální mozeþkovou obrubu. Pod mozeþkem se nachází most (pons cerebri). StĜední mozek (mesencephalon) je tvoĜen ventrálnČ dvČma mozkovými stonky a dorzálnČ þtverohrbolím (corpora quadrigemina). Mezimozek (diencephalon) není shora vidČt. Jeho boþní stČny jsou tvoĜeny vejþitými útvary (thalamy), jež jsou zakryty polokoulemi pĜedního mozku. Hypothalamus, spodní þást mezimozku, je v prostoru mezi kĜížením zrakových nervĤ s mozkovými stonky zakryt hypofýzou. PĜední mozek (telencephalon) je nejmohutnČjší þást mozku, který je velmi protažený pĜedozadním smČrem. Avšak nekryje mozeþek. Polokoule 12

telencephalonu mají hladký povrch bez závitĤ (lissencephalon). Na pĜední póly hemisfér se vybíhají mohutné þichové laloky. Polokoule se vzadu dotýkají mozeþku, takže není vidČt stĜední mozek, jehož zadní þást tvoĜí þtverohrbolí. Na spodní stranČ mozku jsou viditelné stonky mozkové, které náleží ke stĜednímu mozku [2]. Centrální nervová soustava se dá pomČrnČ snadno vypreparovat. Mozek i mícha jsou obklopeny pomČrnČ slabými kostmi, které lze snadno pĜestĜihnout [2].

2.3. Generování nanoþástic PbO a CdO Nanoþástice oxidu kademnatého byly generovány v prĤtokovém reaktoru na základČ odpaĜovacího-oxidaþnČ-kondenzaþního postupu. Postup je založen na odpaĜování kovových pelet p.a. kadmia v keramickém žíhacím kelímku, zavČšeném v keramické trubici ve vertikálnČ orientované peci (Carbolite TZF 15/50/610). Kadmium se odpaĜovalo pĜi teplotČ 340 °C. VytvoĜené kovové výpary byly unášeny ven z pece pomocí proudu inertního dusíku, a zĜedČny proudem vzduchu, který zoxidoval kadmium na oxid kademnatý. ObČ objemové rychlosti dusíku byly nastaveny na 3 l/min pomocí hmotových regulátorĤ prĤtoku (MFS). Takto pĜipravené nanoþástice oxidu kademnatého byly smíchány s proudem vzduchu o prĤtoku 20 l/min a poté po celou dobu experimentu používány k inhalaci v dávkovacích koncentraþních komorách. V koncentraþní dávce byl geometrický prĤmČr nanoþástic oxidu kademnatého 14,4 ± 1,76 nm. Rozložení nanoþástic, s ohledem na jejich velikost, bylo mČĜeno pomocí pĜístroje Scanning Mobility Particle Sizer™ spectrometer, model 3936L72 (TSI). Koncentrace nanoþástic CdO byla v prĤbČhu pokusu v kleci s nižší koncentrací 1,22 x 106 þástic/cm3 a v kleci s vyšší koncentrací 3,03 x 106 þástic/cm3. Nahrazením kadmia za olovo a zvýšením teploty pece na 840 °C lze v proudu dusíku (2,5 l/min) obsahujícího maximálnČ 5 ppb (v/v) kyslíku a následnou oxidaci nanoþástic vzduchem (3,0 l/min) dlouhodobČ generovat polydisperzní aerosol nanoþástic PbO o koncentraci 7,0 ± 0,5 x 106 þástic/cm3. Tento „primární aerosol“ se pro potĜeby inhalaþního experimentu dČlil do dvou vČtví v pomČru 1 (1 litr/min) : 4,5 (4,5 l/min) a v dalším stupni se Ĝedil 22 l/min þistého vzduchu o konstantní teplotČ a vlhkosti. Geometrický prĤmČr nanoþástic olova bČhem experimentu byl 17 ± 7,6 nm. NamČĜená koncentraþní stabilita aerosolu nanoþástic PbO v prĤbČhu experimentu byla 1,80 ± 0,2 x 106 þástic/cm3 a 0,40 ± 0,07 x 106 þástic/cm3.

2.4. Vliv tČžkých kovĤ na organismus V životním prostĜedí se v posledních sto letech výraznČ zvyšuje koncentrace tČžkých kovĤ. PĜestože je jejich negativní vliv na lidské zdraví znám již nČkolik let, stále jsou hojnČ využívány v prĤmyslu a zemČdČlství (fungicidy, insekticidy, fosfátová hnojiva atd.) [16]. TČžké kovy, již ve velmi nízkých koncentracích, hlavnČ olovo a kadmium mají schopnost akumulovat se v rĤzných orgánech a výraznČ ovlivĖovat zdraví jedince. Jejich chronická, subakutní nebo akutní toxicita mĤže vést až k neurotoxickým, karcinogenním nebo mutagenním efektĤm [17].

13

Toxické tČžké kovy, mezi které patĜí i kadmium a olovo, se oznaþují také jako enzymatické jedy. V metaloenzymech nahrazují pĤvodní kofaktor a nabourávají tak funkci a strukturu enzymu. Takto mohou zasahovat do mnoha bunČþných dČjĤ a mohou tímto mechanismem zpĤsobit vznik nádorového onemocnČní. Olovo mĤže nahrazovat vápník v kostech, ve kterých se následnČ kumuluje a kadmium nahrazuje zinek v nČkterých enzymech [18]. NejvýznamnČjší negativní vlivy tČžkých kovĤ na bunČþné procesy jsou uvedeny na obrázku 3. Nervový systém slouží jako cíl pro mnoho cizorodých slouþenin z životního prostĜedí, mezi které patĜí tČžké kovy olova, kadmia a hoĜþíku. Tyto kovy stejnČ jako jejich slitiny a slouþeniny jsou využívány v prĤmyslových procesech, pĜi kterých se vytváĜí þástice oxidĤ jejich kovĤ. Vdechování vzduchu obsahujícího kovový prach nebo kouĜ z prostĜedí je hlavní cesta zpĤsobující akutní a chronické nemoci jako je horeþka z kovového kouĜe a chronická obstrukþní plicní nemoc. PĜi vdechování tČchto þástic je rozhodující jejich velikost. Nanoþástice, které vždy nacházíme v kovovém kouĜi, mají obrovský povrch vzhledem k jejich hmotČ a mohou pronikat skrz tkáĖové vazby jako je alveolární stČna a hematoencefalická bariéra. PĜes tuto bariéru se pravdČpodobnČ dostávají nanoþástice pĜímo do centrální nervové soustavy [10]. Pracovní vystavení kouĜi s kovy kadmia zpĤsobuje snížení visuomotorických reakcí, tedy koordinaci pohybĤ oþí a konþetin, problémy s koncentrováním a pohybovou rovnováhou [9]. Zpracování a recyklace olova spolu s používáním olovnatého benzínu jsou hlavní zdroje zneþištČní vzduchu. Olovo se nejprve ukládá v kĤĜe mozku a hippokampu. U pracovníkĤ vystavených expozici olova bylo pozorováno ovlivnČní senzorického vnímání a rychlosti nervového vzruchu [9]. I pĜes vzrĤstající využívání nanoþástic kadmia, existuje nedostatek údajĤ o úþincích inhalace tČchto NPs (nanoþástic). Navíc, dvČ pĜedchozí studie byly zamČĜeny jen na krátkodobou expozici po dobu 7 dnĤ. PĜestože inhalaþní experimenty s CdO již existují, testované nanoþástice (20-40 µ m) byly sférické, což není pravdČpodobnČ jejich reálný tvar [23]. Navíc, exponovaná zvíĜata (potkani) byla opakovanČ vystavena CdO pouze 6 hodin dennČ. Tato krátkodobá expozice vedla ke zvýšení obsahu kadmia v játrech a ledvinách, a k rozvoji multifokálního alveolárního zánČtu v den nula a jeden den po šesti-hodinové inhalaci (550 µ g/m3). Blum ve své studii zjistil, že dokonce krátkodobá inhalace nanoþástic CdO mĤže zpĤsobit zánČt, poškození bunČk a pĜestavbu tkání a mĤže poškozovat imunitní funkce v plicích. Ve studii bylo jeden den po expozici zjištČno významné zvýšení hladiny celkového proteinu, aktivity laktát-dehydrogenázy, zánČtlivých cytokinĤ (interleukinu-1ȕ, tumor nekrotizujícího faktoru-Į, a interferonu-Ȗ), metaloproteinĤ zpĤsobujících pĜestavbu tkáĖové matrix a fagocytární aktivity [24]. Kadmium je také jedním ze známých þinitelĤ vyvolávajících oxidaþní stres pĤsobením reaktivních forem kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species). KromČ jídla je hlavním zdrojem vystavení se kadmiu vdechování (cigaretový kouĜ, pracovištČ). Okolo 50 % inhalované dávky kadmia je absorbováno v plicích a mĤže vyvolat plicní emfyzém a chronickou obstrukþní plicní nemoc [24].

14

Obr. 3: Vliv tČžkých kovĤ na bunČþné procesy [10].

2.4.1. PĜíjem, transport a mechanismus pĤsobení tČžkých kovĤ na organismus Expozicí je nazývána situace, která je charakterizována objektivními parametry, pĜi které je þlovČk vystaven pĤsobení biologickému agens, fyzikálnímu faktoru nebo chemické látky. V pĜípadČ expozice aerosolĤm nebo chemickým látkám dochází k interakci organismu se škodlivinou, jakmile se þástice þi látka po proniknutí do tČla dostane do krevního ĜeþištČ. Škodlivé látky vstupují do organismu dýchacím ústrojím (inhalaþní expozice), trávicím ústrojím (perorální expozice), kĤží a sliznicemi (dermální expozice) nebo pĜímo do krevního obČhu poškozenou tkání nebo vpichem (intravenózní expozice). Hlavními zpĤsoby vstĜebání tČžkých kovĤ do tČla jsou absorpce kĤží, inhalace a ingesce. Jestliže není vdechnutá látka rozpustná v mukózních hlenech pĜechází do alveol a difúzí nebo aktivním transportem se dostává do krve. PĜi ingesci závisí toxicita na formČ kovu, jeho pH, biotransformaci stĜevními organismy, rychlosti prĤchodu trávicím ústrojím a množstvím komplexotvorných organických látek a proteinĤ (metalothioneiny). Metalothioneiny jsou kov-vázající peptidy, které pomáhají pĜi detoxikaci organismu. PĜi vstĜebání se uplatĖuje pasivní transport – difúze a také aktivní transport – vazba na specifické bílkoviny. Za úþasti krevních bílkovin probíhá transport krví. Hlavními centry detoxikace tČžkých kovĤ jsou játra a ledviny. Ke kumulaci kovĤ dochází, ale i v mozku a kostech. NČkolik studií již prokázalo, že kadmium a olovo vázané na metalothioneiny jsou pro organizmus ménČ toxické, než stejné kovy ve volném stavu [19] [20] [21]. PĜi perorální a dermální expozici narĤstá koncentrace dané látky v krvi pomalu, ale pĜi dlouhodobČjší expozici se naopak jejich koncentrace v krvi snižuje pomaleji. U inhalaþní a intravenózní expozice je tomu právČ naopak. NejsnadnČji a nejþastČji vstupují nanoþástice 15

do tČla trávicím ústrojím a plícemi [7]. NČkteré ultra jemné þástice mohou projít pĜes epitel a proniknout až do intersticiálních tkání. Tento prĤnik þástic je výraznČjší v pĜípadČ vyšších savcĤ (napĜ. psi a opice), než v pĜípadČ hlodavcĤ [8]. Projdou-li þástice pĜes epitel, þást z nich je schopna proniknout i do lymfatických uzlin prostĜednictvím mezibunČþného transportu. Jsou známy další dva mechanismy pronikání v pĜípadČ ultra jemných þástic. Ultra jemné þástice mohou pronikat do mimoplicních orgánĤ pĜes krevní obČh a urþité þástice mohou být transportovány pĜes axony senzitivních nervĤ do centrální nervové soustavy. Výše uvedené dva mechanismy by mohly hrát významnou roli pĜi rozvoji nČkterých onemocnČní srdce a centrální nervové soustavy. Katz a kol., již v roce 1984 popsal neurální pĜenos þástic o velikosti 20 nm až 200 nm z nosu do mozku. Inhalace radioaktivních uhlíkových þástic o velikosti 35 nm vedla k akumulaci tČchto þástic v olfaktorickém bulbu krys sedm dní po expozici. Bylo také prokázáno, že u krys vystavených nanoþásticím nebo svaĜovacím dýmĤm obsahujícím mangan, dochází k pĜenosu þástic pĜes hematoencefalickou bariéru pĜímo z nosu do mozku prostĜednictvím olfaktorických nervĤ. Již byly provedeny další studie zamČĜené na pĜenos rozpustných kovĤ s obdobnými výsledky [8] [22]. Dýchací systém pĜedstavuje pro rĤzné nanomateriály nejsnadnČjší a nejpravdČpodobnČjší cestu vstupu do organismu. Vdechování þástic probíhá stejným zpĤsobem jako pĜi vystavení se pĤsobení par þi plynĤ. Plíce absorbují nanoþástice velmi rychle, protože jsou svojí stavbou uzpĤsobeny k efektivní výmČnČ plynĤ mezi vdechovaným vzduchem a krví. Celkové vystavení þásticím z ovzduší závisí na velikosti vdechovaných þástic, na jejich koncentraci, dechové frekvenci exponovaného jedince a na zpĤsobu dýchání (ústy nebo nosem). V jaké þásti dýchacího ústrojí se þástice usazují, závisí i na vlastnostech inhalovaných þástic [25].

16

3. CÍLE PRÁCE Experiment s inhalací PbO: • Vyhodnotit zda dlouhodobá inhalace vzduchu s nanoþásticemi oxidu olovnatého ovlivní hmotnost vybraných orgánĤ (slezina, játra, ledvina, plíce, mozek). • Stanovit jak inhalace nanoþástic oxidu olovnatého souvisí se zmČnou hmotnosti daného orgánu (pĜírĤstek nebo úbytek hmotnosti). • Porovnat rozdíly v hmotnostech daných orgánĤ po inhalaci vzduchu s nižší nebo vyšší koncentrací oxidu olovnatého. Experiment s inhalací CdO: • Vyhodnotit zda dlouhodobá inhalace vzduchu s nanoþásticemi oxidu kademnatého ovlivní hmotnost vybraných orgánĤ (slezina, játra, ledvina, plíce, mozek). • Zhodnotit jak inhalace nanoþástic oxidu kademnatého ovlivnila hmotnost sledovaného orgánu. • Posoudit rozdíl zmČny hmotnosti orgánu po inhalaci vzduchu s nižší nebo vyšší koncentrací oxidu olovnatého.

Dopady experimentu s nanoþásticemi PbO a CdO vyhodnotit s ohledem na zmČny hmotností vybraných orgánĤ myší ICR (CD-1) mus musculus var. alba, navzájem porovnat a zjistit zda je statistický rozdíl ve zmČnách hmotností stanovovaných orgánĤ pĜi dýchání nanoþástic oxidu olovnatého a kademnatého. Pokud rozdíl v inhalaci tČchto kovĤ je, tak vyhodnotit, který z tČchto dvou kovĤ zpĤsobuje vČtší zmČnu v hmotnosti sledovaných orgánĤ.

17

4. EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST V našem experimentu byla použita outbrední linie myši ICR (CD-1). Myší samice byly dovezeny z Masarykovy univerzity (Brno, ýeská republika). ZvíĜata byla ponechána k aklimatizaci na laboratorní podmínky nejménČ 1 týden pĜed experimenty. Komerþní krmivo, ve formČ granulí schválené Ministerstvem zemČdČlství, a voda byla poskytována dle libosti. Experimenty byly provedeny v souladu s etickým souhlasem Ústavu živoþišné fyziologie a genetiky (no. 081/2010). V práci jsou použity hmotnosti vybraných orgánĤ ze dvou experimentĤ. První experiment na inhalaci oxidu olovnatého v dobČ od 12. 8. do 11. 11. 2014 a druhý experiment s inhalací oxidu olovnatého v dobČ od 13. 12. 2014 do 10. 3. 2015. V každém experimentu bylo na zaþátku projektu chováno 120 myších samic s prĤmČrnou hmotností do 24 g. Myší samice byly po týdenní aklimatizaci vystaveny nanoþásticím oxidu olovnatého v jednom experimentu a oxidu kademnatého v druhém experimentu, na 24 hodin dennČ, 7 dní v týdnu, po dobu 13 -ti týdnĤ. Z celkového poþtu myší bylo náhodnČ 40 samic umístČno do kontrolní klece, 40 myší bylo umístČno do klece 1, s nižší koncentrací nanoþástic a 40 myší do klece 2, s vyšší koncentrací nanoþástic. Kontrolní skupina myší inhalovala vzduch o stejném složení jako myši v kleci 1 a 2, ale bez nanoþástic.

Obr. 4: Inhalaþní komora, která obsahuje þtyĜi nerezové inhalaþní klece. Inhalaþní komora byla vyrobena ze skla a nerezové oceli a obsahovala þtyĜi nerezové inhalaþní klece, viz obr. 4. Pomocí klimatizace, byly udržovány stálé parametry vzduchu, který proudil pĜes inhalaþní klece (tj. teplota, relativní vlhkost a tlak). Aktuální hladiny parametrĤ vzduchu byly mČĜeny a zaznamenávány v jedno-minutových intervalech. Doba 18

osvČtlení byla nastavena na 12 hodin svČtla a 12 hodin tmy. Chování a zdravotní stav myší byl prĤbČžnČ monitorován pomocí kamerového systému po celou dobu experimentu. Distribuce nanoþástic s ohledem na velikost a poþet þástic na jednotku objemu byly mČĜeny pĜímo pomocí Scanning Mobility Particle Sizeru 3936L72, TSI (DMA 3080L, CPC model 3772 a nanoDMA 3085, CPC model 3775). Koncentrace nanoþástic oxidu olovnatého v inhalovaném vzduchu bČhem pokusu byla v kleci 1 (Pb1) cca 4 · 105 þástic v cm3 a v kleci 2 (Pb2) cca 2 · 106 þástic v cm3. Koncentrace nanoþástic oxidu kademnatého v inhalovaném vzduchu byla v kleci 1 (Cd1) 1,22 · 106 þástic v cm3 a v kleci 2 (Cd2) 3,03 · 106 þástic v cm3.

4.1. OdbČr, zpracování orgánĤ a pĜíprava vzorkĤ V každém inhalaþním pokusu byly vybrané orgány (slezina, játra, ledvina, plíce, mozek) odebírány vždy od pČti myší z kontrolní skupiny, od pČti myší z klece s nižší koncentrací nanoþástic a od pČti myší z klece s vyšší koncentrací nanoþástic. Tedy pĜi každém odbČru, bylo usmrceno 15 myší a od každé myši byly odebrány vybrané orgány (slezina, játra, ledvina, plíce, mozek). Tyto odbČry byly provádČny po jednom týdnu trvání inhalace nanoþástic, poté po druhém týdnu inhalace, následnČ po tĜetím, pátém, sedmém, devátém, jedenáctém a tĜináctém týdnu inhalace nanoþástic oxidu olovnatého v jednom pokusu a oxidu kademnatého v druhém pokusu. Na konci expozice daného týdne byly myši usmrceny cervikální dislokací po krátké anestezii chloroformem v souladu s projektem pokusĤ þ. 214/2011 dle vyhlášky þ. 207/2004 Sb., o ochranČ, chovu a využití pokusných zvíĜat. Na obrázku 5 je vyfocena usmrcená myš s odkrytou bĜišní a hrudní dutinou, kde mĤžeme dobĜe vidČt velká þervenohnČdá játra, nad nimi jsou svČtlé plíce, na kterých leží þervenohnČdé srdce. Pod játry mĤžeme pozorovat þást tenkého a tlustého stĜeva.

Obr. 5: Usmrcená myš s orgány. 19

Sledované orgány byly vyjmuty z tČla myši a zváženy na analytických vahách Sartorius analytic, viz obr. 6, s pĜesností na þtyĜi desetinná místa. Tyto analytické váhy jsou nejpĜesnČjší používané váhy, vážící s pĜesností na 0,0001 g a váživostí do 200 g. Jsou urþené pro pĜesnou chemickou práci. Váhy byly umístČny na stabilním laboratorním stole, chránČny pĜed proudČním vzduchu a pĜímým sluneþním svČtlem, aby nedocházelo k pĜenosu tepla. Vybrané orgány byly z myší odebírány s velkou opatrností, aby se zabránilo vnČjší kontaminaci, která by zkreslovala výsledky. Pracovalo se tak, aby chirurgické nástroje pĜišly co nejménČ do kontaktu s odebíraným orgánem. Orgán byl opatrnČ opláchnut destilovanou vodou, osušen filtraþním papírem a položen na vytárované analytické váhy s malou sklenČnou miskou, aby opČt nedošlo ke kontaminaci od kovových nástrojĤ a misek.

Obr. 6: Analytické váhy Sartorius analytic. Pro práci s laboratorními zvíĜaty jsem byla ĜádnČ proškolena a absolvovala jsem Kurz odborné pĜípravy k získání osvČdþení odborné zpĤsobilosti podle § 17 odst. 3 zákona þ. 246/1992 Sb., na ochranu zvíĜat proti týrání, ve znČní pozdČjších pĜedpisĤ, na Veterinární a farmaceutické univerzitČ v BrnČ. Všechny pokusné myši byly usmrceny standardizovaným postupem Ústavu živoþišné fyziologie a genetiky AV ýR.

20

5. VÝSLEDKY A DISKUSE ZjištČné hmotnosti vybraných orgánĤ ze dvou rĤzných pokusĤ byly získány v prĤbČhu srpna až listopadu 2014 po inhalaci oxidu olovnatého a v prĤbČhu prosince 2014 až bĜezna 2015 po inhalaci oxidu kademnatého. Cílem práce bylo zjistit, zda doba inhalace nanoþástic oxidu olovnatého a oxidu kademnatého souvisí se vzrĤstající hmotností námi vybraných orgánĤ, jedná se tedy o slezinu, játra, ledvinu, plíce a mozek. Dalším cílem bylo zjistit, zda je rozdíl v nárĤstu hmotnosti orgánĤ pĜi inhalaci vyšší þi nižší koncentraci daného kovu. Pokud inhalace nanoþástic souvisí s nárĤstem hmotnosti daného orgánu, tak jak a jestli je rozdíl v nárĤstu hmotnosti orgánu mezi inhalací oxidu kademnatého a oxidu olovnatého. Pokud souvislost je, tak jestli hmotnost orgánu roste více u inhalace PbO nebo u inhalace CdO. Každý vzorek byl zmČĜen jednou a pro kontrolu sloužilo porovnání stejného orgánu od ostatních myší pĜi odbČru a posouzení hmotnosti orgánu k celkové stavbČ usmrcené myši. Získali jsme tak pro každý orgán pČt hodnot od pČti rĤzných myší pĜi každém odbČru. OdbČrĤ bylo celkem osm, stejnČ pro PbO i CdO, první týden, druhý týden, tĜetí týden, pátý týden, sedmý týden, devátý týden, jedenáctý týden a poslední odbČr byl tĜináctý týden inhalace. Dohromady, pro oba experimenty, bylo získáno 400 hodnot hmotností pro pČt sledovaných orgánĤ. Pro slezinu 80 hodnot, 80 hodnot pro játra, 80 hodnot pro levou ledvinu, 80 hodnot pro plíce a 80 hodnot pro mozek. Tedy 40 hodnot hmotností pro každý sledovaný orgán u oxidu olovnatého a 40 hodnot hmotností pro každý sledovaný orgán u oxidu kademnatého. Oba experimenty byly hodnoceny zvlášĢ a nakonec byly porovnány navzájem. Pro každý experiment byla zvlášĢ hodnocena slezina, zvlášĢ hodnoceny játra, zvlášĢ hodnocena ledvina, zvlášĢ hodnoceny plíce i mozek. Tyto orgány byly hodnoceny následovnČ: kontrolní skupina se skupinou, která inhalovala nižší koncentraci nanoþástic daného kovu (pro první experiment kontrola a Pb1; pro druhý experiment kontrola a Cd1); kontrolní skupina se skupinou, která inhalovala vyšší koncentraci nanoþástic daného kovu (pro první experiment kontrola a Pb2; pro druhý experiment kontrola a Cd2); skupina, která inhalovala nižší koncentraci daného kovu se skupinou, která inhalovala vyšší koncentraci daného kovu (pro první experiment Pb1 s Pb2; pro druhý experiment Cd1 s Cd2); skupina, která inhalovala nižší koncentraci oxidu kademnatého se skupinou, která inhalovala nižší koncentraci oxidu olovnatého (Pb1 s prvního experimentu s Cd1 s druhého experimentu); skupina, která inhalovala vyšší koncentraci oxidu kademnatého se skupinou, která inhalovala vyšší koncentraci oxidu olovnatého (Pb2 s prvního experimentu s Cd2 s druhého experimentu). Pro hodnocení daného orgánu v každém experimentu byl nejprve zvolen dvouvýbČrový t-test s rovností rozptylĤ, protože se pĜedpokládalo, že výsledky mČĜení se v jedné skupinČ (kontrolní) budou výraznČ lišit od výsledkĤ mČĜení ve druhé skupinČ (exponované). Tento test byl také zvolen proto, že na zaþátku každého experimentu byly použity myši stejné outbrední linie, stejného pohlaví, staĜí i hmotnosti, které se náhodnČ rozdČlily do kontrolní skupiny, do skupiny, jenž inhalovala vzduch s nižší koncentrací nanoþástic a do skupiny myší, které inhalovaly vzduch s vyšší koncentrací nanoþástic. DvouvýbČrovým t-testem s rovností rozptylĤ jsme porovnávali dvČ skupiny myší a chtČli jsme dokázat, že jedna skupina myší 21

má hmotnost orgánĤ v prĤmČru vyšší než druhá skupina myší. V tomto testu nás zajímala p-hodnota, která popisuje statistickou významnost a pokud je menší než 5 %, tak se hmotnosti daného orgánu statisticky významnČ lišily. Dále nás v testu zajímaly prĤmČrné hodnoty daného orgánu u testované skupiny. V tomto dvouvýbČrovém t-testu s rovností rozptylĤ jsme porovnávali první a poslední týden inhalace nanoþástic, abychom zjistili, zda nČjaká závislost existuje, protože jsme pĜedpokládali, že nejvČtší rozdíl v hmotnostech orgánĤ by mČl být právČ mezi prvním a posledním odbČrem. Pokud jsme dvouvýbČrovým t-testem s rovností rozptylĤ závislost, mezi kontrolní skupinou a skupinou, která inhalovala urþitou koncentraci nanoþástic, našli, tak jsme dané hodnoty podrobili regresi, abychom tuto závislost ukázali v závislosti na délce inhalace daného kovu. ÚplnČ nakonec jsme porovnali navzájem oba experimenty dvouvýbČrovým párovým t-testem na stĜední hodnotu, u tČch orgánĤ, kde byl nárĤst hmotností orgánĤ s pĜibývající dobou inhalace statisticky významný. Tento test jsme zvolili, abychom zjistili, zda nárĤst hmotnosti daného orgánu více ovlivĖuje inhalace oxidu olovnatého nebo oxidu kademnatého. V testu nás opČt zajímala hlavnČ p-hodnota a prĤmČr hmotnosti daného orgánu. P-hodnota byla statisticky významná, pokud byla pod 5 %.

5.1. Hodnocení výsledkĤ pro PbO Na zaþátku experimentu bylo 120 bílých laboratorních myší rozdČleno stejným poþtem do tĜí klecí. Tedy v kontrolní kleci bylo 40 myší, v kleci 1 (Pb1) inhalovalo 40 myší vzduch s nižší koncentrací nanoþástic a 40 myší inhalovalo vzduch s vyšší koncentrací nanoþástic (Pb2). V prĤbČhu tĜinácti týdnĤ bylo provedeno 8 odbČrĤ, kdy pĜi každém odbČru bylo usmrceno 5 myší z každé klece, dohromady 15 myší. U každé myši se vážila slezina, játra, levá ledvina, plíce a mozek. Podle pĜedpokladu nanoþástice vstupovaly do laboratorních myší dýcháním. Z plic pĜecházely do krve, kterou byly transportovány do ostatních orgánĤ. PĜedpokládalo se, že by se mČla zvýšit hmotnost hlavnČ jater, jakožto centra detoxikace, pak u plic, ledvin, mozku a nakonec sleziny. Získané hodnoty hmotností sledovaných orgánĤ byly podrobeny nejprve dvouvýbČrovému t-testu s rovností rozptylĤ (tabulka þ. 1) a u statisticky významného nárĤstu prĤmČrné hmotnosti daného orgánu byla provedena regrese, abychom tuto závislost nárĤstu hmotnosti ukázali na délce inhalace (graf þ. 1 a 2). V nČkterých grafech regresní pĜímky jsou vidČt velké rozdíly v hmotnostech orgánĤ (graf þ. 1 i 2), tyto rozdíly mohou být zpĤsobeny odbČrem orgánu, protože nČkdy i pĜes velkou peþlivost odbČru, se orgán mohl vážit i s vazivem orgánu, nČkdy jen pĜesnČ daný orgán, ale hlavnČ tyto rozdíly byly zpĤsobeny celkovou hmotností dané myši hlavnČ v pokroþilém stádiu experimentu. I pĜesto, že všechny myši mČly stejný pĜístup k potravČ i vodČ, nČkteré již na první pohled byly vČtší þi menší než ostatní, tento jev je zpĤsoben biologickou variabilitou. Jedním z cílĤ práce bylo zjistit, zda zvyšující se hmotnost námi vybraných orgánĤ lze korelovat s dobou inhalaþní expozice nanoþásticím oxidu olovnatého. Tento pĜedpoklad se nepotvrdil u žádného orgánu, u skupiny myší, která inhalovala nižší koncentraci nanoþástic 22

oxidu olovnatého. Tedy žádná souvislost s nárĤstem hmotnosti daného orgánĤ s dobou inhalace se nepotvrdila. PrávČ naopak, u všech sledovaných orgánĤ se prĤmČrná hmotnost snížila, viz tabulka þ. 1. To mĤže být zpĤsobeno celkovou metabolickou poruchou, kvĤli oxidativnímu stresu zpĤsobenému olovem, a tím pĜítomnosti volných radikálĤ. Výše uvedený cíl se potvrdil u skupiny myší, které inhalovali vyšší koncentraci PbO, viz tabulka þ. 1, orgány zvýraznČny þervenou barvou. Jedná se tedy o ledvinu a plíce. Tyto dva orgány (ledvina, plíce) u vyšší koncentrace nanoþástic olova byly podrobeny regresi (graf þ. 1 a 2). Dalším cílem práce bylo zjistit, zda je rozdíl v nárĤstu hmotnosti orgánu pĜi inhalaci nižší a vyšší koncentrace nanoþástic olova. Pomocí dvouvýbČrového t-testu s rovností rozptylĤ se tento rozdíl potvrdil u sleziny, ledviny a plic (tabulka þ. 2), orgány zvýraznČny zelenČ. U tČchto orgánĤ se potvrdilo, že pĜi inhalaci vzduchu s vyšší koncentrací nanoþástic se výraznČ zvýšila i hmotnost orgánu. U sleziny z prĤmČrné hmotnosti 0,1141 g na 0,1277 g, u ledviny z 0,1941 g na 0,2089 g a u plic z 0,2347 g na 0,2771 g. U zbývajících dvou orgánĤ, jater a plic se jejich prĤmČrná hmotnost u inhalace vyšší koncentrace nanoþástic zvýšila také, ale tento nárĤst nebyl statisticky významný.

Tabulka þ. 1: Výsledné prĤmČrné hmotnosti orgánĤ u olova. ƉƌƽŵĢƌŶĄŚŵŽƚŶŽƐƚ΀Ő΁ ǀŽƵǀljďĢƌŽǀljƚͲƚĞƐƚƐƌŽǀŶŽƐƚşƌŽnjƉƚLJůƽ ŬŽŶƚƌŽůĂ ŽƌŐĄŶ

ƉͲŚŽĚŶŽƚĂ

ŽůŽǀŽ

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ƐůĞnjŝŶĂ ϭ͕ϴϬ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϮϬϭ

Ϭ͕ϬϯϮϱ

Ϭ͕ϭϭϰϭ

Ϭ͕ϬϮϱϮ

ϭ͕Ϭϲ͘ϭϬͲϭ

ϭ͕ϱϴϬϵ

Ϭ͕Ϯϭϭϳ

ϭ͕ϱϮϮϬ

Ϭ͕ϮϬϲϱ

ůĞĚǀŝŶĂ Ϯ͕ϰϮ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϵϳϯ

Ϭ͕ϬϮϮϬ

Ϭ͕ϭϵϰϭ

Ϭ͕Ϭϭϴϵ

ƉůşĐĞ

ϭ͕Ϭϳ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕Ϯϰϲϭ

Ϭ͕ϬϱϭϮ

Ϭ͕Ϯϯϰϳ

Ϭ͕ϬϮϲϲ

ŵŽnjĞŬ

ϰ͕ϴϵ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϱϮϭϵ

Ϭ͕Ϭϯϭϯ

Ϭ͕ϱϮϮϭ

Ϭ͕Ϭϯϰϴ









ũĄƚƌĂ <ŽŶƚƌŽůĂнWďϭ







ƐůĞnjŝŶĂ

ϭ͕ϱϭ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϮϬϭ

Ϭ͕ϬϯϮϱ

Ϭ͕ϭϮϳϳ

Ϭ͕ϬϯϮϵ

ũĄƚƌĂ

ϰ͕ϵϰ͘ϭϬͲϭ

ϭ͕ϱϴϬϵ

Ϭ͕Ϯϭϭϳ

ϭ͕ϱϴϭϳ

Ϭ͕Ϯϱϴϵ

<ŽŶƚƌŽůĂнWďϮ ůĞĚǀŝŶĂ Ϯ͕ϵϵ͘ϭϬͲϮ

Ϭ͕ϭϵϳϯ

Ϭ͕ϬϮϮϬ

Ϭ͕ϮϬϴϵ

Ϭ͕Ϭϯϭϯ

ƉůşĐĞ

ϲ͕Ϭϱ͘ϭϬͲϰ

Ϭ͕Ϯϰϲϭ

Ϭ͕ϬϱϭϮ

Ϭ͕Ϯϳϳϭ

Ϭ͕ϬϮϳϴ

ŵŽnjĞŬ

ϭ͕ϳϭ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϱϮϭϵ

Ϭ͕Ϭϯϭϯ

Ϭ͕ϱϮϴϮ

Ϭ͕ϬϮϳϳ

23

Tabulka þ. 2: Porovnání výsledkĤ hmotností orgánĤ mezi Pb1 a Pb2. ƉƌƽŵĢƌŶĄŚŵŽƚŶŽƐƚ΀Ő΁ ǀŽƵǀljďĢƌŽǀljƚͲƚĞƐƚƐƌŽǀŶŽƐƚşƌŽnjƉƚLJůƽ Wďϭ

WďϮ

ŽƌŐĄŶ

ƉͲŚŽĚŶŽƚĂ

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

ƐůĞnjŝŶĂ

Ϯ͕Ϭϴ͘ϭϬͲϮ

Ϭ͕ϭϭϰϭ

Ϭ͕ϬϮϱϮ

Ϭ͕ϭϮϳϳ

Ϭ͕ϬϯϮϵ

ϭ͕ϱϮϮ

Ϭ͕ϮϬϲϱ

ϭ͕ϱϴϭϳ

Ϭ͕Ϯϱϴϵ

ũĄƚƌĂ WďϭнWďϮ

Ͳϭ

ϭ͕Ϯϵ͘ϭϬ  Ͳϯ

^

ůĞĚǀŝŶĂ

ϲ͕Ϯϴ͘ϭϬ 

Ϭ͕ϭϵϰϭ

Ϭ͕Ϭϭϴϵ

Ϭ͕ϮϬϴϵ

Ϭ͕Ϭϯϭϯ

ƉůşĐĞ

ϰ͕ϱϭ͘ϭϬͲϭϬ

Ϭ͕Ϯϯϰϳ

Ϭ͕ϬϮϲϲ

Ϭ͕Ϯϳϳϭ

Ϭ͕ϬϮϳϴ

ŵŽnjĞŬ

ϭ͕ϵϰ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϱϮϮϭ

Ϭ͕Ϭϯϰϴ

Ϭ͕ϱϮϴϮ

Ϭ͕ϬϮϳϳ

5.1.1. Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Pb2) – ledvina

Graf þ. 1: Závislost hmotnosti ledviny na dobČ inhalace v kleci Pb2. Ledviny jsou druhým detoxikaþním centrem, hned po játrech, u kterých se ale souvislost vzrĤstající hmotnosti s dobou inhalace neprojevila. Na základČ regrese, jsme zjistili, že na zaþátku experimentu byla hmotnost levé ledviny v prĤmČru 0,193 g a v každém následujícím týdnu se její hmotnost zvýšila v prĤmČru o 0,003 g (graf þ. 1).

24

5.1.2. Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Pb2) - plíce

Graf þ. 2: Závislost hmotnosti plic na dobČ inhalace v kleci Pb2. Plíce absorbují nanoþástice velmi rychle, protože jsou svojí stavbou uzpĤsobeny k efektivní výmČnČ plynĤ mezi vdechovaným vzduchem a krví. PĜedpokládalo se, že pĜi inhalaci se hmotnost plic musí zvýšit a tento pĜedpoklad jsme potvrdili. Zjistili jsme, že na zaþátku experimentu byla hmotnost plic v prĤmČru 0,252 g a v každém následujícím týdnu se její hmotnost zvýšila v prĤmČru o 0,003 g (graf þ. 2).

5.2. Hodnocení výsledkĤ pro CdO Na zaþátku experimentu bylo 120 bílých pokusných myší rozdČleno do tĜí klecí. V kontrolní kleci bylo 40 myší, v kleci 1 (Cd1) inhalovalo 40 myší vzduch s nižší koncentrací nanoþástic kadmia a 40 myší inhalovalo vzduch s vyšší koncentrací nanoþástic kadmia (Cd2). V prĤbČhu 13 -ti týdnĤ bylo provedeno 8 odbČrĤ, kdy pĜi každém odbČru bylo usmrceno pČt myší z každé klece, dohromady 15 myší. U každé myši se vážila slezina, játra, levá ledvina, plíce a mozek. Získané hodnoty hmotností sledovaných orgánĤ byly stejnČ jako u experimentu s oxidem olovnatým, podrobeny nejprve dvouvýbČrovému t-testu s rovností rozptylĤ (tabulka þ. 3) a u statisticky významného nárĤstu prĤmČrné hmotnosti daného orgánu byla provedena regrese, abychom tuto závislost nárĤstu hmotnosti ukázali na délce inhalace (graf þ. 3 až 8). Ve všech grafech regresní pĜímky jsou vidČt velké rozdíly v hmotnostech orgánĤ (graf þ. 3 až 8), tyto rozdíly mohou být zpĤsobeny nepĜesným odbČrem orgánu, ale hlavnČ tyto rozdíly mohou být zpĤsobeny celkovou hmotností dané myši hlavnČ v pokroþilém stádiu experimentu. I pĜesto, že všechny myši mČly stejný pĜístup k potravČ i vodČ, nČkteré již na první pohled byly vČtší þi menší než ostatní, tento jev je zpĤsoben biologickou variabilitou. 25

Jedním z cílĤ práce bylo zjistit, zda doba inhalace nanoþástic oxidu kademnatého souvisí se vzrĤstající hmotností námi vybraných orgánĤ. Tento pĜedpoklad se potvrdil jak u inhalace vzduchu s nižší koncentrací nanoþástic oxidu kademnatého, tak i inhalace vzduchu s vyšší koncentrací nanoþástic oxidu kademnatého. V pĜípadČ inhalace vzduchu s nižší koncentrací kovu se potvrdila závislost vzrĤstající hmotnosti s dobou inhalace u sleziny, jater, plic i mozku, viz tabulka 3, orgány zvýraznČny þervenČ. U inhalace vzduchu s vyšší koncentrací CdO se tato závislost potvrdila u sleziny a plic (tabulka þ. 3). Výše uvedené orgány, tedy u Cd1: slezina, játra, plíce, mozek a u Cd2: slezina a plíce, byly vyhodnoceny pomocí regrese (graf þ. 3 a 4). Tabulka þ. 3: Výsledné prĤmČrné hmotnosti orgánĤ u kadmia. ƉƌƽŵĢƌŶĄŚŵŽƚŶŽƐƚ΀Ő΁ ǀŽƵǀljďĢƌŽǀljƚͲƚĞƐƚƐƌŽǀŶŽƐƚşƌŽnjƉƚLJůƽ ŬŽŶƚƌŽůĂ

ŬĂĚŵŝƵŵ

ŽƌŐĄŶ

ƉͲŚŽĚŶŽƚĂ

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ƐůĞnjŝŶĂ

ϭ͕ϯϬ͘ϭϬͲϯ

Ϭ͕ϭϭϳϰ

Ϭ͕ϬϮϭϳ

Ϭ͕ϭϯϯϲ

Ϭ͕ϬϮϰϳ

ũĄƚƌĂ

ϭ͕ϳϲ͘ϭϬͲϮ

ϭ͕ϱϲϭϱ

Ϭ͕ϭϴϲϭ

ϭ͕ϲϲϱϴ

Ϭ͕Ϯϰϱϭ

ůĞĚǀŝŶĂ

ϯ͕ϭϮ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϴϴϲ

Ϭ͕ϬϮϳϭ

Ϭ͕ϭϵϭϱ

Ϭ͕ϬϮϱϵ

ƉůşĐĞ

ϭ͕ϱϰ͘ϭϬͲϰ

Ϭ͕Ϯϭϴϵ

Ϭ͕Ϭϯϯϰ

Ϭ͕Ϯϱϭϳ

Ϭ͕Ϭϰϯϱ

ŵŽnjĞŬ

ϰ͕ϵϭ͘ϭϬͲϯ

Ϭ͕ϱϬϰϴ

Ϭ͕Ϭϯϯϲ

Ϭ͕ϱϮϯϯ

Ϭ͕ϬϮϴϵ









<ŽŶƚƌŽůĂнĚϭ



<ŽŶƚƌŽůĂнĚϮ





ƐůĞnjŝŶĂ

ϲ͕ϴϬ͘ϭϬͲϯ

Ϭ͕ϭϭϳϰ

Ϭ͕ϬϮϭϳ

Ϭ͕ϭϯϴϱ

Ϭ͕ϬϰϴϬ

ũĄƚƌĂ

ϭ͕ϵϰ͘ϭϬͲϭ

ϭ͕ϱϲϭϱ

Ϭ͕ϭϴϲϬ

ϭ͕ϱϮϭϰ

Ϭ͕ϮϮϰϰ

ůĞĚǀŝŶĂ

Ϯ͕ϯϰ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϴϴϲ

Ϭ͕ϬϮϳϭ

Ϭ͕ϭϴϰϰ

Ϭ͕ϬϮϯϴ

ƉůşĐĞ

ϱ͕ϵϯ͘ϭϬͲϭϮ

Ϭ͕Ϯϭϴϵ

Ϭ͕Ϭϯϯϰ

Ϭ͕ϯϯϵϳ

Ϭ͕ϬϵϬϮ

ŵŽnjĞŬ

Ϯ͕ϲϱ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϱϬϰϴ

Ϭ͕Ϭϯϯϲ

Ϭ͕ϱϬϵϯ

Ϭ͕Ϭϯϭϭ

Dalším cílem práce bylo zjistit, zda je rozdíl v nárĤstu hmotnosti orgánu pĜi inhalaci nižší a vyšší koncentrace nanoþástic kadmia. Pomocí dvouvýbČrového t-testu s rovností rozptylĤ se tento rozdíl potvrdil u jater, plic a mozku (tabulka þ. 4), orgány zvýraznČny zelenČ. U tČchto orgánĤ bylo zjištČno, že záleží na koncentraci oxidu kademnatého v inhalovaném vzduchu. Z prĤmČrných hodnot, ale vyplynulo, že v kleci 1 mČla játra prĤmČrnou hmotnost 1,6658 g a v kleci 2 1,5214 g, z þehož plyne, že pĜi inhalaci vyšší koncentrace kadmia se prĤmČrná hmotnost jater snížila. MĤže to být zpĤsobeno metabolickými poruchami, pĜi otravČ kadmiem. U plic došlo k zvýšení prĤmČrné hmotnosti z 0,2517 g v kleci 1 na 0,3397 g 26

v kleci 2. Tyto hodnoty hmotnosti plic lze vysvČtlit tak, že v plicích mohl v dĤsledku pohlcení cizorodých nanoþástic oxidu kademnatého makrofágy, buĖkami imunitního systému, vzniknout zánČt. Plíce postiženy zánČtem mají vČtší hmotnost v dĤsledku poškození funkþní tkánČ a nahromadČní bunČk imunitního systému, které se snaží odstranit cizorodé nanoþástice z plic. PĜi vyšší koncentraci v inhalovaném vzduchu je i vyšší koncentrace tČchto nanoþástic CdO v plicích [14]. U mozku došlo stejnČ jako u jater k snížení hmotnosti z 0,5233 g v kleci 1 na 0,5093 g v kleci 2. U ledvin nedošlo k statisticky významnému zvýšení jejich hmotnosti v závislosti na dobČ inhalace, proto usuzujeme, že se nanoþástice pĜetrvávají v tČle a nejsou z tČla vyluþovány. Snížení hmotnosti u jater a sleziny pĜi inhalaci vyšších koncentrací nanoþástic tak mĤže být zpĤsobeno toxicitou tČchto vyšších dávek kadmia pro organismus. Tabulka þ. 4: Porovnání výsledkĤ hmotností orgánĤ mezi Cd1 a Cd2. ƉƌƽŵĢƌŶĄŚŵŽƚŶŽƐƚ΀Ő΁ ǀŽƵǀljďĢƌŽǀljƚͲƚĞƐƚƐƌŽǀŶŽƐƚşƌŽnjƉƚLJůƽ Ěϭ

ĚϮ

ŽƌŐĄŶ

ƉͲŚŽĚŶŽƚĂ

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

ƐůĞnjŝŶĂ

Ϯ͕ϴϱ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϯϯϲ

Ϭ͕ϬϮϰϳ

Ϭ͕ϭϯϴϱ

Ϭ͕ϬϰϴϬ

ũĄƚƌĂ

ϯ͕ϳϮ͘ϭϬͲϯ

ϭ͕ϲϲϱϴ

Ϭ͕Ϯϰϱϭ

ϭ͕ϱϮϭϰ

Ϭ͕ϮϮϰϰ

ůĞĚǀŝŶĂ

ϭ͕Ϭϰ͘ϭϬͲϭ

Ϭ͕ϭϵϭϱ

Ϭ͕ϬϮϱϵ

Ϭ͕ϭϴϰϰ

Ϭ͕ϬϮϯϴ

ƉůşĐĞ

ϭ͕ϳϴ͘ϭϬͲϳ

Ϭ͕Ϯϱϭϳ

Ϭ͕Ϭϰϯϱ

Ϭ͕ϯϯϵϳ

Ϭ͕ϬϵϬϮ

ŵŽnjĞŬ

Ϯ͕Ϭϰ͘ϭϬͲϮ

Ϭ͕ϱϮϯϯ

Ϭ͕ϬϮϴϵ

Ϭ͕ϱϬϵϯ

Ϭ͕Ϭϯϭϭ

ĚϭнĚϮ

5.2.1. Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - slezina

Graf þ. 3: Závislost hmotnosti sleziny na dobČ inhalace v kleci Cd1. 27

Slezina slouží jako krevní filtr, tak by se dalo pĜedpokládat, že se její hmotnost v prĤbČhu inhalace zvýší a dvouvýbČrový t-test s rovností rozptylĤ nám to potvrdil. PĜímka regrese nám však ukázala, že souvislost mezi nárĤstem hmotnosti s dobou inhalace není. Zjistili jsme jen, že hmotnost sleziny na zaþátku experimentu byla v prĤmČru 0,123 g a následující týdny se její hmotnost nezvyšovala (graf þ. 3). Tento rozpor ve výsledku mĤže být zpĤsoben podstatou statistického testování, že vzhledem k nastavení 5% hladiny významnosti se stane, že v pČti procentech pĜípadĤ objevíme závislost nČkde, kde vĤbec není. DvouvýbČrový t-test nám nesprávnČ vyhodnotil závislost, ale pĜímka regrese nám tuto závislost vyvrátila.

5.2.2. Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - játra

Graf þ. 4: Závislost hmotnosti jater na dobČ inhalace v kleci Cd1. Játra slouží jako hlavní detoxikaþní centrum, takže se dalo pĜedpokládat, že se jejich hmotnost v prĤbČhu inhalace zvýší, což jsme také potvrdili. Na zaþátku experimentu byla hmotnost jater v prĤmČru 1,571 g a každý následující týden se s dobou inhalace zvyšovala hmotnost jater v prĤmČru o 0,0134 g (graf þ. 4).

5.2.3. Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - plíce Dýchací systém jako první bariéra vstupu nanoþástic do organismu potvrdil, že se v nČm nanoþástice kadmia usazovali, tak jak jsme pĜedpokládali. Plíce mČli v prĤmČru na zaþátku experimentu hmotnost 0,214 g a jejich hmotnost se v každém následujícím týdnu zvýšila o 0,006 g (graf þ. 5).

28

Graf þ. 5: Závislost hmotnosti plic na dobČ inhalace v kleci Cd1.

5.2.4. Regrese u nižší koncentrace nanoþástic (Cd1) - mozek

Graf þ. 6: Závislost hmotnosti mozku na dobČ inhalace v kleci Cd1. U mozku se pĜedpokládalo, že se jeho hmotnost zvýší také, protože jak ukázali dĜívČjší studie [22] [8], nanoþástice se mohou dostat skrz þichové nervy do mozku. Na zaþátku experimentu byla prĤmČrná hmotnost mozku 0,504 g a každý následující týden se jeho hmotnost zvýšila o 0,002 g. 29

5.2.5. Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Cd2) - slezina

Graf þ. 7: Závislost hmotnosti sleziny na dobČ inhalace v kleci Cd2. Tak jako u inhalace vzduchu s nižší koncentrací nanoþástic kadmia, tak i u inhalace vzduchu s vyšší koncentrací CdO se pĜedpokládal nárĤst hmotnosti u exponované skupiny oproti skupinČ kontrolní. U nižší koncentrace se tato závislost nepotvrdila, ale u vyšší koncentrace ano. Na zaþátku experimentu byla hmotnost sleziny v prĤmČru 0,116 g a v každém následujícím týdnu se její hmotnost zvýšila o 0,004 g (graf þ. 7). V grafu je navíc patrné, že v jedenáctém týdnu se hmotnost jedné sleziny výraznČ lišila od ostatních. Tato odlišnost byla zpĤsobena, již na první pohled viditelnou splenomegalií.

5.2.6. Regrese u vyšší koncentrace nanoþástic (Cd2) – plíce HlavnČ u plic, jakožto brány vstupu inhalovaných nanoþástic, se pĜedpokládal nárĤst hmotnosti v prĤbČhu experimentu, který se potvrdil také pĜi inhalaci vzduchu s vyšší koncentrací nanoþástic oxidu kademnatého. V prĤmČru na zaþátku experimentu byla hmotnost plic 0,219 g a v každém následujícím týdnu se jejich hmotnost zvýšila v prĤmČru o 0,0189 g (graf þ. 8).

30

Graf þ. 8: Závislost hmotnosti plic na dobČ inhalace v kleci Cd2.

5.3. Porovnání PbO a CdO Z výsledkĤ získaných jak pro nanoþástice oxidu olovnatého tak pro nanoþástice oxidu kademnatého plyne, že souþasnČ statisticky významná souvislost mezi nárĤstem hmotnosti daného orgánu a dobou inhalace, je pouze u vyšších koncentrací obou kovĤ u plic (tabulka þ. 5). U ostatních orgánĤ souþasná závislost jak pro olovo, tak i pro kadmium není. Z testu je patrné, že v prĤmČru byla hmotnost plic vyšší u inhalování vyšších koncentrací kadmia než pĜi inhalování vyšších koncentrací olova. To mĤže být zpĤsobeno tím, že nanoþástice kadmia vytváĜely aglomeráty, které se usadily v plicích a kvĤli své velikosti se nedostaly pĜes hemato-alveolární bariéru do krevního ĜeþištČ. Podle studie Bluma [24], se pĜibližnČ polovina inhalované dávky kadmia absorbuje v plicích, kde mĤže vyvolat plicní emfyzém nebo chronickou obstrukþní plicní nemoc, kdy je funkþní plicní tkáĖ nahrazována kolagenním vazivem. Tabulka þ. 5: Porovnání PbO a CdO u plic. ǀŽƵǀljďĢƌŽǀljƉĄƌŽǀljƚͲƚĞƐƚ ŶĂƐƚƎĞĚŶşŚŽĚŶŽƚƵ

ƉƌƽŵĢƌŶĄŚŵŽƚŶŽƐƚ΀Ő΁ WďϮ

ŽƌŐĄŶ ƉͲŚŽĚŶŽƚĂ ŚŵŽƚŶŽƐƚ WďϮнĚϮ ƉůşĐĞ

ϰ͕ϵϱ͘ϭϬͲϱ

Ϭ͕Ϯϳϳϭ

ĚϮ ^

ŚŵŽƚŶŽƐƚ

^

Ϭ͕ϬϮϳϴ

Ϭ͕ϯϯϵϳ

Ϭ͕ϬϵϬϮ

31

6. ZÁVċR V této bakaláĜské práci byl sledován dlouhodobý, 13 -ti týdenní, vliv inhalace vzduchu s nanoþásticemi oxidu olovnatého a oxidu kademnatého na hmotnost vybraných orgánĤ bílé laboratorní myši. Oba experimenty se uskuteþnily na Ústavu analytické chemie a Ústavu živoþišné fyziologie a genetiky Akademie vČd ýR v BrnČ. Pokusné myši byly chovány v akreditovaném zvČĜinci a v každém experimentu bylo použito 120 myší. Myši byly rozdČleny náhodnČ do tĜí skupin: kontrolní, nižší koncentrace daného kovu a vyšší koncentrace daného kovu. V prĤbČhu obou experimentĤ nebyl zaznamenán rozdíl v chování a celkovém zdravotním stavu pokusných zvíĜat mezi exponovanými skupinami a kontrolní skupinou. V žádném experimentu nedošlo k úhynu zvíĜete. Vybrané orgány (slezina, játra, ledvina, plíce, mozek) byly peþlivČ zváženy na analytických vahách s pĜesností na þtyĜi desetinná místa. Hodnoty hmotností byly nejprve podrobeny dvouvýbČrovému t-testu s rovností rozptylĤ, kdy se v každém experimentu porovnávala kontrolní skupina s obČma koncentracemi nanoþástic, pak obČ koncentrace navzájem a nakonec se porovnávaly oba tČžké kovy navzájem dvouvýbČrovým párovým t-testem na stĜední hodnotu. Pokud byla souvislost nárĤstu hmotnosti orgánu s dobou inhalace statisticky významná, byly tyto orgány podrobeny regresi. Myším, které inhalovali nanoþástice oxidu olovnatého byla zjištČna statisticky významná souvislost mezi nárĤstem hmotnosti a dobou inhalace jen u vyšší koncentrace, a to u ledvin a plic. Hmotnost ledvin se v prĤmČru zvýšila z 0,1973 g na 0,2089 g a hmotnost plic z 0,2461 g na 0,2771 g. Statisticky významný nárĤst hmotnosti nebyl u sleziny, jater a mozku. U skupiny myší, která inhalovala nižší koncentraci nanoþástic olova bylo zjištČno snížení hmotnosti u všech orgánĤ. Mohlo to být zpĤsobeno celkovou otravou organismu olovem a pĜítomností volných radikálĤ. PĜi porovnání obou koncentrací olova bylo zjištČno, že u sleziny, ledvin a plic je nárĤst hmotnosti orgánu vČtší u skupiny myší, které inhalovaly vyšší koncentraci nanoþástic než u skupiny myší, které inhalovaly nižší koncentraci nanoþástic. U sleziny se tudíž hmotnost zvýšila v prĤmČru z 0,1141 g na 0,1277 g, u ledvin z 0,1941 g na 0,2089 g a u plic z 0,2347 g na 0,2771 g. Myši, které inhalovali nanoþástice oxidu kademnatého byla zjištČna statisticky významná souvislost mezi nárĤstem hmotnosti a dobou inhalace u nižší koncentrace kadmia u sleziny, jater, plic a mozku a u vyšší koncentrace u sleziny a plic. PĜi inhalaci nižší koncentrace kadmia se zvýšila v prĤmČru hmotnost sleziny z 0,1174 g na 0,1336 g, u jater z 1,5615 g na 1,6658 g, u plic z 0,2189 g na 0,2517 g a mozku z 0,5048 g na 0,5233 g. PĜi inhalaci vyšší koncentrace kadmia se zvýšila hmotnost sleziny v prĤmČru z 0,1174 g na 0,1385 g. PĜi porovnání obou koncentrací kadmia bylo zjištČno, že u jater, plic a mozku je nárĤst hmotnosti orgánu statisticky významný v souvislosti s inhalací rozdílné koncentrace nanoþástic. Hmotnost jater se v prĤmČru snížila pĜi inhalaci vyšší koncentrace z 1,6658 g u nižší koncentrace na 1,5214 g. U plic se hmotnost v prĤmČru zvýšila u inhalace vyšší koncentrace, a to z 0,2517 g na 0,3397 g. Hmotnost mozku se pĜi inhalaci vyšší koncentrace kadmia snížila z 0,5233 g u nižší koncentrace na 0,5093 g.

32

Pro porovnání obou kovĤ se mohly použít jen plíce u vyšších koncentrací, protože pouze u nich se projevila statisticky významná souvislost mezi nárĤstem hmotnosti orgánu a dobou inhalace. Bylo zjištČno, že nárĤst hmotnosti byl vyšší u kadmia. PĜi inhalaci vyšší koncentrace oxidu kademnatého byla hmotnost plic v prĤmČru 0,3397 g a pĜi inhalaci oxidu olovnatého 0,2771 g. Je však otázkou þím je tato zmČna hmotnosti zpĤsobena, a proto nelze urþit, který kov je pro organismus nebezpeþnČjší. Vyšší hmotnost plic u inhalace vyšší koncentrace CdO než u inhalace vyšší koncentrace PbO mĤže být zpĤsobena tím, že oxid kademnatý více proniká do plicní tkánČ, kde zpĤsobuje nahrazování funkþní plicní tkánČ kolagenním vazivem. U kadmia bylo také zjištČno, že nárĤst hmotnosti ledvin není statisticky významný jak u inhalace vzduchu s vyšší koncentrací CdO, tak i u inhalace vzduchu s nižší koncentrací CdO. TČlo takto exponovaných myší se nezbavuje nebezpeþných oxidĤ kadmia, které se musí hromadit v tČle. U nanoþástic olova, byl zjištČn statisticky významný nárĤst hmotnosti ledvin, proto se dá pĜedpokládat, že se organismus exponovaný vzduchu s nanoþásticemi PbO, snažil inhalací pĜijaté olovo vylouþit.

33

7. POUŽITÁ LITERATURA [1] HORKÝ, Drahomír a Svatopluk ýECH. Mikroskopická anatomie. 2. nezm. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2005, 353 s. ISBN 80-210-3775-X. [2] LANE-PETTER, William. Laboratorní zvíĜata: zásady chovu a ošetĜování. 1. vyd. Praha: Academia, 1969, 678 s. [3] NEJEDLÝ, Karel. Biologie a soustavná anatomie laboratorních zvíĜat. 1. vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1965, 629 s. [4] REICHHOLF, Josef. Savci. Ilustrace Fritz Wendler. Praha: Knižní klub, 1996, 287 s. PrĤvodce pĜírodou (Ikar). ISBN 80-859-4437-5. [5] DOLEŽAL, Dalibor. Práce s laboratorními zvíĜaty: laboratorní myš, potkan a králík. 1.vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2011. 119 s. ISBN 978-802-4429472. [6] ýECH, Svatopluk a Drahomír HORKÝ. PĜehled obecné histologie. 1.vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2005, 140 s. ISBN 80-210-3854-3. [7] SKěEHOT, Petr A. a Marcela RUPOVÁ. Nanobezpeþnost. Vyd. 1. Praha: Výzkumný ústav bezpeþnosti práce, 2011, 240 s. ISBN 978-808-6973-890. [8] OSTIGUY, C. …et al..Nanoparticles: Actual Knowledge About Occupational Health and Safety Risks and Prevention Measures [online]. Institut de recherche Robert Sauvé en santé et en sécurité du travail. 2006. [cit. 2015-01-05]. Dostupný z www: http://www.irsst.qc.ca/media/documents/pubirsst/r-470.pdf. [9] OSLÁNCZI, Gábor, Horváth EDINA and Szabó ANDREA. Subacute exposure of rats by metal oxide nanoparticles through the airways: general toxocity and neuro-functional effects. Acta Biologica Szegediensis. 2010, roþ. 54, (2), s. 165-170. Dostupný z www: http://www.sci.u-szeged.hu/ABS. [10] HORVÁTH, Edina, Gábor OSZLÁNCZI and Zsuzsanna MÁTÉ. Nervous system effects of dissolved and nanoparticulate cadmium in rats in subacute exposure. Journal of Applied Toxicology. 2011, vol. 31, issue 5, s. 471-476. DOI: 10.1002/jat.1664. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jat.1664 [11] BUZEA, Cristina, Ivan PACHECO a Kevin ROBBIE. Nanomaterials and nanoparticles: Sources and toxicity. Biointerphases. 2007, vol. 2, issue 4, MR17-. DOI: 10.1116/1.2815690. Dostupné z: http://scitation.aip.org/content/avs/journal/bip/2/4/10.1116/1.2815690 [12] MAYNARD, Andrew D., Robert J. AITKEN a Tilman BUTZ. Safe handling of nanotechnology. Nature. 2006-11-16, vol. 444, issue 7117, s. 267-269. DOI: 10.1038/444267a. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/444267a [13] FERNÁNDEZ ÁLVAREZ, M. TERNERO Rodríguez, A.J. FERNÁNDEZ Espinosa. Physical speciation of arsenic, mercury, lead, cadmium and nickel in inhalable atmospheric particles. Analytica Chimica Acta. 2004, vol. 524, 1-2, s. 33-40. DOI: 10.1016/j.aca.2004.02.004. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003267004001825 34

[14] GEISER, Marianne. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 2010, vol. 23, issue 4, s. 207-217. DOI: 10.1089/jamp.2009.0797. Dostupné z: http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1089 [15] OBERDÖRSTER, Eva. Manufactured Nanomaterials (Fullerenes, C60) Induce Oxidative Stress in the Brain of Juvenile Largemouth Bass. Environmental Health Perspectives. 2004-04-07, vol. 112, issue 10, s. 1058-1062. DOI: 10.1289/ehp.7021. Dostupné z: http://www.ehponline.org/ambra-doi-resolver/10.1289/ehp.7021 [16] AL-SALEH, Iman, Neptune SHINWARI a Abdullah MASHHOUR. Heavy metals (lead, cadmium and mercury) in maternal, cord blood and placenta of healthy women. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 2011, vol. 214, issue 2, s. 79-101. DOI: 10.1016/j.ijheh.2010.10.001. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1438463910001240 [17] JARUP, L. Hazards of heavy metal contamination. British Medical Bulletin. 2003-1201, vol. 68, issue 1, s. 167-182. DOI: 10.1093/bmb/ldg032. Dostupné z: http://bmb.oupjournals.org/cgi/doi/10.1093/bmb/ldg032 [18] HU, Howard. Bone Lead as a New Biologic Marker of Lead Dose: Recent Findings and Implications for Public Health. Environmental Health Perspectives. 1998, vol. 106, s. 961-. DOI: 10.2307/3434138. Dostupné z: http://www.jstor.org/stable/3434138?origin=crossref [19] CHAN, H. Mobilization of Hepatic Cadmium in Pregnant Rats. Toxicology and Applied Pharmacology. vol. 120, issue 2, s. 308-314. DOI: 10.1006/taap.1993.1116. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/doi/10.1006/taap.1993.1116 [20] QU, Wei, Bhalchandra A. DIWAN, Jie LIU a Robert A. GOYER. The Metallothionein-Null Phenotype Is Associated with Heightened Sensitivity to Lead Toxicity and an Inability to Form Inclusion Bodies. The American Journal of Pathology. 2002, vol. 160, issue 3, s. 1047-1056. DOI: 10.1016/S0002-9440(10)64925-5. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0002944010649255 [21] WAALKES, Michael P., Michael J. HARVEY a Curtis D. KLAASSEN. Relative in vitro affinity of hepatic metallothionein for metals. Toxicology Letters. 1984, vol. 20, issue 1, s. 33-39. DOI: 10.1016/0378-4274(84)90179-6. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0378427484901796 [22] KATZ, L. C., A. BURKHALTER a W. J. DREYER. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 1984-8-9, vol. 310, issue 5977, s. 498-500. DOI: 10.1038/310498a0. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/310498a0 [23] TAKENAKA, S., E. KARG, W. G. KREYLING, B. LENTNER, H. SCHULZ, A. ZIESENIS, P. SCHRAMEL a J. HEYDER. Fate and Toxic Effects of Inhaled Ultrafine Cadmium Oxide Particles in the Rat Lung. Inhalation Toxicology. 2004, vol. 16, s1, s. 8392. DOI: 10.1080/08958370490443141. Dostupné: http://www.informapharmascience.com/doi/abs/10.1080/08958370490443141

35

[24] BLUM, Jason L., Lauren K. ROSENBLUM a Gabriele GRUNIG. Short-term inhalation of cadmium oxide nanoparticles alters pulmonary dynamics associated with lung injury, inflammation, and repair in a mouse model. Inhalation Toxicology. 2014, vol. 26, issue 1, s. 48-58. DOI: 10.3109/08958378.2013.851746. Dostupné z: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/08958378.2013.851746 [25] BAEZA-SQUIBAN, Armelle a Sophie LANONE. Exposure, Uptake, and Barriers. Nanoethics and Nanotoxicology. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2011, s. 37. DOI: 10.1007/978-3-642-20177-6_2. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/978-3-642-20177-6_2

36