VOLBA OPTIMÁLNÍ METODY Jak nalézt z velkého množství metod nejlepší („fit for purpose“) postup?
(c) David MILDE
„Jak na to?“ 1. 2. 3. 4. 5. 6.
ACH/ZCHM, SLP
Identifikovat problém – požadovaná informace (kvalitativní či kvantitativní analýza, …). Nalézt faktory, které je nutné posuzovat (kritéria: jaká preciznost, pravdivost, …). Identifikace interferencí. Volba metody (vyhledání vhodných metod v literatuře, normách, modifikace existujících metod). Provedení validace metody. Volba strategie vzorkování.
1
Zvažované faktory I PRECIZNOST a PRAVDIVOST – obvykle nejsou limitujícím faktorem pro stopovou analýzu. Důležitou roli hrají u výsledků blízko limitní hodnoty. MEZ DETEKCE A STANOVITELNOSTI – důležité zejména u stopové analýzy. Mez detekce by měla být 10x menší než běžně analyzované koncentrace. Naopak nehrají roli u analýzy makrosložek. CITLIVOST – míra schopnosti metody rozlišit dva vzorky – směrnice kalibrační přímky. PRACOVNÍ ROZSAH ROZSAH OPERACÍ, POŽADOVANÉ VYBAVENÍ
Zvažované faktory II RYCHLOST ANALÝZY CENA ANALÝZY BEZPEČNOST – radiochemické analýzy a experimenty, toxická rozpouštědla, KCN, klinické a biologické vzorky, … ROBUSTNOST – necitlivost metody na „malé“ odchylky v postupu či složení vzorků. SELEKTIVITA – selektivní metoda: stanovení analytu v určité matrici není závislé na přítomnosti omezeného množství určitých příměsí. Zcela selektivní metoda pro analyt nebo skupinu analytů – specifická.
ACH/ZCHM, SLP
2
Selektivita Signál vzorku: Ssamp = k.cA – citlivost x koncentrace analytu Ssamp = SA + SI = kA.cA + kI.cI citlivosti a koncentrace Analytu a Interferentu
Koeficient selektivity – míra citlivosti metody na přítomnost interferentu (může nabývat kladných i záporných hodnot) KA,I = kI/kA Je-li KA,I větší než +1 či menší než –1 je metoda selektivnější k interferentu než analytu.
Ssamp = kA(cA + KA,I.cI)
VALIDACE METODY
Validace = potvrzení platnosti
ACH/ZCHM, SLP
3
VALIDACE Definice dle ISO 17025: validace je potvrzení přezkoušením a poskytnutím objektivního důkazu, že jsou jednotlivé požadavky na specifické zamýšlené použití splněny. Definice podle VIM 3: ověřování, že specifikované požadavky jsou přiměřené pro zamýšlené použití. Plánovaný a dokumentovaný postup pro stanovení výkonnostních charakteristik (validačních parametrů) s cílem posouzení vhodnosti pro daný účel. Kdo provádí validaci metody? instituce vydávající normy (mezilaboratorní validace), laboratoř (vnitrolaboratorní validace).
Validační plán Specifikace požadavků Volba metody Nalezení validačních údajů (standardizovaná metoda) Volba rozsahu validace Validační experimenty + vyhodnocení Bezpečné používání metody
ACH/ZCHM, SLP
4
Validační parametry Konfirmace identity – tzn. že měřená odezva může být přiřazena danému analytu a že nepochází od interferujících složek. Selektivita metody – udává rozsah, do kterého může být analyt stanoven v komplexní směsi, aniž by došlo k interferenci s ostatními složkami směsi. Pracovní rozsah (u kvantitativní analýzy) + linearita kalibrační závislosti. Mez detekce a mez stanovitelnosti. Preciznost metody. Odchylka (pravdivost) metody, výtěžnost. Robustnost – vliv malých odchylek v postupu na výsledek.
Selektivita metody Definice (VIM 3): taková vlastnost měřicího systému používajícího specifikovaný postup měření, pomocí něhož poskytuje naměřené hodnoty veličiny pro jednu nebo více měřených veličin, že hodnoty každé měřené veličiny jsou nezávislé na jiných měřených veličinách nebo jiných veličinách v rámci zkoumaného jevu, tělesa nebo látky Selektivita metody se mění v závislosti na koncentraci stanovovaného analytu. Použitelnost metody by měla být studována pomocí různých vzorků od čistých etalonů po směsi s komplexními matricemi. Selektivitu ověřujeme analýzou čistého analytu a analytu s přídavkem interferujících příměsí.
ACH/ZCHM, SLP
5
Pracovní rozsah kalibrace, linearita Definice kalibrace (VIM 3): kalibrace je činnost, která za specifikovaných podmínek v prvním kroku stanoví vztah mezi hodnotami veličiny s nejistotami měření poskytnutými standardy a odpovídajícími indikacemi s přidruženými nejistotami měření a ve druhém kroku použije tyto informace ke stanovení vztahu pro získání výsledku měření z indikace.
Kalibrační závislost 1,0
Pracovní rozsah
SIGNÁL
0,8 0,6 0,4
LOD LOQ
0,2
Lineární rozsah
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
KONCENTRACE
Ellison S.L.R., Barwick V.J., Duguid Farrant TJ.: Practical statistics for the analytical scientist. RSC Publishing, Cambridge 2009.
ACH/ZCHM, SLP
6
Mez detekce a stanovitelnosti Mez detekce (Limit of Detection, LOD) – nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni detekovat, ale které není nutně kvantifikovatelné jako exaktní hodnota. Mez stanovitelnosti (Limit of Quanification, LOQ) – nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni stanovit jako exaktní hodnotu se stanovenou přesností. Pro výpočet meze detekce je nejrozšířenější postup zpracovaný Kaiserem v 60. létech minulého století, ze směrodatné odchylky měření slepého vzorku. Při uvádění meze detekce metody je bezpodmínečně nutné, aby byla jasně uvedena použitá konvence pro výpočet této hodnoty !!!
LOD, LOQ Slepý pokus ‘blank’ • přístrojový • z přípravy vzorku • Podmínky opakovatelnosti, mezilehlé preciznosti Kalibrační rovnice: y b0 b1 c (Signál) y LOD y bl 3sbl c ( LOD ) ( y LOD b0 ) / b1 c ( LOQ ) ( y b )/b
y LOQ y bl 10sbl
LOQ
0
1
ybl = signál slepého pokusu sbl= směrodatná odchylka signálu blanku
ACH/ZCHM, SLP
7
Kvalitativní metody: prahová koncentrace Prahová koncentrace – pod ní, je pozitivní identifikace zkoušky nespolehlivá. Koncentrace [µg/g] 200
Počet opakování
Pozitivní/negativní
10
10/0
100
10
10/0
75
10
5/5
50
10
1/9
25
10
0/10
0
10
0/10
Odchylka (bias)- pravdivost Pravdivost v laboratoři lze zajistit: pomocí opakované analýzy CRM (nebo pomocí laboratorního etalonu, jehož referenční hodnota byla získána primární metodou), testováním výtěžnosti, srovnáním s nezávislou (primární) metodou, z výsledků zkoušení způsobilosti.
ACH/ZCHM, SLP
8
Odchylka (pravdivost) Testování výtěžnosti (spike recovery): Výtěžnost: R
csp cb cref
100
[%]
csp je pozorovaná koncentrace po přídavku standardu (spike), cb je koncentrace analytu ve vzorku, cref je skutečná koncentrace (z údajů o referenčním materiálu, změřená definitní metodou). Výtěžnost je třeba zásadně sledovat při několika koncentracích a provést několik opakování.
Test výtěžnosti - příklad Ověřte výtěžnost stanovení Cl- ve vodě. Do 500 ml baňky bylo odpipetováno 5 ml standardu Cl- o c = 25000 ppm a doplněno vzorkem po rysku. Analýza spikovaného vzorku poskytla výsledek 409 ppm a analýza samotného vzorku 183 ppm. R
csp cb cref
100
[%]
5 250 ppm 500 409 183 R 100 90,4 % 250
cref 25000
ACH/ZCHM, SLP
9
Preciznost Provádí se opakovaná analýza (alespoň 10x) CRM či laboratorního RM při různých koncentracích analytu, obvykle následovně: 1. 2.
3.
ACH/ZCHM, SLP
Stejný analytik, stejný přístroj, stejná laboratoř, krátké časové rozmezí. Výpočet směrodatné odchylky opakovatelnosti. Různí analytikové, popř. různé přístroje, stejná laboratoř, různé koncentrace, dlouhé časové rozpětí. Výpočet směrodatné odchylky mezilehlé preciznosti pro každou koncentraci. Různé laboratoře v režimu mezilaboratorního testu, různé koncentrace. Vyhodnocení výsledků ANOVA pro každou koncentraci reprodukovatelnost (udaná směrodatnou odchylkou).
10
Robustnost Test robustnosti – Blackett-Burman (7 parametrů, teoreticky 128 kombinací, faktoriální experiment) Kritické parametry měření a jejich tolerance musí být známy pro každý analytický postup (např.: pH, teplota, čistota a stáří činidel, vlhkost). V testu se zkoušejí pozměněné objemy, časy, navážky, vlivy různých šarží činidel apod. Parametry
1
2
3
4
5
6
7
8
A/a
A
A
A
A
a
a
a
a
B/b
B
B
b
b
B
B
b
b
C/c
C
c
C
c
C
c
C
c
D/d
D
D
d
d
d
d
D
D
E/e
E
e
E
e
e
E
e
E
F/f
F
f
f
F
F
f
f
F
G/g
G
g
g
G
g
G
G
g
Výsledky měření
s
t
u
v
w
x
y
z
Testování robustnosti Schéma pro test robustnosti: VA = 1/4(s + t + u + v) – 1/4(w + x + y + z) VB = 1/4(s + t + w + x) – 1/4 (u + v + y + z) VC = 1/4(s + u + w + y) – 1/4(t + v + x + z) VD = 1/4(s + t + y + z) – 1/4(u + v + w + x) VE = 1/4(s + u + x + z) – 1/4(t + v + w + y) VF = 1/4(s + v + w + z) – 1/4(t + u + x + y) VG = 1/4(s + v + x + y) – 1/4(t + u + w + z)
ACH/ZCHM, SLP
11
Testování robustnosti Test robustnosti spočívá v testu hypotézy H0: Vi = 0; oproti H1: Vi 0. Vypočteme-li interval spolehlivosti (IS) jako
.
;
,
.
t(1-/2;7) = 2,365 pro = 0,05
a obsahuje-li IS bod nula, potom je kontrast statisticky nevýznamný a metoda je pro daný parametr robustní.
Testování robustnosti - příklad Otestujte robustnost spektrofotometrického stanovení PO43- ve vodách, které se provádí vybarvením vzorku vody 5 ml směsného činidla, které se připravuje těsně před stanovením z H2SO4, (NH4)2MoO4, askorbové kyselina a vínanu antimonylo-draselného. Absorbance se měří při 690 nm. Byly testovány následující faktory:
ACH/ZCHM, SLP
12
Validované parametry podle typu analýzy Parametr
Kvalitativní analýza
Preciznost Pravdivost Selektivita Robustnost
Linearita LOD
Hlavní složky
Stopová analýza
Fyzikální vlastnosti
LOQ
VÝVOJ analytické metody
VALIDACE analytické metody
SOP
„Zlatá pravidla validace“ validovat celou metodu validovat celý rozsah koncentrací validovat v rozsahu všech uvažovaných matric
ACH/ZCHM, SLP
13
Shrnutí Validace metod je nezbytná, abychom získali smysluplné výsledky. Rozsah validovaných parametrů se může lišit. Validační studii je třeba plánovat a provádět v souladu s analytickými požadavky.
Na počátku se vytvoří validační plán (zprávu o validaci). Po skončení se vytvoří validační protokol.
VERIFIKACE – zavádění již validované metody do laboratoře.
ACH/ZCHM, SLP
14
